WO2021186913A1 - ゲノムｄｎａのメチル化状態を改変する方法 - Google Patents

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dna
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stranded dna
gene
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博寿 遠藤
石根 鈴木
善博 白岩
間世田　英明
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国立大学法人筑波大学
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the present invention relates to a method of modifying the methylation state of genomic DNA and a method of suppressing gene expression using single-stranded DNA.
  • RNAi RNA-directed DNA Methylation
  • Non-Patent Documents 3 to 5 have also been reported.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide a method for easily and efficiently modifying the methylated state of genomic DNA. A further object of the present invention is to provide a method for simply and efficiently suppressing the expression of a specific gene through modification of the methylated state.
  • the present inventors simply introduce a single-stranded DNA having a base sequence homologous to the base sequence of the target DNA region into a cell, and the genomic DNA of the target DNA region is obtained. It was found that it is possible to modify the methylation state of. In addition, the present inventors modify the methylation state around the gene region by introducing single-stranded DNA having a base sequence homologous to the base sequence of the sense strand of a specific gene into cells for a long period of time. Over the years, they have found that it is possible to specifically and remarkably suppress the expression of the gene, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following aspects in more detail.
  • a method for modifying the methylation state of genomic DNA in which a single-stranded DNA having a base sequence homologous to the base sequence of a DNA region desired to modify the methylation state on the genomic DNA is introduced into a cell.
  • a composition for producing a cell in which the expression of a gene in the genomic DNA is suppressed which comprises a single-stranded DNA having a base sequence homologous to the base sequence of the sense strand of the gene whose expression is to be suppressed on the genomic DNA.
  • a kit for producing a cell in which the expression of a gene in the genomic DNA is suppressed, which comprises a single-stranded DNA having a base sequence homologous to the base sequence of the sense strand of the gene whose expression is to be suppressed on the genomic DNA.
  • a simple operation of introducing a single-stranded DNA having a certain length into a cell modifies the methylation state of the base of the target DNA region, and accordingly, the expression of a specific gene is expressed. It becomes possible to suppress it efficiently. Since the method of the present invention is not a specific polymerase-dependent method such as RdDM-dependent epigenetic editing, it can be applied to a wide range of species. Further, as compared with the method using a base recognition protein, it is possible to modify the methylation state of a plurality of bases at a time over a wide range.
  • Region 1 It is a figure which shows the result of having analyzed the methylation state in the region (region 1) containing the promoter and the 5'end of an open reading frame (ORF) in a haptophyte whose fluorescence was abolished by the introduction of ssDNA1 or ssDNA2.
  • Region 1 had 80 cytosine bases, and the bases whose methylation status was changed as compared with the wild type (WT) were extracted from them.
  • the numbers in the box indicate the percentage of methylated cytosine. Percentage of methylated cytosine: 0-35%: white, 35-70%: gray, 70-100%: black.
  • Region 2 shows the result of having analyzed the methylation state in the ORF region (region 2) where the single-stranded DNA was designed in the haptophyte whose fluorescence disappeared by the introduction of ssDNA1 or ssDNA2.
  • Region 2 had 91 cytosine bases, and the bases whose methylation status was changed as compared with the wild type (WT) were extracted from them.
  • the numbers in the box indicate the percentage of methylated cytosine. Percentage of methylated cytosine: 0-35%: white, 35-70%: gray, 70-100%: black. It is a graph which shows the result of having analyzed the correlation between the introduction amount of ssDNA2 and the expression suppression efficiency.
  • the present invention provides a method for modifying the methylation state of genomic DNA.
  • the method of the present invention is characterized in that a single-stranded DNA having a base sequence homologous to the base sequence of a DNA region (target genomic DNA region) whose methylation state is desired to be modified on genomic DNA is introduced into a cell. do.
  • Method of genomic DNA is a chemical reaction in which a methyl group modification is added to a carbon atom of a base in genomic DNA, and in the present invention, it is mainly methylated to the 5-carbon atom of the pyrimidine ring of cytosine. Addition of a group.
  • the "modification of the methylated state” in the present invention includes both an increase and a decrease (demethylation) of methylation of genomic DNA, but is mainly an increase in methylation.
  • the relationship between the methylation of genomic DNA and the suppression of gene expression is known, and as will be described later, the expression of a specific gene can be suppressed as the methylation of genomic DNA increases according to the method of the present invention.
  • the cell may be, for example, a eukaryotic cell such as an algae cell, a plant cell, an animal cell, a fungal cell, or a prokaryotic cell such as a bacterium or a paleobacterium.
  • algae examples include eukaryphae such as haptoalgae, cryptoalgae, brown algae, red algae, green algae, diatomaceae, golden algae, gray algae, Euglena algae, shajik algae, whirlpool algae, and prokaryotic algae such as cyanobacteria.
  • Plants include seed plants, fern plants, and moss plants, and experimentally or industrially useful plants include Arabidopsis thaliana, tomatoes, soybeans, rice, wheat, barley, corn, rapeseed, tobacco, bananas, peanuts, and sunflowers.
  • Corn, cotton, carnation can be exemplified.
  • Animals include, for example, mammals (mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, humans, monkeys, pigs, cows, goats, sheep, etc.), as well as fish, birds, reptiles, amphibians, and insects.
  • Cells include cells in individuals as well as cultured cells. It also includes cells that have undergone specific treatments, such as protoplasts, to introduce single-stranded DNA.
  • the "single-stranded DNA" introduced into a cell has a base sequence homologous to the base sequence of the target strand of the DNA region (target genomic DNA region) for which it is desired to modify the methylation state on the genomic DNA.
  • target genomic DNA region any genomic DNA region can be targeted for modification of the methylated state.
  • the "target strand” is a strand having a base sequence homologous to the single-stranded DNA of the present invention among the double strands of the genomic DNA, and is a base for designing the single-stranded DNA of the present invention.
  • the target strand is the sense strand.
  • the "sense strand” means the strand of the double strand of genomic DNA that does not serve as a transcription template.
  • the strand length of single-stranded DNA is not particularly limited as long as the methylation state can be modified, but is, for example, 40 to 200 bases, preferably 50 to 120 bases.
  • the homology between the single-stranded DNA and the target genomic DNA region does not necessarily have to be 100% as long as the methylation state of the genomic DNA can be modified.
  • Homology can be, for example, 90% or higher (eg, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, 99% or higher).
  • Sequence homology can be calculated using BLAST or the like (eg, default parameters).
  • the introduction of single-stranded DNA into cells can be appropriately selected according to the type and morphology of the cells. Examples include, but are not limited to, electroporation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, lipofection, nanoparticle-mediated transfection, virus-mediated nucleic acid delivery, and the like.
  • PEG polyethylene glycol
  • the concentration of single-stranded DNA to be introduced into cells is not limited as long as the methylation state of genomic DNA can be modified, and those skilled in the art should appropriately set it according to the strand length of single-stranded DNA and the type of cell to be introduced. but it is, for example, a 10 5 cells per 1 ng ⁇ 50 [mu] g, preferably 10 5 cells per 6 ng ⁇ 8 [mu] g.
  • Changes in the methylation state by the method of the present invention can be analyzed by known methods such as bisulfite sequencing method, methylation-specific PCR (MSP) method, quantitative MSP method, COBRA method, and pyrosequencing method. It can be evaluated as a modification of the methylated state compared to a control (for example, when single-stranded DNA is not introduced).
  • MSP methylation-specific PCR
  • Modification of the methylated state by the method of the present invention occurs not only in the base for which the single-stranded DNA was designed in the genomic DNA, but also in the vicinity thereof.
  • “nearby” refers to a region within 300 bases upstream from the 5'end of the base sequence for which the single-stranded DNA was designed and a region within 300 bases downstream from the 3'end of the base sequence for which the single-stranded DNA was designed. be.
  • the present invention is a method for suppressing the expression of a gene in genomic DNA, and is a single-stranded DNA having a base sequence homologous to the base sequence of the sense strand of the gene (target gene) whose expression is desired to be suppressed on the genomic DNA. Also provided is a method characterized by the introduction of.
  • the region for designing single-stranded DNA is preferably an open reading frame region of the gene. According to the method of the present invention, gene expression can be specifically and remarkably suppressed over a long period of time.
  • the present invention has a composition for producing a cell containing the above-mentioned single-stranded DNA in which the methylation state of the genomic DNA is modified, or for producing a cell in which the expression of a gene in the genomic DNA is suppressed.
  • a composition for producing a cell containing the above-mentioned single-stranded DNA in which the methylation state of the genomic DNA is modified, or for producing a cell in which the expression of a gene in the genomic DNA is suppressed. Provide goods or kits.
  • the standard and the composition of the present invention constituting the kit of the present invention may further contain other components, if necessary.
  • Other ingredients include, for example, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, etc. Examples include, but are not limited to, fragrances, chelating agents, and the like.
  • the kit of the present invention can further include additional elements. Additional factors include, but are not limited to, for example, dilution buffers, wash buffers, nucleic acid transfer reagents, control reagents (eg, control single-stranded DNA, etc.).
  • the kit may include instructions for carrying out the methods of the invention.
  • the single-stranded DNA used in the GFP expression suppression experiment has a strand length of 100 bases and has the same sequence as the sense strands of the two regions in the ORF of the GFP gene (hereinafter, "ssDNA1" and “ssDNA2"). ).
  • the strand length of the single-stranded DNA used in the FCP expression suppression experiment is also 100 bases and has the same sequence as the sense strand of a part of the ORF of the FCP gene.
  • composition of the solution used is as follows.
  • Hypo-osmotic buffer HPES 10mM, KCl 100mM, NaOH 350 ⁇ M
  • MaMg buffer MaMg buffer (mannitol 400mM, MgCl 2 15mM, MES 0.1% (w / v), pH adjusted to 5.8 with KOH)
  • 40% PEG in CMS solution PEG 4g, CMS solution 6mL
  • CMS solution mannitol 400 mM, Ca (NO 3 ) 2 100 mM, pH adjusted to 7.0 with KOH
  • the expression suppression efficiency was defined by the following formula. 100-[(Number of fluorescently colored cells in the single-stranded DNA introduction experimental group / Number of fluorescently colored cells in the control experimental group) ⁇ 100] (%) In this formula, for example, when the expression suppression efficiency is 80%, the fluorescence is lost in 80% of the cells.
  • the promoter region of GFP and the region containing the ORF (region 1) and the ORF region (region 2) in which the introduced single-stranded DNA was designed are amplified by PCR for TA cloning. It was introduced into Escherichia coli (JM109 strain).
  • PCR and cloning of region 1 and region 2 were performed using genomic DNA not subjected to bisulfite treatment as a template, and used as a control sequence. Escherichia coli was isolated and cultured for 12 clones from each experimental group, and the fragments amplified by PCR were sequenced to calculate the methylation rate.
  • (C) Region for designing single-stranded DNA Two locations in the 5'side untranslated region of the GPF gene (Prom1, Prom2; schematic diagram A) and two locations in the ORF (near the center and near the 3'end; ssDNA3 , SsDNA4; Design a single-stranded DNA consisting of 80 bases in schematic diagram B) (Fig. 1), introduce 10 ⁇ g per 4.2 ⁇ 10 5 cells in the procedure (2), and increase the expression suppression efficiency in the procedure (3). Calculated.
  • FCP Flucoxanthin chlorophyll a / c-binding protein
  • FCP is a protein that binds to photosynthetic pigments and forms photoreceptors, and is accepted when the expression of this gene is suppressed. The body shrinks and the cells become lighter in color. In P. carterae, this gene forms a family consisting of 7 types of sequences, and a single-stranded DNA with a strand length of 80 bases is synthesized based on the sequence of the type with the highest expression level. Introduced into cells. After culturing, cells whose color changed lightly were isolated and recultured, and FCP gene expression analysis was performed.
  • the present invention it is possible to modify the functions of various cells and individuals by modifying the methylation state of genomic DNA and suppressing the expression of a specific gene. It is expected to be used in a wide range of fields including medical treatment. For example, by applying the present invention to haptophytes, which are microalgae, it is possible to efficiently produce high-fat-producing strains and useful lipid-producing strains. By using the present invention, cells and individuals having modified functions can be obtained without performing genetic recombination. It is also advantageous for industrial applications in that there are few restrictions.

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Abstract

標的DNA領域の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを細胞に導入することにより、標的DNA周辺のゲノムDNAのメチル化状態を改変させるとともに、遺伝子の発現を抑制することが可能であることを見出した。

Description

ゲノムＤＮＡのメチル化状態を改変する方法
　本発明は、一本鎖DNAを利用して、ゲノムDNAのメチル化状態を改変する方法、および遺伝子の発現を抑制する方法に関する。
　特定の遺伝子の発現を長期間抑制する技術としては、遺伝子組換え技術を用いてshRNA(短ヘアピンRNA)を転写するカセットをゲノム内に組み込む方法（RNAi）が、動物、植物を問わず多くの生物種で用いられている（非特許文献１）。また、陸上植物にのみ用いられる方法として、RdDM(RNA-directed　DNA　Methylation)の機構を利用し、標的遺伝子の発現を抑制する方法も報告されている（非特許文献２）。さらに、動物の培養細胞については、TALE、ZnF、dCas9といった特定の塩基配列を認識するタンパク質断片に、DNAのメチル化やヒストンの脱メチル化などを触媒する酵素を融合させ、特定の遺伝子の発現を制御する方法も報告されている（非特許文献３～５）。
　しかしながら、これら遺伝子組換えやゲノム編集を利用した遺伝子発現制御技術は、目的の株を得るために比較的長時間を要する。また、ゲノム編集において塩基配列認識タンパク質を利用する場合、その作成は非常に煩雑な作業を伴い、当該タンパク質と宿主との相性がゲノム編集効率に影響を与えてしまうという問題もある。
Paddison　P.　J.　et　al.,　Genes　Dev.　2002,　16,　948-958 Marjori　A.　Matzke　et　al.,　Nature　Reviews　Genetics,　2014,　15,　394-408 Morgan　L.　Maeder　et　al.,　Nature　Biotechnology,　2013,　31(12),　1137-1142 Hui　Chen　et　al.,　Nucleic　Acids　Research,　2014,　42(3),　1563-1574 Angelo　Amabile　et　al.,　cell,　2016,　167(1),　219-232
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便かつ効率的にゲノムDNAのメチル化状態を改変する方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、当該メチル化状態の改変を介して、特定の遺伝子の発現を簡便かつ効率的に抑制する方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、標的DNA領域の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを細胞に導入するだけで、標的DNA領域のゲノムDNAのメチル化状態を改変することが可能であることを見出した。また、本発明者らは、特定の遺伝子のセンス鎖の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを細胞に導入することにより、当該遺伝子領域周辺のメチル化状態を改変させ、長期に渡り、当該遺伝子の発現を特異的かつ顕著に抑制することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下の態様を提供するものである。
　（１）ゲノムDNAのメチル化状態を改変する方法であって、ゲノムDNA上でメチル化状態を改変することを望むDNA領域の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを細胞に導入することを特徴とする方法。
　（２）ゲノムDNAにおける遺伝子の発現を抑制する方法であって、ゲノムDNA上で発現を抑制したい遺伝子のセンス鎖の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを細胞に導入することを特徴とする方法。
　（３）一本鎖DNAが50～120塩基である、（１）または（２）に記載の方法。
　（４）細胞が藻類である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
　（５）ゲノムDNA上でメチル化状態を改変することを望むDNA領域の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを含む、ゲノムDNAのメチル化状態が改変された細胞を製造するための組成物またはキット。
　（６）ゲノムDNA上で発現を抑制したい遺伝子のセンス鎖の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを含む、ゲノムDNAにおける遺伝子の発現が抑制された細胞を製造するための組成物またはキット。
　本発明によれば、一定の長さを持つ一本鎖DNAを細胞内に導入するという簡便な操作により、標的DNA領域の塩基のメチル化状態を改変し、それに伴い、特定の遺伝子の発現を効率的に抑制することが可能となる。本発明の方法は、RdDM依存的エピジェネティック編集のような特定のポリメラーゼに依存する方法ではないため、広範囲な生物種に応用可能である。また、塩基認識タンパク質を利用した方法と比較して、一度に複数かつ広範囲にわたって塩基のメチル化状態を改変することが可能である。
一本鎖DNAを設計したDNA領域を示す図である。GPF遺伝子の5’側非翻訳領域に2か所(Prom1、Prom2；模式図A)、ORF内に4か所（ssDNA1、ssDNA2、ssDNA3、ssDNA4；模式図B）の塩基配列を基に一本鎖DNAを設計した。 ssDNA1またはssDNA2の導入したハプト藻におけるGFPの発現抑制効率を示すグラフである。 ssDNA1またはssDNA2の導入により蛍光が消失したハプト藻におけるGFP遺伝子の発現解析の結果を示す電気泳動写真（左）およびグラフ（右）である。 ssDNA1またはssDNA2の導入により蛍光が消失したハプト藻におけるプロモーターとオープンリーディングフレーム（ORF）の5’端を含む領域（領域1）におけるメチル化状態を解析した結果を示す図である。領域１は80のシトシン塩基を有し、その中から野生型（WT）と比較してメチル化の状態に変化があった塩基を抜粋した。枠内の数値はメチル化シトシンの割合を示す。メチル化シトシンの割合：0-35%:白、35-70%:灰色、70-100%:黒。 ssDNA1またはssDNA2の導入により蛍光が消失したハプト藻における、一本鎖DNAを設計したORF領域（領域2）におけるメチル化状態を解析した結果を示す図である。領域２は91のシトシン塩基を有し、その中から野生型（WT）と比較してメチル化の状態に変化があった塩基を抜粋した。枠内の数値はメチル化シトシンの割合を示す。メチル化シトシンの割合：0-35%:白、35-70%:灰色、70-100%:黒。 ssDNA2の導入量と発現抑制効率との相関を解析した結果を示すグラフである。 ssDNA2の鎖長と発現抑制効率との相関を解析した結果を示すグラフである。 一本鎖DNAを設計する領域と発現抑制効率との相関を解析した結果を示すグラフである。 一本鎖DNAによる内在性遺伝子FCPの発現抑制を解析した結果を示す電気泳動写真である。図中、「WT」は野生型を、「B4」はFCP発現抑制株を示す。 図８Ａで電気泳動を行ったゲルの蛍光を測定した結果を示すグラフである。図中、「WT」は野生型を、「B4」はFCP発現抑制株を示す。
　本発明は、ゲノムDNAのメチル化状態を改変する方法を提供する。
　本発明の方法は、ゲノムDNA上でメチル化状態を改変することを望むDNA領域（標的ゲノムDNA領域）の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを細胞に導入することを特徴とする。
　「ゲノムDNAのメチル化」とは、ゲノムDNA中の塩基の炭素原子にメチル基修飾が付加される化学反応であり、本発明においては、主として、シトシンのピリミジン環の5位炭素原子へのメチル基の付加である。本発明における「メチル化状態の改変」は、ゲノムDNAのメチル化の増加および減少（脱メチル化）の双方を含むが、主として、メチル化の増加である。ゲノムDNAのメチル化と遺伝子発現の抑制との関係は公知であり、後述する通り、本発明の方法によるゲノムDNAのメチル化の増加に伴い、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
　ゲノムDNAのメチル化状態の変化は、真核細胞か原核細胞かを問わず生じることが知られており、本発明の方法においてゲノムDNAのメチル化状態を改変させる対象となる「細胞」としては特に制限はない。細胞は、例えば、藻細胞、植物細胞、動物細胞、真菌細胞などの真核細胞であっても、細菌や古細菌などの原核細胞であってもよい。
　藻類としては、ハプト藻、クリプト藻、褐藻、紅藻、緑藻、珪藻、黄金藻、灰色藻、ユーグレナ藻、シャジク藻、渦鞭毛藻などの真核藻類およびシアノバクテリアなどの原核藻類が挙げられる。植物としては、種子植物、シダ植物、コケ植物が挙げられ、実験上あるいは産業上有用な植物としては、シロイヌナズナ、トマト、ダイズ、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ナタネ、タバコ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、ジャガイモ、ワタ、カーネーションを例示することができる。動物としては、例えば、哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）の他、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類が挙げられる。
　「細胞」は、培養細胞の他、個体中の細胞も含まれる。また、プロトプラストなど、一本鎖DNAを導入するための特定の処理が施された細胞も含まれる。
　本発明の方法において、細胞に導入する「一本鎖DNA」は、ゲノムDNA上でメチル化状態を改変することを望むDNA領域（標的ゲノムDNA領域）の標的鎖の塩基配列と相同な塩基配列を有する。本発明によれば、任意のゲノムDNA領域をメチル化状態の改変の対象とすることができる。また、「標的鎖」は、ゲノムDNAの二本鎖のうち、本発明の一本鎖DNAに相同な塩基配列を有し、本発明の一本鎖DNAを設計する基となる鎖である。例えば、本発明の一本鎖DNAを利用して遺伝子領域のメチル化を行う場合には、標的鎖は、センス鎖である。ここで「センス鎖」とは、ゲノムDNAの二本鎖のうち、転写の鋳型にならない側の鎖を意味する。
　一本鎖DNAの鎖長は、メチル化状態を改変できる限り、特に制限はないが、例えば、40～200塩基、好ましくは50～120塩基である。
　一本鎖DNAと標的ゲノムDNA領域との相同性は、ゲノムDNAのメチル化状態を改変できる限り、必ずしも100％でなくともよい。相同性は、例えば、90％以上（例えば、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上）であり得る。配列の相同性は、BLAST等（例えば、デフォルトのパラメータ）を利用して算出できる。
　一本鎖DNAの細胞への導入は、細胞の種類や形態などに応じて、適宜選択することができる。例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール（PEG）法、DEAE-デキストラン法、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、ウイルス媒介性核酸送達などが挙げられるが、これらに制限されない。
　細胞に導入する一本鎖DNAの濃度は、ゲノムDNAのメチル化状態を改変できる限り制限はなく、一本鎖DNAの鎖長や導入する細胞の種類に応じて、当業者は適宜設定することができるが、例えば、105細胞あたり1ng～50μgであり、好ましくは105細胞あたり6ng～8μgである。
　本発明の方法によるメチル化状態の変化は、例えば、バイサルファイトシークエンス法、メチル化特異的PCR（MSP）法、定量的MSP法、COBRA法、パイロシークエンス法などの公知の方法により解析することができ、対照（例えば、一本鎖DNAを導入しない場合）と比較したメチル化状態の相違をメチル化状態の改変として評価することができる。
　本発明の方法によるメチル化状態の改変は、ゲノムDNAにおいて一本鎖DNAを設計した塩基のみならず、その近傍にも生じる。ここで「近傍」とは、一本鎖DNAを設計した塩基配列の5'端から上流300塩基以内の領域および一本鎖DNAを設計した塩基配列の3'端から下流300塩基以内の領域である。但し、一本鎖DNAを設計した塩基配列から、さらに離れた塩基のメチル化状態が改変されることを除外するものではない。
　本発明の方法により、遺伝子領域のメチル化状態を改変することにより、当該遺伝子の発現を抑制することができる。従って、本発明は、ゲノムDNAにおける遺伝子の発現を抑制する方法であって、ゲノムDNA上で発現を抑制したい遺伝子（標的遺伝子）のセンス鎖の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを細胞に導入することを特徴とする方法をも提供する。遺伝子発現の抑制を目的とする場合、一本鎖DNAを設計する領域は、好ましくは、遺伝子のオープンリーディングフレーム領域である。本発明の方法によれば、長期に渡り、遺伝子の発現を特異的かつ顕著に抑制することが可能である。
　また、本発明は、上記一本鎖DNAを含む、ゲノムDNAのメチル化状態が改変された細胞を製造するための、または、ゲノムDNAにおける遺伝子の発現が抑制された細胞を製造するための組成物またはキットを提供する。
　本発明のキットを構成する標品および本発明の組成物には、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられるが、これらに制限されない。
　本発明のキットは、さらに追加の要素を含むことができる。追加の要素としては、例えば、希釈緩衝液、洗浄緩衝液、核酸導入試薬、対照試薬（例えば、対照の一本鎖DNAなど）が挙げられるが、これらに制限されない。当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書を含んでいてもよい。
　［材料と方法］
　（１）実験対象種
　GFP(Green　Fluorescence　Protein)の発現抑制に関する実験では、ハプト藻類（Pleurochrysis　carterae　LU株）にGFP遺伝子およびAph7遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子）を組み込んだSG-2株（GFPを恒常的に発現する株）を実験対象種として用いた。また、FCP(Fucoxanthin　chlorophyll　a/c-binding　protein)に関する実験では、ハプト藻類（Pleurochrysis　carterae　LU株）の野生株を用いた。細胞は、Marine　Art-ESM培地を用いて、20℃にて明期16時間／暗期8時間で培養した。
　（２）プロトプラストの調製と一本鎖DNAの導入
　定常期後期の細胞培養液から遠心で細胞を集め、Protanase　Kで30℃, 3時間（振とう）、20℃で1時間（静置）処理した。集めた細胞をhypo-osmotic　buffer中で5～10分間処理し、細胞壁を除去した。得られたプロトプラストをMiracloth(EMD　millipore)でフィルタリングし、遠心で集め、0.4M　マンニトール溶液に懸濁した。懸濁液を再び遠心し、上清を破棄したのち、再度、0.4M　マンニトール溶液に懸濁し、細胞数をカウントした。再度、プロトプラスト懸濁液を遠心し、4.2×105の細胞を320μLのMaMg　bufferに懸濁し、300μLのミリポア水に溶解した30μgの一本鎖DNAと混合した。
　なお、GFPの発現抑制実験に用いた一本鎖DNAの鎖長は100塩基で、GFP遺伝子のORF内の2つの領域のセンス鎖と同一の配列を持つ（以下、「ssDNA1」、「ssDNA2」とする）。また、FCPの発現抑制実験に用いた一本鎖DNAの鎖長も同様に100塩基でFCP遺伝子のORFの一部分のセンス鎖と同一の配列を有する。
　一本鎖DNAを入れたプロトプラスト懸濁液を暗所で10分間静置した後、350μLの40%　PEG(MW=6,000、WAKO)CMS溶液を注ぎ、よく攪拌した後、20℃の明所にて15分間静置した。上記の処理を行ったプロトプラスト懸濁液を7.5mLの培地で洗浄し、2mLの培地で懸濁し、培養を行った。
　使用した溶液の組成の組成は、以下の通りである。
　・hypo-osmotic　buffer（HEPES　10mM、KCl　100mM、NaOH　350μM）
　・MaMg　buffer（マンニトール　400mM、MgCl2　15mM、MES　0.1%(w/v)、pHはKOHで5.8に調整)
　・40%　PEG　in　CMS溶液（PEG　4g、CMS溶液　6mL）
　・CMS溶液（マンニトール　400mM、Ca(NO3)2　100mM、pHはKOHで7.0に調整）
　（３）GFP蛍光発現抑制効率の算出
　ssDNA1またはssDNA2の導入の約1週間後に、フローサイトメトリーを用いてGFP蛍光発色細胞と蛍光消失細胞の割合を測定した。また、一本鎖DNAの導入を行わなかった実験区を対照実験区として、同時に測定を行った。なお、発現抑制効率は、以下の式により定義した。
100-[(一本鎖DNA導入実験区の蛍光発色細胞数／対照実験区の蛍光発色細胞数)×100](%)
　この式においては、例えば、発現抑制効率が80％である場合、80％の細胞において蛍光が消失していることになる。
　（４）長期的な発現抑制が生じた細胞の単離
　（２）で得られた細胞を約2週間液体培地で培養した後、ゲランガム0.2%を含む1/2濃度のMA-ESMプレート培地で培養を行った。2週間後、プレート上に形成されたコロニーを蛍光実態顕微鏡下で観察し、GFPの蛍光を完全に消失しているコロニーを単離し、再度、液体培地で約4週間培養を行った。培養後、フローサイトメトリーを用いて蛍光の消失を確認した後、ssDNA1またはssDNA2を導入した実験区からそれぞれ1コロニーずつ選び（それぞれ「ssD1」、「ssD2」と称する）、RNAおよびゲノムDNAの抽出を行った。
　（５）GFP　mRNAの発現解析
　（４）で抽出したRNAを用いて、GFP特異的プライマーを用いて発現解析を行った。また、ポジティブコントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるFCP遺伝子の発現も同時に確認した。
　（６）ゲノムのメチル化の解析
　（３）で得られたゲノムDNAをFast　Bisulfite　Conversion　Kit(abcam社)を用いてバイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理により、メチル化されていないC（シトシン塩基）が脱アミノ化され、U（ウラシル塩基）に変換される。この処理後にPCRを行うことにより、メチル化されていないCはT（チミン塩基）に置換され、Cのメチル化および非メチル化を検出できる。
　バイサルファイト処理を行ったゲノムDNAを鋳型に、GFPのプロモーター領域とORFを含む領域（領域１）および導入した一本鎖DNAを設計したORF領域（領域2）をPCRで増幅し、TAクローニングを行い、大腸菌（JM109株）に導入した。また、バイサルファイト処理を行わないゲノムDNAを鋳型に、領域1と領域2のPCRおよびクローニングを行い、対照配列とした。各実験区からそれぞれ12クローンずつ大腸菌を単離して培養し、PCRで増幅した断片の配列決定を行い、メチル化の割合を算出した。
　（７）導入する一本鎖DNAの検討
　GFPの一本鎖DNAについては、以下の条件検討を行った。
　（ａ）一本鎖DNAの導入量
　上記（２）の操作において、ssDNA2を4.2×105細胞あたり5ng、10ng、25ng、50ng、75ng、100ng、125ng、500ng、1μg、1.5μgの各量となるように調整して導入し、上記（３）の手順で発現抑制効率を算出した。
　（ｂ）一本鎖DNAの鎖長
　上記（２）の操作において、40塩基、50塩基、60塩基、80塩基、100塩基の各鎖長にしたssDNA2を作成し、それぞれ4.2×105細胞あたり4ng、5ng、6ng、8ng、10ngとなるように量を調整して導入し、上記（３）の手順で発現抑制効率を算出した。
　（ｃ）一本鎖DNAを設計する領域
　GPF遺伝子の5’側非翻訳領域に2か所(Prom1、Prom2；模式図A)、ORF内に2か所（中央付近と3’端付近；ssDNA3、ssDNA4；模式図B）に80塩基からなる一本鎖DNAを設計し（図1）、（２）の手順で4.2×105細胞あたり10μg導入し、（３）の手順で発現抑制効率を算出した。
　（８）内在性遺伝子FCP(Fucoxanthin　chlorophyll　a/c-binding　protein)を用いた応用実験
　FCPは光合成色素と結合し、光受容体を形成するタンパク質であり、この遺伝子の発現が抑制されると受容体が縮小し、細胞の色彩が薄くなる。P.　carteraeでは、この遺伝子は7種類の配列からなるファミリーを形成しているが、このうち最も発現量の高いタイプの配列をもとに80塩基の鎖長の一本鎖DNAを合成し、細胞内に導入した。培養後、色が薄く変化している細胞を単離して再培養し、FCP遺伝子の発現解析を行った。
　［結果］
　（１）ssDNA1またはssDNA2の導入によるGFPの発現抑制
　図2に示すように、ssDNA1およびssDNA2のGFP発現抑制効率は、それぞれ約83.8%および87.5%であった。
　（２）ssDNA1またはssDNA2の導入によるGFP発現抑制
　図3に示すように、単離した蛍光消失株についてGFP遺伝子の発現解析を行った。その結果、ssDNA1およびssDNA2のいずれを導入した株においてもGFP遺伝子の発現はコントロールと比較して1%以下に抑制されていた。
　（３）メチル化状態の解析
　上述の単離した2つの株について、プロモーターとORFの5’端を含む領域（領域1）および導入した一本鎖DNAを含むORFの領域（領域2）についてメチル化状態を調べた。図4に示すように、単離した株においてはメチル化および脱メチル化の両方が確認されたが、新たにメチル化されている部位がより多く見られた。また、領域1に比べ、領域2の方により顕著な差が見られた。
　（４）一本鎖DNAの導入量と発現抑制効率
　ssDNA2を用いて、導入量と発現抑制効率について相関を調べた。図5に示すように、4.2×105細胞あたり25ng～30μgまではおおむね70%以上の抑制効率を示したが、10ngおよび5ngの実験群では抑制効率は著しく低下した。
　（５）一本鎖DNAの鎖長と発現抑制効率
　ssDNA2の領域で40塩基、50塩基、60塩基、80塩基の各鎖長の一本鎖DNAを設計し、導入する一本鎖DNAの鎖長と発現抑制効率についての相関を調べた。図6に示したように、40塩基の鎖長の一本鎖DNAを用いた場合、著しく効率が低下した。
　（６）一本鎖DNAの設計領域と発現抑制効率
　一本鎖DNAをORFとプロモーターのいくつかの領域に設計し、発現抑制効率との相関を調べた。その結果、図7に示すように、ORF内に設計した一本鎖DNAはいずれも75%以上の抑制効率が見られたが、プロモーター領域に設計したものでは抑制効率は著しく低かった(5%程度)。
　（７）内在性遺伝子FCPを用いた遺伝子発現抑制実験
　FCPの一本鎖DNAを導入後、色が薄くなったコロニーを単離し、FCP遺伝子の発現解析を行った。図8に示すように、7つのサブタイプのうち、type　5を除くすべての発現が抑制されていた。
　本発明によれば、ゲノムDNAのメチル化状態の改変および特定の遺伝子の発現の抑制により、様々な細胞や個体の機能を改変することが可能となることから、本発明は、工業、農業、医療を含む幅広い分野での利用が期待される。例えば、微細藻類であるハプト藻に本発明を適用することにより、高脂質生産株や有用脂質高生産株の作出を効率的に行うことが可能である。本発明を利用すれば、遺伝子組換えを行うことなく、改変された機能を持つ細胞や個体が得られるため、遺伝子組換え個体などと比較して、規制（例えば、カルタヘナ法）による設備等に対する制限が少ない点でも産業応用に有利である。

Claims (6)

  1. 　ゲノムDNAのメチル化状態を改変する方法であって、ゲノムDNA上でメチル化状態を改変することを望むDNA領域の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを細胞に導入することを特徴とする方法。
  2. 　ゲノムDNAにおける遺伝子の発現を抑制する方法であって、ゲノムDNA上で発現を抑制したい遺伝子のセンス鎖の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを細胞に導入することを特徴とする方法。
  3. 　一本鎖DNAが50～120塩基である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　細胞が藻類である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　ゲノムDNA上でメチル化状態を改変することを望むDNA領域の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを含む、ゲノムDNAのメチル化状態が改変された細胞を製造するための組成物またはキット。
  6. 　ゲノムDNA上で発現を抑制したい遺伝子のセンス鎖の塩基配列と相同な塩基配列を有する一本鎖DNAを含む、ゲノムDNAにおける遺伝子の発現が抑制された細胞を製造するための組成物またはキット。
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