JP7029741B2 - ゲノム編集方法 - Google Patents
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Description
進められている(特許文献1)。この技術によれば、ガイドRNAとCasタンパク質との組合
せにより、細胞のゲノム上の特定配列にDNA二本鎖切断を発生させることができる。このD
NA切断端ではDNAのランダムな削り込み又は付加等の変異が高頻度に起こるため、CRISPR/
Casシステムによれば、容易に遺伝子破壊が可能である。また、DNA切断端付近のDNA配列
を含むドナーDNAをさらに組み合わせることにより、ゲノムDNAの塩基配列の置換や欠失等
を起こすことも可能である。
列近傍に限定されている。また、DNA二本鎖切断後は、DNAのランダムな削り込みや付加が
起こるため、ゲノム編集後の塩基配列の変化を予想することができない。さらに、ガイド
RNAは、通常、20塩基程の比較的短い配列を標的とするものであるので、意図した標的配
列以外の配列にも結合し、意図しないゲノム編集を引き起こすこともある(オフターゲッ
ト効果)。
、簡便に、且つゲノム編集対象部位を選択する自由度がより高く、さらに目的の変異以外
の意図しない変異の確率がより低減されたゲノム編集方法を提供することを課題とする。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列、又は
からなる、一本鎖ポリヌクレオチドを細胞に導入するだけで、前記改変塩基配列において
前記任意塩基配列が欠失していた場合(図1)はその欠失がゲノム内で起こり、また前記
改変塩基配列において前記任意配列が挿入していた場合(図2)はその挿入がゲノム内で
起こり、さらに前記改変塩基配列において前記任意塩基配列が置換していた場合(図3)
はその置換がゲノム内で起こることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた
結果、本発明が完成した。
項1.
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記
任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1
種を細胞又は生物に導入する工程を含む、ゲノム編集方法。
前記一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくと
も1種を合成する工程を含む、項1に記載のゲノム編集方法。
さらに、ゲノム編集された細胞又は生物を回収する工程を含む、項1又は2に記載のゲノ
ム編集方法。
さらに、ゲノム編集された細胞又は生物を選別する工程を含む、項1~3のいずれかに記
載のゲノム編集方法。
ヌクレアーゼ、ガイドRNA、及びそれらの発現ベクターからなる群より選択される少なく
とも1種を導入する工程を含まない、項1~4のいずれかに記載のゲノム編集方法。
項6.
前記改変塩基配列の塩基数が80~1000である、項1~5のいずれかに記載のゲノム編集方
法。
前記改変塩基配列の塩基数が90~300である、項1~6のいずれかに記載のゲノム編集方
法。
欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の塩基数が1~920である、項1~7のいずれ
かに記載のゲノム編集方法。
前記改変塩基配列の塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の塩基
数の比が10以下である、項1~8のいずれかに記載のゲノム編集方法。
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する
前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’
末端の塩基までの塩基数の比が、0.2~5である、項1~9のいずれかに記載のゲノム編集
方法。
前記一本鎖ポリヌクレオチドが一本鎖DNA又は一本鎖RNAである、項1~10のいずれかに
記載のゲノム編集方法。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記
任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1
種を含有する、ゲノム編集用組成物。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記
任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1
種を含有する、ゲノム編集用キット。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記
任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1
種を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の
製造方法。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配
列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記
任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端
の塩基までの塩基数が、40~300である、
一本鎖ポリヌクレオチド。
項15に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの発現カセットを含有する、発現ベクター。
導入するだけで、簡便にゲノム編集を行うことができる。このゲノム編集技術は、編集対
象部位を選択する自由度がより高く、さらに目的の変異以外の意図しない変異の確率がよ
り低減されている。また、一本鎖ポリヌクレオチドの塩基数をより多くすることにより、
オフターゲット効果をより低減することも可能である。
ついては、「含有(comprising)」、「含む(comprising)」、「実質的にからなる(es
sentially consisting of)」、及び「からなる(consisting of)」という概念を含む。
ノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、そ
れらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列
分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは
、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST(KarlinS,Altschul SF.“Methods for
assessing the statistical significance of molecular sequence features by using
general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA.87:2264-2268(1990)、KarlinS,
Altschul SF.“Applications and statistics for multiple high-scoring segments i
n molecular sequences.”Proc Natl Acad Sci USA.90:5873-7(1993))を用いて決
定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開
発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Bio
technology Information(NCBI)のウェエブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を
参照すればよい。
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列、又は
(ii)前記改変塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列(ただし、前記センス鎖塩
基配列と同一の塩基配列は除く)
からなる、一本鎖ポリヌクレオチド(本明細書において、「本発明の一本鎖ポリヌクレオ
チド」と示すこともある。)、及び本発明の一本鎖ポリヌクレオチドやその発現ベクター
(本明細書において、「本発明の発現ベクター」と示すこともある。)を利用したゲノム
編集用組成物、ゲノム編集用キット、ゲノム編集方法、ゲノム編集された細胞又は非ヒト
生物の製造方法等に関する。
考えられる。
において重なり合ってなる式:X-Y-X-Y-X[式中、X及びYは塩基数が1以上の異なる塩基配
列を示す。]で示される塩基配列(本明細書において、「PODiR(Partially Overlapped
Direct Repeat)配列」と示す場合もある。)中の重なっていない配列(X-Y)が欠失する
という法則が存在することを報告している(特許文献2)。また、ゲノム中のX-Y-Xとい
う配列の5’側に隣接してX-Yで示される塩基配列が挿入され、PODiR配列が創出されると
いう法則が存在することも報告している(特許文献2)。さらに、本発明者は、これらの
法則が、真核細胞においても保存されていることも見出している。
含むDNAでコードされるタンパク質を発現させる際に、PODiR配列中のX-Yで示される塩基
配列が欠失したmRNAが生成されてしまうという現象を見出した(現象2)。
塩基配列が欠失するのは(現象1)、ゲノム中のPODiR配列を含むDNAから転写された、POD
iR配列中のX-Yで示される塩基配列が欠失したmRNA(現象2)が、ゲノム中のPODiR配列を
含むDNAと相互作用(例えばハイブリダイズ)し、その結果できた、相互作用できない余
分な部位(ゲノムDNAのX-Y)が、何らかの酵素によって切断されるために起こるのではな
いかと推察した。さらに、本発明者は、ゲノム中のX-Y-Xという配列の5’側に隣接してX-
Yで示される塩基配列が挿入されてPODiR配列が創出されるのは(現象1)、PODiR配列を有
するmRNAがゲノム中のX-Y-Xという配列(非PODiR配列)を含むDNAと相互作用(例えばハ
イブリダイズ)し、その結果できた、相互作用できない余分な部位(mRNAのX-Y)の塩基
配列が、DNA複製時等にゲノムDNA中に挿入されるために起こるのではないかと推察した。
ド、つまりゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列(図1の部位(a))に対して任意塩基配
列(図1の部位(c))が欠失してなる改変塩基配列(図1の部位(b))からなる一本鎖
ポリヌクレオチドを人為的に導入すれば、ゲノムDNAと相互作用(例えばハイブリダイズ
)し、その結果できた、相互作用できない余分な部位(一本鎖ポリヌクレオチドにおいて
欠失している、ゲノムDNA中の任意塩基配列:図1の部位(c))が、何らかの酵素によっ
て切断されるのではないかという着想に至った(図1)。さらに、本発明者は、ゲノムDN
Aの任意のセンス鎖塩基配列(図2の部位(a))に対して任意塩基配列(図2の部位(c
))が挿入してなる改変塩基配列(図2の部位(b))からなる一本鎖ポリヌクレオチド
を人為的に導入すれば、ゲノムDNAと相互作用(例えばハイブリダイズ)し、その結果で
きた、相互作用できない余分な部位(一本鎖ポリヌクレオチドにおいて挿入している任意
塩基配列:図2の部位(c)))の塩基配列が、DNA複製時等にゲノムDNA中に挿入される
のではないかという着想に至った(図2)。またさらに、本発明者は、ゲノムDNAの任意
のセンス鎖塩基配列(図3の部位(a))に対して任意塩基配列(図3の部位(c))が他
の塩基配列に置換してなる改変塩基配列(図3の部位(b))からなる一本鎖ポリヌクレ
オチドを人為的に導入すれば、ゲノムDNAと相互作用(例えばハイブリダイズ)し、その
結果できた、相互作用できない余分な部位(一本鎖ポリヌクレオチドにおける置換後の部
位)の塩基配列が、DNA複製時等により、ゲノムDNA中にも反映されるのではないかと推察
した(図3)。
カニズムによって本発明のゲノム編集が起こると考えられる。
することにより、ゲノムDNAに所望の変異(欠失、挿入、又は置換)を導入することがで
きる。
ある配列を欠失したい場合(図4の上段)は、ゲノムDNAとハイブリダイズした時に、欠
失したい配列がハイブリダイズできずに「おでき(図1の部位(c))」のようにはみ出
してしまうような一本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。すなわち、図4の下段に示さ
れるように、ゲノムDNA内の欠失したい配列の両側の配列(図1の部位(d)及び(e)に
相当)を連結してなる配列からなる一本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。
す。ある配列をゲノムDNAの特定部位に挿入したい場合(図5の上段)は、ゲノムDNAとハ
イブリダイズした時に、挿入したい配列がハイブリダイズできずに「おでき(図2の部位
(c))」のようにはみ出してしまうような一本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。す
なわち、図5の下段に示されるように、ゲノムDNA内の挿入したい部位の両側の配列(図
2の部位(d)及び(e)に相当)の間に、挿入したい配列が挟まれてなる配列からなる一
本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。
図6に示す。ゲノムDNA内のある配列を別の他の配列に置換したい(図6の上段)は、ゲ
ノムDNAとハイブリダイズした時に、ゲノムDNA内のある配列と(置換したい配列=置換さ
れる配列)と他の配列(置換する配列)がハイブリダイズできずに「おでき(図3の部位
(c))」のようにはみ出してしまうような一本鎖ポリヌクレオチドをデザインする。す
なわち、図6の下段に示されるように、置換したい配列の両側の配列(図3の部位(d)
及び(e)に相当)の間に、所望の配列(=他の配列)が挟まれてなる配列からなる一本
鎖ポリヌクレオチドをデザインする。
うにデザインすることにより、ゲノムDNAに所望の変異(欠失、挿入、又は置換)を導入
することができる:
A)センス鎖配列上の(ia)欠失させる配列の直前と直後の塩基、(ib)挿入させる箇
所の連続した2つの塩基(直前と直後の塩基)、及び(ic)置換させる配列の直前と直後
の塩基を特定し、
B)欠失/挿入/置換の対象のとなる塩基を特定し(欠失の場合は、ヌル)、
C)上記B)で特定された塩基の上流に、センス鎖上の該直前の塩基の上流側X塩基を
、イの塩基の下流にセンス鎖上の該直前の塩基の下流側X塩基を、配置する。
/10倍のうち長いものである。改変する塩基とは、1.欠失させる塩基数、2.挿入させ
る塩基数、3.置換により除去/導入する塩基のうち長いほうの数である。
基の下流側X塩基は、改変されると意図しないゲノム編集が起きるので好ましくない。
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドは、
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列、又は
(ii)前記改変塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列
からなる、一本鎖ポリヌクレオチドである。
ポリヌクレオチドの塩基配列(改変塩基配列又はその相同配列)の元となる塩基配列であ
る。
されない。
ニズムによれば、PODiR配列の欠失及び創出現象(原核細胞のみならず、真核細胞におい
ても起こることが見出されている。)が起こる細胞及び生物であれば、本発明のゲノム編
集が可能である。
核生物としては、例えばグラム陰性菌(緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス
菌、ブルセラ菌、淋菌、バークホルデリア、赤痢菌、サルモネラ菌、アシネトバクター、
コレラ菌、肺炎桿菌、レジオネラ菌、ピロリ菌、カンピロバクター等)、グラム陽性菌(
結核菌、マイコプラズマ菌、黄色ブドウ球菌、放線菌、枯草菌、炭疽菌等)等を例示する
ことができる。これらの中でも、好ましくはグラム陰性菌等が挙げられ、より好ましくは
緑膿菌、大腸菌、セラチア菌、スフィンゴモナス菌等が挙げられ、さらに好ましくは緑膿
菌、大腸菌等が挙げられる。真核生物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、
イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳類動物; ニワトリ等の鳥類; カメ、ワニ等の爬虫類;
アフリカツメガエル等の両生類動物; ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ等の魚類動
物; ホヤ等の脊索動物; ショウジョウバエ、カイコ等の節足動物;等の動物: シロ
イヌナズナ、イネ、コムギ、タバコ等の植物: 酵母、アカパンカビ、マツタケ、シイタ
ケ、エノキタケ、シメジ、ナメコ、エリンギ等の菌類等が挙げられる。一実施形態におい
て、ゲノム編集対象生物は、ヒトを含む「生物」である。また、別の一実施形態において
、ゲノム編集対象生物は、ヒト以外の「非ヒト生物」である。
血幹細胞・前駆細胞、配偶子(***、卵子)、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮
細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、
iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等の動物細胞; 柔組織細胞、厚角組織細胞等の植物細
胞等が挙げられる。
の鋳型にならない方のDNA鎖である。センス鎖は、好ましくはコード領域のセンス鎖であ
る。「コード領域」には、タンパク質のコード領域に限定されず、タンパク質をコードし
ないRNA(例えば、miRNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、gRNA、SRP RNA、pRNA、tncRNA、s
bRNA、snlRNA、SLRNA等)のコード領域も包含する。
限されない。任意のセンス鎖塩基配列の塩基数は、特に制限されないが、例えば20~1200
0、好ましくは20~3000、より好ましくは40~2000、よりさらに好ましくは60~1000、よ
りさらに好ましくは80~600、よりさらに好ましくは90~300、特に好ましくは95~200程
度である。
変塩基配列」(図1の部位(b))とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して、
該センス鎖塩基配列内の任意の塩基配列が欠失してなる塩基配列である。なお、ここでい
う「欠失」とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列の内部が除かれることであり、該
センス鎖塩基配列の末端を含む部位が除かれることではない。つまり、改変塩基配列にお
いては、5’端及び3’端の両方において、改変の元となったセンス鎖塩基配列由来の配列
が残っている。換言すれば、改変塩基配列は、5’端及び3’端の両方において、改変の元
となったセンス鎖塩基配列由来の配列を有する。なお、上記「任意の塩基配列」は、連続
する1つの塩基配列である。
いが、例えば20~2000、好ましくは40~2000、より好ましくは60~1000、さらに好ましく
は80~1000、よりさらに好ましくは80~600、よりさらに好ましくは90~300、特に好まし
くは95~200程度である。
配列」(図2の部位(b))とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して、任意の
塩基配列が挿入してなる塩基配列である。なお、ここでいう「挿入」とは、ゲノムDNAの
任意のセンス鎖塩基配列の内部に任意塩基配列が挿入されることであり、該センス鎖塩基
配列の末端に任意塩基配列が付加されることではない。つまり、改変塩基配列においては
、5’端及び3’端の両方において、改変の元となったセンス鎖塩基配列由来の配列が残っ
ている。換言すれば、改変塩基配列は、5’端及び3’端の両方において、改変の元となっ
たセンス鎖塩基配列由来の配列を有する。なお、上記「任意の塩基配列」は、連続する1
つの塩基配列である。
が、例えば20~12000、好ましくは20~2000、より好ましくは40~2000、さらに好ましく
は60~1000、よりさらに好ましくは80~1000、よりさらに好ましくは80~600、よりさら
に好ましくは90~300、特に好ましくは95~200程度である。
置換してなる改変塩基配列」(図3の部位(b))とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基
配列に対して、該センス鎖塩基配列内の任意の塩基配列が他の塩基配列に置換してなる塩
基配列である。なお、ここでいう「置換」とは、ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列の
内部が置換することであり、該センス鎖塩基配列の末端を含む部位が置換することではな
い。つまり、改変塩基配列においては、5’端及び3’端の両方において、改変の元となっ
たセンス鎖塩基配列由来の配列が残っている。換言すれば、改変塩基配列は、5’端及び3
’端の両方において、改変の元となったセンス鎖塩基配列由来の配列を有する。また、「
他の塩基配列」は、置換対象の塩基配列と異なる塩基配列であれば特に制限されず、例え
ば置換対象の塩基配列との同一性が0~50%、0~20%、0~10%、0~5%の塩基配列であ
る。なお、上記「任意の塩基配列」は、連続する1つの塩基配列である。
が、例えば20~12000、好ましくは20~2000、より好ましくは40~2000、さらに好ましく
は60~1000、よりさらに好ましくは80~1000、よりさらに好ましくは80~600、よりさら
に好ましくは90~300、特に好ましくは95~200程度である。
により、ゲノム内で欠失、挿入、又は置換させる対象となる塩基配列であり、その配列は
特に制限されない。欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」の塩基数は、特に制限さ
れないが、例えば1~10000、好ましくは1~1000、より好ましくは1~920、さらに好まし
くは2~500、よりさらに好ましくは4~200、よりさらに好ましくは4~100、よりさらに好
ましは5~50、よりさらに好ましくは6~20、よりさらに好ましくは7~12、よりさらに好
ましくは8~9である。
する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の塩基数の比(部位(c)の塩基数/部位
(b)の塩基数)は、特に制限されないが、例えば500以下、好ましくは100以下、より好
ましくは10以下、さらに好ましくは5以下、よりさらに好ましくは2以下、よりさらに好ま
しくは1以下である。該比の下限値は特に制限されないが、例えば0.01、0.02、0.04等で
ある。
ら、欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も5’側の
塩基の5’側隣の塩基まで(図1~3の(d))の塩基数は、特に制限されないが、例えば
10~1000、好ましくは20~1000、より好ましくは30~500、さらに好ましくは40~300、よ
りさらに好ましくは40~100、特に好ましくは40~70程度である。
基の3’側隣の塩基から、「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1~3の部位(a
))の3’末端の塩基まで(図1~3の(e))の塩基数は、特に制限されないが、例えば
10~1000、好ましくは20~1000、より好ましくは30~500、さらに好ましくは40~300、よ
りさらに好ましくは40~100、特に好ましくは40~70程度である。
「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1~3の部位(a))の5’末端の塩基から
、欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も5’側の塩
基の5’側隣の塩基まで(図1~3の(d))の塩基数と、
欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も3’側の塩基
の3’側隣の塩基から、「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1~3の部位(a)
)の3’末端の塩基まで(図1~3の(e))の塩基数
の両方或いは少なくとも一方が、例えば10~1000、好ましくは20~1000、より好ましくは
30~500、さらに好ましくは40~300、よりさらに好ましくは40~100、特に好ましくは40
~70程度である。
ら、欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も5’側の
塩基の5’側隣の塩基まで(図1~3の(d))の塩基数に対する、
欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1~3の部位(c))の最も3’側の塩基
の3’側隣の塩基から、「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1~3の部位(a)
)の3’末端の塩基まで(図1~3の(e))の塩基数の比(部位(e)の塩基数/部位(d
)の塩基数)は、
特に制限されないが、例えば0.01~100、好ましくは0.1~10、より好ましくは0.2~5、さ
らに好ましくは0.5~2である。
塩基配列(ただし、前記センス鎖塩基配列と同一の塩基配列は除く)も包含される。同一
性の程度は、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは99%以上
、よりさらに好ましくは99.5%以上、特に好ましくは99.9%以上である。
は、ゲノムDNAと相互作用(例えばハイブリダイズ)することにより、ゲノム編集を起こ
すと考えられる。この観点から、本発明の一本鎖ポリヌクレオチド(図1~3の(b))
は、「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1~3の部位(a))と、ゲノム編集対
象細胞内において相互作用(例えばハイブリダイズ)可能であることが望ましい。具体的
には、例えばストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能である。ストリンジェントな
条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods i
n Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、プロー
ブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイ
ズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができ
る。かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。
特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃
」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗
浄条件を挙げることができる。
り強力に相互作用(例えばハイブリダイズ)可能であるという観点から、好ましくはRNA
である。
りにおいて、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼ
などの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基(ホスフェー
ト)を、例えば、ホスホロチオエート(PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネー
ト等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖(リ
ボース)の2位の水酸基を、-OR(Rは、例えばCH3(2’-O-Me)、CH2CH2OCH3(2’-O-MOE
)、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す)に置換してもよい。さらに、塩
基部分(ピリミジン、プリン)に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5
位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニ
ルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビ
オチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げる
ことができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2’酸素と4’炭素
を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA(LN
A)等もまた、好ましく用いられ得る。
ことができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術等を
利用して作製することができる。
本発明の発現ベクターは、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの発現カセットを含有する
発現ベクターである。
鎖ポリヌクレオチドを発現(転写)可能なポリヌクレオチドである限り特に制限されない
。発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置
された本発明の一本鎖ポリヌクレオチドのコード配列を有するDNA等のポリヌクレオチド
が挙げられる。
ゲノム編集対象生物や、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの塩基数等に応じて、適宜選択
することができる。原核細胞用プロモーターとしては、例えばlacプロモーター、tacプロ
モーター、tetプロモーター、araプロモーター等が挙げられる。また、真核細胞用プロモ
ーターとしては、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプ
ロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等のpol II
系プロモーター; マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモ
ーター、ヒトバリン-tRNAプロモーター等のpol III系プロモーター等が挙げられる。
(MCS))を含んでいてもよい。例えば、発現カセットにおいて、5’側から、プロモータ
ーと本発明の一本鎖ポリヌクレオチドのコード配列との間に(好ましくはいずれか一方或
いは両方に隣接して)、及び/又は本発明の一本鎖ポリヌクレオチドのコード配列の3’
側に(好ましくは隣接して)、MCSが配置されている態様が挙げられる。MCSは複数(例え
ば2~50、好ましくは2~20、より好ましくは2~10)個の制限酵素サイトを含むものであ
れば特に制限されない。
ては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる
。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。
耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシ
ン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシ
ン耐性遺伝子等が挙げられる。
レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウ
イルス等のウイルスベクター; アグロバクテリウムベクター等が挙げられる。
る。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術等を利用して作
製することができる。
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドをゲノム編集対象細胞又はゲノム編集対象非ヒト生物
に導入する工程を含む方法により、これらの細胞又は生物のゲノムを編集すること、より
具体的には、一本鎖ポリヌクレオチドにおいてゲノムDNA中の任意塩基配列が欠失してい
る場合(図1)は、その欠失をゲノム内で起こすことができ、また一本鎖ポリヌクレオチ
ドにおいて任意塩基配列が挿入している場合(図2)は、その挿入をゲノム内で起こすこ
とができ、さらに一本鎖ポリヌクレオチドにおいて任意塩基配列が置換している場合(図
3)は、その置換をゲノム内で起こすことができる。
種類等に応じて、適宜選択することができる。導入方法としては、例えばマイクロインジ
ェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン処理、リポフェクション、ナ
ノ粒子媒介性トランスフェクション、ウイルス媒介性核酸送達等が挙げられる。
象生物内でゲノム編集が起こるので、この細胞又は生物を回収することにより、ゲノム編
集された(すなわち、一本鎖ポリヌクレオチドにおいてゲノムDNA中の任意塩基配列が欠
失している場合(図1)は、その欠失がゲノム内で起きた、また一本鎖ポリヌクレオチド
において任意塩基配列が挿入している場合(図2)は、その挿入がゲノム内で起きた、さ
らに一本鎖ポリヌクレオチドにおいて任意塩基配列が置換している場合(図3)は、その
置換がゲノム内で起きた)細胞又は非ヒト生物を得ることができる。
象となった細胞又は生物を全て回収してもよいし、ゲノム編集された細胞又は生物を選別
してもよい。選別方法としては、特に制限されず、公知の選別方法を採用することができ
る。例えば、ゲノム編集により特定のタンパク質の発現がON/OFFになる場合は、そのタン
パク質の発現の有無を指標として、ゲノム編集された細胞を選別することができる。
Casタンパク質等)及び/又はその発現ベクターや、ガイドRNA及び/又はその発現ベクタ
ーを導入せずとも、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドのみによりゲノム編集が可能である
。この観点から、本発明のゲノム編集方法は、上記ヌクレアーゼ及び/又はその発現ベク
ターや、ガイドRNA及び/又はその発現ベクターを導入する工程を含まない、非ZFN、非TA
LEN、非CRISPR/Cas型ゲノム編集方法である。
発明の一本鎖ポリヌクレオチドを導入する工程の前に、さらに本発明の一本鎖ポリヌクレ
オチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を合成する工程
を含むこともある。また、該合成工程の前に、さらに本発明の一本鎖ポリヌクレオチド、
及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種の配列を設計する工程を
含むこともある。
編集部位において、DNAのランダムな削り込みもしくは付加等の意図しない変異が起こら
ない、或いは起こったとしても極めてわずかである。特に、CRISPR/Casシステムに比べる
と、このような意図しない変異を遥かに低減することが可能である。
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドは、ゲノム編集用組成物として利用することもできる
し、或いはキットとして利用することもできる。
制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学
的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、
分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、
着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
特に制限されず、必要に応じて核酸導入試薬、緩衝液等、本発明のゲノム編集方法の実施
に必要な他の試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。
Casタンパク質等)及び/又はその発現ベクターや、ガイドRNA及び/又はその発現ベクタ
ーを導入せずとも、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドのみによりゲノム編集が可能である
。この観点から、本発明のゲノム編集用組成物及びキットは、上記ヌクレアーゼ及び/又
はその発現ベクターや、ガイドRNA及び/又はその発現ベクターを含まない、非ZFN、非TA
LEN、非CRISPR/Cas型ゲノム編集用組成物及びキットである。
て限定されるものではない。
緑膿菌のmexR遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基
配列が欠失又は挿入してなる塩基配列(配列番号1~6)からなる一本鎖DNAを、DNA合成受
託会社(macrogen)にて合成した。これらの一本鎖DNAの各部位の塩基数を表1に示す。
表1中、パターン及び(a)~(e)は、図1及び図2のパターン及び(a)~(e)に対応
する。
」は一本鎖DNAにおいて欠失している塩基を示し、「 }」はゲノムDNA配列に対して挿入
した配列及び挿入位置を示す。
部分(c)の欠失、パターン2の場合は部分(d)と部分(e)の間に部分(c)の挿入が起
こると、該遺伝子から発現するタンパク質はmexRタンパク質本来の活性(MexAB-OprM薬剤
排出ポンプの発現抑制活性)が損なわれることとなり、緑膿菌の薬剤耐性能が高まるので
、薬剤含有培地で生育する菌数(コロニー数)が増加することが予想される。
液を得た。一本鎖DNA溶液1μL又は水1μLを、緑膿菌(PAO1S-Lac)のコンピテントセル溶
液40μLに添加し、氷上で20分間放置した。エレクトロポレーション法(2500V、25μF、7
00Ω)により一本鎖DNAを細胞内に導入した後、SOC培地を960μL添加し、37℃で4時間、
振盪培養した。得られた培養液を、アズトレオナム含有LB寒天培地上にプレーティングし
、37℃で2日間培養した。培養後、コロニー数をカウントし、一本鎖DNAの代わりに水を添
加した場合(コントロール)のコロニー数に対する、一本鎖DNAを添加した場合のコロニ
ー数の相対値(コロニー数相対値)を算出した。さらに、任意の10個のコロニーをピック
アップしてシークエンシングを行い、目的の変異(パターン1の場合は部分(c)の欠失、
パターン2の場合は部分(d)と部分(e)の間に部分(c)の挿入)が起こっているコロニ
ーの割合を算出した。結果を表2に示す。
入してなる塩基配列からなる一本鎖DNAにより、ゲノムにおいて目的の変異(パターン1の
場合は部分(c)の欠失、パターン2の場合は部分(d)と部分(e)の間に部分(c)の挿
入)が起こっていた。また、コロニー数相対値から、一本鎖DNAの長さがより長い方が、
目的の変異の導入効率がより高まることが示唆された。
た(コロニー数相対値=0.9)が、シークエンシングの結果、これは、コントロールの方
でも、自然に発生する変異(部分(c)の欠失又は挿入とは異なる変異(点変異等))に
より、薬剤耐性がある程度向上していたためであることが明らかとなった。表2に示され
るように、109R-1を用いた場合であっても目的の変異を起こすことができた。
緑膿菌のmexR遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基
配列が欠失してなる塩基配列(配列番号7)からなる一本鎖DNAを、DNA合成受託会社(mac
rogen)にて合成した。この一本鎖DNAの各部位の塩基数を表3に示す。表3中、パターン
及び(a)~(e)は、図1及び図2のパターン及び(a)~(e)に対応する。
た10個のコロニー中、2個のコロニーで目的の変異((c)の欠失)が導入できていた。
下記(A)~(D)の一本鎖DNA:を、DNA合成受託会社(FASMAC)にて合成した。(A)
緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配
列が欠失してなる塩基配列(配列番号8~9)からなる一本鎖DNA、
(B)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のアンチセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部
の任意塩基配列が欠失してなる塩基配列(配列番号10~11)からなる一本鎖DNA((A)の
アンチセンス鎖)、
(C)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列(配列番号12~13)からなる一本
鎖DNA((A)の、欠失前の配列)、
(D)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のアンチセンス鎖塩基配列(配列番号14~15)からな
る一本鎖DNA((B)の、欠失前の配列)。
)は、図1及び図2のパターン及び(a)~(e)に対応しており、sはセンス鎖を示し、a
はアンチセンス鎖を示す。
起こると、該遺伝子から活性型mexTタンパク質が発現し、これによりMexEF-OprM薬剤排出
ポンプの発現が増強されて、緑膿菌の薬剤耐性能が高まるので、薬剤含有培地で生育する
菌数(コロニー数)が増加することとなる。
ル)のコロニー数に対する、一本鎖DNAを添加した場合のコロニー数の相対値を算出した
。結果を表5及び表6に示す。
任意塩基配列が欠失してなる塩基配列からなる一本鎖DNAを用いた場合のみ、コロニー数
相対値が大きく増加していた。これは、(A)の一本鎖DNAを用いた場合のみ、ゲノムにお
いて目的の変異が起こっていたことを示唆する。以上より、ゲノムにおいて目的の変異を
起こすには、一本鎖DNAの塩基配列は、ゲノムのセンス鎖塩基配列に基づく配列であるこ
とが重要であることが示された。
緑膿菌のmexR遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基
配列が挿入してなる塩基配列(配列番号5、6及び16~21)からなる一本鎖DNAを、DNA合成
受託会社(macrogen)にて合成した。これらの一本鎖DNAは、長さ、、挿入される塩基配
列等が異なる関係にある。これらの一本鎖DNAの各部位の塩基数を表7に示す。表7中、
パターン及び(a)~(e)は、図1及び図2のパターン及び(a)~(e)に対応する。
れのコロニーから抽出したDNAを鋳型として、挿入が予想される部位を挟むように配置さ
れたプライマーセットでPCRを行った。得られたPCR産物の電気泳動像より、バンドの位置
が高分子側にシフトしているサンプル(すなわち、部分(c)の挿入が起こっていると予
想されるサンプル)の割合を算出した。さらにシークエンシングで確認し、部分(c)の
挿入が起こっているサンプルの割合を求めた。その結果を表8に示す。なお、PCRにより
算出された割合と、シークエンシングにより確認された割合は、ほぼ同じであった。
において目的の変異(部分(c)の挿入)が起こっていた。
pMMB67EHベクターのプロモーター下流に位置するMCSのEcoR IサイトとHind IIIサイト
を制限酵素で切断し、そこへ、野生型mexS遺伝子ORF全長に対して一部の塩基配列が欠失
してなる塩基配列(mexS遺伝子欠失体配列:配列番号22~24)を含むDNA断片を挿入した
。得られたベクターの名称、挿入されたmexS遺伝子欠失体配列の配列番号、及びmexS遺伝
子欠失体配列における欠失部位(野生型mexS遺伝子ORFの5’末端の塩基を1番目の塩基と
する)を表9に示す。
の水に懸濁し、得られた懸濁液をLB培地(lennox)5 mLに添加し、37℃で17時間、振盪培
養した。得られた培養液をクロラムフェニコール含有LB寒天培地上にプレーティングし、
37℃で1日間培養した。コロニー数をカウントし、野生型緑膿菌を用いた場合のコロニー
数に対する、ベクターが導入された緑膿菌を用いた場合のコロニー数の相対値(コロニー
数相対値)を算出した。独立の実験で算出されたコロニー数相対値それぞれを表10に示
す。
る部位が、緑膿菌ゲノムのmexS遺伝子内において欠失すると、該遺伝子から発現するタン
パク質は本来の活性(mexT発現抑制活性)が損なわれることとなり、これによりMexEF-Op
rM薬剤排出ポンプの発現が増強されて、緑膿菌の薬剤耐性能が高まるので、薬剤含有培地
で生育する菌数(コロニー数)が増加することとなる。
コロニー数が大幅に増加した。中でも、mexS遺伝子欠失体配列における欠失塩基数が8で
ある場合は、特に顕著にコロニー数が増加した。このことから、mexS遺伝子欠失体配列が
挿入されたベクターの導入により、目的の変異(ベクター内のmexS遺伝子欠失体において
欠失させている部位が、緑膿菌ゲノムのmexS遺伝子内において欠失すること)が起こるこ
とが示唆された。
ングした結果、mexS遺伝子欠失体配列が挿入されたベクターを導入した場合は、全てのコ
ロニーにおいて、目的の変異が起こっていることが確認された。
GFPのコード配列内に8塩基を挿入してなる改変GFPの発現カセットが導入されたHEK293T
細胞(アッセイ細胞)を作製した。該改変GFPは、8塩基の挿入により読み枠がずれている
ので、翻訳後のタンパク質が不活性型となり、蛍光を示さない。改変GFPのコード配列(
配列番号25)を図8に示す。
の染色体にランダムに挿入されるpCDH-CMV-EGFP-nonPOD-RFP+Puro)を混合し、HEK293Tと
混和し、培地に0.5 ng/μlのピューロマイシンを含む培地で培養し、細胞にpCDH-CMV-EGF
P-nonPOD-RFP+Puroベクターが挿入された細胞集団を濃縮した。この細胞集団をアッセイ
細胞とした。
DNA(100EGFPdelnonPOD:配列番号26、及び120EGFPdelnonPOD:配列番号27)を、DNA合成
受託会社(macrogen)にて合成した。この一本鎖DNAの各部位の塩基数を表11に示す。
表11中、パターン及び(a)~(e)は、図1のパターン及び(a)~(e)に対応する。
塩基の欠失が起こると、正常なGFPタンパク質が発現することになるので、細胞の蛍光が
観察されると予想される。
1.使用前にFuGENE HD Transfection Reagentを室温に戻した。
2.転倒混和またはボルテックスにより混和した。(誤って凍結させ、沈殿が生じた場合は
37°Cで短時間温め、沈殿を融解させた後、室温に戻した。
1. 滅菌チューブに、あらかじめ室温にしたopti-MEM培地672μlを加えた。一本鎖DNA溶
液を14μg加え、ボルテックスで混和した。そこへ、FuGENE HD Transfection Reagentを4
3μl加え、すばやく混合し、FuGENE HD Transfection Reagent/DNA混合液を作成した。
2. FuGENE HD Transfection Reagent/DNA混合液を、室温で10分間インキュベートした。
3. アッセイ細胞が増殖しているプレートに 325μLのFuGENE HD Transfection Reagent/
DNA混合液を加え、優しく混和し、細胞をインキュベータに戻して4日間培養し、それを10
cmディッシュに植え継ぎ、さらに3日間インキュベートした。
4. 培養後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
蛍光観察像を図9に示す。図9に示されるように、蛍光を発する細胞集団が観察された
。
5. 目視で発色した細胞集団を検出・回収し、そこからDNAを抽出し、目的の意図したゲ
ノム編集が起きていることを、次世代sequencer、もしくは、sanger法による塩基配列の
決定により確認した。
Claims (22)
- 1本鎖形態のDNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)1または2塩基長の任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80~200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、30~100である、
前記一本鎖形態のDNAを単離されたヒト細胞(但し、MSH2欠損細胞、ミスマッチ修復(MMR)欠損細胞、配偶子および受精卵を除く)に導入する工程を含み、これにより、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が、(ia)、(ib)、および(ic)からなる群から選択されるいずれかの改変塩基配列に置き換わり、
上記工程においてヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方を用いず、かつ、ソラレンを用いず、
その後、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が改変塩基配列に置き換わった細胞を選別して取得する工程をさらに含む、
ゲノム編集方法。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の水素を-O-メチル、または-O-CH2CH2OCH3に置き換える修飾を含む、
請求項1に記載のゲノム編集方法。 - 一本鎖形態のDNAが化学修飾を有し、化学修飾が、リボースの2位の炭素と4位の炭素とを架橋し、リボースのコンフォメーションをN型に固定する修飾を含む、
請求項1に記載のゲノム編集方法。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列からなる、請求項1~3のいずれかに記載のゲノム編集方法。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列からなる、請求項1~3のいずれかに記載のゲノム編集方法。 - 前記改変塩基配列の塩基数が95~200である、請求項1~5のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 前記改変塩基配列の塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の塩基数の比が10以下である、請求項1~6のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数の比が、0.2~5である、請求項1~7のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 一本鎖形態のDNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)1または2塩基長の任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80~200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、30~100である、
前記一本鎖形態のDNAを含有し、かつ、
ヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方と一緒に用いられず、かつ、ソラレンとも一緒に用いられず、
前記一本鎖形態のDNAをヒト細胞(但し、MSH2欠損細胞でもミスマッチ修復(MMR)欠損細胞でもない)に導入するように用いられる、
ヒト細胞またはヒトのゲノム編集用組成物。 - 一本鎖形態のDNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)1または2塩基長の任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80~200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、30~100である、
前記一本鎖形態のDNAを含有し、かつ、
ヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方と一緒に用いられず、かつ、ソラレンとも一緒に用いられず、
前記一本鎖形態のDNAをヒト細胞(但し、MSH2欠損細胞でもミスマッチ修復(MMR)欠損細胞でもない)に導入するように用いられる、
ヒト細胞またはヒトのゲノム編集用キット。 - 一本鎖形態のDNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)1または2塩基長の任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80~200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、30~100である、
前記一本鎖形態のDNAを単離されたヒト細胞(但し、MSH2欠損細胞、ミスマッチ修復(MMR)欠損細胞、配偶子および受精卵を除く)に導入する工程を含み、これにより、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が、(ia)、(ib)、および(ic)からなる群から選択されるいずれかの改変塩基配列に置き換わり、
上記工程においてヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方を用いず、かつ、ソラレンを用いず、
その後、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が改変塩基配列に置き換わった細胞を選別して取得する工程をさらに含む、
ゲノム編集されたヒト細胞の製造方法。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列からなる、請求項9に記載のゲノム編集用組成物。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列からなる、請求項9に記載のゲノム編集用組成物。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列からなる、請求項10に記載のゲノム編集用キット。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列からなる、請求項10に記載のゲノム編集用キット。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列からなる、請求項11に記載の製造方法。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)6~20塩基長の内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列からなる、請求項1~4および6~8のいずれかに記載のゲノム編集方法。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)6~20塩基長の内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列からなる、請求項9に記載のゲノム編集用組成物。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)6~20塩基長の内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列からなる、請求項10に記載のゲノム編集用キット。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)6~20塩基長の内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列からなる、請求項11に記載の製造方法。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ib)6~20塩基長の任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列からなる、請求項1~3および6~8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記一本鎖形態のDNAが、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ib)8~9塩基長の任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列からなる、請求項21に記載の方法。
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