JP7171746B2 - タンパク質二量体化を特徴解析するためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年2月2日に出願された米国仮特許出願第62/625,732号明細書、および2018年9月28日に出願された米国仮特許出願第62/738,051号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、両出願はその全体で参照により本明細書に援用される。
本発明は概して、タンパク質およびその断片中の非共有結合性相互作用を特徴解析するための分析的方法およびシステムを目的とする。
過去20年にわたり、モノクローナル抗体(mAb)を採用して広範な治療領域を標的とすることに成功している(Walsh G.,Nature biotechnology 2014;32:992-1000(非特許文献1);Lawrence S.Nature biotechnology 2007;25:380-2(非特許文献2))。タンパク質凝集は、モノクローナル抗体および他の治療用タンパク質の製造において未だ主要な懸念点である。有効性と免疫原性に影響を与える可能性があるために、凝集メカニズムを理解し、適切な制御戦略を実装して製品の質を保証できるようにすることが重要である。
[本発明1001]
タンパク質医薬中の非共有結合性相互作用部位または二量体化インターフェースを特定するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
ネイティブ条件下でタンパク質医薬の制限消化を行い、単量体と非共有結合性二量体とを含有するタンパク質医薬二量体サンプル混合物を形成させる、工程;
前記タンパク質医薬二量体サンプル混合物の前記二量体および前記単量体に、検出可能な修飾を導入して、修飾二量体および修飾単量体を生成する、工程;
ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーを使用して前記修飾二量体および前記修飾単量体を、修飾二量体分画および修飾単量体分画へと分離させる、工程;
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画を消化して、ペプチドサンプルを形成させる、工程;
液体クロマトグラフィー/質量分析(LC-MS)を使用して前記ペプチドサンプルを分離させ、前記ペプチドサンプルの質量分析データを取得する、工程;および
前記タンパク質医薬の各ペプチドおよび修飾ペプチドの質量を算出することにより、前記タンパク質医薬の公知の質量データと比較された前記ペプチドの前記質量分析データを使用して、前記ペプチドサンプル中の各ペプチドの修飾部位を決定する、工程。
[本発明1002]
ネイティブ制限消化条件が、ポリペプチド間のジスルフィド結合、および二量体間の非共有結合性相互作用を保持する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記二量体および前記単量体が、迅速光化学酸化により修飾されて、前記二量体および前記単量体内に検出可能な酸化修飾を形成する、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記タンパク質医薬が、抗体もしくはその抗原結合断片、組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記二量体が本質的に2つの相互作用するF(ab’)断片またはF(ab)断片からなる、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記単量体が本質的にF(ab)断片およびFc断片からなる、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記修飾が、アミノ酸側鎖の修飾である、本発明1001~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記抗体が、モノクローナル抗体、二特異性抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1004~1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーが、酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムを含有する移動相を使用して実施される、本発明1001~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記消化されたタンパク質サンプルが、逆相液体クロマトグラフィーを用いて分離される、本発明1001~1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記修飾が、酸化、二酸化、三酸化、キヌレニン、ジチオメチル、脱炭酸、ヒドロキシキヌレニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1001~1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記タンパク質医薬が、酵素で消化される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1013]
前記酵素が、パパイン、フィカイン、エンドプロテアーゼのLys-CおよびIdeS、またはそれらの改変型からなる群から選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画が、2つの連続アミノ酸残基を結合させる共有結合性化学結合を切断してペプチドを形成させる酵素により消化される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記タンパク質医薬サンプルが、流加培養、精製プロセスステップ、または製剤化原薬からのサンプルである、本発明1001~1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
前記抗体を産生する細胞を、前記抗体を産生するのに適した条件下で細胞培養において培養する、工程;
前記抗体を、前記抗体を抽出するのに適した条件下で精製する、工程;
前記抗体と賦形剤を、前記抗体を安定化するのに適した条件下で混合する、工程;
(i)前記細胞培養から、(ii)前記細胞培養から前記抗体を精製した後に、または(iii)前記精製された抗体に賦形剤を添加した後に、前記抗体のサンプルを取得する、工程;
本発明1001~1015のいずれかの方法に従い、前記抗体の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程;および
1つもしくは複数の細胞培養、精製、または賦形剤の条件を変更して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させる、工程。
[本発明1017]
二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させるために変更される前記1つまたは複数の条件が、pH、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、溶存酸素、金属イオン、ガス分圧、アフィニティマトリクス、クロマトグラフィー樹脂、緩衝剤、界面活性剤、安定剤またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えばCHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS細胞(例えば、COS-7)、網膜細胞、Vero細胞、CV1細胞、腎細胞(例えばHEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa細胞、HepG2細胞、WI38細胞、MRC 5細胞、Colo25細胞、HB 8065細胞、HL-60細胞、リンパ球細胞、例えば自己T細胞、Jurkat(Tリンパ球)またはDaudi(Bリンパ球)、A431(表皮)細胞、U937細胞、3T3細胞、L細胞、C127細胞、SP2/0細胞、NS-0細胞、MMT細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞のいずれかに由来する細胞株からなる群から選択される、本発明1016または1017の方法。
[本発明1019]
前記細胞が、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である、本発明1016または1017の方法。
[本発明1020]
本発明1012~1015のいずれかの方法により作製される抗体。
[本発明1021]
改変抗体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
本発明1001~1015のいずれかの方法を使用して、前記抗体中の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程;および
前記二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位のアミノ酸を改変して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用を減少させる、工程。
[本発明1022]
本発明1021の改変抗体。
[本発明1023]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1021または1022の抗体。
I.定義
本明細書に別段の示唆がない限り、または文脈から相反することが明白でないかぎり、本明細書において請求される本発明を記載する文脈(特に請求の範囲の文脈)において、「1つの(a)」、「1つの(an)」、「その(the)」、および類似の指示対象の用語の使用は、単数および複数の両方を包含するとみなされる。
1つの実施形態は、タンパク質医薬の二量体化または非共有結合性相互作用を減少させるために改変されたタンパク質医薬を提供する。そうした改変は、保存的アミノ酸置換であり得る。保存的アミノ酸置換では、アミノ酸は、類似した性質を有する別のアミノ酸へと交換される。このタイプの置換は、対応するタンパク質の機能障害を滅多に起こさないと予測される。
1つの実施形態では、タンパク質医薬は、原核細胞または真核細胞での発現に適した、1つまたは複数の対象タンパク質を含有してもよい。例えば対象タンパク質としては、限定されないが、抗体もしくはその抗原結合断片、キメラ抗体もしくはその抗原結合断片、ScFvもしくはその断片、Fc融合タンパク質もしくはその断片、成長因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または細胞表面受容体の細胞外ドメインもしくはその断片が挙げられる。対象タンパク質は、単一のサブユニットからなる単一ポリペプチドであってもよく、または2つ以上のサブユニットを含む複合的なマルチサブユニットタンパク質であってもよい。対象タンパク質は、バイオ医薬、食品添加物もしくは保存剤、または精製および品質標準に供される任意のタンパク質製品であってもよい。
1つの実施形態では、タンパク質医薬は、流加細胞培養で製造される。タンパク質製造において、「流加細胞培養」または「流加培養」とは、細胞と培養培地が最初に培養管に供給され、そして追加の培養栄養素が個別の増分で培養中にゆっくりと培養物に供給される回分培養のことを指す。培養終了前に定期的な細胞および/または産生物の回収を伴う場合と伴わない場合がある。流加培養には「半連続的流加培養」が含まれる。この培養では定期的に全培養物(細胞と培地を含み得る)が除去され、新たな培地で置き換えられる。流加培養は、シンプルな「回分培養」とは区別される。回分培養では、細胞培養のためのすべての構成要素(動物細胞とすべて培養栄養素を含む)が、培養プロセスの開始時に培養管に供給される。標準的な流加培養プロセス中に培養管から上清が除去されない限りにおいては、流加培養は「灌流培養」とは異なり得る。灌流培養では、細胞は例えばろ過により培養物中に残され、培養培地が連続的に、または断続的に導入され、培養管から除去される。しかし検証目的で流加細胞培養中にサンプルが取り出されることは予期される。流加培養プロセスは、最大作動量および/または最大タンパク質産生に達したと決定されるまで継続され、その後、タンパク質が回収される。
タンパク質の凝集は、モノクローナル抗体の製造において未だ主要な懸念点である。純度、有効性、および免疫原性に影響を与える可能性があるために、凝集メカニズムを理解し、適切な制御戦略を実装して製品の質を保証できるようにすることが重要である。mAb分子中の二量体化インターフェースのマッピングは、mAb二量体のその複雑性と不均一性のために未だ困難な課題である。水素-重水素交換質量分析(HDX MS:hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry)により、タンパク質-タンパク質の相互作用の解明には成功しているが、mAb二量体化インターフェースの解明にはほとんど至っておらず、恐らくこれはタンパク質側鎖の相互作用を検出する方法に限界があるためと思われる。
1つの実施形態は、タンパク質のペプチド/残基レベルで二量体化インターフェースを決定する方法を提供するものである。方法の例としては、タンパク質二量体サンプルをサブドメインへと消化する工程と、消化されたタンパク質サンプル混合物を標識する工程と、標識された二量体サブドメイン断片および単量体サブドメイン断片を単離する工程と、標識されたサンプルにペプチドマッピングを行い、二量体中、および単量体中の標識度を決定および比較する工程と、を含む。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。
1つの実施形態では、例えば抗体などのタンパク質医薬は細胞培養から取得され、二量体が富化されて、富化二量体サンプルが提供される。富化二量体サンプルは、限定されないが、液体クロマトグラフィーをはじめとする様々な富化技術を使用して製造され得る。好ましい液体クロマトグラフィー法としては、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。一部の実施形態では、富化二量体サンプルは、二量体以外のいくつかのタンパク質凝集物を含有する。ゆえに富化二量体サンプルは二量体のみで構成される必要はない。1つの実施形態では、富化二量体サンプルは、50%超の二量体を含有する。
i.カルボキシル基の標識
1つの実施形態では、消化されたmAbサンプルは、カルボキシル基標識を使用して標識される。カルボキシル基のフットプリンティングは、タンパク質の立体構造、および相互作用の研究に普遍的に使用されている共有結合標識技術であり、Asp残基およびGlu残基の側鎖を、グリシンエチルエステル塩酸塩(GEE:glycine ethyl ester hydrochloride)で標識する。GEE標識反応において、タンパク質の表面に配置されたAsp残基およびGlu残基のカルボキシル基は容易に修飾される一方で、タンパク質構造の内部に埋もれた場合にはほとんど、または全く修飾を受けない。1つの実施形態では、消化サンプルを0.2Mの1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)および2MのGEEと混合し、1時間室温でインキュベートしてもよい。GEE標識反応は、1MのTris-HCl(pH8)を添加することでクエンチされ得る。1つの実施形態では、その後、サンプル溶液を濃縮してもよい。サンプルを濃縮する方法は当分野に公知である。例示的な方法としては、限定されないが、膜透析、沈殿または塩析、セルロース膜濃縮装置、および遠心分離が挙げられる。好ましい実施形態では、サンプルは例えばUltracel-10K遠心フィルターを使用した遠心分離により濃縮される。
1つの実施形態では、消化されたmAbサンプルは、FPOPを使用して標識される。FPOPは、確立されたヒドロキシルラジカル標識法であり、マイクロ秒の時間スケールでタンパク質をアミノ酸残基の側鎖で標識し、タンパク質-タンパク質/リガンドの相互作用の研究に広く適用されている。1つの実施形態では、mAb断片と非共有結合断片二量体を含有する消化されたmAb二量体は、例えばPBS(pH7.4)などの適切な緩衝液へと緩衝液交換される。クエンチ剤は素早くOHラジカルと反応し、そして標識中には回避されなければならないため、緩衝液交換が必要な場合がある。普遍的なクエンチ剤としては、限定されないが、例えばTris-HClなどの特定の緩衝溶液、ならびにグリセロールおよびDTTなどの化学物質が挙げられる。
1つの実施形態では、共有結合標識されたサンプル混合物は、例えばBEH(登録商標)SECカラムなどのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して分離されてもよい。SEC分離およびUV検出(280nm)の後、二量体断片と単量体断片が収集されトリプシンペプチドマッピング分析が行われてもよい
1つの実施形態では、二量体分画と単量体分画に、トリプシンペプチドマッピングが行われてもよい。トリプシンペプチドマッピングの方法は当分野に公知である。1つの実施形態では、二量体分画と単量体分画は、例えばSpeedVac中で乾燥され、8Mの尿素、5mMのジチオスレイトール(DTT)および0.1MのTris-HCl(pH7.5)を含有する溶液中で再構成され、その後にトリプシンペプチドマッピングが行われる。変性され、還元されたサンプルは、暗室において30分間、10mMのヨードアセトアミド(IAA:iodoacetamide)でアルキル化されてもよい。次いでサンプル溶液は、尿素濃度を下げるために0.1MのTris-HCl(pH7.5)で希釈され、1:20(w/w)の酵素:基質の比率で一晩、37℃でトリプシン消化されてもよい。消化は、10%のギ酸(FA:formic acid)を各消化タンパク質サンプルに添加することで停止され得る。次いで逆相UPLCでサンプルが分離され、その後にオンライン質量分析が為されて、ペプチドの質量が決定され、ペプチドのアイデンティティが確認されてもよい。1つの実施形態では、MSおよびMS/MS実験は、MS/MS実験中のペプチド断片化に採用される高エネルギー衝突解離(HCD:higher-energy collisional dissociation)を備えたThermo Q Exactive Plus MSシステム上で実施される。
カルボン酸基標識に関する1つの実施形態では、GEE標識トリプシンペプチドの特定のために、LC-MS/MSデータは、例えばBYONIC(商標)(Protein Metrics社)などのソフトウェアを利用して、Asp残基とGlu残基に限定したGEE1(+85.0522)およびGEE2(+57.0209)の可変修飾を伴う対応mAbタンパク質配列を含有するデータベースまたはサーチエンジンに対して検索される。Asp/Glu残基を含有する各トリプシンペプチド上のGEE標識度を定量するために、GEE標識ペプチドと天然ペプチドの両方の最初のアイソトープピークのm/zに基づき、抽出イオンクロマトグラム(EIC:extracted ion chromatogram)を作成し、抽出ピーク面積を積分する。各GEE標識ペプチドの百分率は、対応するEICピーク面積を使用し、標識ペプチドと天然ペプチドのピーク面積の総計と比較して算出される。トリプシンペプチドが複数のAsp残基およびGlu残基を含有する場合には、異なる保持時間で溶出するGEE標識ペプチドを最初にMS/MSスペクトルに対して検証して標識部位を確認し、その後に対応するEICピーク面積を使用して、部位特異的な標識百分率を算出する。最後に、各トリプシンペプチドまたは残基に関して、GEE標識度を二量体分画と単量体分画の間で比較する。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。
式中、Ioxは、修飾ペプチドの強度であり(Met酸化は、非標識サンプルの操作の間に導入されたMetに対する酸化の可能性があるために除外された)、Iは、非修飾ペプチドの強度である。残基レベルでの酸化標識の定量的分析は、二量体と単量体の間の修飾度の差異をペプチドレベルで示すペプチド、およびMet残基を含有するペプチドに対しても実施される。ペプチド上の修飾部位は、MS2情報を割り当てられる。一部の実施形態では、MS2からの断片化情報が限定的であるために、またはペプチド異性体の共溶出による干渉があるために、一残基に対する修飾の部位決定が不可能であり、その場合、修飾は、可能性のある残基のセット上に存在すると示される。単量体分画よりも二量体分画で標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される。
1つの実施形態は、抗体の作製方法を提供するものであり、当該方法は、抗体を産生させるのに適した条件下で抗体を産生する細胞を培養する工程、抗体を抽出するのに適した条件下で抗体を精製する工程、抗体を安定化させるのに適した条件下で抗体と賦形剤を混合する工程、(i)細胞培養から、(ii)細胞培養から抗体を精製した後に、または(iii)精製抗体に賦形剤を添加した後に、抗体のサンプルを取得する工程、本明細書に開示されるシステムおよび方法を使用して抗体の二量体化インターフェースを特徴解析する工程、および抗体産生の条件を変更して、または抗体の二量体化インターフェースを改変して、非改変抗体と比較して二量体化および非共有結合性相互作用を減少させる工程、を含む。抗体産生条件の変更は、上記に解説されている。
方法
mAb-1の制限消化
IgG1アイソタイプであるmAb-1は、ネイティブ条件下でエンドプロテアーゼLysCにより、F(ab)断片とFc断片に消化された。最初にmAb-1二量体は、10mM Tris-HCl(pH7.5)中、1μg/μLに希釈され、その後、エンドプロテアーゼLys-Cとともに37℃で1時間インキュベートされた(タンパク質:酵素=400:1)。この制限消化処置により、2つのヒンジ領域ジスルフィド結合に対してN末端側にあるLys残基で重鎖が特異的に切断され、F(ab)断片とFc断片の両方が生成される。混合物中で、二量体種に由来する任意の非共有結合性の二量体相互作用(最も普遍的なものはF(ab)-F(ab))が維持される。
IgG4アイソタイプであるmAb-2は、ネイティブ条件下で化膿連鎖球菌(Streptocoocus pyogenes)由来のIdeS酵素であるFabRICATOR(登録商標)により、F(ab’)2断片とFc*断片へと消化された。最初にmAb-2二量体は、10mM Tris-HCl(pH8.0)中、1μg/μLに希釈され、その後、FabRICATOR(登録商標)で37℃にて1時間消化された(タンパク質1μgあたり、1IUBミリ単位)。この制限消化処置は、2つのヒンジ領域ジスルフィド結合に対してC末端側の部位の2つのGly残基の間で特異的に切断する。この処置によって、1つのF(ab’)2断片と、非共有結合性相互作用を介して相互に結合する2つの同一のFc/2断片(Fc*)が生じた。次いで消化混合物を5mMのジチオスレイトール(DTT)とともに37℃で30分間、インキュベートして、鎖間ジスルフィド結合を還元しながら、鎖内ジスルフィド結合は損なわずに維持される。結果として、Fab2断片は、2つのF(ab’)断片へと還元され、FdとLCは非共有結合性相互作用を介して相互に結合する。混合物中で、二量体種に由来する非共有結合性の二量体相互作用(最も普遍的なものはF(ab’)-F(ab’))もまた維持される。
カルボキシル基のフットプリンティングは、タンパク質の立体構造、および相互作用の研究に普遍的に使用されている共有結合性標識技術であり、Asp残基およびGlu残基の側鎖を、GEEで標識する。GEE標識反応において、タンパク質の表面に配置されたAsp残基およびGlu残基のカルボキシル基は容易に修飾される一方で、タンパク質構造の内部に埋もれた場合にはほとんど、または全く修飾を受けない。標識を行うために、100μLのmAb-1の消化サンプルを、50μLの0.2M 1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)および50μLの2Mグリシンエチルエステル塩酸塩(GEE:glycine ethyl ester hydrocholoride)と混合し、室温で1時間インキュベートした。500μLの1M Tris-HCl(pH8)を加えることでGEE標識反応をクエンチした後、Ultracel-10K遠心分離フィルターを使用した遠心分離により、サンプル溶液を約40μLに濃縮した。
FPOPは、確立されたヒドロキシルラジカル標識法であり、マイクロ秒の時間スケールでタンパク質をアミノ酸残基の側鎖で標識し、タンパク質-タンパク質/リガンドの相互作用の研究に広く適用されている。標識プロセスにおいて、上記の緩衝液交換済み混合液50μLは最初に1xPBSおよび濃縮His溶液およびH2O2ストック溶液と混合され、1mg/mLのmAb-2消化混合物、350μM His、および20mM H2O2を含有する100μLの最終溶液が作製された。H2O2は、FPOP用の管への溶液の注入の直前に添加された。100μLの気密シリンジ内にサンプルをロードし、レーザービームに面する中心に透明窓を備えた、150μm内径の石英ガラス管に連結されたシリンジポンプを介して導入した。KrFエキシマレーザーの出力は100~120mJ/パルスに調整され、そのパルス周波数は6Hzに設定された。サンプル管の透明窓でのレーザービームの幅は、3.0mmと測定された。パルスレーザーをオンにした後、サンプル溶液を23.86μL/分の流速で管内に注入し(管内径、レーザー周波数、および測定されたレーザービーム幅に従い調整された)、・OH曝露と反応の反復を回避するための20%の***量が確保された。キャピラリーのアウトフローは、20μLの100mM Metおよび2μLの1mg/mL カタラーゼを含有するバイアル中に集められ、残留H2O2が還元された。最後に、Ultracel-10K遠心フィルターを使用した遠心分離により標識サンプル溶液が約40μLに濃縮された。
共有結合性に標識されたサンプル混合物は、BEH(登録商標)SECカラム(300mmx4.6mm、200Å、1.7μm)上に0.2mL/分の流速で注入された。当該カラムは移動相(140mMの酢酸アンモニウムと10mMの重炭酸アンモニウム、pH7.4)で前もって平衡化された。SEC分離およびUV検出(280nm)の後、二量体断片および単量体断片が収集され、トリプシンペプチドマッピング分析が行われた。
トリプシン消化の前に、すべての二量体分画および単量体分画がSpeedVac中で乾燥され、8Mの尿素、5mMのジチオスレイトール(DTT)および0.1MのTris-HCl(pH7.5)を含有する溶液中で再構成され、50℃で30分間維持された。変性され、還元されたサンプルは、暗室において30分間、10mMのヨードアセトアミド(IAA:iodoacetamide)でアルキル化された。次いでサンプル溶液は、尿素濃度を0.8Mまで下げるために0.1MのTris-HCl(pH7.5)で10倍希釈され、1:20(w/w)の酵素:基質の比率で一晩、37℃で、トリプシンで消化された。その後、10%のFAを添加し、最終0.2%のFAを生成することで消化を停止させた。その後、各消化タンパク質サンプルの分注物(約5μg)は逆相UPLCで分離され、次いでオンライン質量分析が為されてペプチドの質量が決定され、ペプチドのアイデンティティが確認された。MSおよびMS/MS実験は、MS/MS実験中のペプチド断片化に採用される高エネルギー衝突解離(HCD:higher-energy collisional dissociation)を備えたThermo Q Exactive Plus MSシステム上で実施された。
カルボキシル(Carboxyl)基の標識
カルボン酸基標識について、GEE標識トリプシンペプチドを特定するために、Asp残基とGlu残基に限定したGEE1(+85.0522)およびGEE2(+57.0209)の可変修飾を伴う対応mAbタンパク質配列を含有するデータベースに対して、LC-MS/MSデータは検索された。Asp/Glu残基を含有する各トリプシンペプチド上のGEE標識度を定量するために、GEE標識ペプチドと天然ペプチドの両方の最初のアイソトープピークのm/zに基づき、抽出イオンクロマトグラム(EIC:extracted ion chromatogram)を作成し、抽出ピーク面積が積分された。各GEE標識ペプチドの百分率は、対応するEICピーク面積を使用し、標識ペプチドと天然ペプチドのピーク面積の総計と比較して算出された。トリプシンペプチドが複数のAsp残基およびGlu残基を含有する場合には、異なる保持時間で溶出するGEE標識ペプチドを最初にMS/MSスペクトルに対して検証して標識部位を確認し、その後に対応するEICピーク面積を使用して、部位特異的な標識百分率を算出した。最後に、各トリプシンペプチドまたは残基に関して、GEE標識度を二量体分画と単量体分画の間で比較した。単量体分画よりも二量体分画において標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される(図2、3Aおよび3B)。
FPOP標識について、LC-MS/MSデータは、すべて公知の酸化標識産物を含む対応mAbタンパク質配列を含有するデータベースに対して最初に検索され(表1)、すべての標識産物が特定された。ペプチド上の修飾部位は、MS/MS情報に基づき特定され、精密なm/zにより確認された。特定ペプチドに対する修飾度は、以下のように算出された:
式中、Ioxは、修飾ペプチドの強度であり(Met酸化は、非標識サンプルの操作の間に導入されたMetに対する酸化の可能性があるために除外された)、Iは、非修飾ペプチドの強度である。残基レベルでの酸化標識の定量的分析は、二量体と単量体の間の修飾度の差異をペプチドレベルで示したペプチド、およびMet残基を含有するペプチドに対しても実施された。ペプチド上の修飾部位は、MS2情報を割り当てられた。数例において、MS2からの断片化情報が限定的であるために、またはペプチド異性体の共溶出による干渉があるために、一残基に対する修飾の部位決定が不可能であり、その場合、修飾は、可能性のある残基のセット上に存在すると示された。サブドメインレベルで+0、+16、+32、+48などの標識種のポアソン分布は、過剰標識が発生していないことを示す(図4A~4C)。単量体分画よりも二量体分画において標識度の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していると推定される(図5Aおよび5B)。
方法:
実施例1のFPOPプロトコールに従った。プロトコールの様々な構成要素、すなわちレーザー位置、スカベンジャー濃度およびクエンチャーの含有を操作して、アッセイに対する影響を決定した。
表2は、図6Aおよび図6Bの実験パラメーターを示す。図6Aおよび図6Bに認められるように、位置とレーザー出力は、リゾチームタンパク質の標識効率に影響を与える。近接焦点位置および122mJのレーザー出力を含む、図6Bのパラメーターを使用して分析されたサンプル中の酸化種は、ポアソン分布に対し、+0、+16、+32...の状態生成品分布の優れた適合を示す。これは、標識効率の上昇を示す。
Claims (21)
- タンパク質医薬中の非共有結合性相互作用部位または二量体化インターフェースを特定するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
単量体と非共有結合性二量体とを含有するタンパク質医薬二量体サンプル混合物を形成させる条件下で、タンパク質医薬の酵素消化を行う、工程;
前記タンパク質医薬二量体サンプル混合物の前記二量体および前記単量体に、検出可能な修飾を導入して、修飾二量体および修飾単量体を生成する、工程であって、前記検出可能な修飾が、タンパク質の迅速光化学酸化により導入される、工程;
クロマトグラフィーを使用して前記修飾二量体および前記修飾単量体を、修飾二量体分画および修飾単量体分画へと分離させる、工程;
前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画を消化して、消化されたペプチドサンプルを形成させる、工程;
液体クロマトグラフィー/質量分析(LC-MS)を使用して前記消化されたペプチドサンプルを分離させ、前記消化されたペプチドサンプルの質量分析データを取得する、工程;および
前記タンパク質医薬の各ペプチドおよび修飾ペプチドの質量を算出することにより、前記タンパク質医薬の公知の質量データと比較された前記ペプチドの前記質量分析データを使用して、前記消化されたペプチドサンプル中の各ペプチドの修飾部位を決定する、工程であって、前記単量体分画と比較して前記二量体分画で標識の減少を示す領域は、二量体化インターフェースに関与している、または近接していることを示す、工程。 - 消化条件が、ポリペプチド間のジスルフィド結合、および二量体間の非共有結合性相互作用を保持する、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬が、抗体もしくはその抗原結合断片、組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記二量体が2つの相互作用するF(ab’)断片またはF(ab)断片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬が抗体であり、前記混合物中の前記単量体がF(ab)断片およびFc断片を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記修飾が、アミノ酸側鎖の修飾である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、二特異性抗体、またはその抗原結合断片である、請求項3に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが、酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムを含有する移動相を使用して実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記消化されたペプチドサンプルが、逆相液体クロマトグラフィーを用いて分離される、請求項1に記載の方法。
- 前記修飾が、酸化、二酸化、三酸化、キヌレニン、ジチオメチル、脱炭酸、ヒドロキシキヌレニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬が、パパイン、フィカイン、エンドプロテアーゼのLys-CおよびIdeS、またはそれらの改変型からなる群から選択される酵素で消化されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記修飾二量体分画および前記修飾単量体分画が、2つの連続アミノ酸残基を結合させる共有結合性化学結合を切断してペプチドを形成させる酵素により消化される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬サンプルが、流加培養、精製プロセスステップ、または製剤化原薬からのサンプルである、請求項1に記載の方法。
- タンパク質医薬を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
抗体を産生する細胞を、前記抗体を産生するのに適した条件下で細胞培養において培養する、工程;
前記抗体を、前記抗体を抽出するのに適した条件下で精製する、工程;
前記抗体と賦形剤を、前記抗体を安定化するのに適した条件下で混合する、工程;
(i)前記細胞培養から、(ii)前記細胞培養から前記抗体を精製した後に、または(iii)前記精製された抗体に賦形剤を添加した後に、前記抗体のサンプルを取得する、工程;
請求項1に記載の方法に従い、前記抗体の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程;および
1つもしくは複数の細胞培養、精製、または賦形剤の条件を変更して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させて、前記タンパク質医薬を作製する、工程。 - 二量体化または非共有結合性相互作用の量を減少させるために変更される前記1つまたは複数の条件が、pH、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子の濃度、撹拌、溶存酸素、金属イオン、ガス分圧、アフィニティマトリクス、クロマトグラフィー樹脂、緩衝剤、界面活性剤、安定剤またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えばCHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS細胞(例えば、COS-7)、網膜細胞、Vero細胞、CV1細胞、腎細胞(例えばHEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa細胞、HepG2細胞、WI38細胞、MRC 5細胞、Colo25細胞、HB 8065細胞、HL-60細胞、リンパ球細胞、例えば自己T細胞、Jurkat(Tリンパ球)またはDaudi(Bリンパ球)、A431(表皮)細胞、U937細胞、3T3細胞、L細胞、C127細胞、SP2/0細胞、NS-0細胞、MMT細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞のいずれかに由来する細胞株からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記細胞が、ハイブリドーマ細胞またはクアドローマ細胞である、請求項14に記載の方法。
- 請求項14に記載の方法により作製されるタンパク質医薬。
- タンパク質医薬を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
請求項1に記載の方法を使用して、抗体中の二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位を特徴解析する、工程;および
前記二量体化インターフェースまたは非共有結合性相互作用部位のアミノ酸を改変して、前記抗体の二量体化または非共有結合性相互作用を減少させる、工程。 - 請求項19に記載の方法により作製されるタンパク質医薬。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、請求項20に記載のタンパク質医薬。
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