JP7078946B2 - ゲノム編集方法 - Google Patents
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Description
を含むドナーDNAをさらに組み合わせることにより、ゲノムDNAの塩基配列の置換や欠失等を起こすことも可能である。
列以外の配列にも結合し、意図しないゲノム編集を引き起こすこともある(オフターゲット効果)。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列、又は
からなる、一本鎖ポリヌクレオチドを細胞に導入するだけで、前記改変塩基配列において前記任意塩基配列が欠失していた場合(図1)はその欠失がゲノム内で起こり、また前記改変塩基配列において前記任意配列が挿入していた場合(図2)はその挿入がゲノム内で起こり、さらに前記改変塩基配列において前記任意塩基配列が置換していた場合(図3)はその置換がゲノム内で起こることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
項1.
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1
種を細胞又は生物に導入する工程を含む、ゲノム編集方法。
前記一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を合成する工程を含む、項1に記載のゲノム編集方法。
さらに、ゲノム編集された細胞又は生物を回収する工程を含む、項1又は2に記載のゲノム編集方法。
さらに、ゲノム編集された細胞又は生物を選別する工程を含む、項1~3のいずれかに記載のゲノム編集方法。
ヌクレアーゼ、ガイドRNA、及びそれらの発現ベクターからなる群より選択される少なく
とも1種を導入する工程を含まない、項1~4のいずれかに記載のゲノム編集方法。
項6.
前記改変塩基配列の塩基数が80~1000である、項1~5のいずれかに記載のゲノム編集方法。
前記改変塩基配列の塩基数が90~300である、項1~6のいずれかに記載のゲノム編集方
法。
欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の塩基数が1~920である、項1~7のいずれかに記載のゲノム編集方法。
前記改変塩基配列の塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の塩基数の比が10以下である、項1~8のいずれかに記載のゲノム編集方法。
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’
末端の塩基までの塩基数の比が、0.2~5である、項1~9のいずれかに記載のゲノム編集方法。
前記一本鎖ポリヌクレオチドが一本鎖DNA又は一本鎖RNAである、項1~10のいずれかに
記載のゲノム編集方法。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1
種を含有する、ゲノム編集用組成物。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1
種を含有する、ゲノム編集用キット。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1
種を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記
任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド。
項15に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの発現カセットを含有する、発現ベクター。
導入するだけで、簡便にゲノム編集を行うことができる。このゲノム編集技術は、編集対象部位を選択する自由度がより高く、さらに目的の変異以外の意図しない変異の確率がより低減されている。また、一本鎖ポリヌクレオチドの塩基数をより多くすることにより、オフターゲット効果をより低減することも可能である。
ノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、そ
れらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは
、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST(KarlinS,Altschul SF.“Methods for
assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA.87:2264-2268(1990)、KarlinS,Altschul SF.“Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.”Proc Natl Acad Sci USA.90:5873-7(1993))を用いて決
定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開
発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information(NCBI)のウェエブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を参照すればよい。
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列、又は
(ii)前記改変塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列(ただし、前記センス鎖塩基配列と同一の塩基配列は除く)
からなる、一本鎖ポリヌクレオチド(本明細書において、「本発明の一本鎖ポリヌクレオチド」と示すこともある。)、及び本発明の一本鎖ポリヌクレオチドやその発現ベクター(本明細書において、「本発明の発現ベクター」と示すこともある。)を利用したゲノム編集用組成物、ゲノム編集用キット、ゲノム編集方法、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法等に関する。
において重なり合ってなる式:X-Y-X-Y-X[式中、X及びYは塩基数が1以上の異なる塩基配列を示す。]で示される塩基配列(本明細書において、「PODiR(Partially Overlapped Direct Repeat)配列」と示す場合もある。)中の重なっていない配列(X-Y)が欠失するという法則が存在することを報告している(特許文献2)。また、ゲノム中のX-Y-Xとい
う配列の5’側に隣接してX-Yで示される塩基配列が挿入され、PODiR配列が創出されると
いう法則が存在することも報告している(特許文献2)。さらに、本発明者は、これらの法則が、真核細胞においても保存されていることも見出している。
配列が欠失したmRNAが生成されてしまうという現象を見出した(現象2)。
含むDNAと相互作用(例えばハイブリダイズ)し、その結果できた、相互作用できない余
分な部位(ゲノムDNAのX-Y)が、何らかの酵素によって切断されるために起こるのではないかと推察した。さらに、本発明者は、ゲノム中のX-Y-Xという配列の5’側に隣接してX-Yで示される塩基配列が挿入されてPODiR配列が創出されるのは(現象1)、PODiR配列を有するmRNAがゲノム中のX-Y-Xという配列(非PODiR配列)を含むDNAと相互作用(例えばハ
イブリダイズ)し、その結果できた、相互作用できない余分な部位(mRNAのX-Y)の塩基
配列が、DNA複製時等にゲノムDNA中に挿入されるために起こるのではないかと推察した。
ド、つまりゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列(図1の部位(a))に対して任意塩基配列(図1の部位(c))が欠失してなる改変塩基配列(図1の部位(b))からなる一本鎖ポリヌクレオチドを人為的に導入すれば、ゲノムDNAと相互作用(例えばハイブリダイズ
)し、その結果できた、相互作用できない余分な部位(一本鎖ポリヌクレオチドにおいて欠失している、ゲノムDNA中の任意塩基配列:図1の部位(c))が、何らかの酵素によって切断されるのではないかという着想に至った(図1)。さらに、本発明者は、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列(図2の部位(a))に対して任意塩基配列(図2の部位(c
))が挿入してなる改変塩基配列(図2の部位(b))からなる一本鎖ポリヌクレオチド
を人為的に導入すれば、ゲノムDNAと相互作用(例えばハイブリダイズ)し、その結果で
きた、相互作用できない余分な部位(一本鎖ポリヌクレオチドにおいて挿入している任意塩基配列:図2の部位(c)))の塩基配列が、DNA複製時等にゲノムDNA中に挿入される
のではないかという着想に至った(図2)。またさらに、本発明者は、ゲノムDNAの任意
のセンス鎖塩基配列(図3の部位(a))に対して任意塩基配列(図3の部位(c))が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列(図3の部位(b))からなる一本鎖ポリヌクレ
オチドを人為的に導入すれば、ゲノムDNAと相互作用(例えばハイブリダイズ)し、その
結果できた、相互作用できない余分な部位(一本鎖ポリヌクレオチドにおける置換後の部位)の塩基配列が、DNA複製時等により、ゲノムDNA中にも反映されるのではないかと推察した(図3)。
きる。
失したい配列がハイブリダイズできずに「おでき(図1の部位(c))」のようにはみ出
してしまうような一本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。すなわち、図4の下段に示されるように、ゲノムDNA内の欠失したい配列の両側の配列(図1の部位(d)及び(e)に
相当)を連結してなる配列からなる一本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。
す。ある配列をゲノムDNAの特定部位に挿入したい場合(図5の上段)は、ゲノムDNAとハイブリダイズした時に、挿入したい配列がハイブリダイズできずに「おでき(図2の部位(c))」のようにはみ出してしまうような一本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。す
なわち、図5の下段に示されるように、ゲノムDNA内の挿入したい部位の両側の配列(図
2の部位(d)及び(e)に相当)の間に、挿入したい配列が挟まれてなる配列からなる一本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。
図6に示す。ゲノムDNA内のある配列を別の他の配列に置換したい(図6の上段)は、ゲ
ノムDNAとハイブリダイズした時に、ゲノムDNA内のある配列と(置換したい配列=置換される配列)と他の配列(置換する配列)がハイブリダイズできずに「おでき(図3の部位(c))」のようにはみ出してしまうような一本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。す
なわち、図6の下段に示されるように、置換したい配列の両側の配列(図3の部位(d)
及び(e)に相当)の間に、所望の配列(=他の配列)が挟まれてなる配列からなる一本
鎖ポリヌクレオチドをデザインする。
することができる:
A)センス鎖配列上の(ia)欠失させる配列の直前と直後の塩基、(ib)挿入させる箇所の連続した2つの塩基(直前と直後の塩基)、及び(ic)置換させる配列の直前と直後
の塩基を特定し、
B)欠失/挿入/置換の対象のとなる塩基を特定し(欠失の場合は、ヌル)、
C)上記B)で特定された塩基の上流に、センス鎖上の該直前の塩基の上流側X塩基を
、イの塩基の下流にセンス鎖上の該直前の塩基の下流側X塩基を、配置する。
る塩基数、3.置換により除去/導入する塩基のうち長いほうの数である。
基の下流側X塩基は、改変されると意図しないゲノム編集が起きるので好ましくない。
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドは、
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列、又は
(ii)前記改変塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列
からなる、一本鎖ポリヌクレオチドである。
ても起こることが見出されている。)が起こる細胞及び生物であれば、本発明のゲノム編集が可能である。
胞等が挙げられる。
の鋳型にならない方のDNA鎖である。センス鎖は、好ましくはコード領域のセンス鎖であ
る。「コード領域」には、タンパク質のコード領域に限定されず、タンパク質をコードしないRNA(例えば、miRNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、gRNA、SRP RNA、pRNA、tncRNA、sbRNA、snlRNA、SLRNA等)のコード領域も包含する。
りさらに好ましくは80~600、よりさらに好ましくは90~300、特に好ましくは95~200程
度である。
変塩基配列」(図1の部位(b))とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して、該センス鎖塩基配列内の任意の塩基配列が欠失してなる塩基配列である。なお、ここでいう「欠失」とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列の内部が除かれることであり、該
センス鎖塩基配列の末端を含む部位が除かれることではない。つまり、改変塩基配列においては、5’端及び3’端の両方において、改変の元となったセンス鎖塩基配列由来の配列が残っている。換言すれば、改変塩基配列は、5’端及び3’端の両方において、改変の元となったセンス鎖塩基配列由来の配列を有する。なお、上記「任意の塩基配列」は、連続する1つの塩基配列である。
配列」(図2の部位(b))とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して、任意の塩基配列が挿入してなる塩基配列である。なお、ここでいう「挿入」とは、ゲノムDNAの
任意のセンス鎖塩基配列の内部に任意塩基配列が挿入されることであり、該センス鎖塩基配列の末端に任意塩基配列が付加されることではない。つまり、改変塩基配列においては、5’端及び3’端の両方において、改変の元となったセンス鎖塩基配列由来の配列が残っている。換言すれば、改変塩基配列は、5’端及び3’端の両方において、改変の元となったセンス鎖塩基配列由来の配列を有する。なお、上記「任意の塩基配列」は、連続する1
つの塩基配列である。
は60~1000、よりさらに好ましくは80~1000、よりさらに好ましくは80~600、よりさら
に好ましくは90~300、特に好ましくは95~200程度である。
置換してなる改変塩基配列」(図3の部位(b))とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して、該センス鎖塩基配列内の任意の塩基配列が他の塩基配列に置換してなる塩基配列である。なお、ここでいう「置換」とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列の
内部が置換することであり、該センス鎖塩基配列の末端を含む部位が置換することではない。つまり、改変塩基配列においては、5’端及び3’端の両方において、改変の元となったセンス鎖塩基配列由来の配列が残っている。換言すれば、改変塩基配列は、5’端及び3’端の両方において、改変の元となったセンス鎖塩基配列由来の配列を有する。また、「他の塩基配列」は、置換対象の塩基配列と異なる塩基配列であれば特に制限されず、例えば置換対象の塩基配列との同一性が0~50%、0~20%、0~10%、0~5%の塩基配列であ
る。なお、上記「任意の塩基配列」は、連続する1つの塩基配列である。
は60~1000、よりさらに好ましくは80~1000、よりさらに好ましくは80~600、よりさら
に好ましくは90~300、特に好ましくは95~200程度である。
により、ゲノム内で欠失、挿入、又は置換させる対象となる塩基配列であり、その配列は特に制限されない。欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」の塩基数は、特に制限されないが、例えば1~10000、好ましくは1~1000、より好ましくは1~920、さらに好まし
くは2~500、よりさらに好ましくは4~200、よりさらに好ましくは4~100、よりさらに好ましは5~50、よりさらに好ましくは6~20、よりさらに好ましくは7~12、よりさらに好
ましくは8~9である。
する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の塩基数の比(部位(c)の塩基数/部位(b)の塩基数)は、特に制限されないが、例えば500以下、好ましくは100以下、より好
ましくは10以下、さらに好ましくは5以下、よりさらに好ましくは2以下、よりさらに好ましくは1以下である。該比の下限値は特に制限されないが、例えば0.01、0.02、0.04等で
ある。
ら、欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基まで(図1~3の(d))の塩基数は、特に制限されないが、例えば10~1000、好ましくは20~1000、より好ましくは30~500、さらに好ましくは40~300、よ
りさらに好ましくは40~100、特に好ましくは40~70程度である。
))の3’末端の塩基まで(図1~3の(e))の塩基数は、特に制限されないが、例えば10~1000、好ましくは20~1000、より好ましくは30~500、さらに好ましくは40~300、よりさらに好ましくは40~100、特に好ましくは40~70程度である。
「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1~3の部位(a))の5’末端の塩基から
、欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基まで(図1~3の(d))の塩基数と、
欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1~3の部位(a)
)の3’末端の塩基まで(図1~3の(e))の塩基数
の両方或いは少なくとも一方が、例えば10~1000、好ましくは20~1000、より好ましくは30~500、さらに好ましくは40~300、よりさらに好ましくは40~100、特に好ましくは40
~70程度である。
ら、欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基まで(図1~3の(d))の塩基数に対する、
欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1~3の部位(a)
)の3’末端の塩基まで(図1~3の(e))の塩基数の比(部位(e)の塩基数/部位(d)の塩基数)は、
特に制限されないが、例えば0.01~100、好ましくは0.1~10、より好ましくは0.2~5、さらに好ましくは0.5~2である。
すと考えられる。この観点から、本発明の一本鎖ポリヌクレオチド(図1~3の(b))
は、「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1~3の部位(a))と、ゲノム編集対象細胞内において相互作用(例えばハイブリダイズ)可能であることが望ましい。具体的には、例えばストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。ストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、プローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができ
る。かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃
」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗
浄条件を挙げることができる。
り強力に相互作用(例えばハイブリダイズ)可能であるという観点から、好ましくはRNA
である。
りにおいて、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基(ホスフェート)を、例えば、ホスホロチオエート(PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖(リボース)の2位の水酸基を、-OR(Rは、例えばCH3(2’-O-Me)、CH2CH2OCH3(2’-O-MOE
)、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す)に置換してもよい。さらに、塩基部分(ピリミジン、プリン)に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5
位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニ
ルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2’酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA(LNA)等もまた、好ましく用いられ得る。
本発明の発現ベクターは、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの発現カセットを含有する発現ベクターである。
が挙げられる。
側に(好ましくは隣接して)、MCSが配置されている態様が挙げられる。MCSは複数(例えば2~50、好ましくは2~20、より好ましくは2~10)個の制限酵素サイトを含むものであ
れば特に制限されない。
ては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドをゲノム編集対象細胞又はゲノム編集対象非ヒト生物に導入する工程を含む方法により、これらの細胞又は生物のゲノムを編集すること、より具体的には、一本鎖ポリヌクレオチドにおいてゲノムDNA中の任意塩基配列が欠失してい
る場合(図1)は、その欠失をゲノム内で起こすことができ、また一本鎖ポリヌクレオチドにおいて任意塩基配列が挿入している場合(図2)は、その挿入をゲノム内で起こすことができ、さらに一本鎖ポリヌクレオチドにおいて任意塩基配列が置換している場合(図3)は、その置換をゲノム内で起こすことができる。
ノ粒子媒介性トランスフェクション、ウイルス媒介性核酸送達等が挙げられる。
失している場合(図1)は、その欠失がゲノム内で起きた、また一本鎖ポリヌクレオチドにおいて任意塩基配列が挿入している場合(図2)は、その挿入がゲノム内で起きた、さらに一本鎖ポリヌクレオチドにおいて任意塩基配列が置換している場合(図3)は、その置換がゲノム内で起きた)細胞又は非ヒト生物を得ることができる。
を含むこともある。また、該合成工程の前に、さらに本発明の一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種の配列を設計する工程を
含むこともある。
ない、或いは起こったとしても極めてわずかである。特に、CRISPR/Casシステムに比べると、このような意図しない変異を遥かに低減することが可能である。
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドは、ゲノム編集用組成物として利用することもできるし、或いはキットとして利用することもできる。
緑膿菌のmexR遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配列が欠失又は挿入してなる塩基配列(配列番号1~6)からなる一本鎖DNAを、DNA合成受託会社(macrogen)にて合成した。これらの一本鎖DNAの各部位の塩基数を表1に示す。
表1中、パターン及び(a)~(e)は、図1及び図2のパターン及び(a)~(e)に対応する。
」は一本鎖DNAにおいて欠失している塩基を示し、「 }」はゲノムDNA配列に対して挿入
した配列及び挿入位置を示す。
こると、該遺伝子から発現するタンパク質はmexRタンパク質本来の活性(MexAB-OprM薬剤排出ポンプの発現抑制活性)が損なわれることとなり、緑膿菌の薬剤耐性能が高まるので、薬剤含有培地で生育する菌数(コロニー数)が増加することが予想される。
振盪培養した。得られた培養液を、アズトレオナム含有LB寒天培地上にプレーティングし、37℃で2日間培養した。培養後、コロニー数をカウントし、一本鎖DNAの代わりに水を添加した場合(コントロール)のコロニー数に対する、一本鎖DNAを添加した場合のコロニ
ー数の相対値(コロニー数相対値)を算出した。さらに、任意の10個のコロニーをピックアップしてシークエンシングを行い、目的の変異(パターン1の場合は部分(c)の欠失、パターン2の場合は部分(d)と部分(e)の間に部分(c)の挿入)が起こっているコロニーの割合を算出した。結果を表2に示す。
入)が起こっていた。また、コロニー数相対値から、一本鎖DNAの長さがより長い方が、
目的の変異の導入効率がより高まることが示唆された。
でも、自然に発生する変異(部分(c)の欠失又は挿入とは異なる変異(点変異等))に
より、薬剤耐性がある程度向上していたためであることが明らかとなった。表2に示されるように、109R-1を用いた場合であっても目的の変異を起こすことができた。
緑膿菌のmexR遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配列が欠失してなる塩基配列(配列番号7)からなる一本鎖DNAを、DNA合成受託会社(macrogen)にて合成した。この一本鎖DNAの各部位の塩基数を表3に示す。表3中、パターン及び(a)~(e)は、図1及び図2のパターン及び(a)~(e)に対応する。
た10個のコロニー中、2個のコロニーで目的の変異((c)の欠失)が導入できていた。
下記(A)~(D)の一本鎖DNA:を、DNA合成受託会社(FASMAC)にて合成した。(A)
緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配列が欠失してなる塩基配列(配列番号8~9)からなる一本鎖DNA、
(B)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のアンチセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部
の任意塩基配列が欠失してなる塩基配列(配列番号10~11)からなる一本鎖DNA((A)のアンチセンス鎖)、
(C)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列(配列番号12~13)からなる一本
鎖DNA((A)の、欠失前の配列)、
(D)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のアンチセンス鎖塩基配列(配列番号14~15)からな
る一本鎖DNA((B)の、欠失前の配列)。
)は、図1及び図2のパターン及び(a)~(e)に対応しており、sはセンス鎖を示し、aはアンチセンス鎖を示す。
起こると、該遺伝子から活性型mexTタンパク質が発現し、これによりMexEF-OprM薬剤排出ポンプの発現が増強されて、緑膿菌の薬剤耐性能が高まるので、薬剤含有培地で生育する菌数(コロニー数)が増加することとなる。
。結果を表5及び表6に示す。
任意塩基配列が欠失してなる塩基配列からなる一本鎖DNAを用いた場合のみ、コロニー数
相対値が大きく増加していた。これは、(A)の一本鎖DNAを用いた場合のみ、ゲノムにおいて目的の変異が起こっていたことを示唆する。以上より、ゲノムにおいて目的の変異を起こすには、一本鎖DNAの塩基配列は、ゲノムのセンス鎖塩基配列に基づく配列であるこ
とが重要であることが示された。
緑膿菌のmexR遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配列が挿入してなる塩基配列(配列番号5、6及び16~21)からなる一本鎖DNAを、DNA合成受託会社(macrogen)にて合成した。これらの一本鎖DNAは、長さ、、挿入される塩基配
列等が異なる関係にある。これらの一本鎖DNAの各部位の塩基数を表7に示す。表7中、
パターン及び(a)~(e)は、図1及び図2のパターン及び(a)~(e)に対応する。
れのコロニーから抽出したDNAを鋳型として、挿入が予想される部位を挟むように配置さ
れたプライマーセットでPCRを行った。得られたPCR産物の電気泳動像より、バンドの位置が高分子側にシフトしているサンプル(すなわち、部分(c)の挿入が起こっていると予
想されるサンプル)の割合を算出した。さらにシークエンシングで確認し、部分(c)の
挿入が起こっているサンプルの割合を求めた。その結果を表8に示す。なお、PCRにより
算出された割合と、シークエンシングにより確認された割合は、ほぼ同じであった。
において目的の変異(部分(c)の挿入)が起こっていた。
pMMB67EHベクターのプロモーター下流に位置するMCSのEcoR IサイトとHind IIIサイト
を制限酵素で切断し、そこへ、野生型mexS遺伝子ORF全長に対して一部の塩基配列が欠失
してなる塩基配列(mexS遺伝子欠失体配列:配列番号22~24)を含むDNA断片を挿入した
。得られたベクターの名称、挿入されたmexS遺伝子欠失体配列の配列番号、及びmexS遺伝子欠失体配列における欠失部位(野生型mexS遺伝子ORFの5’末端の塩基を1番目の塩基と
する)を表9に示す。
の水に懸濁し、得られた懸濁液をLB培地(lennox)5 mLに添加し、37℃で17時間、振盪培養した。得られた培養液をクロラムフェニコール含有LB寒天培地上にプレーティングし、37℃で1日間培養した。コロニー数をカウントし、野生型緑膿菌を用いた場合のコロニー
数に対する、ベクターが導入された緑膿菌を用いた場合のコロニー数の相対値(コロニー数相対値)を算出した。独立の実験で算出されたコロニー数相対値それぞれを表10に示す。
ある場合は、特に顕著にコロニー数が増加した。このことから、mexS遺伝子欠失体配列が挿入されたベクターの導入により、目的の変異(ベクター内のmexS遺伝子欠失体において欠失させている部位が、緑膿菌ゲノムのmexS遺伝子内において欠失すること)が起こることが示唆された。
GFPのコード配列内に8塩基を挿入してなる改変GFPの発現カセットが導入されたHEK293T細胞(アッセイ細胞)を作製した。該改変GFPは、8塩基の挿入により読み枠がずれているので、翻訳後のタンパク質が不活性型となり、蛍光を示さない。改変GFPのコード配列(
配列番号25)を図8に示す。
の染色体にランダムに挿入されるpCDH-CMV-EGFP-nonPOD-RFP+Puro)を混合し、HEK293Tと混和し、培地に0.5 ng/μlのピューロマイシンを含む培地で培養し、細胞にpCDH-CMV-EGFP-nonPOD-RFP+Puroベクターが挿入された細胞集団を濃縮した。この細胞集団をアッセイ
細胞とした。
表11中、パターン及び(a)~(e)は、図1のパターン及び(a)~(e)に対応する。
塩基の欠失が起こると、正常なGFPタンパク質が発現することになるので、細胞の蛍光が
観察されると予想される。
1.使用前にFuGENE HD Transfection Reagentを室温に戻した。
2.転倒混和またはボルテックスにより混和した。(誤って凍結させ、沈殿が生じた場合は37°Cで短時間温め、沈殿を融解させた後、室温に戻した。
1. 滅菌チューブに、あらかじめ室温にしたopti-MEM培地672μlを加えた。一本鎖DNA溶
液を14μg加え、ボルテックスで混和した。そこへ、FuGENE HD Transfection Reagentを43μl加え、すばやく混合し、FuGENE HD Transfection Reagent/DNA混合液を作成した。
2. FuGENE HD Transfection Reagent/DNA混合液を、室温で10分間インキュベートした。3. アッセイ細胞が増殖しているプレートに 325μLのFuGENE HD Transfection Reagent/DNA混合液を加え、優しく混和し、細胞をインキュベータに戻して4日間培養し、それを10cmディッシュに植え継ぎ、さらに3日間インキュベートした。
4. 培養後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
蛍光観察像を図9に示す。図9に示されるように、蛍光を発する細胞集団が観察された。
5. 目視で発色した細胞集団を検出・回収し、そこからDNAを抽出し、目的の意図したゲ
ノム編集が起きていることを、次世代sequencer、もしくは、sanger法による塩基配列の
決定により確認した。
Claims (16)
- 1本鎖形態のDNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列(但し、挿入される任意塩基配列が4塩基長である場合を除く)
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80~200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5'末端の塩基から、挿入する前記任意塩基配列の最も5'側の塩基の5'側隣の塩基までの塩基数、及び挿入する前記任意塩基配列の最も3'側の塩基の3'側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3'末端の塩基までの塩基数が、30~100である、
前記一本鎖形態のDNAを単離されたヒト細胞(但し、MSH2欠損細胞、ミスマッチ修復(MMR)欠損細胞、ヒト配偶子およびヒト受精卵を除く)に導入する工程を含み、これにより、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が、(ib)の改変塩基配列に置き換わり、
上記工程においてヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方を用いず、かつ、ソラレンを用いず、
その後、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が改変塩基配列に置き換わったヒト細胞を選別して取得する工程をさらに含む、
ゲノム編集方法。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の水素を-O-メチル、または-O-CH2CH2OCH3に置き換える修飾を含む、
請求項1に記載のゲノム編集方法。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の炭素と4位の炭素とを架橋し、リボースのコンフォメーションをN型に固定する修飾を含む、
請求項1に記載のゲノム編集方法。 - 前記センス鎖塩基配列の5'末端の塩基から、挿入する前記任意塩基配列の最も5'側の塩基の5'側隣の塩基までの塩基数に対する、挿入する前記任意塩基配列の最も3'側の塩基の3'側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3'末端の塩基までの塩基数の比が、0.2~5である、請求項1~3のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 一本鎖形態のDNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列(但し、挿入される任意塩基配列が4塩基長である場合を除く)
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80~200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5'末端の塩基から、挿入する前記任意塩基配列の最も5'側の塩基の5'側隣の塩基までの塩基数、及び挿入する前記任意塩基配列の最も3'側の塩基の3'側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3'末端の塩基までの塩基数が、30~100である、
前記一本鎖形態のDNAを含有し、かつ、
ヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方と一緒に用いられず、かつ、ソラレンとも一緒に用いられず、
前記一本鎖形態のDNAをヒト細胞(但し、MSH2欠損細胞でもミスマッチ修復(MMR)欠損細胞でもない)に導入するように用いられる、
ヒト細胞またはヒトのゲノム編集用組成物。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の水素を-O-メチル、または-O-CH 2 CH 2 OCH 3 に置き換える修飾を含む、
請求項5に記載のゲノム編集用組成物。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の炭素と4位の炭素とを架橋し、リボースのコンフォメーションをN型に固定する修飾を含む、
請求項5に記載のゲノム編集用組成物。 - 前記センス鎖塩基配列の5'末端の塩基から、挿入する前記任意塩基配列の最も5'側の塩基の5'側隣の塩基までの塩基数に対する、挿入する前記任意塩基配列の最も3'側の塩基の3'側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3'末端の塩基までの塩基数の比が、0.2~5である、請求項5~7のいずれかに記載のゲノム編集用組成物。
- 一本鎖形態のDNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列(但し、挿入される任意塩基配列が4塩基長である場合を除く)
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80~200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5'末端の塩基から、挿入する前記任意塩基配列の最も5'側の塩基の5'側隣の塩基までの塩基数、及び挿入する前記任意塩基配列の最も3'側の塩基の3'側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3'末端の塩基までの塩基数が、30~100である、
前記一本鎖形態のDNAを含有し、かつ、
ヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方と一緒に用いられず、かつ、ソラレンとも一緒に用いられず、
前記一本鎖形態のDNAをヒト細胞(但し、MSH2欠損細胞でもミスマッチ修復(MMR)欠損細胞でもない)に導入するように用いられる、
ヒト細胞またはヒトのゲノム編集用キット。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の水素を-O-メチル、または-O-CH 2 CH 2 OCH 3 に置き換える修飾を含む、
請求項9に記載のゲノム編集用キット。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の炭素と4位の炭素とを架橋し、リボースのコンフォメーションをN型に固定する修飾を含む、
請求項9に記載のゲノム編集用キット。 - 前記センス鎖塩基配列の5'末端の塩基から、挿入する前記任意塩基配列の最も5'側の塩基の5'側隣の塩基までの塩基数に対する、挿入する前記任意塩基配列の最も3'側の塩基の3'側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3'末端の塩基までの塩基数の比が、0.2~5である、請求項9~11のいずれかに記載のゲノム編集用キット。
- 一本鎖形態のDNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列(但し、挿入される任意塩基配列が4塩基長である場合を除く)
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80~200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5'末端の塩基から、挿入する前記任意塩基配列の最も5'側の塩基の5'側隣の塩基までの塩基数、及び挿入する前記任意塩基配列の最も3'側の塩基の3'側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3'末端の塩基までの塩基数が、30~100である、
前記一本鎖形態のDNAを単離されたヒト細胞(但し、MSH2欠損細胞、ミスマッチ修復(MMR)欠損細胞、ヒト配偶子およびヒト受精卵を除く)に導入する工程を含み、これにより、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が、(ib)の改変塩基配列に置き換わり、
上記工程においてヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方を用いず、かつ、ソラレンを用いず、
その後、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が改変塩基配列に置き換わったヒト細胞を選別して取得する工程をさらに含む、
ゲノム編集されたヒト細胞の製造方法。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の水素を-O-メチル、または-O-CH 2 CH 2 OCH 3 に置き換える修飾を含む、
請求項13に記載の製造方法。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の炭素と4位の炭素とを架橋し、リボースのコンフォメーションをN型に固定する修飾を含む、
請求項13に記載の製造方法。 - 前記センス鎖塩基配列の5'末端の塩基から、挿入する前記任意塩基配列の最も5'側の塩基の5'側隣の塩基までの塩基数に対する、挿入する前記任意塩基配列の最も3'側の塩基の3'側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3'末端の塩基までの塩基数の比が、0.2~5である、請求項13~15のいずれかに記載の製造方法。
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