CN111801427A - 用于单分子的单链环状dna模板的产生 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种对核酸进行测序的新方法,其涉及制备单链环状靶核酸的文库并且对其进行测序。
Description
发明领域
本发明涉及核酸分析领域,并且更具体地,涉及制备用于核酸测序的模板。
发明背景
由于技术的高误差率,包括纳米孔测序在内的单分子核酸测序通常需要建立共有序列。存在生产环状双链模板的文库制备方法,其允许靶序列在单次长聚合酶读取中被读取多次。参见美国专利号7,302,146和8,153,375。线性核酸可以转化为环状形式,用于扩增以及随后的检测和定量,参见美国专利号RE44265。当在使用单分子实时(SMRT)技术的平台(Pacific Biosciences, Menlo Park, Cal.)上进行测序时,聚合酶读取文库分子,产生连续的读取结果(聚合酶读取结果),所述读取结果由文库分子的交替有义和反义拷贝组成。存在这样的情况:其中由于技术应用或其他限制,只读取了原始双链分子的DNA链之一。本发明是生产仅包含靶序列的单链的环状文库和对其进行测序的方法。该方法具有以下详细描述的多个优点。
发明概述
在一个实施方案中,本发明是分别对双链靶核酸的每条链进行测序的方法,其包括以下步骤:在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含影响核酸外切酶消化速率的修饰的核苷酸;使反应混合物与核酸外切酶接触,从而从反应混合物中消除扩增子的两条互补链中的第一条;使扩增子的两条互补链中的第二条环化以形成单链环;将测序引物退火至单链环;并且延伸引物,从而对靶核酸的一条链进行测序。衔接子可以通过连接(例如通过接合靶核酸和衔接子的粘端)而接合。衔接子可以包含双链部分和含有两个非退火部分的单链部分、至少一个条形码和可以位于衔接子的相同或分开的臂上的至少一个引物结合位点。测序引物结合位点也可以在衔接子中。修饰的核苷酸可以是带有λ核酸外切酶的5′-磷酸化的末端核苷酸。修饰的核苷酸可以包含带有T5或T7核酸外切酶的硫代磷酸酯基团。该方法可以在环化步骤之后进一步包括第二核酸外切酶消化步骤。第二核酸外切酶可以是双链特异性核酸外切酶和单链特异性核酸外切酶,例如,核酸外切酶I、核酸外切酶III、T5核酸外切酶和核酸外切酶VII的组合。
环化可以通过连接(例如夹板连接(splint ligation)或单链连接)发生。该方法可以进一步包括靶富集步骤,例如,通过经由与固体支持物结合的靶特异性探针的捕获。该方法可以进一步包括使反应混合物与选自糖基化酶和核酸内切酶的DNA损伤特异性试剂接触。
在一些实施方案中,本发明是从样品中的双链靶核酸制备单链核酸的文库的方法,该方法包括以下步骤:在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含影响核酸外切酶消化速率的修饰的核苷酸;使反应混合物与核酸外切酶接触,从而从反应混合物中消除扩增子的两条互补链中的第一条;使扩增子的两条互补链中的第二条环化以形成单链环,从而形成单链环状靶核酸的文库。
在一些实施方案中,本发明是确定样品中靶核酸文库的序列的方法,该方法包括以下步骤:形成上文概述的单链环状靶核酸的文库;将引物退火至每个单链环中的引物结合位点;延伸引物从而对文库进行测序。
在一些实施方案中,本发明是分别对双链靶核酸的每条链进行测序的方法,其包括以下步骤:在反应混合物中,用一对靶特异性引物扩增靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含抑制核酸外切酶消化的修饰的核苷酸;使反应混合物与核酸外切酶接触,从而从反应混合物中消除扩增子的两条互补链中的第一条;使扩增子的两条互补链中的第二条环化以形成单链环;将测序引物退火至单链环;延伸引物,从而对靶核酸的一条链进行测序。
在一些实施方案中,本发明是从样品中的双链靶核酸制备单链核酸的文库的方法,该方法包括以下步骤:在反应混合物中,用一对靶特异性引物扩增靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含影响核酸外切酶消化速率的修饰的核苷酸;使反应混合物与核酸外切酶接触,从而从反应混合物中消除扩增子的两条互补链中的第一条;使扩增子的两条互补链中的第二条环化以形成单链环,从而形成单链环状靶核酸的文库。
在一些实施方案中,本发明是确定样品中靶核酸文库的序列的方法,该方法包括以下步骤:通过上文概述的方法形成单链环状靶核酸的文库;将引物退火至每个单链环中的引物结合位点;延伸引物,从而对文库中每个靶核酸的一条链进行测序。
在一些实施方案中,本发明是分别对双链靶核酸的每条链进行测序的方法,其包括以下步骤:在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含捕获部分的配体;使扩增子的两条链分离;使反应混合物与捕获部分接触,从而捕获扩增子的两条链中的第一条;将扩增子的链环化以形成单链环;将测序引物退火至单链环;延伸引物,从而对靶核酸的一条链进行测序。该方法可以进一步包括使用选自单链结合(SSB)蛋白、C0t DNA、碱、甘油、尿素、DMSO和甲酰胺的链分离增强剂。可以保留捕获的单链,并且可以消除游离的单链。或者,可以消除捕获的单链,并保留游离的单链。
在一些实施方案中,本发明是从样品中的双链靶核酸制备单链核酸的文库的方法,该方法包括以下步骤:在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含捕获部分的配体;使扩增子的两条链分离;使反应混合物与捕获部分接触,从而捕获扩增子的两条互补链中的第一条;使扩增子的互补链环化以形成单链环,从而形成单链环状靶核酸的文库。
在一些实施方案中,本发明是确定样品中靶核酸文库的序列的方法,该方法包括以下步骤:通过上文概述的方法形成单链环状靶核酸的文库;将引物退火至每个单链环中的引物结合位点;延伸引物,从而对文库中每个靶核酸的一条链进行测序。
在一些实施方案中,本发明是优先对双链靶核酸的一条链进行测序的方法,其包括以下步骤:在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,该对包含限制量的限量引物和过度量的过量引物;使延伸产物环化以形成单链环;将测序引物退火至单链环;延伸引物,从而优先对靶核酸的一条链进行测序。过量引物可包含影响核酸外切酶消化速率的修饰的核苷酸,并且进一步包括使反应混合物与核酸外切酶接触,从而从反应混合物中消除限量引物的延伸产物。在一些实施方案中,过量引物可包含亲和捕获部分的配体,以捕获并保留过量引物的延伸产物。在一些实施方案中,限量引物可包含亲和捕获部分的配体,以捕获和除去限量引物的延伸产物。
附图简述
图1显示制备环状单链核酸的文库的方法的第一实施方案(方法1)的工作流程。
图2显示包括PCR步骤的制备环状单链核酸的文库的方法的第二实施方案(方法2)的工作流程。
图3是Y形衔接子的示意图。(A)显示衔接子,其具有在衔接子的臂之间分开的引物结合位点的部分(带下划线)。(B)显示衔接子,其具有存在于衔接子的一个臂中的完整引物结合位点(带下划线)。序列对应于SEQ ID NO. 5-8。
图4显示对对照文库进行测序的结果。
图5显示对使用方法1制备的文库进行测序的结果。
图6显示用纳米孔衔接子对使用方法1制备的文库进行测序的结果。
图7显示用T7核酸外切酶对使用方法2制备的文库进行测序的结果。
图8显示用λ核酸外切酶对使用方法2制备的文库进行测序的结果。
发明详述
定义
以下定义辅助本公开内容的理解。
术语“样品”是指含有或假定含有靶核酸的任何组合物。这包括从个体分离的组织或流体,例如,皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、器官和肿瘤的样品,并且也是指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品,包括***固定的石蜡包埋组织(FFPET)和从其分离的核酸。样品还可以包括无细胞材料,诸如含有无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA (ctDNA)的无细胞血液级分。
术语“核酸”是指核苷酸(例如,天然的和非天然的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合物,包括DNA、RNA及其亚类,诸如cDNA、mRNA等。核酸可以是单链的或双链的,且通常将含有5'-3'磷酸二酯键,尽管在一些情况下,核苷酸类似物可以具有其他连接。核酸可以包括天然存在的碱基(腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)以及非天然碱基。非天然碱基的一些实例包括在例如Seela等人, (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640中描述的那些。非天然碱基可以具有特定功能,例如,增加核酸双链体的稳定性、抑制核酸酶消化或阻断引物延伸或链聚合。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。多核苷酸是单链或双链核酸。寡核苷酸是有时用于描述较短多核苷酸的术语。通过本领域已知的任意合适方法制备寡核苷酸,例如,通过涉及直接化学合成的方法,如以下文献中所述:Narang等人(1979) Meth. Enzymol. 68:90-99;Brown等人(1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; Beaucage等人(1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; Matteucci等人(1981) J. Am. Chem. Soc.103:3185-3191。
术语“引物”是指与靶核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交且能够在适合这种合成的条件下充当沿着核酸的互补链的合成的起始点的单链寡核苷酸。
术语“衔接子”意指可以被添加至另一个序列以便将额外的特性输入该序列的核苷酸序列。衔接子通常是这样的寡核苷酸:其可以是单链或双链的,或者可以同时具有单链部分和双链部分。
术语“连接”是指接合两条核酸链的缩合反应,其中一个分子的5'-磷酸基团与另一个分子的3'-羟基基团反应。连接通常是由连接酶或拓扑异构酶催化的酶促反应。连接可以接合两条单链以产生一个单链分子。连接还可以接合两条链(每条链属于一个双链分子),因此接合两个双链分子。连接还可以将双链分子的两条链接合至另一个双链分子的两条链,因此接合两个双链分子。连接还可以接合在双链分子内的链的两个末端,因此修复双链分子中的切口。
术语“条形码”是指可以检测和标识的核酸序列。可以将条形码掺入多种核酸中。条形码是足够长的,例如2、5、20个核苷酸,使得在样品中,可以将掺入了条形码的核酸根据所述条形码进行区分或分组。
术语“多重标识符”或“MID”是指标识靶核酸的来源(例如,核酸所源自的样品)的条形码。来自相同样品的所有或基本上所有的靶核酸将共享相同的MID。可以将来自不同来源或样品的靶核酸混合并同时测序。使用MID,可以将序列读取结果分配至靶核酸所来源的各个样品。
术语“独特的分子标识符”或“UID”是指标识与其附着的核酸的条形码。来自相同样品的所有或基本上所有的靶核酸将具有不同的UID。源自相同原始靶核酸的所有或基本上所有的后代(例如,扩增子)将共享相同的UID。
术语“通用引物”和“通用引发结合位点”或“通用引发位点”是指存在于(通常,通过体外添加至)不同靶核酸的引物和引物结合位点。使用衔接子或使用具有在5'-部分中的通用引发位点的靶特异性(非通用)引物,将通用引发位点添加至多种靶核酸。通用引物可以结合通用引发位点并指导从所述通用引发位点的引物延伸。
更通常,术语“通用”是指可以添加至任何靶核酸并独立于靶核酸序列执行它的功能的核酸分子(例如,引物或其他寡核苷酸)。通用分子可以通过与互补物杂交(例如通用引物与通用引物结合位点杂交或通用环化寡核苷酸与通用引物序列杂交)来执行它的功能。
如本文所使用的,术语“靶序列”、“靶核酸”或“靶”是指要检测或分析的样品中的核酸序列的一部分。术语靶包括靶序列的所有变体,例如,一种或多种突变型变体和野生型变体。
术语“扩增”是指制备额外拷贝的靶核酸的过程。扩增可以具有多于一个循环,例如,多个循环的指数扩增。扩增可以仅具有一个循环(制备单拷贝的靶核酸)。拷贝可以具有额外序列,例如存在于用于扩增的引物中的那些。扩增也可以产生仅一条链(线性扩增)或优先一条链(不对称PCR)的拷贝。
术语“测序”是指确定靶核酸中的核苷酸的序列的任何方法。
单分子测序通常部分涉及从多个读取结果构建共有序列,以减轻技术的高误差率。在一些方法中,从相同模板分子特别是环状分子的多次读取构建共有序列。测序文库制备方法将靶分子文库转换为环状模板文库。一种这样的方法使用在双链靶分子的任一端附着的发夹衔接子。参见美国专利号7,302,146和8,153,375。在测序期间,聚合酶连续读取文库分子,产生连续的读取结果,其由散布有衔接子序列的文库分子的交替有义和反义拷贝组成。在将聚合酶读取结果分割成子读取结果后,子读取结果用于产生高准确度共有序列,称为环状共有序列。在一些应用中,可能需要分别读取双链分子的每条链。本发明是生产由单链环组成的文库和对其进行测序的方法,每个单链环均含有文库***物。
本发明包括检测样品中的靶核酸。在一些实施方案中,样品源自受试者或患者。在一些实施方案中,样品可以包含例如通过活组织检查源自受试者或患者的实体组织或实体瘤的片段。样品还可以包含体液(例如,尿、痰、血清、血浆或淋巴液、唾液、痰、汗液、泪液、脑脊液、羊水、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、囊液、胆汁、胃液、肠液和/或粪便样品)。样品可以包含其中可能存在肿瘤细胞的全血或血液级分。在一些实施方案中,样品,尤其是液体样品可以包含无细胞材料,诸如无细胞DNA或RNA,包括无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA。本发明特别适合于分析稀有和低量靶。在一些实施方案中,样品是无细胞样品,例如无细胞血液来源的样品,其中存在无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA。在其他实施方案中,样品是含有或怀疑含有传染物或源自传染物的核酸的培养样品,例如,培养物或培养物上清液。在一些实施方案中,传染物是细菌、原生动物、病毒或支原体。
靶核酸是可以存在于样品中的关注的核酸。在一些实施方案中,靶核酸是基因或基因片段。在其他实施方案中,靶核酸含有遗传变体,例如,多态性,包括单核苷酸多态性或变体(SNP或SNV),或导致例如基因融合的遗传重排。在一些实施方案中,靶核酸包含生物标志物。在其他实施方案中,靶核酸是特定生物体所特有的,例如,有助于鉴定病原生物体,或病原生物体的特征,例如,药物敏感性或药物抗性。在另外的其他实施方案中,靶核酸是人受试者所特有的,例如,定义受试者的独特HLA或KIR基因型的HLA或KIR序列。在另外的其他实施方案中,样品中的所有序列都是靶核酸,例如,在鸟枪基因组测序中。
在本发明的一个实施方案中,将双链靶核酸转化为本发明的模板构型。在一些实施方案中,靶核酸在自然界中以单链形式(例如,RNA,包括mRNA、微RNA、病毒RNA;或单链病毒DNA)存在。将单链靶核酸转化为双链形式以使得能够实现请求保护的方法的另外步骤。
可以将较长靶核酸片段化,尽管在一些应用中,可能期望较长靶核酸来实现较长的读取结果。在一些实施方案中,靶核酸被天然地片段化,例如,循环无细胞DNA (cfDNA)或化学降解的DNA,诸如在保存的样品中发现的DNA。在其他实施方案中,靶核酸在体外被片段化,例如,通过物理方式诸如超声处理或通过核酸内切酶消化,例如,限制酶切消化。
在一些实施方案中,本发明包括靶富集步骤。富集可以是通过经由一种或多种靶特异性探针捕获靶序列。样品中的核酸可以被变性并与单链靶特异性探针接触。探针可以包含亲和捕获部分的配体,从而在形成杂交复合物之后,通过提供亲和捕获部分来捕获它们。在一些实施方案中,亲和捕获部分是亲和素或链霉亲和素,且配体是生物素。在一些实施方案中,该部分结合至固体支持物。如下文进一步详细描述,固体支持物可包括超顺磁性球形聚合物颗粒,例如DYNABEADS™磁珠或磁性玻璃颗粒。
在本发明的一些实施方案中,衔接子分子与靶核酸连接。连接可以是平端连接或更有效的粘端连接。通过“末端修复”,包括链填充,即通过DNA聚合酶延伸3'-末端以消除5'-突出端,可以使靶核酸或衔接子成为平端的。在一些实施方案中,通过将单个核苷酸添加至衔接子的3'-末端并将单个互补核苷酸添加至靶核酸的3'-末端(例如通过DNA聚合酶或末端转移酶),可以使平端的衔接子和靶核酸成为粘性的。在另外的其他实施方案中,衔接子和靶核酸可以通过用限制性核酸内切酶消化而获得粘端(突出端)。后一种选择对于已知含有限制酶识别位点的已知靶序列是更有利的。在一些实施方案中,可能需要其他酶促步骤来完成连接。在一些实施方案中,可以使用多核苷酸激酶将5'-磷酸添加至靶核酸分子和衔接子分子。
在其中不依赖于靶核酸的序列而添加衔接子(例如,通过连接)的实施方案中,样品中的靶核酸在每个末端接受相同的衔接子分子。为了区分所得的衔接的靶核酸的链,衔接子可以具有Y结构,参见例如美国专利号8053192、8182989和8822150(图3)。
在一些实施方案中,衔接子包含引物结合位点,例如,扩增引物结合位点或测序引物结合位点。引物结合位点在衔接子上可以是连续的,图3,图片(B)。在一些实施方案中,为了增加测序的特异性(即,仅对环化的分子进行测序),测序引物结合位点在衔接子臂上可以是不连续的,如图3,图片(A)所示,从而仅仅在衔接的靶核酸被环化时,当衔接子的臂在环状分子中接合在一起时,才形成功能性引物结合位点。
在一些实施方案中,衔接子分子是体外合成的人工序列。在其他实施方案中,衔接子分子是体外合成的天然存在的序列。在另外的其他实施方案中,衔接子分子是分离的天然分子。
在一些实施方案中,本发明是包括扩增靶核酸的步骤的方法。扩增可以是通过指数聚合酶链反应(PCR)、仅一条链的线性扩增或利用寡核苷酸引物的任何其他方法。在PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand和J. J. Sninsky编, 1995, AcademicPress, San Diego, CA)第14章; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky和T. J. White 编,Academic Press, NY, 1990)中描述了各种PCR条件。
在一些实施方案中,扩增利用存在于缀合于上文所述靶序列的衔接子中的通用引物结合位点。在其他实施方案中,使用基因特异性(靶特异性)引物或引物对。在一些实施方案中,引物含有5'-突出端,其包含衔接子序列,例如条形码或测序引物结合位点。这种引物的使用免除了本发明方法中的衔接子连接步骤。
在一些实施方案中,扩增涉及不对称PCR,其产生过量的两条链之一,如例如Gyllensten U.B. 和Erlich H.A. (1988) Generation of single-stranded DNA by the polymerase chain reaction and its application to direct sequencing of the HLA-DQA locus, PNAS, 85:7652中所述。在该实施方案中,一对引物由以过度量存在的过量引物和以限制量存在的限量引物组成。所得的扩增优先包含代表过量引物的延伸产物的链。如果本发明的方法包括不对称PCR的步骤,则所得的单链环将优先包含作为过量引物的延伸产物的一条链。为了进一步富集一条链的反应,可以采用本文所述的核酸外切酶消化步骤。具体地,过量引物可包含核酸外切酶抗性修饰,使得在环化之前,可通过核酸外切酶消化消除限量引物的延伸产物。替代地,过量引物可包含亲和捕获部分的配体,使得过量引物的延伸产物可使用亲和捕获部分被捕获并保留用于进一步分析。然而在另一种替代方案中,限量引物可以包含亲和捕获部分的配体,从而可以使用亲和捕获部分捕获限量引物的延伸产物,并丢弃,而过量引物的产物保留在反应混合物中用于进一步分析。
在一些实施方案中,本发明包括将条形码引入靶核酸中。对各个分子测序通常需要分子条形码,诸如在例如美国专利号7,393,665、8,168,385、8,481,292、8,685,678和8,722,368中所述的。独特的分子条形码是通常在体外操作的最早步骤期间添加给样品(诸如患者的样品)中的每种分子的短人工序列。条形码标记分子和它的后代。独特的分子条形码(UID)具有多种用途。条形码允许追踪样品中的每种单个核酸分子以评估例如循环肿瘤DNA(ctDNA)分子在患者的血液中的存在和量,以便不经活组织检查而检测和监测癌症。参见美国专利申请14/209,807和14/774,518。独特的分子条形码还可以用于测序误差校正。单个靶分子的全部后代用相同条形码标记并形成带条形码的家族。不被带条形码的家族的所有成员共享的序列中的变异被作为伪迹抛弃且不是真突变。条形码还可以用于位置去重复(positional deduplication)和靶定量,因为整个家族代表原始样品中的单一分子。参见同上。
在本发明的一些实施方案中,衔接子包含一个或多个条形码。条形码可以是在样品被混合(多重化)的情况下用于标识样品的来源的多重样品ID (MID)。条形码也可以充当用于标识每种原始分子和它的后代的UID。条形码也可以是UID和MID的组合。在一些实施方案中,将单个条形码用作UID和MID二者。
在一些实施方案中,每个条形码包含预定义的序列。在其他实施方案中,条形码包含随机序列。条形码的长度可以是1-20个核苷酸。
在一些实施方案中,该方法进一步包括使衔接的靶核酸的链分离的步骤。在一些实施方案中,两条分离的链均保留用于下游分析,例如测序。可以通过物理手段,即碱变性或热变性使两条链分离。
在一些实施方案中,例如通过核酸酶选择性降解一条链来酶促分离链。在一些实施方案中,核酸外切酶具有5’-> 3’活性。有利的是,可以使仅一条链易受核酸外切酶消化,而保护第二条链免受核酸外切酶消化,任一性质都由链中存在的修饰的核苷酸赋予。在一些实施方案中,修饰的核苷酸是5’-磷酸化的末端核苷酸,且核酸外切酶是λ核酸外切酶,其消化5’-磷酸化的链,同时保留非磷酸化的链用于后续步骤。在其他实施方案中,修饰的核苷酸包含硫代磷酸酯基团,并且核酸外切酶选自T5和T7核酸外切酶,其消化未修饰的链,同时保留修饰的链用于后续步骤。
在其他实施方案中,通过亲和捕获将一条链标记用于保留。例如,扩增引物之一可以包含亲和配体(例如生物素),其将使得链能够被亲和捕获部分(例如,通过链霉亲和素)捕获并保留,而互补链可以被丢弃。在一些实施方案中,亲和捕获利用结合到固体支持物上的亲和分子(例如,链霉亲和素)。固体支持物可以能够悬浮在溶液中(例如,玻璃珠、磁珠、聚合物珠或其他类似颗粒)或可以是固相支持物(例如,硅晶片、载玻片等)。溶液相支持物的实例包括超顺磁球形聚合物颗粒,例如DYNABEADS™磁珠或磁性玻璃颗粒,例如在美国专利656568、6274386、7371830、6870047、6255477、6746874和6255851中所述。
在一些实施方案中,通过各种试剂来增强链分离,所述试剂选自单链结合蛋白,例如细菌SSB、低复杂度DNA C0t DNA(富集重复序列的DNA),或化学试剂,例如碱、甘油、尿素、DMSO或甲酰胺。
该方法进一步包括使单链核酸环化的步骤。连接步骤利用能够催化核酸的5’-磷酸和3’-OH基团之间的反应的连接酶。在一些实施方案中,连接酶是能够进行不依赖于模板的连接的DNA或RNA连接酶,例如描述于例如公开号WO2010094040中的病毒连接酶。此外,非酶试剂可用于形成引物延伸产物的5′-磷酸和衔接子的3′-OH之间的磷酸二酯键,如例如US20140193860中所述。在一些实施方案中,连接酶是热稳定的单链RNA或DNA连接酶,例如Thermophage连接酶或其衍生物,例如Circligase™ 和Circligase™ II (EpicentreTech., Madison, Wisc.)。在一些实施方案中,夹板用于使得能够实现双链连接酶,例如T4连接酶活性。夹板寡核苷酸与从头到尾排列的衔接子的两条链均互补。
在一些实施方案中,本发明包括核酸外切酶消化步骤,其从反应混合物中消除线性(非环状)核酸并富集环状核酸。线性核酸可以包含未环化的靶核酸链、未使用的引物和衔接子。
在一些实施方案中,核酸外切酶是单链特异性核酸外切酶、双链特异性核酸外切酶或其组合。在一些实施方案中,核酸外切酶具有3’-> 5’活性。核酸外切酶可以是核酸外切酶I、核酸外切酶III和核酸外切酶VII中的一种或多种。
在一些实施方案中,本发明是制备本文所述的测序准备就绪的环状单链靶核酸的文库的方法和通过该方法产生的文库。具体地,文库包含源自样品中存在的核酸的环状单链的集合。文库的单链环状分子包含与衔接子序列接合的靶序列。
在一些实施方案中,本发明包括通过核酸测序检测样品中的靶核酸。可以将多个核酸,包括样品中的所有核酸,转化成本发明的模板构型并测序。在一些实施方案中,可以对单链环状分子的文库进行核酸测序。
在一些实施方案中,该方法进一步包括消除受损或降解的靶的步骤,以改进测序读取结果的质量和长度。该步骤可以包括使反应混合物与尿嘧啶DNA N-糖基化酶(UNG或UDG)、AP核酸酶和Fpg (甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶)(也称作8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶)中的一种或多种接触,以降解这种受损的靶核酸。
如上所述,衔接子或靶特异性引物可以包含测序引物结合位点,其可以启动每条链的测序读取。
可以通过本领域已知的任意方法执行测序。特别有利的是能够读取环状靶核酸的高通量单分子测序。这样的技术的实例包括利用SMRT的Pacific BioSciences平台(Pacific Biosciences, Menlo Park, Cal.)或利用纳米孔技术的平台(诸如由OxfordNanopore Technologies (Oxford, UK)或Roche Sequencing Solutions (Roche Genia,Santa Clara, Cal.)制造的那些)和任意其他目前存在的或将来的涉及或不涉及通过合成测序的DNA测序技术。测序步骤可以利用平台专用的测序引物。可以将这些引物的结合位点引入如本文中所述的本发明的方法中,即,通过成为第二衔接子或扩增引物的一部分。
分析和误差校正
在一些实施方案中,测序步骤涉及序列分析,其包括序列比对的步骤。在一些实施方案中,使用比对来确定来自多个序列(例如,具有相同条形码(UID)的多个)的共有序列。在一些实施方案中,使用条形码(UID)来确定来自全部都具有相同条形码(UID)的多个序列的共有序列。在其他实施方案中,使用条形码(UID)来消除伪迹,即,存在于一些但并非全部具有相同条形码(UID)的序列中的变异。可以消除这样的源自PCR误差或测序误差的伪迹。
在一些实施方案中,通过对样品中具有每种条形码(UID)的序列的相对数目进行定量,可以对样品中的每种序列的数目进行定量。每个UID代表在原始样品中的单个分子,且计数与每种序列变体相关的不同UID可以确定在原始样品中的每种序列的分数。本领域技术人员将能够确定为确定共有序列所必需的序列读取结果的数目。在一些实施方案中,相关数目是准确定量结果所必需的读取结果/UID (“序列深度”)。在一些实施方案中,期望的深度是5-50个读取结果/UID。
如图1所示,该方法的一个实施方案涉及将衔接子(例如Y形衔接子)连接至靶分子或靶分子的文库。衔接子可以包含条形码,例如样品ID(SID)或独特的分子ID(UID)和测序引物结合位点。此外,衔接子分子的5′-末端被磷酸化以使得能够实现连接步骤。在下一步中,通过物理(温度)或化学(碱性)方式使链分离并保持在单链形式。通过存在单链稳定剂例如单链结合蛋白,例如细菌SSB,可以进一步增强单链状态。还可以通过用核酸外切酶除去一条链来使链分离。在下一步中,借助于单链连接酶或能够连接单链的5'-磷酸和3'-OH的类似试剂,将单链进行自我连接(环化)。在一些实施方案中,夹板用于使得能够实现双链连接酶,例如T4连接酶活性。例如通过核酸外切酶消化除去不期望的副产物,例如线性多联体、过量的衔接子或未用到的靶核酸,由于具有游离的5′-和3′-末端,它们易受所述核酸外切酶消化。可以使用核酸外切酶VII和核酸外切酶III的组合。通过将测序引物退火至衔接子序列中的引物结合位点,对所得的环状单链靶核酸或环状单链靶核酸的文库进行测序。
如图2所示,该方法的一个实施方案涉及将衔接子(例如Y形衔接子)连接至靶分子或靶分子的文库。衔接子可以包含条形码,例如样品ID(SID)或独特的分子ID(UID)和引物结合位点。在下一步中,使用与引物结合位点互补的通用引物扩增连接的衔接的靶分子或衔接的靶分子的文库。引物包含磷酸化的5'末端,以使得能够实现连接步骤。在下一步中,通过物理(温度)或化学(碱性)方式使链分离并保持在单链形式。通过存在单链稳定剂例如单链结合蛋白,例如细菌SSB,可以进一步增强单链状态。还可以通过用核酸外切酶除去一条链来使链分离。引物之一可以包含防止引物和引物延伸产物(即,扩增子链)的核酸外切酶消化的修饰。引物之一可以替代地包含使得能够实现引物和扩增子链的核酸外切酶消化的修饰。在下一步中,借助于单链连接酶或能够连接单链的5'-磷酸和3'-OH的类似试剂,或使用夹板寡核苷酸辅助的双链连接酶,将剩余单链进行自我连接(环化)。例如通过核酸外切酶消化除去不期望的副产物,例如线性多联体、过量的衔接子或缺乏衔接子的靶核酸,由于具有游离的5′-和3′-末端,它们易受所述核酸外切酶消化。通过将测序引物退火至衔接子序列中的引物结合位点,对所得的环状单链靶核酸或环状单链靶核酸的文库进行测序。
实施例
实施例1.制备环状单链未扩增文库并对其进行测序
根据图1所示的方法,从500ng或1ug的大肠杆菌基因组DNA制备测序文库。该文库包含专门用于Pacific BioSciences RSII测序平台的衔接子。使用Bioanalyzer RNA 皮可(pico)测定来分辨核酸外切酶抗性(可能是环状的)材料。最终文库产率为起始DNA质量的10-20%。
所得文库在Pacific BioSciences RSII平台(Pacific BioSciences, MenloPark, Cal.)上测序。结果如图4和图5所示。
除了根据图1的单链环状文库,还制备了两种类型的对照:1)使用发夹衔接子制备的常规双链文库;2)通过图1的方法(但跳过变性步骤,从而重新形成类似于对照1的双链环状模板)制备的文库。所有文库均在Pacific Biosciences RSII平台上测序。如所预期的,对照包含约80%的双链DNA和少于1%的单链DNA(图4),而根据本发明的方法制备的文库的约40%仅包含一条链(图5)。
用包含专门用于基于纳米孔的测序平台(Roche Genia)的衔接子的文库重复该实验。 该文库在RSII上测序,表明30%(有SSB)和61%(无SSB)是单链的。对照文库包含<1%的单链DNA(图6)。
实施例2.制备环状单链PCR扩增的文库并对其进行测序。
根据图2所示的方法,从500ng或1ug的大肠杆菌基因组DNA制备测序文库。该文库包含专门用于Pacific BioSciences RSII测序平台的衔接子。用表1的引物对之一扩增衔接的核酸。
表1.
SEQ ID NO: 1 | 正向 | AACGGAGGAGGAGGAAAAG |
SEQ ID NO: 2 | 反向 | /5phos/G*T*T*G*TTGTTGAGAGAGATT |
SEQ ID NO: 3 | 正向 | GTTGTTGTTGAGAGAGATT |
SEQ ID NO: 4 | 反向 | /5phos/AACGGAGGAGGAGGAAAAG |
* -硫代磷酸酯核苷酸
/5phos/ - 5’-磷酸。
SEQ ID NO:2掺入了四个硫代磷酸酯核苷酸,以给引物延伸得到的链赋予T7核酸外切酶抗性。SEQ ID NO:4掺入了5′-磷酸,以促进用λ核酸外切酶消化引物延伸得到的链。扩增产物用T7或λ核酸外切酶处理(取决于引物)。DNA产量示于表2。
表2.
核酸外切酶 | 单位 | dsDNA产量 (ng) | ssDNA产量(ng) |
T7核酸外切酶 | 10U | 45.39 | 102.2 |
T7核酸外切酶 | 5U | 43.01 | 98.7 |
T7核酸外切酶 | 1U | 583.1 | 1311.8 |
λ核酸外切酶 | 2.5U | 46.92 | 101.5 |
λ核酸外切酶 | 1U | 59.16 | 116.2 |
λ核酸外切酶 | 0.5U | 85 | 130.9 |
在RSII平台上对所得文库进行测序。结果显示于图7(T7核酸外切酶)和图8(λ核酸外切酶)。
实施例1和实施例2的合并结果概括在表3中。
表3.
*“单次通过(Single pass)”是丢弃的读取结果,其与参照物不匹配或缺少衔接子序列。
**总的单链由等量的(+)和(-)链组成。
序列表
<110> Genia Technologies Inc. et al.
<120> 用于单分子的单链环状DNA模板的产生
<130> P34422-WO
<150> 62/626589
<151> 2018-02-05
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 全部人工的、单链的
<400> 1
aacggaggag gaggaaaag 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 全部人工的、单链的
<400> 2
gttgttgttg agagagatt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 全部人工的、单链的
<400> 3
gttgttgttg agagagatt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 全部人工的、单链的
<400> 4
aacggaggag gaggaaaag 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 全部人工的、单链的
<400> 5
ctcctccgtt tttgagagag att 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 全部人工的、单链的
<400> 6
atctctctct acgactgtcc tc 22
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 全部人工的、单链的
<400> 7
gtcctcctcc tccgtttttt gagagagatt 30
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 全部人工的、单链的
<400> 8
atctctctct actgactg 18
Claims (18)
1.分别对双链靶核酸的每条链进行测序的方法,其包括以下步骤:
a)在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;
b)用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含影响核酸外切酶消化速率的修饰的核苷酸;
c)使反应混合物与核酸外切酶接触,从而从反应混合物中消除扩增子的两条互补链中的第一条;
d)使扩增子的两条互补链中的第二条环化以形成单链环;
e)将测序引物退火至单链环;
f)延伸引物,从而对靶核酸的一条链进行测序。
2.权利要求1的方法,其中接合至衔接子是通过连接。
3.权利要求1的方法,其中连接是通过接合靶核酸和衔接子的粘端。
4.权利要求1的方法,其中衔接子包含双链部分和含有两个非退火部分的单链部分。
5.权利要求1的方法,其中衔接子包含至少一个条形码。
6.权利要求1的方法,其中衔接子包含至少一个引物结合位点。
7.权利要求1的方法,其中修饰的核苷酸是5′-磷酸化的末端核苷酸,并且核酸外切酶是λ核酸外切酶。
8.权利要求1的方法,其中修饰的核苷酸包含硫代磷酸酯基团,并且核酸外切酶选自T5和T7核酸外切酶。
9.权利要求1的方法,其在环化步骤d)之后进一步包括第二核酸外切酶消化步骤。
10.权利要求1的方法,其中环化是通过夹板连接。
11.权利要求1的方法,其中测序引物接合位点是在衔接子中。
12.权利要求1的方法,进一步包括在步骤c)之前,使反应混合物与选自糖基化酶和核酸内切酶的DNA损伤特异性试剂接触。
13.从样品中的双链靶核酸制备单链核酸的文库的方法,该方法包括以下步骤:
a)在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;
b)用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含影响核酸外切酶消化速率的修饰的核苷酸;
c)使反应混合物与核酸外切酶接触,从而从反应混合物中消除扩增子的两条互补链中的第一条;
d)使扩增子的两条互补链中的第二条环化以形成单链环,从而形成单链环状靶核酸的文库。
14.分别对双链靶核酸的每条链进行测序的方法,其包括以下步骤:
a)在反应混合物中,用一对靶特异性引物扩增靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含抑制核酸外切酶消化的修饰的核苷酸;
b)使反应混合物与核酸外切酶接触,从而从反应混合物中消除扩增子的两条互补链中的第一条;
c)使扩增子的两条互补链中的第二条环化以形成单链环;
d)将测序引物退火至单链环;
e)延伸引物,从而对靶核酸的一条链进行测序。
15.从样品中的双链靶核酸制备单链核酸的文库的方法,该方法包括以下步骤:
a)在反应混合物中,用一对靶特异性引物扩增靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含影响核酸外切酶消化速率的修饰的核苷酸;
b)使反应混合物与核酸外切酶接触,从而从反应混合物中消除扩增子的两条互补链中的第一条;
c)使扩增子的两条互补链中的第二条环化以形成单链环,从而形成单链环状靶核酸的文库。
16.分别对双链靶核酸的每条链进行测序的方法,其包括以下步骤:
a)在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;
b)用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含捕获部分的配体;
c)使扩增子的两条链分离;
d)使反应混合物与捕获部分接触,从而捕获扩增子的两条链中的第一条;
e)将扩增子的链环化以形成单链环;
f)将测序引物退火至单链环;
g)延伸引物,从而对靶核酸的一条链进行测序。
17.从样品中的双链靶核酸制备单链核酸的文库的方法,该方法包括以下步骤:
a)在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;
b)用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,从而形成扩增子,其中该对引物中的一个引物包含捕获部分的配体;
c)使扩增子的两条链分离;
d)使反应混合物与捕获部分接触,从而捕获扩增子的两条互补链中的第一条;
e)使扩增子的互补链环化以形成单链环,从而形成单链环状靶核酸的文库。
18.优先对双链靶核酸的一条链进行测序的方法,其包括以下步骤:
a)在反应混合物中,将双链靶核酸接合至衔接子以形成衔接的靶核酸,其中衔接子包含引物结合位点;
b)用与引物结合位点互补的一对引物扩增衔接的靶核酸,该对包含限制量的限量引物和过度量的过量引物;
c)使延伸产物环化以形成单链环;
d)将测序引物退火至单链环;
e)延伸引物,从而优先对靶核酸的一条链进行测序。
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---|---|---|---|---|
US20230279483A1 (en) * | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Element Biosciences, Inc. | Double-stranded splint adaptors and methods of use |
US20230279382A1 (en) * | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Element Biosciences, Inc. | Single-stranded splint strands and methods of use |
WO2023240611A1 (zh) * | 2022-06-17 | 2023-12-21 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 单链核酸环状文库的建库以及测序方法 |
WO2024073034A1 (en) * | 2022-09-29 | 2024-04-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Simplified sequencing library preparation for dna |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002209594A (ja) * | 1993-01-15 | 2002-07-30 | Orchid Biosciences Inc | ヌクレオチド塩基の同定方法 |
US20030207279A1 (en) * | 2002-04-25 | 2003-11-06 | Crothers Donald M. | Amplification of DNA to produce single-stranded product of defined sequence and length |
US20040265888A1 (en) * | 1999-08-13 | 2004-12-30 | Kenneth Horlick | Binary encoded sequence tags |
WO2009120372A2 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
WO2012003374A2 (en) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Targeted sequencing library preparation by genomic dna circularization |
WO2012162267A2 (en) * | 2011-05-20 | 2012-11-29 | Fluidigm Corporation | Nucleic acid encoding reactions |
WO2014196863A1 (en) * | 2013-06-07 | 2014-12-11 | Keygene N.V. | Method for targeted sequencing |
CN105400776A (zh) * | 2014-09-12 | 2016-03-16 | 深圳华大基因科技有限公司 | 寡核苷酸接头及其在构建核酸测序单链环状文库中的应用 |
JP2017528138A (ja) * | 2014-09-12 | 2017-09-28 | ビージーアイ シェンチェン カンパニー リミテッド | 小胞性リンカー、ならびに核酸ライブラリ構築およびシーケンシングにおけるその使用 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US656568A (en) | 1899-09-30 | 1900-08-21 | Truman Noble | Binder for loose sheets. |
DE19512361A1 (de) | 1995-04-01 | 1996-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Isolierung eines biologischen Materials |
KR100463475B1 (ko) | 1995-06-08 | 2005-06-22 | 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 | 자기성피그먼트 |
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GB2378245A (en) | 2001-08-03 | 2003-02-05 | Mats Nilsson | Nucleic acid amplification method |
US7315019B2 (en) | 2004-09-17 | 2008-01-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Arrays of optical confinements and uses thereof |
US7393665B2 (en) | 2005-02-10 | 2008-07-01 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
EP2121983A2 (en) | 2007-02-02 | 2009-11-25 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
WO2009120374A2 (en) | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sample preparation |
EP2610352B1 (en) | 2009-02-16 | 2014-10-08 | Epicentre Technologies Corporation | Template-independent ligation of single-stranded DNA |
WO2011088573A1 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-28 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Health | Set of probes for the detection and typing of 46 human papillomavirus mucosal types |
ES2690753T3 (es) | 2010-09-21 | 2018-11-22 | Agilent Technologies, Inc. | Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular |
GB201101621D0 (en) | 2011-01-31 | 2011-03-16 | Olink Ab | Method and product |
WO2013188840A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-19 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for sensitive mutation detection in nucleic acid molecules |
US9816120B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-11-14 | The Penn State Research Foundation | Low sequence bias single-stranded DNA ligation |
EP3033431B1 (en) | 2013-08-13 | 2019-10-02 | General Electric Company | Endonuclease-assisted isothermal amplification using contamination-free reagents |
EP3191628B1 (en) * | 2014-09-12 | 2022-05-25 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Identification and use of circulating nucleic acids |
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Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002209594A (ja) * | 1993-01-15 | 2002-07-30 | Orchid Biosciences Inc | ヌクレオチド塩基の同定方法 |
US20040265888A1 (en) * | 1999-08-13 | 2004-12-30 | Kenneth Horlick | Binary encoded sequence tags |
US20030207279A1 (en) * | 2002-04-25 | 2003-11-06 | Crothers Donald M. | Amplification of DNA to produce single-stranded product of defined sequence and length |
WO2009120372A2 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
WO2012003374A2 (en) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Targeted sequencing library preparation by genomic dna circularization |
WO2012162267A2 (en) * | 2011-05-20 | 2012-11-29 | Fluidigm Corporation | Nucleic acid encoding reactions |
WO2014196863A1 (en) * | 2013-06-07 | 2014-12-11 | Keygene N.V. | Method for targeted sequencing |
CN105400776A (zh) * | 2014-09-12 | 2016-03-16 | 深圳华大基因科技有限公司 | 寡核苷酸接头及其在构建核酸测序单链环状文库中的应用 |
JP2017528138A (ja) * | 2014-09-12 | 2017-09-28 | ビージーアイ シェンチェン カンパニー リミテッド | 小胞性リンカー、ならびに核酸ライブラリ構築およびシーケンシングにおけるその使用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SAMUEL MYLLYKANGAS 等: "Targeted sequencing library preparation by genomic DNA circularization" * |
Also Published As
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