JP2003527087A - バイナリーコード化配列タグ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸試料の包括的分析方法および該方法に用いるためのディテクター組成物が開示されている。該方法は、バイナリーコード化配列タグ（ＢＥＳＴ）と称され、一連の核酸フラグメントを生成し、認識部位からオフセットの部位で切断するための認識部位を含有する末端にアダプターを付加し、そのフラグメントを切断して複数の付着末端を有するフラグメントを生成し、そのフラグメントにインデックスを付して付着末端の配列に基づきセットに分けることを含む。オフセットアダプターを新たに生成された末端に付加することでフラグメントをインデックスに付す。種々のアダプターを各々異なる付着末端にカップリングさせる。末端が限定されており、（好ましい具体例において）長さが等しく、供給源の核酸分子から由来の中心配列を有する、得られたフラグメントは、バイナリー配列タグである。このバイナリー配列タグは極めて多くの方法にて用いることができ、さらには分析することができる。例えば、このバイナリー配列タグはプローブとハイブリダイズし、カップリングすることにより、好ましくはライゲートすることにより捕獲することができる。該プローブはアレイにまたは分類可能なビーズ上に固定することが好ましい。バイナリー配列タグの修飾補助分析（ＭＡＡＢＳＴ）と称される、ＢＥＳＴ法の一の形態は、分子の修飾の有無を基礎としてディファレンシャル切断を検出することにより核酸分子中の配列の修飾を評価するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 開示されている発明は、一般に、核酸の特徴化および分析の分野、さらに詳し
くは遺伝子発現のパターン、核酸試料およびゲノムの分析および比較の分野に関
するものである。

【０００２】 （従来技術） 遺伝子−発現のパターンにおける違いを研究することは、分化および進化の機
構を理解するための最も将来性のある方法の一つである。加えて、疾患−関連の
標的分子を同定することは、合理的な医療介入についての新しい解決方法を開放
するものである。現在、分子発現のパターンを分析するのに、２つの主な解決方
法：（１）ｍＲＮＡ−発現地図の作成、および（２）蛋白の発現特性を、二元的
ゲル電気泳動、質量分光測定法［マトリックス−アシステッド−レーダー−デソ
ープション−イオニゼーション−タイム−オブ−フライト（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
）または電子噴射］などの技法により分析し、それによりピコモル以下の蛋白を
配列決定することのできる、「プロテオーム」の試験がある。ノーザンブロット
またはプラークハイブリダイゼーションなどのイメージを転写する伝統的な方法
は、ｍＲＮＡ−発現のパターンを分析するのに時間を要し、材料集約的な方法で
ある。これらの理由から、工業上および臨床的にリサーチするにおいて、高い処
理能でスクリーニングする別の方法が開発されてきた。

【０００３】 遺伝子発現の分析における飛躍的進歩は、１９７７年のノーザンブロット技法
の開発であった（Alwineら、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. ７４：５３５０−５
３５４（１９７７））。この技術では、標識されたｃＤＮＡまたはＲＮＡプロー
ブがＲＮＡブロットにハイブリダイズされ、ｍＲＮＡ転写物の発現パターンが研
究される。また、ＲＮａｓｅ−保護アッセイは特異的なＲＮＡの発現を検出する
ことができる。これらのアッセイではｍＲＮＡ部分集合の発現を並行して測定す
ることができる。ＲＮａｓｅ−保護アッセイの場合、選択されるｍＲＮＡとのハ
イブリッドを形成する標識されたｃＤＮＡを合成するために、分析されるｍＲＮ
Ａの配列は既知でなければならず；そのようなハイブリッドは一本鎖特異的ヌク
レアーゼによるＲＮＡ分解を阻止し、ゲル電気泳動により検出することができる
。第３の方法として、ディファレンシャルプラークフィルターハイブリダイゼー
ションは、クローン化ｃＤＮＡの発現における特異的な差異を同定することがで
きる（Maniatisら、Cell １５：６８７−７０１（１９７８））。これらの技法
はすべて、遺伝子発現の違いを研究するのには優れた方法であるが、これらの伝
統的な方法を制限する原因が既知の遺伝子についてのみ発現パターンを分析でき
るということである。

【０００４】 遺伝子−発現のパターンの分析は、ある起源のｍＲＮＡプールを異なる起源の
ｍＲＮＡプールにハイブリダイズすることにより作成される、引き算ｃＤＮＡラ
イブラリーの開発と共に有意な発展を遂げた。その場合、ハイブリダイゼーショ
ン工程においては相補鎖のない転写物がｃＤＮＡライブラリーの構築に使用され
る（Hedrickら、Nature ３０８：１４９−１５３（１９８４））。特異的ｍＲＮ
Ａを同定するのに、種々の改善がこの方法に対してなされた（Swaroopら、Nucle
ic Acids Res. ２５：１９５４（１９９１）；Diatchenkoら、Proc. Natl. Acad
. Sci. U.S.A. ９３：６０２５−６０３０（１９９６））。その一つがビオチン
−および制限−媒介強化を介してディファレンシャルに発現するｍＲＮＡを選択
的に増幅することであり（selective amplification of differentially expres
sed mRNA via biotin−and restriction−mediated enrichment；ＳＡＢＲＥ；L
averyら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ９４：６８３１−６８３６（１９９
７））、テスター集団から由来のｃＤＮＡをドライバー（コントロール）集団の
ｃＤＮＡに対してハイブリダイズさせる。テスター−ｃＤＮＡ含有のハイブリッ
ドについて特異的な精製工程に付した後、付加したリンカーを用い、テスター−
テスターの同種ハイブリッドを特異的に増幅させ、そうして未知の遺伝子を単離
する。

【０００５】 真核生物のｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ法は二方向性方式にて
組織学的に転写された遺伝子を分析および比較するための第１ワン・チューブ法
であり；引き算およびディファレンシャルハイブリダイゼーション技法はディフ
ァレンシャルに発現される遺伝子を一方向に同定するために適用されるにすぎな
かった（LiangおよびPardee、Science ２５７：９６７−９７１（１９９２））
。ディファレンシャルディスプレイの再現性、有効性および実施の強化に対する
改善が提案されている（Bauerら、Nucleic Acids Res. １１：４２７２−４２８
０（１９９３）；LiangおよびPardee、Curr. Opin. Immunol. ７：２７４−２８
０（１９９５）；ItoおよびSakaki、Methods Mol. Biol. ８５：３７−４４（１
９９７）；PrascharおよびWeissman、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ９３：６
５９−６６３（１９９６）；Shimketsら、Nat Biotechnol, １７：７９８−８０
３（１９９９））。これらの方法は伝統的なＰＣＲを基礎とするディファレンシ
ャルディスプレイよりも再現的であって、正確であるが、かかる方法はゲル電気
泳動を用いる必要がある。このことは、しばしば、特定のＤＮＡフラグメントを
分析から排除することを意味する。

【０００６】 ２つの複合ゲノムの間の違いを同定するのに最初に開発された、リプレゼンテ
ーション・ディファレンス・アナリシス（ＲＤＡ）が、引き算ハイブリダイゼー
ションおよびＰＣＲの両方の利点を考慮することにより、ディファレンシャル遺
伝子発現の分析に適用された（Lisitsynら、Science ２５９：９４６−９５１（
１９９３）；HubankおよびSchatz、Nucleic Acids Res. ２２：５６４０−５６
４８（１９９４））。第１工程において、２つの異なる集団、すなわち、テスタ
ーおよびドライバー（コントロール）集団から由来のｍＲＮＡを逆転写する；テ
スターｃＤＮＡはディファレンシャル遺伝子発現が起こると考えられるｃＤＮＡ
集団を示す。切断を頻繁に行う制限エンドヌクレアーゼを用いて消化した後、リ
ンカーでそのｃＤＮＡの両末端をリンゲージする。ついで、ＰＣＲ工程に付して
、異なる遺伝子プールの最初の表示を得る。テスターおよびドライバーｃＤＮＡ
のリンカーを消化し、新たなリンカーをテスターｃＤＮＡの末端にライゲートす
る。ついで、テスターおよびドライバーｃＤＮＡを過剰量のドライバーｃＤＮＡ
と１：１００の割合で混合し、テスターおよびドライバーｃＤＮＡプールの両方
に共通する一本鎖ｃＤＮＡの間のハイブリダイゼーションを促進させる。ｃＤＮ
Ａをハイブリダイゼーションに付した後、ＰＣＲにより、二本鎖ｃＤＮＡの両端
にあるプライム化部位を介して、テスターｃＤＮＡにより生成される同種二量体
だけを指数的に増幅させる（O'NeillおよびSinclair、Nucleic Acid Res. ２５
：２６８１−２６８２（１９９７）；Wadaら、Kidney Int. ５１：１６２９−１
６３８（１９９７）；Edmanら、J. ３２３：１１３−１１８（１９９７））。

【０００７】 細胞または生物の遺伝子−発現のパターンにより、その基本的な生物学的特徴
が決定される。ｍＲＮＡコード化配列の発見および特徴化を容易にするために、
種々の組織から直接的にｃＤＮＡのフラグメントを無作為に配列決定するという
概念が生じた（Adamsら、Science ２５２：１６５１−１６５６（１９９１）；A
damsら、Nature ３７７：３−１６（１９９５））。これらの発現配列タグ（Ｅ
ＳＴ）により、ゲノム誘導配列のコード化領域の同定が可能となる。公に利用可
能なＥＳＴデータベースは、コンピューターによる遺伝子発現の比較的分析を可
能とする。所定の器官または細胞型の発現配列タグと、種々の起源からの配列情
報とを比較することにより、ディファレンシャルに発現された遺伝子を同定する
ことができる（Leeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ９２：８３０３−８３
０７（１９９５）；Vasmatzisら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ９５：３０
０−３０４（１９９８））。ＥＳＴを配列決定することの欠点は大規模な配列決
定装置を必要とすることである。

【０００８】 遺伝子発現の連続的分析（ＳＡＧＥ）は、比較分析物を介してディファレンシ
ャルに発現される遺伝子を同定するための、配列を基礎とする方法である（Velc
ulescuら、Science ２７０：４８４−４８７（１９９５））。その方法では種々
の細胞集団または組織から由来の配列を同時に分析することができる。（１）発
現される転写物を同定するために配列タグ（１０−１４ｂｐ）を生成する工程；
（２）クローンし、配列決定することのできるコンカテマーを得るために配列タ
グをライゲートする工程；および（３）該タグにより同定される遺伝子の発現に
おける違いを決定するために配列データと比較する工程の、３工程がＳＡＧＥに
ついての分子的基礎を形成する。この操作は分析すべきｍＲＮＡ集団毎に行われ
る。ＳＡＧＥの主な欠点は対応する遺伝子がジンバンクに寄託されているそれら
のタグについてのみ同定できるということであり、すなわち、利用できるデータ
ベースの量がＳＡＧＥの効率を決定するということである。また、配列決定作業
の大部分は細胞のｍＲＮＡ中に高頻度で存在するこれらタグの反復読みを行うこ
とであるため、どのｍＲＮＡ集団についても簡単に９５％の適用範囲を付与しう
るＳＡＧＥデーターのセットを得るには、多大な配列決定を行う作業が必要とさ
れる。言いかえれば、ＳＡＧＥ配列決定実験では稀なｍＲＮＡについては見返り
が少なく、その独特なタグは配列決定の作業から数週間後にデータベースへの蓄
積が開始されることになる。

【０００９】 遺伝子発現プロフィールおよびゲノム組成を研究する種々の方法はＤＮＡマイ
クロアレイを用いることである。最近のＤＮＡマイクロアレイは組織的に高密度
でグライドされている。かかるマイクロアレイはｃＤＮＡ（例えば、ＥＳＴ）、
ＰＣＲ産物またはクローン化ＤＮＡを用い、それをナイロンフィルター、ガラス
スライドまたはシリコーンチップの表面に連結させることによって生成される（
Schenaら、Science ２７０、４６７−４７０（１９９５））。ＤＮＡアレイはま
た、合成したオリゴヌクレオチドをマトリックスに直接塗布するか、またはフォ
トリソグラフィーと固相化学合成を組み合わすより複雑にした方法により、合成
オリゴヌクレオチドから組み立てることもできる（Fodorら、Nature ３６４：５
５５−５５６（１９９３））。遺伝子発現の違いを測定するために、標識された
ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドをＤＮＡ−またはオリゴマー担持アレイにハ
イブリダイズする。ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを標識するために異なる
フルオロフォアーを用いる場合、２つのプローブを同時に該アレイに用いること
ができ、さらには単一のチップ上で分析することができる（Cheeら、Science ２
７４：６１０−６１４（１９９６））。しかし、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオ
チドアレイの両方の感度に応じて、ハイブリダイゼーションシグナルの強度は、
少しまたは豊富に発現された遺伝子を分析する場合、その直線から離れていく。
かくして、ディファレンシャルに発現される遺伝子の正確な検出を行うには、個
々の最適化工程が要求される。かかるマイクロアレイ法を用いて多くの興味のあ
る生物学的問題を解決することもできるが、新しい遺伝子の発見には適していな
い。

【００１０】 付着末端−特異的アダプターを用いてＤＮＡフラグメントをタグ化する方法が
、BurgerおよびSchinzel、Mol. Gen. General. １８９：２６９−２７４（１９
８３）；MandeckiおよびBolling、Gene ６８：１０１−１０７（１９８８）；Po
sfaiおよびSzybalski、Gene ７４：１７９−１８１（１９８８）；Urlaubら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. ８２：１１８９−１１９３（１９８５）；Vermeschおよ
びBennett、Gene ５４：２２９−２３８（１９８７）；UnrauおよびDeugau、Gen
e １４５（２）：１６３−９（１９９４）に記載されている。これらの方法はす
べて存在する制限部位の使用を包含し、種々の長さのタグ化フラグメントを産生
する。

【００１１】 ディファレンシャルディスプレイまたはＳＡＧＥに固有の遺伝子を見出す能力
と、アレイハイブリダイゼーション技法のパワーおよび便利性を組み合わせた方
法が望まれている。ゲル電気泳動を用いることなく、冗長的なＤＮＡ配列決定作
業を必要とすることなく、包括的な遺伝子発現分析を行うことができるならば、
かかる方法はかなり魅力な方法であろう。 かくして、本発明の目的は核酸配列タグを包括的に分析するための方法を提供
することである。 核酸配列タグの指標化を可能とするディテクター組成物を提供することも本発
明のもう一つ別の目的である。 核酸試料からの配列タグのカタログを提供することも本発明のもう一つ別の目
的である。

【００１２】 （発明の開示） 核酸試料を包括的に分析するための方法および該方法にて用いるためのディテ
クター組成物を開示する。バイナリーコード化配列タグ（ＢＥＳＴ）と称される
、本発明の方法は、一連の核酸フラグメントを生成し、アダプターを認識部位か
らオフセット位置にある部位にて切断するための認識部位を含有する末端に付加
し、そのフラグメントを切断して複数の付着末端を有するフラグメントを生成し
、そのフラグメントを付着末端の配列を基礎とするセットにインデックスする、
ことを包含する。マルチプル付着末端配列はアダプターの一部として付加された
認識部位を用いるオフセット切断により生成される。これは核酸試料を認識配列
の部位とは異なる部位で切断する制限エンドヌクレアーゼによる消化に付すこと
で達成することが好ましい。オフセットアダプターを新たに生成された末端に付
加することによりフラグメントをインデックスする。異なるアダプターが各々異
なる付着末端にカップリングされるであろう。末端が限定されており、（好まし
い具体例において）長さが等しく、中心配列が供給源の核酸分子から派生するで
あろう、その得られるフラグメントがバイナリー配列タグである。そのバイナリ
ー配列タグは非常に多くの方法にて用いることができ、さらには分析することが
できる。例えば、このバイナリー配列タグは、ハイブリダイズし、カップリング
させ、好ましくはライゲーションすることにより、プローブに捕獲することがで
きる。該プローブはアレイに固定されているか、または分類可能なビーズ上に固
定されていることが好ましい。本発明の方法はオフセット切断部位を標的とする
核酸フラグメントに導入しているため、この開示されている方法は少なくとも従
来の方法とは区別される。この方法は長さが限定された配列タグのセットを生成
するという利点がある。

【００１３】 該方法はバイナリー配列タグの検出を可能とし、その検出により各フラグメン
トの生成された付着末端の配列、最初に核酸分子を切断するのに用いられる核酸
切断試剤、好ましくは制限エンドヌクレアーゼの認識配列、およびタグの中心配
列を含む、タグについての配列情報が得られる。特定の核酸切断試剤およびアダ
プターを用いて核酸試料より得られるバイナリー配列タグのセットは、バイナリ
ー配列タグの特徴的なセットを生成するであろう。この方法は再現性のある配列
特異的な方法にて複合的な核酸の試料を迅速かつ容易にカタログ分類することを
可能とする。本発明の方法はまた、核酸試料中の各切断部位について２つのバイ
ナリー配列タグを生成するであろう。これはバイナリー配列タグを比較し、確認
することを可能とする。

【００１４】 バイナリー配列タグの修飾補助分析（ＭＡＡＢＳＴ）と称される、ＢＥＳＴ法
の一の形態は、核酸分子中の修飾の存在または不存在を基礎としてディファレン
シャルな切断を検出することによりその分子中の配列の修飾を評価するものであ
る。例えば、核酸分子中でメチル化された部位はその部位でのメチル化に対して
感受的な制限酵素により切断されないであろう。メチル化に対して非感受的な制
限酵素はその部位を切断し、かくして異なるパターンのバイナリー配列タグを生
成するであろう。

【００１５】 （発明を実施するための最良の形態） バイナリーコード化配列タグ（ＢＥＳＴ）と称される、この開示方法は、再現
性のある配列特異的な方法にて、核酸の複合的試料を迅速かつ容易にカタログに
分類することを可能とする。かかるカタログは他の核酸試料の他の同様に調製さ
れたカタログと比較することができ、その試料間の違いを簡単に検出することが
できる。核酸試料について有意な量の情報が組み入れられているカタログはフィ
ンガープリントとして供することができ、それは関連する核酸試料を検出し、核
酸試料を比較するのに用いることができる。例えば、特定の生物の存在または同
定は、試験生物の核酸のカタログを作成し、その得られたカタログを既知の生物
から調製された標準カタログと比較することにより検出することができる。遺伝
子発現パターンの変化および違いもまた、種々の細胞試料からのｍＲＮＡのカタ
ログを作成し、そのカタログを比較することにより検出することができる。また
、配列のカタログを用いて、核酸試料の供給源に特異的なプローブまたはプライ
マーのセットを生成することもできる。

【００１６】 この開示方法を用いて作成される核酸カタログの比較は、該方法にて作成され
、かつカタログ分類された配列情報の整然とした特性により容易となる。該方法
にて固定化、分類化および／またはアレイ検出を用いることで、該方法の自動化
、該情報のカタログ分類および他のカタログとの比較が可能となる。該方法は、
充填したビンと空のビンのパターンで、充填した、空の、または種々のレベルに
充填することができ、および／または一定量のシグナルがビンに入れた、多数の
配列特異的なビンであって、既にカタログ分類されている核酸試料についての情
報を提供する、均等物をもたらし得る。重複する配列鎖をより大きな配列に組み
立てることは可能であるが、その必要がない。検出される個々の配列がカタログ
におけるデータそのものである。

【００１７】 ＢＥＳＴ法は以下の基礎工程を含む。核酸試料を１またはそれ以上の核酸切断
試剤、好ましくは制限エンドヌクレアーゼと一緒にインキュベートして、特定の
部位で切断されたＤＮＡフラグメントのセットを得る。ついで、その試料を１ま
たはそれ以上のオフセットアダプターと混合し、そのアダプターの各々は、認識
配列よりオフセットにある部位を切断する、核酸切断試剤のための認識配列を有
する。ついで、そのオフセットアダプターを、好ましくはライゲーションにより
、ＤＮＡフラグメントに共有結合させる。そのオフセットアダプターは核酸フラ
グメントの末端と適合しうる末端を有していなければならない。ここでの、およ
び他の工程におけるカップリングは、ライゲーションおよび化学反応を含む、い
ずれか適当な技法を用いて行うことができる。ライゲーションが好ましい。カッ
プリングがライゲーションによりなされる場合、適当な鎖とのライゲーションに
て沈殿することのできる５’−ホスフェートがなければならない。

【００１８】 核酸試料を、オフセットアダプターの認識配列を用いて核酸フラグメントを切
断し、種々の配列の付着末端を有するフラグメントを生成する、１またはそれ以
上の核酸切断試剤、好ましくは制限エンドヌクレアーゼと一緒にインキュベート
する。フラグメントは認識配列から同じ距離で切断されることが好ましい。該方
法の一の形態においては、試料をアリコート（インデックス試料と称される）；
好ましくは付着末端配列と同じ数のアリコートに分けることができる。マルチプ
ル制限エンドヌクレアーゼを用いる場合、切断する前に核酸試料をインデックス
試料に分割することが好ましい。シングル制限エンドヌクレアーゼを用いる場合
、切断した後に核酸試料をインデックス試料に分割することが好ましい。核酸試
料はオフセットアダプターまたはアダプター−インデクサーを付加した後にイン
デックス試料に分割することもできる。インデックス試料それ自体をさらに第２
インデックス試料に分割することもできる。

【００１９】 各試料（核酸試料を分割したならば、各インデックス試料）を１またはそれ以
上のアダプター−インデクサーと混合する。そのアダプター−インデクサーの各
々はそのインデックス試料のＤＮＡフラグメント上の可能性のある付着末端の一
つと適合しうる付着末端を有する。種々のアダプター−インデクサーを各インデ
ックス試料と混合することが好ましい。ついで、アダプター−インデクサーを、
好ましくはライゲーションにより、適合可能なＤＮＡフラグメントに共有結合さ
せる。得られた核酸フラグメントがバイナリー配列タグである。 バイナリー配列タグは種々の方法にて分析することができる。例えば、バイナ
リー配列タグを、増幅し、検出し、同定し、配列決定し、カタログ分類し、また
はそれらの組み合わせに付すことができる。好ましくは、１またはそれ以上のバ
イナリー配列タグの存在、数量、存在および数量、または不存在を、直接的また
は間接的に測定することにより、バイナリー配列タグを検出することが好ましい
。バイナリ配列タグを分析するのに適する、核酸フラグメントを分析するための
多くの技術および方法が知られている。

【００２０】 バイナリー配列タグ分析の好ましい形態はインデックスを付したプローブをハ
イブリダイゼーションすることである。この分析は、各試料（またはインデック
ス試料）中にあるバイナリー配列タグをライゲーター−ディテクターにハイブリ
ダイズすることにより行うことができる。各ライゲーター−ディテクターの一端
は第２核酸切断試剤により生成される可能性のある付着末端配列の一つのすべて
または一部に対合するまたは相補的な配列を有する。ライゲーター−ディテクタ
ーはアダプター−インデクサーにカップリングしたフラグメントの付着末端配列
に隣接した配列のすべてまたは一部に対合するまたは相補的な配列を有すること
ができる、好ましくはそのような配列を有している。各インデックス試料に用い
られるライゲーター−ディテクターは、好ましくは、そのインデックス試料に用
いられるアダプター−インデクサー配列中の、付着末端配列を含む、配列のすべ
てまたは一部に対合するか、あるいはそれらに相補的であることが好ましい。各
試料（またはインデックス試料）を反応させて、好ましくはライゲーションによ
り、１またはそれ以上のディテクタープローブにカップリングさせる。使用され
るディテクタープローブのセットは、一定の長さのあらゆる可能性のある配列（
例えば、あらゆる可能性のある６塩基配列）を含むことが好ましい。プローブが
ライゲーター−アダプターの末端に隣接してハイブリダイズしているならば、プ
ローブとライゲーター−ディテクターの末端は単にカップリングしているだけで
ある。プローブは固定されたオリゴヌクレオチドであることが好ましい。

【００２１】 インデックスを付したプローブのハイブリダイゼーションを介して処理される
バイナリー配列タグは、各々、ライゲーター−ディテクターがプローブにカップ
リングすることでシグナルを発するであろう。複合的な核酸試料は独特なパター
ンのシグナルを発するであろう。このパターンが核酸試料の独特なカタログ分類
を可能とし、異なる核酸試料から生成されるシグナルのパターンとの感受的かつ
強力な比較を可能とする。 ライゲーター−ディテクターとプローブとのカップリングは、直接的または間
接的に検出することができる。例えば、プローブ、ライゲーター−ディテクター
または結合したアダプター−インデクサーまたはオフセットアダプターのいずれ
も検出することができる。ライゲーター−ディテクター、アダプター−インデク
サーまたはオフセットアダプターと所定のプローブとの結合はプローブおよびラ
イゲーター−ディテクターのカップリングを示す。かかる結合の検出は、プロー
ブ、ディテクター−ライゲーター、アダプター−インデクサーまたはオフセット
アダプターを固定し、捕獲タグ、分類タグおよび検出可能な標識のプローブ、デ
ィテクター−ライゲーター、アダプター−インデクサーおよび／またはオフセッ
トアダプターとの結合において用いることにより容易にすることができる。固定
化ならびに捕獲タグ、分類タグおよび標識との結合のいずれの組み合わせも用い
ることができる。好ましくは、該プローブをアレイに固定し、ライゲーター−デ
ィテクターを検出可能な標識と結合させる。したがって、固定されたプローブの
特定のアレイ中の特定の場所でのシグナルの検出は核酸試料から由来のインデッ
クスを付した核酸フラグメントについての情報を提供することができる。

【００２２】 プローブをアレイに固定した場合、アレイおよびＤＮＡフラグメントがシグナ
ルを発するアレイ中の場所により、ＤＮＡフラグメントの付着末端の配列および
付着末端に隣接する配列が同定される。４個の塩基の付着末端および６個の塩基
の固定プローブを用いた場合、これは１０個の塩基配列である。認識配列と（使
用した場合）ＩＩＳ型の制限酵素の切断部位との間の固定された関係、および認
識配列の同一性は、ＤＮＡフラグメントに関する付加的な配列情報を提供する。
同じ効果が、別途、（捕獲タグ、分類タグおよび標識を介して）特定のプローブ
を捕獲するか、分類するか、または検出するかによって得ることができる。すな
わち、プローブと、それに結合するライゲーター−ディテクターとが同定される
限りは、一定のパターンを決定することができる。 開示されている方法を用いて生成されるバイナリー配列タグは、一般に、最初
の切断部位がＤＮＡ基質の末端近くに生じる少数の場合を除いて、相関関係にあ
る対で生じる。開示されている方法を用いてタグカタログを分析することにより
、特定の信頼限界内で、相関関係にある対の部分集合が同一であることを明らか
にすることができる。相関関係にある対の部分集合を同定することにより、タグ
のカタログについて付加的な配列情報が得られる。

【００２３】 バイナリー配列タグの修飾補足分析（ＭＡＡＢＳＴ）と称される、ＢＥＳＴ法
の一の形態は、分子中の修飾の存在または不存在を基礎として、ディファレンシ
ャルな切断を検出することにより核酸分子中の配列の修飾を評価する。例えば、
核酸分子にてメチル化されている部位はその部位でのメチル化に感受的な制限酵
素により切断されないであろう。メチル化に対して非感受的な制限酵素はその部
位を切断し、かくして種々のパターンの配列タグが得られる。

【００２４】 材料 核酸試料 いずれの核酸試料もこの開示されている方法にて用いることができる。適当な
核酸試料として、例えば、ゲノム試料、ｍＲＮＡ試料、ｃＤＮＡ試料、核酸ライ
ブラリー（ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーを含む）、全細胞試料、環境試料
、培養試料、組織試料、体液、および生検試料が挙げられる。多くの他の核酸試
料の供給源も公知であるか、あるいは開発されており、いずれも開示されている
方法に用いることができる。開示方法に用いるのに好ましい核酸試料は、ゲノム
試料およびｍＲＮＡ試料などの有意な複合性を有する核酸試料である。 核酸フラグメントはより大きな核酸分子のセグメントである。この開示方法に
て用いられる核酸フラグメントは、一般に、切断されている核酸分子をいう。核
酸切断試剤と一緒にインキュベートした核酸試料を消化試料という。制限酵素を
用いて消化した核酸試料を消化試料という。

【００２５】 インデックス試料はさらなる処理のために異なるアリコートに分割されている
核酸試料である。この開示方法において、インデックス試料は、好ましくはライ
ゲーションによって消化試料中にある核酸フラグメントにカップリングさせるた
めに、異なるアダプター−インデクサーが添加されている、消化核酸試料のアリ
コートであることが好ましい。この開示方法において、異なる核酸フラグメント
は該フラグメントの付着末端配列を基礎として異なるインデックス試料にて処理
される。かくして、消化核酸試料は、該試料を消化するのに用いられる核酸切断
試剤により得られる可能性のある付着末端配列の数と同じ数のインデックス試料
に分割されることが好ましい。複数の異なる核酸切断試剤を用いて核酸試料を切
断する場合、核酸試料は使用される核酸切断試剤と同じ数のアリコートに分割さ
れ、その核酸試料は切断の前に分割されることが好ましい。マルチプル制限エン
ドヌクレアーゼを用いる場合、切断する前に核酸試料をインデックス試料に分割
することが好ましい。シングル制限エンドヌクレアーゼを用いる場合、切断した
後に核酸試料をインデックス試料に分割することが好ましい。核酸試料はオフセ
ットアダプターまたはアダプター−インデクサーを付加した後にインデックス試
料に分割することもできる。インデックス試料それ自体をさらに第２インデック
ス試料に分割することもできる。

【００２６】 コントロール核酸試料は、もう一つ別の核酸試料（テスター核酸試料というこ
とができる）を比較することのできる核酸試料である。コントロールインデック
ス試料は、もう一つ別のインデックス試料（テスターインデックス試料というこ
とができる）を比較することのできるインデックス試料である。

【００２７】 核酸切断試剤 開示されている方法は核酸切断試剤を用いている。核酸切断試剤は、核酸分子
の切断を生じさせ、媒介し、または触媒する、化合物、複合物および酵素である
。好ましい核酸切断試剤は配列−特異的方法にて核酸分子を切断する試剤である
。制限酵素（制限エンドヌクレアーゼともいう）が核酸切断試剤の好ましい形態
である。他の核酸切断試剤は、Szybalski（Szybalski、Gene ４０（２−３）：
１６９−７３（１９８５）；PodhajskaおよびSzybalski、Gene ４０（２−３）
：１７５−８２（１９８５）［Gene ４３（３）：３２５（１９８５）にて誤り
が明らかにされた］の万能制限エンドヌクレアーゼ、Breakerら（Carmiら、Proc
. Natl. Acad. Sci. USA ９５（５）：２２３３−２２３７（１９９８））によ
り開発された最新ＤＮＡ切断系、およびKimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９
３（３）：１１５６−１１６０（１９９６）およびSmithら、Nucleic Acids Res
. ２７（２）：６７４−６８１（１９９９）によって記載されているハイブリッ
ド制限酵素などの制限酵素の部位認識を方向付ける亜鉛フィンガーの使用を包含
する。

【００２８】 多くの核酸切断試剤が公知であり、当該開示方法にて用いることができる。開
示されている方法に関連する、核酸切断試剤は、一般に、認識配列および認識部
位を有する。多くの核酸切断試剤、特に制限酵素はまた、切断部位に付着末端を
生成する。認識配列は、核酸分子中にある場合、同種の核酸切断試剤によって核
酸の切断を方向付ける、ヌクレオチド配列である。核酸切断試剤の切断部位は、
通常、認識配列に関連する部位であり、その核酸切断試剤が核酸分子を切断する
。付着末端（粘着末端、突出末端、および５’または３’突出部ともいう）は、
二本鎖核酸セグメントの末端にある一本鎖核酸セグメントである。

【００２９】 該方法の詳細な具体例として、使用される核酸切断試剤は該方法にて用いられ
る他の制限酵素に対してある特性および／またはある関係を有するであろう。例
えば、開示されている方法の好ましい具体例においては、複数の異なる配列を有
する付着末端を生成する核酸切断試剤が好ましく、認識配列からオフセットの位
置に切断部位を有する核酸切断試剤が最も好ましい。開示されている方法の他の
具体例では、該方法の他の段階で同じインデックス試料に用いられる他の核酸切
断試剤とは異なる認識配列を有し、および／または異なる付着末端を生成する異
なる核酸切断試剤の使用を必要とする。例えば、マルチプル消化（すなわち、切
断反応）をこの方法にて用いる場合、この消化の各々に用いられる核酸切断試剤
は、他の消化に用いられる核酸切断試剤の認識配列とは異なる配列を有すること
が好ましい。かかる場合、核酸切断試剤の既知の特性を用いて適当な核酸切断試
剤を選択または消化することができる。

【００３０】 核酸切断試剤が認識配列とは異なるまたはオフセットな部位でＤＮＡを切断す
る場合、異なる配列を有する種々の付着末端を生成することができる。これは核
酸の認識配列がいずれの配列にも隣接して生じることができるためであり、その
ため、切断の部位はいずれの配列を有することもできる。例えば、ＦｏｋＩはＧ
ＧＡＴＧの認識部位から９（上鎖）および１３（下鎖）個下流にあるヌクレオチ
ドを切断する。どのような配列が生じても、４個の塩基付着末端は認識部位から
離れて１０ないし１３個のヌクレオチドを有するであろう。十分な切断部位が得
られたならば、合計２５６個の異なる付着末端配列（可能性のあるあらゆる４個
の塩基配列）がＦｏｋＩ消化から生じ得る。その結果、ＩＩＳ型制限酵素などの
制限酵素は複数の異なる配列を有する付着末端を生成しうるようである。

【００３１】 本明細書で用いる場合、特記しない限り、消化物、消化、消化されたおよび消
化するなる語は、一般に、切断反応または切断の作用に言及するものであり、蛋
白酵素による、または特定の機構による切断に限定することを意図とするもので
はない。同様に、制限なる語は、核酸の切断に言及するものであって、制限酵素
による切断だけをいうものではない。核酸切断試剤なる語において、配列−特異
的とは、絶対的な配列特異性ではなく、単にある程度の配列特異性を必要とする
にすぎない。すなわち、完全にまたは部分的に限定された認識配列を有する核酸
切断試剤が好ましい。かくして、その認識配列にていくらか縮重性を有する核酸
切断試剤も配列−特異的であると考えられる。 第１核酸切断試剤は核酸試料を消化するのに最初に用いられる核酸切断試剤で
ある。第２核酸切断試剤はオフセットアダプターをカップリングさせるフラグメ
ントを消化するのに用いられる核酸切断試剤である。第１核酸切断試剤は、好ま
しくは、認識配列内を切断する、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである。第２核
酸切断試剤は、好ましくは、ＩＩＳ型制限酵素である。

【００３２】 標準的方法における制限酵素の使用に加えて、ＩＩＳ型酵素を、Szybalski（S
zybalski、Gene ４０（２−３）：１６９−７３（１９８５）；Podhajskaおよび
Szybalski、Gene ４０（２−３）：１７５−８２（１９８５）［Gene ４３（３
）：３２５（１９８５）にて誤りが明らかにされた］により記載された万能制限
エンドヌクレアーゼとして用いることができる。Szybalski法において、一本鎖
または二本鎖ＤＮＡは、記載されている構造物をＩＩＳ型酵素と組み合わせて利
用して（特異的ではあるが）恣意的な部位で切断することができる。さらに進ん
だＤＮＡ切断系が、Breakerら（Carmiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９５（
５）：２２３３−２２３７（１９９８））により開発された。これらの系におい
て、BreakerはＤＮＡが標的ＤＮＡの特定の配列を認識し、標的ＤＮＡ、一本鎖
または二本鎖標的を切断しうることを明らかにした。特定の作用についてＤＮＡ
を進化させるためにBreakerの系を用いた場合、適当なＤＮＡを認識し、特定の
切断結果を得るのに合理的な時間および努力を要するのは明らかである。

【００３３】 オフセットアダプター オフセットアダプターは、認識部位からずれた部位で切断する核酸切断試薬の
認識部位を含有する二本鎖核酸である。オフセットアダプターは好ましくは、一
本鎖部分および二本鎖部分を含有する。一本鎖部分は、オフセットアダプターの
一端にあり、粘着末端を構成する。突出する一本鎖（粘着末端）が２、３、４ま
たは５個のヌクレオチドを有することが好ましい。オフセットアダプターの二本
鎖部分は、いずれかの都合のよい配列または長さを有していてもよい。一般に、
二本鎖部分の配列および長さは、該方法におけるその後の工程に適応するように
選択される。例えば、オフセットアダプター中の配列をプライマーまたはプロー
ブハイブリダイゼーションに用いてもよい。アダプターが連結した試料中のフラ
グメントを増幅する場合、オフセットアダプターは、プライマーハイブリダイゼ
ーションのための配列を提供することができる。したがって、オフセットアダプ
ターの二本鎖部分に好ましい配列組成および長さは、一般に、プライマーハイブ
リダイゼーションに有用なものであろう。

【００３４】 オフセットアダプターは、自己相補的ないずれの配列も有さないことが好まし
い。ミスマッチまたはギャップがない６ヌクレオチド長よりも大きい相補性領域
が存在しない場合、該条件が満たされると考えられる。開示される方法に有用な
一組のオフセットアダプターは、一本鎖部分が各々、第一制限酵素の１つによっ
て生じた粘着末端配列と適合した異なるヌクレオチド配列を有する異なるオフセ
ットアダプターを包含することができる。一組のオフセットアダプターのメンバ
ーが、該組の各メンバーに同一の二本鎖部分を含有することが好ましい。

【００３５】 オフセットアダプターは、また、オフセットアダプターが結合するフラグメン
トの固定化または捕獲を容易にするための捕獲タグを含有するか、または該捕獲
タグと結合することができる。オフセットアダプターは、また、オフセットアダ
プターが結合するフラグメントの選別または分離を容易にするための選別タグを
含有するか、または該選別タグと結合することができる。オフセットアダプター
は、また、オフセットアダプターが結合するフラグメントの検出を容易にするた
めの標識を含有するか、または該標識と結合することができる。オフセットアダ
プターはまた、基体上に固定化することができる。

【００３６】 オフセットアダプターは、また、粘着末端の反対の末端に突出末端を包含する
ことができる。かかる末端を例えば、オフセットアダプターと結合されるべき標
識のハイブリダイゼーション標的として使用することができる（かくして、オフ
セットアダプターの検出部分とみなすことができる）。オフセットアダプターの
２つの鎖は、開示される方法において別々に使用することができる。例えば、オ
フセットアダプターの２つの鎖を核酸フラグメントに別々に結合することができ
る。オフセットアダプターは、また、検出のためのアダプター−インデクサー配
列の遊離を容易にする１以上の光切断可能なヌクレオチドを包含することができ
る。光切断可能なヌクレオチドおよびそれらの使用は、ＷＯ００／０４０３６号
に記載されている。

【００３７】 オフセットアダプターは、天然ヌクレオチドより構成される必要はない。修飾
されたヌクレオチド、非天然塩基およびヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
類似体を使用することができる。オフセットアダプターが本明細書に記載の一般
構造を有し、開示される方法において必要とされる相互作用および反応が可能で
あることだけが必要とされる。

【００３８】 アダプター−インデクサー アダプター−インデクサーは、一本鎖部分および二本鎖部分を含有する二本鎖
核酸である。一本鎖部分は、アダプター−インデクサーの一端にあり、粘着末端
を構成する。粘着末端は、アダプター−インデクサーの粘着末端部分と称される
。突出する一本鎖（粘着末端）が２、３、４または５個のヌクレオチドを有する
ことが好ましい。アダプター−インデクサーの二本鎖部分は、いずれかの都合の
よい配列または長さを有していてもよい。一般に、二本鎖部分の配列および長さ
は、該方法におけるその後の工程に適応するように選択される。例えば、アダプ
ター−インデクサー中の配列をプライマーまたはプローブハイブリダイゼーショ
ンに使用してもよい。アダプター−インデクサーの好ましい目的は、ライゲータ
ー−デテクターによるハイブリダイゼーションのための配列を提供することであ
る。アダプターが結合した試料中のフラグメントを増幅する場合、アダプター−
インデクサーは、また、プライマーハイブリダイゼーションのための配列（それ
は、ライゲーター−デテクターハイブリダイゼーションのための配列と重複また
は隣接することができる）を提供することができる。したがって、アダプター−
インデクサーの二本鎖部分に好ましい配列組成および長さは、一般に、プローブ
およびプライマーハイブリダイゼーションに有用なものであろう。アダプター−
インデクサーは、また、アダプター−インデクサーの検出を容易にするために設
計されたデテクター部分を包含することができる。検出部分は、例えば、ハイブ
リダイゼーション標的である配列であることができ、または、それは標識または
タグであることができる。

【００３９】 一般に、アダプター−インデクサーの二本鎖部分の配列は、該方法におけるそ
の後の工程で使用されるべきいずれかの制限酵素の認識配列を包含すべきでない
。アダプター−インデクサーは、自己相補的ないずれの配列も有さないことが好
ましい。該条件は、ミスマッチまたはギャップがない６ヌクレオチド長より大き
い相補性領域が存在しない場合に満たされると考えられる。

【００４０】 開示される方法において有用な一組のアダプター−インデクサーは、一本鎖部
分が各々、ヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴの順列組み合わせから選択される異
なるヌクレオチド配列を有する異なるアダプター−インデクサーを包含するべき
である。複数の核酸切断試薬を最初の消化に用いる場合、各アダプター−インデ
クサーの一本鎖部分は、核酸切断試薬の１つによって生じた粘着末端配列と適合
した異なるヌクレオチド配列を有することができる。一組におけるアダプター−
インデクサーの粘着末端は異なる配列を有するが、それらは、１の核酸切断試薬
による切断によって生じたフラグメントを表示するための該組の使用を容易にす
るために、同じ長さであることが好ましい。一組のアダプター−インデクサーの
メンバーは、該組の各メンバーに同一の二本鎖部分を含有することが好ましい。
しかしながら、一組のアダプター−インデクサーのメンバーは、また、ある点で
異なる二本鎖部分を有することができる。同様に、一組中のアダプター−インデ
クサーのいくつかは、同一の二本鎖部分を有することができるが、同じ組におけ
る他のいくつかは異なる二本鎖部分を有する。該組の異なる配置を用いて、異な
る型のデータを得るか、または開示される方法においてタグ間の特定の関係をプ
ローブすることができる。

【００４１】 （ａ）少なくとも２つの１本鎖第一オリゴヌクレオチド（その各々が共通の同
一の配列、および３’末端および５’末端から選択される一端にて、Ａ、Ｇ、Ｃ
およびＴヌクレオチドの順列組み合わせから選択される２、３、４および５ヌク
レオチドから選択される長さの独特の配列を有する）；および（ｂ）一本鎖第二
オリゴヌクレオチド（その配列は第一オリゴヌクレオチドの共通配列に相補的で
あり、その結果、第一オリゴヌクレオチドのいずれか１つとハイブリダイズする
とき、二本鎖アダプター−インデクサーがそれを生じる）を含んでなるインデキ
シング（indexing）リンカー鎖の好ましい組は、独特の配列の粘着末端を有する
末端を包含する。

【００４２】 アダプター−インデクサーは、また、アダプター−インデクサーが結合するフ
ラグメントの固定化または捕獲を容易にするための捕獲タグを含有するか、また
は該捕獲タグと結合することができる。一般に、捕獲タグは、ビオチンおよびス
トレプトアビジンのような結合対の１メンバーであることができる。捕獲タグは
、本明細書の他の箇所でより詳細に論じられている。アダプター−インデクサー
は、また、アダプター−インデクサーが結合するフラグメントの選別および分離
を容易にするための選別タグを含有するか、または該選別タグと結合することが
できる。一般に、選別タグは、蛍光部分のような検出可能な標識または磁性ビー
ズのような操作可能な部分であることができる。選別タグは、本明細書の他の箇
所でより詳細に論じられている。アダプター−インデクサーは、また、アダプタ
ー−インデクサーが結合するフラグメントの検出を容易にするための標識を含有
するか、または該標識と結合することができる。アダプター−インデクサーは、
また、基体上に固定化することができる。

【００４３】 アダプター−インデクサーは、また、粘着末端の反対の末端に突出末端を包含
することができる。かかる末端は、例えば、アダプター−インデクサーと結合さ
れるべき標識のハイブリダイゼーション標的として使用することができる（かく
して、アダプター−インデクサーの検出部分とみなすことができる）。アダプタ
ー−インデクサーの２つの鎖は、開示される方法において別々に使用することが
できる。例えば、アダプター−インデクサーの２つの鎖を核酸フラグメントに別
々に結合することができる。アダプター−インデクサーは、また、検出のための
アダプター−インデクサー配列の遊離を容易にする１以上の光切断可能なヌクレ
オチドを包含することができる。光切断可能なヌクレオチドおよびそれらの使用
は、ＷＯ００／０４０３６号に記載されている。

【００４４】 アダプター−インデクサーは、天然ヌクレオチドより構成される必要はない。
修飾されたヌクレオチド、非天然塩基およびヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チド類似体を使用することができる。アダプター−インデクサーが本明細書に記
載の一般構造を有し、開示される方法において必要とされる相互作用および反応
が可能であることだけが必要とされる。

【００４５】 ライゲーター−デテクター ライゲーター−デテクターは、核酸試料から開示される方法において生成され
るバイナリー配列タグの一部に相補的な一本鎖領域を含有する核酸分子である。
ライゲーター−デテクターは、一般に、アダプター−インデクサーまたはオフセ
ットアダプターに対して特異的な配列関係を有する。ライゲーター−デテクター
は、好ましくは、アダプター−インデクサーの少なくとも１つの粘着末端を包含
し、それに隣接した配列の全てまたは一部に合致するかまたは相補的な配列（ラ
イゲーター−デテクターのデテクター部分と称される）を包含する。したがって
、ライゲーター−デテクターは、粘着末端配列（いずれかまたは両末端の）に隣
接する、または粘着末端に合致する、または粘着末端に相補的な核酸フラグメン
ト中の配列に合致するかまたは相補的な配列、あるいは粘着末端配列に隣接する
核酸フラグメント中の配列および粘着末端の両方に合致するかまたは相補的な配
列を有することができる。

【００４６】 好ましくは、ライゲーター−デテクターの配列は、粘着末端配列の全てまたは
一部およびその粘着末端配列と一緒に使用するように設計されたアダプター−イ
ンデクサーの隣接配列の全てまたは一部に合致するか、または相補的である。該
形態において、ライゲーター−デテクターの配列は、切断が認識配列からずれて
いない場合、最初の制限酵素の認識配列の全てまたは一部に合致するか、または
相補的である。別法では、ライゲーター−デテクターは、オフセットアダプター
部位の粘着末端配列に隣接する核酸フラグメント中の配列に合致するか、または
相補的な配列を包含することができる。ライゲーター−デテクター中の配列が合
致するかまたは相補的であるかは、アダプター−インデクサーおよび／またはフ
ラグメントのどちらの鎖がデテクター−ライゲーターにハイブリダイズするかを
決定する。ライゲーター−デテクター（合致するかまたは相補的）の１つの型の
みを開示される方法の所定の反応において使用することが好ましい。

【００４７】 アダプター−インデクサーとライゲーター−デテクターとの配列関係のいくつ
かの例を図１Ａ−Ｃに示す。図１Ａ−Ｃのライゲーター−デテクター１−１２は
、アダプター−インデクサーＩの粘着末端配列の全てまたは一部およびアダプタ
ー−インデクサーＩの隣接配列の全てまたは一部と合致するように設計されてい
る。ライゲーター−デテクター１３−１９は、アダプター−インデクサーＩの粘
着末端配列の全てまたは一部およびアダプター−インデクサーＩの隣接配列の全
てまたは一部に相補的であるように設計されている。ライゲーター−デテクター
２１−３２は、アダプター−インデクサーＩＩの粘着末端配列の全てまたは一部
およびアダプター−インデクサーＩＩの隣接配列の全てまたは一部に合致するよ
うに設計されている。ライゲーター−デテクター３３−４０は、アダプター−イ
ンデクサーＩＩの粘着末端配列の全てまたは一部およびアダプター−インデクサ
ーＩＩの隣接配列の全てまたは一部に相補的であるように設計されている。ライ
ゲーター−デテクターにおいて具体化されるアダプター−インデクサーの隣接配
列の一部がライゲーター−デテクターにおいて具体化される粘着末端配列の部分
と隣接することに注目されたい。これは、隣接によって何が意味されるかという
ことである。

【００４８】 図１Ａ−１Ｃのライゲーター−デテクター１−４は、アダプター−インデクサ
ーＩの粘着末端配列の全ておよびアダプター−インデクサーＩの隣接配列の全て
または一部に合致するように設計されている。ライゲーター−デテクター５−１
２は、アダプター−インデクサーＩの粘着末端配列の一部およびアダプター−イ
ンデクサーＩの隣接配列の全てまたは一部に合致するように設計されている。ラ
イゲーター−デテクター２−４および８−１２は、アダプター−インデクサーＩ
の粘着末端配列の全てまたは一部およびアダプター−インデクサーＩの隣接配列
の一部に合致するように設計されている。ライゲーター−デテクター１３−１６
は、アダプター−インデクサーＩの粘着末端配列の全ておよびアダプター−イン
デクサーＩの隣接配列の全てまたは一部に相補的であるように設計されている。
ライゲーター−デテクター１７−１９は、アダプター−インデクサーＩの粘着末
端配列の一部およびアダプター−インデクサーＩの隣接配列の全てまたは一部に
相補的であるように設計されている。ライゲーター−デテクター１４−１６は、
アダプター−インデクサーＩの粘着末端配列の全てまたは一部およびアダプター
−インデクサーＩの隣接配列の一部に相補的であるように設計されている。ライ
ゲーター−デテクター２０は、制限酵素（アダプター−インデクサーＩの粘着末
端と適合した粘着末端を生じる）の認識配列の全ておよびアダプター−インデク
サーＩの隣接配列の全てに合致するように設計されている。アダプター−インデ
クサー粘着末端配列を超えて伸びている余分のヌクレオチドに注目されたい。こ
れは、認識配列におけるフランキングヌクレオチドである。

【００４９】 ライゲーター−デテクター２１−２４は、アダプター−インデクサーＩＩの粘
着末端配列の全ておよびアダプター−インデクサーＩＩの隣接配列の全てまたは
一部に合致するように設計されている。ライゲーター−デテクター２５−３２は
、アダプター−インデクサーＩＩの粘着末端配列の一部およびアダプター−イン
デクサーＩＩの隣接配列の全てまたは一部に合致するように設計されている。ラ
イゲーター−デテクター２２−２４および２８−３１は、アダプター−インデク
サーＩＩの粘着末端配列の全てまたは一部およびアダプター−インデクサーＩＩ
の隣接配列の一部に合致するように設計されている。ライゲーター−デテクター
３３−３６は、アダプター−インデクサーＩＩの粘着末端配列の全ておよびアダ
プター−インデクサーＩＩの隣接配列の全てまたは一部に相補的であるように設
計されている。ライゲーター−デテクター３７−４０は、アダプター−インデク
サーＩＩの粘着末端配列の一部およびアダプター−インデクサーＩＩの隣接配列
の全てまたは一部に相補的であるように設計されている。ライゲーター−デテク
ター３４−３６および４０は、アダプター−インデクサーＩＩの粘着末端配列の
全てまたは一部およびアダプター−インデクサーＩＩの隣接配列の一部に相補的
であるように設計されている。

【００５０】 最初の消化に使用される核酸切断試薬が、認識配列が粘着末端配列を超えて伸
びるような核酸切断試薬の認識配列内で切断する場合、ライゲーター−デテクタ
ーは、また、認識配列の全てまたは一部に合致するかまたは相補的であることが
できる。認識配列が粘着末端配列を超えて伸びている場合（例えば、６−塩基認
識配列および４−塩基粘着末端）、ライゲーター−デテクター配列は、その同起
源のアダプター−インデクサーの粘着末端配列を超えて伸びることができる。か
かるライゲーター−デテクターの例を図１Ａ−１Ｃに示す（ライゲーター−デテ
クター番号２０）。

【００５１】 ライゲーター−デテクターが配列に基づく検出系を用いて検出できる場合、ラ
イゲーター−デテクターは、また、ライゲーター−デテクターの検出を容易にす
るための標識を含有することができる。多くの標識が知られており、この目的に
使用することができる。ライゲーター−デテクターは、また、ライゲーター−デ
テクターの固定化または捕獲を容易にするための捕獲タグを含有するか、または
該捕獲タグと結合することができる。ライゲーター−デテクターは、また、ライ
ゲーター−デテクターの選別または分離を容易にするための選別タグを含有する
か、または該選別タグと結合することができる。ライゲーター−デテクターは、
また、基体上に固定化することができる。

【００５２】 ライゲーター−デテクターは、また、検出のためのライゲーター−デテクター
配列の遊離を容易にするための１以上の光切断可能なヌクレオチドを包含するこ
とができる。光切断可能なヌクレオチドおよびそれらの使用は、ＷＯ００／０４
０３６号に記載されている。 ライゲーター−デテクターは、天然ヌクレオチドより構成される必要はない。
修飾されたヌクレオチド、非天然塩基およびヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チド類似体を使用することができる。ライゲーター−デテクターが本明細書に記
載の一般構造を有し、開示される方法において必要とされる相互作用および反応
が可能であることだけが必要とされる。

【００５３】 図１Ａ−Ｃのアダプター−インデクサーＩは、配列番号１のヌクレオチド２−
２５（上段の鎖）および配列番号２のヌクレオチド１−２０（下段の鎖）より構
成される。アダプター−インデクサーＩＩは、配列番号３（上段の鎖）および配
列番号４（下段の鎖）のヌクレオチド５−２４より構成される。ライゲーター−
デテクター１は、配列番号１のヌクレオチド２−２５である。ライゲーター−デ
テクター２は、配列番号１のヌクレオチド２−２４である。ライゲーター−デテ
クター３は、配列番号１のヌクレオチド２−２１である。ライゲーター−デテク
ター４は、配列番号１のヌクレオチド２−１８である。ライゲーター−デテクタ
ー５は、配列番号１のヌクレオチド３−２５である。ライゲーター−デテクター
６は、配列番号１のヌクレオチド４−２５である。ライゲーター−デテクター７
は、配列番号１のヌクレオチド５−２５である。ライゲーター−デテクター８は
、配列番号１のヌクレオチド３−２４である。ライゲーター−デテクター９は、
配列番号１のヌクレオチド３−２３である。ライゲーター−デテクター１０は、
配列番号１のヌクレオチド３−２０である。ライゲーター−デテクター１１は、
配列番号１のヌクレオチド３−１８である。ライゲーター−デテクター１２は、
配列番号１のヌクレオチド４−２２である。ライゲーター−デテクター１３は、
配列番号２である。ライゲーター−デテクター１４は、配列番号２のヌクレオチ
ド２−２４である。ライゲーター−デテクター１５は、配列番号２のヌクレオチ
ド４−２４である。ライゲーター−デテクター１６は、配列番号２のヌクレオチ
ド９−２４である。ライゲーター−デテクター１７は、配列番号２のヌクレオチ
ド１−２３である。ライゲーター−デテクター１８は、配列番号２のヌクレオチ
ド１−２２である。ライゲーター−デテクター１９は、配列番号２のヌクレオチ
ド１−２１である。ライゲーター−デテクター２０は、配列番号１である。ライ
ゲーター−デテクター２１は、配列番号３である。ライゲーター−デテクター２
２は、配列番号３のヌクレオチド１−２３である。ライゲーター−デテクター２
３は、配列番号３のヌクレオチド１−２１である。ライゲーター−デテクター２
４は、配列番号３のヌクレオチド１−１５である。ライゲーター−デテクター２
５は、配列番号３のヌクレオチド２−２４である。ライゲーター−デテクター２
６は、配列番号３のヌクレオチド３−２４である。ライゲーター−デテクター２
７は、配列番号３のヌクレオチド４−２４である。ライゲーター−デテクター２
８は、配列番号３のヌクレオチド２−２３である。ライゲーター−デテクター２
９は、配列番号３のヌクレオチド２−２１である。ライゲーター−デテクター３
０は、配列番号３のヌクレオチド２−１９である。ライゲーター−デテクター３
１は、配列番号３のヌクレオチド２−１６である。ライゲーター−デテクター３
２は、配列番号３のヌクレオチド３−２４である。ライゲーター−デテクター３
３は、配列番号４である。ライゲーター−デテクター３４は、配列番号４のヌク
レオチド２−２４である。ライゲーター−デテクター３５は、配列番号４のヌク
レオチド４−２４である。ライゲーター−デテクター３６は、配列番号４のヌク
レオチド９−２４である。ライゲーター−デテクター３７は、配列番号４のヌク
レオチド１−２３である。ライゲーター−デテクター３８は、配列番号４のヌク
レオチド１−２２である。ライゲーター−デテクター３９は、配列番号４のヌク
レオチド１−２１である。ライゲーター−デテクター４０は、配列番号４のヌク
レオチド５−２３である。

【００５４】 デテクタープローブ デテクタープローブは、配列特異的に核酸とハイブリダイズできる分子、好ま
しくはオリゴヌクレオチドである。開示される方法において、デテクタープロー
ブは、ライゲーター−デテクターがハイブリダイズする試料核酸フラグメント中
に存在する相補的配列に基づいてライゲーター−デテクターを捕獲するために使
用される。デテクタープローブは、好ましくは、種々のプローブ配列を有する組
、好ましくは、一定の長さのプローブのヌクレオチド配列のあらゆる可能な組み
合わせを有する（またはあらゆる組み合わせにハイブリダイズできる）プローブ
の組において使用される。デテクタープローブは、好ましくは、各プローブが同
じ長さを有する組において使用される。デテクタープローブのプローブ部分に好
ましい長さは、５、６、７および８ヌクレオチドである。デテクタープローブは
、好ましくは、プローブ部分（試料フラグメントへのハイブリダイゼーションの
ための）およびそれを介してプローブ部分が基体、捕獲タグ、選別タグまたは標
識に結合するリンカー部分を包含する。これらのリンカー部分は、いずれかの適
当な構造を有することができ、一般に、デテクタープローブの固定化または合成
の方法に基づいて選択されるであろう。リンカー部分は、ヌクレオチドより成る
かまたはヌクレオチドを包含することができる。リンカー部分は、いずれかの適
当な長さを有することができ、好ましくは、プローブ部分を効果的にハイブリダ
イズさせるのに十分な長さである。便宜上、別記しないかぎり、デテクタープロ
ーブの長さに言及する場合、プローブのプローブ部分の長さをいう。固定化され
たデテクタープローブは、支持体上に固定化されたデテクタープローブである。

【００５５】 デテクタープローブは、基体上に固定化することができ、好ましくは、基体上
に固定化されている。デテクタープローブは、また、それらが結合するプローブ
およびライゲーター−デテクターの固定化または捕獲を容易にするための捕獲タ
グを含有するか、または該捕獲タグと結合することができる。デテクタープロー
ブは、また、それらが結合するプローブおよびライゲーター−デテクターの選別
または分離を容易にするための選別タグを含有するか、または該選別タグと結合
することができる。デテクタープローブは、また、それらが結合するプローブお
よびライゲーター−デテクターの検出を容易にするための標識を含有するか、ま
たは該標識と結合することができる。

【００５６】 デテクタープローブは、また、プローブ配列およびプローブに結合したライゲ
ーター−デテクターの遊離を容易にするための１以上の光切断可能なヌクレオチ
ドを包含することができる。光切断可能なヌクレオチドおよびそれらの使用は、
ＷＯ００／０４０３６号に記載されている。 デテクタープローブは、天然ヌクレオチドより構成される必要はない。修飾さ
れたヌクレオチド、非天然塩基およびヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類
似体を使用することができる。プローブが本明細書に記載の一般構造を有し、開
示される方法において必要とされる相互作用および反応が可能であることだけが
必要とされる。

【００５７】 プローブアレイ 異なるデテクタープローブを一緒に一組として使用することができる。該組は
、プローブの全てまたはサブセットの混合物として使用でき、分離反応において
別々に使用でき、またはアレイにおいて固定化できる。別々にまたは混合物とし
て使用されるプローブは、例えば、捕獲タグ、選別タグ、またはビーズ上での固
定化によって物理的に分離できる。プローブアレイ（本明細書においてアレイと
もいう）は、アレイ上の同定されたまたは予め決定された位置に固定化された１
以上のプローブまたは複数のプローブを包含する。このような関係において、複
数のプローブとは、各々が異なる配列を有する複数のプローブをいう。アレイ上
の各々の予め決定された位置は、プローブの１つの型を有する（すなわち、その
位置の全てのプローブが同じ配列を有する）。各位置は、好ましくは、プローブ
の複数コピーを有するであろう。アレイにおける異なる配列のプローブの空間的
分離は、核酸試料中の核酸フラグメントに対するプローブのハイブリダイゼーシ
ョンを介してプローブに結合するようになるライゲーター−デテクターの別々の
検出および同定を可能にする。ライゲーター−デテクターがプローブアレイにお
ける所定の位置で検出される場合、ライゲーター−デテクターがハイブリダイズ
した核酸フラグメント中の部位に隣接する配列がアレイ中の該位置に固定化され
たプローブに相補的であることを示す。

【００５８】 アダプター−インデクサー、ライゲーター−デテクターおよびオフセットアダ
プターは、また、アレイにおいて固定化することができる。開示される方法の異
なる様式は、固定化、標識化またはタグ付加された異なる成分を用いて行うこと
ができる。アダプター−インデクサー、ライゲーター−デテクターおよびオフセ
ットアダプターのアレイを作成することができ、下記およびデテクタープローブ
についての本明細書の別の箇所に記載のように使用できる。 プローブアレイにおいて有用な固体状の基体は、オリゴヌクレオチドが直接ま
たは間接的に結合できるいずれかの固体材料を包含することができる。これは、
アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、シリコン、ポリスチ
レン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、
ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカルボネ
ート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポ
リ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフ
メレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような材
料を包含する。固体状の基体は、薄層または膜、ビーズ、ボトル、皿、繊維、繊
維織物、成形ポリマー、粒子および微粒子を包含するいずれかの有用な形態を有
することができる。固体状基体に好ましい形態は、ミクロタイター皿である。ミ
クロタイター皿の最も好ましい形態は、標準的な９６ウェル型である。

【００５９】 オリゴヌクレオチドの固体状基体への固定化方法は、よく確立されている。確
立された結合法を用いて、デテクタープローブを基体に結合することができる。
例えば、適当な接着方法は、Peaseら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):502
2-5026 (1994)およびKhrapkoら、Mol Biol (Mosk) (USSR) 25: 718-730 (1991)
に記載されている。３’−アミンオリゴヌクレオチドのカゼイン被覆スライド上
への固定化方法は、Stimpsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383 (1
995)に記載されている。オリゴヌクレオチドの固体状基体への好ましい接着方法
は、Guoら、Nucleic Acids Res. 22: 5456-5465 (1994)に記載されている。

【００６０】 固体状基体上のオリゴヌクレオチドのアレイの製造方法もまた知られている。
かかる技術の例は、米国特許第５，８７１，９２８号、Fodorら、米国特許第５
，６５４，４１３号、Brenner、米国特許第５，４２９，８０７号および米国特
許第５，５９９，６９５号、Peaseらに記載されている。 好ましいものであるが、所定のプローブアレイが単一単位または構造である必
要はない。プローブの組は、多数の固体支持体にわたって分布していてもよい。
例えば、極端には、各プローブは、分離した反応管または容器中に固定化されて
いてもよい。

【００６１】 アレイ中のプローブは、また、類似のハイブリッド安定性を有するように設計
されることができる。これは、フラグメントのデテクタープローブへのハイブリ
ダイゼーションをより効果的にし、ミスマッチハイブリダイゼーションの発生を
減らすであろう。プローブのハイブリッド安定性は、既知の式および熱力学の原
理を用いて算出できる（例えば、Santa Luciaら、Biochemistry 35: 3555-3562
(1996); Freierら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9373-9377 (1986); Bresl
auerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3746-3750 (1986)を参照）。プロー
ブのハイブリッド安定性は、例えば、プローブを化学的に修飾することによって
、より類似させることができる（ハイブリッド安定性を平滑化すると称すること
ができる工程）（Nguyenら、Nucleic Acids Res. 25(15):3059-3065 (1997); Ho
hsisel, Nucleic Acids Res. 24(3):430-432 (1996)）。ハイブリッド安定性は
また、特別の条件下でのハイブリダイゼーションを行うことによって、平滑化す
ることができる（Nguyenら、Nucleic Acids Res. 27(6):1492-1498 (1999); Woo
dら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(6): 1585-1588(1985)）。

【００６２】 プローブのハイブリッド安定性を平滑化するもう一つ別の方法は、プローブの
長さを変化することである。これは、各プローブのハイブリッド安定性の調整を
可能にし、その結果、全てのプローブが類似のハイブリッド安定性（可能な範囲
まで）を有する。プローブからの単一ヌクレオチドの付加または欠失は、固定増
分によってプローブのハイブリッド安定性を変化するので、プローブアレイにお
けるプローブのハイブリッド安定性は等しくないであろうと理解される。この理
由で、本明細書で使用する場合、ハイブリッド安定性の類似性とは、プローブの
ハイブリッド安定性の類似性におけるいずれかの増加（または、別法では、プロ
ーブのハイブリッド安定性の差におけるいずれかの減少）をいう。ハイブリッド
安定性におけるいずれかのかかる増加した類似性は、デテクタープローブのハイ
ブリダイゼーションおよびライゲーションの効率および適合度を改善できるので
、このことは有用である。

【００６３】 デテクタープローブの試料フラグメントへのハイブリダイゼーションおよびラ
イゲーションの効率はまた、異なるハイブリダイゼーション条件に付すことので
きるプローブアレイのセクションまたはセグメントにおける類似のハイブリッド
安定性のデテクタープローブを分類することによって、改善することができる。
このように、ハイブリダイゼーション条件は、プローブの特定のクラスに対して
最適化することができる。

【００６４】 増幅プライマー 増幅プライマーは、バイナリー配列タグを増幅するために使用されるオリゴヌ
クレオチドである。増幅プライマーは、バイナリー配列タグの鎖の１つに相補的
な配列を包含する。該配列は、増幅プライマーの相補性部分と称される。好まし
くは、増幅プライマーの相補性部分は、アダプター−インデクサーの鎖の１つの
全てまたは一部、オフセットアダプターの鎖の１つの全てまたは一部、アダプタ
ー−インデクサーの二本鎖部分の全てまたは一部、またはオフセットアダプター
の二本鎖部分の全てまたは一部に相補的である。増幅プライマーの相補性部分は
、プライマーとプライマー相補性部分との間の特定の安定なハイブリダイゼーシ
ョンを支持するいずれかの長さであることができる。一般に、これは１０〜３５
ヌクレオチド長であるが、好ましくは、１６〜２０ヌクレオチド長である。

【００６５】 増幅プライマーはまた、バイナリー配列タグのいずれかの部分に相補的ではな
いプライマーの５’末端に付加的な配列を含有することが好ましい。該配列は、
増幅プライマーの非相補性部分と称される。増幅プライマーの非相補性部分は、
いずれの長さであってもよいが、一般に、１〜１００ヌクレオチド長である。増
幅プライマーは、完全に一本鎖である必要はないが、５’末端とプライマー中の
内部配列との間に形成されるヘアピン領域を含有することができる。かかる増幅
プライマーは、本明細書において、ヘアピンプライマーと称される。

【００６６】 増幅プライマーはまた、エキソヌクレアーゼ消化に耐性にするために、または
他の目的で、修飾されたヌクレオチドを包含していてもよい。例えば、プライマ
ーは、プライマーの５’末端にてヌクレオチド間に３または４個のモノチオリン
酸結合を有することができる。増幅プライマーは、その後にエンドヌクレアーゼ
によって切断されることのできるデオキシ−ウリジン残基を含有していてもよい
。増幅プライマーはまた、その後の検出工程において標識または質量タグの遊離
を容易にするために、１以上の光切断可能なヌクレオチドを包含することができ
る。光切断可能なヌクレオチドは、ＷＯ００／０４０３６号に記載されている。

【００６７】 増幅プライマーはまた、増幅した配列タグの固定化または捕獲を容易にするた
めの捕獲タグを含有するか、または該捕獲タグと結合することができる。一般に
、捕獲タグは、ビオチンおよびスレプトアビジンのような結合対の一メンバーで
あることができる。捕獲タグは、本明細書の他の箇所においてより詳細に論じら
れている。増幅プライマーはまた、増幅した配列タグの選別または分離を容易に
するための選別タグを含有するか、または該選別タグと結合することができる。
一般に、選別タグは、蛍光部分のような検出可能な標識または磁性ビーズのよう
な操作可能な部分であることができる。選別タグは、本明細書の他の箇所により
詳細に論じられている。増幅プライマーはまた、増幅された配列タグの検出を容
易にするための標識を含有するか、または該標識と結合することができる。増幅
プライマーはまた、基体上へ固定化することができる。

【００６８】 増幅プライマーは、天然ヌクレオチドより構成される必要はない。修飾された
ヌクレオチド、非天然塩基およびヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体
を使用することができる。増幅プライマーが本明細書に記載の一般構造を有し、
開示される方法において必要とされる相互作用および反応が可能であることだけ
が必要とされる。

【００６９】 アンカード（Anchored）プライマー アンカードプライマーは、オリゴｄＴ部分およびアンカー部分を包含するオリ
ゴヌクレオチドである。オリゴｄＴ部分は、プライマーの５’末端の一連のｄＴ
残基である。アンカー部分は、全てがｄＴというわけではないプライマーの３’
末端の１以上のヌクレオチドである。アンカードプライマーは、ｃＤＮＡ合成に
有用である。アンカードプライマーのいくつかの形態は、Liangら、Nucleic Aci
ds Res, 21(14): 3269-75 (1993)およびLiangおよびPardee, Science 257: 967-
971 (1992)に記載されている。アンカードプライマーの好ましい形態は、１６ｄ
Ｔ残基およびＴＮ以外の３’末端の２残基を含む。アンカードプライマーの例は
、配列TTTTTTTTTTTTTTTTGC（配列番号５）、TTTTTTTTTTTTTTTTGT（配列番号６）
およびTTTTTTTTTTTTTTTTCA（配列番号７）である。この型の１２の異なるプライ
マーが存在し、その各々が３’末端ジヌクレオチドのヌクレオチド配列によって
区別されている。アンカードプライマーは、より低い複雑性のｃＤＮＡ調製物を
生成するのに有用である。これは、１のアンカードプライマーの存在下または可
能な配列のサブセットのみを集合的に有する一組のアンカードプライマーの存在
下で、逆転写を行うことによって達成される。例えば、複雑性が減少した６個の
異なるｃＤＮＡ調製物は、各組が、上記のように独特な非−ＴＮジヌクレオチド
で終結している全ての可能なアンカードプライマーのうち２個だけを含んでなる
アンカードプライマーの６個の別個の組を用いることによって生成されうる。

【００７０】 標識 ディテクタープローブに結合したライゲイター-ディテクターの検出および定
量に役立てるために、標識をライゲイター-ディテクター、オフセットアダプタ
ー、ディテクタープローブおよび／またはアダプター-インデキサーに組込み、
結合し、または連結することができる。ライゲイター-ディテクターが標識され
ることが好ましい。標識は、ライゲイター-ディテクターに直接的または間接的
に連結されることができかつ直接的または間接的のいずれかで測定可能な、検出
可能なシグナルを生じる、いずれかの分子である。標識は、成分に共有または非
共有のいずれかで結合またはバインドする場合に、成分と結合する。標識は、成
分に共有結合する場合に、成分と結合する。核酸に組込み、結合させ、または連
結させるための多くの適当な標識が公知である。開示される方法における使用に
適した標識の例には、放射能活性アイソトープ、蛍光分子、燐光分子、生物発光
分子、酵素、抗体およびリガンドが挙げられる。

【００７１】 適当な蛍光標識の例には、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５,６-カルボキシメ
チルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ-２-オキサ-１,３-ジアゾ
ール-４-イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミン、４’-
６-ジアミジノ-２-フェニルイノドール（ＤＡＰＩ）およびシアニン色素Ｃｙ３
、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。好ましい蛍光標識
は、フルオレセイン（５-カルボキシフルオレセイン-Ｎ-ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル）およびローダミン（５,６-テトラメチルローダミン）である。同
時検出のために好ましい蛍光標識はＦＩＴＣおよびシアニン染色Ｃｙ３、Ｃｙ３
．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光標識に関する吸収
および発光最大量は、それぞれ、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３
（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５
（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣ
ｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、こうしてその同時検出が可能となる。
蛍光標識は、Molecular Probes, Eugene, ORおよびResearch Organics, Clevela
nd, Ohioを含む様々な市販源から入手することができる。

【００７２】 標識ヌクレオチドは、合成中にライゲイター-ディテクターに直接組み込まれ
ることができるので、好ましい標識形態である。ＤＮＡまたはＲＮＡに組み込ま
れることができる標識の例には、BrdUrd(Hoy and Schimke, Mutation Research
290: 217-230 (1993))、BrUTP(Wansick et al., J. Cell Biology 122:283-293(
1993))などのヌクレオチドアナログおよび、ビオチン(Langer et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 78:6633(1981))またはディゴキシゲニン等の適当なハプテ
ン（Kerkhof, Anal. Biochem. 205: 359-364(1992))で修飾されたヌクレオチド
が含まれる。適当な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン-イソチオシアネ
ート-ｄＵＴＰ、シアニン-３-ｄＵＴＰおよびシアニン-５-ｄＵＴＰ(Yu et al.,
Nucleic Acids Res., 22: 3226-3232(1994))である。ＤＮＡのために好ましい
ヌクレオチドアナログ検出標識は、BrdUrd（BUDRトリホスフェート、Sigma）で
あり、ＲＮＡのために好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ビオチン-１
６-ウリジン-５’-トリホスフェート（ビオチン-１６-ｄＵＴＰ、Boehringher M
annheim)である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は直接標識のためにｄＵ
ＴＰに結合されることができる。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチンまたはデ
ィゴキシゲニン標識プローブの二次検出のためのアビジンまたは抗ディゴキシゲ
ニン結合物として利用することができる。

【００７３】 核酸に組み込まれる標識、ビオチン等は、当該分野で周知の感光法を用いて、
後で検出することができる。例えば、ビオチンは、ビオチンに結合して、その後
適当な基質（例えば化学ルミネセント基質ＣＳＰＤ：ジソディウム、３-（４-メ
トキシスピロ-[１,２,-ジオキシエタン-３-２’-（５’-クロロ）トリシクロ[３
．３．１．１^３,７]デカン]-４-イル）フェニルホスフェート；Tropix, Inc.)の
化学ルミネセンスにより検出されるストレプトアビジン-アルカリホスフェート
結合物(Tropix. Inc.)を用いて検出することができる。

【００７４】 他の標識には、分子または金属バーコード、質量標識(mass labels)、および
核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、表面強化ラマン分散、表面プラスモン共鳴、蛍光
、燐光、化学ルミネセンス、共鳴ラマン、マイクロ波またはこれらの組み合わせ
により検出可能な標識が含まれる。質量標識は、標識成分、質量分光器で特徴的
な質量サインを有するまたは生じる化合物または部分である。質量標識は、質量
分光器が検出に用いられる場合に有用である。好ましい質量標識は、ペプチド核
酸および炭水化物である。標識の組み合わせを用いることもできる。例えば、例
えば２５６のユニークな標識の組み合わせを有する、色をコード化したマイクロ
ビーズが多くの成分を区別するのに有用である。例えば、２５６の異なるライゲ
イター-ディテクターをユニークに標識および検出することができ、開示される
方法の複合化および自動化が可能となる。

【００７５】 有用な標識は、Haas et al., "Platinum porphyrins as phosphorescent labe
l for time-resolved microscopy." J. Histochem. Cytochem. 45(9): 1279-92(
1997); Karger and Gesteland, "Digital chemiluminescence imaging of DNA s
equencing blots using a charge-coupled device camera," Nucleic Acid Res.
20 (24): 6657-65 (1992); Keyes et al., "Overall and internal dynamics o
f DNA as monitored by five-atom-tethered spin labels," Biophys. J. 72(1)
: 282-90 (1997); Kirschstein et al., "Detection of the DeltaF508 mutatio
n in the CFTR gene by means of time- resolved fluorescence mothods," Bio
electrochem. Bioenerg. 48(2):415-21 (1999); Kricka, "Selected strategies
for improving sensitivity and reliability of immunoassays," Clin. Chem.
40(3): 347-57 (1994); Kricka, "Chemiluminescent and bioluminescent tech
niques," Clin. Chem. 37(9): 1472-81 (1991); Kumke et al., "Temperature a
nd quenching studies of fluorescence polarization detection of DNA hybri
dization," Anal. Chem. 69(3): 500-6(1997); McCreery, "Digoxigenin labeli
ng," Mol. Biotechnol. 7(2): 121-4 (1997); Mansfield et al., "Nucleic aci
d detection using non-radioactive labeling methods," Mol. Cell Probes 9(
3): 145-56 (1995); Nurmi et al., "A new label technology for the detecti
on of specific polymerase chain reaction products in a closed tube," Nuc
leic Acids Res. 28(8): 28(2000): Oetting et al. "Multiplexed short tande
m repeat polymorphisms of the Weber 8A set of markers using tailed prime
rs and infrared fluorescence detection," Electrophoresis 19 (18): 3079-
83 (1998); Roda et al., "Chemiluminescent imaging of enzyme-labeled prob
es using an optical microscope-videocamera luminograph" Anal. Biochem. 2
57 (1): 53-62 (1998); Siddiqi et al., "Evaluation of electrochemilumines
cence- and bioluminescence-based assays for quantitating specific DNA,"
J. Clin. Lab. Anal. 10(6): 423-31(1996); Stevenson et al., "Synchronous
luminescence: a new detection technique for multiple fluorescent probes
uded for DNA sequencing," Biotechniques 16(6): 1104-11 (1994); Vo-Dinh e
t al., "Surface-enhanced Raman gene probes," Anal. Chem. 66(20): 3379-83
(1994); Volkers et al., "Microwave label detection technique for DNA in
situ hybridization," Eur. J. Morphol. 29(1): 59-62 (1991)に記載されてい
る。

【００７６】 分子バーコードの形態である金属バーコードは、３０-３００ｎｍの直径×４
００-４０００ｎｍの多層多金属ロッドである。これらのロッドはアルミナモー
ルドへの電着により構成され、次いでアルミナが除去されて、これらの小さな多
層物体が後に残る。該システムは、７つまでの異なる金属中に、コードされた１
２までのゾーンを有することができ、ここで、金属は異なる反射力を有し、従っ
て金属いかんで光学顕微鏡にて明るくまたは暗く見え、これにより実質上無限の
同定コードが導かれる。金属バーはガラスまたは他の金属でコートすることがで
き、およびプローブは当業者に一般に知られる方法を用いてガラスに付着し、ア
ッセイの読み出しは、標識からの蛍光によりなされ、およびプローブの同一性は
バーコードの明暗パターンから確認される。

【００７７】 標識が発生するシグナルを検出および測定する方法は公知である。例えば放射
能活性アイソトープはシンチレーション測定または直接視覚化により検出するこ
とができ、蛍光分子は蛍光分光光度計で検出することができ、燐光分子は分光光
度計で検出することができ、またはカメラで直接視覚化することができ、酵素は
、酵素により触媒される反応の生成物の測定または視覚化により検出することが
でき、抗体は抗体と結合した二次検出標識を検出することにより検出することが
できる。このような方法を、増幅および検出に関する開示される方法に直接用い
ることができる。本明細書中で使用されるように、検出分子は、増幅された核酸
と相互作用し、１またはそれ以上の検出標識を結合した分子である。検出の他の
形態では、標識は異なる蛍光、燐光または化学ルミネセント発生寿命により一時
に識別することができる。複合(multiplexed)時間依存性検出は、Squire et al.
, J. Microscopy 197 (2): 136-149 (2000)およびWO00/08443に開示されている
。

【００７８】 標識の量または強度に関する定量測定を用いることができる。例えば、定量を
用いて所定の標識、および従って標識された成分が閾値レベルまたは量で存在す
るかどうかを決定することができる。閾値レベルまたは量は、シグナルに関して
必要とされるいずれかのレベルまたは量であり、実行される方法の特定の形態の
必要に応じるように選択することができる。

【００７９】 捕獲タグ 捕獲タグは、捕獲タグを有する化合物または複合体を、それらを有しないもの
から分けるのに用いることができるいずれかの化合物である。好ましくは、捕獲
タグは、リガンド結合分子または抗体などの他の化合物に結合する、またはそれ
らと相互作用する、リガンドまたはハプテンなどの化合物である。ハプテンと抗
体、またはリガンドとリガンド結合分子の間のような、捕獲タグと捕獲成分の間
のそのような相互作用は特定の相互作用であることがまた好ましい。捕獲タグは
好ましくは抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプター-タンパク質、ハプテ
ン、アプタマー、炭水化物、合成ポリアミドまたはオリゴヌクレオチドである。
好ましい結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である。好ましい結合タンパク
質はＤＮＡ結合タンパク質である。好ましいＤＮＡ結合タンパク質はＺｎフィン
ガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチ
ーフである。これらのモチーフは、同じ特定の結合分子に結合されることができ
る。

【００８０】 核酸プローブに関連して記載される好ましい捕獲タグは、Syvnen et al., Nuc
leic Acids Res., 14: 5037 (1986)により開示されている。好ましい捕獲タグに
は、核酸に組み込まれることができるビオチンが含まれる。開示されている方法
では、アダプター-インデキサーまたはオフセットアダプターに組み込まれる捕
獲タグにより、（アダプターを結合した）サンプルフラグメントが基質により捕
獲され、基質に付着し、または基質に結合することが可能となる。そのような捕
獲により、フラグメントの単純化された洗浄および取扱いが可能となり、該方法
の全部または部分の自動化が可能となる。

【００８１】 Ｚｎフィンガー、Ｚｎフィンガーモチーフの特性およびそれらの相互作用はNa
rdelli et al., Zinc finger-DNA recognition: analysis of base specificity
by site-directed mutagenesis. Nucleic Acid Res, 20 (16): 4137-44 (1992)
, Jamieson et al., In vitro selection of zinc fingers with altered DNA-b
inding specificity. Biochemistry, 33 (19): 5689-95 (1994), Chandrasegara
n, S. and J. Smith, Chimeric restriction enzymes: what is next? Biol Che
m, 380(7-8): 841-8 (1999), and Smith et al., A detailed study of the sub
strate specificity of a chimeric restriction enzume. Nucleic Acids Res,
27 (2): 674-81 (1999)に開示されている。

【００８２】 基質上でのサンプルフラグメントの捕獲は、数種の方法で完遂することができ
る。一態様では、捕獲ドックを基質に付着し、または基質に結合する。捕獲ドッ
クは、フラグメント上の捕獲タグに結合することにより、またはフラグメント上
の捕獲タグと相互作用することによりサンプルフラグメントの付着を媒介する化
合物または部分である。基質上に固定された捕獲ドックにより、基質上でのフラ
グメントの捕獲が可能となる。このような捕獲により、後のステップを妨害する
可能性のある反応成分を洗浄除去する簡便な方法が提供される。

【００８３】 開示される方法における使用のための基質には、アッセイの成分を付着し、ま
たは結合することができるいずれかの固体物質が含まれることができる。基質の
例には、制限されるものではないが、アクリルアミド、セルロース、ニトロセル
ロース、ガラス、シリコン、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポ
リプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポ
リシリケート、ポリカルボネート、テフロン、過フッ化炭素、ナイロン、シリコ
ンゴム、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、ポリアクティック酸、ポリオ
ルトエステル、ポリプロピルフメラート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、
およびポリアミノ酸などの物質が含まれる。基質は、薄膜または膜、ビーズ、ボ
トル、プレート、ファイバー、編み込まれたファイバー、成形ポリマー、粒子お
よび微粒子を含むいずれかの有用な形態を有することができる。基質の好ましい
形態は、プレートおよびビーズである。ビーズの最も好ましい形態は、磁石ビー
ズである。

【００８４】 一態様では、捕獲ドックはオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドを
基質に固定させる、および結合させる方法は、十分に確立されている。例えば、
適当な付着方法は、Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11): 5022-
5026 (1994), and Khrapko et al., Mol Biol (Mosk)(USSR) 25: 718-730 (1991
)に開示されている。カゼイン-被覆性スライド上の３’-アミンオリゴヌクレオ
チドの固定のための方法が、Stimpson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92
: 6379-6383 (1995)に開示されている。オリゴヌクレオチドを固体状態の基質に
付着させるのに好ましい方法が、Guo et al., Nucleic Acids Res. 22: 5456-54
65(1994)に開示されている。

【００８５】 他の態様では、捕獲ドックは抗-ハイブリッド抗体である。抗体を基質に固定
させるための方法は十分に確立されている。固定は、例えばアミノ化された表面
、カルボキシル化された表面またはヒドロキシル化された表面への常套の固体化
作用を用いる付着により完遂することができる。付着剤の例には、シアノゲンブ
ロマイド、スクシンイミド、アルデヒド、トシルクロライド、アビジン-ビオチ
ン、光架橋可能剤、エポキシドおよびマレイミドである。好ましい結合剤は、グ
ルタルアルデヒドである。これらおよび他の付着剤ならびに付着におけるその使
用方法は、Protein immobilization: fundamentals and applications, Richard
F. Taylor, ed. (M.Dekker, New York, 1991), Johnstone and Thorpe, Immuno
chemistry In Practice (Blackwell Scientific Publications, Oxford, Englan
d, 1987)209-216および241-242頁、およびImmobilized Affinity Ligands, Crai
g T. Hermanson et al., eds. (Academic Press, New York, 1992)に開示されて
いる。抗体は、基質内に存在する反応性側基に抗体上の遊離アミノ基を化学的に
架橋結合させることにより、基質に付着させることができる。例えば、抗体は、
遊離アミノまたはカルボキシル基を含む基質に、架橋結合剤としてグルタルアル
デヒドまたはカルボジイミドを用いて化学的に架橋結合させることができる。こ
の方法では、遊離抗体を含む水溶液を、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミ
ドの存在下で固体状態の基質とインキュベートする。グルタルアルデヒドとの架
橋結合のために、反応物を０．１Ｍのナトリウムカコジレート等の緩衝溶液中２
体積％のグルタルアルデヒドとｐＨ７．４でインキュベートすることができる。
他の常套の固定化作用は、当業者に公知である。

【００８６】 ソーティングタグ ソーティングタグは、ソーティングタグを有する化合物または複合体を、ソー
ティングタグを有しない化合物または複合体からソートするまたは分けるのに用
いることができるいずれかの化合物である。概して、全捕獲タグはソーティング
タグであり得る。ソーティングタグには、検出されることができ、標識された成
分のソーティングを媒介することができる化合物および部分も含まれる。ソーテ
ィングタグのそのような形態は、一般には捕獲タグではない。例えば、蛍光部分
は、該部分でタグされた成分をタグされていない成分（または異なるタグを有す
るもの）からソーティングすることを可能とすることができる。しかし、そのよ
うな蛍光部分は、相互作用することができ、および捕獲されることができる適当
な捕獲ドックを必ずしも有しない。好ましくは、ソーティングタグは、ソーティ
ングを媒介することができる蛍光標識などの標識である。

【００８７】 増幅ターゲットサークル 増幅ターゲットサークル（ＡＴＣ）は、一般に４０〜１０００ヌクレオチド、
好ましくは約５０〜１５０ヌクレオチド、および最も好ましくは約５０〜１００
ヌクレオチドを含む環状単鎖ＤＮＡ分子である。ＡＴＣの部分が、ＡＴＣをロー
リングサークル増幅（ＲＣＡ）に有用なものとする特異的機能を有する。これら
の部分はプライマー相補部分およびレポータータグ部分と呼ばれる。プライマー
相補部分およびレポータータグ部分は、増幅ターゲットサークルに関して必要と
される要素である。ＡＴＣの特異的部分に相当しないＡＴＣのこれらのセグメン
トは、任意に選択された配列であることができる。ＡＴＣは、自己相補的である
いずれかの配列を有しないことが好ましい。この条件は、ミスマッチまたはギャ
ップを持たない、６ヌクレオチド長より大きな相補領域がない場合に満たされる
と考えられる。

【００８８】 増幅ターゲットサークルは、複製されると、増幅ターゲットサークルに相補的
な配列の複数のリピートを含む長いＤＮＡ分子を生じる。この長いＤＮＡ分子は
、本明細書中、タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ-ＤＮＡ）と呼ばれる。ＴＳ-ＤＮＡは
、プライマー相補部分およびレポータータグ部分に相補的な配列を含む。ＴＳ-
ＤＮＡ中のこれらの配列は、プライマー配列（これは、ローリングサークル複製
プライマーの配列にマッチする）およびレポータータグと呼ばれる。増幅ターゲ
ットサークルおよびその使用は、U.S. Patent No. 5,854,033にさらに開示され
ている。

【００８９】 方法 開示される方法には、以下の基本ステップが含まれる。核酸サンプルを、特定
部位で開裂されたＤＮＡフラグメントのセットを生じる１またはそれ以上の核酸
開裂試薬、好ましくは制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベートする。サン
プルを次いで、そのそれぞれが認識配列から外れた部位で開裂する核酸開裂試薬
のための認識配列を有する１またはそれ以上のオフセットアダプターと混合する
。オフセットアダプターはその後、好ましくはライゲーションによりＤＮＡフラ
グメントに共有結合する。オフセットアダプターは、核酸フラグメントの末端に
適合可能な末端を有するべきである。

【００９０】 核酸サンプルは、様々な配列を有する接着末端を有するＤＮＡフラグメントの
セットが生じるように、１またはそれ以上の核酸開裂試薬、好ましくは制限エン
ドヌクレアーゼと共にインキュベートする。この目的のためには、オフセット開
裂部位を有する単一タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの使用が好ましい。そ
のようなタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼは認識配列とは別の部位で開裂す
るので、これにより様々な配列を有する接着末端を有するＤＮＡフラグメントの
セットが生じる。同様の効果は、認識部位で開裂する制限エンドヌクレアーゼま
たは他の核酸開裂試薬の混合物で核酸サンプルを消化することにより得ることが
できる。

【００９１】 ４つの接着末端に関しては、２５６の可能な配列が存在する。一般式はＮ＝４ ^Ｘ であり、ここで、Ｘは接着末端の長さであり、およびＮは可能な配列の数であ
る。十分複雑な核酸サンプル中、これらの配列は全てＤＮＡフラグメントのセッ
トの末端に表される。核酸サンプルは、さらに（インデックスサンプルと呼ばれ
る）部分、好ましくは接着末端配列が存在するできるだけ多くの部分（即ち、Ｎ
＝４^Ｘ等分）に等分する。多様な制限エンドヌクレアーゼを用いる場合、核酸サ
ンプルを、好ましくは消化の前にインデックスサンプルに分ける。単一の制限エ
ンドヌクレアーゼを用いる場合、核酸アンプルは、好ましくは消化後にインデッ
クスサンプルに分ける。各インデックスサンプルを次いで、そのインデックスサ
ンプル中のＤＮＡフラグメントの可能な接着末端の一つと適合可能な接着末端を
それぞれが有する種々のアダプター-インデキサーと混合する。アダプター-イン
デキサーはこの後、適合可能なＤＮＡフラグメントに適合する。これにより、バ
イナリー配列タグが形成される。バイナリー配列タグは、各末端に結合されたア
ダプターを有する。バイナリー配列タグは次いで、所望により適当な方法、例え
ばＰＣＲを用いて増幅することができる。アダプター中の配列を、この増幅のた
めのプライマー結合部位として用いることができる。

【００９２】 バイナリー配列タグは次いで分析することができる。好ましくは、バイナリー
配列タグをライゲーター-ディテクターとハイブリダイズさせる。各ライゲータ
ー-ディテクターの一部は、アダプター-インデキサーの少なくとも一つの接着末
端を含む配列、およびそれに隣接する配列の全部または一部に適合するか、また
は相補的である。好ましくは、ライゲーター-ディテクターは、制限酵素による
消化により生じる可能な接着末端配列の一つに適合しているか、または相補的で
ある配列を有する。ライゲーター-ディテクターは、認識配列で開裂する制限酵
素が用いられる場合、制限酵素の認識配列中のヌクレオチドに相補的であること
も可能である。ライゲーター-ディテクターは、アダプター-インデキサー中の共
通配列に適合している、または相補的な配列を有することも可能である。この場
合、適当なライゲーターディテクターをインデックスサンプルのそれぞれと共に
用いる。つまり、各インデックスサンプル中で用いるライゲーター-ディテクタ
ーオリゴヌクレオチドは、そのインデックスサンプル中で用いるアダプター-イ
ンデキサー配列中の、接着末端配列を含む配列に適合するか、または相補的であ
る。別に、ライゲーター-ディテクターは、接着末端配列に隣接する、およびフ
ラグメントのアダプター-インデキサーと反対側（すなわち、バイナリー配列タ
グのオフセットアダプター側）の、（アダプター-インデキサーが結合している
）核酸フラグメントの配列に適合している、または相補的な配列を有することが
可能である。

【００９３】 各インデックスサンプルを次いで、ディテクタープローブと混合することがで
き、プローブをライゲーター-ディテクターと結合させる。好ましくは、用いる
プローブのセットには、所定の長さのそれぞれ可能な配列（例えば、それぞれ可
能な６塩基配列）が含まれる。ディテクタープローブは、アレーに固定すること
ができる。 ディテクタープローブおよびライゲーター-ディテクターの末端は、プローブ
がライゲーター-アダプターの末端に隣接してハイブリダイズする場合にのみ結
合する。つまり、オリジナルサンプルから誘導されたバイナリー配列タグ中、ラ
イゲーター-ディテクターの末端がハイブリダイズする領域のすぐ隣にプローブ
に相補的な配列（好ましくは接着末端配列）が存在する場合にのみ、ライゲータ
ー-ディテクターはディテクタープローブに結合する。

【００９４】 バイナリー配列タグにより、ライゲーター-ディテクター（およびアダプター-
インデキサーおよびオフセットアダプター）のディテクタープローブとの連結が
生じる。この連結は、連結した成分の１またはいくつかから生じるシグナルによ
り検出される。開示される方法の好ましい形態では、（複数のセットが用いられ
る場合、）ディテクタープローブのセットにおいて、所定のフラグメントのため
のシグナルは、オリジナル接着末端配列（または認識配列）の配列により決定さ
れる。それぞれの異なる接着末端または認識配列を、個々のインデックスサンプ
ル中で加工し、ディテクタープローブの個々のセットを、各インデックスサンプ
ルまたは誘導インデックスサンプルのために用いる。プローブのセット中、所定
のフラグメントのためのシグナルが連結および検出されるプローブは、接着末端
配列（または認識配列）に隣接するバイナリー配列中の配列により決定される（
これは、ディテクタープローブは、バイナリー配列タグにハイブリダイズしたラ
イゲーター-ディテクターに結合するのに、この配列にハイブリダイズするはず
だからである）。複雑な核酸サンプルは、プローブセット中で独自のシグナルパ
ターンを生じるであろう。このパターンにより、核酸サンプルのユニークなカタ
ロギングと、種々の核酸サンプルから生じるシグナルパターンの高感度かつ強力
な比較が可能となる。

【００９５】 シグナルを連結したディテクタープローブのセットおよび、該セット中の特定
のプローブにより、シグナルを生じるＤＮＡフラグメントの接着末端および、接
着末端に隣接する配列の配列が同定される。４塩基接着末端と６塩基プローブを
用いる場合、これは１０塩基配列である。ディテクタープローブの各セットは異
なる接着末端配列を有する異なるアダプター-インデキサーを用いたので、ディ
テクタープローブのセットにより接着末端配列（４塩基）が同定される。各プロ
ーブは異なる配列を有する異なるプローブを有するので、特定のプローブにより
、接着末端に隣接する配列（６塩基）が同定される。隣接配列に相補的な配列を
有するプローブのみがハイブリダイズし、こうして、シグナルと連結する。

【００９６】 得られる情報は、プローブアレーを用いる場合、類似する。（複数のアレーを
用いる場合）所定のフラグメントに関するシグナルが検出されるアレーは、オリ
ジナル接着末端配列（または認識配列）の配列により決定される。各異なる接着
末端または認識配列を、個々のインデックスサンプル中で加工し、個々のアレー
は各インデックスサンプルまたは誘導インデックスサンプルのために用いる。ア
レー中、所定のフラグメントに関するシグナルが検出される位置は、接着末端配
列（または認識配列）に隣接するバイナリー配列タグ中の配列により決定される
（これは、プローブはバイナリー配列タグにハイブリダイズされたライゲーター
-ディテクターに結合するために、この配列にハイブリダイズするはずだからで
ある）。複雑な核酸サンプルは、アレー上でユニークなシグナルパターンを生じ
るであろう。

【００９７】 配置、ならびにＤＮＡフラグメントがシグナルを生じる配列の配置は、ＤＮＡ
フラグメントの付着端の配列および付着端に隣接する配列を特定する。これは、
４塩基付着端および６塩基プローブが使用される場合、１０塩基配列である。配
列は、各々の配列が異なる付着端配列を有する異なるアダプターインデクサー（
adaptor-indexer）を使用するため、付着端配列（４塩基）と一致する。配列の
配置は、配列の配置が異なる配列の異なるプローブを有するため、付着端に隣接
する配列に一致する。隣接する配列に相補的な配列のプローブだけがハイブリッ
ド形成し、したがって、シグナルに関係するようになる。 開示された方法は、これらの認識された配列から派生した部位で切断する１つ
またはそれ以上の核酸切断剤を使用することが好ましい。開示された方法で使用
される好ましい核酸切断剤は、ＩＩＳ型制限酵素であり、これは、認識部位の外
部の（または、そこから分岐した）位置でＤＮＡを切断し、付着端を産生する酵
素である。ＩＩＳ型制限酵素の例は、ＦｏｋＩ、ＢｂｖＩ、ＨｇａＩ、ＢｓｐＭ
ＩおよびＳｆａＮＩである。 開示された方法で使用される核酸切断剤は、４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇお
よびＴの順列および組み合わせを包含する付着端を産生する。突出塩基が多いほ
ど、末端ヌクレオチド配列の可能な順列および組み合わせが多くなり、そして、
指標が特異的になる可能性がある。例えば、４つの塩基のフラグメント、例えば
５’突出付着端を遊離するＦｏｋＩのような制限酵素は、４^４または２５６可能
な突出テトラヌクレオチド末端を有するフラグメントを産生する。認識配列の長
さ、生じた付着端の長さおよび使用されるプローブの長さは、共に、データビン
（data bins）（これはプローブ独自性である）の数を決定し、バイナリー配列
タグを短くする。付着端および適当な長さのプローブを使用することにより、フ
ラグメントの分類が、分析される試料の複雑さに適合されうる。

【００９８】 アダプターインデクサーの包括的なパネルの使用は、核酸フラグメントの複合
混合物の選択されたサブセットに特に機能的な修飾を付着し、そのように修飾さ
れた分子を同定するための手段を提供する。このような定義された分子のサブセ
ットは、さらに、付加的な切断および指標化またはクローニングのような確立し
た技術、ＰＣＲ適用、またはゲル電気泳動のいずれかにより分別される。群の個
体数は、長さ、配列または制限酵素マップのような特性の識別により分類できる
。アダプターインデクサーの付着末端の配列は、大量の核酸フラグメントの指標
方法を提供する。 異なる配列のディテクタープローブ（detector probes）は、プローブ配列の
異なる位置に固定化できる。このようにして、プローブ配列上のプローブの配列
およびバイナリー配列タグの配列は、配列上でライゲーター−ディテクター（li
gator-detector）が対になっている場所を決定する。したがって、プローブ配列
の異なる位置でのライゲーター−ディテクターの存在、量、存在および量または
欠損が、バイナリー配列タグの痕跡または指紋を提供し、したがって試料の特別
な核酸配列の存在または欠損に基づく核酸試料のシグナルの型を形成する。した
がって、このシグナルの型（これは、ライゲーター−ディテクターの存在、量、
存在および量、または欠損の型である）のカタログは、特別な関係の開示された
方法の具体例である。本明細書に別に記載されるように、プローブの不一致の可
能性は、異なるディテクタープローブに対する特別のフラグメントの引き算ハイ
ブリダイゼーションに基づくより複雑なカタログの作成に利用できる。

【００９９】 カタログは、例えば、プローブ配列上のライゲーター−ディテクターの型、プ
ローブ配列上のライゲーター−ディテクターの存在の型、バイナリー配列タグの
カタログ、試料の核酸フラグメントのカタログ、または試料の核酸配列のカタロ
グとして、作成でき参照できる。カタログの情報は、好ましくは、位置情報の形
態（これは、ディテクター配列の位置）であり、またはより好ましくは、配列の
形態である。カタログの好ましい配列情報は、ライゲーター−ディテクターが対
になったものおよび試料中に存在する核酸フラグメントの配列に対するディテク
タープローブの配列を含む（ライゲーター−ディテクターが対になった場所であ
るディテクター配列中の位置から誘導する）。また、カタログは、開示された方
法で生じる常用から導かれる他の情報を含み、またはそれから構成され、いずれ
かの他の出所から得られたまたは生じた情報と組み合わせることができる。開示
された方法を使用して作られたカタログの情報の性質は、それ自身の公知の生体
情報系および方法を使用する組み合わせおよび／または分析に役立つ。 このような核酸試料のカタログは、試料の類似性および相異性を検出するため
、いずれかの他の試料由来の同様のカタログと比較できる（これは、試料の核酸
中の類似性および相異性を示している）。例えば、第１の核酸の試料のカタログ
は、第１の核酸試料としての同型の器官からの試料、第１の核酸試料としての同
様の型の組織からの試料、第１の核酸試料としての同様の生物からの試料、第１
の核酸試料と同じ源から得られたが第１の核酸試料とは異なる時に得られた試料
、第１の核酸試料のものとは異なる生物からの試料、第１の核酸試料のものとは
異なる組織の型からの試料、第１の核酸試料のものとは異なる生物の株からの試
料、第１の核酸試料のものとは異なる生物の種からの試料、または第１の核酸試
料のものとは異なる生物の型からの試料のカタログと比較できる。

【０１００】 組織の同様の型は、肝臓組織、筋組織または皮膚（同様のまたは異なる生物ま
たは生物の型からのものである）のような同様の型の組織である。同様の生物と
は、同様の個体の動物または細胞を意味する。例えば、患者から取り出された２
つの資料は、同様の生物からのものである。同様の出所は、同様にしかし大局的
に、例えば、同様の生物、同様の生物からの同様の組織、同様のｃＤＮＡ、また
は同様のｃＤＮＡライブラリーからの試料を意味する。比較するための同様の出
所からの試料は、異なる時間に収集できる（したがって、検出される時間を変更
できる可能性がある）。これは、温度または条件の変化の影響を評価する場合に
、特に役立つ。また、異なる処理を経た同様の出所からの試料も、収集すること
ができ、開示された方法を使用して比較できる。異なる生物は、異なる患者、異
なる個体の動物のような異なる個体の生物を意味する。異なる生物は、同様の型
の異なる生物または異なる型の生物を含む。異なる型の生物は、イヌおよびネコ
、ヒトおよびマウスまたはイー・コリおよびサルモネラのような異なる型の生物
を意味する。異なる型の組織は、肝臓および腎臓または皮膚および脳のような異
なる型の組織を意味する。生物の異なる株または種は、これらの用語は当該分野
において理解されているようなこれらの種または株の意味とは異なる生物を意味
する。

【０１０１】 オフセットアダプター（offset adaptor）およびアダプターインデクサーは、
好ましくは、より効果的になるので、二重標準形態の核酸フラグメントに結合す
る。しかし、オフセットアダプターおよびアダプターインデクサーの２つのスト
ランドは、開示された方法に別個に使用できる。例えば、オフセットアダプター
およびアダプターインデクサーの２つのストランドは、核酸フラグメントと別個
に対になることができる。したがって、オフセットアダプターまたはアダプター
インデクサーの核酸フラグメントとの混合およびカップリング工程は、オフセッ
トアダプターまたはアダプターインデクサーの二重ストランドの形態の混合およ
びカップリングおよびオフセットアダプターまたはアダプターインデクサーのス
トランドの混合およびカップリング両方を包含する。 第１のオフセットアダプターストランドが核酸フラグメントにカップリングす
る場合、切断される二重ストランド認識部位は、第２のオフセットアダプタース
トランドと核酸フラグメントとの共有結合以外により形成できる。例えば、第２
のオフセットアダプターストランドは、第１のオフセットアダプターストランド
とハイブリッド形成できるが、核酸フラグメントとはカップリングしない。ハイ
ブリットは、核酸フラグメントの切断により第２の核酸切断剤と共に留まること
のみが必要である。核酸フラグメントのオフセットアダプター領域は、認識部が
機能的である限りは、完全な二重ストランドを必要としない。代わりに、オフセ
ットアダプターの他のストランドは、核酸フラグメントにカップリングした第１
のオフセットアダプターの一重ストランド部分を満たすことにより形成されうる
。 第１のアダプターインデクサーストランドを核酸フラグメントにカップリング
される場合、第２のストランドを使用または加える必要はない。第１のアダプタ
ーインデクサーストランド単独のカップリングは、２次元配列タグの１つのスト
ランドの形成を完全にできる。バイナリー配列タグの操作および分析の多くの形
態を必要とすることが全てである。カップリングした二重ストランドのアダプタ
ーインデクサーは、第２のアダプターインデクサーストランドの核酸フラグメン
トへのカップリング以外により形成できる。例えば、アダプターインデクサーの
他のストランドは、カップリングされた第１の単ストランドの一部と核酸フラグ
メントを満たすことにより形成できる。第２のオフセットアダプターストランド
と同様に、第２のアダプターインデクサーストランドは、核酸フラグメントとの
カップリングなしに、第１のアダプターインデクサーストランドにハイブリッド
形成できる。

【０１０２】 バイナリー配列タグのカップリングカタログを関係する試料から得た場合、相
関対（correlated pairs）のサブセットの存在を同定することが可能である。開
示された方法を使用するバイナリー配列タグは、一般的に、初期切断部が近くに
ＤＮＡ基質の終点を生じる稀な場合を除いて、相関対を生じる。バイナリー配列
タグの相関対は、特別な部での最初の切断から得られる２つのタグである。オフ
セットアダプターは、切断部の各々の末端にカップリングし、最終的には、２つ
の相関２次元配列タグを生じる。 長いｍＲＮＡ分子から生じるｃＤＮＡは、バイナリー配列タグの複雑な型を生
じる可能性がある。一方、より短いｃＤＮＡは、相対的に少数のバイナリー配列
タグを生じる可能性がある。濃度が薄いジデオキシ三リン酸ヌクレオチドは、第
１のストランドｃＤＮＡ合成反応に含まれ、第１のストランド合成は、相対的に
低いより長い分子の発現量でのストランドの分布となる。ｄｄＣＴＰが停止剤と
して使用される特殊な場合、Ｃが存在する全ての位置での鎖の伸長の確率Ｐは： Ｐ＝（[ｄＣＴＰ]）／（[ｄＣＴＰ]＋ｑ[ｄｄＣＴＰ]） [式中、ｑは、ｄＣＴＰに対応するｄＣＴＰの結合効率である] により得られる。ｎ個の位置にＣを含む鎖の伸長確率はＰ^ｎである。

【０１０３】 任意のプライマーでの第２のストランドの発生により、二重ストランドのＤＮ
Ａフラグメントの傾斜分布は維持され、ｃＤＮＡの３’−末端付近の配列が全て
説明される。結果として、また、３’末端付近の配列由来のバイナリー配列は、
５’に近接する配列由来のバイナリー配列タグの関係を完全に説明する。バイナ
リー配列タグがこのようなｃＤＮＡから生じる間、各々の相関対の発現量（これ
はシグナル強度である）がほぼ同じである場所で、相関対の型を確認できる。異
なる相関対が、各々離れた切断部から生じ、これらの発現量により配列できる。
公知の配列のゲノムに関して、ｃＤＮＡと傾斜３’末端発現量を使用するいくら
かの配列から得られるデータは、相関タグの大きなデータセットおよび対応する
強度のシグナル勾配を得ることに使用できる。これらの勾配は、ｃＤＮＡの３’
末端からの各々のバイナリー配列タグの距離でもって調整できる。したがって、
相関タグのシグナル勾配は、未知の配列のゲノムからのｍＲＮＡ転写の分析を含
む他の検定でのキャリブレーターとして役立つ。 これは、ゲノム配列が公知である生物で行われる実験から得られる３つの候補
相関タグの以下のカタログの実施例で説明できる。

【０１０４】

【表１】

【０１０５】 この実施例において、相関タグの一番上の対は、固有のｃＤＮＡの３’末端付
近に位置しており、ｃＤＮＡは、試験試料中の約１５の因子によりアップレギュ
レートされている。タグの他の２つの対は、共通の非常に似た試験物／対照発現
比を有し、ｃＤＮＡの３’末端からの距離が増加する位置で生じている。すなわ
ち、発現の絶対レベルは、バイナリーの対として生じ、ｃＤＮＡの３’末端に関
係するヌクレオチドの距離との相関を示している。対中のバイナリー配列タグの
両方のレベルは、相関する種で共に低下する（したがって、これらの比を同じに
保つ）。 ゲノムが決定されていない生物において同様の検定が行われる場合、ほとんど
同様の発現比を共有し、絶対的な発現量の段階的なレベルを示す相関するバイナ
リー配列のタグは、特別なｃＤＮＡ由来のバイナリー配列タグの可能な種類を推
測することに使用できる。異なるレベルの同じｄｄＮＴＰまたは同じレベルの異
なるｄｄＮＴＰ存在下で生じるｃＤＮＡを使用する繰り返し検定は、同様の遺伝
子由来と思われる推定バイナリー配列タグの識別、順序付けおよび距離の分離を
確認または強化できる追加データを与える。相関するバイナリー配列タグの分析
は、固定プライマーを使用することにより単純化できる。本明細書に別に記載さ
れているように、固定プライマーは、より複雑でない核酸試料の生成に使用でき
る。複雑性の減少は、結果として分析されるタグを少なくする。また、代わりの
スプライシング過程が、このようなスプライシング型を有する遺伝子由来の相関
するバイナリー配列タグについての異なる距離マップを導くことができる点に留
意すべきである。 相関タグが元の核酸分子に隣接する配列に由来しているので、一旦、相関対が
同定されると、それらの配列は、共に置かれた場合、元の核酸フラグメント中の
より長い配列を表す。例えば、開示された方法が、ＭｂｏＩおよびＦｏｋＩを使
用して行われる場合、相関するバイナリータグの情報の内容は２４（４＋６＋４
＋６＋４）ヌクレオチドである。これらのより長い配列は、タグのカタログに加
えることができる。

【０１０６】 ディテクタープローブにカップリングされたライゲーター−ディテクターの存
在、量、存在および量または欠損は、ライゲーター−ディテクターに取りこまれ
、カップリングし、または関係するレベルの検出により達成できる。あるいは、
ライゲーター−ディテクターは、それらの配列の検出に基づいて検出できる。そ
れらの検出は、一般的にライゲーター−ディテクターのカップリングの直接の検
出として見なされる。例えば、標識プローブのハイブリッド形成を含むいずれの
多数の配列種検出技術も、この目的に使用できる。また、ライゲーター−ディテ
クターの存在、量、存在および量または不有在は、ライゲーター−ディテクター
により媒介されるシグナルの発生により検出できる。下記のローリングサークル
型複製（rolling circle replication）用のプライマーとしてのライゲーター−
ディテクターの使用は、この好ましい例である。また、ライゲーター−ディテク
ターの存在、量、存在および量または不有在は、ライゲーター−ディテクターが
カップリングしたディテクタープローブカップリングしたライゲーターディテク
ターに関連したアダプター−インデクサー、カップリングしたライゲーター−デ
ィテクターに関連したオフセットアダプター、あるいは組み合わせを検出するこ
とによっても検出できる。これらの検出は、一般的にライゲーター−ディテクタ
ーのカップリングの間接的な検出として見なされている。 バイナリー配列を検出するシグナルは、本発明方法を実施している間の核酸の
増幅により増加させることができる。バイナリー配列タグが増幅するか、または
ディテクタープローブとカップリングしたライゲーター−ディテクターが増幅す
るか、または他の核酸の増幅を媒介することが好ましい。第一の場合、バイナリ
ー配列タグはいずれかの適当な方法を使用して増幅できる。これらは、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己維持配列複製（３
ＳＲ）、核酸塩基増幅（ＮＡＳＢＡ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、Ｑβレ
プリカーゼ複製およびローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）（Birkenmeyer and
Mushahwar, J. Virological Methods, 35: 117-126 (1991); Landegren, Trends
Genetics, 9: 199-202(1993); Lizardi et al., Nature Genetics 19(3): 225-
232 (1998))を含む。ライゲーター−ディテクター増幅の場合、増幅の好ましい
形態は、ライゲーター−ディテクターにより初回抗原刺激を受けた一重ストラン
ド環状ＤＮＡ分子のローリングサークル型増幅である。このようにＤＮＡサーク
ルの長縦列反復は、ライゲーター−ディテクターを介してディテクター配列に固
定された増幅されたストランドと共に生じる。この増幅技術はＰＣＴ出願ＷＯ９
７／１９１９３に記載されている。ライゲーター−ディテクターがローリングサ
ークル複製プライマーとして使用される場合、複製ＤＮＡが検出できるので（直
接的または組み込まれた標識により）、ライゲーター−ディテクター中に標識を
組み込む必要はない。

【０１０７】 バイナリー配列タグの増幅は、バイナリー配列タグの末端のオフセットアダプ
ターおよびアダプターインデクサーの存在により促進される。例えば、オフセッ
トアダプター配列およびアダプターインデクサー配列は、プライマー配列の増幅
に使用できる。また、オフセットアダプターおよびアダプターインデクサー配列
は、ローリングサークル型複製による配列増幅用の、バイナリー配列タグの環化
に使用できる。ローリングサークル型増幅は、米国特許第５，８５４，０３３号
およびＰＣＴ出願９７／１９１９３に記載されている。 他の具体例として、バイナリー配列タグのストランドは、ライゲーター−ディ
テクターにハイブリッド形成する前に分離できる。このようなストランド分離は
、ライゲーター−ディテクターハイブリッド形成の有効性を改善できる。この分
離はいずれかの適当な技術を使用して達成できる。好ましくは、ストランド分離
は、オフセットアダプターまたはアダプターインデクサーの１つのストランド上
の捕獲タグまたは選別タグを含むことにより達成される。ついで、このような捕
獲タグは、他のストランドが洗い流される間、バイナリー配列タグの１つのスト
ランドの固定化に使用できる。固定化された、あるいは洗い流されたストランド
のいずれもこの方法で繰り越すことができる。選別タグは選別技術によりストラ
ンドの分離を可能にする。 他の具体例として、指標試料中の種々の核酸フラグメントの濃度を標準化する
。好ましくは、バイナリー配列タグの濃度を標準化する。標準化は、使用できる
いずれの増幅工程の前または後のいずれでも実行できる。フラグメント標準化の
好ましい技術は、核酸フラグメントの一方のストランド（好ましくはバイナリー
配列タグ）を固定化すること、核酸フラグメントを変性させること、豊富な核酸
フラグメントに対してはｃ_０ｔ_１／２より長く、まれな核酸フラグメントに対し
てはｃ_０ｔ_１／２より短い時間核酸フラグメントを再生させること、ならびに未
再生核酸フラグメントを収集することを包含する。

【０１０８】 多くの変化したプローブのセットおよび配列は、当業者に公知のものであり、
開示された方法と共に使用できる。Terstappen et al. (Tibbe et al., Optical
tracking and detection of immunomagnetically selected and aligned cells
. Nat Biotechnol, 17(12): 1210-3 (1999); 米国特許第５，９８５，１５３号
（Dolan and Terstappen, Magnetic separation apparatus and methods employ
ing an internal magnetic capture gradient and an external transport forc
e); 米国特許第５，９９３，６６５号（Terstappen and Liberti, Quantitative
cell analysis methods employing magnetic separation）; 米国特許第６，０
１３，１８８（Terstappen and Libeerti, Methods for biological substance
analysis employing internal magnetic gradients separation and an externa
lly-applied transport force)）は、関連細胞の検出用の免疫磁気選択され、蛍
光標識されたプローブを示している。これらの技術において、細胞は免疫特異性
結合プローブを使用して標識化され、得られた標識細胞は、外部から使用される
磁場によりディテクターへの移動を誘導される。試料容器の壁の石版製法は、十
分に決定された空間的パターンに沿ってタグ細胞を配置するという改善を導く。

【０１０９】 Thorp et al. (Napier et al., Probing biomolecule recognition with elec
tron transfer: electrochemical sensors for DNA hybridization. Bioconjug
Chem, 8(6): 906-13 (1997); 米国特許第５，９６８，７４５号(Thorp et al.,
Polymer-electrodes for detecting nucleic acid hybridization and method o
f use thereof); 米国特許第５，８７１，９１８（Throp et al., Electrochemi
cal detection of nucleic acid hybridization); ＷＯ９９／６４８４７（Welc
h, Electochemical probes for detection of molecular interactions and dru
g discovery))は、電気化学検出法を開発させている。これらの方法は、試料増
幅または蛍光標識の使用無しに、直接的に標的核酸を検出する。検出は、電気化
学測定によるＲｕ（ｂｐｙ）_３ ^２＋の酸化還元サイクルに従って達成される。測
定エレメントは、電極に付着した合成的に製造されたオリゴヌクレオチドプロー
ブを有し、電極は、バイオチップ、マイクロタイタープレートおよび手持ちの制
御装置を含む種々の構成で組み立てられる。

【０１１０】 フローサイトメトリーのような計数技術と結合したスペクトル標識化は、ＤＮ
Ａ試料の分析に使用される（米国特許第５，７３６，３３０号（Fulton, Method
and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences);
ＷＯ９９／１９５１５（Phipps et al., Precision fluorescently dyed partic
les and methods of making and using same); ＷＯ９９／３７８１４（Chandle
r and Chandler, Microparticles with multiple fluorecent signals))。この
ような分析において、ミクロン規模のビーズは、これらの表面に付着したプロー
ブによりカラー・コード化され、標的は分析的な蛍光タグで標識化され、ビーズ
カラーおよび分析カラーを含む同時事象が計数される。この方法において、多く
のカラーのプローブ配列は、非常に速くかつ簡単に読み取られる。 他のミクロスフェアを利用する技術において、Walt et al. (Walt, Techview:
molecular biology. Bead-based fiber-optic arrays. Sicience, 287 (5452):
451-2(2000); ＷＯ９８／５０７８２（Ferguson et al., Fiber optic biosens
or for selectively detecting oligonucleotide species in a mixed fluid sa
mple); 米国特許第６，０２３，５４０（Walt and Michael, Fiber optic senso
r with encoded microspheres); Micael et al., Randomly ordered addressabl
e high-density optical sensor arrays. Anal Chem, 70(7): 1242-8 (1998))は
、プローブがミクロスフェアに付着され、その後、ミクロスフェアが、光学繊維
配列の遠位末端に乱雑な分布様式で自己集合する系を開発している。各々のミク
ロスフェアの「光学式バーコード」特性は、付着プローブの独自性を提供し、標
識化された標的のシグナルは、標的の濃度を表す。

【０１１１】 開示された方法を用いて同定された配列をし使用できる方法の１つは、配列タ
グに基づいてオリゴマーの配置を創り出すことである。したがって、新規のオリ
ゴマーは、適当なカップリング化学成分およびスペーサーと共に、合成され、そ
れらは配列タグに対応したものである。これらのタグは配置され、適当に微小配
置スライド上にカップリングされ、発現する配列タグプローブと共に、関係する
生物の新規の微小配置を生じる。このような配置（array）は、開示された方法
を含み、オリゴヌクレオチドの配列を含む種々の方法のいずれかに使用できる。
特に、配置は、元の試料といずれかの先の物質との間の類似性および相異性の検
出に使用できる。 ゲノム配列情報が入手できる場合において、配列が特徴付けられた遺伝子の５
’位に位置する場合、バイナリー配列タグ由来の配列を使用するＢＬＡＳＴ検索
は、プロモーターの存在を表すことができる。予想メチレン化部のインシリコ分
析（in silico analysis）は、このような条件を容易にするだろう。ゲノム配列
が入手できない場合、配列タグは、関係する未確定のゲノムＤＮＡ領域の特徴付
けを容易にするため、出発点として役立つことができる。

【０１１２】 バイナリー配列タグの修飾支援分析（Modification Assisted Analysis of Bi
nary Sequence Tags）（ＭＡＡＢＳＴ） バイナリー配列タグの修飾支援分析（ＭＡＡＢＳＴ）は、核酸分子における修
飾の存在または不在に基づく特異な切断を検出することにより核酸分子における
配列の修飾を評価するＢＥＳＴの一形態である。例えば、核酸分子においてメチ
ル化される部位は、この部位でのメチル化に感受性がある制限酵素によっては切
断されないであろう。メチル化に感受性がない制限酵素は、この部位で切断する
であろうし、かくして、異なるパターンの配列タグを産生するであろう。核酸の
種々の試料についての結果を比較して、種々の試料における修飾レベルまたはパ
ターンの差異を確立することができる。本明細書で用いる場合、認識部位におけ
る修飾に感受性がある核酸切断試薬または制限酵素は、該部位が修飾されていな
い場合にのみ切断するか、または、該部位が修飾されている場合にのみ切断する
核酸切断試薬または制限酵素である（すなわち、核酸切断試薬または制限酵素は
、切断のために特定の修飾状態を必要とする）。認識部位における修飾に感受性
がない核酸切断試薬または制限酵素は、該部位が修飾されているかいないかにか
かわらず切断する核酸切断試薬または制限酵素である。

【０１１３】 ＭＡＡＢＳＴは、核酸分子における修飾の状態、レベルおよび条件を評価する
のに有用である。生物学的効果および意義を有する多くの核酸修飾が知られてい
る。メチル化は、例えば、動物および植物における遺伝子発現を調節するのに万
能なメカニズムである（Bird and Wolffe, Methylation-induced repression-be
lts, braces, and chromatin, Cell 99:451-454 (1999)；Finnegan et al., DNA
Methylation in Plants, Annual Rev Physiol 49:223-247 (1998)；Bird, DNA
Methylation de Novo, Science 286:2287-2288 (1999)）。メチル化の生理学的
結果を理解することは、多くの分野において有用性を有する。プロモーター領域
のメチル化がインビトロおよびインビボの両方において転写を抑制することがで
きることは、十分に立証されている（Baylin et al., Alterations in DNA meth
ylation: a fundamental aspect of neoplasia, Adv Cancer Res 72:141-96 (19
98)）。例えば、新生物および腫瘍抑制に関与するいくつかの遺伝子のプロモー
ターは、過剰メチル化されやすい（Melki et al., Concurrent DNA hypermethyl
ation of multiple genes in acute myeloid leukemia, Cancer Res 59(15):373
0-40 (1999)）。メチル化は、また、植物の成長および開花において重要な機能
を果たす。

【０１１４】 遺伝子機能を研究するためのディファレンシャルメチル化の使用は、クローン
化し、配列決定し、目的の領域のメチル化感受性を変化させようとする実質的な
試みの後にのみ得られるメチル化されやすいＤＮＡ配列の前知識を伝統的に必要
とした。ＭＡＡＢＳＴは、特異にメチル化された配列の同定を、その好ましい形
態で、高処理マイクロアレイ技術の能力とディファレンシャルディスプレイの感
度および定量化についてのコンピューター分析とを組み合わせることによって迅
速に処理する。

【０１１５】 ＭＡＡＢＳＴは、ゲノムスケールでプロモーターを同定するための他の現行法
に比べていくつかの利点を有する。高処理法においてプロモーターおよび他の調
節要素を同定する現行法としては、転写因子結合部位についてのヌクレオチド配
列のコンピューター分析、β−ラクタマーゼ挿入（Whitney et al., A genome-w
ide functional assay of signal transduction in living mammalian cells, N
at Biotechnol 16(13):1329-33 (1998)）、ＣＯＢＲＡ（Xiong and Laird, COBR
A: a sensitive and quantitative DNA methylation assay, Nuc Acid Res 25(1
2):2532-2534 (1997)）、および制限ランドマークゲノムスキャニング（Costell
et al., aberrant CpG-island methylation has non-random and tumour-type-
specific patterns, Nature Genetics 25:132-138 (2000)）が挙げられる。

【０１１６】 他の形態の修飾は、特定の試薬に起因するある種のタイプのＤＮＡ損傷を示し
ている。これらの形態としては、アルキル化、二量体化、誘導体化、脱プリン、
またはＡＤＰ−リボシル化が挙げられる。修飾およびそれらの源の例は、Lodovi
ci et al., Levels of 8-hydroxydeoxyguanosine as a marker of DNA damage i
n human leukocytes, Free Radic Biol Med 28(1):13-7 (2000)；Maehira et al
., Alterations of protein kinase C, 8-hydroxydeoxyguanosine, and K-ras o
ncogene in rat lungs exposed to passive smoking, Clin Chim Acta 289(1-2)
:133-44 (1999)；Gamboa Da Costa et al., Characterization of the Major DN
A Adduct Formed by alpha-Hydroxy-N-desmethyltamoxifen in Vitro and in Vi
vo, Chem Res Toxicol 13(3):200-207 (2000)；Phillips et al., Methods of D
NA adduct determination and their application to testing compounds for g
enotoxicity, Environ Mol Mutagen 35(3):222-233 (2000)；Airoldi et al., C
arcinogen-DNA adducts as tools in risk assessment, Adv Exp Med Biol 472:
231-40 (1999)；Purewal et al., Association between acetylator genotype a
nd 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP) DNA adduct for
mation in clolon and prostate of inbred Fischer 344 および Wistar Kyoto
rats, Cancer Lett 149(1-2):53-60 (2000) に開示されている。

【０１１７】 ＭＡＡＢＳＴは、ＢＥＳＴと同一の基本的な工程を用いており、核酸切断試薬
での切断およびオフセットアダプターと核酸断片とのカップリングを包含する。
相違点は、ＭＡＡＢＳＴが認識部位の修飾に感受性がある核酸切断試薬を用いる
ことである。かくして、核酸切断試薬は、修飾されている部位で切断されないか
、または、修飾されている部位のみで切断される。認識部位に修飾を有する核酸
断片において、該断片は、核酸切断試薬によって切断されず、オフセットアダプ
ターは、末端に付加されない。

【０１１８】 未切断核酸断片は、多くの手段で当該方法から淘汰することができる。例えば
、核酸断片がオフセットアダプターの付加の後に増幅されるべきである場合、増
幅は、末端でのオフセットアダプターの存在に依存して行われ得る。これは、例
えば、オフセットアダプターにおける配列と相補的なＰＣＲプライマーを用いる
ことにより行うことができる。未切断核酸フラグメトンは、また、オフセットア
ダプターに捕獲タグ、選別タグ、または標識を含ませることによって淘汰できる
。捕獲または選別タグの存在または不在に基づいて断片を捕獲または選別するこ
とにより、オフセットアダプターを含有するこれらの断片だけが該方法において
先に進められる。

【０１１９】 標識がオフセットアダプターと結合している場合、全ての断片が該方法におい
て先に進められ得るが、オフセットアダプター（かくして、標識も）を有するも
のだけが検出可能なシグナルを生じるであろう（このシナリオにおいて、オフセ
ットアダプター上の標識は、ディテクタープローブおよび／またはライゲーター
−ディテクターと関連して検出されるべきである）。オフセットアダプターにお
けるこのような標識の使用により、また、切断および未切断断片（すなわち、核
酸切断試薬によって切断されているかまたは切断されていない断片）を識別する
ことができる。これは、ディテクタープローブ、ライゲーター−ディテクター、
またはアダプター−インデクサー上の標識、捕獲タグ、または選別タグによりラ
イゲーター−ディテクターとディテクタープローブとのカップリングを検出する
ことによって、さらにまた、その標識により断片上のオフセットアダプターの存
在、量、存在と量、または不在を検出することによって行うことができる。

【０１２０】 ＭＡＡＢＳＴは、また、一のタイプの細胞または生物が別のタイプの細胞また
は生物における遺伝子発現または他の生物学的経路にどのような影響を及ぼすか
を判定するために用いることもできる。例えば、仮に、マウスが遺伝子ターゲテ
ィングにより遺伝子改変されて、特定のメチルトランスフェラーゼ遺伝子を不活
性化していると仮定する（マウスについていくつか知られているが、説明のため
に１つだけを仮定する）。遺伝子改変されてメチルトランスフェラーゼメカニズ
ムを不活性化されたマウスから目的細胞（例えば、Ｂ細胞）を採取し、正常なマ
ウスから得られた他の目的細胞（例えば、Ｔ細胞）と混合する。Ｂ細胞およびＴ
細胞を一緒に混合する。次いで、混合されたＢ細胞と混合された非Ｂ細胞との間
のＴ細胞メチル化パターンを比較することができる。Ｂ細胞は、不活性化メチル
トランスフェラーゼを含むので、観察されたメチル化の変化は、Ｔ細胞内で生じ
たと考えることができる。

【０１２１】 標準的なディファレンシャル遺伝子発現技法を用いると、Ｂ細胞に源を発する
転写体とＴ細胞に源を発する転写体とを区別することは、多くの遺伝子について
非常に困難であり、別のものについては不可能である（２つの細胞型はいずれも
多くの遺伝子の発現を共有するからである）。しかしながら、前の遺伝子改変に
より、すなわち、メチルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失することにより、ＭＡ
ＡＢＳＴにより、混合した細胞群における遺伝子発現を試験することができる。
ＭＡＡＢＳＴの例を例示７に記載する。

【０１２２】 質量分光検出 質量分光測定法は、ＢＥＳＴにおける検出に用いることができる。これらの技
法は、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型（matrix-assisted
laser desorption/ionization time-of-flight）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分
光法を包含する。かかる技法により、自動化が可能になり、複数の試料および検
定法の迅速な処理が可能になる。

【０１２３】 質量分光測定検出は、分子が小さいほど良好に行われるので、質量分光測定検
出前にまたはその一部としていくつかのＢＥＳＴ成分を切断するのが好ましい。
質量分光測定による検出の前に検出しようとするオリゴヌクレオチド分子をより
短く切断する多くの方法が考えられる。ＢＥＳＴプロトコールは、標準のように
進行し、好ましい実施態様においては、ヘキサマープローブが結合した表面（su
rface）は、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分光計（
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）の源領域（source region）と適合する。この特定
の場合にＢＥＳＴプロセスの結果として生じる断片は、おおよそ以下のように考
えられる：

【０１２４】

【化１】

【０１２５】 ここで、 Ｈは、ヘキサマープローブであり； 下鎖において３'−ＣＴＡＧ−５'は、最初のＩＩ型制限部位（ＭｂｏＩ）を記
し； 下鎖において３'−ＣＣＴＡＣ−５'は、ＩＩＳ型制限部位（ＦｏｋＩ）を示し
； Ｙは、オフセットアダプターの残部であり； Ｉは、インデキシング工程からの４量体であり； Ｚは、アダプター−インデクサーの残部であり； −は、リンカー、万能塩基、模倣体または他のアナログであり； Ｘは、相補塩基であり、密接な関係はなく； Ｌは、標識である。 下鎖は、配列番号８である。

【０１２６】 約５０塩基を超えるＤＮＡ試料については、質量分光測定技法の遂行は、減少
する。化学的試薬、生物学的試薬、物理的（熱的）試薬、および他の切断試薬を
用いて、質量分光計において分析されるべきである、より小さな、より最適な、
微細断片（sub-fragment）を生じさせることができる。断片化の程度は、親イオ
ンを見、次いで、断片化を増加させて分解断片を、かくして、配列を見ることが
できることができるＱ−ＴＯＦシステム（アメリカ合衆国、０１９１５−６１０
１マサチューセッツ州、ベヴァリー、カミングズ・センター１００、スゥィート
４０７エヌにアメリカ合衆国でのヘッドオフィスがあるマイクロマス（Micromas
s））のような装置で多少調整できる；かかる技法は、十分な大きさの微細断片
を判定し、これらの公知の手段を介して微細断片の配列（基本的なＢＥＳＴ法に
ついてよりも長い配列情報である）を推論することが考えられる。検出可能な断
片は、スキームに依存して、上鎖であっても、下鎖であっても、または両方の鎖
であってもよい。標識は、切断可能な質量タグであってもよく、または、該鎖は
、標識化を必要としない。

【０１２７】 この目的のために有用な切断試薬がいくつかある。例えば、一の技法は、Ｆｏ
ｋＩを用いて任意の特異的な認識部位から固定の距離で切断する Szybalski の
技法（本明細書の別の箇所に記載されている）である。この技法は、ＩＩＳ型ま
たはＩＩＩ型の他の制限酵素に及ぶことができる。この技法は、また、２回用い
ることができ、１回は、表面に近い末端から取り除き、１回は、表面から遠い末
端から取り除く；好ましくは、ＩＩ型酵素を用いて表面から最も遠い末端を切断
する。

【０１２８】 ＭｃｒＢＣ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）
）を用いて、Ｇ／Ａに隣接したメチルシトシン部位で切断することができる。親
および断片化セットを得るのに有利に用いることができる切断部位（約３０塩基
）は、十分に定義されていない。オリゴヌクレオチドに結合した金属含有ポルフ
ィリンが光に曝露した場合にポルフィリンに非常に近いＤＮＡを切断することが
証明された（Texaphyrins、米国特許5607924）。変性させることができ、ハイブ
リダイゼーションテキサフィリン（texaphyrin）および光を用いて残りの鎖を切
断することができる。他の切断技法には、Dervan の方法がある（Cartwright et
al., Cleavage of chromatin with methidiumpropyl-EDTA. iron(II). Proc Na
tl Acad Sci USA, 80(11):3213-7 (1983)；Schultz and Dervan, Sequence-spec
ific double-strand cleavage of DNA by penta-N-methylpyrrolecarboxamide-E
DTA X Fe(II). Proc Natl Acad Sci USA, 80(22):6834-7 (1983)）。光切断可能
な連鎖を用いる技法は、Olejnik et al. によって開示されている（Olejnik et
al., Photocleavable peptide-DNA conjugates: synthesis and applications t
o DNA analysis using MALDI-MS. Nucleic Acids Res, 27(23):4626-31 (1999)
；Olejnik et al., Photocleavable affinity tags for isolation and detecti
on of biomolecules. Methods Enzymol, 291:135-54 (1998)；Olejnik et al.,
Photocleavable aminotag phosphoramidites for 5'-termini DNA/RNA labeling
. Nucleic Acids Res, 26(15):3572-6 (1998)；Olejnik et al., Photocleavabl
e biotin derivatives: a versatile approach for the isolation of biomolec
ules. Proc Natl Acad Sci USA, 92(16):7590-4 (1995)）。これらの連鎖は、光
を用いて切断して表面から断片を遊離することができ、かくして、より穏やかな
脱着をもたらすことができる。WO 0004036 には、光切断可能なヌクレオチドお
よびその使用法が開示されている。

【０１２９】 一の実施態様において、異なる配列および分子量のペプチド核酸（ＰＮＡ）分
子（Hanvey et al., Science 258:1481-1485 (1992)）のような質量標識を、ラ
イゲーター−ディテクターまたはアダプター−インデクサーにおける配列に特異
的に結合する標識として用いることができる。該試料のレーザー脱着を用いて、
分光計中に放出されて質量により分析されるＰＮＡ標識のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質
量スペクトルが得られる。各ＰＮＡ標識の強度は、種々の成分（例えば、ライゲ
ーター−ディテクターまたはアダプター−インデクサー）の相対量を示す。すな
わち、ＰＮＡスペクトルにより、アレイにおける特異的な位置で比較的豊富な標
識成分の直接指標であるスカラー値が得られる。

【０１３０】 例えば、衝突誘発性解離（ＣＩＤ）によって得られる断片自体の質量および／
またはその断片化パターンを用いてヘキサマーが正確にハイブリダイズされたこ
とを立証することができ、さらなるコントロール／テスター比情報が得られる。
このＣＩＤオプションについての好ましい装置は、第一の四極子を用いて目的の
質量を選択し、衝突セルを用いて断片スペクトルを得るという Loboda et al.（
Loboda et al., Design and Performance of a MALDI-QqTOF Mass Spectrometer
. in 47th ASMS Conference. 1999. Dallas, Texas.）により開示されたＭＡＬ
ＤＩ−ｑＱＴＯＦのクラスのタンデム質量分光計を使用する。インデキシングに
よるｃＤＮＡ群の細分化（Unrau and Deugau, Gene 145(2):163-9 (1994)）がア
ダプターのミスマッチライゲーションによる多重複サブセットを発生しやすいこ
とが Shaw-Smith et al.（Biotechniques, 28:958-964 (2000)）によって報告さ
れた。大部分の場合、ミスマッチライゲーションは、１個の誤対合塩基を含む。
ライゲーション条件は、高温での熱安定性リガーゼを用いて修飾されてミスマッ
チライゲーションの頻度を減少させることができるが、しばしば、ミスマッチを
減少させる条件は、ＡＴリッチオーバーハングについてのライゲーション効率を
も低下させる。開示された方法の一の形態は、「多重複サブセットの捕獲」とし
て記載できるインデキシングの代替法を提供する。制限酵素断片とアダプターと
のライゲーションの条件は、１つの塩基ミスマッチを有するいつくかの配列の同
時のライゲーションを用いて、完全にマッチした配列の高収率ライゲーションの
ために修飾される。この高収率法により、特有のサブセットの代わりに多重複サ
ブセットが得られる。次いで、各多重複サブセットに存在するｃＤＮＡ断片を、
例えば、以下のとおり、さらに分析することができる：

【０１３１】 １． 一対のアダプター−インデクサー特異的オリゴヌクレオチド（その一方
は、ビオチンを含む）を用いて、ＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を増幅する。テスタ
ーおよびコントロール試料を含む検定法について、コントロールおよびテスター
タグの質量を質量分光計によって容易に分析可能にするために、これらの試料の
１つを増幅するのに用いるプライマーの１つは、好ましくは、１またはそれ以上
の５'末端塩基を含有する。

【０１３２】 ２． 一本鎖アンプリコンを、ストレプトアビジンビーズに結合させ、次いで
、未結合鎖を遊離することによって単離する。

【０１３３】 ３． 一本鎖ｃＤＮＡタグをライゲーター−ディテクターオリゴヌクレオチド
とハイブリダイズし、次いで、全てのヘキサマーを含むマイクロアレイと接触さ
せる。ライゲーションは、ヘキサマー塩基対形成の最大特異性が得られる条件下
でアレイ表面と接触している溶液中で行われる。２５６個の起こり得るアダプタ
ー−インデクサーの各々について異なるヘキサマーマイクロアレイを用いる。

【０１３４】 ４． マイクロアレイを洗浄して弱く結合しているｃＤＮＡタグを除去する。

【０１３５】 ５． マイクロアレイスポットを、質量分光測定法によるＤＮＡの分析を行う
のに適当なマトリックスで覆う。

【０１３６】 ６． 単一質量−電荷の伝達のために第一の四極子フィルターを調整すること
によって、ＭＡＬＤＩ源、タンデム四極子、四極子、飛行時間型質量分光計を用
いて質量分析を行う。マイクロアレイは、全ての起こり得るヘキサマーからなっ
ている；特有のアドレスで結合した正確にハイブリダイズされたｃＤＮＡタグは
、単一の十分に定義された質量を有する。さらに、２５６個の起こり得るアダプ
ターの各々について、該アダプター結合末端の配列は知られており、単一の質量
に対応する。したがって、４０９６個のアレイアドレスの各々および２５６個の
マイクロアレイの各々にどの正確なｃＤＮＡ質量タグウインドを用いることがで
きるかを予め決定することができる。例えば、１個のアダプター配列を用いて、
４０９６個のヘキサマーのマイクロアレイ上の特異的なアドレスに結合する特有
のｃＤＮＡタグについて合計８４個の起こり得る様々な質量組合せが存在する。
一般式は、この形態の二項係数である： 組合せ＝[(ｎ＋ｒ−１)！]／[ｎ！(ｒ−１)！] この式において、「ｎ」は、マイクロアレイにおけるディテクター配列中の塩基
の数であり、「ｒ」は、塩基の質量についての起こり得る数値である。ｎ＝６お
よびｒ＝４について解くと、ｒ−１＝３であり；[(６＋３)＊(６＋２)＊(６＋１
)]／３！＝９＊８＊７／６＝８４である。

【０１３７】 質量分光計において測定したシグナルは、特異的なアレイアドレスが調整され
た質量を有するＤＮＡイオンの数に対応する。不正確なアドレスに存在するほと
んどのＤＮＡ分子は、ヘキサマー配列またはアダプター−インデクサー配列のい
ずれかにおいて、単一の塩基ミスマッチを有する；かかる分子は全て、異なる質
量を有しており、検出されない。２つのミスマッチを有する分子は、お互いに厳
密に代償し合う２つのミチマッチ塩基を有する分子という特別の場合を除いて、
異なる質量を有すると考えられる。かかる分子は、タンデム質量分光計の衝突セ
ル中での断片化パターンを収集することにより、断片化におけるそれらの不正確
な断片質量について評価され得る（下記を参照のこと）。

【０１３８】 質量分光分析におけるさらなる任意の工程は、次なる衝突セル（イオンガイド
として作用する四極子および比較的高圧の化学的に不活性なガスの領域）におけ
る断片化、次いで、ＤＮＡ断片のＴＯＦ分析である。断片化およびＴＯＦ分析は
、正確なアダプター−インデクサー・ライゲーションおよび正確なヘキサマーラ
イゲーションから得られる断片を、アダプター−インデクサー・ライゲーション
およびヘキサマーライゲーション工程で可能な相互代償性ミスマッチから得られ
る、質量は等しいが異なる配列である他の断片と分離する。

【０１３９】 さらに、ＭＡＬＤＩ源においてレーザー照射によりバイナリー配列タグから短
くて十分に定義された断片を生じる光切断可能なヌクレオチドまたはリンカーを
用いることができる。光切断可能なリンカーは、質量標識の結合において用いる
ことができる（この場合、試料がＭＡＬＤＩのＵＶ源に付されるとリンケージが
切断されて質量タグを遊離する）。

【０１４０】 さらにまた、合成アダプター（グレン・リサーチ（Glenn Research）から入手
可能なホスホラミダイト化合物）においてチミンではなくてウラシルを使用する
ことは、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＵＤＧ（ニュー・イングランド・バ
イオラブズ（New England Biolabs）から入手可能）と組み合わせて用いて、Ｕ
ＤＧでの処理後に特定の断片を遊離するように設計することができる特異的な鎖
切断を導入することができる。かかる鎖切断は、センスおよびアンチセンス鎖に
おいてオフセットされるように遺伝子工学処理されて、複合体は、ＭＡＬＤＩ源
のレーザーに付されるまで室温付近で実質的に無処置のままである。

【０１４１】 確率検出 ハイブリダイゼーションによる配列決定は、ミスマッチエラーを生じることが
知られている（Lipshutz, Likelihood DNA sequencing by hybridization. J. B
iomol Struct Dyn, 11(3):637-53 (1993)）。現在の配列情報についてのデータ
ベース調査は、規則的発現ベースであり、データベースエントリーと調査配列と
の間でマッチした「文字」が必要である。ＢＥＳＴは、規則的発現マッチング（
塩基当たりのマッチ対非マッチ）の代わりに確率関数を用いてバイナリー配列タ
グの同一性の付与における信頼性を決定することができる。

【０１４２】 開示する方法は、ライゲーションを用いて該ライゲーション部位付近でのハイ
ブリダイゼーションの特異性を改良する。この改良にもかかわらず、特に、ライ
ゲーション部位から取り出された多くのヌクレオチドについては、ミスマッチの
有限確率はそのままであろう。エラー率は、少なくとも２つのミスマッチ特性に
依存する：塩基対形成（すなわち、ＡとＧ）およびライゲーション部位からの距
離。

【０１４３】 信頼値を決定するためのプロセスの例示として、ライゲーション部位から最も
遠いヘキサマープローブにおける２つの塩基を考える。該塩基のナンバリングは
、如何に示すとおりである。

【０１４４】

【化２】

【０１４５】 ここで、この目的の場合、構造は、表面（sueface）---リンカー（linker）−ス
ペーサー（spacer）------ＡＴＸＸＸＸであり、当面の例示のためにＡＴ（位置
１および位置２）塩基に集中する。

【０１４６】 示された配列の起こり得るセットを評価するために、Dayhoff（Dayhoff et al
., A model of evolutionary changes in proteins, in Atlas of Protein Sequ
ence and Structure, Dayhoff, ed. 1978, National Biomedical Research Foun
dation: Washington DC）および Venezia（Venezia and O'Hara, Rapid motif c
ompliance scoring with match weight sets. Comput Appl Biosci, 9(1):65-9
(1993)）に従って、重量マトリックスを用いる。ＢＥＳＴシステムについてのこ
れらのマトリックスにおける係数は、実験的に決定されるであろう。位置１およ
び位置２を表すマトリックスの例（例示的係数を含む）は、以下のとおりである
（ここで、行は、上鎖ヌクレオチドを表し、列は、下鎖ヌクレオチドを表す）。
実際の係数は、経験的に決定することができる。

【０１４７】

【化３】

【０１４８】 ヘキサマーＡＴＸＸＸＸについての完全マッチ検出の場合について、スコアは
、太字で如何に示されているマトリックスの係数の積であることが決定される；
０.９０×０.９７＝０.８７。

【０１４９】

【化４】

【０１５０】 一本鎖における単一塩基ミスマッチが、例えば、ヘキサマー側の位置１におけ
るＡ→Ｇを生じる場合、スコアは、同様に、０.０５×０.９７＝０.０５である
と決定される。

【０１５１】

【化５】

【０１５２】 この方法は、同様に任意の数の塩基に及ぶことができる。所定の数のヌクレオ
チドについて、全ての起こり得るミスマッチおよび順序付けられたランクについ
てのスコアをコンピュータ処理して、最も起こり得る同一性を明らかにすること
ができる。カットオフスコアを用いて、マトリックス推定から起こり得る同一性
の数を減ずることができる。例えば、上記マトリックスを用いて、０.５０以上
の閾値スコアを有する配列から、プローブとマッチする配列である唯一の配列を
得ることができる。

【０１５３】 この配列を推定する方法および該プローブについてのミスマッチ事象の母集団
からのそれらの各確率スコアは、１からｎまでに及ぶことができる（ここで、ｎ
は、ハイブリダイゼーションに利用可能な遊離塩基の数である）。

【０１５４】 完全には特徴付けられていない（すなわち、少なくとも、配列決定およびコン
センサス配列構築されていない）生物において、塩基のランダム分布が仮定され
た場合、唯一性についての信頼値をコンピュータ処理することができる。例えば
、推定した１０^８塩基ゲノムを有する生物において１５塩基長の候補がある場合
、この１５塩基断片は、１０^８／４^１５＝０.１が１よりも非常に小さいので、
ただ１つしかないと予想される。特定の１５塩基断片について２回の出現が予想
される場合には、該ゲノムは１０倍大きくなければならない。

【０１５５】 公知のゲノムにおける分布は、完全にはランダムではないことが知られており
、情報を集めて、ランダム分布の初期の仮定を改良することができる。この新し
い情報を用いて信頼値を付与して用いることができる。

【０１５６】 例えば、メンバーがＡＢＣＤ１、ＡＢＣＤ２およびＡＢＣＤ３である架空の遺
伝子ファミリーＡＢＣＤを考える。熱ショックのようなある種の事象に従って３
つのメンバーが発見され、かくして、それらは、推定上、遺伝子の熱ショックフ
ァミリーに属すると特定され、偶然に、この遺伝子ファミリーの間で保存された
配列の有意な鎖を有する。生物が植物であると考える（ここで、ＡＢＣＤ１は、
植物の根から単離され、ＡＢＣＤ２は、植物の葉から単離され、ＡＢＣＤ３は、
植物の花から単離された）。推定マトリックスは、以下のように考えられる。

【０１５７】

【化６】 ここで、行１は、根を表し、行２は、葉を表し、行３は、花を表す。

【０１５８】 配列において高い信頼性があるが、該配列がファミリーの３つの公知のメンバ
ーのうちの１つに属している１つの実験において、試料の供給源（すなわち、根
、葉または花）から、遺伝子の同一性を推定することができる。完全に数学的に
制限された処理について、該マトリックスは、該ファミリーの全ての要素を含有
しなければならず、ここでは、このファミリーにはなおも見出されるべき遺伝子
があり、列および行は、加算しても１にならない；他のメンバーは全て、合計０
.０５が付与され、この生物について知られている情報量としてアップデートさ
れるべき値は増す。

【０１５９】 この推定を拡大して生物のホモロジーを包含するようにすることができる。す
なわち、植物１の遺伝子ＡＢＣＤ１からのバイナリー配列についての全ての生物
のデータベースの調査は、植物１、植物２、哺乳動物１などに対するマッチを参
照することができる。推定マトリックスは、データベースにおける公知の生物デ
ータから構築されるであろう。

【０１６０】 上記した計算および分析は、以下のカタログの構築の例を用いて説明すること
ができる。二プローブディテクターアレイ、コントロール試料およびテスター試
料を考えてみる。公知の配列を有する２つのプローブ、Ａ、＜基板（substrate
）--リンカー（linker）--ＡＧＧＧＡＧ−３'＞、および、Ｂ、＜基板--リンカ
ー--ＡＴＧＧＡＧ＞を考えてみる。これらのプローブは、コントロールおよびテ
スター試料からのそれらの同族配列：ＡＡ、＜...ＴＣＣＣＴＣ...＞、およびＢ
Ｂ、＜...ＴＡＣＣＴＣ...＞、ならびに、本明細書に記載した低い確率を有する
いくつかのミスマッチ種を捕獲する。上記で検討した推定マトリックス技法を利
用して、正確なマッチングの確率を算出することができる。

【０１６１】 コントロールおよびテスターに対してＢＥＳＴ法を行って、プローブディテク
ターアレイからシグナルを回収し、４つのシグナルを含むカタログを作製する：

【０１６２】

【化７】

【０１６３】 該カタログは、また、上記で検討したとおり、各プローブ／標的組合せについ
て、確率、および／または、確率から誘導されたエントリーを含んでいる。例示
のために、標的配列ＡＡと対形成するプローブ配列Ａを有する確率が０.８０で
あり、配列ＢＢと対形成するプローブ配列Ａを有する確率が０.１０であり、標
的配列ＡＡと対形成するプローブ配列Ｂが０.０５であり、配列ＢＢと対形成す
るプローブ配列Ｂを有する確率が０.７５である、または、

【化８】 であると仮定する。

【０１６４】 各標的に対応するシグナルを決定することは、一次代数の適用の簡単なもので
ある。ここでは、例えば、対応するエントリーを一緒に増幅して、コントロール
およびテスターを目的の標的の確率パターンに対応するパターンに転換する。例
えば、ＡＡ標的によると考えられるコントロール試料中の全シグナルは、０.３
０×０.８０（Ａプローブ部位上で、完全なマッチ）＋０.０３×０.０５（Ｂプ
ローブ部位上で、不完全なマッチ）＝約０.２４である。テスター試料について
は、ＡＡ標的シグナルは、０.８０×０.８０＋０.０３×０.０５＝約０.６４で
ある。ＡＡに対応する配列についてのコントロールおよびテスターのパターンを
比較すると、各々、テスターに対するコントロールについて、０.２４から０.６
４までの相対的な値の増加が示される。該パターンにおける他のエントリーの全
ては、同様に算出される。

【０１６５】 例示 開示した方法を、その例を含む以下の例示によってさらに理解することができ
る。本例示は方法の範囲を制限するものではない。

【０１６６】 例示１：質量分析検出 本例示は検出に公知の酵素および質量分析法を使用する開示した方法の例であ
る。コントロール試料およびテスター試料のシグナルは標識部分が異なる質量を
有する点で質量分析計において識別される。適切なピークの比率はコントロール
材料とテスター材料との比率を表す。コントロール試料およびテスター試料につ
いて、工程１〜８を平行して実施し、工程８の標識はコントロールおよびテスタ
ーについてそれぞれ重質量タグおよび軽質量タグである。コントロールおよびテ
スターについて得られた混合物をプールし、次いで同時に工程９のアレイと接触
させる。

【０１６７】 １．標準的な手順に従って逆転写酵素を使用して二本鎖ｃＤＮＡを作製する。

【０１６８】 ２．∧ＧＡＴＣ＿の認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼＭｂｏＩで消化
する。示すｃＤＮＡは配列番号９である。

【０１６９】

【化９】

【０１７０】 ３．オフセットアダプター（offset adapter、式中off-adap）を結合する。こ
れらのオフセットアダプターはＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。オ
フセットアダプターを適正なフラグメントにハイブリダイズさせ、連結する。こ
こで使用するＩＩＳ型酵素の例はＦｏｋＩである。これはＧＧＡＴＧ（９／１３
）の認識および切断位置を有する。

【０１７１】

【化１０】

【０１７２】 ４．第２の消化。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼで切断する。明らかにする
ために、「Ｂ」フラグメント（ＧＧＡＴＧＡＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；配列番
号１０）のみを以下に示す。

【０１７３】

【化１１】

【０１７４】 ５．得られた消化物を３８４マイクロタイタープレートの２５６個のウェルに
分割する。捕獲タグ（この場合ビオチン（biotin））を含むアダプター−インデ
クサー（adapter-indexer）を構築物に添加し、ハイブリダイズさせ、連結する
。

【０１７５】

【化１２】

【０１７６】 ５ａ．ビオチン−アビジン相互作用を用いて洗浄し、連結した構築物のみを保
持させる。

【０１７７】 ６．増幅。２つの増幅プライマーを使用する。一方はオフセットアダプターの
鎖に相補的であるように設計し、他方はアダプター−インデクサーに相補的であ
るように設計する。多数のホスホロチオエート結合が下方鎖の３’末端に含まれ
る；これらは続くエキソヌクレアーゼ消化に対して保護するために使用される。 ＰＣＲから生成するアンプリコン：

【０１７８】

【化１３】

【０１７９】 ７．一本鎖アンプリコンを生成するためのエキソヌクレアーゼ消化工程。

【０１８０】

【化１４】

【０１８１】 ８．テスターおよびコントロールについて異なる標識を使用して、質量標識（
label）を有するライゲーター−ディテクター（ligator-detector、式中ligator
-detect）を付加する。

【０１８２】

【化１５】

【０１８３】 ９．アレイに局在化させる。本例示においては全部で４０９６個までのヘキサ
マーを含むアレイを構築してもよい。本例示については、アレイはスライドグラ
ス上にあり、ＰＥＧリンカー−スペーサー（linker-spacer）を介してスライド
に共有結合した全部で４０９６個のヘキサマー（hexamer）を含むと考える。

【０１８４】 コントロール溶液とテスター溶液とを合し、混合物をアレイとハイブリダイゼ
ーション条件下で接触させる。一旦ハイブリダイズさせたら連結する。

【０１８５】

【化１６】

【０１８６】 １０．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる検出。 適切なマトリックス材料（例えば、２，５−ジヒドロキシ安息香酸またはその
他の当該分野で公知のもの）でスライドグラスをコートする。スライドグラスを
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの源領域（source region）に配置する。個々のヘキ
サマー領域をレーザーによってサンプリングし、これによって表面（surface）
に結合した鎖に相補的なフラグメントが遊離し、飛行時間型分析計で検出される
。コントロールとテスターとはスペクトルにおいて異なる質量を有するので、軽
質量シグナルに対する重質量シグナルの比率は投入したコントロールおよびテス
ターＤＮＡの比率を表す。単一塩基のミスマッチによって親ピークが塩基変化の
質量だけ移動させられるので、この検出方法は、アレイにミスマッチした試料を
識別することに留意のこと；このような短いオリゴヌクレオチドの質量の正確さ
は当該分野において公知である。

【０１８７】 １１．統計および誤差検出。 工程２の各制限切断によって２つのタグが生じることを認識し、相関するタグ
からのデータ（公知のゲノムの場合）をさらに誤差検出および強度補正に利用す
る。質量分析検出の他の選択を以下に記載する。

【０１８８】 例示２：プローブアレイにおける蛍光検出 本例示は公知の酵素、スライドグラス上のプローブアレイおよび蛍光読出しを
使用する開示した方法の例である。コントロール試料およびテスター試料のシグ
ナルは異なる蛍光標識を使用することによって識別される。ここで、適切なピー
クの比率はコントロール材料とテスター材料との比率を表す。コントロール試料
およびテスター試料について、工程１〜８を平行して実施し、工程８の標識はコ
ントロールおよびテスターについて２つの異なる蛍光タグである。コントロール
およびテスターについての混合物をプールし、次いで同時に工程９のアレイと接
触させる。

【０１８９】 １．標準的な手順に従って逆転写酵素を使用して二本鎖ｃＤＮＡを作製する。

【０１９０】 ２．∧ＧＡＴＣ＿の認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼＭｂｏＩで消化
する。示すｃＤＮＡは配列番号９である。

【０１９１】

【化１７】

【０１９２】 ３．オフセットアダプターを結合する。これらのオフセットアダプターはＩＩ
Ｓ型エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。オフセットアダプターを適正なフラグ
メントにハイブリダイズさせ、連結する。ここで使用するＩＩＳ型酵素の例はＦ
ｏｋＩである。これはＧＧＡＴＧ（９／１３）の認識および切断位置を有する。

【０１９３】

【化１８】

【０１９４】 ４．第２の消化。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼで切断する。明らかにする
ために、「Ｂ」フラグメント（ＧＧＡＴＧＡＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；配列番
号１０）のみを以下に示す。

【０１９５】

【化１９】

【０１９６】 ５．得られた消化物を３８４マイクロタイタープレートの２５６個のウェルに
分割する。捕獲部分（この場合ビオチン）を含むアダプター−インデクサーを構
築物に添加し、ハイブリダイズさせ、連結する。

【０１９７】

【化２０】

【０１９８】 ５ａ．ビオチン−アビジン相互作用を用いて洗浄し、連結した構築物のみを保
持させる。

【０１９９】 ６．増幅。２つの増幅プライマーを使用する。一方はオフセットアダプターの
鎖に相補的であるように設計し、他方はアダプター−インデクサーに相補的であ
るように設計する。多数のホスホロチオエート結合が下方鎖の３’末端に含まれ
る；これらは続くエキソヌクレアーゼ消化に対して保護するために有用である。 ＰＣＲから生成するアンプリコン：

【０２００】

【化２１】

【０２０１】 ７．一本鎖アンプリコンを生成するためのエキソヌクレアーゼ消化工程。

【０２０２】

【化２２】

【０２０３】 ８．ライゲーター−ディテクターを付加する。

【０２０４】

【化２３】

【０２０５】 ９．アレイに局在化させる。例えば、全部で４０９６個までのヘキサマーを含
むアレイを構築してもよい。本例示については、アレイはスライドグラス上にあ
り、ＰＥＧリンカー−スペーサーを介してスライドに共有結合した全部で４０９
６個のヘキサマーを含むと考える。

【０２０６】 コントロール溶液とテスター溶液とを合し、混合物をアレイとハイブリダイゼ
ーション条件下で接触させる。一旦ハイブリダイズさせたら連結する。

【０２０７】

【化２４】

【０２０８】 １０．蛍光による検出。

【０２０９】 少なくとも２色の検出が可能なスライドスキャナー中にスライドグラスを配置
する（例えば、ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ，Ａｘｏｎ，Ｖｉｒｔｅｋの製品およ
びその他のいくつかの機器が市販されている）。コントロールおよびテスターは
異なる色を有するので、２色のシグナルの比率は投入したコントロールおよびテ
スターＤＮＡの比率を表す。標識検出の他の選択を以下に記載する。

【０２１０】 例示３：標識およびソーティング 以下の例示では、開示した方法において、標識、ソーティングおよびマイクロ
ビーズを利用する。本例示において、２５６種類のライゲーター−ディテクター
はそれぞれ２５６個の異なる色をコードしたマイクロビーズの表面に結合されて
おり、従って各ライゲーター−ディテクターは単一の色によって同定される。こ
れらの新たな「マイクロビーズライゲーター−ディテクター」を標的配列にアニ
ールさせ連結した後、２５６組のマイクロビーズライゲーター−ディテクターを
、４０９６個のヘキサマープローブを１ウェルあたり１個含む４０９６ウェルマ
イクロタイタープレートに同時に負荷する。ハイブリダイゼーションの間に完全
にマッチした場合のみ蛍光色素標識ヘキサマーが特異的マイクロビーズ標識複合
体に連結される。ルミネックス（Luminex）１００（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）フロー分析機は、色をコードしたマイクロビーズを識別し、そ
の蛍光を同時に測定することができる。マイクロタイタープレートのウェルの特
異的アドレス（およびそのアドレスに含まれるヘキサマー）を知ることによって
、ライゲーター−ディテクターに隣接する６個の塩基を同定することができる。
設計を以下に示す。

【０２１１】 一本鎖アンプリコンの生成までの工程は基本的なＢＥＳＴと同じであり、酵素
切断、オフセットアダプター連結、ＩＩＳ型酵素切断、アダプター−インデクサ
ー連結、ＰＣＲ増幅ならびにバイナリー配列タグの一本鎖を生成するためのフラ
グメントの捕獲および変性を含む。

【０２１２】 ２５６個の一本鎖バイナリー配列タグを２５６個のライゲーター−ディテクタ
ーにアニールさせる。生成する４塩基付着末端の各々に相補的な２５６個の異な
るライゲーター−ディテクターを含む２５６個の異なるライゲーター−ディテク
ターの配列が存在する。ライゲーター−ディテクターは、蛍光色素または蛍光ビ
ーズのようなシグナル部分で標識される。２５６個のアニールした一本鎖調製物
の各々を４０６９個のアリコートに分割し、４０９６個のヘキサマープローブの
うち１個にハイブリダイズさせる。例えば、４０９６個のヘキサマーが４０９６
ウェルマイクロタイタープレート中に含まれ、各ウェルは単一のヘキサマープロ
ーブを含有する。４０９６個のヘキサマープローブの各々は５’末端で蛍光標識
されており、遊離の３’−ヒドロキシル末端を含む。

【０２１３】 アニールした一本鎖アンプリコンとのヘキサマープローブのハイブリダイゼー
ションおよび連結の後、２５６個の調製物をストレプトアビジンを含有する別の
ウェルに移し、未結合の材料を洗浄する（ヘキサマープローブはビオチン基も含
む）。次いで２つのシグナルを測定する。

【０２１４】 １つのシグナルは試料（例えば、テスターまたはコントロールのいずれか）に
対応する。テスター試料およびコントロール試料は蛍光コードしたビーズ（Ｌｕ
ｍｉｎｅｘ）によって識別される。１つの実施態様において、５１２色を使用す
ることができる；テスター用に２５６色およびコントロール用に２５６色。しか
し、ビーズがテスターとコントロールとの間で「ずれている（offset）」場合、
２５６個の色をコードしたビーズを使用することもできる。例えば、色１はテス
ターについてはヘキサマー２に対応するが、コントロールについてはヘキサマー
３に対応するなど。第２のシグナルは標識ヘキサマープローブに由来し、ライゲ
ーター−ディテクターにアニールした一本鎖ＤＮＡのレベルを測定する。ここで
測定される２つのシグナルをルミネックス１００のような機器で同時に読み取る
ことができる。

【０２１５】 例示４：初期増幅を伴うＢＥＳＴ いくつかの場合、特に非常に希少なｍＲＮＡの検出のためには、初期増幅が有
益である。上記例示１および２において、増幅工程前に試料を２５６個のアリコ
ートに分割する。複数のｃＤＮＡ分子を含む初発試料において、２５６個のアリ
コートへ分割した後に、いくつかの種がシステムの検出限界を下回る濃度で存在
することが予想される。そのような濃度の制限を克服するために、以下の形態の
方法では２５６個の等価なプールへの試料の分割の前に増幅工程を導入する。

【０２１６】 １．二本鎖ｃＤＮＡを作製する。

【０２１７】 ２．ＩＩＳ型、ＩＩ型両方の制限酵素を含む制限酵素の組を選択する。２つの
制限部位間の未知塩基の全てまたは大部分を決定するように設計して、認識部位
、認識部位中の塩基数、ＩＩＳ型酵素の作用範囲などを選択してこの組を設計し
て異なる実験結果を扱うことができる。ここではＦｏｋＩ（ＩＩＳ）およびＭｂ
ｏＩ（ＩＩ）を利用する。

【０２１８】 ３．まずｃＤＮＡをＩＩ型制限エンドヌクレアーゼで消化する。５’末端にお
ける４塩基のオーバーハングが好ましい。ＭｂｏＩは∧ＧＡＴＣの認識部位を有
する。示すｃＤＮＡは配列番号９である。

【０２１９】

【化２５】

【０２２０】 ４．ハイブリダイゼーションおよび連結によってＩＩＳ認識部位を含むオフセ
ットアダプターを付加する。ここで、ＩＩＳ型はＦｏｋＩであり認識部位はＧＧ
ＡＴＧ（９／１３）である。このアダプターは後の工程においてＰＣＲ用ユニバ
ーサルプライマーとして使用する領域も含む。この領域をＵＰ１と称する。

【０２２１】

【化２６】

【０２２２】 ５．第２の消化。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ。新生構築物をＦｏｋＩを
使用して消化する。明らかにするために、「Ｂ」フラグメント（ＧＧＡＴＧＡＴ
ＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；配列番号１０）のみを以下に示す。

【０２２３】

【化２７】

【０２２４】 ６．複数のアダプター−インデクサーを付加する。２５６個の異なる種類のア
ダプター−インデクサーが存在し、各アダプターはユニバーサルプライマーをコ
ードする共通部（ＵＰ２）、アダプター特異的ＰＣＲ部（ＡＳ１）、それに続く
アダプター特異的４塩基５’オーバーハングを有して構築される。可能なＡＳ１
は４塩基の５’オーバーハングの相補物である。

【０２２５】

【化２８】

【０２２６】 ７．ＵＰ１およびＵＰ２に相補的なユニバーサルプライマーを使用してＰＣＲ
増幅する。この回の増幅によって５００倍のオーダーでの増幅が生じる。

【０２２７】 ８．アンプリコンを複数のウェルに分割する。ここでは、２５６個全ての可能
性を考慮し３８４ウェルマイクロタイタープレートの２５６個のウェルに移す。

【０２２８】 ９．さらにＰＣＲを実施する。ここでビオチンが結合したＵＰ１用ユニバーサ
ルプラマ―を使用し、第２のプライマーは特定のＡＳ１に特異的であり、従って
特異的な（２５６個中１個）ビオチン化アダプター特異的アンプリコンが生成さ
れる。

【０２２９】

【化２９】

【０２３０】 １０．残りの工程は、例示１に開した工程を反映する。 ビオチン−アビジン相互作用を用いて洗浄し、構築物を保持させ、一本鎖フラ
グメントを作製する。

【０２３１】

【化３０】

【０２３２】 ライゲーター−ディテクターを付加する。

【０２３３】

【化３１】

【０２３４】 ４０９６個のヘキサマーのプローブアレイにハイブリダイズさせる。

【０２３５】

【化３２】

【０２３６】 質量分析法（または蛍光（例示２のように標識が蛍光定量性である場合））に
よって検出する。

【０２３７】 例示５：ピロシーケンシング（Pyrosequencing） バイナリー配列タグの検出を当該分野において公知のいずれかの配列決定技術
によって行ってもよい。好ましい技術はピロシーケンシングである。このために
好ましい機器はＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ，Ｖａｌｌｏｎｇａｔａｎ １，ＳＥ−７５２ ２８ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能である
。この機器を使用して、ＩＩ型認識部とＩＩＳ型認識部位との間の未知の塩基を
以下の方法で配列決定し得る。

【０２３８】 １．二本鎖ｃＤＮＡを作製する。

【０２３９】 ２．ＩＩ型酵素（好ましくは４塩基認識および４塩基５’オーバーハングを有
するもの）で切断する。

【０２４０】 ３．例示１に記載の方法でＩＩＳ型認識部位およびＩＩ型切断のオーバーハン
グに適合するオーバーハングを有するオフセットアダプターを調製する。

【０２４１】 ４．工程２の切断フラグメントにオフセットアダプターをハイブリダイズさせ
、連結する。

【０２４２】 ５．オフセットアダプターの付加によって導入された認識配列から外れた部位
で切断するＩＩＳ型酵素でｃＤＮＡを切断する。

【０２４３】 ６．工程５の溶液を２５６回反復して３８４ウェルマイクロタイタープレート
の２５６個のウェルに分配する。これらはインデックス試料である。

【０２４４】 ７．インデックスアダプターを連結する。各インデックス試料を異なるアダプ
ター−インデクサーとインキュベートし、その各々はそのインデックス試料中の
ＤＮＡフラグメントの可能な付着末端の１つに適合する付着末端を有する。次い
で、アダプター−インデクサーを適合するＤＮＡフラグメントに連結によって結
合させ、各末端に共有結合したアダプターを有するバイナリー配列タグが形成さ
れる。

【０２４５】 ８．希釈。以下の工程で試料を９６、３８４または１５３６ウェルマイクロタ
イタープレートに分配したときに１ウェルあたり１分子未満の濃度が達成される
ように、バイナリー配列タグのインデックス試料の各々を希釈する。希釈は、次
に試料を分配するウェルの数、ＩＩ型切断の頻度および初発ＤＮＡ投入量を含む
多数の要因に依存する。

【０２４６】 ９．分配。各々１種のアダプターインデクサーを含有する工程８の各ウェルの
内容物を多数のウェルに分配する。本例示において、総数２５６個のマイクロタ
イタープレートについて、各ウェルを９６個のウェルに移す。

【０２４７】 １０．増幅。バイナリー配列タグの各アリコートを、適切な増幅方法（例えば
、ＰＣＲ）を使用して増幅する。２個のＰＣＲプライマーを使用する。一方はオ
フセットアダプターの配列に相補的であるように設計し、他方はアダプター−イ
ンデクサーに相補的であるように設計する。増幅され得る分子がウェル中に１個
のみ存在するべきであるので、増幅後に１個の優勢な分子種が存在するべきであ
る。

【０２４８】 １１．洗浄。増幅したバイナリー配列タグを、当該分野において公知の多数の
方法のいずれを使用して洗浄してもよい。好ましい方法では、一本鎖アンプリコ
ンがさらなる工程のために保持されるように、ＰＣＲプライマーに取り込まれた
捕獲タグ（例えば、ビオチン）を有する。

【０２４９】 １２．ピロシーケンシングによる検出。アダプター配列の１つに相補的な配列
決定プライマーを使用して、未知の隣接する塩基を、ピロシーケンシングの技術
によって直接決定することができる。各ウェルに優勢に１個の一本鎖ＤＮＡフラ
グメントが存在するので、そのフラグメントに対応する１個の優勢な配列が存在
するはずである。市販の機器は約１０分間で９６ウェルについて１ウェルあたり
１０塩基を配列決定することができる。所定のバイナリー配列タグの発現レベル
は配列が出現する回数に比例する。

【０２５０】 例示６：ヘアピンプライマー 本例示はヘアピンプライマーの使用を記載する。例示１に記載の方法を適合さ
せて、以下のように切断可能なヘアピンプライマーを利用し、タグを遊離させる
ことができる：

【０２５１】 １．例示１のようにバイナリー配列タグを生成し、次いでヘアピンプライマー
を使用してＰＣＲ工程を実施する。このヘアピンプライマーはヘアピン配列中ま
たはヘアピン配列付近にウラシルを含む。ヘアピンプライマーは、プライマー配
列を含み、ステム−ループまたはヘアピン構造を形成可能な核酸分子である。ヘ
アピン構造が増幅フラグメントの末端において形成され、これはフラグメントの
プローブへの結合を容易にする（次工程参照）。ヘアピン構造は、一本鎖領域の
隣に二重鎖領域を形成することによってバイナリー配列タグへハイブリダイズし
たライゲーター−ディテクターの機能を果たす。これによって増幅フラグメント
の末端のプローブアレイへの連結が可能になる（次工程参照）。

【０２５２】 ２．プローブヘキサマーアレイへハイブリダイズさせ、連結する。

【０２５３】

【化３３】

【０２５４】 式中、ｘはヘキサマープローブであり、Ｎはヘアピンであり、Ｍは付加塩基（単
数または複数）であり、ｎはバイナリー配列タグであり、｜は塩基対合を示す。

【０２５５】 ３．アルカリで洗浄して非連結タグヘアピンを除去する。

【０２５６】 ４．ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼで切断する。 分析する遊離フラグメントは以下のようになる：

【０２５７】

【化３４】

【０２５８】 ５．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して２つの異なる質量を分離し、切断したタグ
を検出する。切断したタグの断片化に上記のような直列質量分析計を使用するこ
とによって、タグ配列のいくつかまたは全部が決定され、Ｓ／Ｎが改善される

【０２５９】 ヘアピンプライマーを利用して、表面アレイの同じアドレスからのタグのコン
トロールおよびテスターの読出しを多重化し得る。

【０２６０】 １．例示１のようにｃＤＮＡからバイナリ―配列タグを生成させ、次いでヘア
ピンプライマーを使用してＰＣＲ産物を生成させる。テスターおよびコントロー
ルについて異なるヘアピンプライマーを使用する。テスターについては合成アダ
プター中にウラシルを、そしてコントロールについては合成アダプター中にチミ
ンを。標準的な蛍光標識ヌクレオチドを使用して蛍光標識をヘアピン中に取り込
ませてもよい。

【０２６１】 ２．プローブアレイにハイブリダイズさせ、連結する。

【０２６２】

【化３５】

【０２６３】 式中、ｘはヘキサマープローブであり、Ｎはヘアピンであり、ｎはバイナリー配
列タグであり、｜は塩基対合を示し、＊は蛍光標識ヌクレオチドを示す。

【０２６４】 ３．ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ前のシグナルを読み取る。これはコントロ
ール＋テスターの総シグナルに対応する。

【０２６５】 ４．ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを使用してウラシルを含有するヘアピンを
切断する。チミン含有ヘアピンはインタクトなままである。

【０２６６】 ５．スライドを洗浄する。

【０２６７】 ６．ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ後のシグナルを読み取る。これはコントロ
ールシグナルのみに対応する。

【０２６８】 例示７：質量分析検出を用いるＭＡＡＢＳＴ 本例示は検出に公知の酵素および質量分析法を使用する詳細な形式である。コ
ントロール試料およびテスター試料のシグナルはシグナル部分が異なる質量を有
する点で質量分析計において識別される。ここで、適切なピークの比率はコント
ロール材料とテスター材料との比率を表す。

【０２６９】 １．二本鎖ｃＤＮＡを作製する。

【０２７０】 ２．メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化する。示すｃＤＮＡは配列
番号９である。

【０２７１】

【化３６】

【化３７】

【０２７２】 ３．ＩＩＳ型構築物を作製する。ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼをコードするオ
フセットアダプターをハイブリダイゼーションおよび連結によって付加する。Ｆ
ｏｋＩ＝ＧＧＡＴＧ（９／１３）。

【０２７３】

【化３８】

【０２７４】 核酸がメチル化されている場合、配列は切断されず、連結は可能ではなく、バ
イナリー配列タグは生成されない。ＤＮＡが切断される場合、オフセットアダプ
ターは連結される：

【０２７５】

【化３９】

【０２７６】 ４．第２の消化。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ。明らかにするために、「
Ｂ」フラグメント（ＧＧＡＴＧＡＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；配列番号１０）の
みを以下に示す。

【０２７７】

【化４０】

【０２７８】 ５．ｃＤＮＡ消化物を３８４マイクロタイタープレートの２５６個のウェルに
分割する。固定化インデクサーアダプターを構築物に添加し、連結する。

【０２７９】

【化４１】

【０２８０】 ５ａ．ビオチン−アビジン相互作用を用いて洗浄し、構築物を保持させる。

【０２８１】 ６．増幅。２つの増幅プライマーを使用する。一方はオフセットアダプターの
鎖に相補的であるように設計し、他方はアダプター−インデクサーに相補的であ
るように設計する。多数のホスホロチオエート結合が下方鎖の３’末端に含まれ
る；これらは続くエキソヌクレアーゼ消化に対して保護するために必要である。 ＰＣＲから生成するアンプリコン：

【０２８２】

【化４２】

【０２８３】 ７．一本鎖アンプリコンを生成するためのエキソヌクレアーゼ消化工程。

【０２８４】

【化４３】

【０２８５】 ８．ライゲーター−ディテクターを付加する。

【０２８６】

【化４４】

【０２８７】 ９．４０９６個のヘキサマーの固体表面インデックスにハイブリダイズさせる
。連結。

【０２８８】

【化４５】

【０２８９】 １０．表面をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの源領域に配置する。個々のヘキサマ
ー領域をレーザーによってサンプリングし、飛行時間型分析計で検出する。軽質
量シグナルに対する重質量シグナルの比率は投入したコントロールおよびテスタ
ーＤＮＡの比率を表す。必要に応じて、ＤＮＡ鎖の質量自体および／またはその
断片化パターンを使用して、ヘキサマーが適正にハイブリダイズしたことを確認
することができ、これによってさらなるコントロール／テスター比率の情報が提
供される。

【０２９０】 １１．工程２の各制限切断によって２つのタグが生じることを認識し、相関す
るバイナリー配列タグからのデータ（公知のゲノムの場合）をさらに誤差検出お
よび補正に利用する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ−１Ｃは、２つの例示としてのアダプター−インデクサー
（上部に記載）の一方を用いて設計したライゲーター−ディテクター（番号を付
した配列）の例を列挙する。付着末端配列（またはその相補配列）を太文字で示
す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ポール・エム・リザーディ アメリカ合衆国06492コネチカット州ウォ リングフォード、ストーニー・ブルック・ ロード７番 (72)発明者 リ・フェン アメリカ合衆国10461ニューヨーク州ブロ ンクス、アパートメント２ティ、ラインラ ンダー・アベニュー1579番 (72)発明者 ダリン・アール・ラティマー アメリカ合衆国06405コネチカット州ブラ ンフォード、アパートメント２ビー、フロ ーレンス・ロード123番 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 HA19 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR32 QR55 QR62 QR84 QS25 QS34 QX02

Claims (126)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸試料中における核酸断片からバイナリー配列タグを生成
   する方法であって、 (ａ)核酸試料を１種またはそれ以上の第１核酸開裂試薬と共にインキュベート
   して、核酸断片を生成すること、 (ｂ)１種またはそれ以上のオフセット・アダプターを核酸試料と混合し、オフ
   セット・アダプターを核酸断片に共有結合させること、 (ｃ)核酸試料を１種またはそれ以上の第２核酸開裂試薬と共にインキュベート
   して、粘着末端を有する核酸断片を生成すること(ここで、第２核酸開裂試薬は
   それらの認識配列からオフセットした部位で開裂を行い、各オフセット・アダプ
   ターは第２核酸開裂試薬の少なくとも１種に対する認識配列を有する)、 (ｄ)１種またはそれ以上のアダプター−インデクサーを核酸試料と混合し、ア
   ダプター−インデクサーを核酸断片に共有結合させること(ここで、各アダプタ
   ー−インデクサーは異なる粘着末端を有し、アダプター−インデクサーの各粘着
   末端は第２核酸開裂試薬により生成した粘着末端に適合する)、 を包含し、オフセット・アダプターおよびアダプター−インデクサーが結合し
   ている核酸断片がバイナリー配列タグである、方法。
2. 【請求項２】 バイナリー配列タグを増幅するか、検出するか、同定するか
   、配列決定するか、カタログ化するか、またはその組合せである請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】 バイナリー配列タグを検出する(ここで、検出は１種または
   それ以上のバイナリー配列タグの存在、量、存在および量、または非存在を直接
   または間接的に決定することからなる)請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 オフセット・アダプターおよびアダプター−インデクサーを
   ライゲーションにより核酸断片に共有結合させる請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 第１及び第２核酸開裂試薬が制限酵素である請求項１記載の
   方法。
6. 【請求項６】 制限酵素の認識配列の長さが４〜３０ヌクレオチドである請
   求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 制限酵素の認識配列の長さが４〜１０ヌクレオチドである請
   求項５記載の方法。
8. 【請求項８】 制限酵素の認識配列の長さが４〜８ヌクレオチドである請求
   項５記載の方法。
9. 【請求項９】 第１制限酵素が４塩基認識配列を有し、１種の第２制限酵素
   が用いられ、第２制限酵素がその認識配列と異なる部位で開裂を行うIIＳ型制限
   酵素である請求項５記載の方法。
10. 【請求項１０】 バイナリー配列タグを増幅する請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 バイナリー配列タグを増幅の間に標識する請求項１０記載
    の方法。
12. 【請求項１２】 バイナリー配列タグをポリメラーゼ連鎖反応により増幅す
    る請求項１０記載の方法。
13. 【請求項１３】 バイナリー配列タグをディテクター・プローブにハイブリ
    ダイズさせることをさらに包含する請求項１記載の方法。
14. 【請求項１４】 ディテクター・プローブをビースに結合させる請求項１３
    記載の方法。
15. 【請求項１５】 ビーズが標識を含有する請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 標識が分子バーコードである請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 標が質量標識である請求項１５記載の方法。
18. 【請求項１８】 バイナリー配列タグを標識により分類または分離すること
    をさらに包含する請求項１５記載の方法。
19. 【請求項１９】 バイナリー配列タグをビーズにより分類または分離するこ
    とをさらに包含する請求項１４記載の方法。
20. 【請求項２０】 ディテクター・プローブを基板上にアレイ状に固定する請
    求項１３記載の方法。
21. 【請求項２１】 ディテクター・プローブが標識を含有する請求項１３記載
    の方法。
22. 【請求項２２】 バイナリー配列タグを標識により分類または分離すること
    をさらに包含する請求項２１記載の方法。
23. 【請求項２３】 バイナリー配列タグを質量分析法により検出することをさ
    らに包含する請求項１記載の方法。
24. 【請求項２４】 バイナリー配列タグをマトリクス支援レーザー脱着／イオ
    ン化飛行時間型質量分析法により検出する請求項２３記載の方法。
25. 【請求項２５】 検出の前または間に、バイナリー配列タグを衝突誘起解離
    により断片化する請求項２３記載の方法。
26. 【請求項２６】 バイナリー配列タグの一方または両方の鎖を検出前に開裂
    または部分的に分解させる請求項２３記載の方法。
27. 【請求項２７】 バイナリー配列タグをテキサフィリン技術により部分的に
    分解させる請求項２６記載の方法。
28. 【請求項２８】 バイナリー配列タグを検出前にディテクター・プローブに
    ハイブリダイズさせる請求項２３記載の方法。
29. 【請求項２９】 ディテクター・プローブを基板上にアレイ状に固定する請
    求項２８記載の方法。
30. 【請求項３０】 バイナリー配列タグの１種またはそれ以上の全部または一
    部を配列決定することをさらに包含する請求項１記載の方法。
31. 【請求項３１】 オフセット・アダプターまたはアダプター−インデクサー
    のいずれかの配列に対応しないバイナリー配列タグの一部を配列決定する請求項
    ３０記載の方法。
32. 【請求項３２】 配列決定前に、 各核酸試料を希釈し、平均して、各一定分量あたり１個のバイナリー配列タグ
    分子を含有する一定分量に分割すること、および 各一定分量中のバイナリー配列タグを増幅すること、 をさらに包含する請求項３０記載の方法。
33. 【請求項３３】 各アダプター−インデクサーが二本鎖部分を有し、各アダ
    プター−インデクサーの二本鎖部分が異なる請求項１記載の方法。
34. 【請求項３４】 各アダプター−インデクサーが二本鎖部分を有し、各アダ
    プター−インデクサーの二本鎖部分が同一である請求項１記載の方法。
35. 【請求項３５】 各アダプター−インデクサーが二本鎖部分を有し、アダプ
    ター−インデクサーの少なくとも２種の二本鎖部分が異なる請求項１記載の方法
    。
36. 【請求項３６】 各アダプター−インデクサーが二本鎖部分を有し、アダプ
    ター−インデクサーの少なくとも２種の二本鎖部分が同一である請求項１記載の
    方法。
37. 【請求項３７】 各アダプター−インデクサーが標識を含有する請求項１記
    載の方法。
38. 【請求項３８】 バイナイリー配列タグを標識により分類または分離するこ
    とをさらに包含する請求項３７記載の方法。
39. 【請求項３９】 バイナイリー配列タグの鎖を分離することをさらに包含す
    る請求項１記載の方法。
40. 【請求項４０】 各バイナリー配列タグが上鎖および下鎖を有し、上鎖がそ
    れらの５'末端にオフセット・アダプター配列を有し、下鎖がそれらの５'末端に
    アダプター−インデクサー配列を有し、バイナリー配列タグの上鎖をバイナリー
    配列タグの下鎖から分離する請求項３９記載の方法。
41. 【請求項４１】 １種またはそれ以上のライゲーター−ディテクターをバイ
    ナリー配列タグの上鎖またはバイナリー配列タグの下鎖のいずれかとハイブリダ
    イズさせること(ここで、各ライゲーター−ディテクターは、アダプター−イン
    デクサーの少なくとも１種の粘着末端を含み、かつ隣接する配列の全部または一
    部に対合するか、または相補的な配列を有する)、 核酸試料を、１種またはそれ以上のプローブを有するディテクター・アレイと
    ハイブリダイズさせ、ライゲーター−ディテクターをプローブに共有結合させる
    こと(ここで、各プローブは異なる配列を有する)、および ライゲーター−ディテクターのディテクター・アレイ・プローブへの結合を直
    接または間接的に検出すること、 をさらに包含する請求項４０記載の方法。
42. 【請求項４２】 １種またはそれ以上のライゲーター−ディテクターをバイ
    ナリー配列タグとハイブリダイズさせること(ここで、各ライゲーター−ディテ
    クターは、アダプター−インデクサーの少なくとも１種の粘着末端を含み、かつ
    隣接する配列の全部または一部に対合するか、または相補的な配列を有する)、 核酸試料を、１種またはそれ以上のプローブを有するディテクター・アレイと
    ハイブリダイズさせ、ライゲーター−ディテクターをプローブに共有結合させる
    こと(ここで、各プローブは異なる配列を有する)、および ライゲーター−ディテクターのディテクター・アレイ・プローブへの結合を直
    接または間接的に検出すること、 をさらに包含する請求項１記載の方法。
43. 【請求項４３】 ライゲーター−ディテクターの結合を増幅標的サークルの
    ローリング・サークル複製(ここで、複製はライゲーター−ディテクターにより
    プライムされる)により検出する請求項４２記載の方法。
44. 【請求項４４】 非結合ライゲーター−ディテクターが増幅標的サークルの
    ローリング・サークル複製をプライムしない請求項４３記載の方法。
45. 【請求項４５】 核酸開裂試薬が、異なるＮ配列を有する粘着末端を生成し
    、試料がＮインデックス試料に分割される請求項４２記載の方法。
46. 【請求項４６】 ディテクター・アレイ・プローブがすべて同じ長さである
    請求項４２記載の方法。
47. 【請求項４７】 ディテクター・アレイ・プローブの長さが６、７または８
    ヌクレオチドである請求項４６記載の方法。
48. 【請求項４８】 ディテクター・アレイ・プローブがすべて同様のハイブリ
    ッド安定性を有する請求項４２記載の方法。
49. 【請求項４９】 各オフセット・アダプター、アダプター−インデクサー、
    ライゲーター−ディテクターまたはディテクター・アレイ・プローブが標識を含
    有する(ここで、ライゲーター−ディテクターのプローブへの結合は標識により
    検出する)請求項４２記載の方法。
50. 【請求項５０】 核酸試料から生成したバイナリー配列タグのコレクション
    が核酸試料に対するバイナリー配列タグのカタログを構成する請求項１記載の方
    法。
51. 【請求項５１】 複数の核酸試料について、工程(ａ)から工程(ｄ)を行うこ
    とをさらに包含する請求項１記載の方法。
52. 【請求項５２】 対照核酸試料について、工程(ａ)から工程(ｄ)を行うこと
    、 核酸試料および対照核酸試料から生成したバイナリー配列タグのコレクション
    の間の差異を同定すること、 をさらに包含する請求項５１記載の方法。
53. 【請求項５３】 差異が、核酸試料および対照核酸試料から生成したバイナ
    リー配列タグの存在、量、存在および量、または非存在の差異である請求項５２
    記載の方法。
54. 【請求項５４】 工程(ａ)から工程(ｄ)を対照核酸試料および試験核酸試料
    について行い、試験核酸試料または試験核酸試料の起源を工程(ａ)の前に処理し
    て、試験核酸試料中における１種またはそれ以上の核酸分子を破壊、***または
    除去し、破壊、***または除去した核酸分子に対応するバイナリー配列タグを対
    照核酸試料から生成するが、試験核酸試料からは生成しない請求項５１記載の方
    法。
55. 【請求項５５】 試験核酸試料を処理して、試験核酸試料中における１種ま
    たはそれ以上の核酸分子を破壊、***または除去する請求項５４記載の方法。
56. 【請求項５６】 試験および対照核酸試料がメッセンジャーＲＮＡの試料で
    あり、工程(ａ)の前に、 メッセンジャーＲＮＡ分子を逆転写して、メッセンジャーＲＮＡ分子の第１ｃ
    ＤＮＡ鎖を生成すること、 試験核酸試料中において配列特異的な開裂により１種またはそれ以上の第１ｃ
    ＤＮＡ鎖を破壊または***させるが、対照核酸試料においては破壊または***さ
    せないこと、 第１ＤＮＡ鎖から第２ｃＤＮＡ鎖を合成すること、 をさらに包含する請求項５５記載の方法。
57. 【請求項５７】 試験および対照核酸試料がメッセンジャーＲＮＡの試料で
    あり、工程(ａ)の前に、 メッセンジャーＲＮＡ分子を逆転写して、メッセンジャーＲＮＡ分子の第１お
    よび第２ｃＤＮＡ鎖を生成すること、 試験核酸試料中において配列特異的な開裂により１種またはそれ以上の第２ｃ
    ＤＮＡ鎖を破壊または***させるが、対照核酸試料においては破壊または***さ
    せないこと、 をさらに包含する請求項５５記載の方法。
58. 【請求項５８】 試験核酸試料の起源を処理して、試験核酸試料中における
    １種またはそれ以上の核酸分子を破壊、***または除去する請求項５４記載の方
    法。
59. 【請求項５９】 試験試料を誘導する細胞を、１種またはそれ以上の遺伝子
    の発現を減少または排除する分子、組成物または条件にさらすことにより、起源
    の処理を達成する請求項５８記載の方法。
60. 【請求項６０】 対照核酸試料および試験核酸試料から生成したバイナリー
    配列タグの差異を同定することをさらに包含する請求項５４記載の方法。
61. 【請求項６１】 核酸試料から生成したバイナイリー配列タグのコレクショ
    ンの間の差異を同定することをさらに包含する請求項５１記載の方法。
62. 【請求項６２】 核酸試料の１種またはそれ以上から生成したバイナリー配
    列タグに対応する核酸断片を同定または調製するが、他方の核酸試料の１種また
    はそれ以上からは同定または調製しないことをさらに包含する請求項６１記載の
    方法。
63. 【請求項６３】 核酸試料から生成したバイナリー配列タグに対応する核酸
    断片を同定または調製することをさらに包含する請求項１記載の方法。
64. 【請求項６４】 調製した核酸断片を、異なる核酸試料を分析するためのプ
    ローブとして用いることをさらに包含する請求項６３記載の方法。
65. 【請求項６５】 異なる核酸試料の分析が、異なる核酸試料における核酸分
    子の検出、定量、同定、比較、スクリーニング、配列決定、選択、破壊、分類、
    捕捉またはその組合せを包含する請求項６４記載の方法。
66. 【請求項６６】 単一型のオフセット・アダプターを用いる請求項１記載の
    方法。
67. 【請求項６７】 １種の第２核酸開裂試薬を用い、第２核酸開裂試薬がIIＳ
    型制限酵素である請求項１記載の方法。
68. 【請求項６８】 第１核酸開裂試薬の少なくとも１種がその認識部位の修飾
    に対して感受性を有する請求項１記載の方法。
69. 【請求項６９】 第１および第２核酸開裂試薬が制限酵素である請求項６８
    記載の方法。
70. 【請求項７０】 認識部位に対する修飾が、メチル化、アルキル化、二量体
    化、誘導体化、脱プリン化またはＡＤＰ-リボース化である請求項６９記載の方
    法。
71. 【請求項７１】 修飾が、単離した場合に核酸断片に存在するか、あるいは
    単離後に核酸断片に導入される請求項６９記載の方法。
72. 【請求項７２】 アダプター−インデクサーの核酸断片への結合後に、 オフセット・アダプターおよびアダプター−インデクサーが結合しているイン
    デックス試料中における核酸断片を増幅すること、 をさらに包含する請求項６９記載の方法。
73. 【請求項７３】 核酸試料中における核酸断片の少なくとも１種の一部の配
    列を決定することをさらに包含する請求項７２記載の方法。
74. 【請求項７４】 オフセット・アダプターの核酸断片への結合後に、 オフセット・アダプターに結合した核酸断片をオフセット・アダプターに結合
    しない核酸断片から分離すること(ここで、オフセット・アダプターに結合した
    唯一の核酸断片を工程(ｃ)に用いる)、 ことをさらに包含する請求項６９記載の方法。
75. 【請求項７５】 第１制限酵素の少なくとも１種が(１)その認識部位の修飾
    に対して感受性を有さず、(２)その認識部位の修飾に対して感受性を有する第１
    制限酵素と同じ認識部位を有し、第１制限酵素による消化の前に、 各インデックス試料をインデックス試料の２種またはそれ以上の組に分割する
    ことをさらに包含する(ここで、インデックス試料の各組における各２次インデ
    ックス試料は異なる第１制限酵素で消化し、工程(ａ)から工程(ｄ)は２次インデ
    ックス試料の各々を用いて行う)請求項６９記載の方法。
76. 【請求項７６】 その認識部位の修飾に対して感受性を有する第１制限酵素
    を用いて作成したバイナリー配列タグの存在または非存在のパターンを、その認
    識部位の修飾に対して感受性を有さず、その認識部位の修飾に対して感受性を有
    する第１制限酵素と同じ認識部位を有する第１制限酵素を用いて作成したバイナ
    リー配列タグの存在または非存在のパターンと比較することをさらに包含する請
    求項７５記載の方法。
77. 【請求項７７】 バイナリー配列タグの存在、量、存在および量、または非
    存在のパターンが、核酸試料中における核酸断片のカタログを構成する請求項６
    ９記載の方法。
78. 【請求項７８】 第２核酸試料中における核酸断片の第２カタログを調製す
    ること、および第１カタログと第２カタログとを比較すること(ここで、第１お
    よび第２カタログの差異は第１および第２核酸試料の修飾の差異を示す)をさら
    に包含する請求項７７記載の方法。
79. 【請求項７９】 第１核酸試料を誘導する細胞が第２核酸試料を誘導する細
    胞に対して修飾不足であること以外は、第２核酸試料が第１核酸試料と同じタイ
    プの細胞由来の試料である請求項７７記載の方法。
80. 【請求項８０】 第２核酸試料が第１核酸試料と異なるタイプの細胞由来の
    試料であり、第１核酸試料を誘導する細胞が第２核酸試料を誘導する細胞に対し
    て修飾不足である請求項７７記載の方法。
81. 【請求項８１】 核酸試料がｃＤＮＡ試料であり、ｃＤＮＡが１種またはそ
    れ以上のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で合成され、 相関バイナリー配列タグを同定することをさらに包含する請求項１記載の方法
    。
82. 【請求項８２】 相関バイナリー配列タグが、 複数のバイナリー配列タグの発現レベルおよび発現比を計算すること、 同様の発現比を有するバイナリー配列タグを同定すること、 同様の発現比を有するバイナリー配列タグをバイナリーペアにグループ化して
    、相関バイナリー配列タグのリストを作成すること、 相関バイナリー配列タグのリストにおけるバイナリーペアをバイナリー配列タ
    グの発現レベルに従って順序付けること、および 発現レベルの値を逆指数関数に基いて標準曲線に適合させること、 により同定される請求項８１記載の方法。
83. 【請求項８３】 異なるｃＤＮＡ試料を用いて相関バイナリー配列タグを同
    定すること(ここで、ｃＤＮＡは異なる濃度の１種またはそれ以上のジデオキシ
    ヌクレオシドトリホスフェートまたは異なる組の１種またはそれ以上のジデオキ
    シヌクレオシドトリホスフェートの存在下で合成される)、 各リストの相関バイナリー配列タグの発現を、ジデオキシターミネーターレベ
    ルの各々に対応する逆指数関数により予測される予測勾配変化と相関させること
    、および 各リストのバイナリータグのｃＤＮＡ内における順番および位置を予測するこ
    と、 をさらに包含する請求項８２記載の方法。
84. 【請求項８４】 １種またはそれ以上の固定プライマーを用いてｃＤＮＡを
    合成する請求項８１記載の方法。
85. 【請求項８５】 工程(ａ)から工程(ｄ)を第２核酸試料について行うことを
    さらに包含する請求項１記載の方法。
86. 【請求項８６】 第２核酸試料が第１核酸試料と同じタイプの生物由来の試
    料である請求項８５記載の方法。
87. 【請求項８７】 第２核酸試料が第１核酸試料と同じタイプの組織由来の試
    料である請求項８５記載の方法。
88. 【請求項８８】 第２核酸試料が第１核酸試料と同じ生物由来の試料である
    請求項８５記載の方法。
89. 【請求項８９】 第２核酸試料を第１核酸試料と異なる時点で得る請求項８
    ８記載の方法。
90. 【請求項９０】 第２核酸試料が第１核酸試料と異なる生物由来の試料であ
    る請求項８５記載の方法。
91. 【請求項９１】 第２核酸試料が第１核酸試料と異なるタイプの組織由来の
    試料である請求項８５記載の方法。
92. 【請求項９２】 第２核酸試料が第１核酸試料と異なる系列の生物由来の試
    料である請求項８５記載の方法。
93. 【請求項９３】 第２核酸試料が第１核酸試料と異なる系統の生物由来の試
    料である請求項８５記載の方法。
94. 【請求項９４】 第２核酸試料が第１核酸試料と異なる細胞区画由来の試料
    である請求項８５記載の方法。
95. 【請求項９５】 核酸試料を複数のインデックス試料に分割することをさら
    に包含する請求項１記載の方法。
96. 【請求項９６】 異なるアダプター−インデクサーを各インデックス試料と
    混合する請求項９５記載の方法。
97. 【請求項９７】 異なる第２核酸開裂試薬を各インデックス試料と混合する
    請求項９５記載の方法。
98. 【請求項９８】 異なるオフセット・アダプターを各インデックス試料と混
    合する請求項９５記載の方法。
99. 【請求項９９】 異なる第１核酸開裂試薬を各インデックス試料と混合する
    請求項９５記載の方法。
100. 【請求項１００】 工程(ｄ)の前に核酸試料を複数のインデックス試料に分
     割する請求項９５記載の方法。
101. 【請求項１０１】 工程(ｃ)の前に核酸試料を複数のインデックス試料に分
     割する請求項９５記載の方法。
102. 【請求項１０２】 工程(ｂ)の前に核酸試料を複数のインデックス試料に分
     割する請求項９５記載の方法。
103. 【請求項１０３】 工程(ａ)の前に核酸試料を複数のインデックス試料に分
     割する請求項９５記載の方法。
104. 【請求項１０４】 １種またはそれ以上のインデックス試料を複数の２次イ
     ンデックス試料に分割する請求項９５記載の方法。
105. 【請求項１０５】 異なるアダプター−インデクサーを各２次インデックス
     試料と混合する請求項１０４記載の方法。
106. 【請求項１０６】 異なる第２核酸開裂試薬を各２次インデックス試料と混
     合する請求項１０４記載の方法。
107. 【請求項１０７】 異なるオフセット・アダプターを各２次インデックス試
     料と混合する請求項１０４記載の方法。
108. 【請求項１０８】 １種またはそれ以上の２次インデックス試料を複数の３
     次インデックス試料に分割する請求項１０４記載の方法。
109. 【請求項１０９】 異なるアダプター−インデクサーを各３次インデックス
     試料と混合する請求項１０８記載の方法。
110. 【請求項１１０】 異なる第２核酸開裂試薬を各３次インデックス試料と混
     合する請求項１０８記載の方法。
111. 【請求項１１１】 核酸試料を複数のインデックス試料に分割する前にバイ
     ナリー配列タグを増幅する請求項９５記載の方法。
112. 【請求項１１２】 核酸試料を複数のインデックス試料に分割した後にバイ
     ナリー配列タグを増幅する請求項９５記載の方法。
113. 【請求項１１３】 バイナリー配列タグを増幅する前に、各インデックス試
     料を希釈し、平均して、各一定分量あたり１個のバイナリーア配列タグ分子を含
     有する一定分量に分割すること、および バイナリー配列タグを増幅した後に、１種またはそれ以上のバイナリー配列タ
     グの全部または一部を配列決定すること、 をさらに包含する請求項１１２記載の方法。
114. 【請求項１１４】 工程(ｄ)の後に、 核酸試料を１種またはそれ以上の異なるヘアピン・プライマーと混合すること
     (ここで、各ヘアピン・プライマーは異なるプライマー配列を有し、各プライマ
     ー配列はアダプター−インデクサーの少なくとも１種の配列の全部または一部に
     相補的である)、 バイナリー配列タグの増幅を促進する条件下で核酸試料をインキュベートする
     こと(ここで、一方または両方の末端にヘアピン・プライマー配列を有する増幅
     したバイナリー配列タグが形成される)、 増幅したバイナリー配列タグの末端におけるヘアピン・プライマー配列による
     ヘアピン構造の形成を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすること、 核酸試料を複数のディテクター・プローブとハイブリダイズさせ、ヘアピン構
     造をプローブに共有結合させること(ここで、各プローブは異なる配列を有する)
     、および 増幅した断片の異なるディテクター・プローブへの結合を検出すること、 をさらに包含する請求項１記載の方法。
115. 【請求項１１５】 バイナリー配列タグの濃度を正規化する請求項１記載の
     方法。
116. 【請求項１１６】 バイナリー配列タグの一方の鎖を固定すること、バイナ
     リー配列タグを変性すること、豊富なバイナリー配列タグに対するｃ_０ｔ_１／２ より長く、稀なバイナリー配列タグに対するｃ_０ｔ_１／２より短い時間にわたっ
     てバイナリー配列タグを復元すること、および復元しないバイナリータグを収集
     することにより、バイナリー配列タグの濃度を正規化する請求項１１５記載の方
     法。
117. 【請求項１１７】 核酸試料中における核酸断片からバイナリー配列タグを
     生成する方法であって、 (ａ)核酸試料を１種またはそれ以上の第１核酸開裂試薬と共にインキュベート
     して、核酸断片を生成すること、 (ｂ)１種またはそれ以上の第１オフセット・アダプター鎖を核酸試料と混合し
     、第１オフセット・アダプター鎖を核酸断片に共有結合させること(ここで、結
     合後に、第１オフセット・アダプター鎖は全体または部分的に一本鎖化される)
     、 (ｃ)核酸試料を処理して、第１オフセット・アダプター鎖にハイブリダイズし
     た全体または部分的に相補的な配列を得ること、 (ｄ)核酸試料を１種またはそれ以上の第２核酸開裂試薬と共にインキュベート
     して、粘着末端を有する核酸断片を生成すること(ここで、第２核酸開裂試薬は
     それらの認識配列からオフセットした部位で開裂を行い、各第１オフセット・ア
     ダプター鎖は第２核酸開裂試薬の少なくとも１種に対する認識配列を有する)、 (ｅ)１種またはそれ以上のアダプター−インデクサーを核酸試料と混合し、ア
     ダプター−インデクサーを核酸断片に共有結合させること(ここで、各アダプタ
     ー−インデクサーは異なる粘着末端を有し、アダプター−インデクサーの各粘着
     末端は第２核酸開裂試薬により生成した粘着末端に適合する)、 を包含し、オフセット・アダプターおよびアダプター−インデクサーが結合し
     ている核酸断片がバイナリー配列タグである、方法。
118. 【請求項１１８】 第２オフセット・アダプター鎖を結合した第１オフセッ
     ト・アダプター鎖にハイブリダイズさせることにより、第１オフセット・アダプ
     ター鎖にハイブリダイズした全体または部分的に相補的な配列を得る核酸試料の
     処理を達成する請求項１１７記載の方法。
119. 【請求項１１９】 第２オフセット・アダプター鎖を核酸断片に共有結合さ
     せることをさらに包含する請求項１１８記載の方法。
120. 【請求項１２０】 第１オフセット・アダプター鎖の一本鎖部分に充填する
     ことにより、第１オフセット・アダプター鎖にハイブリダイズした全体または部
     分的に相補的な配列を得る核酸試料の処理を達成する請求項１１７記載の方法。
121. 【請求項１２１】 核酸試料中における核酸断片からバイナリー配列タグを
     生成する方法であって、 (ａ)核酸試料を１種またはそれ以上の第１核酸開裂試薬と共にインキュベート
     して、核酸断片を生成すること、 (ｂ)１種またはそれ以上のオフセット・アダプターを核酸試料と混合し、オフ
     セット・アダプターを核酸断片に共有結合させること、 (ｄ)核酸試料を１種またはそれ以上の第２核酸開裂試薬と共にインキュベート
     して、粘着末端を有する核酸断片を生成すること(ここで、第２核酸開裂試薬は
     それらの認識配列からオフセットした部位で開裂を行い、各第１オフセット・ア
     ダプター鎖は第２核酸開裂試薬の少なくとも１種に対する認識配列を有する)、 (ｅ)１種またはそれ以上の第１アダプター−インデクサー鎖を核酸試料と混合
     し、第１アダプター−インデクサー鎖を核酸断片に共有結合させること(ここで
     、各第１アダプター−インデクサー鎖は異なる末端配列を有し、第１アダプター
     −インデクサー鎖の各末端配列は第２核酸開裂試薬により生成した粘着末端に適
     合し、結合後に、第１アダプター−インデクサー鎖は全体または部分的に一本鎖
     化される)、 を包含し、オフセット・アダプターおよび第１アダプター−インデクサー鎖が
     結合している核酸断片がバイナリー配列タグである、方法。
122. 【請求項１２２】 核酸試料を処理して、第１アダプター−インデクサー鎖
     にハイブリダイズした全体または部分的に相補的な配列を得ることをさらに包含
     する請求項１２１記載の方法。
123. 【請求項１２３】 第２アダプター−インデクサー鎖を結合した第１アダプ
     ター−インデクサー鎖にハイブリダイズさせることにより、第１アダプター−イ
     ンデクサー鎖にハイブリダイズした全体または部分的に相補的な配列を得る核酸
     試料の処理を達成する請求項１２２記載の方法。
124. 【請求項１２４】 第２アダプター−インデクサー鎖を核酸断片に共有結合
     させることをさらに包含する請求項１２３記載の方法。
125. 【請求項１２５】 第１アダプター−インデクサー鎖の一本鎖部分に充填す
     ることにより、第１アダプター−インデクサー鎖にハイブリダイズした全体また
     は部分的に相補的な配列を得る核酸試料の処理を達成する請求項１２２記載の方
     法。
126. 【請求項１２６】 核酸試料中における核酸断片からバイナリー配列タグを
     生成する方法であって、 (ａ)核酸試料を１種またはそれ以上の第１核酸開裂試薬と共にインキュベート
     して、核酸断片を生成すること、 (ｂ)１種またはそれ以上の第１オフセット・アダプター鎖を核酸試料と混合し
     、第１オフセット・アダプター鎖を核酸断片に共有結合させること(ここで、結
     合後に、第１オフセット・アダプター鎖は全体または部分的に一本鎖化される)
     、 (ｃ)核酸試料を処理して、第１オフセット・アダプター鎖にハイブリダイズし
     た全体または部分的に相補的な配列を得ること、 (ｄ)核酸試料を１種またはそれ以上の第２核酸開裂試薬と共にインキュベート
     して、粘着末端を有する核酸断片を生成すること(ここで、第２核酸開裂試薬は
     それらの認識配列からオフセットした部位で開裂を行い、各第１オフセット・ア
     ダプター鎖は第２核酸開裂試薬の少なくとも１種に対する認識配列を有する)、 (ｅ)１種またはそれ以上の第１アダプター−インデクサー鎖を核酸試料と混合
     し、第１アダプター−インデクサー鎖を核酸断片に共有結合させること(ここで
     、各第１アダプター−インデクサー鎖は異なる末端配列を有し、第１アダプター
     −インデクサー鎖の各末端配列は第２核酸開裂試薬により生成した粘着末端に適
     合し、結合後に、第１アダプター−インデクサー鎖は全体または部分的に一本鎖
     化される)、 を包含し、オフセット・アダプターおよびアダプター−インデクサーが結合し
     ている核酸断片がバイナリー配列タグである、方法。