JP7137619B2 - Bcmaに対して高い親和性を有する抗bcma抗体およびそれを含むがんの処置のための医薬組成物 - Google Patents
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Description
(1)ファージディスプレイを用いた抗ヒトBCMA sdAb抗体の選択
遺伝子組換え技術を用いて発現させる遺伝子配列を大腸菌に寄生するバクテリオファージのゲノムに挿入し、ファージディスプレイ技術を用いて抗体の選択を行った。これにより、挿入された遺伝子がファージ表面上でファージコートタンパク質の1つと融合した形態で発現される。
ファージディスプレイにより合成した重鎖可変ドメイン(VHドメイン)の最終的に増幅された集団の単一コロニーを収集した。その後、OD600値が約0.8~1.0に達するまで1.5mlのSB/カルベニシリン中において37℃および220rpmで培養し、1mM IPTGとともに30℃および200rpmで12時間以上培養した。培養物を5,500rpmで5分間遠心分離した後、各上清のみをBCMA抗原でコーティングされたELISAプレートに添加した。室温で2時間反応を進行させた後、PBST(1×PBS、0.05% Tween20)で4回洗浄した。1% BSA/1×PBSで1/5,000に希釈したHRP/抗hFab-HRP複合体を添加し、室温で1時間反応を進行させた。その後、PBST(1×PBS、0.05% Tween20)で再度4回洗浄した。TMB溶液を添加し、5~10分間反応を進行させた。次に、TMB停止液を添加した。TECANのSunriseを用いて測定波長450nmでOD値を読み取り、OD値の高いクローンを個々のクローンとして取得した。
選択された20クローンのうち、BCMAを発現する腫瘍細胞株に対して優れた結合能を有することが予想されるクローンMN1、MN5、MN7およびMN8を精製した。クローンMN1、MN5、MN7およびMN8の組換えヒトBCMAに対する定量的な結合能(親和性)を、OCTETシステム(Pall Corporation)を用いて測定した。HEK293細胞から精製したBCMA(Cat. No. 193-BC, R&D Systems)をバイオセンサー(Pall Corporation)に固定した。次に、Kinetic bfr(Pall Corporation)で段階的に希釈したMN1、MN5、MN7またはMN8抗体を0.078nM~5nMの濃度範囲で120秒間結合させ、30μl/分の流速で1,800秒間流すことによって解離させた。BCMAに結合した抗体の解離を、10mMグリシン-HCl pH1.5を30μl/分の流速で30秒間流すことによって誘導した(表3)。結合親和性を、Octetシステムデータ分析ソフトウェアを用いて動態パラメーター(KonおよびKoff)および平衡解離定数(KD)として得た(表4)。
合成ライブラリー由来の抗BCMA抗体がBCMA発現細胞に選択的に結合するか否かを評価するために、がん細胞株におけるBCMAの発現レベルを測定し、抗体結合をFACS試験によって同定した。
細胞表面BCMAの発現を、2つの多発性骨髄腫細胞株(MM1S、H929)および1つの乳がん細胞株(MB231、陰性対照)においてFACS試験によって確認した。培養中の各多発性骨髄腫細胞株および乳がん細胞株を50mlチューブに配置し、1,000rpmおよび室温で5分間遠心分離した。その後、培養液を捨て、PBSで1回洗浄した。残留物をFACS緩衝液に懸濁した後、丸底チューブに移した。2,000rpmおよび室温で3分間遠心分離した。上清を捨て、FACS緩衝液でほぐし、1×106細胞/100μlを得た。抗BCMA抗体(Abcam)を4℃においてBCMAに対するFACSアッセイ抗体として用いた。30分後、FACS緩衝液で2回洗浄した。PE結合抗体を試料あたり0.5μlの量で添加し、4℃で30分間結合させた。細胞を1,500rpmで5分間の遠心分離により収集した。その後、300μlの固定化緩衝液を添加し、細胞を再懸濁した。次いで、FACS fortessaにより測定を行った。結果を図2に示す。
ファージディスプレイにより選択された20の抗体においてBCMAを発現する多発性骨髄腫細胞株H929に対する結合能を有する抗体を選択するためにFACS試験を行った。陰性対照としてBCMAを発現しない乳がん細胞株MB231を用いた。
BCMAを発現する多発性骨髄腫細胞株H929およびMM1Sに対する結合能を有することが示されている4つの抗体MN1、MN5、MN7およびMN8を精製し、抗BCMA抗体が多発性骨髄腫細胞株に選択的に結合するか否かをFACS試験により確認した。陰性対照としてBCMAを発現しない乳がん細胞株MB231を用いた。
Claims (10)
- B細胞成熟抗原(BCMA)に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであって、
配列番号1、5、7または8のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン(VHドメイン)を含む、抗体または抗体フラグメント。 - BCMAに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントであって:
(i) 配列番号21のアミノ酸配列からなるVH-CDR1;
配列番号22のアミノ酸配列からなるVH-CDR2;および
配列番号23のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含む、
(ii) 配列番号27のアミノ酸配列からなるVH-CDR1;
配列番号28のアミノ酸配列からなるVH-CDR2;および
配列番号31のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含む、
(iii) 配列番号27のアミノ酸配列からなるVH-CDR1;
配列番号28のアミノ酸配列からなるVH-CDR2;および
配列番号33のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含む、あるいは
(iv) 配列番号27のアミノ酸配列からなるVH-CDR1;
配列番号28のアミノ酸配列からなるVH-CDR2;および
配列番号34のアミノ酸配列からなるVH-CDR3を含む、
抗体または抗体フラグメント。 - 抗体がヒト化抗体である、請求項1または2に記載の抗体または抗体フラグメント。
- 抗体のフラグメントが単一ドメイン抗体(sdAb)である、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメント。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体の重鎖可変ドメイン(VHドメイン)をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項5記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項6記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項7記載の宿主細胞を培養することを含む、BCMAに特異的に結合する抗体を作製する方法。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントを含む、がんを予防または処置するための医薬組成物。
- がんが多発性骨髄腫(MM)である、請求項9に記載の医薬組成物。
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