CN117871866A - 用于表征蛋白质二聚化的***和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了在蛋白质的亚结构域水平上表征二聚化界面的***和方法。示例性方法包括将蛋白质二聚体样品消化成亚结构域、标记所述消化的蛋白质样品、分离标记的二聚体亚结构域片段和单体亚结构域片段以及对所述标记的样品进行肽作图以确定所述二聚体片段被标记的位置和所述二聚体片段未被标记的位置。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与所述二聚化界面有关或非常接近。

Description

用于表征蛋白质二聚化的***和方法
本申请是申请号为201980008061.3、申请日为2019年2月1日、发明名称为“用于表征蛋白质二聚化的***和方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2019/016278的国家阶段申请，该国际申请要求于2018年2月2日提交的美国临时专利申请No.62/625,732和于2018年9月28日提交的美国临时专利申请No.62/738,051的优先权，将这两个美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明整体涉及用于表征蛋白质及其片段中的非共价相互作用位点的分析方法和***。
背景技术
在过去的20年中，单克隆抗体(mAb)已经成功地用于靶向各种治疗领域(WalshG.,Nature biotechnology 2014；32:992-1000；Lawrence S.Nature biotechnology2007；25:380-2)。蛋白质聚集仍然是单克隆抗体和其他治疗性蛋白质制备中的主要问题。由于对效力和免疫原性的潜在影响，理解聚集机制非常重要，以使得可实施适当的控制策略来确保产品品质。
由于mAb二聚体的复杂性和异质性，对mAb分子中的二聚化界面进行作图仍然具有挑战性。尽管氢-氘交换质谱(HDX MS)已经成功地研究了蛋白质-蛋白质相互作用，但在揭示mAb二聚化界面方面几乎没有取得成功，这可能是由于检测蛋白质侧链相互作用的方法局限性。
因此，本发明的目的是提供用于对蛋白质的异质二聚化界面进行作图的***和方法。
本发明的另一个目的是提供二聚化水平降低的蛋白质药物产品。
本发明的另一个目的是提供制备二聚化减少的蛋白质药物产品的方法。
发明内容
本发明提供在蛋白质的肽/残基水平上表征蛋白质二聚化界面的***和方法。示例性方法包括将蛋白质二聚体样品消化成亚结构域，标记经消化的蛋白质样品混合物，分离标记的二聚体亚结构域片段和单体亚结构域片段，以及对标记的样品进行肽作图以确定并比较二聚体中和单体中的标记程度。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与二聚化界面有关或非常接近。
在一个实施方案中，分离非共价二聚体并通过肽作图分析以定位非共价相互作用位点。在用以在肽/残基水平上定位非共价二聚化界面的另一个实施方案中，将富集的mAb二聚体样品消化成F(ab)[或F(ab′)]同型二聚体、F(ab)[或F(ab′)]单体和Fc单体的混合物，并使其接受标记实验，随后进行分级分离、胰蛋白酶消化和LC-MS分析，用于肽/残基水平上的标记程度量化和比较。下文提供所公开的方法的步骤的更多细节。
另一个实施方案提供制备抗体的方法，包括以下步骤：在细胞培养物中培养产生所述抗体的细胞，从所述细胞培养物获得样品，根据上述方法表征所述抗体样品中的二聚化界面，以及修改所述细胞培养物的一种或多种培养条件以减少细胞培养期间所产生的抗体的二聚化或非共价相互作用/聚集的量。在一些实施方案中，在细胞培养期间以任一间隔采集样品。在其他实施方案中，在制备培养后、在蛋白质收获后或在纯化后采集样品。经改变以减少二聚化或聚集的量的一种或多种细胞培养条件可选自温度、pH、细胞密度、氨基酸浓度、渗透压、生长因子浓度、搅拌、气体分压、表面活性剂或它们的组合。所述细胞可为真核细胞或原核细胞。所述细胞可为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS细胞(如COS-7)、视网膜细胞、Vero细胞、CV1细胞、肾细胞(如HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa细胞、HepG2细胞、WI38细胞、MRC 5细胞、Colo25细胞、HB 8065细胞、HL-60细胞、诸如自体T细胞、Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)等的淋巴细胞、A431(表皮)细胞、U937细胞、3T3细胞、L细胞、C127细胞、SP2/0细胞、NS-0细胞、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞以及衍生自任一前述细胞的细胞系。在一个实施方案中，所述细胞是杂交瘤或四源杂交瘤(quadroma)细胞。
另一个实施方案提供制备抗体的方法，包括以下步骤：在细胞培养物中培养产生所述抗体的细胞，然后纯化并配制所述抗体以获得配制药物物质(FDS)，在配制所述抗体之前和/或之后获取所述纯化抗体的样品，根据上述方法表征所述抗体样品或FDS样品中的二聚化界面，以及修改所述抗体纯化或配制的一种或多种条件以减少细胞培养期间所产生的抗体的二聚化或非共价相互作用/聚集的量。经改变以减少二聚化或聚集的量的一种或多种抗体纯化条件可选自温度、pH、亲和基质、色谱树脂、缓冲液、过滤器或它们的组合。经改变以减少二聚化或聚集的量的一种或多种抗体配制条件可选自pH、抗体浓度、赋形剂浓度、缓冲液、表面活性剂、稳定剂或它们的任何组合。可改变FDS的一种或多种赋形剂以减少二聚化或聚集的量，并且所述赋形剂选自本领域已知赋形剂中的任一者。
另一个实施方案提供通过本文所述方法制备的抗体。
本文也提供用于提供经修饰的蛋白质药物产品的方法，所述经修饰的蛋白质药物产品相对于未修饰的蛋白质药物产品具有减少的二聚化或非共价相互作用。在一个实施方案中，蛋白质药物产品是单克隆抗体或其抗原结合片段。
附图说明
图1是用于mAb二聚化界面作图的示例性有限消化和单标记策略的工作流程图。
图2是所指示链/残基的甘氨酸乙酯盐酸盐(GEE)(单体-二聚体)的百分比图，其显示了由富集HMW样品的有限Lys-C消化产生的mAb-1 Fab二聚体与Fab单体之间的差异GEE标记图。
图3A是肽水平上所指示mAb-1抗体片段的GEE百分比的条形图。图3B是氨基酸残基水平上所指示mAb-2抗体片段的GEE百分比的条形图。
图4A-4C是散点图，显示了有限LysC消化的mAb1 HMW样品的氧化物质的泊松拟合(Poisson fitting)。图4A展示Fc区，图4B展示LC区，图4C展示Fd区。线条表示每个图的泊松拟合。
图5A是在mAb-1的肽水平上所指示片段的FPOP修饰程度的条形图。图5B是在mAb-1的残基水平上所指示片段的FPOP修饰程度的条形图。
图6A和6B是散点图，显示了在不同聚焦位置和激光功率条件下溶菌酶蛋白的氧化物质的泊松拟合。
图7A-7F是散点图，显示了在各种清除剂浓度(500μM、350μM或200μM His)和各种激光功率设置(97mJ或156mJ)下溶菌酶蛋白的氧化物质的泊松拟合。
图8A-8D是散点图，显示了在各种清除剂浓度(500μM或200μMHis)和各种蛋白质浓度(1mg/mL或0.1mg/mL)下溶菌酶蛋白的氧化物质的泊松拟合。
图9A-9B是散点图，显示了mAb1(图9A)或去糖基化mAb1(图9B)的氧化物质的泊松拟合。
具体实施方式
I.定义
在描述当前要求权利保护的本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“一个”、“一种”、“该(所述)”和类似指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且将每个单独的值并入本说明书中，就如同其在本文中单独引用一样。
术语“约”的使用旨在描述在大约+/-10％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，所述值的数值范围可以在大约+/-5％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，所述值的数值范围可以在大约+/-2％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，所述值的数值范围可以在大约+/-1％的范围内高于或低于所述值。前面的范围旨在通过上下文解释清楚，并且不暗示进一步的限制。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求权利保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。
“蛋白质”是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽，并且还可包括修饰，诸如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、烷基化、羟基化和ADP-核糖基化。蛋白质可以具有科学价值或商业价值，包括基于蛋白质的药物，并且蛋白质尤其包括酶、配体、受体、抗体和嵌合蛋白或融合蛋白。蛋白质是使用众所周知的细胞培养方法通过各种类型的重组细胞产生的，并且通常通过转染基因工程核苷酸载体(例如，诸如编码嵌合蛋白的序列，或者密码子优化的序列、无内含子序列等)被引入细胞中，其中载体可以作为附加体存在或被整合到细胞基因组中。
“抗体”是指由通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))组成的免疫球蛋白分子。每条重链具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。每条轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个VH/CH1和VL/CL链缔合(例如通过二硫键)而形成一对(或F(ab))，在其N末端具有抗原结合位点。因此，在有限酶消化后，F(ab)[或F(ab′)]片段是仍然与抗原结合的抗体片段，但是单价的，没有Fc部分。就抗原结合而言，抗体通常是二价的，因此包括通过上铰链中的二硫键连接在一起的被称为F(ab′)2的两个F(ab)部分。F(ab′)2片段是通过有限消化整个抗体以移除大部分Fc区同时保留完整的一些铰链区而产生，并且可进一步缩减为F(ab′)片段。术语“抗体”包括指任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体分子，诸如从经转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。术语抗体也包括双特异性抗体，其包括可结合至不止一个不同表位的异四聚免疫球蛋白。就每个抗原结合位点对不同抗原的特异性而言，二价抗体结构也可是双特异性的。双特异性抗体在美国专利申请公开No.2010/0331527中进行了一般性描述，该专利申请以引用方式并入本申请中。
“Fc融合蛋白”包含在自然界中原本不在一起的两种或更多种蛋白质的一部分或全部，其中一种是免疫球蛋白分子的Fc部分。包含与抗体衍生多肽的各种部分(包括Fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备已例如由以下进行描述：Ashkenazi等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.ScL USA)88:10535,1991；Byrn等人，《自然》(Nature)344:677，1990；和Hollenbaugh等人，“免疫球蛋白融合蛋白的构造(Construction ofImmunoglobulin Fusion Proteins)”，《免疫学实验室指南》(Current Protocols inImmunology)，增刊4，第10.19.1-10.19.11页，1992。“受体Fc融合蛋白”包含与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域，在一些实施方案中，所述Fc部分包含免疫球蛋白的铰链区、随后的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc融合蛋白包含结合至一种或多种配体的两条或更多条独特的受体链。例如，Fc融合蛋白是trap，诸如IL-1trap或VEGF trap。
“细胞培养”是指细胞在诸如烧瓶或生物反应器之类的容器中繁殖或增殖，并且包括但不限于补料分批培养、连续培养、灌流培养等。
术语“MS/MS”是指串联使用两个质谱仪的质谱技术。在两个分析仪(MS1和MS2)之间是碰撞气室。MS1选择的前体离子与室中的高压气体(通常是He)碰撞并经历片段化。
术语“LC-MS”是指液相色谱-质谱，其是将液相色谱(或HPLC)的物理分离能力与质谱(MS)的质量分析能力相结合的分析化学技术。
术语“保守氨基酸取代”是指用另一种具有相似性质的氨基酸替代一种氨基酸。预期此种类型的替代很少会导致相应蛋白质的功能障碍。
II.蛋白质药物产品
一个实施方案提供蛋白质药物产品，其已经过修饰以减少蛋白质药物产品的二聚化或非共价相互作用。所述修饰可是保守的氨基酸取代。在保守氨基酸取代中，一个氨基酸被交换成另一个具有相似性质的氨基酸。预期此种类型的替代很少会导致相应蛋白质的功能障碍。
A.所关注的蛋白质
在一个实施方案中，所述蛋白质药物产品可含有一种或多种适于在原核或真核细胞中表达的所关注的蛋白质。例如，所关注的蛋白质包括(但不限于)抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段、或细胞表面受体的胞外结构域或其片段。所关注的蛋白质可为由单个亚基组成的简单多肽或为由两个或更多个亚基组成的复杂多亚基蛋白质。所关注的蛋白质可是生物医药产品、食品添加剂或防腐剂或任何受纯化和质量标准约束的蛋白质产品。
在一些实施方案中，所述蛋白质产品(所关注的蛋白质)是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体或四链抗体、双特异性四价免疫球蛋白G样分子(被称为双可变结构域免疫球蛋白(DVD-IG))、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG2抗体。在一个实施方案中，所述抗体是IgG4抗体。在另一个实施方案中，所述抗体包含嵌合铰链。在其他实施方案中，所述抗体包含嵌合Fc。在一个实施方案中，所述抗体是嵌合IgG2/IgG4抗体。在一个实施方案中，所述抗体是嵌合IgG2/IgG1抗体。在一个实施方案中，所述抗体是嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。
在一些实施方案中，该抗体选自抗程序化细胞死亡1抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0203579A1中所述的抗PD1抗体)、抗程序化细胞死亡配体1(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0203580A1中所述的抗PD-L1抗体)、抗Dll4抗体、抗血管生成素2抗体(例如，如美国专利No.9,402,898中所述的抗ANG2抗体)、抗血管生成素样3抗体(例，如美国专利No.9,018,356中所述的抗AngPtl3抗体)、抗血小板衍生生长因子受体抗体(例如，如美国专利No.9,265,827中所述的抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，如美国专利No.9,302,015中所述的抗PRLR抗体)、抗补体5抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0313194A1中所述的抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利No.9,132,192中所述的抗EGFR抗体或如美国专利申请公开No.US2015/0259423A1中所述的抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin-9抗体(例如，如美国专利No.8,062,640或美国专利申请公开No.US2014/0044730A1中所述的抗PCSK9抗体)、抗生长和分化因子8抗体(例如，抗GDF8抗体，也称为抗肌生长抑制素抗体，如美国专利No.8,871,209或No.9,260,515中所述)、抗胰高血糖素受体(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0337045A1或No.US2016/0075778A1中所述的抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、白介素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2014/0271681A1或美国专利No.8,735,095或No.8,945,559中所述的抗IL4R抗体)、抗白介素6受体抗体(例如，如美国专利No.7,582,298、No.8,043,617或No.9,173,880中所述的抗IL6R抗体)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗白介素33(例如，如美国专利申请公开No.US2014/0271658A1或No.US2014/0271642A1中所述的抗IL33抗体)、抗呼吸道合胞病毒抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2014/0271653A1中所述的抗RSV抗体)、抗分化簇3(例如，如在美国专利申请公开No.US2014/0088295A1和No.US20150266966A1以及在美国申请No.62/222,605中所述的抗CD3抗体)、抗分化簇20(例如，如美国专利申请公开No.US2014/0088295A1和No.US20150266966A1以及在美国专利No.7,879,984中所述的抗CD20)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇48(例如，如美国专利No.9,228,014中所述的抗CD48抗体)、抗Fel d1抗体(例如，如美国专利No.9,079,948中所述)、抗中东呼吸综合征病毒(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0337029A1中所述抗MERS抗体)、抗埃博拉病毒抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2016/0215040中所述)、抗塞卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如，抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2016/0017029以及美国专利No.8,309,088和No.9,353,176中所述的抗NGF抗体)和抗激活素A抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体选自抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利申请公开No.US2014/0088295A1和No.US20150266966A1中所述)、抗CD3×抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗CD3×抗Muc16双特异性抗体)和抗CD3×抗***特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在一些实施方案中，所关注的蛋白质选自阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-atto(adalimumab-atto)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝洛托单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、康纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、PEG化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、得瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗(emicizumab-kxwh)、厄塔毒素-阿利珠单抗偶联物(emtansinealirocumab)、依维库人单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、fasinumab、戈利木单抗(golimumab)、塞库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-abda(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊西贝单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、雷珠单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥必托昔单抗(obiltoxaximab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、塞库单抗(secukinumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、塔西单抗(tocilizumab)、塔西单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、特伐单抗(trevogrumab)、乌司他单抗(ustekinumab)和维多珠单抗(vedolizumab)。
在一些实施方案中，所关注的蛋白质是含有Fc部分和另一个结构域的重组蛋白质(例如Fc融合蛋白)。在一些实施方案中，Fc融合蛋白是受体Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域。在一些实施方案中，所述Fc部分包含IgG的铰链区、随后的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，所述受体Fc融合蛋白含有结合至单种配体或多种配体的两条或更多条独特的受体链。例如，Fc融合蛋白是TRAP蛋白，诸如例如IL-1trap(例如，rilonacept，其含有与融合至hIgG1的Fc的Il-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区；参见美国专利No.6,927,004，该专利全文以引用的方式并入本文)或VEGF trap(例如，aflibercept或ziv-aflibercept，其包含与融合至hIgG1的Fc的VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flk1的Ig结构域2；参见美国专利No.7,087,411和No.7,279,159)。在其他实施方案中，Fc融合蛋白是ScFv-Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合结构域(诸如可变重链片段和可变轻链片段)中的一者或多者。
B.制备蛋白质的方法
在一个实施方案中，所述蛋白质药物产品以补料分批细胞培养制备。在蛋白质制备中，“补料分批细胞培养”或“补料分批培养”是指分批培养，其中在最初将细胞和培养基供应至培养容器，并且在培养期间将另外的培养营养物以不连续的增量缓慢地供料至培养物，在终止培养之前进行或不进行定期的细胞和/或产物收获。补料分批培养包括“半连续补料分批培养”，其中定期移出整个培养物(可能包括细胞和培养基)并用新鲜培养基代替。补料分批培养不同于简单的“分批培养”，而在分批培养中用于细胞培养的所有组分(包括动物细胞和所有培养营养物)都在培养过程的开始就提供至培养容器。只要在标准补料分批过程中未从培养容器中移出上清液，补料分批培养即可与“灌流培养”不同，而在灌流培养中，通过例如过滤将细胞限制在培养物中，并连续或间歇地将培养基引入培养容器并从培养容器移出。但是，设想了在补料分批细胞培养过程中移出样品以用于测试目的。所述补料分批过程持续进行直至确定达到最大工作体积和/或蛋白质产量，随后收获蛋白质。
一个实施方案提供以连续细胞培养制备的蛋白质药物产品。短语“连续细胞培养”涉及一种用于连续培养细胞(通常是处于特定生长期)的技术。例如，如果需要持续供应细胞，或者需要制备所关注的特定蛋白质，则细胞培养物可能需要维持在特定的生长期。因此，必须连续地监测并相应地调节条件，以将细胞维持在该特定生长期。
用于制备所述蛋白质药物产品的细胞培养物包括细胞培养基。术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于培养哺乳动物细胞的营养液，其通常提供必要的营养以增强细胞的生长，诸如碳水化合物能源、必需氨基酸(如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸)和非必需氨基酸(如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)、痕量元素、能源、脂质、维生素等。细胞培养基可含有提取物，例如血清或蛋白胨(水解产物)，其可提供支持细胞生长的原料。培养基可含有源自酵母的提取物或大豆提取物，而不是源自动物的提取物。化学限定培养基是指其中所有化学组分均已知(即具有已知化学结构)的细胞培养基。化学限定培养基完全不含源于动物的组分，诸如源于血清或源于动物的蛋白胨。在一个实施方案中，所述培养基是化学限定培养基。
该溶液还可以含有增强生长和/或存活率高于最低速率的组分，包括激素和生长因子。可以将该溶液配制成对于所培养的特定细胞的存活和增殖而言最佳的pH和盐浓度。
“细胞系”是指通过细胞的连续传代或继代培养而衍生自特定谱系的一个或多个细胞。术语“细胞”可与“细胞群体”互换使用。
术语“细胞”包括适合于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的细胞，诸如细菌细胞、哺乳动物细胞、人细胞、非人动物细胞、禽细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细胞融合物，诸如例如杂交瘤或四源杂交瘤。在某些实施方案中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其他实施方案中，所述细胞选自以下细胞：中国仓鼠卵巢(CHO)(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)细胞、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、例如Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)等的淋巴细胞、A431(表皮细胞)、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞和源自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，所述细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如细胞)。在一些实施方案中，所述细胞是CHO细胞。在其他实施方案中，所述细胞是CHO K1细胞。
纯化蛋白质的方法为本领域所熟知。在细胞培养和蛋白质收获之后，可使所述药物产品接受许多纯化步骤以移除与细胞培养过程相关的杂质，包括宿主细胞蛋白质和所述药物产品的异常形式。色谱的形式为本领域所熟知的，诸如“亲和色谱”，其是利用蛋白质之间特异性的、可逆的相互作用而非蛋白质的一般性质(诸如等电点、疏水性或大小)来实现色谱分离的色谱方法。“蛋白质A亲和色谱”或“蛋白质A色谱”是指利用蛋白质A的IgG结合结构域对免疫球蛋白分子Fc部分的亲和力的特异性亲和色谱方法。该Fc部分包含人或动物免疫球蛋白恒定结构域CH2和CH3或与这些结构域基本上类似的免疫球蛋白结构域。其他形式的色谱或分离技术包括(但不限于)：蛋白质G亲和色谱、His标签亲和色谱、离子交换(弱阳离子、弱阴离子、强阳离子、强阴离子)色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、正相色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱。每种技术都需要优化合适的条件，包括(但不限于)树脂电荷和大小、洗涤条件、pH、上样体积、上样浓度等等。纯化过程还可以想到超滤和透滤技术。
配制蛋白质的方法为本领域所熟知。本发明的药物产品包括包含本发明的抗原结合分子(例如抗体)的液体药物组合物。本发明的药物组合物与合适的载剂、赋形剂和提供改善的转移、递送、耐受性等的其他试剂一起配制。在所有药物化学家已知的处方集中可找到大量合适的配方：Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA(《雷明顿制药科学》，麦克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿市)。例如，赋形剂可包括稳定剂、缓冲剂、调渗剂(tonicifier)、表面活性剂、有机溶剂、盐或它们的组合。在一些实施方案中，所述稳定剂选自多元醇、糖、氨基酸、非离子表面活性剂以及它们的组合。在一些实施方案中，所述调渗剂选自糖、氨基酸、盐以及它们的组合。在一些实施方案中，所述药物产品是药物产品的液体制剂或重构冻干制剂。在一些实施方案中，所述药物产品是包含两种或更多种不同抗体的共制剂。
III.用于表征蛋白质中的二聚化界面的方法
蛋白质聚集仍然是单克隆抗体制备中的主要问题。由于对纯度、效力和免疫原性的潜在影响，理解聚集机制非常重要，以使得可实施适当的控制策略来确保产品品质。由于mAb二聚体的复杂性和异质性，对mAb分子中的二聚化界面进行作图仍然具有挑战性。尽管氢-氘交换质谱(HDX MS)已经成功地研究了蛋白质-蛋白质相互作用，但在揭示mAb二聚化界面方面几乎没有取得成功，这可能是由于检测蛋白质侧链相互作用的方法局限性。
为了克服这些障碍，提供了新的***和方法，用于通过基于MS的综合方法成功地对蛋白质的异质二聚化界面(共价和非共价)进行作图。图1提供二聚化界面作图的示例性策略。该蛋白质可为抗体或其抗原结合片段、重组蛋白或融合蛋白。
A.表征非共价相互作用位点的方法
一个实施方案提供在蛋白质的肽/残基水平上确定二聚化界面的方法。示例性方法包括将蛋白质二聚体样品消化成亚结构域，标记经消化的蛋白质样品混合物，分离标记的二聚体亚结构域片段和单体亚结构域片段，以及对标记的样品进行肽作图以确定并比较二聚体中和单体中的标记程度。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与二聚化界面有关或非常接近。
在一个实施方案中，分离肽并通过肽作图分析以定位非共价相互作用位点。在用以在肽/残基水平上定位非共价二聚化界面的另一个实施方案中，将富集的mAb二聚体样品消化成F(ab)[或F(ab′)]同型二聚体、F(ab)[或F(ab′)]单体和Fc单体的混合物，然后使其接受共价标记实验，随后进行SEC分级分离、胰蛋白酶消化和LC-MS分析，用于肽/残基水平上的标记程度量化和比较。在用以在肽/残基水平上定位非共价二聚化界面的另一个实施方案中，将富集的mAb二聚体样品消化成F(ab)[或F(ab′)]同型二聚体、F(ab)[或F(ab′)]单体和Fc单体的混合物，然后使其接受单一FPOP(蛋白质的快速光化学氧化)标记实验，随后进行SEC分级分离、胰蛋白酶消化和LC-MS分析，用于肽/残基水平上的标记程度量化和比较。下文提供所公开的方法的步骤的更多细节。
1.蛋白质二聚体的片段化
在一个实施方案中，从细胞培养物获得蛋白质药物产品，例如抗体，并富集二聚体以提供富集的二聚体样品。富集的二聚体样品可使用多种富集技术(包括但不限于液相色谱)制备。优选的液相色谱技术包括(但不限于)尺寸排阻色谱。在一些实施方案中，富集的二聚体样品含有除二聚体以外的一些蛋白质聚集体。因此，富集的二聚体样品不需要仅由二聚体构成。在一个实施方案中，富集的二聚体样品含有超过50％的二聚体。
可使用通常称为有限消化的常规技术(包括化学技术和酶技术)来完成蛋白质产品的片段化或消化，例如用以保持形成mAb二聚体的非共价相互作用。在一个实施方案中，使用蛋白酶在原生条件下消化mAb二聚体样品，以产生各种Fab片段和Fc片段，例如F(ab)同型二聚体、F(ab)单体和Fc单体的混合物。示例性的蛋白酶是内切蛋白酶LysC。其他蛋白酶包括木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶。在一个实施方案中，可将mAb二聚体稀释于10mM Tris-HCl(pH 7.5)中，然后与内切蛋白酶Lys-C(蛋白质:酶＝400:1)一起温育。这种有限消化处理特异性地在两个铰链区二硫键N末端的Lys残基处裂解重链，从而导致产生Fab片段和Fc片段。来自二聚体物质的任何非共价二聚体相互作用(最常见为F(ab)-F(ab))在混合物中得以维持。
在另一个实施方案中，在原生条件下，使用以名称出售的IdeS蛋白酶将mAb二聚体样品消化成F(ab′)2片段和Fc*片段(即两个通过非共价相互作用相互作用的Fc多肽，在本文中称为Fc单体)。首先可将mAb二聚体稀释于10mM Tris-HCl(pH 8.0)中，然后用/>(1IUB毫单位/1μg蛋白质)消化。这种有限消化处理特异性地在两个Gly残基之间(两个铰链区二硫键的C末端的位点)裂解。这种处理可导致生成一个F(ab′)2片段和通过非共价相互作用结合在一起的两个相同的Fc/2片段(Fc*)。然后可将消化混合物与还原剂一起温育，该还原剂可还原链间二硫键而同时保持链内二硫键完整。因此，F(ab′)2片段被还原成两个F(ab′)片段，而Fd和LC通过非共价相互作用结合在一起。来自二聚体物质的非共价二聚体相互作用(最常见为F(ab′)-F(ab′))也保持在混合物中。
可使用的示例性还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT，CAS 3483-12-3)、β-巯基乙醇(BME、2BME、2-ME、b-mer，CAS 60-24-2)、2-胺基乙烷硫醇(2-MEA-HCl，也称为半胱胺-HCl，CAS156-57-0)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，CAS 5961-85-3)、半胱氨酸盐酸盐(Cys-HCl，CAS52-89-1)或2-巯基乙烷磺酸钠盐(MESNA)。用于还原蛋白质键的其他方法为本领域已知，诸如含有树脂的固定化还原剂柱，基于硫醇的还原剂已经固定至该树脂上，以实现肽和蛋白质二硫键的固相还原。还设想适用于还原多肽之间的化学相互作用的还原剂，包括氧化剂。
2.标记蛋白质片段
i.羧基标记
在一个实施方案中，使用羧基标记来标记消化的mAb样品。羧基足迹法是一种常用的共价标记技术，用以通过用甘氨酸乙酯盐酸盐(GEE)标记Asp和Glu残基的侧链来研究蛋白质构象和相互作用。在GEE标记反应中，位于蛋白质表面的Asp和Glu残基的羧基容易被修饰，而埋藏在蛋白质结构内部的羧基则发生较少或甚至没有修饰。在一个实施方案中，可将消化的样品与0.2M 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2M GEE混合，并在室温下温育1小时。可通过添加1M Tris-HCl(pH 8)淬灭GEE标记反应。在一个实施方案中，然后可浓缩样品溶液。浓缩样品的方法为本领域所熟知。示例性方法包括(但不限于)膜渗析、沉淀或盐析、纤维素膜浓缩器和离心。在一优选的实施方案中，通过使用例如Ultracel-10K离心过滤器离心来浓缩样品。
ii.蛋白质的快速光化学氧化(FPOP)
在一个实施方案中，使用FPOP来标记消化的mAb样品。FPOP是一种成熟的羟基自由基标记方法，其以μs时间尺度在氨基酸残基侧链上标记蛋白质，并已广泛应用于研究蛋白质-蛋白质/配体相互作用。在一个实施方案中，将含有mAb片段和非共价连接片段二聚体的经消化mAb二聚体缓冲液交换至合适的缓冲液(例如PBS(pH7.4))中。缓冲液交换可能是必要的，因为淬灭剂与OH自由基快速反应，应在标记过程中加以避免。常见的淬灭剂包括(但不限于)诸如Tris-HCl的某些缓冲溶液和诸如甘油和DTT的化学品。
·OH标记可引起蛋白质天然构象的构象变化。在一个实施方案中，可将清除剂用于控制OH自由基寿命使得蛋白质不会被过度标记，从而确保捕集天然构象，而非构象发生变化的过度标记蛋白质。可使用的示例性清除剂包括(但不限于)Cys、Trp、Tyr、Met、His、Phe、Arg、Ile、Leu、Val、Pro、Gln、Thr和Lys。在优选的实施方案中，所述清除剂是His。可首先将经缓冲液交换的混合物与PBS和浓缩清除剂溶液以及H2O2储备溶液混合。His可以200-500μM的浓度添加。His浓度可为200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500μM。示例性混合物含有1mg/mL mAb消化混合物、350μM His和20mM H2O2，以制成最终100μL溶液。在一个实施方案中，可在刚好将溶液注入FPOP管之前添加H2O2。
蛋白质的氧化标记可通过泊松分布对未经修饰的物质、+16Da物质、+32Da物质和+48Da物质的强度建模来监测。可检验氧添加状态分布值与泊松分布的拟合优度。在一个实施方案中，未拟合至预测泊松分布的数据指示蛋白质过度标记。或者，若数据拟合至泊松模型，则有足够的标记而无蛋白质过度标记。
在一个实施方案中，可将样品装载至100μL气密注射器中，并经由偶联至150μm内径熔融石英管子的注射器泵引入。该管子可在面向激光束的中心有一个透明的窗口。激光器可以是准分子激光器，例如KrF准分子激光器。可使用任何市售的准分子激光器，例如COMPex 50激光器(Coherent公司(Coherent Inc.))。KrF准分子激光功率可在约100与150mJ/脉冲之间。在一优选的实施方案中，激光功率可在约100与120mJ/脉冲之间。激光器的脉冲频率可设置为6Hz。透明样品管窗口处的激光束宽度可为约1.5mm至3.0mm。激光宽度可为1.5mm、1.75mm、2mm、2.25mm、2.5mm、2.75mm或3mm。激光功率可随时间推移而波动。因此，在一个实施方案中，同一组标记实验可在同一天进行，以获得最大的标记一致性。在另一个实施方案中，可添加剂量计来监测每次运行之间的标记效率波动。
打开脉冲激光器后，可将样品溶液注入管子中，例如流速为23.86μL/min。流速可根据管子内径、激光频率和测量的激光束宽度进行调节。流速应足以确保20％的排除体积，以避免重复的·OH暴露和反应。在一个实施方案中，可将毛细管流出物收集至含有溶液的小瓶中，以还原残余H2O2。残余H2O2的还原可使用还原剂、抗氧化剂或它们的组合来实现。示例性的非酶抗氧化剂包括(但不限于)维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、胡萝卜素、牛磺酸、亚牛磺酸、谷胱甘肽、硒、锌、甲硫氨酸和泛醌。酶抗氧化剂包括(但不限于)SOD、过氧化氢酶、谷氧还蛋白和谷胱甘肽还原酶。在一优选的实施方案中，还原残余H2O2的溶液含有甲硫氨酸和过氧化氢酶。标记的样品流出溶液可通过离心(例如使用ultracel-10K离心过滤器)浓缩。
iii.标记的mAb片段二聚体和单体的分离
在一个实施方案中，可使用尺寸排阻色谱(例如SEC柱)分离共价标记的样品混合物。在SEC分离和UV检测(280nm)后，可收集二聚体片段和单体片段用于胰蛋白酶切肽作图分析。
应理解，所公开的方法不限于如本文所呈现的分级分离(有限消化)和标记的任何特定步骤顺序。
iv.标记的二聚体片段的肽作图
在一个实施方案中，可使二聚体级分和单体级分接受胰蛋白酶切肽作图。胰蛋白酶切肽作图的方法为本领域已知。在一个实施方案中，可将二聚体级分和单体级分(例如在SpeedVac中)干燥，并在胰蛋白酶切肽作图之前在含有8M尿素、5mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1MTris-HCl(pH 7.5)的溶液中重构。可将变性和还原的样品在暗处用10mM碘乙酰胺(IAA)烷基化30分钟。然后可用0.1M Tris-HCl(pH 7.5)稀释样品溶液以降低尿素浓度，并在37℃下用胰蛋白酶以1:20(w/w)的酶与底物比消化过夜。可通过向每份消化的蛋白质样品添加10％甲酸(FA)来终止消化。然后可通过反相UPLC分离样品，随后进行在线质谱分析，以确定肽质量并确认肽身份。在一个实施方案中，MS和MS/MS实验是在Thermo Q ExactivePlus MS***上进行，该***在MS/MS实验期间采用高能碰撞解离(HCD)进行肽片段化。
v.二聚化界面的鉴别和表征
在羧基标记的一个实施方案中，为了鉴别GEE标记的胰蛋白酶切肽，例如利用诸如BYONICTM(Protein Metrics)之类的软件针对含有相应mAb蛋白质序列的数据库或搜索引擎搜索LC-MS/MS数据，所述相应mAb蛋白质序列具有局限于Asp和Glu残基的GEE1(+85.0522)和GEE2(+57.0209)的可变修饰。为了量化含有Asp/Glu残基的每个胰蛋白酶切肽上的GEE标记程度，生成了基于GEE标记肽和天然肽二者的第一同位素峰的m/z的提取离子色谱图(EIC)，并对提取峰面积进行积分。使用相对于标记肽和天然肽的峰面积之和的相应EIC峰面积来计算每种GEE标记肽的百分比。在含有多个Asp和Glu残基的胰蛋白酶切肽的情形下，首先检查在不同保留时间洗脱的GEE标记肽的MS/MS谱以确认标记位点，然后使用相应的EIC峰面积计算位点特异性标记百分比。最后，比较二聚体级分与单体级分之间每种胰蛋白酶切肽或残基的GEE标记程度。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与二聚化界面有关或非常接近。
在FPOP标记的一个实施方案中，首先针对含有具有所有已知氧化标记产物的相应mAb蛋白质序列(表1)的数据库搜索LC-MS/MS数据，以鉴别所有标记产物/肽。基于MS/MS信息鉴别该肽上的修饰位点，并通过精确的m/z进行确认，并且某个肽的修饰程度计算为：其中Iox是修饰肽的强度(由于在非标记样品处理期间引入的Met上可能发生氧化而排除Met氧化)，且I是未修饰肽的强度。还对二聚体与单体在肽水平上显示出修饰程度不同的肽以及含有Met残基的肽在残基水平上进行了氧化标记的定量分析。肽上的修饰位点分配有MS2信息。在一些实施方案中，倘若由于来自MS2的碎片信息有限或存在肽异构体共洗脱的干扰而无法定位对单个残基的修饰，则指示修饰发生在一组可能的残基上。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与二聚化界面有关或非常接近。
一个实施方案提供通过以下步骤来鉴别蛋白质药物产品中的非共价相互作用位点或二聚化界面的方法：在原生有限消化条件下消化蛋白质药物产品的富集二聚体样品以形成含有非共价连接的二聚体亚结构域(如F(ab)二聚体)和单体亚结构域的蛋白质药物混合物样品，并将可检测的修饰引入所述蛋白质药物混合物样品的二聚体和单体中以产生经修饰的二聚体和经修饰的单体。该方法包括使用原生尺寸排阻色谱将经修饰的二聚体和经修饰的单体分离成经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分，并消化经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分的大量肽键以形成消化的肽样品。该方法也包括使用液相色谱/质谱分析消化的肽样品以获得消化的肽样品的质谱数据，并使用消化的肽的质谱数据与具有引入蛋白质药物产品中的特定残基修饰的蛋白质药物产品的已知质谱数据进行比较来确定消化的肽样品中消化肽的修饰位点。
在一个实施方案中，通过快速光化学氧化来修饰二聚体和单体，以使可检测到的氧化修饰形成于二聚体和单体中。修饰可为氨基酸侧链修饰。
如上所述，蛋白质药物产品可为抗体或其抗原结合片段、重组蛋白、融合蛋白或它们的组合。优选的蛋白质药物产品是单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，使用包含乙酸铵和碳酸氢铵的流动相进行原生尺寸排阻色谱。在另一个实施方案中，用反相液相色谱分离消化的蛋白质样品。
在一个实施方案中，修饰选自氧化、二氧化、三氧化、犬尿氨酸、脱硫甲基(dithiomethyl)、脱羧化、羟基犬尿氨酸(hydrozykynurenin)以及它们的组合。
通常，所述蛋白质药物产品是用酶消化，例如用蛋白酶消化。有限消化所利用的示例性蛋白酶包括(但不限于)木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、内切蛋白酶Lys-C和IdeS。用于肽键消化以形成大量肽的示例性蛋白酶包括(但不限于)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和rLys-C。
在一些实施方案中，蛋白质药物产品样品来自补料分批培养。
B.制备非共价相互作用或聚集减少的蛋白质药物产品的方法
一个实施方案提供制备抗体的方法，包括以下步骤：在合适的条件下培养产生抗体的细胞以产生抗体；在合适的条件下纯化该抗体以提取抗体；在合适的条件下将所述抗体与赋形剂混合以稳定抗体；i)从细胞培养物获得该抗体的样品、ii)在从细胞培养物纯化所述抗体后获得所述抗体的样品或iii)在将赋形剂添加至经纯化抗体后；使用本文所公开的***和方法表征所述抗体中的二聚化界面，并修改制备抗体的条件或修饰抗体的二聚化界面，以相对于未修饰的抗体具有减少的二聚化和非共价相互作用。上文解释了修改制备抗体的条件。
在一个实施方案中，所述修饰可为二聚化界面的保守氨基酸取代或化学修饰。
本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。
实施方案1.一种用于鉴别蛋白质药物产品中的非共价相互作用位点或二聚化界面的方法，包括：
在原生条件下采用对蛋白质药物产品的有限消化以形成包含单体和非共价连接的二聚体的蛋白质药物二聚体样品混合物；
将可检测的修饰引入所述蛋白质药物二聚体样品混合物的所述二聚体和单体中以产生经修饰的二聚体和经修饰的单体；
使用原生尺寸排除色谱将所述经修饰的二聚体和经修饰的单体分离成经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分；
消化所述经修饰的二聚体级分和所述经修饰的单体级分以形成肽样品；
使用液相色谱/质谱(LC-MS)分离所述肽样品以获得所述肽样品的质谱数据；
通过计算所述蛋白质药物产品的每种肽和经修饰肽的质量，使用所述肽的所述质谱数据与所述蛋白质药物产品的已知质量数据进行比较，确定所述肽样品中的每种肽的修饰位点。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中原生有限消化条件可保留多肽之间的二硫键和二聚体之间的非共价相互作用。
实施方案3.根据实施方案1或2所述的方法，其中通过快速光化学氧化来修饰所述二聚体和单体以使可检测的氧化修饰形成于所述二聚体和单体中。
实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品包含抗体或其抗原结合片段、重组蛋白、融合蛋白或它们的组合。
实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品是抗体，并且所述混合物中的所述二聚体基本上由两个相互作用的F(ab’)或F(ab)片段组成。
实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品是抗体，并且所述混合物中的所述单体基本上由F(ab)片段和Fc片段组成。
实施方案7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述修饰是氨基酸侧链修饰。
实施方案8.根据实施方案4-7中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体或它们的抗原结合片段。
实施方案9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中使用包含乙酸铵和碳酸氢铵的流动相进行所述原生尺寸排阻色谱。
实施方案10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中使用反相液相色谱分离所述消化的蛋白质样品。
实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述修饰选自氧化、二氧化、三氧化、犬尿氨酸、脱硫甲基、脱羧化、羟基犬尿氨酸以及它们的组合。
实施方案12.根据实施方案1或2所述的方法，其中用酶消化所述蛋白质药物产品。
实施方案13.根据实施方案12所述的方法，其中所述酶选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、内切蛋白酶Lys-C和IdeS或它们的经修饰形式。
实施方案14.根据实施方案1所述的方法，其中所述经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分是通过可破坏连接两个连续氨基酸残基的共价化学键的酶消化而形成肽。
实施方案15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品样品来自补料分批培养物、纯化处理步骤或配制药物物质。
实施方案16.一种制备抗体的方法，包括：
在合适的条件下在细胞培养物中培养产生所述抗体的细胞以产生所述抗体；
在合适的条件下纯化所述抗体以提取所述抗体；
在合适的条件下将所述抗体与赋形剂混合以稳定所述抗体；
i)从所述细胞培养物获得所述抗体的样品、ii)在从所述细胞培养物纯化所述抗体后获得所述抗体的样品或iii)在将赋形剂添加至所述经纯化抗体后获得所述抗体的样品；
根据实施方案1-15中任一项所述的方法表征所述抗体的二聚化界面或非共价相互作用位点，以及
修改一种或多种细胞培养、纯化或赋形剂条件以减少所述抗体的二聚化或非共价相互作用的量。
实施方案17.根据实施方案16所述的方法，其中经改变以减少二聚化或非共价相互作用的量的所述一种或多种条件选自pH、细胞密度、氨基酸浓度、渗透压、生长因子浓度、搅拌、溶解氧、金属离子、气体分压、亲和基质、色谱树脂、缓冲液、表面活性剂、稳定剂或它们的组合。
实施方案18.根据实施方案16或17所述的方法，其中所述细胞选自细菌细胞、酵母细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS细胞(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero细胞、CV1细胞、肾细胞(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa细胞、HepG2细胞、WI38细胞、MRC 5细胞、Colo25细胞、HB 8065细胞、HL-60细胞、如自体T细胞、Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)等的淋巴细胞、A431(表皮)细胞、U937细胞、3T3细胞、L细胞、C127细胞、SP2/0细胞、NS-0细胞、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞以及衍生自任一前述细胞的细胞系。
实施方案19.根据实施方案16或17所述的方法，其中所述细胞是杂交瘤细胞或四源杂交瘤细胞。
实施方案20.一种抗体，所述抗体通过根据实施方案12至15中任一项所述的方法制备。
实施方案21.一种制备经修饰抗体的方法，包括：
使用根据实施方案1-15中任一项所述的方法表征所述抗体中的二聚化界面或非共价相互作用位点，以及
修饰所述二聚化界面或非共价相互作用位点中的氨基酸以减少所述抗体的二聚化或非共价相互作用。
实施方案22.根据实施方案21所述的经修饰的抗体。
实施方案23.根据实施方案21或22所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段。
实施例
实施例1：通过共价标记对二聚体和单体混合物进行单标记
方法
mAb-1的有限消化
将mAb-1(IgG1同种型)在原生条件下用内切蛋白酶LysC消化成F(ab)片段和Fc片段。首先将mAb-1二聚体在10mM Tris-HCl(pH7.5)中稀释至1μg/μL，然后与内切蛋白酶Lys-C(蛋白质:酶＝400:1)在37℃温育1小时。这种有限消化处理特异性地在两个铰链区二硫键N末端的Lys残基处裂解重链，从而导致产生Fab片段和Fc片段二者。来自二聚体物质的任何非共价二聚体相互作用(最常见为F(ab)-F(ab))在混合物中得以维持。
mAb-2的有限消化
在将mAb-2(IgG4同种型)在原生条件下用(来自酿脓链球菌(Streptocoocus pyogenes)的IdeS酶)消化成F(ab′)2和Fc*片段。首先将mAb-2二聚体在10mM Tris-HCl(pH 8.0)中稀释至1μg/μL，然后用/>(1IUB毫单位/1μg蛋白质)在37℃下消化1小时。这种有限消化处理特异性地在两个Gly残基之间(两个铰链区二硫键的C末端的位点)裂解。这种处理导致生成一个F(ab′)2片段和通过非共价相互作用结合在一起的两个相同的Fc/2片段(Fc*)。然后将消化混合物与5mM的二硫苏糖醇(DTT)在37℃下一起温育30分钟，还原链间二硫键而同时保持链内二硫键完整。因此，Fab2片段被还原成两个F(ab′)片段，而Fd和LC经由非共价相互作用结合在一起。来自二聚体物质的非共价二聚体相互作用(最常见为F(ab′)-F(ab′))也保持在混合物中。
上述产生的mAb片段和非共价连接片段二聚体的混合物首先缓冲液交换到1×PBS(pH 7.4)中至约2mg/mL。
羧基标记
羧基足迹法是一种常用的共价标记技术，用以通过用GEE标记Asp和Glu残基的侧链来研究蛋白质构象和相互作用。在GEE标记反应中，位于蛋白质表面的Asp和Glu残基的羧基容易被修饰，而埋藏在蛋白质结构内部的羧基则发生较少或甚至没有修饰。为了进行标记，将100μL消化的mAb-1样品与50μL 0.2M 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和50μL 2M甘氨酸乙酯盐酸盐(GEE)混合，并在室温下温育1小时。通过添加500μL1M Tris-HCl(pH 8)淬灭GEE标记反应后，通过使用Ultracel-10K离心过滤器离心将样品溶液浓缩至约40μL。
蛋白质的快速光化学氧化(FPOP)
FPOP是一种成熟的羟基自由基标记方法，其以μs时间尺度在氨基酸残基侧链上标记蛋白质，并已广泛应用于研究蛋白质-蛋白质/配体相互作用。在标记过程中，首先将50μL上述缓冲液交换混合物与1×PBS及浓缩His溶液和H2O2储备溶液混合，制成最终100μL含有1mg/mLmAb-2消化混合物、350μM His和20mM H2O2的溶液。可在刚好将溶液注入FPOP的管子之前添加H2O2。将样品装载至100μL气密注射器中，并经由偶联至150μm内径熔融石英管子的注射泵引入，该管子在面向激光束的中心有一个透明的窗口。将KrF准分子激光功率调节至100-120mJ/脉冲，且其脉冲频率设置为6Hz。透明样品管窗口处的激光束宽度测得为3.0mm。打开脉冲激光器后，将样品溶液以23.86μL/min的流速(根据管子内径、激光频率和测量的激光束宽度进行调整)注入管子中以确保20％的排除体积，以避免重复的·OH暴露和反应。将毛细管流出物收集在容纳有20μL的100mM Met和2μL的1mg/mL过氧化氢酶的小瓶中，以还原残余的H2O2。最后，通过使用ultracel-10K离心过滤器离心将标记的样品溶液浓缩至约40μL。
SEC/MS
将共价标记的样品混合物注入SEC柱(300mm×4.6mm，/>1.7μm)中，该柱用流动相(140mM乙酸铵和10mM碳酸氢铵，pH 7.4)以0.2mL/min的流速预平衡。在SEC分离和UV检测(280nm)后，收集二聚体片段和单体片段用于胰蛋白酶切肽作图分析。
肽作图
在胰蛋白酶消化之前，在SpeedVac中干燥所有二聚体级分和单体部分，并在含有8M尿素、5mM二硫苏糖醇(DTT)和0.1M Tris-HCl(pH 7.5)的溶液中重构，且在50℃下保持30分钟。将变性且还原的样品在暗处用10mM碘乙酰胺(IAA)烷基化30分钟。然后用0.1MTris-HCl(pH 7.5)稀释样品溶液十倍，以降低尿素浓度至0.8M，并在37℃下用胰蛋白酶以1:20(w/w)的酶与底物比消化过夜。然后通过添加10％ FA至达到最终0.2％ FA来终止消化。然后通过反相UPLC分离每个消化蛋白质样品的等分试样(约5μg)，随后进行在线质谱分析，以确定肽质量并确认肽身份。MS和MS/MS实验是在Thermo QExactive Plus MS***上进行，该***在MS/MS实验期间采用高能碰撞解离(HCD)进行肽片段化。
结果
羧基标记
对于羧基标记，为了鉴别GEE标记的胰蛋白酶切肽，针对含有相应mAb蛋白质序列的数据库搜索LC-MS/MS数据，所述相应mAb蛋白质序列具有局限于Asp和Glu残基的可变GEE1(+85.0522)和GEE2(+57.0209)修饰。为了量化含有Asp/Glu残基的每个胰蛋白酶切肽上的GEE标记程度，生成了基于GEE标记肽和天然肽二者的第一同位素峰的m/z的提取离子色谱图(EIC)，并对提取峰面积进行积分。使用相对于标记肽和天然肽的峰面积之和的相应EIC峰面积来计算每种GEE标记肽的百分比。在含有多个Asp和Glu残基的胰蛋白酶切肽的情形下，首先检查在不同保留时间洗脱的GEE标记肽的MS/MS谱以确认标记位点，然后使用相应的EIC峰面积计算位点特异性标记百分比。最后，比较二聚体级分与单体级分之间每种胰蛋白酶切肽或残基的GEE标记程度。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与二聚化界面有关或非常接近(图2、图3A和图3B)。
FPOP标记
对于FPOP标记，首先针对含有具有所有已知氧化标记产物(表1)的相应mAb蛋白质序列的数据库搜索LC-MS/MS数据，以鉴别所有标记产物。基于MS/MS信息鉴别该肽上的修饰位点，并通过精确的m/z进行确认，并且某个肽的修饰程度计算为： 其中Iox是修饰肽的强度(由于在非标记样品处理期间引入的Met上可能发生氧化而排除Met氧化)，且I是未修饰肽的强度。还对二聚体与单体在肽水平上显示出修饰程度不同的肽以及含有Met残基的肽在残基水平上进行了氧化标记的定量分析。肽上的修饰位点分配有MS2信息。在少数情形下，倘若由于来自MS2的碎片信息有限或存在肽异构体共洗脱的干扰而无法定位对单个残基的修饰，则指示修饰发生在一组可能的残基上。在亚结构域水平上+0、+16、+32、+48等标记物质的泊松分布指示没有发生过度标记(图4A-4C)。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与二聚化界面有关或非常接近(图5A和图5B)。
表1.可能的氧化标记产物
实施例2：FPOP优化
方法：
遵循实施例1中的FPOP方案。操纵该方案的各个组成部分，即激光器位置、清除剂浓度和猝灭剂的加入，以确定它们对测定的影响。
结果：
表2示出了图6A和图6B的实验参数。如图6A和图6B中所示，位置和激光功率影响溶菌酶蛋白的标记效率。使用图6B的参数(包括更近的聚焦位置和122mJ的激光功率)分析的样品中的氧化物质显示出+0、+16、+32…状态产物分布与泊松分布的良好拟合。这指示标记效率提高。
表2.实验参数
如图7A-7F和图8A-8D中的泊松分布日期所示，激光功率和清除剂浓度对蛋白质标记效率的影响远远大于蛋白质浓度。
与进行缓冲液交换的mAb1(图9A)相比，不进行缓冲液交换的去糖基化mAb1显示标记程度降低(图9B)。这提示淬灭剂可干扰蛋白质氧化标记。
尽管在前面的说明书中已关于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明还可有其他实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。
本公开整篇所提及的所有参考文献均通过引用整体并入本文。

Claims (23)

1.一种用于鉴别蛋白质药物产品中的非共价相互作用位点或二聚化界面的方法，包括：
在原生条件下采用对蛋白质药物产品的有限消化以形成包含单体和非共价连接的二聚体的蛋白质药物二聚体样品混合物；
通过快速光化学氧化将可检测的氧化修饰引入所述蛋白质药物二聚体样品混合物的所述二聚体和单体中以产生经修饰的二聚体和经修饰的单体；
使用原生尺寸排除色谱将所述经修饰的二聚体和经修饰的单体分离成经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分；
消化所述经修饰的二聚体级分和所述经修饰的单体级分以形成肽样品；
使用液相色谱/质谱(LC-MS)分离所述肽样品以获得所述肽样品的质谱数据；以及
通过计算所述蛋白质药物产品的每种肽和经修饰肽的质量，使用所述肽的所述质谱数据与所述蛋白质药物产品的已知质量数据进行比较，确定所述肽样品中的每种肽的修饰位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中原生有限消化条件可保留多肽之间的二硫键和二聚体之间的非共价相互作用。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质药物产品包含抗体或其抗原结合片段、重组蛋白、融合蛋白或它们的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品是抗体，并且所述混合物中的所述二聚体基本上由两个相互作用的F(ab’)或F(ab)片段组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品是抗体，并且所述混合物中的所述单体基本上由F(ab)片段和Fc片段组成。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述修饰是氨基酸侧链修饰。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体或它们的抗原结合片段。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中使用包含乙酸铵和碳酸氢铵的流动相进行所述原生尺寸排阻色谱。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中使用反相液相色谱分离所述消化的蛋白质样品。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述修饰选自氧化、二氧化、三氧化、犬尿氨酸、脱硫甲基、脱羧化、羟基犬尿氨酸以及它们的组合。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中用酶消化所述蛋白质药物产品。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酶选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、内切蛋白酶Lys-C和IdeS或它们的经修饰形式。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分是通过可破坏连接两个连续氨基酸残基的共价化学键的酶消化而形成肽。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品样品来自补料分批培养物、纯化处理步骤或配制药物物质。
15.一种制备抗体的方法，包括：
在合适的条件下在细胞培养物中培养产生所述抗体的细胞以产生所述抗体；
在合适的条件下纯化所述抗体以提取所述抗体；
在合适的条件下将所述抗体与赋形剂混合以稳定所述抗体；
i)从所述细胞培养物获得所述抗体的样品、ii)在从所述细胞培养物纯化所述抗体后获得所述抗体的样品或iii)在将赋形剂添加至所述经纯化抗体后获得所述抗体的样品；
根据权利要求1-14中任一项所述的方法表征所述抗体的二聚化界面或非共价相互作用位点，以及
修改一种或多种细胞培养、纯化或赋形剂条件以减少所述抗体的二聚化或非共价相互作用的量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中经改变以减少二聚化或非共价相互作用的量的所述一种或多种条件选自pH、细胞密度、氨基酸浓度、渗透压、生长因子浓度、搅拌、溶解氧、金属离子、气体分压、亲和基质、色谱树脂、缓冲液、表面活性剂、稳定剂或它们的组合。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述细胞选自细菌细胞、酵母细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、视网膜细胞、Vero细胞、CV1细胞、肾细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、WI38细胞、MRC 5细胞、Colo25细胞、HB 8065细胞、HL-60细胞、淋巴细胞、A431(表皮)细胞、U937细胞、3T3细胞、L细胞、C127细胞、SP2/0细胞、NS-0细胞、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞以及衍生自任一前述细胞的细胞系。
18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述细胞是杂交瘤细胞或四源杂交瘤细胞。
19.一种制备经修饰抗体的方法，包括：
使用根据权利要求1-14中任一项所述的方法表征所述抗体中的二聚化界面或非共价相互作用位点，以及
修饰所述二聚化界面或非共价相互作用位点中的氨基酸以减少所述抗体的二聚化或非共价相互作用。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述CHO细胞是CHO K1、DXB-11CHO和Veggie-CHO细胞。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述COS细胞是COS-7细胞。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述肾细胞是HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK和BHK21细胞。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述淋巴细胞是自体T细胞、Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)。
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