JP7096893B2 - 単一分子のための一本鎖環状dna鋳型の作製 - Google Patents
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Description
以下の定義は、本開示の理解に役立つ。
いくつかの実施形態では、配列決定のステップは、配列アライニングのステップを含む配列解析を含む。いくつかの実施形態では、アライニングを使用して、複数の配列、例えば、同じバーコード(UID)を有する複数からのコンセンサス配列を決定する。いくつかの実施形態では、バーコード(UID)を使用して、すべてが同一のバーコード(UID)を有する複数の配列からコンセンサスを決定する。他の実施形態では、バーコード(UID)を使用してアーチファクトを排除し、すなわち、同一のバーコード(UID)を有する一部の配列中に存在するがすべての配列中に存在するわけではないバリエーションを排除する。PCRエラーまたは配列決定エラーに起因するそのようなアーチファクトを排除することができる。
配列決定ライブラリーは、図1に示す方法に従って、500ngまたは1ugの大腸菌(E. coli)ゲノムDNAから調製した。ライブラリーは、Pacific BioSciences RSII配列決定プラットフォームに特異的なアダプターを含んでいた。エキソヌクレアーゼ耐性の(おそらくは環状)物質は、Bioanalyzer RNA picoアッセイを使用して分析した。最終的なライブラリー収量は、開始DNA質量の10~20%であった。
配列決定ライブラリーは、図2に示す方法に従って、500ngまたは1ugの大腸菌ゲノムDNAから調製した。ライブラリーは、Pacific BioSciences RSII配列決定プラットフォームに特異的なアダプターを含んでいた。アダプター付加核酸は、表1のプライマー対のうちの一対で増幅した。
Claims (13)
- 二本鎖標的核酸の各鎖を別々に配列決定する方法であって、
a)反応混合物において、二本鎖標的核酸をアダプターに連結して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、ここで、前記アダプターがプライマー結合部位を含むものである、前記ステップ;
b)前記アダプター付加標的核酸を、前記プライマー結合部位に相補的な一対のプライマーで増幅し、それによりアンプリコンを形成するステップであって、ここで、前記一対のプライマーのうちの1つのプライマーがエキソヌクレアーゼによる消化速度に影響する修飾ヌクレオチドを含むものであり、前記修飾ヌクレオチドが5’-リン酸化末端ヌクレオチドであり、前記エキソヌクレアーゼがラムダエキソヌクレアーゼである、前記ステップ;
c)前記反応混合物をエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより反応混合物から前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第1の相補鎖を除去するステップ;
d)ポリヌクレオチドキナーゼによって前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第2の相補鎖に5’-リン酸を付加し、前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第2の相補鎖を環化して、一本鎖環を形成するステップ;
e)配列決定プライマーを前記一本鎖環にアニーリングするステップ;および
f)プライマーを伸長し、それにより標的核酸の1つの鎖を配列決定するステップ;
を含む、前記方法。 - 前記アダプターへの連結がライゲーションによるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記ライゲーションが、前記標的核酸と前記アダプターの付着末端を連結することによるものである、請求項2に記載の方法。
- 前記アダプターが、二本鎖部分と一本鎖部分とを含むものである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アダプターが少なくとも1つのバーコードを含むものである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アダプターが少なくとも1つのプライマー結合部位を含むものである、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップd)の後に、第2のエキソヌクレアーゼ消化ステップをさらに含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記環化がスプリントライゲーションによるものである、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 配列決定プライマー結合部位がアダプター内にある、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップc)の前に、反応混合物を、グリコシラーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼと接触させることをさらに含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中の二本鎖標的核酸から一本鎖核酸のライブラリーを作製する方法であって、
a)反応混合物において、二本鎖標的核酸をアダプターに連結して、アダプター付加標的核酸を形成するステップであって、ここで、前記アダプターがプライマー結合部位を含むものである、前記ステップ;
b)前記アダプター付加標的核酸を、前記プライマー結合部位に相補的な一対のプライマーで増幅し、それによりアンプリコンを形成するステップであって、ここで、前記一対のプライマーのうちの1つのプライマーがエキソヌクレアーゼによる消化速度に影響する修飾ヌクレオチドを含むものであり、前記修飾ヌクレオチドが5’-リン酸化末端ヌクレオチドであり、前記エキソヌクレアーゼがラムダエキソヌクレアーゼである、前記ステップ;
c)前記反応混合物をエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより反応混合物から前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第1の相補鎖を除去するステップ;および
d)ポリヌクレオチドキナーゼによって前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第2の相補鎖に5’-リン酸を付加し、前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第2の相補鎖を環化して、一本鎖環を形成し、それにより一本鎖環状標的核酸のライブラリーを形成するステップ;
を含む、前記方法。 - 二本鎖標的核酸の各鎖を別々に配列決定する方法であって、
a)反応混合物において、標的核酸を一対の標的特異的プライマーで増幅し、それによりアンプリコンを形成するステップであって、ここで、前記一対のプライマーのうちの1つのプライマーが、エキソヌクレアーゼによる消化を阻害する修飾ヌクレオチドを含むものであり、前記修飾ヌクレオチドが5’-リン酸化末端ヌクレオチドであり、前記エキソヌクレアーゼがラムダエキソヌクレアーゼである、前記ステップ;
b)前記反応混合物をエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより反応混合物からアンプリコンの2つの相補鎖のうちの第1の相補鎖を除去するステップ;
c)ポリヌクレオチドキナーゼによって前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第2の相補鎖に5’-リン酸を付加し、前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第2の相補鎖を環化して、一本鎖環を形成するステップ;
d)配列決定プライマーを前記一本鎖環にアニーリングするステップ;および
e)前記プライマーを伸長し、それにより標的核酸の1つの鎖を配列決定するステップ;
を含む、前記方法。 - 試料中の二本鎖標的核酸から一本鎖核酸のライブラリーを作製する方法であって、
a)反応混合物において、一対の標的特異的プライマーで標的核酸を増幅し、それによりアンプリコンを形成するステップであって、ここで、前記一対のプライマーのうちの1つのプライマーがエキソヌクレアーゼによる消化速度に影響する修飾ヌクレオチドを含むものであり、前記修飾ヌクレオチドが5’-リン酸化末端ヌクレオチドであり、前記エキソヌクレアーゼがラムダエキソヌクレアーゼである、前記ステップ;
b)前記反応混合物をエキソヌクレアーゼと接触させ、それにより反応混合物からアンプリコンの2つの相補鎖のうちの第1の相補鎖を除去するステップ;および
c)ポリヌクレオチドキナーゼによって前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第2の相補鎖に5’-リン酸を付加し、前記アンプリコンの2つの相補鎖のうちの第2の相補鎖を環化して、一本鎖環を形成し、それにより一本鎖環状標的核酸のライブラリーを形成するステップ;
を含む、前記方法。
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