JP2021519610A - 多価抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、3つ以上の結合ドメインを含む広範な抗体の迅速かつ堅牢な生成に広く適用可能である抗体の産生のために、3つ以上の結合ドメイン及びリンカーを有する多価抗体のための新しく有用なフォーマットが必要である。
2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも1つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体を提供し、
該ベース抗体部分は、リンカーによって少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続され、
該ベース抗体部分の各結合ドメイン及び該少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれは全て、共通可変領域を有し、
該リンカーは、ヒンジ配列、又はヒンジ配列に由来する配列を含む。
2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも1つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体を提供し、
少なくとも1つの追加の結合ドメインは、CH1領域を含み、該リンカーによって該ベース抗体部分に接続されて、該ベース抗体部分の可変領域及び該CH1領域を連結し、
該多価抗体は、少なくとも3つの異なるエピトープに結合する。
好ましい実施形態は多価抗体であり、1つ以上の結合ドメインが、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含むFvドメインである。
好ましい実施形態は多価抗体であり、1つ以上の追加の結合ドメインは、抗原への曝露後に体細胞再構成を受けた再構成可変領域と対合する共通の再構成可変領域を含むFabドメインを含むか、又は体細胞再構成の結果である配列から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく核酸によってコードされる。あるいは、再構成可変領域は、合成ファージディスプレイライブラリの使用を含む当該技術分野において既知の分子生物学技術を使用して、多様性がレパートリーに導入される合成レパートリーから得られるか、それに由来するか、又はそれに基づくものであり得る。好ましくは、Fabドメインは、対応する再構成重鎖可変領域と対合する共通軽鎖可変領域を含む。好ましくは、共通軽鎖可変領域は、CL領域に接続され、再構成重鎖可変領域は、CH1領域に接続される。好ましくは、共通軽鎖は、CL及びCH1領域の結合を介して重鎖可変領域と対合する。あるいは、共通鎖が重鎖であり、再構成可変領域が軽鎖であり、該鎖は、それぞれCH1及びCLドメインを含んでもよく、CL及びCH1領域の結合を介して対合してもよい。
好ましい実施形態は該多価抗体であり、該リンカーが天然に存在する配列であるか、又は天然に存在する配列に基づくものである。より具体的には、該リンカーは、ヒンジ配列であるか、又はヒンジ配列に基づく配列を含む。より具体的には、該リンカーは、IgG1ヒンジ領域、IgG2ヒンジ領域、IgG3ヒンジ領域、又はIgG4ヒンジ領域に基づくヒンジ領域を含み得る。
ESKYGPP(配列番号1)
EPKSCDKTHT(配列番号2)
GGGGSGGGGS(配列番号3)
ERKSSVESPPSP(配列番号4)
ERKCSVESPPSP(配列番号5)
ELKTPLGDTTHT(配列番号6)
ESKYGPPSPSSP(配列番号7)
ERKSSVEAPPVAG(配列番号8)
ERKCSVEAPPVAG(配列番号9)
ESKYGPPAPEFLGG(配列番号10)
EPKSCDKTHTSPPSP(配列番号11)
EPKSCDGGGGSGGGGS(配列番号12)
GGGGSGGGGSAPPVAG(配列番号13)
EPKSCDKTHTAPELLGG(配列番号14)
ERKSSVESPPSPAPPVAG(配列番号15)
ERKCSVESPPSPAPPVAG(配列番号16)
ELKTPLGDTTHTAPEFLGG(配列番号17)
ESKYGPPSPSSPAPEFLGG(配列番号18)
EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGG(配列番号19)
ERKSSVEEAAAKEAAAKAPPVAG(配列番号20)
ERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAG(配列番号21)
ESKYGPPEAAAKEAAAKAPEFLGG(配列番号22)
EPKSCDKTHTEAAAKEAAAKAPELLGG(配列番号23)
ELKTPLGDTTHTEAAAKEAAAKAPEFLGG(配列番号24)
又はこれらのいずれか1つに対して少なくとも約85%の配列同一性を有する配列のうちの1つ以上を含むペプチド領域を含む。
好ましい実施形態は多価抗体であり、ベース抗体部分が、リンカーによって1つ以上の追加の結合ドメインに接続され、該リンカーが、該ベース抗体部分の可変領域のN末端を、1つ以上の追加の結合ドメインのC末端に接合する。好ましくは、ベース抗体部分は、Fabドメインを含み、1つ以上の追加の結合ドメインは、CH1ドメイン及びCLドメインを含むFabドメインを含み、リンカーは、ベース抗体部分のFabの可変領域のN末端を1つ以上の追加の結合ドメインのFabドメインのCH1ドメイン及びCLドメインのC末端のいずれか若しくは両方に接続する。
抗体の組み立ては、VHとVL間、及びCH1とCL間の界面において相互作用する残基に基づいた、軽鎖及び重鎖の会合、すなわちVHとVL及びCH1とCLの会合(対合)によって生じる。典型的には、対合は、軽鎖が、サブタイプに応じて、CL内の軽鎖のシステイン残基と、CH1又はヒンジにおける重鎖のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって重鎖に共有結合することにより更に安定化する。
ベース抗体部分の重鎖定常領域(例えば、CH2及びCH3)を対合する、及びそれらのヘテロ二量体化を引き起こす、異なる技術が当該技術分野において既知である。例えば、抗体重鎖のヘテロ二量体化を引き起こすためのDEKK変異の使用(参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2013/157954及びDe Nardis et al.,J.Biol.Chem.(2017)292(35)14706−14717)により、効率的なヘテロ二量体形成、安定なFc領域、及び製造の容易さが更に可能となる。このアプローチにより、分子のFc領域を機能させ、Fc受容体、補体、及びFcRnなどの免疫受容体と関与することができる。したがって、本発明の特定の多価抗体の実施形態は、当業者に既知であるDEKK修飾、又は他のFc修飾を用いて、ベース抗体部分の重鎖を優先的にヘテロ二量体化する。
本発明はまた、医学的適応症に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法も提供し、該方法は、ヒト又は動物に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む。
2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも1つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体を提供し、
該ベース抗体部分は、リンカーによって少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続され、
該ベース抗体部分の各結合ドメイン及び該少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれは全て、共通可変領域を有し、
該リンカーは、ヒンジ配列、又はヒンジ配列に由来する配列を含む。
2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも1つの追加の結合ドメインと、を含む多価抗体を提供し、
少なくとも1つの追加の結合ドメインは、CH1領域を含み、該リンカーによって該ベース抗体部分に接続されて、該ベース抗体部分の可変領域及び該CH1領域を連結し、
該多価抗体は、少なくとも3つの異なるエピトープに結合する。
本発明の他の特徴及び態様は、例として本発明の実施形態による特徴を示した添付の図面と合わせて詳細な説明から明らかになることに留意されたい。図面は例示的なものであり、特許請求の範囲及び完全な範囲の詳細な開示によって定義される本発明の範囲を限定することを意図したり、限定したりするものではなく、本明細書に記載された発明を説明し、可能にする。本発明の多価抗体は、ベース抗体部分及び追加の結合ドメイン、好ましくはVL−CL領域と対合するVH−CH1領域を含むFabドメインを含み得る。該多価抗体は、3つのVH領域、及び3つのVL領域を含む。VH又はVLのいずれかは、同族鎖の再構成可変領域と対合する共通可変領域(VHc又はVLc)であり得る。例えば、3つのVL領域は、共通鎖(VLc)であってもよく、各VH領域(VH1〜VH3)は、再構成可変領域を含んでもよく、該VH1、VH2、及びVH3領域は、同じエピトープ又は3つの異なるエピトープに結合してもよい。多価抗体は、共通軽鎖(VLc)及び3つの重鎖可変領域(VH1〜VH3)を含み、VLc−CLと対合したVH3−CH1からなる追加のFabドメインは、ベース抗体部分のVH1又はVH2領域と追加のFabドメインのCH1との間に配置されたリンカーを介して、ベース抗体に接続されてもよい。例えば、図1aを参照のこと。
図1a〜1uは、CH2及びCH3領域を含む対合する重鎖定常領域を含む多価抗体のベース抗体部分を示すが、これらの領域は単に例示目的のために示され、本発明はこれらの実施形態に限定されないことに留意されたい。本明細書では、開示される抗体における使用に好適なベース抗体部分及び追加の結合ドメインの異なるフォーマットが記載される。
本発明の抗体は、1つ以上の追加の結合ドメインをベース抗体部分に接続する1つ以上のリンカーを含む。リンカーは、リンカーが接続される結合ドメインと共に、多価抗体の機能性を少なくとも部分的に判定する。
本明細書で使用されるリンカーは、ベース抗体部分を少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続し得る。加えて、少なくとも1つの追加の結合ドメインがFabドメインであるか、又は重鎖可変領域と軽鎖可変領域との対合から構成される場合、リンカーは、共有結合を介して、典型的にはジスルフィド架橋を介して、重鎖及び軽鎖を対合し得る。ジスルフィド架橋は、リンカー内のシステイン残基と追加の結合ドメイン(複数可)の可変領域との間に形成され得る。リンカーによって引き起こされるかかる対合は、共通軽鎖と対応する再構成重鎖可変領域とを含むFabドメイン、又は共通重鎖と対応する再構成軽鎖可変領域とを含むFabドメイン、を含む追加の結合ドメインに適用することができる。
本発明の多価タンパク質のベース抗体の2つの結合ドメインが異なる抗原に結合する場合、該第1及び第2の抗原は、1つの細胞又は異なる細胞型に位置する2つの異なる分子又は部分であり得る。内因性免疫細胞を動員及び活性化することによって細胞傷害を媒介する2つの結合ドメインを含む抗体は、新たなクラスの抗体治療薬である。これは、標的細胞(すなわち、腫瘍細胞)及びエフェクター細胞(すなわち、T細胞、NK細胞、及びマクロファージ)の抗原結合特異性を1分子中で組み合わせることによって達成することができる(例えば、国際公開第2014/051433号を参照のこと)。本発明の抗体は、少なくとも3つの結合ドメインを含む。ベース抗体部分は、典型的には、2つの異なる結合ドメインを含む(ただし、2つの結合ドメインは同じ配列を有してもよく、同じエピトープに結合してもよい)。3つ以上の結合ドメインを含む多価抗体は、1つ、2つ、3つ、又はそれ以上の腫瘍関連抗原を標的にして、正常細胞に対する有害細胞の特異的標的化を可能にし得る。例えば、多価抗体の1つの結合ドメイン又は2つの結合ドメインは、異常な(腫瘍)細胞上の抗原に結合してもよく、一方で、多価抗体の第2又は第3の結合ドメインは、1つ以上の腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の方向付けられた殺傷を引き起こし得る免疫エフェクター細胞上の抗原に結合し得る。あるいは、多価抗体の2つの結合ドメインは、腫瘍細胞で発現される同一の抗原又は異なる抗原上の2つの異なるエピトープに特異的に結合し得、一方で、これらの腕の親和性は、1つの抗原のみを発現する細胞への結合を軽減するために、又は多価抗体の1つの結合ドメインのみが関与する場合に弱められる。又は、本発明の多価抗体の3つの結合ドメインは、3つの異なる抗原又は同一の抗原に結合し得るが、免疫エフェクター細胞の異なるエピトープで結合してもよい。
本発明の抗体などの多価多量体は、免疫エフェクター細胞エンゲージャー抗体であってもよい。すなわち、本発明の多価抗体は、T細胞などの免疫エフェクター細胞上の抗原に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインを含むものであってもよく、また癌又は腫瘍細胞などの異常細胞上の抗原に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインを含むものであってもよい。
本発明の多価抗体は、好ましくは、3つ以上の結合ドメインのそれぞれにおいて共通鎖を使用する。記載されるように、本発明の多価抗体のベース抗体部分は、好ましくは、1つの抗原に結合する第1の重鎖可変領域/軽鎖可変領域(VH/VL)の組み合わせを有し、第2の抗原に結合する第2のVH/VLの組み合わせを有する。ベース抗体部分に接続された、それぞれの追加の結合ドメインは、抗原上の更なるエピトープに結合する追加のVH/VLの組み合わせを含んでもよい。
本発明の多価抗体は、図1a〜図1u含む上記のような多価抗体を含む多量体を形成する3つ以上のタンパク質を一緒にコードする1つ以上の遺伝子構築物と個々の細胞を共トランスフェクションすることによって産生され得る。例えば、宿主細胞は、3つ以上の重鎖可変領域及び共通軽鎖可変領域をコードする核酸と共トランスフェクションされて、多価抗体を産生することができる。あるいは、本発明の多価抗体は、3つ以上の軽鎖可変領域及び共通重鎖を一緒にコードする1つ以上の遺伝子構築物を用いた個々の細胞の共トランスフェクションによって産生され得る。
本発明による多価抗体に組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
該宿主細胞を、ポリペプチドの発現及びそれらの組み立てを多価抗体に提供する条件下で培養することと、を含む。
2つ以上の抗体に組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞を提供することであって、そのうちの少なくとも1つは、本発明による多価抗体である、ことと、
該宿主細胞を、ポリペプチドの発現を提供する条件下で、それらの組み立てを2つ以上の抗体に提供する条件下で培養することであって、そのうちの少なくとも1つは、本発明による多価抗体である、ことと、を含む。
共通軽鎖とともにある重鎖可変領域を有する第1の重鎖をコードし、第1の抗原に結合する結合ドメイン又は可変ドメインを形成する核酸と、
該共通軽鎖とともにある重鎖可変領域を有する第2の重鎖をコードし、第2の抗原に結合する可変ドメイン、及び該共通軽鎖とともにある重鎖可変領域を形成し、第3の抗原に結合する可変ドメインを形成する核酸と、
該共通軽鎖とともにある重鎖可変領域を有する第3の重鎖をコードし、第4の抗原に結合する可変ドメインを形成する核酸と、
該共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、を有する細胞を提供することを含み、
該核酸のうちの2つ以上は、物理的に連結されていても、されていなくてもよく、該核酸のそれぞれは、該細胞内のコードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を更に含み、該方法は、該細胞を培養して該重鎖及び軽鎖の発現を可能にすることと、任意に該2つ以上の抗体を収集することと、を更に含む。一実施形態では、該第1及び第2の重鎖は、適合性ヘテロ二量体化ドメイン、好ましくはDE/KKヘテロ二量体化ドメインを有する。好ましい実施形態では、該第3の重鎖は、適合性ヘテロ二量体化ドメインの一部のうちの1つを含み、その結果、2つの抗体が産生される。一実施形態では、本方法は、該核酸を有する細胞の収集を提供することと、収集したものから、重鎖及び軽鎖それぞれの発現の所望の比を有する細胞を選択することと、を更に含む。好ましい実施形態では、該2つ以上の抗体は、2つ以上の多重特異性抗体である。好ましい実施形態では、細胞は、本質的に2つ以上の抗体の等モル量を産生する。いくつかの実施形態では、細胞は、該2つ以上の抗体のうちの他方のものよりも一方の抗体をより多く産生する。
多価結合タンパク質の合成及び発現は、一部は2つ以上の異なる重鎖と結合して発現できる適切な軽鎖の特定に関連する問題が原因で、一部は分離の問題が原因で問題がある。更に、当該技術分野では、多様な抗体の価数、安定性を有する柔軟性、及び低免疫原性を可能にする一連のリンカーを欠いている。
本発明は、本発明の多価抗体の組み立てにおいて使用され得るポリペプチド又はリンカーをコードする核酸配列、かかる核酸配列を含むベクター、本発明の多価抗体を産生できる細胞、及びかかる細胞を使用してかかる多価抗体を調製する方法を、更に提供する。
本発明の多価抗体に組み立てることが可能なポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
該宿主細胞を、ポリペプチドの発現及びそれらの組み立てを多価抗体に提供する条件下で培養することと、を含む。
組み換え宿主細胞における抗体の発現は、当該技術分野において記載されている。本発明の抗体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、染色体外コピーとして存在してもよく、及び/又は宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましいが、その場合には遺伝子サイレンシングを欠くことが知られている遺伝子座を標的とし得る。
また、本発明によって提供されるのは、本発明の抗体と、薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤を含む医薬組成物である。
24のリンカー構築物を、IgG重鎖ヘテロ二量体(国際公開第2013/157954号及び国際公開第2013/157953号)の生成のために、CH3領域においてKK残基(L351K、T366K)を含有するMV1626ベクター(図3参照)に表2に詳細を示すサイズに従って、プールにクローニングした。構築物を、制限酵素SfiI及びXhoIを使用してベクターMV1626にクローニングした。全ての構築物は、MF1337のVH遺伝子、CH1ドメイン、翻訳物が表2に列挙されているリンカー配列、及びMF1122のVH遺伝子を連続して含有する。一例として、構築物MF1337xIgG4 UHxMF1122のDNA配列を以下の表3に提供する。概略的に構築物を図2aに示す。構築物は、構築物の名前に示されるIgGアイソタイプのCH1及びリンカー配列の両方に基づく。リンカー配列と組み合わせた全ての24のCH1領域の翻訳物が、図5に提供される。全ての3つのVH遺伝子及び共通軽鎖遺伝子の翻訳物は、以下の表4に提供される。
実施例1で生成した発現ベクターを、多重特異性抗体のベース抗体部分の第2重鎖を発現するベクターMG1025C377(図4)と組み合わせ、CH3領域にL351D−L368E変異(国際公開第2013/157954号及び国際公開第2013/157953号)及び抗体MF1025のサイログロブリンFab遺伝子(国際公開第2013/157953号の実施例2を参照のこと)を有する。共通軽鎖とともにある2つの重鎖の発現は、図2bに示されるように、三重特異性抗体の産生をもたらす。
Fab MF1337を使用する二価抗破傷風トキソイド抗体(ベクターMG1337C057を使用)
Fab MF1025を使用する二価抗サイログロブリン抗体(ベクターMG1025C059を使用)
Fab MF1122vを使用する二価抗フィブリノーゲン抗体(ベクターMG1122C057を使用)
各構築物中の3つのFabドメインの結合活性を、破傷風トキソイド、フィブリノーゲン、及びサイログロブリン抗原、及びhuEGFR−Fc抗原を陰性対照として使用して、ELISAによって確認した(コーティング条件、供給元、及びカタログ番号については表7を参照されたい)。
三価抗体構築物中の3つのFabドメインの結合活性の安定性を、4つの加速ストレス条件に従って分析した。試料をPBS中、10μg/mlに希釈し、4℃で1ヶ月間インキュベートした。試料をD10F培地中、10μg/mlに希釈し、40℃で7日間インキュベートした。試料をD10F培地中、10μg/mlに希釈し、50℃で2日間インキュベートした。試料をPBSで希釈し、5回の凍結解凍サイクル(5XFT)に供した。
以下のように、18個の構築物を、更なる分析のために大規模生産用に選択した:IgG1 MH、IgG1 H、IgG1 R、IgG1 G4S,IgG1 UH、IgG3 R、IgG3 UH、**IgG2A R、IgG2A MH、IgG3 ULH、IgG2B R、IgG4 MH、IgG4 UL、IgG2A H、IgG2B H、*IgG1 UL、*IgG4 H、*IgG4 R。対照として、以下の生成物が含まれた:二重特異性抗サイログロブリン×抗破傷風トキソイド(実施例2において前述のMG1025C377×MG1337C260を使用)及び二重特異性抗サイログロブリン×抗フィブリノーゲン(前述のMG1025C377×MG1122C260を使用して)。
安定性分析は、図10において同定された18の多価構築物上で、実施例5に前述したように、安定性分析を行った。加えて、参照により組み込まれる国際公開第2018/056821(A1)号に前述されているMF6744(配列番号91)、MF1337(配列番号28及び配列番号288)、及びMF1122(配列番号26及び配列番号286)を含む重鎖結合ドメインを有する4つの対照抗体を使用し、これらはcLCに結合され、すなわち、
Fab MF6744/cLCを使用した単特異性抗CD137抗体、
Fab MF1122/cLCを使用した単特異性抗フィブリノーゲン抗体、
Fab MF1337/cLCを使用した単特異性抗破傷風トキソイド抗体、並びに
DEKK二重特異性対照としてFab MF1122/cLC及びFab MF1337/cLCを含む二重特異性抗フィブリノーゲン×抗破傷風トキソイド抗体である。
4℃(T0)で1ヶ月間(参照として見た)、
50℃で7日間、
−80℃での5X凍結解凍(FT)サイクル、又は
室温で400rpmで4時間振とう。
UV−Vis吸収分光法:凝集体によるバックグラウンド緩衝吸収及び光散乱の減算後、吸光度を350nmで試験して、Eckhardt,1994:Mulinacci,2011b and Peters,2013に説明されるように、試料の凝集状態に関する情報を提供する。
90°光散乱分光法:溶液中、光の散乱強度は、タンパク質濃度、屈折率、粒径及び形状、並びに入射光の波長などの異なる要因によって影響され得る。この方法は、Cappelle,2005;Demeule,2007a及びb;Mulinacci,2011a及び2013;Luca,2010;Patois,2011及び2012;Peters 2013において報告されているタンパク質凝集を研究するために使用される。
以下の表11に記載され、図13に示される8つのリンカーを更に特性評価した。Karplus及びSchulzの柔軟性予測方法(配列内の各アミノ酸の柔軟性指数の平均を計算する)を使用して、これらの配列のそれぞれについて柔軟性予測を得た。柔軟性指数は、Karplus PA,Schulz GEに記載されるタンパク質構造中の各アミノ酸の平均特性に由来する。タンパク質中の鎖の柔軟性予測−ペプチド抗原の選択のためのツールNaturwissenschaften 1985;72:212−3;(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)。表11では、KSスコアが1.015以下である場合には剛性(R)として、KSスコアが約1.015〜1.04である場合には部分的に柔軟としてリンカーを示す。本発明の目的のための柔軟性配列は、1.04を超えるKarplus及びSchulz柔軟性予測を有する配列である。
免疫化に使用されるマウス。
CD3、EGFR、及びPD−L1に結合するヒト抗体の生成のために、ヒト共通軽鎖及びヒト重鎖(HC)ミニ遺伝子座(ヒトV遺伝子セグメント、全てのヒトD及び全てのヒトJの選択を含む)(参照により本明細書に組み込まれるW02009/157771を参照)のトランスジェニックマウスを、以下に見られるタンパク質をコードするDNA又は組換えDNAのいずれかで免疫することができる。これらのマウスは、「MeMo(登録商標)」マウスと称される。特定の重鎖可変領域、又は本明細書に開示される配列を有する三価多量体については、これらは、当業者に既知の任意の手段によって産生することができる。
「MeMo(登録商標)」マウスを、組換えタンパク質及びGerbuアジュバントMM(Gerbu Biotechnik c#3001)を皮下注射することにより免疫化した。組み換えhuPDL1−His(SinoBiological;カタログ番号10084−H08H)タンパク質を免疫化に使用した。マウスを、40μlのアジュバントと混合したPBS中40μgの組換えタンパク質で、100μlの総容量で免疫化させた。続いて、14及び28日目に、マウスを、20μlのアジュバントと混合したPBS中20μgの組換えタンパク質で、50μlの総容量で追加免疫化させた。35日目にマウス血清を採取し、血清力価を求めた。低血清力価を有するマウスは、ブースター免疫化及び血清分析の更なるサイクルを受けた。各サイクルは、50μlのPBS中20μgの組換えタンパク質を使用する週2回の免疫化、続いて1週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的に対して高い血清力価を示すマウスは、50μlのPBS中の20μgの組換えタンパク質を3日間連続して毎日注射することからなる最終的な追加免疫化を受けた。最終注射から1日後に、マウスリンパ系組織を採取した。
MeMo(登録商標)のマウスを、マイクロピグメンテーション装置を用いて、DNAタトゥーによって免疫化させた。DNAタトゥー免疫化を、標的抗原をコードする20μgのプラスミドDNAを用いて行った。マウスを、ヒト標的PD−L1をコードするDNAで免疫化した。PD−L1の免疫化については、0.5mgの抗CD25抗体PC61.5をマウスに注射して寛容破綻することによる免疫化の開始の4日前にTreg細胞を枯渇させた。マウスを、0、3、6、14、17、28及び31日目に免疫化させた。35日目にマウス血清を採取し、血清力価を求めた。ヒト及び/又はマカクザル標的に対する血清反応性が低いマウスには、ヒト、ラット、又はマカクザルDNA抗原でブースター免疫化の更なるサイクルを受けさせて、血清分析を行った。各サイクルは、週2回のDNA免疫化、続いて1週間後の力価分析のための血清採取からなった。ヒト及びマカクザル標的を発現する細胞に対する血清反応性を示すマウスは、最終的な追加免疫化を受けた後、3日後にリンパ系組織を採取した。
脾臓及び流入領域リンパ節を、正常に免疫化された全てのマウスから除去した。脾臓リンパ節及び鼠径リンパ節の両方から単一細胞懸濁液を生成し、続いてこれらの組織をTrizol LS試薬中に溶解し、使用するまで−80℃で保存した。正常に免疫化されたマウスからのVH遺伝子のRT−PCRクローニングにより「免疫」ファージ抗体レパートリーを生成し、鼠径リンパ節を「免疫」ファージ抗体レパートリーの構築に使用した。この目的のために、TRIZOL LS溶解リンパ組織からRNAを抽出し、IgG−CH1特異的プライマーを用いてRT反応で1μgの全RNAを使用した。次いで、得られたcDNAを使用して、基本的にMarks et al.(J Mol Biol.1991 Dec 5;222(3):581−97)に記載されているように、自社開発VH特異的プライマーを使用して、VHコードcDNAのポリクローナルプールを増幅した。得られたPCR産物は、軽鎖がすべての抗体で同じであり、ベクターによってコードされていたことを除いて、de Haard et al(J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218−30)に記載されているように、ファージ上のFab断片の表示のためにファージミドベクターにクローニングされた。ライゲーション後、ファージミドを使用してE.coli TG1細菌を形質転換し、形質転換細菌をアンピシリン及びグルコースを含有するLB−寒天105プレート上に播種した。全てのファージライブラリは、106個超の形質転換体を含有し、80%超のインサート頻度を有した。一晩増殖後に細菌を採集し、確立されたプロトコル(de Haard et al.,J Biol Chem.1999 Jun 25;274(26):18218−30)に従ってファージを調製するために使用した。
EGFR及びPD−L1 cLC抗体を、以前に記載された方法を使用して、標的免疫化に成功したMeMo(登録商標)マウスから生成されたファージ抗体レパートリーから得た。更に、合成ヒト抗EGFR抗体を含む、EGFR抗体のための抗体可変ドメインVH鎖を生成する方法もまた、参照により本明細書に組み込まれる係属中の出願:WO2015/130173(A1)、WO2015/130172(A1)に記載されている。
CD3に結合するヒト抗体の生成のために、ヒト共通軽鎖及びヒト重鎖(HC)ミニ遺伝子座(ヒトV遺伝子セグメント、全てのヒトD及び全てのヒトJの選択を含む)(参照により本明細書に組み込まれるW02009/157771を参照)のトランスジェニックマウスを、TCR/CD3含有リポ粒子(Intergral Molecular))で免疫化した。これらのマウスは、「MeMo(登録商標)」マウスと称される。特定の重鎖可変領域、又は本明細書に開示される配列を有する三価多量体については、これらは、当業者に既知の任意の手段によって産生することができる。
MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAVMDSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
MRIRLLCCVAFSLLWAGPVIAGITQAPTSQILAAGRRMTLRCTQDMRHNAMYWYRQDLGLGLRLIHYSNTAGTTGKGEVPDGYSVSRANTDDFPLTLASAVPSQTSVYFCASSEAGGNTGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
力価は、ヒトTCR/CD3において1/300であるか(リポ粒子を使用するELISAにおいて)、又は、
力価は、ヒトTCR/CD3において1/300未満及び1/100超であり、最後のブースター免疫化の間に増加しなかった。
TCR/CD3についてMeMo(登録商標)マウスにおける体液性免疫応答をプライミングするために、ヒト5D5M TCRαβの組み合わせを含むリポ粒子を免疫化のために使用した。リポ粒子を、第1及び第2の注射用のGerbuアジュバントと共に使用した。
マウスを、細胞懸濁液の皮下注射によって免疫した。第1のブースター免疫化(28日目)は、PBS中の細胞とアジュバントとの混合物を含み、後続の注射全ては、PBS中の細胞からのみ構成される。35日目に、ヒトTCR/CD3に対する1/300の血清lgG力価(リポ粒子を使用したELISAにより測定)を発現したマウスは、42、43、及び44日目に細胞を追加注射された。これらの基準を満たすことができなかったマウスは、細胞とブースター免疫される(42日目及び49日目)。全ての後続の免疫化は、PBS中の細胞の皮下注射として与えられる。最終免疫化後、マウスを屠殺し、血清及び脾臓及び左鼠径リンパ節を収集する。
暫定血清IgG力価を、TCR/CD3含有リポ粒子と「ヌル」リポ粒子を使用したELISAによりスクリーニングした。抗マウスlgG染色を使用して、血清lgG力価を測定し、この染色は最も敏感であることが示された。
全ての標的特異的クローンのVHコード化cDNAを配列決定した。次いで、配列同一性及びクラスター解析に基づく固有のクローンの選択を、Sfi1−BstEII又はSfiI/XhoI消化及びIgG発現プラスミドへの消化されたcDNAのプールのライゲーションを用いて、異なるIgG発現ベクターに再クローニングし、標準化された分子生物学的技術に従って行った。
抗体を含有する培地を回収し、遠心分離して細胞残屑を除去する。続いて、Protein Aセファロースビーズを培地に添加する。培地及びProtein Aセファロースビーズを抗体とインキュベートして結合を可能にする。
精製された抗体を脱塩するために、フィルタープレート又はフィルターカラムを使用して抗体画分を遠心分離する。プレート又はカラムを遠心分離して、抗体画分の体積を減少させる。続いて、PBS又は必要な緩衝液を画分に添加して、緩衝液を低塩緩衝液と置き換える。任意に、抗体の保存緩衝液を更に脱塩するために、この遠心分離ステップに続いて緩衝液を追加することを繰り返す。
三重特異性抗体を、三重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化及び形成のために、CH3操作技術を用いて、異なるVHドメインを有するIgGをコードする2つのプラスミドの一過性共トランスフェクションによって生成した。共通軽鎖もまた、同じプラスミド又は別のプラスミド上のいずれかで同じ細胞に共トランスフェクションされる。本発明の同時係属出願(例えば、国際公開第2013/157954号及び国際公開第2013/157953号、参照により本明細書に組み込まれる)では、単一の細胞から多重特異性抗体を産生するための方法及び手段を開示しており、これにより、単特異性抗体の形成よりも多重特異性抗体の形成を有利にする手段が提供される。これらの方法はまた、三重特異性抗体を含む多価多量体の生成のために、本発明において好適に使用することができる。
細胞株
BxPC3は、ヒト膵臓癌細胞株である。
HCT−116は、ヒト結腸がん細胞株である。
%殺傷率=(100−(RLU試料/RLU IgGなし)×100)。
本発明によれば、免疫細胞関与結合ドメインは、長腕又は短腕の遠位又は内部位置を含む多価分子上の任意の位置に配置することができ、ヘテロ二量体化技術は、三価分子を好適に生成するために利用することができる。図18(短腕上のCD3結合ドメイン)、図19(内側長腕上のCD3結合ドメイン)、及び図25(遠位長腕上のCD3結合ドメイン)を参照のこと。
細胞株:
MDA−MB−231細胞(ATCC(登録商標)HTB−26)は乳癌細胞であり、転移部位から誘導される。
図18のフォーマットに従って三重特異性抗体を産生し、免疫関与ドメインが短腕に存在する場合に、同時の腫瘍抗原標的化が更に示される。これらの抗体は、上記技術によって生成された。このフォーマットでは、PD−L1親和性の増加に伴い、CD3xPD−L1:EGFR分子で観察されたMDA−MB−231細胞のFACにより測定される標的細胞結合の継続的な増強があったように、二重抗原標的相関結合が実証された。図23a.CD3xPD−L1:EGFRのフォーマットを有する特定のこれらの三重特異性分子の場合、同時の二重抗原結合及び免疫細胞関与は、単一の抗原及びCD3に結合する分子(重鎖配列図示せず)におけるBxPC3細胞の細胞傷害に相加効果があることが示され、これらの分子が3つすべての結合腕に同時に関与する能力が確認された。図23b.これらのデータに対する細胞傷害アッセイのプロトコルについては、上述した。
Jurkat−NFAT−RE−luc2細胞(Promega)は、NFAT応答エレメント(NFAT−RE)によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する操作Jurkat T細胞株である。
EGFRxCD3:EGFR二重特異性三価分子のパネルが生成され(図26)、様々な異なるCD3、免疫細胞関与結合ドメイン、及び8つの異なるリンカーに対する腫瘍標的化及びT細胞関与の有効性が示された。各三価分子は、短腕及び遠位の長腕の位置に同じ抗EGFR結合ドメイン(MF9891)を2つ含有し、長腕の内部の位置にCD3結合ドメインを有した。この研究では、Jurkat−NFAT−RE−luc2細胞及び標的細胞HCT116(中間EGFR発現)及びMDA−MB−231のレポーター細胞株を使用して、前述の方法によりT細胞活性化を測定した。陰性対照の場合、異なるスーパークラスターのCD3結合ドメインを使用した三価分子がモックxCD3xモック又は二重特異性(EGFR(MF8233)xTT(MF1337))(4,000ng/ml)を産生した。読み取り値は、5時間のインキュベーション後のレポーター活性に依存した。
Claims (83)
- 2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも1つの追加の結合ドメインと、を含む、多価抗体であって、
前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続され、
前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、
前記リンカーが、ヒンジ配列、又はヒンジ配列に由来する配列を含む、多価抗体。 - 少なくとも1つの追加の結合ドメインが、Fvドメイン、Fabドメイン、又は修飾Fabドメインを含む、請求項1に記載の多価抗体。
- 少なくとも1つの追加の結合ドメインが、CH1領域を含み、前記リンカーによって前記ベース抗体部分に接続されて、前記ベース抗体部分の可変領域及び前記CH1領域を連結する、請求項1に記載の多価抗体。
- 前記共通可変領域が、VL−CLを含む共通軽鎖の形態である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記共通軽鎖が、配列番号29の配列を含む、請求項4に記載の多価抗体。
- 前記共通可変領域が、VH−CH1を含む共通重鎖の形態である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記ベース抗体部分の各結合ドメインが、異なるエピトープに結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 少なくとも3つの異なるエピトープに結合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、
少なくとも1つの追加の結合ドメインと、を含む、多価抗体であって、
少なくとも1つの追加の結合ドメインが、CH1領域を含み、前記リンカーによって前記ベース抗体部分に接続されて、前記ベース抗体部分の可変領域及び前記CH1領域を連結し、
前記多価抗体が、少なくとも3つの異なるエピトープに結合する、多価抗体。 - 前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有する、請求項9に記載の多価抗体。
- 少なくとも1つの追加の結合ドメインが、Fvドメイン、Fabドメイン、又は修飾Fabドメインを含む、請求項9又は10に記載の多価抗体。
- 前記共通可変領域が、VL−CLを含む共通軽鎖の形態である、請求項10又は11に記載の多価抗体。
- 前記共通軽鎖が、配列番号29の配列を含む、請求項12に記載の多価抗体。
- 前記共通可変領域が、VH−CH1を含む共通重鎖の形態である、請求項10又は11に記載の多価抗体。
- 前記ベース抗体部分の各結合ドメインが、異なるエピトープに結合する、請求項10〜14のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記リンカーが、配列番号1〜24のいずれか1つに記載の配列、又は配列番号1〜24のいずれか1つと少なくとも約85%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記ベース抗体部分が全長免疫グロブリンである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記ベース抗体部分の前記結合ドメインがFabドメインである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記抗体の前記ベース部分が、第2のCH3ドメインと二量体化する第1のCH3ドメインを含み、前記第1のCH3ドメインは、351位及び366位又はそれに対応する位置にアミノ酸残基リジンを含み、前記第2のCH3ドメインは、351位又はそれに対応する位置にアスパラギン酸のアミノ酸残基、及び368位又はそれに対応する位置にグルタミン酸のアミノ酸残基を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記抗体の前記結合ドメインの前記共通可変領域が、その生殖細胞系において再構成可変鎖核酸配列を含むトランスジェニックげっ歯類によってコードされる核酸から得られるか、それに由来するか、又はそれに基づく核酸によってコードされる、請求項1〜19のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記ベース抗体部分の各Fabドメインが、リンカーを介して追加の結合ドメインに接続される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記ベース抗体部分の結合ドメインのN末端が、リンカーを介して1つの追加の結合ドメインのC末端に接続される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記ベース抗体部分の前記第1の結合ドメインのN末端が、リンカーを介して第1の追加の結合ドメインのC末端に接続され、前記ベース抗体部分の前記第2の結合ドメインのN末端が、リンカーを介して第2の追加の結合ドメインのC末端に接合される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記ベース抗体部分の前記第1の結合ドメインのN末端が、リンカーを介して第1の追加の結合ドメインのC末端に接続され、第2の追加の結合ドメインのC末端が、リンカーを介して前記第1の追加の結合ドメインのN末端に接続される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 少なくとも4つの異なるエピトープに結合することができる、請求項1〜24のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 少なくとも2つの異なる抗原に結合することができる、請求項1〜25のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 少なくとも1つの追加の結合ドメインが、Fabドメインであり、前記追加のFabドメインが、前記ベース抗体部分の前記CH1と比較して異なるサブクラスのCH1を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記リンカーが、短い、長い、荷電している、剛性である、又は柔軟性である、請求項1〜27のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記リンカーのアミノ酸配列が、天然に生じる配列を含むか、又は天然に生じる配列に由来する配列を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記リンカーが、中央ヒンジ領域配列を含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記リンカーが、上部及び下部ヒンジ配列を含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記リンカーが、らせん形成配列を含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記リンカーが、配列番号1〜24のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 少なくとも1つの追加の結合ドメインが、CH1ドメインを含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記結合ドメインのうちの少なくとも1つが、免疫エフェクター細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項1〜34のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記免疫エフェクター細胞がT細胞である、請求項35に記載の多価抗体。
- 前記T細胞上の前記抗原がCD3である、請求項36に記載の多価抗体。
- 前記結合ドメインのうちの少なくとも1つが、異常細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項35〜37のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 少なくとも2つの結合ドメインが、異常細胞上の抗原に特異的に結合する、請求項38に記載の多価抗体。
- 前記少なくとも2つの結合ドメインが、異常細胞上の少なくとも2つの異なる抗原に特異的に結合する、請求項39に記載の多価抗体。
- 前記少なくとも2つの結合ドメインが、少なくともEGFR及びPD−L1に特異的に結合する、請求項40に記載の多価抗体。
- 第1の結合ドメインがPD−L1に特異的に結合し、第2の結合ドメインがCD3に特異的に結合し、第3の結合ドメインがEGFRに特異的に結合する、請求項35〜41のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記異常細胞が腫瘍細胞である、請求項38〜42のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記ベース抗体が、結合ドメイン1及び2を含み、前記追加の結合ドメイン3が結合ドメイン1に連結され、任意の追加の結合ドメイン4が結合ドメイン2に連結される、請求項35〜43のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 結合ドメイン1がCD3結合ドメインであり、結合ドメイン2及び3が異なる標的細胞抗原に結合する、請求項44に記載の多価抗体。
- 結合ドメイン2がCD3結合ドメインであり、結合ドメイン1及び3が異なる標的細胞抗原に結合する、請求項44に記載の多価抗体。
- 結合ドメイン3がCD3結合ドメインであり、結合ドメイン1及び2が異なる標的細胞抗原に結合する、請求項44に記載の多価抗体。
- 更なる異なる標的細胞抗原に結合する結合ドメイン4を含む、請求項44〜47のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記標的細胞抗原結合ドメインの第1が、PD−L1、EGFR、CD137、CLEC12A、フィブリノーゲン、又はサイログロブリンに結合する、請求項44〜48のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記第1及び第2の標的細胞結合ドメインが、異なる抗原に結合する、請求項44〜49のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記標的細胞抗原結合ドメインの第1及び第2が、PD−L1、EGFR、CD137、CLEC12A、フィブリノーゲン、及びサイログロブリンから選択される抗原に結合する、請求項50に記載の多価抗体。
- 前記CD3結合ドメインが、MF8057、又はMF8058、又はMF8078、又はMF8397、又はMF8508、又はMF9249、又はMF9267の、CDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有する、CDR1、CDR2、及びCDR3を含む重鎖可変領域を含む、請求項44〜51のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記CD3結合ドメインが、前記CDR以外の1つ以上の位置に0〜10、好ましくは0〜5のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、MF8057、MF8058、MF8078、MF8397、MF8508、MF9249、又はMF9267のVHのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項44〜52のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 標的細胞抗原結合ドメインが、PD−L1結合ドメインである、請求項44〜53のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記PD−L1結合ドメインが、MF5377、又はMF5444、又はMF5380のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む重鎖可変領域を含む、請求項54に記載の多価抗体。
- 前記PD−L1結合ドメインが、前記CDR以外の1つ以上の位置に0〜10、好ましくは0〜5のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、MF5377、MF5444、又はMF5380のVHのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項54又は請求項55に記載の多価抗体。
- 標的細胞抗原結合ドメインが、EGFR結合ドメインである、請求項44〜56のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記EGFR結合ドメインが、MF8233、又はMF9891、又はMF9886、又はMF9873、又はMF9988のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む重鎖可変領域を含む、請求項57に記載の多価抗体。
- 前記EGFR結合ドメインが、前記CDR以外の1つ以上の位置に0〜10、好ましくは0〜5のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、MF8233、MF9891、MF9886、MF9873、又はMF9988のVHのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項57又は請求項58に記載の多価抗体。
- 標的細胞抗原結合ドメインが、CLEC12A結合ドメインである、請求項44〜59のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 前記CLEC12A結合ドメインが、MF4327のCDR1、CDR2、及びCDR3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2、及びCDR3を含む重鎖可変領域を含む、請求項60に記載の多価抗体。
- 前記CLEC12A結合ドメインが、前記CDR以外の1つ以上の位置に0〜10、好ましくは0〜5のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はこれらの組み合わせを有する、MF4327のVHのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項60又は請求項61に記載の多価抗体。
- CD3結合ドメイン、EGFR結合ドメイン、及びPD−L1結合ドメインを含む、請求項52〜62のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 多価抗体の調製方法であって、前記方法が、
請求項1〜63のいずれか一項に記載の多価抗体に組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
前記宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現及びそれらの組み立てを多価抗体に提供する条件下で培養することと、を含む、方法。 - 多価抗体の調製方法であって、前記方法が、
(i)2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、(ii)少なくとも1つの追加の結合ドメインと、(iii)ヒンジ配列又はヒンジ配列に由来する配列を含む少なくとも1つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
前記ベース抗体部分、前記少なくとも1つの追加の結合ドメイン、及び前記少なくとも1つのリンカーの発現、並びに多価抗体へのそれらの組み立てを提供する条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含み、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有する、方法。 - 多価抗体の調製方法であって、前記方法が、
(i)2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、(ii)少なくとも1つの追加の結合ドメインと、(iii)少なくとも1つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
前記ベース抗体部分、前記少なくとも1つの追加の結合ドメイン、及び前記少なくとも1つのリンカーの発現、並びに多価抗体へのそれらの組み立てを提供する条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含み、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、前記多価抗体が、少なくとも3つの異なるエピトープに結合する、方法。 - 多価抗体の調製方法であって、前記方法が、
(i)2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、(ii)少なくとも1つの追加の結合ドメインと、(iii)少なくとも1つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
前記ベース抗体部分、前記少なくとも1つの追加の結合ドメイン、及び前記少なくとも1つのリンカーの発現、並びに多価抗体へのそれらの組み立てを提供する条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含み、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、各結合ドメインが、抗原刺激に応答して体細胞組換えを受けた核酸から得られる、又はそれに基づいて、又はそれに由来した再構成可変領域を含み、前記共通可変領域を有するFabドメインを形成する、方法。 - 少なくとも1つの追加の結合ドメインが、Fvドメイン、Fabドメイン、又は修飾Fabドメインを含む、請求項64〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの追加の結合ドメインが、CH1領域を含む、請求項64〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記共通可変領域が、VL−CLを含む共通軽鎖の形態である、請求項64〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記共通軽鎖が、配列番号29の配列を含む、請求項70に記載の方法。
- 前記共通可変領域が、VH−CH1を含む共通重鎖の形態である、請求項64〜71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベース抗体部分の各結合ドメインが、異なるエピトープに結合する、請求項64〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜63のいずれか一項に記載の多価抗体に組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞。
- (i)2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、(ii)少なくとも1つの追加の結合ドメインと、(iii)ヒンジ配列又はヒンジ配列に由来する配列を含む少なくとも1つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞であって、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有する、細胞。 - (i)2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、(ii)少なくとも1つの追加の結合ドメインと、(iii)少なくとも1つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞であって、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、前記多価抗体が、少なくとも3つの異なるエピトープに結合する、細胞。 - (i)2つの結合ドメインを含むベース抗体部分と、(ii)少なくとも1つの追加の結合ドメインと、(iii)少なくとも1つのリンカーとに、組み立てることができるポリペプチドをコードする1つ以上の核酸配列を含む細胞であって、
組み立ての際に、前記ベース抗体部分が、リンカーによって前記少なくとも1つの追加の結合ドメインに接続され、前記ベース抗体部分の各結合ドメイン及び前記少なくとも1つの追加の結合ドメインのそれぞれが全て、共通可変領域を有し、各共通可変領域が、その同族領域と共進化している、細胞。 - 配列番号3〜5、7〜11若しくは13〜24のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は配列番号3〜5、7〜11若しくは13〜24のいずれか1つに対して少なくとも約85%の配列同一性を有するポリペプチド。
- 請求項78に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
- 請求項79に記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項1〜63のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
- 治療によるヒト又は動物の身体の処置に使用するための、請求項1〜63のいずれか一項に記載の多価抗体。
- 医学的適応症に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項1〜63のいずれか一項に記載の抗体を前記ヒト又は動物に投与することを含む、方法。
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