BR122022014045B1 - Método para identificar sítios de interação não covalente ou interfaces de dimerização em um medicamento proteico - Google Patents

Abstract

São providos sistemas e métodos para caracterizar as interfaces de dimerização no nível de subdomínio de uma proteína. Um método de exemplo inclui digerir uma amostra de dímero de proteína em subdomínios, marcar a amostra de proteína digerida, isolar os fragmentos de subdomínio diméricos e monoméricos marcados e mapear os peptídeos da amostra marcada para determinar onde os fragmentos de dímero estão marcados e onde os fragmentos de dímero não estão marcados. As regiões que mostram extensões de marcação na fração de dímero menores do que na fração de monômero, provavelmente estão envolvidas na ou próximas à interface de dimerização.

Description

“Dividido do BR112020013009-5, depositado em 01/02/2019” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos US N° 62/625.732 depositado em 2 de fevereiro de 2018 e 62/738.051 depositado em 28 de setembro de 2018, sendo que ambos estão aqui incorporados por referência, em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção é direcionada, em geral, a métodos e sistemas analíticos para caracterizar sítios de interação não covalente em proteínas e fragmentos dos mesmos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Os anticorpos monoclonais (mAbs) foram empregados com sucesso para atingir uma ampla gama de áreas terapêuticas nas últimas duas décadas (Walsh G., Nature biotechnology 2014; 32: 992-1000; Lawrence S. Nature biotechnology 2007; 25: 380-2) . A agregação de proteínas continua sendo uma grande preocupação na produção de anticorpos monoclonais e outras proteínas terapêuticas. Devido ao possível impacto na potência e imunogenicidade, é importante entender o mecanismo de agregação para que estratégias de controle apropriadas possam ser implementadas para garantir a qualidade do produto.

[004] O mapeamento da interface de dimerização nas moléculas de mAb permanece desafiador, devido à complexidade e heterogeneidade dos dímeros de mAb. Embora a espectrometria de massa da troca hidrogênio- deutério (HDX MS) tenha sido bem-sucedida no estudo das interações proteína-proteína, pouco sucesso foi alcançado em revelar a interface de dimerização do mAb, presumivelmente devido às limitações do método na detecção de interações da cadeia lateral da proteína.

[005] Assim, é um objetivo da invenção prover sistemas e métodos para mapear interfaces heterogêneas de dimerização de proteínas.

[006] É um outro objetivo da invenção prover medicamentos proteicos com níveis reduzidos de dimerização.

[007] É ainda outro objetivo da invenção prover métodos de produção de medicamentos proteicos com dimerização reduzida.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[008] São providos sistemas e métodos para caracterizar interfaces de dimerização de proteínas no nível de peptídeo/resíduo de uma proteína. Um método de exemplo inclui digerir uma amostra de dímero de proteína em subdomínios, marcar a mistura de amostra de proteína digerida, isolar os fragmentos de subdomínio diméricos e monoméricos marcados e mapear peptídeos da amostra marcada para determinar e comparar a extensão de marcação no dímero e no monômero. As regiões que mostram extensões de marcação na fração de dímero menores do que na fração de monômero, provavelmente estão envolvidas na ou próximas à interface de dimerização.

[009] Em uma modalidade, os dímeros não covalentes foram isolados e analisados por mapeamento de peptídeos para localizar os sítios de interação não covalente. Em outra modalidade, para localizar a interface de dimerização não covalente no nível de peptídeo/resíduo, a amostra de dímero de mAb enriquecido foi digerida em uma mistura de homodímero F(ab) [ou F(ab’)], monômeros F(ab) [ou F(ab’)] e Fc, e submetida a um experimento de marcação, seguido de fracionamento, digestão tríptica e análise por LC-MS para quantificação da extensão da marcação e comparação nos níveis de peptídeo/resíduo. A seguir, são providos mais detalhes nas etapas dos métodos descritos.

[0010] Ainda outra modalidade provê um método para produzir um anticorpo, incluindo as etapas de cultivar as células que produzem o anticorpo em uma cultura celular, obter uma amostra da cultura celular, caracterizar as interfaces de dimerização na amostra de anticorpo de acordo com o método descrito anteriormente e modificar uma ou mais condições de cultura da cultura celular para reduzir a quantidade de dimerização ou interação/agregação não covalente do anticorpo produzido durante a cultura celular. Em algumas modalidades, a amostra é colhida durante a cultura de células em qualquer intervalo. Em outras modalidades, a amostra é colhida após a produção da cultura, após a extração de proteínas ou após a purificação. As uma ou mais condições da cultura de células que são alteradas para reduzir a quantidade de dimerização ou agregação podem ser selecionadas do grupo que consiste em temperatura, pH, densidade celular, concentração de aminoácidos, osmolalidade, concentração de fator de crescimento, agitação, pressão parcial de gás, tensoativos ou suas combinações. As células podem ser eucariontes ou procariontes. As células podem ser células do ovário do hamster chinês (CHO) (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), células COS (por exemplo, COS-7), células da retina, células Vero, células CV1, células renais (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), células HeLa, células HepG2, células WI38, células MRC 5, células Colo25, células HB 8065, células HL-60, células linfocitárias, por exemplo células T autólogas, Jurkat (linfócitos T) ou Daudi (linfócitos B), células A431 (epidérmicas), células U937, 3T3, células L, células C127, células SP2/0, células NS-0, células MMT, células-tronco, células tumorais e uma linha celular derivada de qualquer uma das células mencionadas anteriormente. Em uma modalidade, as células são células de hibridoma ou quadroma.

[0011] Ainda uma outra modalidade provê um método de produção de um anticorpo, incluindo as etapas de cultivar as células que produzem o anticorpo em uma cultura celular, depois purificar e formular o anticorpo para obter uma substância medicamentosa formulada (FDS), obter uma amostra do anticorpo purificado antes e/ou após a formulação do anticorpo, caracterizar as interfaces de dimerização na amostra de anticorpo ou amostra de FDS de acordo com o método descrito anteriormente e modificar uma ou mais condições da purificação ou formulação de anticorpos para reduzir a quantidade de dimerização ou interação/agregação não covalente do anticorpo produzido durante a cultura celular. As uma ou mais condições de purificação do anticorpo que são alteradas para reduzir a quantidade de dimerização ou agregação podem ser selecionadas do grupo que consiste em temperatura, pH, matriz de afinidade, resina de cromatografia, tampões, filtros ou combinações dos mesmos. As uma ou mais condições da formulação do anticorpo que são alteradas para reduzir a quantidade de dimerização ou agregação podem ser selecionadas do grupo que consiste em pH, concentração de anticorpo, concentração de excipiente, tampões, tensoativos, estabilizadores ou quaisquer de suas combinações. Um ou mais excipientes da FDS podem ser alterados para reduzir a quantidade de dimerização ou agregação e são selecionados a partir de qualquer um dos excipientes conhecidos na técnica.

[0012] Ainda outra modalidade provê um anticorpo produzido pelos métodos aqui descritos.

[0013] Também são providos métodos para prover medicamentos proteicos modificados com dimerização reduzida ou interação não covalente em relação a um medicamento proteico não modificado. Em uma modalidade, o medicamento proteico é um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] A Figura 1 é um diagrama de fluxo de trabalho de uma estratégia de exemplo de digestão limitada e de marcação única para o mapeamento da interface de dimerização do mAb.

[0015] A Figura 2 é um gráfico de porcentagem de cloridrato de éster etílico da glicina (GEE) (dímero de monômero) para a cadeia/resíduo indicado, mostrando o gráfico de marcação diferencial de GEE entre o dímero Fab e o monômero Fab de mAb-1 gerado a partir de digestão limitada por Lys-C da amostra de HMW enriquecida.

[0016] A Figura 3A é um gráfico de barras da porcentagem de GEE para o fragmento de anticorpo indicado do mAb-1 no nível do peptídeo. A Figura 3B é um gráfico de barras da porcentagem de GEE para o fragmento de anticorpo indicado do mAb-2 no nível do resíduo de aminoácido.

[0017] As Figuras 4A a 4C são gráficos de dispersão mostrando o ajuste de Poisson de espécies oxidadas para uma amostra limitada de HMW de mAb1digerido com LysC. A Figura 4A representa a região Fc, a Figura 4B representa a região LC e a Figura 4C representa a região Fd. A linha representa o ajuste de Poisson para cada gráfico.

[0018] A Figura 5A é um gráfico de barras da extensão da modificação com FPOP para o fragmento indicado no nível do peptídeo do mAb-1. A Figura 5B é um gráfico de barras da extensão da modificação com FPOP para o fragmento indicado no nível de resíduo do mAb-1.

[0019] As Figuras 6A e 6B são gráficos de dispersão mostrando o ajuste de Poisson de espécies oxidadas para a proteína lisozima com diferentes posições de foco e condições de potência do laser.

[0020] As Figuras 7A a 7F são gráficos de dispersão mostrando o ajuste de Poisson de espécies oxidadas para a proteína lisozima com várias concentrações de sequestrador (500 μM, 350 μM ou 200 μM His) e várias configurações de potência do laser (97 mJ ou 156 mJ).

[0021] As Figuras 8A a 8D são gráficos de dispersão mostrando o ajuste de Poisson de espécies oxidadas para a proteína lisozima com várias concentrações de sequestrador (500 μM ou 200 μM His) e várias concentrações de proteína (1 mg/mL ou 0,1 mg/mL).

[0022] As Figuras 9A a 9B são gráficos de dispersão mostrando o ajuste de Poisson de espécies oxidadas para mAb1 (Figura 9A) ou para mAb1 desglicosilado (Figura 9B).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

[0023] O uso dos termos “um”, “uma”, “o/a” e referências semelhantes no contexto da descrição da invenção atualmente reivindicada (especialmente no contexto das reivindicações) deve ser interpretado para abranger tanto o singular quanto o plural, salvo indicado em contrário neste documento ou claramente contradito pelo contexto.

[0024] A repetição de intervalos de valores aqui descritos destina-se apenas a servir como um método de referência em forma abreviada a cada valor separado dentro do intervalo, salvo indicado em contrário neste documento, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente mencionado novamente aqui.

[0025] O uso do termo “cerca de” se destina a descrever valores acima ou abaixo do valor declarado em um intervalo de aproximadamente +/10%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor indicado em um intervalo de aproximadamente +/- 5%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor indicado em um intervalo de aproximadamente +/- 2%; em outras modalidades os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor indicado em um intervalo de aproximadamente +/- 1%. Os intervalos acima mencionados destinam-se a ser esclarecidos por contexto, e nenhuma limitação adicional está implícita. Todos os métodos aqui descritos podem ser executados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado aqui de outra forma ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem de exemplo (por exemplo, “como”) provida neste documento, visa meramente esclarecer melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que seja reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicativa de qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[0026] O termo “proteína” refere-se a uma molécula composta por dois ou mais resíduos de aminoácidos ligados entre si por uma ligação de peptídeo. A proteína inclui polipeptídeos e peptídeos e também pode incluir modificações como glicosilação, ligação lipídica, sulfatação, gama- carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, alquilação, hidroxilação e ADP- ribosilação. As proteínas podem ser de interesse científico ou comercial, incluindo os medicamentos à base de proteínas, e as proteínas incluem, entre outras coisas, enzimas, ligantes, receptores, anticorpos e proteínas quiméricas ou de fusão. As proteínas são produzidas por vários tipos de células recombinantes com o uso de métodos conhecidos de cultura celular, e são introduzidas em geral na célula por transfecção de vetores de nucleotídeos de engenharia genética (por exemplo, como uma sequência que codifica uma proteína quimérica ou uma sequência otimizada de códons, uma sequência isenta de íntrons etc.), sendo que os vetores podem residir como um epissoma ou ser integrados no genoma da célula.

[0027] O termo “anticorpo” refere-se a uma molécula de imunoglobulina composta por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada possui uma região variável da cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada contém um domínio CH1, um domínio de região da dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Cada cadeia leve possui uma região variável da cadeia leve e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve consiste em um domínio (CL). As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservadas, denominadas regiões de cadeia principal (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Cada cadeia VH/CH1 e VL/CL se associa (por exemplo, por pontes de dissulfeto) para formar um par, ou F(ab), tendo um sítio de ligação ao antígeno em seu terminal N. Assim, após a digestão enzimática limitada, um fragmento F(ab) [ou F(ab’)] é um fragmento de anticorpo que ainda se liga a antígenos, mas é monovalente, sem nenhuma porção Fc. Um anticorpo é tipicamente bivalente em relação à ligação ao antígeno e, como tal, inclui duas porções F (ab), conhecidas como F(ab’)2, ligadas entre si por pontes de dissulfeto na dobradiça superior. Os fragmentos F(ab’)2 são gerados pela digestão limitada de anticorpos inteiros para remover a maior parte da região Fc, deixando intacta parte da região de dobradiça, e podem ser ainda mais reduzidos aos fragmentos F(ab’). O termo “anticorpo” inclui referência a imunoglobulinas, tanto glicosiladas quanto não glicosiladas, de qualquer isotipo ou subclasse. O termo “anticorpo” inclui moléculas de anticorpo preparadas, expressas, criadas ou isoladas por meios recombinantes, como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo. O termo anticorpo também inclui anticorpo biespecífico, que inclui uma imunoglobulina heterotetramérica que pode se unir a mais de um epítopo diferente. As estruturas de anticorpos bivalentes também podem ser biespecíficas no que diz respeito à especificidade de cada sítio de ligação ao antígeno para diferentes antígenos. Os anticorpos biespecíficos são geralmente descritos na Publicação de Pedido de Patente US N° 2010/0331527, que está incorporada por referência neste documento.

[0028] “Proteínas de fusão Fc” compreendem parte ou todas as duas ou mais proteínas, uma das quais é uma porção Fc de uma molécula de imunoglobulina, que não são encontradas juntas na natureza. A preparação de proteínas de fusão compreendendo certos polipeptídeos heterólogos fundidos com várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpos (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344: 677, 1990; e Hollenbaugh et al., “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, em Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11, 1992. “Proteínas de fusão Fc do receptor” compreendem um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma fração Fc o qual, em algumas modalidades, compreende uma região de dobradiça seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc compreende duas ou mais cadeias distintas do receptor que se ligam a um ou mais ligantes. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma armadilha, como, por exemplo, uma armadilha de IL-1 ou armadilha de VEGF.

[0029] O termo “Cultura celular” refere-se à propagação ou proliferação de células em um vaso, como um balão ou biorreator, e inclui, mas não está limitado a, cultura de lote alimentado, cultura contínua, cultura de perfusão e semelhantes.

[0030] O termo “MS/MS” refere-se a uma técnica de espectrometria de massa que usa dois espectrômetros de massa em tandem. Entre os dois analisadores (MS1 e MS2) está uma célula de gás de colisão. Os íons precursores selecionados por MS1 colidem com um gás de alta pressão (geralmente He) na célula e sofrem fragmentação.

[0031] O termo “LC-MS” refere-se a cromatografia líquida- espectrometria de massa, que é uma técnica química analítica que combina os recursos de separação física da cromatografia líquida (ou HPLC) com os recursos de análise de massa da espectrometria de massa (MS).

[0032] O termo “uma substituição conservadora de aminoácidos” refere-se a uma substituição de um aminoácido por outro que possui propriedades semelhantes. Espera-se que este tipo de substituição raramente resulte em disfunção na proteína correspondente.

II. Medicamentos Proteicos

[0033] Uma modalidade provê um medicamento proteico que foi modificado para reduzir a dimerização ou interação não covalente do medicamento proteico. A modificação pode ser uma substituição conservativa de aminoácidos. Em uma substituição conservativa de aminoácidos, um aminoácido é trocado por outro que possui propriedades semelhantes. Espera- se que este tipo de substituição raramente resulte em disfunção na proteína correspondente.

A. Proteínas de Interesse

[0034] Em uma modalidade, o medicamento proteico pode conter uma ou mais proteínas de interesse adequadas para expressão em células procariontes ou eucariontes. Por exemplo, a proteína de interesse inclui, mas não se limita a, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um ScFv ou fragmento do mesmo, uma proteína de fusão Fc ou fragmento do mesmo, um fator de crescimento ou um fragmento do mesmo, uma citocina ou um fragmento do mesmo, ou um domínio extracelular de um receptor da superfície celular ou um fragmento do mesmo. As proteínas de interesse podem ser polipeptídeos simples que consistem em uma única subunidade ou proteínas complexas de múltiplas subunidades compreendendo duas ou mais subunidades. A proteína de interesse pode ser um produto biofarmacêutico, aditivo ou conservante de alimentos, ou qualquer produto proteico sujeito a purificação e padrões de qualidade.

[0035] Em algumas modalidades, o produto proteico (proteína de interesse) é um anticorpo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo biespecífico, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um diacorpo, triacorpo ou tetracorpo, uma molécula tipo imunoglobulina G tetravalente dupla específica, denominada imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD- IG), um anticorpo IgD, um anticorpo IgE, um anticorpo IgM, um anticorpo IgG, um anticorpo IgG1 , um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 ou um anticorpo IgG4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG1. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG4. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende uma dobradiça quimérica. Ainda em outras modalidades, o anticorpo compreende um Fc quimérico. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico IgG2/IgG4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico IgG2/IgG1. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico IgG2/IgG1/IgG4.

[0036] Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-morte celular programada 1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD1, como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2015/0203579A1), um ligante anti-morte celular programada-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1 como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2015/0203580A1), um anticorpo anti-Dll4, um anticorpo anti-Angiopoetina-2 (por exemplo, um anticorpo anti-ANG2 como descrito na Patente US N° 9.402.898), um anticorpo anti-Angiopoetina tipo 3 (por exemplo, um anticorpo anti-AngPtl3 como descrito na Patente U.S. N° 9.018.356), um anticorpo do receptor de fator de crescimento derivado de antiplaquetas (por exemplo, um anticorpo anti-PDGFR como descrito na Patente US N° 9.265.827), um anticorpo anti-Erb3, um anticorpo anti-receptor de prolactina (por exemplo, anticorpo anti-PRLR como descrito na Patente US N° 9.302.015), um anticorpo anti-Complemento 5 (por exemplo, um anticorpo anti-C5 como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2015/0313194A1), um anticorpo anti-TNF, um anticorpo anti-receptor de fator de crescimento epidérmico (por exemplo, um anticorpo anti-EGFR como descrito na Patente US N° 9.132.192 ou um anticorpo anti-EGFRvIII como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2015/0259423A1), um anticorpo anti-Pró-proteína Convertase Subtilisina Kexina-9 (por exemplo, um anticorpo anti-PCSK9 como descrito na Patente US N° 8.062.640 ou Publicação do Pedido de Patente US N° US2014/0044730A1), um anticorpo anti-Fator de Crescimento e Diferenciação-8 (por exemplo, um anticorpo anti-GDF8, também conhecido como anticorpo anti-miostatina, conforme descrito nas patentes US N°s 8.871.209 ou 9.260.515), um receptor anti-glucagon (por exemplo, anticorpo anti-GCGR como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N°s US2015/0337045A1 ou US2016/0075778A1), um anticorpo anti-VEGF, um anticorpo anti-IL1R, um anticorpo receptor de interleucina 4 (por exemplo, um anticorpo anti-IL4R como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2014/0271681A1 ou Patentes US N°s 8.735.095 ou 8.945.559), um anticorpo anti-receptor de interleucina 6 (por exemplo, um anticorpo anti- IL6R como descrito nas Patentes US N°s 7.582.298, 8.043.617 ou 9.173.880), um anticorpo anti-IL1, um anticorpo anti-IL2, um anticorpo anti-IL3, um anticorpo anti-IL4, um anticorpo anti-IL5, um anticorpo anti-IL6, um anticorpo anti-IL7 , um anti-interleucina 33 (por exemplo, anticorpo anti-IL33 como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2014/0271658A1 ou US2014/0271642A1), um anticorpo anti-Vírus respiratório sincicial (por exemplo, anticorpo anti-RSV como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2014/0271653A1), um anti-Grupo de diferenciação 3 (por exemplo, um anticorpo anti-CD3, como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N°s US2014/0088295A1 e US20150266966A1, e no pedido US N° 62/222.605), um anticorpo anti- Grupo de diferenciação 20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20 como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N°s US2014/0088295A1 e US20150266966A1, e na Patente US N° 7.879.984), um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-CD28, um anticorpo anti-Grupo de diferenciação-48 (por exemplo, anticorpo anti-CD48, como descrito na Patente US N° 9.228.014), um anticorpo anti-Fel d1 (por exemplo, como descrito na Patente US N° 9.079.948), um anti-vírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (por exemplo, um anticorpo anti-MERS como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2015/0337029A1), um anticorpo anti-Vírus Ebola (por exemplo, como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2016/0215040), um anticorpo anti-Vírus Zika, um anticorpo anti-Gene de Ativação Linfocitária 3 (por exemplo, um anticorpo anti-LAG3 ou um anticorpo anti-CD223), um anticorpo anti-Fator de Crescimento de Nervos (por exemplo, um anticorpo anti-NGF como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N° US2016/0017029 e nas Patentes US N°s 8.309.088 e 9.353.176) e um anticorpo anti-Ativina A. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD20 (como descrito na Publicação do Pedido de Patente US N°s US2014/0088295A1 e US20150266966A1), um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Mucina 16 (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Muc16) e um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Antígeno de membrana específico da próstata (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-PSMA). Em algumas modalidades, a proteína de interesse é selecionada do grupo que consiste em abciximabe, adalimumabe, adalimumabe-atto, ado-trastuzumabe, alemtuzumabe, alirocumabe, atezolizumabe, avelumabe, basiliximabe, belimumabe, benralizumabe, bevacizumabe, blzlotent, brodalumabe, canakinumabe, capromabe pendetide, certolizumabe pegol, cemiplimabe, cetuximabe, denosumabe, dinutuximabe, dupilumabe, durvalumabe, eculizumabe, elotuzumabe, emicizumabe-kxwh, emtansinealirumabe, evin infliximab-abda, infliximab-dyyb, ipilimumabe, ixekizumabe, mepolizumabe, necitumumabe, nesvacumabe, nivolumabe, obiltoxaximabe, obinutuzumabe, ocrelizumabe, ofatumumabe, olaratumabe, omalizumabe, panitumumabe, pembrolizumabe, pertuzumabe, ramucirumabe, ranibizumabe, raxibacumabe, reslizumabe, rinucumabe, rituximabe, sarilumabe, secukinumabe, siltuximabe, tocilizumabe, tocilizumabe, trastuzumabe, trevogrumabe, ustekinumabe e vedolizumabe.

[0037] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína recombinante que contém uma fração Fc e outro domínio ((por exemplo, uma proteína de fusão Fc). Em algumas modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão Fc de receptor, que contém um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma fração Fc. Em algumas modalidades, a fração Fc compreende uma região de dobradiça seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma IgG. Em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc do receptor contém duas ou mais cadeias de receptores distintas que se ligam a um único ligante ou a vários ligantes. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma proteína TRAP, como, por exemplo, uma armadilha para IL-1 (por exemplo, rilonacept, que contém a região de ligação ao ligante IL-1RAcP fundida à região extracelular de Il-1R1 fundida a Fc de hIgGl; consultar a Patente US N° 6.927.004, que está aqui incorporada por referência em sua totalidade), ou uma armadilha para VEGF (por exemplo, aflibercept ou ziv-aflibercept, que compreende o domínio de Ig 2 do Flt1 receptor de VEGF fundido ao domínio de Ig 3 do receptor VEGF Flk1 fundido a Fc de hIgGl; ver Patente US N°s 7.087.411 e 7.279.159). Em outras modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão ScFv-Fc, que contém um ou mais de um ou mais domínios de ligação ao antígeno, como um fragmento de cadeia pesada variável e um fragmento de cadeia leve variável, de um anticorpo acoplado a uma fração Fc.

B. Métodos de Produção de Proteínas

[0038] Em uma modalidade, o medicamento proteico é produzido em uma cultura celular de lote alimentado. Na produção de proteínas, uma “cultura celular de lote alimentado” ou “cultura de lote alimentado” refere-se a uma cultura em lote em que as células e o meio de cultura são providos inicialmente ao vaso de cultura e os nutrientes adicionais da cultura são alimentados lentamente, em incrementos distintos, à cultura durante a cultura, com ou sem colheita periódica de células e/ou produtos antes do término da cultura. A cultura de lote alimentado inclui “cultura de lote alimentado semicontínua”, sendo que, periodicamente, toda a cultura (que pode incluir células e meio) é removida e substituída por meio fresco. A cultura de lote alimentado é diferenciada da “cultura de lotes” simples, considerando que todos os componentes para cultura celular (incluindo as células animais e todos os nutrientes da cultura) são providos ao vaso de cultura no início do processo de cultura na cultura em lote. A cultura de lote alimentado pode ser diferente de “cultura de perfusão”, na medida em que o sobrenadante não é removido do vaso de cultura durante um processo padrão de lote alimentado, enquanto que na cultura por perfusão, as células são restringidas na cultura por, por exemplo, filtração e o meio de cultura é contínua ou intermitentemente introduzido e removido do vaso de cultura. Entretanto, a remoção de amostras para finalidade de testes durante a cultura celular de lote alimentado é contemplada. O processo de lote alimentado continua até se determinar que foi alcançado o volume de trabalho máximo e/ou a produção de proteínas, e a proteína é, então, colhida.

[0039] Uma modalidade provê um medicamento proteico que é produzido em uma cultura celular contínua. A frase “cultura celular contínua” refere-se a uma técnica usada para cultivar células continuamente, geralmente em uma fase específica de crescimento. Por exemplo, se for necessário um fornecimento constante de células, ou se for necessária a produção de uma proteína específica de interesse, a cultura celular poderá exigir manutenção em uma fase específica de crescimento. Assim, as condições devem ser continuamente monitoradas e ajustadas de acordo para manter as células nessa fase específica.

[0040] As culturas celulares utilizadas para produzir o medicamento proteico incluem um meio de cultura celular. Os termos “meio de cultura celular” e “meio de cultura” se referem a uma solução nutritiva utilizada para o cultivo de células de mamíferos que normalmente provê os nutrientes necessários para aumentar o crescimento das células, como uma fonte de energia de carboidratos, aminoácidos essenciais (por exemplo, fenilalanina, valina, treonina, triptofano, metionina, leucina, isoleucina, lisina e histidina) e não essenciais (por exemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, prolina, serina e tirosina), oligoelementos, fontes de energia, lipídeos, vitaminas etc. O meio de cultura celular pode conter extratos, por exemplo, soro ou peptonas (hidrolisados), que proveem matérias-primas que sustentam o crescimento celular. Os meios podem conter extratos de soja ou derivados de levedura, em vez de extratos de origem animal. O meio quimicamente definido refere-se a um meio de cultura celular no qual todos os componentes químicos são conhecidos (ou seja, têm uma estrutura química conhecida). O meio quimicamente definido é totalmente livre de componentes derivados de animais, como peptonas derivadas de soro ou animal. Em uma modalidade, o meio é um meio quimicamente definido.

[0041] A solução também pode conter componentes que aumentam o crescimento e/ou a sobrevivência acima da taxa mínima, incluindo hormônios e fatores de crescimento. A solução pode ser formulada para um pH e uma concentração de sal ideal para a sobrevivência e proliferação da célula específica que está sendo cultivada.

[0042] Uma “linha celular” refere-se a uma célula ou células que são derivadas de uma linhagem específica por meio de passagem em série ou subcultura de células. O termo “células” é usado de forma intercambiável com “população celular”.

[0043] O termo “célula” inclui qualquer célula que seja adequada para expressar uma sequência de ácidos nucleicos recombinante. As células incluem as dos procariontes e eucariontes, como células bacterianas, células de mamíferos, células humanas, células animais não humanas, células aviárias, células de insetos, células de leveduras ou fusões celulares, como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em certas modalidades, a célula é uma célula humana, de macaco, símio, hamster, rato ou camundongo. Em outras modalidades, a célula é selecionada das seguintes células: Ovário de hamster chinês (CHO) (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie- CHO), COS (por exemplo, COS-7), células da retina, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK , BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, linfócitos, por exemplo, Jurkat (linfócito T) ou Daudi (linfócito B), A431 (epidérmico), U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, célula MMT, célula-tronco, célula tumoral e uma linhagem celular derivada de uma célula mencionada anteriormente. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula da retina que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6®). Em algumas modalidades, a célula é uma célula CHO. Em outras modalidades, a célula é uma célula CHO K1.

[0044] Os métodos de purificação de proteínas são bem conhecidos na técnica. O medicamento pode ser submetido a várias etapas de purificação após a cultura celular e a extração da proteína para remover impurezas, incluindo proteínas da célula hospedeira e formas aberrantes do medicamento, associadas ao processo de cultura celular. As formas de cromatografia são bem conhecidas, como “cromatografia de afinidade”, que é um método cromatográfico que utiliza interações específicas e reversíveis entre proteínas em vez de propriedades gerais da proteína, como ponto isoelétrico, hidrofobicidade ou tamanho, para efetuar a separação cromatográfica. A “Cromatografia de afinidade de Proteína A” ou a “Cromatografia de Proteína A” refere-se a um método cromatográfico de afinidade específico que utiliza a afinidade dos domínios de ligação a IgG da Proteína A para a porção Fc de uma molécula de imunoglobulina. Esta porção Fc compreende domínios constantes de imunoglobulina humana ou animal CH2 e CH3 ou domínios de imunoglobulina substancialmente semelhantes a estes. Outras formas de cromatografia ou técnicas de separação incluem, mas não se limitam a: Cromatografia de afinidade de proteína G, cromatografia de afinidade Marcada com His, cromatografia de Troca Iônica (Cátion fraco, Ânion fraco, Cátion forte, Ânion forte), cromatografia de Exclusão por Tamanho, cromatografia de Fase Reversa, cromatografia de Fase Normal, Cromatografia de Interação Hidrofóbica, Cromatografia de Interação Hidrofílica. Cada técnica requer otimização de condições adequadas, incluindo, mas não se limitando a, carga e tamanho de resina, condições de lavagem, pH, volume de carga, concentração de carga e semelhantes. As técnicas de ultrafiltração e diafiltração também são contempladas no processo de purificação.

[0045] Os métodos de formulação de proteínas são bem conhecidos na técnica. Os medicamentos da presente invenção incluem composições farmacêuticas líquidas que compreendem as moléculas de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo) da presente invenção. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com veículos, excipientes e outros agentes adequados que proporcionam transferência, entrega, tolerância e semelhantes aprimorados. Uma infinidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Por exemplo, os excipientes podem incluir um estabilizador, um tampão, um tonificante, um tensoativo, um solvente orgânico, um sal ou suas combinações. Em algumas modalidades, o estabilizador é selecionado do grupo que consiste em um poliol, um açúcar, um aminoácido, um tensoativo não iônico e suas combinações. Em algumas modalidades, o tonificante é selecionado do grupo que consiste em um açúcar, um aminoácido, um sal e suas combinações. Em algumas modalidades, o medicamento é uma formulação líquida ou uma formulação liofilizada reconstituída do medicamento. Em algumas modalidades, o medicamento é uma coformulação que compreende dois ou mais anticorpos diferentes.

III. Métodos para Caracterizar Interfaces de Dimerização em Proteínas

[0046] A agregação de proteínas continua sendo uma grande preocupação na produção de anticorpos monoclonais. Devido ao potencial de impacto na pureza, potência e imunogenicidade, é importante entender o mecanismo de agregação para que estratégias de controle apropriadas possam ser implementadas para garantir a qualidade do produto. O mapeamento da interface de dimerização em uma molécula de mAb permanece desafiador, devido à complexidade e heterogeneidade dos dímeros de mAb. Embora a espectrometria de massa da troca hidrogênio-deutério (HDX MS) tenha sido bem-sucedida no estudo das interações proteína-proteína, pouco sucesso foi alcançado em revelar a interface de dimerização do mAb, presumivelmente devido às limitações do método na detecção de interações da cadeia lateral da proteína.

[0047] Para superar esses obstáculos, são providos novos sistemas e métodos para o mapeamento bem-sucedido das interfaces heterogêneas de dimerização (covalentes e não covalentes) de uma proteína por métodos abrangentes baseados em MS. Uma estratégia exemplar para o mapeamento da interface de dimerização é provida na Figura 1. A proteína pode ser um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, uma proteína recombinante ou uma proteína de fusão.

A. Métodos para Caracterizar Sítios de Interação Não Covalente

[0048] Uma modalidade provê um método para determinar as interfaces de dimerização no nível de peptídeo/resíduo de uma proteína. Um método de exemplo inclui digerir uma amostra de dímero de proteína em subdomínios, marcar a mistura de amostra de proteína digerida, isolar os fragmentos de subdomínio diméricos e monoméricos marcados e mapear peptídeos da amostra marcada para determinar e comparar a extensão de marcação no dímero e no monômero. As regiões que mostram extensões de marcação na fração de dímero menores do que na fração de monômero, provavelmente estão envolvidas na ou próximas à interface de dimerização.

[0049] Em uma modalidade, os peptídeos foram isolados e analisados por mapeamento de peptídeos para localizar sítios de interação não covalente. Em uma outra modalidade para localizar a interface de dimerização não covalente no nível de peptídeo/resíduo, a amostra de dímero de mAb enriquecido foi digerida em uma mistura de homodímero F(ab) [ou F(ab’)], monômeros F(ab) [ou F(ab’)] e Fc, depois submetida a um experimento de marcação covalente, seguido por fracionamento com SEC, digestão tríptica e análise por LC-MS para quantificação da extensão da marcação e comparação nos níveis de peptídeo/resíduo. Em ainda outra modalidade para localizar a interface de dimerização não covalente no nível de peptídeo/resíduo, a amostra de dímero de mAb enriquecido foi digerida em uma mistura de homodímero F(ab) [ou F(ab’)], monômeros F(ab) [ou F(ab’)] e Fc, depois submetida a um único experimento de marcação com FPOP (oxidação fotoquímica rápida de proteínas), seguido de fracionamento com SEC, digestão tríptica e análise por LC-MS para quantificação e comparação da extensão da marcação nos níveis de peptídeo/resíduo. A seguir, são providos mais detalhes nas etapas dos métodos descritos.

1. Fragmentação de Dímeros de Proteínas

[0050] Em uma modalidade, um medicamento proteico, por exemplo, um anticorpo, é obtido a partir de uma cultura celular e enriquecido para dímeros para que os dímeros forneçam uma amostra de dímero enriquecido. A amostra de dímero enriquecido pode ser produzida com o uso de uma variedade de técnicas de enriquecimento, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia líquida. Uma técnica de cromatografia líquida preferida inclui, mas não está limitada a, cromatografia de exclusão por tamanho. Em algumas modalidades, a amostra de dímero enriquecido contém alguns agregados de proteína que não são dímeros. Assim, a amostra de dímero enriquecido não precisa de ser composta apenas por dímeros. Em uma modalidade, a amostra de dímero enriquecido contém mais de 50% de dímeros.

[0051] A fragmentação ou digestão de um produto proteico, por exemplo para preservar as interações não covalentes que formam um dímero de mAb, pode ser realizada com o uso de técnicas convencionais, frequentemente chamadas de digestão limitada, incluindo técnicas químicas e enzimáticas. Em uma modalidade, uma amostra de dímero de mAb é digerida em condições nativas para produzir vários fragmentos Fab e Fc, por exemplo. uma mistura de homodímero F(ab), F(ab) e monômero Fc, com o uso de uma protease. Uma protease de exemplo é a endoprotease LysC. Outras proteases incluem papaína e ficaína. Em uma modalidade, o dímero de mAb pode ser diluído em Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) e depois incubado com endoprotease Lys-C (Proteína: enzima = 400:1). Este tratamento de digestão limitado cliva especificamente a cadeia pesada em um resíduo Lys que é o terminal N das duas ligações dissulfeto da região de dobradiça, levando à geração de fragmentos Fab e Fc. Quaisquer interações não covalentes com dímeros (mais comumente F(ab) - F(ab)) das espécies de dímero são mantidas na mistura.

[0052] Em outra modalidade, a amostra de dímero de mAb é digerida nos fragmentos F(ab’)2 e Fc* (isto é, dois polipeptídeos Fc que interagem por interações não covalentes, aqui referidos como monômeros Fc) em condições nativas com protease IdeS vendida com o nome FabRICATOR® . O dímero de mAb pode primeiro ser diluído em Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) e depois digerido com FabRICATOR® (1 miliunidade de IUB por 1 μg de proteína). Este tratamento de digestão limitado cliva especificamente entre dois resíduos de Gly, um sítio que é terminal C para as duas ligações de dissulfeto da região da dobradiça. Este tratamento pode resultar na geração de um fragmento F(ab’)2 e dois fragmentos Fc/2 idênticos que são ligados por meio de interações não covalentes (Fc*). A mistura de digestão pode então ser incubada com um agente redutor, o que reduz as ligações de dissulfeto intercadeia, mantendo intactas as ligações de dissulfeto intracadeia. Como resultado, os fragmentos F(ab’)2 são reduzidos em dois fragmentos F(ab’), e os Fd e LC são ligados por meio de interação não covalente. As interações não covalentes do dímero (mais comumente F(ab’) - F(ab’)) das espécies de dímero também são mantidas na mistura.

[0053] Exemplos de agentes redutores que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, ditiotreitol (DTT, CAS 3483-12-3), beta- mercaptoetanol (BME, 2BME, 2-ME, b-mer, CAS 60-24-2), 2 - aminoetanotiol (2-MEA-HCl, também chamado cisteamina-HCl, CAS 15657-0), cloridrato de Tris (2-carboxietil) fosfina, (TCEP, CAS 5961-85-3), cloridrato de cisteína (Cys-HCl, CAS 52-89-1) ou sal de sódio do ácido 2- mercaptoetanossulfônico (MESNA). Outros métodos para reduzir as ligações proteicas são conhecidos na técnica, como uma coluna redutora imobilizada que contém resina à qual um agente redutor à base de tiol foi imobilizado para possibilitar a redução em fase sólida das ligações de dissulfeto do peptídeo e da proteína. Também estão previstos agentes redutores, incluindo agentes oxidantes, adequados para reduzir a interação química entre os polipeptídeos.

2. Marcação dos Fragmentos de Proteína i. Marcação do Grupo Carboxila

[0054] Em uma modalidade, a amostra de mAb digerido é marcada com o uso da marcação do grupo carboxila. A pegada do grupo carboxila é uma técnica de marcação covalente comumente utilizada para estudar a conformação e interações de proteínas, mediante a marcação das cadeias laterais dos resíduos Asp e Glu com cloridrato de éster etílico da glicina (GEE). Na reação de marcação com GEE, os grupos carboxila dos resíduos Asp e Glu localizados na superfície de uma proteína são facilmente modificados, enquanto os enterrados no interior da estrutura da proteína sofrem menos ou mesmo nenhuma modificação. Em uma modalidade, a amostra digerida pode ser misturada com cloridrato de 1-etil-3- [3- dimetilaminopropil] carbodi-imida 0,2 M (EDC) e GEE 2 M e incubada à temperatura ambiente por 1 hora. A reação de marcação com GEE pode ser resfriada pela adição de Tris-HCl 1M (pH 8). Em uma modalidade, a solução de amostra pode então ser concentrada. Os métodos de concentração de amostras são bem conhecidos na técnica. Métodos exemplares incluem, mas não se limitam a, diálise de membrana, precipitação ou precipitação por sal, concentradores de membrana de celulose e centrifugação. Em uma modalidade preferida, a amostra é concentrada por centrifugação com o uso, por exemplo, de um filtro centrífugo Ultracel-10K.

ii. Rápida Oxidação Fotoquímica de Proteínas (FPOP)

[0055] Em uma modalidade, a amostra de mAb digerido é marcada com o uso de FPOP. A FPOP é um método de marcação de radicais hidroxila bem desenvolvido que marca a proteína na cadeia lateral do resíduo de aminoácido na escala de tempo de μs e tem sido amplamente aplicado no estudo das interações proteína-proteína/ligante. Em uma modalidade, o dímero de mAb digerido contendo fragmentos de mAb e os dímeros de fragmentos não covalentemente ligados são trocados por tampão para um tampão apropriado, por exemplo PBS (pH 7,4). A troca de tampão pode ser necessária devido aos inibidores reagirem rapidamente com os radicais OH e devem ser evitados durante a marcação. Os inibidores comuns incluem, mas não se limitam a, soluções tampão como Tris-HCl e produtos químicos como glicerol e DTT.

[0056] • A marcação de OH pode causar alterações conformacionais na conformação nativa da proteína. Em uma modalidade, os sequestradores podem ser utilizados para controlar a vida útil do radical OH, para que a proteína não seja marcada em excesso, assegurando que a conformação nativa seja capturada e não uma proteína marcada em excesso com alterações conformacionais. Sequestradores de exemplo que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, Cys, Trp, Tyr, Met, His, Phe, Arg, Ile, Leu, Val, Pro, Gln, Thr e Lys. Em uma modalidade preferida, o sequestrador é His. A mistura com troca de tampão pode primeiro ser misturada com PBS e solução de sequestrador concentrada e solução de estoque de H2O2. O His pode ser adicionado a uma concentração de 200 a 500 μM. A concentração de His pode ser 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 ou 500 μM. Uma mistura de exemplo contém 1 mg/mL de mistura de digestão com mAb, His 350 μM e H2O2 20 mM para produzir 100 μL finais de solução. Em uma modalidade, H2O2 pode ser adicionado imediatamente antes da infusão da solução no tubo para FPOP.

[0057] A marcação oxidativa da proteína pode ser monitorada modelando-se as intensidades de espécies não modificadas, +16 Da, +32 Da e +48 Da por distribuição de Poisson. Os valores de distribuição do estado de adição de oxigênio podem ser testados quanto ao grau de ajuste à distribuição de Poisson. Em uma modalidade, os dados que não se ajustam na distribuição de Poisson prevista indicam uma marcação excessiva da proteína. Alternativamente, se os dados se ajustarem no modelo de Poisson, existe uma marcação suficiente sem a marcação excessiva da proteína.

[0058] Em uma modalidade, a amostra pode ser carregada em uma seringa estanque a gás de 100 μL e introduzida através de uma bomba de seringa acoplada a um tubo de sílica fundida de 150 μm de i.d. O tubo pode ter uma janela clara no centro, de frente para um feixe de laser. O laser pode ser um Excimer laser, por exemplo, um Excimer laser de KrF. Quaisquer Excimer laseres disponíveis no mercado podem ser utilizados, por exemplo, laser COMPex 50 (Coherent Inc.). A potência do Excimer laser de KrF pode estar entre cerca de 100 e 150 mJ/pulso. Em uma modalidade preferida, a potência do laser pode estar entre cerca de 100 e 120 mJ/pulso. A frequência de pulso do laser pode ser ajustada para 6 Hz. A largura do feixe de laser na janela transparente do tubo de amostra pode ser de cerca de 1,5 mm a 3,0 mm. A largura do laser pode ser de 1,5 mm, 1,75 mm, 2 mm, 2,25 mm, 2,5 mm, 2,75 mm ou 3 mm. A potência do laser pode variar com o tempo. Portanto, em uma modalidade, o mesmo conjunto de experimentos de marcação pode ser realizado no mesmo dia para máxima consistência na marcação. Em outra modalidade, dosímetros podem ser adicionados para monitorar as flutuações de eficiência de marcação de execução a execução.

[0059] Após o laser pulsado ser ligado, a solução da amostra pode ser infundida no tubo, por exemplo, a uma vazão de 23,86 μL/min. A vazão pode ser ajustada de acordo com o i.d. do tubo, a frequência do laser e a largura medida do feixe de laser. A vazão deve ser adequada para garantir um volume de exclusão de 20% para evitar exposição e reação repetidas a OH. Em uma modalidade, a saída capilar pode ser coletada em um frasco que contém soluções para reduzir o H2O2 residual. A redução do H2O2 residual pode ser alcançada com o uso de agentes redutores, antioxidantes ou uma combinação dos mesmos. Agentes antioxidantes não enzimáticos de exemplo incluem, mas não se limitam a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, beta-caroteno, caroteno, taurina, hipotaurina, glutationa, selênio, zinco, metionina e ubiquinona. Agentes antioxidantes enzimáticos incluem, mas não se limitam a, SOD, catalase, glutaredoxina e glutationa redutase. Em uma modalidade preferida, a solução para reduzir o H2O2 residual contém metionina e catalase. A solução de saída de amostra marcada pode ser concentrada por centrifugação, por exemplo, com o uso de um filtro centrífugo ultracel-10K.

iii. Isolamento de Dímeros e Monômeros de Fragmentos de mAb Marcados

[0060] Em uma modalidade, a mistura de amostra marcada covalentemente pode ser separada com o uso de cromatografia de exclusão por tamanho, por exemplo, uma coluna de SEC BEH®. Após a separação por SEC e a detecção por UV (280 nm), os fragmentos diméricos e monoméricos podem ser coletados para análise de mapeamento de peptídeos trípticos.

[0061] Entende-se que os métodos descritos não se limitam a nenhuma sequência específica das etapas de fracionamento (digestão limitada) e marcação conforme apresentado neste documento.

iv. Mapeamento de Peptídeos de Fragmentos de Dímero Marcados

[0062] Em uma modalidade, as frações de dímero e monômero podem ser submetidas ao mapeamento de peptídeo tríptico. Os métodos de mapeamento de peptídeos trípticos são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, as frações de dímero e monômero podem ser secas, por exemplo, em um SpeedVac e reconstituídas em uma solução contendo ureia 8 M, ditiotreitol (DTT) 5 mM e Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) antes do mapeamento do peptídeo tríptico. As amostras desnaturadas e reduzidas podem ser alquiladas com iodoacetamida 10 mM (IAA) no escuro por 30 minutos. As soluções de amostra podem então ser diluídas com Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) para diminuir a concentração de ureia e digeridas com tripsina na razão de enzima para substrato de 1:20 (p/p) a 37 °C durante a noite. A digestão pode ser interrompida adicionando-se 10% de ácido fórmico (FA) a cada amostra de proteína digerida. As amostras podem então ser separadas por UPLC de fase reversa seguida por análise espectrométrica de massa online para determinar as massas peptídicas e confirmar as identidades peptídicas. Em uma modalidade, os experimentos de MS e MS/MS são conduzidos em um sistema MS Thermo Q Exactive Plus com dissociação colisional de alta energia (HCD) empregada para fragmentação de peptídeos durante os experimentos de MS/MS.

v. Identificação e Caracterização de Interfaces de Dimerização

[0063] Em uma modalidade para a marcação de grupo carboxílico, para se identificar peptídeos trípticos marcados com GEE, os dados de LC- MS/MS são pesquisados em um banco de dados ou mecanismo de pesquisa que contém a sequência de proteínas mAb correspondente com modificações variáveis de GEE1 (+85,0522) e GEE2 ( +57.0209) restrito a resíduos Asp e Glu, por exemplo, utilizando software como BYONIC™ (Protein Metrics). Para se quantificar a extensão da marcação com GEE em cada peptídeo tríptico contendo resíduo Asp/Glu, são gerados os cromatogramas de íons extraídos (EICs), com base no m/z do primeiro pico isotópico do peptídeo marcado com GEE e peptídeo nativo, e as áreas do pico extraídas são integradas. A porcentagem de cada peptídeo marcado com GEE é calculada com o uso da área de pico de EIC correspondente em relação à soma das áreas de pico dos peptídeos marcados e nativos. No caso de um peptídeo tríptico conter vários resíduos de Asp e Glu, os peptídeos marcados com GEE com eluição em diferentes tempos de retenção são examinados primeiro quanto aos espectros de MS/MS para confirmar os sítios de marcação e, em seguida, as áreas de pico de EIC correspondentes são usadas para calcular a porcentagem de marcação específica para o sítio. Finalmente, as extensões de marcação com GEE são comparadas entre a fração do dímero e a fração do monômero para cada peptídeo ou resíduo tríptico. As regiões que mostram extensões de marcação na fração de dímero menores do que na fração de monômero, provavelmente estão envolvidas na ou próximas à interface de dimerização.

[0064] Em uma modalidade para marcação com FPOP, os dados de LC-MS/MS são primeiro pesquisados em um banco de dados contendo a sequência de proteínas de mAb correspondente com todos os produtos de marcação oxidativos conhecidos (Tabela 1) para identificar todos os produtos/peptídeos de marcação. Os sítios de modificação no peptídeo são identificados com base nas informações de MS/MS e confirmados por m/z preciso, e a extensão da modificação para um determinado peptídeo foi calculada como: em que Iox é a intensidade do peptídeo modificado (excluída a oxidação do Met devido à possível oxidação do Met introduzido durante o manuseio da amostra sem marcação) e I é a intensidade do peptídeo não modificado. A análise quantitativa da marcação oxidativa ao nível do resíduo também é realizada para peptídeos que mostraram diferenças na extensão da modificação no nível do peptídeo entre dímeros e monômeros e peptídeos contendo resíduos Met. Os sítios de modificação no peptídeo são indicados com informações do MS2. Em algumas modalidades, onde a localização de uma modificação em um único resíduo não é possível, devido a informações limitadas de fragmentação de MS2 ou à presença de interferência da coeluição de isômeros de peptídeo, a modificação é indicada a ocorrer em um conjunto de possíveis resíduos. As regiões que mostram extensões de marcação na fração de dímero menores do que na fração de monômero, provavelmente estão envolvidas na ou próximas à interface de dimerização.

[0065] Uma modalidade provê um método para identificar sítios de interação não covalente ou interfaces de dimerização em um medicamento proteico, mediante a digestão da amostra de dímero enriquecido de um medicamento proteico em condições de digestão limitadas nativas para formar uma amostra de mistura de medicamento proteico contendo subdomínios diméricos não covalentemente ligados (por exemplo, dímeros F(ab)) e subdomínios monoméricos, e introduzir modificações detectáveis nos dímeros e monômeros da amostra da mistura de medicamento proteico para produzir dímeros e monômeros modificados. O método inclui separar os dímeros modificados e monômeros modificados com o uso de cromatografia de exclusão por tamanho nativa em frações de dímero modificado e monômero modificado, e digerir uma infinidade de ligações peptídicas do dímero modificado e frações de monômero modificado para formar amostras de peptídeo digerido. O método também inclui analisar as amostras de peptídeo digerido com o uso de cromatografia líquida/espectrometria de massa para obter os dados de espectrometria de massa das amostras de peptídeo digerido e determinar os sítios de modificação nos peptídeos digeridos na amostra de peptídeo digerido usando os dados de espectrometria de massa dos peptídeos digeridos em comparação com os dados de espectrometria de massa conhecidos do medicamento proteico com modificações específicas de resíduos introduzidas no medicamento proteico.

[0066] Em uma modalidade, os dímeros e monômeros são modificados por oxidação fotoquímica rápida para formar modificações oxidativas detectáveis nos dímeros e monômeros. A modificação pode ser uma modificação da cadeia lateral de aminoácidos.

[0067] Como observado anteriormente, o medicamento proteico pode ser um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, uma proteína recombinante, uma proteína de fusão ou suas combinações. Um medicamento proteico preferencial é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno.

[0068] Em uma modalidade, a cromatografia de exclusão por tamanho nativa é realizada com o uso de uma fase móvel compreendendo acetato de amônio e bicarbonato de amônio. Em uma outra modalidade, a amostra de proteína digerida é separada por cromatografia líquida de fase reversa.

[0069] Em uma modalidade, a modificação é selecionada do grupo que consiste em oxidação, dioxidação, trioxidação, quinurenina, ditiometila, descarboxilação, hidroxiquinurenina e suas combinações.

[0070] Geralmente, o medicamento proteico é digerido com uma enzima, por exemplo digerido com protease. As proteases de exemplos utilizadas na digestão limitada incluem, mas não se limitam a, papaína, ficaína, endoprotease Lys-C e IdeS. As proteases de exemplos utilizadas na digestão da ligação peptídica para formar uma variedade de peptídeos incluem, mas não se limitam a, tripsina, quimotripsina, pepsina e rLys-C.

[0071] Em algumas modalidades, a amostra de medicamento proteico é de uma cultura de lote alimentado.

B. Métodos de Produção de Medicamentos Proteicos com Interação ou Agregação Não Covalente Reduzida

[0072] Uma modalidade provê um método de produção de um anticorpo, incluindo as etapas de cultivar células que produzem o anticorpo em condições adequadas para produzir o anticorpo; purificar o anticorpo em condições adequadas para extrair o anticorpo; misturar o anticorpo com excipientes em condições adequadas para estabilizar o anticorpo; obter uma amostra do anticorpo i) da cultura celular, ii) após a purificação do anticorpo da cultura celular, ou iii) após a adição de excipientes ao anticorpo purificado; caracterizar as interfaces de dimerização no anticorpo usando os sistemas e métodos aqui descritos e modificar as condições para produzir o anticorpo ou modificar as interfaces de dimerização do anticorpo para ter dimerização reduzida e interação não covalente em relação a um anticorpo não modificado. A modificação das condições para a produção do anticorpo está explicada anteriormente nesse documento.

[0073] Em uma modalidade, a modificação pode ser uma substituição conservativa de aminoácidos ou uma modificação química das interfaces de dimerização.

Exemplos Exemplo 1: Marcação única da mistura de dímero e monômero por marcação covalente Métodos Digestão limitada de mAb-1

[0074] O mAb-1, um isotipo IgG1, foi digerido nos fragmentos F(ab) e Fc em condições nativas com a endoprotease LysC. Um dímero de mAb-1 foi primeiro diluído para 1 μg/μL em Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) e depois incubado com endoprotease Lys-C (proteína: enzima = 400: 1) a 37 °C por 1 hora. Este tratamento de digestão limitada cliva, especificamente, a cadeia pesada em um resíduo de Lys que é o terminal N das duas ligações de dissulfeto da região de dobradiça, levando à geração de fragmentos F(ab) e Fc. Quaisquer interações não covalentes do dímero (mais comumente F(ab) - F(ab)) das espécies de dímero são mantidas na mistura.

Digestão limitada de mAb-2

[0075] O mAb-2 e o isotipo IgG4 foram digeridos nos fragmentos F(ab’)2 e Fc* em condições nativas com FabRICATOR®, uma enzima IdeS de Streptocoocus pyogenes. O dímero de mAb-2 é primeiro diluído para 1 μg/μL em Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) e depois digerido com FabRICATOR® (1 miliunidade de IUB por 1 μg de proteína) a 37 °C por 1 hora. Este tratamento de digestão limitado cliva especificamente entre dois resíduos de Gly, um sítio que é terminal C para as duas ligações de dissulfeto da região da dobradiça. Este tratamento resultou na geração de um fragmento F(ab’)2 e dois fragmentos Fc/2 idênticos que se ligaram por meio de interações não covalentes (Fc*). A mistura de digestão é então incubada com 5 mM de ditiotreitol (DTT) a 37 °C por 30 minutos, o que reduz as ligações de dissulfeto intercadeia, mantendo intactas as ligações de dissulfeto intracadeia. Como resultado, os fragmentos Fab2 são reduzidos em dois fragmentos F(ab’) e o Fd e LC são ligados por meio de interação não covalente. As interações não covalentes do dímero (mais comumente F(ab’) - F(ab’)) das espécies de dímero também são mantidas na mistura.

[0076] A mistura anterior gerada de fragmentos de mAb e dímeros de fragmentos não covalentemente ligados é primeiro trocada de tampão em IxPBS (pH 7,4) a ~ 2 mg/mL.

Marcação do grupo carboxila

[0077] A pegada do grupo carboxila é uma técnica de marcação covalente comumente utilizada para estudar a conformação e interações de proteínas, marcando as cadeias laterais dos resíduos de Asp e Glu com GEE. Na reação de marcação com GEE, os grupos carboxila dos resíduos Asp e Glu localizados na superfície de uma proteína são facilmente modificados, enquanto os enterrados no interior da estrutura da proteína sofrem menos ou mesmo nenhuma modificação. Para realizar a marcação, 100 μL da amostra digerida de mAb-1 foram misturados com 50 μL de cloridrato de 1-etil-3- [3- dimetilaminopropil] carbodi-imida 0,2 M (EDC) e 50 μL de cloridrato de éster etílico de glicina 2 M (GEE) e incubados à temperatura ambiente por 1 hora. Após a extinção da reação de marcação com GEE por adição de 500 μL de Tris-HCl 1M (pH 8), a solução da amostra foi concentrada por centrifugação com o uso de um filtro centrífugo Ultracel-10K a cerca de 40 μL.

Rápida Oxidação Fotoquímica de Proteínas (FPOP)

[0078] A FPOP é um método de marcação de radicais hidroxila bem desenvolvido que marca a proteína na cadeia lateral do resíduo de aminoácido na escala de tempo de μs e tem sido amplamente aplicado no estudo das interações proteína-proteína/ligante. No processo de marcação, 50 μL da mistura com troca de tampão anterior foram, primeiramente, misturados com 1 x PBS e solução de His concentrada e solução de estoque de H2O2 para produzir 100 μL finais de solução contendo 1 mg/mL de mistura de digestão com mAb-2, His 350 μM e H2O2 20 mM. O H2O2 foi adicionado imediatamente antes da infusão da solução no tubo para FPOP. A amostra foi carregada em uma seringa estanque a gás de 100 μL e introduzida através de uma bomba de seringa acoplada ao tubo de sílica fundido de diâmetro interno de 150 μm com uma janela transparente no centro voltada para o feixe de laser. A potência do Excimer laser de KrF foi ajustada para 100 a 120 mJ/pulso, e sua frequência de pulso ajustada para 6 Hz. A largura do feixe de laser na janela transparente do tubo de amostra foi medida em 3,0 mm. Após ligar o laser pulsado, a solução da amostra foi infundida o tubo a uma vazão de 23,86 μL/min (ajustada de acordo com o i.d. do tubo, a frequência do laser e a largura medida do feixe de laser) para garantir um volume de exclusão de 20% para evitar exposição e reação repetidas de •OH. A saída capilar foi coletada em um frasco contendo 20 μL de Met 100 mM e 2 μL de 1 mg/mL de catalase para reduzir o H2O2 residual. Finalmente, a solução da amostra marcada foi concentrada por centrifugação com o uso de um filtro centrífugo ultracel-10K até cerca de 40 μL.

SEC/MS

[0079] A mistura de amostra marcada covalentemente foi injetada em uma coluna de SEC BEH® (300 mm x 4,6 mm, 200Â, 1,7 μm) que foi pré- equilibrada com a fase móvel (acetato de amônio 140 mM e bicarbonato de amônio 10 mM, pH 7,4) em um regime de vazão de 0,2 mL/min. Após a separação da SEC e a detecção por UV (280 nm), os fragmentos diméricos e monoméricos foram coletados para análise de mapeamento de peptídeos trípticos.

Mapeamento de Peptídeos

[0080] Antes da digestão tríptica, todas as frações de dímero e monômero foram secas em um SpeedVac e reconstituídas em uma solução contendo ureia 8 M, ditiotreitol (DTT) 5 mM e Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) e mantidas a 50 °C por 30 minutos. As amostras desnaturadas e reduzidas foram alquiladas com iodoacetamida 10 mM (IAA) no escuro por 30 minutos. As soluções de amostra foram então diluídas dez vezes com Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) para diminuir a concentração de ureia para 0,8 M e digeridas com tripsina na razão de enzima para substrato de 1:20 (p/p) a 37 °C durante a noite. A digestão foi então interrompida ao se adicionar 10% de FA para produzir 0,2% de FA final. As alíquotas (~ 5 μg) de cada amostra de proteína digerida foram então separadas por UPLC de fase reversa seguida por análise espectrométrica de massa online para determinar as massas de peptídeo e confirmar as identidades do peptídeo. Os experimentos de MS e MS/MS foram conduzidos em um sistema Thermo Q Exactive Plus MS com dissociação colisional de maior energia (HCD) empregado para fragmentação de peptídeos durante os experimentos de MS/MS.

Resultados Marcação do Grupo Carboxila

[0081] Para marcação do grupo carboxílico, para se identificar peptídeos trípticos marcados com GEE, os dados de LC-MS/MS foram pesquisados em um banco de dados contendo a sequência de proteínas mAb correspondente com modificações variáveis de GEE1 (+85,0522) e GEE2 (+57,0209) restritas a resíduos de Asp e de Glu. Para a quantificação da extensão da marcação com GEE em cada peptídeo tríptico contendo resíduo Asp/Glu, foram gerados cromatogramas de íons extraídos (EICs), com base no m/z do primeiro pico isotópico do peptídeo marcado com GEE e peptídeo nativo, e as áreas de pico extraídas foram integradas. A porcentagem de cada peptídeo marcado com GEE foi calculada com o uso da área de pico de EIC correspondente em relação à soma das áreas de pico dos peptídeos marcados e nativos. No caso de um peptídeo tríptico contendo vários resíduos de Asp e Glu, os peptídeos marcados com GEE eluindo em diferentes tempos de retenção foram examinados primeiro quanto aos espectros de MS/MS para confirmar os sítios de marcação e, em seguida, as áreas de pico de EIC correspondentes foram usadas para calcular a porcentagem de marcação específica do sítio. Finalmente, as extensões de marcação com GEE foram comparadas entre a fração dímero e a fração de monômero para cada peptídeo ou resíduo tríptico. As regiões que mostram extensões de marcação diminuídas na fração de dímero que na fração de monômero provavelmente estão envolvidas ou próximas à interface de dimerização (Figuras 2, 3A e 3B). Marcação com FPOP

[0082] Para marcação com FPOP, os dados de LC-MS/MS foram pesquisados primeiro em um banco de dados contendo a sequência de proteínas de mAb correspondente com todos os produtos de marcação oxidativos conhecidos (Tabela 1) para identificar todos os produtos de marcação. Os sítios de modificação no peptídeo foram identificados com base nas informações de MS/MS e confirmados por m/z preciso, e a extensão da modificação para um determinado peptídeo foi calculada como: Extensão daem que Iox é a intensidade do peptídeo modificado (oxidação do Met excluído devido à possível oxidação do Met introduzido durante o manuseio da amostra sem marcação) e I é a intensidade do peptídeo não modificado. Uma análise quantitativa da marcação oxidativa no nível do resíduo também foi realizada para peptídeos que mostraram diferenças na extensão da modificação no nível do peptídeo entre dímeros e monômeros e peptídeos contendo resíduos de Met. Os sítios de modificação no peptídeo foram indicados com informações do MS2. Em alguns casos, onde a localização de uma modificação em um único resíduo não foi possível, devido à limitada informação de fragmentação do MS2 ou à presença de interferência da coeluição de isômeros de peptídeo, a modificação foi indicada a ocorrer em um conjunto de possíveis resíduos. A distribuição de Poisson das espécies de marcação +0, +16, +32, +48 etc. no nível de subdomínio indica que não houve marcação excessiva (Figuras 4A a 4C). As regiões que mostram extensões de marcação na fração de dímero menores do que na fração de monômero provavelmente estão envolvidas na ou próximas à interface de dimerização (Figuras 5A e 5B). Tabela 1. Possíveis prod utos de marcação oxidativa.

Exemplo 2: Otimização de FPOP Métodos :

[0083] O protocolo de FPOP do Exemplo 1 foi seguido. Vários componentes do protocolo, isto é, posição do laser, concentração de sequestrador e inclusão de inibidores foram manipulados para determinar seu efeito no ensaio.

Resultados :

[0084] A Tabela 2 mostra os parâmetros experimentais para as Figuras 6A e 6B. Como visto nas Figuras 6A e 6B, a posição e a potência do laser afetam a eficiência de marcação da proteína lisozima. As espécies oxidadas na amostra que foi analisada com o uso dos parâmetros da Figura 6B, incluindo uma posição de foco mais próxima e uma potência de laser de 122 mJ, mostram um bom ajuste da distribuição do produto no estado +0, +16, + 32... para uma distribuição de Poisson. Isso é indicativo de maior eficiência de marcação.Tabela 2. Parâmetros experimentais

[0085] Como demonstrado pelos dados de distribuição de Poisson nas Figuras 7A a 7F e 8A a 8D, a potência do laser e a concentração do sequestrador afetam a eficiência de marcação da proteína em um nível muito maior que a concentração da proteína.

[0086] O mAb1 desglicosilado sem troca de tampão mostra a extensão de marcação diminuída (Figura 9B) em comparação com o mAb1 submetido a troca de tampão (Figura 9A). Isso sugere que os inibidores podem interferir na marcação oxidativa das proteínas.

[0087] Embora no relatório descritivo anterior esta invenção tenha sido descrita em relação a certas modalidades do mesmo e muitos detalhes tenham sido apresentados com a finalidade de ilustração, ficará evidente aos os versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e que alguns dos detalhes aqui descritos podem variar consideravelmente sem se afastar dos princípios básicos da invenção.

[0088] Todas as referências mencionadas nesta descrição estão aqui incorporadas por referência, na sua totalidade.

Claims (12)

1. Método para identificar sítios de interação não covalente ou interfaces de dimerização em um medicamento proteico com interações ou agregações não covalentes reduzidas, em que as interfaces de dimerização ou sítios de interação não covalentes identificados no medicamento proteico foram alterados usando substituições de aminoácidos conservativas para modificar as interfaces de dimerização do medicamento proteico para ter dimerização reduzida e interação não covalente em relação a um medicamento proteico não modificado, o método caracterizado pelo fato de que compreende: empregar digestão enzimática limitada do medicamento proteico em condições nativas para formar uma mistura de amostra de dímero de medicamento proteico compreendendo monômeros e dímeros não covalentemente ligados; incubar a mistura de amostra de dímero de medicamento proteico com um agente redutor; introduzir modificações oxidativas detectáveis nos dímeros e monômeros da mistura de amostra de dímero de medicamento proteico para produzir dímeros e monômeros modificados, em que as modificações detectáveis são introduzidas por oxidação fotoquímica rápida de anticorpos; separar os dímeros modificados e os monômeros modificados com o uso de cromatografia de exclusão por tamanho nativa em frações de dímero modificado e monômero modificado; digerir as frações de dímero modificado e de monômero modificado para formar amostras de peptídeo digerido; separar as amostras de peptídeo digerido com o uso de cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC-MS) para obter dados de espectrometria de massa das amostras de peptídeo digerido; e determinar os sítios de modificação em cada peptídeo nas amostras de peptídeo digerido com o uso dos dados de espectrometria de massa dos peptídeos em comparação com os dados de massa conhecidos do medicamento proteico, mediante o cálculo da massa de cada peptídeo e peptídeo modificado desse medicamento proteico, assim caracterizando interfaces de dimerização ou sítios de interação não covalentes no medicamento proteico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a digestão enzimática limitada usa uma enzima que é selecionada do grupo que consiste em papaína, ficaína, endoprotease Lys-C e IdeS ou sua forma modificada.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento proteico compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, uma proteína recombinante, uma proteína de fusão ou suas combinações.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo biespecífico, ou um fragmento de ligação ao antígeno.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de peptídeo digerido é separada por cromatografia líquida de fase reversa.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cromatografia é realizada com o uso de uma fase móvel compreendendo acetato de amônio e bicarbonato de amônio.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as frações de dímero modificado e de monômero modificado são digeridas por uma enzima que quebra as ligações químicas covalentes que ligam dois resíduos de aminoácidos consecutivos para formar peptídeos.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de medicamento proteico é proveniente de uma cultura de lote alimentado, uma etapa do processo de purificação ou uma substância farmacêutica formulada.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento proteico é um anticorpo e os dímeros na mistura compreendem dois fragmentos F(ab’) ou F(ab) de interação.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o medicamento proteico é um anticorpo e os monômeros na mistura compreendem fragmentos F(ab) e fragmentos Fc.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é selecionado do grupo que consiste em ditiotreitol (DTT), beta-mercaptoetanol (BME), 2 -aminoetanotiol (2-MEA- HCl), cloridrato de Tris (2-carboxietil) fosfina, (TCEP), cloridrato de cisteína e sal de sódio do ácido 2-mercaptoetanossulfônico (MESNA).

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de incubação reduz as ligações de dissulfeto intercadeia, mantendo intactas as ligações de dissulfeto intracadeia.