KR100463475B1 - 자기성피그먼트 - Google Patents

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Abstract

자기성 입자는 실질적으로 무기공인 유리 표면 또는 직경 10 nm 미만의 기공을 갖는 외유리 표면을 갖는다. 유리 표면을 갖는 강자성 입자는 바람직하게는 시료로부터 생물학적 물질을 단리하는데 사용한다. 이것은 신속하고 신뢰할만한 정제를 보장한다.

Description

자기성 피그먼트
본 발명의 주제는 유리표면을 갖는 자기성 입자, 및 카오트로픽(chaotropic)염의 존재하 유리 입자를 이용하여 생물학적 물질, 특히 핵산을 정제하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 주제는 이러한 생물학적 물질을 단리하는 방법 및 생물학적 물질을 농축하고 이를 고농도의 염을 갖은 용액으로부터 저농도의 염을 갖은 용액으로 전이시키는 방법이다.
많은 생물학적 물질, 특히 핵산은 이들의 천연적 환경으로부터의 단리면에서 특별한 난제가 따른다. 한편으로는 이것들은 종종 매우 적은 농도로 존재하고, 다른 한편으로는 이것들은 많은 기타 고형물 및 이것들이 단리되거나 측량하는데 어렵게만드는 용해 물질의 존재에서 발견된다.
이러한 이유로, 핵산을 이들의 천연적 환경으로부터 단리하기위한 많은 방법 및 물질이 최근에 제안되었다. Proc.Natl.Acad. USA 76, 615-691 (1979)에, 예컨대, 요오드화나트륨의 존재하 아가로오스겔중의 핵산을 분쇄 박편 유리에서 결합시키는 방법이 제안되었다.
과염소산나트륨의 존재하 유리 더스트상의 박테리아로부터의 플라스미드 DNA의 정제가 Anal.Biochem.121,382-387 (1982) 에 기재되어 있다.
DE-A-37 34 442 에는, 아세트산을 이용한 파아지 입자의 침전 및 과염소산염으로 파아지 입자를 용균시켜 유리섬유 필터상의 단일가닥 M13 파아지 DNA를 단리하는 것이 기재되어 있다. 유리섬유 필터에 결합된 핵산은 세척한후 Tris/EDTA 버퍼중의 멘톨함유 버퍼로 용출한다.
lambda 파아지로부터 DNA 을 정제하는 유사한 방법이 Anal. Biochem. 175, 196-201 (1988) 에 기재되어 있다.
종래기술에 공지된 방법은 카오트로픽 염용액중에서 유리표면에 핵산을 선택적으로 결합시키고 아가로오스, 단백질 또는 세포잔유물과 같은 오염물로부터 핵산을 분리하는 것을 필요로 한다. 종래기술에 따라 오염물로부터 유리입자를 분리하기 위해서는, 입자를 원심분리하거나 유리섬유필터를 통해 액체를 배출시킨다. 그러나, 이것은 상기 방법을 대량의 시료를 처리하기위해 사용하는데 방해가 되는 제한적 단계이다.
염 및 에탄올을 첨가하여 침전시킨후 핵산을 고정화시키는 자기성 입자의 사용이 Anal.Biochem.201,166-169 (1992) 및 PCT GB 91/00212 에 기재되어 있다. 이 방법에 있어서, 핵산은 자기성 입자와 더불어 교착된다. 교착물은 자기장을 적용하고 세척단계를 실시하여 원래의 용매로부터 분리시킨다. 한 번의 세척단계후, 핵산은 Tris 버퍼에 용해시킨다. 그러나, 이 방법은 침전이 핵산에 대해 선택적이지 못하다는 점에서 불리하다. 오히려, 다양한 고형물 및 용해된 물질들이 또한 교착된다. 그 결과, 이 방법은 존재할 수 있는 특정 효소반응의 임의의 억제제의 상당량을 제거하는데 사용할 수 없다.
자기성 입자가 함침된 기공성 유리가 US-A-4,233,169 에 기재되어 있다.
또한 기공성의 특정 유리 매트릭스에 자기성 입자를 함유하고, 스트렙타비딘을 함유하는 층으로 덮여진, 자기성의 기공성 유리를 시판품으로 이용할 수 있다. 이 제품은 생물학적 물질, 예컨대, 단백질 또는 핵산을 단리하는데 사용할 수 있는데, 이는 이것들이 복잡한 제조단계에서 개질되어 바이오틴에 공유결합하는 경우이다.
본 발명의 목적은 생물학적 물질을 고정화시키기 위한 더 나은 물질 및 생물학적 물질, 특히 핵산을 단리하며, 또한 번잡한 진단방법에 사용하는데 적합한 단순방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 주제는 실질적으로 무기공이거나, 직경 10nm 미만의 기공을 갖는 외부유리표면을 갖는 자기성 입자이다. 본 발명의 또 다른 주제는 유리표면을 갖는 강자성 입자, 생물학적 물질, 특히 핵산의 단리방법 및 자기성 유리입자의 제조방법이다.
숙련가에 의하면, 입자는 소직경의 고형 물질이다. 또한 이와같은 입자는 종종 피그먼트(pigment)로서 불리운다. 본 발명에 따라, 100 ㎛ 미만의 평균 입자크기를 갖는 입자가 특히 적합하다. 좀더 바람직하게는 이것은 10 내지 60 ㎛ 의 평균입자크기를 갖는다. 입자크기의 분포는 바람직하게는 비교적 균일하다. 특히, 크기에서 <10㎛ 또는 >60㎛ 의 입자는 거의 없다.
자석에 끌리는 이러한 물질은 자기성, 즉, 강자성 또는 초상자성 물질로 불리운다. 또한, 연 자기성으로 불리우는 물질 (예 아철산염) 또한 자기성이 있는 것으로 이해된다. 특히 만일 강자성 물질이 아직 예비자성화되지 않았으면, 본 발명에 있어서 강자성물질이 특히 바람직하다. 여기에서 예비자성화는 잔류 자기를 증가시키는 자석과 접촉시키는 것을 의미한다. 특히 바람직한 것은 자철광(Fe3O4) 또는 Fe2O3 와 같은 강자성 물질이다.
입자의 외표면은 입자 자체를 통과하여 절단하지 않는 입자의 주위쪽으로 수직선이 바깥쪽으로 그려질 수 있는 연속표면을 의미한다.
기공은 입자의 외표면의 오목부를 의미한다. 표면은 표면상의 오목부에서 그려진 수직선이 입자의 인접주위의 방향에서 적어도 한 번 입자를 절단하는 입자에까지 도달한다. 또한, 기공은 기공의 하나의 반경보다 더 깊은 깊이로 입자에 도달한다.
본 발명에 따른 유리는 실리슘을 함유하는 비정질 물질을 의미한다. 유리는 하기와 같은 기타의 물질을 함유할 수 있다 :
B2O3 (0-30%)
Al2O3 (0-20%)
CaO (0-20%)
BaO (0-10%)
K2O (0-20%)
Na2O (0-20%)
MgO (0-18%)
Pb2O3 (0-15%)
또한 유리는 Mn2O3, TiO2, As2O3, Fe2O3, CuO, CoO 등과 같은 수많은 기타 산화물을 적은 백분율 (0-5%) 로 함유할 수 있다. 붕규산 유리, 박편 유리 또는 실리카의 조성물로된 표면이 특히 효과적임이 입증되었다. 핵산수율면에서 특히 바람직한 붕규산 유리는 25%를 초과하는 보록시드 함량을 갖는다. SiO2/B2O3의 70/30 조성을 갖는 유리가 특히 바람직하다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 것은 겔 졸 방법을 이용하여 형성된후 건조 및 압축된 유리이다. 이 방법의 기본적 원리는 공지되어 있고, 예컨대, C.J.Brinker, G.W. Scherer"Sol Gel Science-The Physics and Chemistry of Sol Gel Processing", Academic Press Inc. 1990, Sol-Gel Optics, Processing and Applications, Lisa C.Klein, Ed., Kluwer Academic Publishers 1994, p. 450 ff., 및 DE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117041 및 DE-A-4217432 에 기재되어 있다. 그러나, 현재까지 자기성 입자에 대한 원리는 기재되어 있지 않다. 생물학적 물질, 특히 핵산을 단리하는데 사용하는 경우 매우 놀라운 특성을 갖는 자기성 입자를 제조하는데 이 방법을 사용할 수 있다는 사실이 기대되지 않았다. 겔-졸 방법에서 네트워크형성 성분의 알콕시드, 예컨대, SiO2, B2O3, Al2O3, TiO2, ZrO3, GeO2 은 기타성분의 산화물 및 염, 예컨대 알코올 용액에서 배합한후 가수분해시킨다. 하기의 방정식에는 소듐 보로알루미늄 실리케이트 유리의 제조방법이 기술되어 있다:
물을 첨가하여 출발성분의 가수분해공정을 개시시킨다. 알칼리 이온은 규산 에스테르의 가수분해의 속도에 촉매 영향을 미치기 때문에 반응은 상대적으로 빠르게 진행한다. 일단 겔이 형성되면 이것은 열공정을 이용하여 건조 및 치밀하게하여 유리를 형성시킬 수 있다.
졸 : 피그먼트비율은 본 발명에의해 제공되는 자기성 피그먼트의 수율에 상당한 영향을 미친다. 피그먼트 분량은 생성되는 덩어리가 여전히 펌핑되거나 분무될 수 있을 정도로 작아야 한다는 사실에 의해 비율이 제한받는다. 만일 피그먼트 분량이 너무 적으면, 예컨대, 비자기성 물질의 미분량이 너무 크게 되어 간섭을 유발한다. 10 내지 25 g 피그먼트 : 100 ml 졸의 비율이 피그먼트 수율면에서 유용한 것으로 발견되었다.
분말을 제조하기 위하여, 슬러리를 바람직하게는 노즐을 통해 분무하고 에어로졸은 이를 낙하시키면서 건조시킨다. 노즐은 바람직하게는 가열시켜 슬러리의 건조를 촉진시킨다. 노즐의 외형에 따라, 노즐온도는 바람직하게는 120 내지 200℃ 이다. 충분한 증발속도를 이용하나 과가열은 피함으로서 타협점을 찾았다.
수율을 최적화하기 위해서는, 치밀화 온도는 가능한 높아야 한다. 그러나, 만일 온도가 너무 높으면, 입자는 함께 부착되어 체로 걸러야하는 응집체를 형성할 것이다. 너무 높은 온도에서의 입자의 추가 처리는 자성의 손실을 가져올 것이다. 그러므로 너무 높은 온도는 생략하여야 한다.
실질적으로 무기공 표면은 표면적의 5% 미만, 바람직하게는 2% 미만, 특히 바람직하게는 0.1 % 미만만을(전술한 바와 같이) 기공이 덮고 있는 표면을 의미한다. 만일 기공이 존재하면, 이것은 바람직하게는 10nm 미만, 특히 바람직하게는 1nm 의 직경을 갖는다.
본 발명에 따라 특히 바람직한 것은 TiO2 로 피복된 운모핵 및 이것상에 고정화된 자철광 입자를 함유하는 입자이다. 이 구조에서, 형성된 복합체 물질은 유리층으로 둘러싸인다. 핵 및 자철광 입자 양쪽은 결정성 및 비기공성이다. 자철광 입자에 의해 차지되지 않은 운모의 표면상의 공간은 자철광 입자의 정점에서보다 두꺼운 유리층으로 덮여 기본적으로 비기공성 유리 표면이 된다.
자기성 입자의 비기공성은 단지 외표면에 근거하고 입자의 내부에는 근거하지 않는다. 그러므로 입자는 단지 만일 표면이 실질적으로 무기공 유리 또는 직경 10nm 미만의 기공을 갖는 유리 표면으로 둘러싸이면 내부에서는 기공성일 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 의해 제공된 자기성 입자는 특히 시료로부터 생물학적 물질을 단리시키는데 적합하다. 특히 긴 핵산은 자기성 입자상에 고정화되는 경우 파괴되지 않거나-또는 단지 최소한도로 파괴된다. 또한, 핵물질은 천연자원이어서 거의 생태학적 문제를 야기하지 않는다. 더욱이, 본 발명에 따른 입자는 저렴하고 제조하기 용이하다.
본 발명의 또다른 목적은 유리표면을 갖는 강자성 입자이다. 초상자성 입자는 종래기술에 기재되어 있다. 유리표면으로 덮여진 강자성 입자는 생물학적 물질을 단리하는데 상당한 이점을 제공함이 실증되었다. 만일 강자성 입자가 자기장과 접촉되지 않는다면, 중력만이 입자가 침전되도록하는 유일한 힘이다. 이것은 용액을 진탕함으로서 용이하고 빠르게 재현탁시킬 수 있다. 자기장을 이용하지 않는 침전방법은 바람직하게는 입자표면상의 생물학적 물질의 고정화보다 느리게 진행한다. 이것은 핵산에 대해서 특히 사실이다. 강자성 입자는 자석을 이용하여 시료 액체중의 특정위치에서 용이하게 채집할 수 있다. 그러면 액체가 입자로부터 분리됨으로해서 고정화된 생물학적 물질로부터 분리된다.
본 발명에 의해 제공된 강자성 입자의 유리표면은 무기공성이거나 기공을 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 자기성 입자에 대한 상기에서 주어진 이유로인해, 강자성 입자의 외표면은 또한 실질적으로 무기공이거나 또는 직경 10nm 미만의 기공을 갖는 것이 바람직하다. 또한 본 발명에 의해 제공된 강자성 입자는 바람직하게는 10 내지 60㎛, 특히 바람직하게는 20 내지 50㎛ 의 입자크기를 갖는다. 특히 바람직한 것은 직경 10 nm 미만, 특히 바람직하게는 1 nm 의 표면기공(존재한다면) 의 입자이다. 본 발명에 따른 강자성 입자의 예는 유리층으로 둘러싸인 운모 및 자철광 입자로 이루어진 전술한 복합체 물질이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이하의 단계로 생물학적 물질을 단리하는 방법이다:
- 액체내 생물학적 물질을 함유하는 시료를 본 발명에 따른 자기성 입자 또는 본 발명에 따른 강자성 입자와 생물학적 물질이 입자표면에 결합하는 조건하에서 접촉시키고,
-액체로부터 생물학적 물질을 분리한다.
생물학적 물질은 특정 또는 분자 기초의 물질을 의미한다. 이것에는, 특히, 백혈구와 같은 단리된 인간 및 동물세포 뿐만아니라, 바이러스 또는 박테리아와 같은 세포 및, 합텐, 항원, 항체 및 핵산과 같은 면역학적 활성의 저분자량 및 고분자량의 화학 화합물이 포함된다. DNA 또는 RNA 와 같은 핵산이 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 시료에는 혈액, 혈청, 구강린스, 소변, 뇌액, 타액, 대변, 생검시료 및 골수 시료와 같은 임상시료가 포함된다. 또한 시료는 환경분석, 식품분석 또는 분자생물학 연구를 위해 사용하는 유형, 예컨대, 박테리아 배양물, 파아지 용해물 및 PCR 과 같은 증폭절차의 생성물로부터 유래할 수 있다.
본 발명에 따른 입자는 외유리 표면이 도포되는 내부핵을 갖는다. 핵은 복합체 물질일 수 있거나, 단순한 철 핵일 수있다. 또한 핵은 산화철이 함침된 결정체, 세라믹 또는 유리같은 구조로 이루어질 수 있다.
기술된 방법은 천연 또는 개질된 생물학적 물질을 단리하는데 사용할 수 있다. 천연 생물학적 물질은 구조가 자연발생 생물학적 물질과 비교하여 비가역적으로 변화되지 않는 물질을 의미한다. 그러나 이것은 시료의 기타 성분은 개질될 수 없음을 의미하는 것은 아니다. 예컨대, 만일 세포가 단리되면, 예컨대, 세포를 둘러싸고 있는 매질은 개질될 수 있으나, 세포자체는 개질되지 않는다. 만일 핵산이 단리되면, 이것은 천연형태, 즉, 비변성되고, 절단되지 않았거나 핵산과 반응기의 결합으로 개질되지 않은 형태로 절단 또는 개질되어야 한다. 그러므로 천연 생물학적 물질의 개념에는 특히 바이오틴화 핵산은 포함되지 않는다. 천연 생물학적 물질의 예는 파아지 DNA 또는 혈액유래의 세포 핵산이다.
개질된 생물학적 물질에는 자연발생하지 않는 물질, 예컨대, 핵산에 반응성, 검출성 또는 고정화할 수 있는 기를 결합시켜 개질된 핵산이 포함된다. 이의 예는 바이오틴화 핵산이다.
특정의 경우에 있어서, 시료는 본 발명에 따른 단리 방법에서 전처리없이 사용할 수 있다. 그러나, 많은 경우에서, 시료는 적당한 방법을 이용하여 용해시키고, 시료내 함유된 생물학적 물질을 방출시켜야한다. 시료를 용해시키는 방법이 숙련가에게는 공지되어 있고, 사실상 화학적, 효소적 또는 물리적일 수 있다. 또한 이러한 방법의 조합이 적용가능하다. 예컨대, 용해는 초음파, 고압, 전단력, 알칼리, 세제 또는 카오트로픽 염수 용액을 이용하거나, 프로틴아제 또는 리파아제를 이용하여 실시할 수 있다.
핵산을 수득하기위한 용해방법에 있어서는, Sambrook et al.:Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY & Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J.Viley & sons, NY 에 특히 언급되어 있다.
단리하고자 하는 생물학적 물질외에, 또한 시료는 세포 잔유물, 단백질, 염 및 기타 단리되지 않은 물질과 같은 기타 성분을 액체내 함유할 수 있다. 이 시료, 바람직하게는 천연형태로 생물학적 물질을 함유하고 있는 시료는 목표 생물학적 물질이 입자 표면에 결합하는 조건하에서 입자와 접촉한다. 이에 대한 조건은 수반되는 생물학적 물질의 종류에 좌우되나, 기본적으로 공지되어 있다. 또한 이것은 생물학적 물질이 표면에 결합하는 방법에 좌우된다. 만일 면역학적 상호작용을 결합에 사용하면, 예컨대, 면역복합체의 형성에 적합한 조건을 선택하여야 한다. 만일 개질된 핵산을 사용하면, 결합은 개질을 나타내는 핵산의 기, 예컨대 스트렙타비딘피복 표면과 결합을 통한 바이오틴을 통해 일어날 수 있다. 그러나, 특히 핵산에 있어서는, 여러 이유들 중에서 핵산은 개질되지 않아야하고 심지어 천연 핵산은 결합될 수 있기 때문에 유리에 핵산의 직접적 결합이 바람직하다. 유리 입자에 천연 핵산을 결합시키는 방법은 종래기술에 기재된 방법과 상동할 수 있다. 이것은 2 내지 8 몰/l, 바람직하게는 4 내지 6 몰/l의 농도로 카오트로픽 염의 존재에서 바람직하게는 실시한다. 카오트로픽 염은 소듐 요오다이드, 과염소산나트륨, 구아니디늄 티오시안에이트, 구아니디늄 이소티오시안에이트 또는 구아니디늄 히드로클로라이드일 수 있다. 기타 화합물도 또한 가능하다.
시료를 입자와 접촉시키기 위해서는, 시료는 입자와 혼합하고 결합이 발생하기에 충분한 시간동안 인큐베이션시킨다. 전문가는 통상적으로 비자기성 입자로 처리를 하는 방법으로부터 인큐베이션 단계의 기간을 잘 알고 있다. 이 단계는 시간에 따른 상이한 시점에서 표면상의 고정화된 생물학적 물질의 양을 측정하여 최적화시킬 수 있다. 10초 내지 30 분의 인큐베이션 시간이 핵산에는 적당할 수 있다.
자기성 입자의 크기 및 유형에 따라, 입자는 인큐베이션 기간동안 액체로부터 분리되거나 현탁액은 장기간동안 온전한 상태로 유지된다. 만일 입자가 매우 작고 초상자성이면, 현탁액은 장기간동안 온전한 상태로 유지된다. 만일 입자의 크기가 크면, 입자는 인큐베이션 시간동안 액체로부터 서서히 분리된다. 강자성 입자가 수반되는 경우 특히 이런 특성의 응집체가 형성된다. 강자성 입자가 예비자성화되지 않는 경우, 이것이 바람직하지만, 매우 약한 분리만이 보장된다.
고정화는 바람직하게는 고정화시킬 물질의 용해도를 낮춤으로서 침전을 통해 실시하지 않는다. 오히려, 고정화는 생물특이적(biospecific) 상호작용( 분자 포획) 또는 흡착에 기초한다. 이것은 주로 오염물이 비특이적으로 포함되는 것을 방지한다.
인큐베이션후, 생물학적 물질은 액체로부터 분리된다. 이것은 통상적으로 자기장을 이용하여 자기성 입자에 결합된 물질을 분리함으로서 달성된다. 예컨대, 자기성 입자는 인큐베이션이 실시되고 있는 용기의 벽으로 끌어 당겨질 수 있다. 자기성 입자에 결합되지 않은 시료 함유물을 함유하는 액체는 이어서 제거할 수 있다. 사용하는 제거방법은 인큐베이션이 실시되는 용기의 유형에 좌우된다. 적합한 단계에는 피펫팅 또는 흡기를 통한 액체의 제거가 포함된다.
이어서 자기성 입자는, 필요에 따라, 세척용액을 이용하여 일회이상 정제할 수 있다. 생물학적 물질이 입자 표면으로부터 탈리되지 않도록하나 원하지 않는 오염물은 가능한 철저히 세척하는 세척 용액을 사용한다. 이 세척단계는 바람직하게는 세척용액을 입자와 함께 인큐베이션시킴으로서 일어난다. 입자는 이 단계동안 바람직하게, 예컨대 진탕 또는 첫 번째 자기장과 상이한 자기장을 적용하여 재현탁시킨다. 오염된 세척 용액은 바람직하게는 생물학적 물질을 결합시키기 위한 전술한 단계에서의 시료와 같이 분리시킨다.
마지막 세척 단계이후, 자기성 입자는 진공에서 짧게 건조시키거나, 또는 액체는 증발시킬 수 있다. 또한 아세톤을 이용한 전처리 단계를 실시할 수 있다.
원한다면, 이런 방식으로 정제된 생물학적 물질은 자기성 입자로부터 분리시킬 수 있다. 또한 이 단계는 생물학적 물질이 자기성 입자에 결합되는 방식에 좌우된다. 만일 생물학적 물질이 천연 핵산이고 자기성 입자가 유리피복 입자이면, 핵산은 저 염함량의 용출버퍼를 이용하여 본 발명에 따른 입자로부터 제거할 수 있다. 이런 성질의 버퍼는 DE 3724442 및 Analytical Biochemistry 175, 196-201 (1988) 에 공지되어 있다. 저 염함량의 용출 버퍼는 특히 0.2 몰/l 미만 함량의 버퍼이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 용출 버퍼는 Tris 를 함유한다. 또 다른 특별 구현예에 있어서, 용출 버퍼는 탈이온수이다.
또 다른 구현예에 있어서, 기술된 정제 및 단리 방법은 세포(예, 바이러스 입자 또는 원핵세포 또는 진핵세포) 를 체액 또는 조직으로부터 면역자기적으로 분리한후 실시한다. 이 단계에서, 시료는, 예컨대 진탕하면서, 세포상의 항원에 대해 항체가 고정화된 자기성 입자와 함께 인큐베이션시킨다. 이 입자는 본 발명에 따른 입자이거나 시판용 입자 (예, 독일, 베르기쉬 글라트바하, 밀테니이바이오텍 게엠베하사제의 MACS Microbreads) 일 수 있다. 자기장을 적용한후, 염수 용액을 이용하여 1 회이상의 세척 단계를 실시한다. 목표 세포가 결합된 입자가 수득된다. 이어서 결합된 세포를 염수 버퍼에 재현탁시킨다. 바람직한 구현예에 있어서, 이 염수버퍼는 카오트로픽 염수 용액이어서 세포내 함유된 핵산은 세포로부터 방출된다.
세포를 함유하는 시료로부터 핵산을 단리하기 위한 특히 유리한 방법은 본 발명에 따른 자기성 입자상에서 전술한 세포의 단리와 또한 전술한 핵산-바람직하게는 이의 천연형태로-의 단리와 합침으로서 달성된다. 이 구현예의 이점은 이의 잠재적 단순성(단일 튜브 방법), 고 민감성(특히 의약 미생물학 및 종양학에서 중요), 및 자동화할 수 있는 용이함이다.
본 발명에 따른 방법을 이용하여 단리된 생물학적 물질은 필요에 따라 추가로 사용할 수 있다. 예컨대, 이것은 다양한 효소반응용 기질로서 사용할 수 있다. 핵산이 수반되는 경우, 이것은 시퀀싱, 방사성 또는 비방사성 표식, 핵산이 함유하고 있는 하나이상의 서열의 증폭, 전사, 표식된 프로브 핵산과의 혼성화, 번역 또는 라이게이션을 위해 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 이점은 액체로부터 생물학적 물질을 분리시키는 것이 매우 용이하다는 점이다. 종래 기술에서는, 원심분리단계를 사용하여 오염물로부터 유리입자를 분리하거나, 또는 생물학적 물질이 유리섬유 필터에 결합한 경우, 액체를 필터를 통해 배수시킨다. 이것은 대량의 시료를 가공처리 하는 것을 어렵게 하는 제한적 단계이다.
본 발명에 따른 입자를 이용하여 좀더 효과적으로 오염물로부터 생물학적 물질을 분리시킬 수 있다. 특히, 특정 효소 반응을 위한 억제제는 본 발명에 따라 상당한 정도로 제거될 수 있다. 생물학적 물질의 수율은 상대적으로 높다. 장쇄의 핵산의 분획화는 관찰되지 않는다. 본 발명에 따른 입자는 바람직하게는 좀더 빠르게 자기화될 수 있다.
도 1은 세포를 함유하는 시료로부터의 핵산의 단리를 보여준다.
도 2 는 아가로오스 겔에서의 본 발명에 따른 단리된 핵산의 분리를 보여준다.
도 3 은 본 발명에 따른 단리후 반응 생성물의 분리 및 PCR 를 이용한 증폭을 보여준다.
도 4 는 실시예 4 로부터의 결과를 갖는 겔을 보여준다.
도 1 은 세포를 함유하는 시료로부터의 핵산의 단리를 보여준다. 세포를 함유하는 시료(검료) 는 시료특이방식으로 전처리하여 핵산을 검출하고자 하는 세포가 적당한 형태로 존재하도록 한다.
체액이 제거된 시료를 사용하는 경우, 예컨대, 이것은, 예컨대, 타액과 같은 점성 시료를 액화시키기 위하여 시약을 첨가하는 것을 동반한다. 검출할수 있고 세포에 결합할 수 있는 고형상 바람직하게는 비드에 결합된 항체를 상기 방식으로 처리된 시료를 함유하는 용기에 가한다. 세포 표면상의 항원은 예컨대 항체에 대한 적합한 파트너로 입증되었다. 항체의 특이성은 수행하고자하는 분석의 특이성에 좌우된다. 만일 고형상이 용기의 벽이면, 세포는 직접 벽에 결합한다. 만일 고형상이 비드로 이루어지면, 이것은 적합한 분리 방법을 이용하여 액체로부터 분리시킨다. 이것은 예컨대 여과를 이용하여 실시할수 있다. 만일 자기성 비드를 사용하면, 이것은 용기의 외벽에 자기장을 적용하여 분리시킬 수 있다. 분리된 세포는 액체로 세척하여 세포를 둘러싸고 있는 매질과 더불어 오염물 (검출을 간섭함) 을 제거한다. 조건은 바람직하게는 세포가 고형상으로부터 분리되지 않거나 파괴되지 않도록 한다. 이어서 세포를 파괴, 즉, 용해시킨다. 이것은 예컨대 세포를 카오트로픽염으로 처리하여 실시할 수 있다. 기타 가능성에는 프로틴아제 및 세제의 적용이 포함된다.
바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 입자를 용해 혼합물에 가한다. 용해가 발생하기에 충분한 시간이 경과한 후 - 표면에 핵산을 적하함으로서 최적화시킬 수 있다 - 입자는 검출되지 않은 추가의 세포 성분을 함유하는 주변액체로부터 분리된다. 이것은 바람직하게는 용기벽에 자석을 위치시킴으로서 자기장을 적용하여 실시한다.
여전히 존재할 수 있는 임의의 오염물을 제거하기 위하여, 세척단계는 바람직하게는 검출하고자 하는 핵산이 유리표면으로부터 분리되지 않도록 하는 액체로 실시한다. 핵산이 유리표면으로부터 분리되는 시약 조건을 갖는 용출버퍼를 첨가하여 유리표면으로부터 핵산을 제거한다. 이 조건은 특히 낮은 염조건이다. 의도하는 핵산의 추가용도에 따라, 액체는 입자로부터 분리할 수 있고 추가로 가공 처리할 수 있다. 이 분리 단계는 바람직하게는 자기장의 적용을 통해 실시하여 입자가 상호간에 분리되도록한다.
하기의 실시예는 본 발명을 좀더 상세히 설명한다.
실시예 1
본 발명에 따른 자기성 입자의 제조
6개의 상이한 졸을 사용한다. 졸은 하기와 같이 제조한다:
졸 1 (SiO2:B2O3=7:3) :
일정하게 교반하면서 250 ml 의 둥근 플라스크에서 합성을 한다.
86.6ml 테트라에틸 오르토실리케이트
+ 7ml 무수 비변성 에탄올
+ 14.1 ml 0.15 M HCl
이상 (biphasal) 혼합물을 제조한다. 이를 실온에서 교반하여 단일상으로 만든다.
+ 37.8 ml 트리메틸보레이트를 적가하고, 이어서 졸을 50℃ 에서 2 시간동안 유지시킨다.
+14.1 ml 0.15 M HCl 를 가한다.
졸 2 (SiO2 :B2O3=4:1) :
일정하게 교반하면서 250 ml 의 둥근 플라스크에서 합성을 한다.
100.5ml 테트라에틸 오르토실리케이트
+ 7ml 무수 비변성 에탄올
+ 16.3 ml 0.15 M HCl
이상 혼합물을 제조한다. 이를 실온에서 교반하여 단일상으로 만든다.
+ 25.6 ml 트리메틸보레이트를 적가하고, 이어서 졸을 50℃ 에서 2 시간동안 유지시킨다.
+16.3 ml 0.15 M HCl 를 가한다.
졸 3 (SiO2:B2O3=85:15) :
일정하게 교반하면서 250 ml 의 둥근 플라스크에서 합성을 한다.
107.8ml 테트라에틸 오르토실리케이트
+ 7ml 무수 비변성 에탄올
+ 17.5 ml 0.15 M HCl
이상 혼합물을 제조한다. 이를 실온에서 교반하여 단일상으로 만든다.
+ 19.4 ml 트리메틸보레이트를 적가하고, 이어서 졸을 50℃ 에서 2 시간동안 유지시킨다.
+17.5 ml 0.15 M HCl 를 가한다.
졸 4 (SiO2:B2O3=4:1; 2 Mol% P2O5) :
일정하게 교반하면서 250 ml 의 둥근 플라스크에서 합성을 한다.
100.5ml 테트라에틸 오르토실리케이트
+ 7ml 무수 비변성 에탄올
+ 16.3 ml 0.15 M HCl
이상 혼합물을 제조한다. 이를 실온에서 교반하여 단일상으로 만든다.
+ 25.6 ml 트리메틸보레이트를 적가하고, 이어서 졸을 50℃ 에서 2 시간동안 유지시킨다.
+16.3 ml 0.15 M HCl
+ 1.63 g P2O5 를 가한다.
졸 5 (SiO2:B2O3=4:1 Mol% Al2O3) :
일정하게 교반하면서 250 ml 의 둥근 플라스크에서 합성을 한다.
100.5ml 테트라에틸 오르토실리케이트
+ 7ml 무수 비변성 에탄올
+ 16.3 ml 0.15 M HCl
이상 혼합물을 제조한다. 이를 실온에서 교반하여 단일상으로 만든다.
+ 25.6 ml 트리메틸보레이트를 적가하고, 이어서 졸을 50℃에서 2 시간동안 유지시킨다.
+16.3 ml 0.15 M HCl
+ 3.06 g AlCl3 를 가한다.
졸 6 (SiO2:B2O3=4:1 Mol% ZrO2) :
일정하게 교반하면서 250 ml 의 둥근 플라스크에서 합성을 한다.
100.5ml 테트라에틸 오르토실리케이트
+ 7ml 무수 비변성 에탄올
+ 16.3 ml 0.15 M HCl
이상 혼합물을 제조한다. 이를 실온에서 교반하여 단일상으로 만든다.
+ 25.6 ml 트리메틸보레이트
+ 5.15 ml 지르콘(IV)-프로일레이트, 1-프로판올중의 70 중량% 용액을 적가하고, 이어서 졸을 50℃ 에서 2 시간동안 유지시킨다.
+16.3 ml 0.15 M HCl 를 가한다.
50℃ 에서 추가로 2 시간이 지난 뒤, 22.5g 이리오딘 600 (흑운모) 을 각각 150ml 졸에 가하여 교반한다. 이어서 분무건조기(Buchi 190, Mini Spray Dryer) 로 도포한다. 분무건조기 노즐의 온도는 134℃ 이다.
이어서 분무 건조 공정에서 수득한 분말에 질소 분위기(90 l/h) 에서 온도 처리단계를 실시한다. 온도는 1k/분의 속도로 증가시키고 분말은 2 시간동안 치밀화 온도에서 유지시킨다. 졸 1 의 피복에 있어서의, 온도는 750℃ 이고, 졸 2 의 피복온도는 860℃ 이다. 온도는 모든 기타 피복 공정에서 800℃ 이다. 소결공정후 오븐은 끄고 분말은 실온으로 만든다. 응집체는 50㎛ 체를 이용하여 체친다.
실시예 2
GMP1, GMO2, GMP3 및 GMP 4 의 제조
GMP1, GMP2, GMP3 및 GMP 4는 하기의 조건하에서, 실시예 1 에 기재된 공정에서 졸 1 (실시예 1) 로부터 수득한 상이한 제조 로트에서 유래한 피그먼트이다:
실시예 3
자기성 유리 입자를 이용한 사람 전혈액으로부터의 PCR 시료 전처리
핵산 단리
3 로트의 유리 자기성 입자 (GMP2-4) 로부터 각각 10mg을 에펜도르프 시험 튜브에 넣는다. 정확한 시료 중량은 표 1 에 나타내었다. 측정은 3 회 실시한다.
40㎕ 프로틴아제 (20mg/ml, 리오필리세이트(lyophilisate)로부터 제조) 을 피펫팅으로 해빙된 전혈액의 각각의 200 ㎕ 에 가하고 즉시 혼합한다. 다음 단계에서, 200 ㎕ 결합 버퍼 (6M 구아니딘-HCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM 우레아, 30% Triton X-100, pH 4.4) 를 가하여 혼합하고, 이어서 70℃ 에서 10 분간 인큐베이션시킨다. 200㎕ i-프로판올을 가하고, 이어서 침전물을 보텍스 혼합기에서 10초간 혼합한다. 시료는 실온에서 20 분간 방치하고, 이어서 10 초간 한 번더 혼합한다. 자기 분리 단계를 베링거 만하임 (ID# 1 641 794) 사제의 자기성 입자 분리기에서 30 초이상 실시한다. 상충액을 제거하여 하기와 같이 분석한다.
자기성 입자는 10 초간 500 ㎕ 세척 버퍼 (20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 (25f℃, 80% 에탄올) 와 혼합하고, 이를 실온에서 1 분간 방치한후 10 초간 혼합하여 세척한다. 이어서 이것을 자기성 입자 분리기를 이용하여 용기벽쪽으로 끌어 당긴다. 상층액을 제거하여 버린다. 세척절차를 세척액이 무색이 될때까지 반복한다 (총 4 회). 이어서 핵산을 매회 70℃ 로 미리데워논 용출버퍼 (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) 200㎕ 씩 3 회 용출하고, 이어서 10 초간 혼합하고 실온에서 10 분간 방치하고, 10 분간 혼합한다.
상층액의 제조
자기성 유리 입자에의 첫 번째 결합후 수득한 상층액은 이의 핵산함량에 대해 하기와 같이 조사한다 : 상층액을 필터 튜브 (예, 베링거 만하임 ID# 1744003, High Pure PCR Product Purification Kit) 에 넣고 에펜도르프 탁상 원심분리기를 이용하여 8000 rpm 으로 1 시간동안 원심분리시킨다. 유출된(flow-through)물질은 버리고 필터 튜브는 500 ㎕ 세척 버퍼로 2 회 세척한다 (전술한 바와 같이 원심분리). 필터 튜브는 짧게 원심분리하여 건조시킨후, 이어서 원심분리로 한번더 70℃ 로 미리데워진 용출버퍼로 200㎕ 씩 2회 용출한다.
용출물 및 시료 상층액의 분석
시료 버퍼 10㎕ 를 용출물 50㎕ 에 첨가하고 각각 필터 튜브를 이용하여 상층액을 제조한다. 이 제제 45㎕ 를 90 분간의 120 V 에서의 전기영동을 이용하여 0.8% 아가로오스 겔에서 분리시킨다.
용출물의 다양한 희석물 및 제조된 상층액을 Uvikon 710(Kontron) 를 이용한 260 내지 280 nm 에서의 분광분석법으로 측정한다.
두 개의 5㎕ 분량의 용출물을 사람 tPA 유전자(생성물의 기대치길이 : 15kb)에 대한 특이 프라이머와 함께 ExpandTM Long Template PCR (베링거 만하임 ID# 1681834) 를 이용하여 이중 측정으로 조사한다.
배합물 I 은 5㎕ 용출물과 함께 얇은 벽의 PCR 튜브에 넣고, 이어서 배합물 II 를 가한다. 이 제제를 짧게 혼합하고, 이어서 30㎕ 의 광유층으로 덮는다.
2 분 92℃
10 초 92℃
30 초 65℃ 10 회
12 분 68℃
10 초 92℃
30 초 65℃ 20 회
12 분 68℃
+ 각회당 20 초
7 분 68℃
이어서 7℃
10㎕ 시료 버퍼를 50㎕ PCR 제제에 첨가한다. 이어서 이 혼합물 45㎕를 120V 에서 90 분간의 전기영동을 이용하여 0.8% 아가로오스겔에서 분리시킨다.
결과
표 1 : 자기성 유리 입자 및 200㎕ 혈액을 이용한 핵산의 수율
용출물 1 은 여전히 색깔면에서 담황색이고 미세한 자기성 입자로 약간 오염되어 있다.
아가로오스 겔에서 용출물의 분석 (도 2) 은 수율의 양호한 재생산성을 보여준다. 자기성 입자 GMP 2-4 는 현저한 차이를 보이지 않는다. 용출물 1 (상) 및 2 (하) 는 대략 동일한 핵산의 농도를 갖는다(겔에의한 평가). 용출물 3 은 핵산의 낮은 농도를 갖는다. 또한 상층액은 핵산의 낮은 농도를 갖는다.
ExpandTM PCR 은 단지 몇몇의 예외적인 것만 제외하고 모든 시료에 대해 매우 양호한 특이적 증폭 생성물을 제공한다 (표 2). 자기성 유리 비드를 사용하는 경우, 핵산은 후속 PCR 단계에서 특별한 증폭물을 산출하는 사람 혈액 시료로부터 단리된다.
표 2. ExpandTMPCR 의 결과
* 용출물 3
도 3 은 PCR 증폭후 반응 생성물을 갖는 겔을 보여준다. MWM III 은 분자량 마커이다 (용출물 1, 상; 용출물 2, 하).
실시예 4
DNA 길이 표준(lenth standard)의 자기성 유리 입자에의 결합
1. 자기성 유리 입자의 제조
GMP4 에서 유래한 유리 자기성 입자 12 mg을 12 mg 에펜도르프 시험 튜브에 넣는다.
2. 용해 및 결합
900 ㎕ 용해 버퍼 (4.6 M GuSCN, 45 mM Tris, 20 EDTA, pH 7.3) 및 베링거만하임사제의 DNA 길이 표준 III (Cat. No. 528552) 이 모델로서 첨가된 100 ㎕ DNA 시료를 균질한 현탁액이 수득될 때까지 12 mg 의 자기성 유리 입자와 함께 1.5 ml 에펜도르프 용기에서 2 내지 10 초간 혼합한다. 용액은 실온에서 20 분간 인큐베이션시키고 5 분 마다 혼합한다.
자기 분리를 자기성 입자 분리기에서 15 초이상 실시한다. 상층액은 피펫팅으로 제거한다.
3. 세척 및 건조
자기장을 제거하고, 피펫팅으로 용액 800㎕ 을 첨가하고, 2 초간 혼합하고, RT 에서 1 분간 방치하고, 자기장을 적용하고 이어서 피펫팅으로 상층액을 제거하여, 자기성 유리 입자를 세척 버퍼 (5.2 M GuSCN, 50 mM Tris, pH 6.5) 로 2 회, 70% 예비냉각된 에탄올로 2회, 아세톤으로 1 회 세척한다.
아세톤을 제거한후, 입자는 두껑을 연상태로 가열 블록에서 56℃ 로 10 분간 건조시킨다.
4. DNA 의 용출
DNA 는 반복적으로 진탕하면서 56℃ 에서 10 분간 인큐베이션시켜 용출 버퍼 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 ㎕ 로 4 회 용출시킨다. 이어서 DNA 를 함유하는 상층액을 피펫으로 새로운 에펜도르프 용기로 옮긴다.
5. 용출물의 분석
시료 버퍼를 1/5 부피의 용출물에 가하고, DNA 를 90V 에서 1% 아가로오스 겔상에서 분리시킨다. 회수율을 측정하기 위하여, DNA 길이 표준 III 의 일련의 희석물을 시료에서 기대되는 DNA 의 양을 함유하는 것과 동일한 겔에 적용한다.
양적 평가는 아가로스 겔의 폴라로이드 사진을 스캐닝하여 수행한다. 표준의 일련의 희석물을 캘리브레이터로서 사용한다.
자기성 유리 입자를 이용한 DNA 의 수율을 표 1 에 나타내었다.
표 1. 자기성 유리입자에 의한 DNA 길이 표준 III 의 수율
양적 평가를 위한 기초로서 사용되는 아가로오스 겔은 도 4 에 나타내었다. 이것은 1% 에티디움 브로마이드-염색 아가로오스겔이다. 레인 1 내지 10 은 DNA 길이 표준 III 의 일련의 희석물에 해당한다. 1:1 ㎍ DNA, 2:200 ng DNA, 3:175 ng DNA, 4:150 ng DNA, 5:125 ng DNA, 6:100 ng DNA, 7:75 ng DNA, 8:50 ng DNA, 9:25 ng DNA, 10:10 DNA.
레인 11 및 레인 12 는 200ng DNA 길이 표준을 첨가하여 자기성 유리입자로부터 용출된 DNA 에 해당한다.

Claims (39)

  1. 보록시드를 함유하는 유리로 이루어진 외부표면을 갖는 자기성 입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 유리표면은 표면적의 5% 미만만이 기공을 갖거나 또는 직경이 10nm 미만인 기공을 갖는 것을 특징으로하는 입자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 10 내지 60㎛ 의 입자크기를 갖는 것을 특징으로하는 입자.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 표면에 함유된 기공의 직경이 1 nm 미만인 것을 특징으로 하는 입자.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 입자는 운모핵과 이에 고정화된 자철광 입자를 갖는 복합체 물질을 함유하고, 복합체 물질은 유리층에 함침된 것을 특징으로 하는 입자.
  6. 이하를 포함하는 생물학적 물질의 단리방법:
    - 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 입자와 액체내 생물학적 물질을 함유하는 시료를 생물학적 물질이 유리표면에 직접적으로 결합하는 조건하에서 접촉시키고,
    -액체로부터 생물학적 물질을 분리한다.
  7. 제 6 항에 있어서, 생물학적 물질이 핵산인 것을 특징으로하는 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 자기성 입자가 시료와의 접촉시 예비자성화되지 않는 것을 특징으로하는 방법.
  9. 이하를 포함하는 핵산의 단리방법:
    - 표면적의 5% 미만만이 기공을 갖거나 또는 기공의 직경이 10nm 미만인 유리표면을 갖는 자기성 입자와 액체중에 천연형태로 핵산을 함유하는 시료를 핵산이 천연형태로 유리표면에 직접적으로 결합할 수 있는 조건하에서 접촉시키고,
    -액체로부터 결합된 핵산을 분리한다.
  10. 제 9 항에 있어서, 자기성 입자는 시료와 접촉시 예비자성화되지 않는 것을 특징으로하는 방법.
  11. 이하의 단계에 의한 입자 크기 100 ㎛ 미만의 자기성 유리 입자의 제조방법:
    - 자기성 핵을 제공하는 단계,
    - 네트워크형성 성분의 알콕시드를 함유하는 알코올 용액으로 형성된 졸을 표면에 침착시켜 표면적의 5% 미만만이 기공을 갖는 유리 표면으로 자기성 핵을 피복하는 단계,
    - 분무건조 방법을 이용하여 졸층을 겔층으로 변형시키는 단계, 이어서
    - 겔을 치밀화시키는 단계.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 유리가 보록시드를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 100 ㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 입자.
  14. 이하를 포함하는 핵산의 단리방법:
    - 실리슘을 함유하는 비정질 물질의 표면을 갖는 자기성 입자와 액체중에 천연형태로 핵산을 함유하는 시료를 핵산이 천연형태로 유리표면에 직접적으로 결합할 수 있는 조건하 카오트로픽제의 존재에서 접촉시키고,
    -액체로부터 결합된 핵산을 분리한다.
  15. 제 14 항에 있어서, 입자는 100 ㎛ 미만의 평균 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 입자는 외유리표면이 도포된 자기성 물질의 내부핵을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 자기성 물질은 자철광(Fe3O4) 또는 Fe2O3 인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 표면은 하기에서 선택되는 기타 물질을 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법:
    B2O3 (0-30%)
    Al2O3 (0-20%)
    CaO (0-20%)
    BaO (0-10%)
    K2O (0-20%)
    Na2O (0-20%)
    MgO (0-18%)
    Pb2O3 (0-15%)
  19. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 실리슘을 함유하는 비정질 물질은 유리인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 환경분석, 식품분석 또는 분자생물학 연구를 위해 사용하는 시료 유형 및 임상 시료를 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 혈액, 혈청, 구강린스, 소변, 뇌액, 타액, 대변, 생검 표본 및 골수 시료에서 선택된 시료를 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 박테리아 배양물, 파아지 용해물 및 증폭 절차의 생성물에서 선택된 시료를 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, DNA 가 단리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, RNA 가 단리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 시료는 전처리없이 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 시료는 적당한 방법을 이용하여 용해시켜, 시료내 함유된 생물학적 물질을 방출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 카오트로픽 염의 농도는 2 내지 8 몰/l인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 카오트로픽 염은 소듐 요오다이드, 과염소산나트륨, 구아니디늄 티오시안에이트, 구아니디늄 이소티오시안에이트 또는 구아니디늄 히드로클로라이드에서 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 시료는 10 초 내지 30 분동안 입자와 인큐베이션시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 액체로부터 결합된 핵산의 분리는 자기장을 이용하여 자기성 입자에 결합된 핵산을 분리하여 완성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 자기성 입자는 세척 용액을 이용하여 1회 이상 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 세척단계는 세척 용액과 입자를 함께 인큐베이션시켜 입자를 재현탁시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 재현탁은 첫 번째 자기장과 동일하지 않은 자기장을 적용하여 완성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, 건조 단계는 최종 세척 단계후 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 정제된 핵산은 자기성 입자로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 0.2 몰/l 미만의 염함량을 가진 용출 버퍼를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 방법은 단일 튜브 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 방법은 자동화 방식으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 27 항에 있어서, 카오트로픽 염의 농도는 4 내지 6 몰/l 인 것을 특징으로 하는 방법.
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