JP6899564B2 - ゲノム編集方法 - Google Patents
ゲノム編集方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6899564B2 JP6899564B2 JP2018533576A JP2018533576A JP6899564B2 JP 6899564 B2 JP6899564 B2 JP 6899564B2 JP 2018533576 A JP2018533576 A JP 2018533576A JP 2018533576 A JP2018533576 A JP 2018533576A JP 6899564 B2 JP6899564 B2 JP 6899564B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- base sequence
- base
- arbitrary
- sequence
- bases
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 140
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 58
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 39
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 23
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 22
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 22
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 20
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 13
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 433
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 77
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 77
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 77
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 37
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 36
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 22
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 238000013461 design Methods 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 6
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 101150035926 mexR gene Proteins 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 229940123611 Genome editing Drugs 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 2
- 241000736131 Sphingomonas Species 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 125000004200 2-methoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N Antibiotic SQ 26917 Natural products O=C1N(S(O)(=O)=O)C(C)C1NC(=O)C(=NOC(C)(C)C(O)=O)C1=CSC(N)=N1 WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 241000251556 Chordata Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 241000270722 Crocodylidae Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000939384 Homo sapiens Urocortin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101000663233 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Signal recognition particle protein Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000276569 Oryzias latipes Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100237386 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) mexR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 108091064432 SbRNA Proteins 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000270666 Testudines Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091026822 U6 spliceosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N aztreonam Chemical compound O=C1N(S([O-])(=O)=O)[C@@H](C)[C@@H]1NC(=O)C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)\C1=CSC([NH3+])=N1 WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N 0.000 description 1
- 229960003644 aztreonam Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- LNNWVNGFPYWNQE-GMIGKAJZSA-N desomorphine Chemical compound C1C2=CC=C(O)C3=C2[C@]24CCN(C)[C@H]1[C@@H]2CCC[C@@H]4O3 LNNWVNGFPYWNQE-GMIGKAJZSA-N 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000441 neoplastic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 125000002813 thiocarbonyl group Chemical group *C(*)=S 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列、又は
からなる、一本鎖ポリヌクレオチドを細胞に導入するだけで、前記改変塩基配列において前記任意塩基配列が欠失していた場合(図1)はその欠失がゲノム内で起こり、また前記改変塩基配列において前記任意配列が挿入していた場合(図2)はその挿入がゲノム内で起こり、さらに前記改変塩基配列において前記任意塩基配列が置換していた場合(図3)はその置換がゲノム内で起こることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
項1.
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5´末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5´側の塩基の5´側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3´側の塩基の3´側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3´末端の塩基までの塩基数が、40〜300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を細胞又は生物に導入する工程を含む、ゲノム編集方法。
前記一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を合成する工程を含む、項1に記載のゲノム編集方法。
さらに、ゲノム編集された細胞又は生物を回収する工程を含む、項1又は2に記載のゲノム編集方法。
さらに、ゲノム編集された細胞又は生物を選別する工程を含む、項1〜3のいずれかに記載のゲノム編集方法。
ヌクレアーゼ、ガイドRNA、及びそれらの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を導入する工程を含まない、項1〜4のいずれかに記載のゲノム編集方法。 項6.
前記改変塩基配列の塩基数が80〜1000である、項1〜5のいずれかに記載のゲノム編集方法。
前記改変塩基配列の塩基数が90〜300である、項1〜6のいずれかに記載のゲノム編集方法。
欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の塩基数が1〜920である、項1〜7のいずれかに記載のゲノム編集方法。
前記改変塩基配列の塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の塩基数の比が10以下である、項1〜8のいずれかに記載のゲノム編集方法。
前記センス鎖塩基配列の5´末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5´側の塩基の5´側隣の塩基までの塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3´側の塩基の3´側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3´末端の塩基までの塩基数の比が、0.2〜5である、項1〜9のいずれかに記載のゲノム編集方法。
前記一本鎖ポリヌクレオチドが一本鎖DNA又は一本鎖RNAである、項1〜10のいずれかに記載のゲノム編集方法。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5´末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5´側の塩基の5´側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3´側の塩基の3´側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3´末端の塩基までの塩基数が、40〜300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、ゲノム編集用組成物。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5´末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5´側の塩基の5´側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3´側の塩基の3´側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3´末端の塩基までの塩基数が、40〜300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、ゲノム編集用キット。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5´末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5´側の塩基の5´側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3´側の塩基の3´側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3´末端の塩基までの塩基数が、40〜300である、
一本鎖ポリヌクレオチド、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を細胞又は非ヒト生物に導入する工程を含む、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法。
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり且つ
前記センス鎖塩基配列の5´末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5´側の塩基の5´側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3´側の塩基の3´側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3´末端の塩基までの塩基数が、40〜300である、
一本鎖ポリヌクレオチド。
項15に記載の一本鎖ポリヌクレオチドの発現カセットを含有する、発現ベクター。
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列、又は
(ii)前記改変塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列(ただし、前記センス鎖塩基配列と同一の塩基配列は除く)
からなる、一本鎖ポリヌクレオチド(本明細書において、「本発明の一本鎖ポリヌクレオチド」と示すこともある。)、及び本発明の一本鎖ポリヌクレオチドやその発現ベクター(本明細書において、「本発明の発現ベクター」と示すこともある。)を利用したゲノム編集用組成物、ゲノム編集用キット、ゲノム編集方法、ゲノム編集された細胞又は非ヒト生物の製造方法等に関する。
A)センス鎖配列上の(ia)欠失させる配列の直前と直後の塩基、(ib)挿入させる箇所の連続した2つの塩基(直前と直後の塩基)、及び(ic)置換させる配列の直前と直後の塩基を特定し、
B)欠失/挿入/置換の対象のとなる塩基を特定し(欠失の場合は、ヌル)、
C)上記B)で特定された塩基の上流に、センス鎖上の該直前の塩基の上流側X塩基を、イの塩基の下流にセンス鎖上の該直前の塩基の下流側X塩基を、配置する。
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドは、
(i)ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列、又は
(ii)前記改変塩基配列と90%以上の同一性を有する塩基配列
からなる、一本鎖ポリヌクレオチドである。
「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1〜3の部位(a))の5´末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1〜3の部位(c))の最も5´側の塩基の5´側隣の塩基まで(図1〜3の(d))の塩基数と、
欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1〜3の部位(c))の最も3´側の塩基の3´側隣の塩基から、「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1〜3の部位(a))の3´末端の塩基まで(図1〜3の(e))の塩基数
の両方或いは少なくとも一方が、例えば10〜1000、好ましくは20〜1000、より好ましくは30〜500、さらに好ましくは40〜300、よりさらに好ましくは40〜100、特に好ましくは40〜70程度である。
欠失、挿入、又は置換する「任意塩基配列」(図1〜3の部位(c))の最も3´側の塩基の3´側隣の塩基から、「ゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列」(図1〜3の部位(a))の3´末端の塩基まで(図1〜3の(e))の塩基数の比(部位(e)の塩基数/部位(d)の塩基数)は、
特に制限されないが、例えば0.01〜100、好ましくは0.1〜10、より好ましくは0.2〜5、さらに好ましくは0.5〜2である。
本発明の発現ベクターは、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドの発現カセットを含有する発現ベクターである。
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドをゲノム編集対象細胞又はゲノム編集対象非ヒト生物に導入する工程を含む方法により、これらの細胞又は生物のゲノムを編集すること、より具体的には、一本鎖ポリヌクレオチドにおいてゲノムDNA中の任意塩基配列が欠失している場合(図1)は、その欠失をゲノム内で起こすことができ、また一本鎖ポリヌクレオチドにおいて任意塩基配列が挿入している場合(図2)は、その挿入をゲノム内で起こすことができ、さらに一本鎖ポリヌクレオチドにおいて任意塩基配列が置換している場合(図3)は、その置換をゲノム内で起こすことができる。
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドは、ゲノム編集用組成物として利用することもできるし、或いはキットとして利用することもできる。
緑膿菌のmexR遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配列が欠失又は挿入してなる塩基配列(配列番号1〜6)からなる一本鎖DNAを、DNA合成受託会社(macrogen)にて合成した。これらの一本鎖DNAの各部位の塩基数を表1に示す。表1中、パターン及び(a)〜(e)は、図1及び図2のパターン及び(a)〜(e)に対応する。
緑膿菌のmexR遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配列が欠失してなる塩基配列(配列番号7)からなる一本鎖DNAを、DNA合成受託会社(macrogen)にて合成した。この一本鎖DNAの各部位の塩基数を表3に示す。表3中、パターン及び(a)〜(e)は、図1及び図2のパターン及び(a)〜(e)に対応する。
下記(A)〜(D)の一本鎖DNA:を、DNA合成受託会社(FASMAC)にて合成した。(A)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配列が欠失してなる塩基配列(配列番号8〜9)からなる一本鎖DNA、
(B)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のアンチセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配列が欠失してなる塩基配列(配列番号10〜11)からなる一本鎖DNA((A)のアンチセンス鎖)、
(C)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列(配列番号12〜13)からなる一本鎖DNA((A)の、欠失前の配列)、
(D)緑膿菌のmexT遺伝子内の任意のアンチセンス鎖塩基配列(配列番号14〜15)からなる一本鎖DNA((B)の、欠失前の配列)。
緑膿菌のmexR遺伝子内の任意のセンス鎖塩基配列に対して、該配列の中央部の任意塩基配列が挿入してなる塩基配列(配列番号5、6及び16〜21)からなる一本鎖DNAを、DNA合成受託会社(macrogen)にて合成した。これらの一本鎖DNAは、長さ、、挿入される塩基配列等が異なる関係にある。これらの一本鎖DNAの各部位の塩基数を表7に示す。表7中、パターン及び(a)〜(e)は、図1及び図2のパターン及び(a)〜(e)に対応する。
pMMB67EHベクターのプロモーター下流に位置するMCSのEcoR IサイトとHind IIIサイトを制限酵素で切断し、そこへ、野生型mexS遺伝子ORF全長に対して一部の塩基配列が欠失してなる塩基配列(mexS遺伝子欠失体配列:配列番号22〜24)を含むDNA断片を挿入した。得られたベクターの名称、挿入されたmexS遺伝子欠失体配列の配列番号、及びmexS遺伝子欠失体配列における欠失部位(野生型mexS遺伝子ORFの5´末端の塩基を1番目の塩基とする)を表9に示す。
GFPのコード配列内に8塩基を挿入してなる改変GFPの発現カセットが導入されたHEK293T細胞(アッセイ細胞)を作製した。該改変GFPは、8塩基の挿入により読み枠がずれているので、翻訳後のタンパク質が不活性型となり、蛍光を示さない。改変GFPのコード配列(配列番号25)を図8に示す。
1.使用前にFuGENE HD Transfection Reagentを室温に戻した。
2.転倒混和またはボルテックスにより混和した。(誤って凍結させ、沈殿が生じた場合は37°Cで短時間温め、沈殿を融解させた後、室温に戻した。
1. 滅菌チューブに、あらかじめ室温にしたopti-MEM培地672μlを加えた。一本鎖DNA溶液を14μg加え、ボルテックスで混和した。そこへ、FuGENE HD Transfection Reagentを43μl加え、すばやく混合し、FuGENE HD Transfection Reagent/DNA混合液を作成した。
2. FuGENE HD Transfection Reagent/DNA混合液を、室温で10分間インキュベートした。
3. アッセイ細胞が増殖しているプレートに 325μLのFuGENE HD Transfection Reagent/DNA混合液を加え、優しく混和し、細胞をインキュベータに戻して4日間培養し、それを10cmディッシュに植え継ぎ、さらに3日間インキュベートした。
4. 培養後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
蛍光観察像を図9に示す。図9に示されるように、蛍光を発する細胞集団が観察された。
5. 目視で発色した細胞集団を検出・回収し、そこからDNAを抽出し、目的の意図したゲノム編集が起きていることを、次世代sequencer、もしくは、sanger法による塩基配列の決定により確認した。
Claims (14)
- 1本鎖形態のRNAであって、
(i)非ヒトかつ非マウス真核細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80〜200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、10〜100である、
一本鎖形態のRNA、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を非ヒトかつ非マウス真核細胞又は非ヒトかつ非マウス真核生物に導入する工程を含み、これにより、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が、(ia)、(ib)、および(ic)からなる群から選択されるいずれかの改変塩基配列に置き換わり、
上記工程においてヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方を用いない、
ゲノム編集方法。 - 1本鎖形態のRNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80〜200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、10〜100である、
一本鎖形態のRNA、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を単離されたヒト細胞(但し、配偶子および受精卵を除く)に導入する工程を含み、これにより、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が、(ia)、(ib)、および(ic)からなる群から選択されるいずれかの改変塩基配列に置き換わり、
上記工程においてヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方を用いない、
ゲノム編集方法。 - 前記非ヒトかつ非マウス真核細胞又は非ヒトかつ非マウス真核生物が、植物細胞、非ヒトかつ非マウス哺乳動物細胞、植物又は非ヒトかつ非マウス哺乳動物である、請求項1に記載のゲノム編集方法。
- 前記一本鎖形態のRNAが、
(i)真核細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、若しくは
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列
からなる、請求項1〜3のいずれかに記載のゲノム編集方法。 - 前記改変塩基配列の塩基数が95〜200である、請求項1〜4のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 欠失する前記任意塩基配列の塩基数が1〜920である、請求項1〜5のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 前記改変塩基配列の塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の塩基数の比が10以下である、請求項1〜6のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数に対する、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数の比が、0.2〜5である、請求項1〜7のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 導入される発現ベクターの発現カセットに挿入される遺伝子は、前記一本鎖形態のRNAを転写可能なDNAのみからなる、請求項1〜8のいずれかに記載のゲノム編集方法。
- 一本鎖形態のRNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80〜200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、10〜100である、
一本鎖形態のRNA、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を含有し、かつ、
ヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方と一緒に用いられない、
ヒト細胞またはヒトのゲノム編集用組成物。 - 一本鎖形態のRNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80〜200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、10〜100である、
一本鎖形態のRNA、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を含有し、かつ、
ヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方と一緒に用いられない、
ヒト細胞またはヒトのゲノム編集用キット。 - 一本鎖形態のRNAであって、
(i)非ヒトかつ非マウス真核細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して (ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80〜200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、10〜100である、
一本鎖形態のRNA、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を非ヒトかつ非マウス真核細胞又は非ヒト真核生物に導入する工程を含み、これにより、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が、(ia)、(ib)、および(ic)からなる群から選択されるいずれかの改変塩基配列に置き換わり、
上記工程においてヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方を用いない、
ゲノム編集された非ヒトかつ非マウス真核細胞又は非ヒトかつ非マウス真核生物の製造方法。 - 一本鎖形態のRNAであって、
(i)ヒト細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80〜200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、10〜100である、
一本鎖形態のRNA、及びその発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種を単離されたヒト細胞(但し、配偶子および受精卵を除く)に導入する工程を含み、これにより、ゲノムDNAの上記任意のセンス鎖塩基配列が、(ia)、(ib)、および(ic)からなる群から選択されるいずれかの改変塩基配列に置き換わり、
上記工程においてヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方を用いない、
ゲノム編集されたヒト細胞の製造方法。 - 請求項1〜9、12、および13のいずれか一項に記載の方法を実施することに用いるための組成物であって、
一本鎖形態のRNAであって、
(i)細胞中のゲノムDNAの任意のセンス鎖塩基配列に対して
(ia)内部の任意塩基配列が欠失してなる改変塩基配列、
(ib)任意塩基配列が挿入してなる改変塩基配列、若しくは
(ic)内部の連続する2塩基長以上の任意塩基配列が他の塩基配列に置換してなる改変塩基配列
からなり、改変塩基配列の塩基数は、80〜200であり、且つ
前記センス鎖塩基配列の5’末端の塩基から、欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も5’側の塩基の5’側隣の塩基までの塩基数、及び欠失、挿入、又は置換する前記任意塩基配列の最も3’側の塩基の3’側隣の塩基から、前記センス鎖塩基配列の3’末端の塩基までの塩基数が、10〜100である、
一本鎖形態のRNAの発現カセットを含有する、発現ベクターを含み、かつ、
ヌクレアーゼ及びその発現ベクターのいずれかまたは両方と一緒に用いられない、
組成物。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021094033A JP6952315B2 (ja) | 2016-08-12 | 2021-06-04 | ゲノム編集方法 |
JP2021150104A JP7029741B2 (ja) | 2016-08-12 | 2021-09-15 | ゲノム編集方法 |
JP2022018559A JP7078946B2 (ja) | 2016-08-12 | 2022-02-09 | ゲノム編集方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016158562 | 2016-08-12 | ||
JP2016158562 | 2016-08-12 | ||
PCT/JP2017/029213 WO2018030536A1 (ja) | 2016-08-12 | 2017-08-10 | ゲノム編集方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021094033A Division JP6952315B2 (ja) | 2016-08-12 | 2021-06-04 | ゲノム編集方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018030536A1 JPWO2018030536A1 (ja) | 2019-08-15 |
JP6899564B2 true JP6899564B2 (ja) | 2021-07-07 |
Family
ID=61162836
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018533576A Active JP6899564B2 (ja) | 2016-08-12 | 2017-08-10 | ゲノム編集方法 |
JP2021094033A Active JP6952315B2 (ja) | 2016-08-12 | 2021-06-04 | ゲノム編集方法 |
JP2021150104A Active JP7029741B2 (ja) | 2016-08-12 | 2021-09-15 | ゲノム編集方法 |
JP2022018559A Active JP7078946B2 (ja) | 2016-08-12 | 2022-02-09 | ゲノム編集方法 |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021094033A Active JP6952315B2 (ja) | 2016-08-12 | 2021-06-04 | ゲノム編集方法 |
JP2021150104A Active JP7029741B2 (ja) | 2016-08-12 | 2021-09-15 | ゲノム編集方法 |
JP2022018559A Active JP7078946B2 (ja) | 2016-08-12 | 2022-02-09 | ゲノム編集方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190284581A1 (ja) |
EP (2) | EP3498837A4 (ja) |
JP (4) | JP6899564B2 (ja) |
WO (1) | WO2018030536A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022249775A1 (ja) | 2021-05-27 | 2022-12-01 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | ゲノムを編集する方法 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3498837A4 (en) * | 2016-08-12 | 2020-04-15 | Nexuspiral Inc. | GENOME EDITING PROCESS |
WO2021186913A1 (ja) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | 国立大学法人筑波大学 | ゲノムdnaのメチル化状態を改変する方法 |
WO2023190848A1 (ja) * | 2022-03-30 | 2023-10-05 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 一本鎖形態のポリヌクレオチド及びゲノム編集におけるその利用 |
WO2023234409A1 (ja) * | 2022-06-02 | 2023-12-07 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | ゲノム編集の効率を高めるための組成物及びその利用 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2436743A1 (en) * | 2001-02-09 | 2002-08-15 | Gene Bridges Gmbh | Recombination method |
US20040023262A1 (en) * | 2002-03-05 | 2004-02-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Targeted manipulation of genes in plants |
GB0218803D0 (en) * | 2002-08-13 | 2002-09-18 | Nl Kanker I | Targeted gene modification by single-standed DNA oligonucleotides |
MXPA05008319A (es) * | 2003-02-10 | 2006-02-28 | Santaris Pharma As | Compuestos oligomericos para la modulacion de la expresion de survivina. |
GB0803109D0 (en) * | 2008-02-20 | 2008-03-26 | Gene Bridges Gmbh | Method of nucleic acid recombination |
CA2735250A1 (en) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Nippon Steel Kankyo Engineering Co., Ltd. | Universal nucleic acid probe set and method for utilization thereof |
KR101971741B1 (ko) * | 2010-07-23 | 2019-08-14 | 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 | 표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산을 사용하는 게놈 편집 |
WO2013026027A1 (en) * | 2011-08-18 | 2013-02-21 | Nestec S.A. | Compositions and methods for detecting allelic variants |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
RS63427B1 (sr) | 2013-03-15 | 2022-08-31 | Cibus Us Llc | Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti modifikacije ciljnog gena korišćenjem genske reparacije posredovane oligonukleotidom |
WO2015115610A1 (ja) * | 2014-01-31 | 2015-08-06 | 国立大学法人徳島大学 | 発現カセット |
WO2015152024A1 (ja) * | 2014-03-31 | 2015-10-08 | 独立行政法人理化学研究所 | 蛍光性標識一本鎖核酸及びその用途 |
CN106714845A (zh) * | 2014-08-11 | 2017-05-24 | 得克萨斯州大学***董事会 | 通过crispr/cas9介导的基因编辑预防肌营养不良 |
JP6997623B2 (ja) * | 2014-12-12 | 2022-02-04 | エム. ウルフ、トッド | オリゴヌクレオチドを利用して細胞内の核酸を編集するための組成物および方法 |
EP3498837A4 (en) * | 2016-08-12 | 2020-04-15 | Nexuspiral Inc. | GENOME EDITING PROCESS |
-
2017
- 2017-08-10 EP EP17839600.8A patent/EP3498837A4/en not_active Withdrawn
- 2017-08-10 JP JP2018533576A patent/JP6899564B2/ja active Active
- 2017-08-10 WO PCT/JP2017/029213 patent/WO2018030536A1/ja active Search and Examination
- 2017-08-10 US US16/324,626 patent/US20190284581A1/en not_active Abandoned
- 2017-08-10 EP EP22154506.4A patent/EP4056701A1/en not_active Withdrawn
-
2021
- 2021-06-04 JP JP2021094033A patent/JP6952315B2/ja active Active
- 2021-09-15 JP JP2021150104A patent/JP7029741B2/ja active Active
-
2022
- 2022-02-09 JP JP2022018559A patent/JP7078946B2/ja active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022249775A1 (ja) | 2021-05-27 | 2022-12-01 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | ゲノムを編集する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2021151246A (ja) | 2021-09-30 |
EP3498837A1 (en) | 2019-06-19 |
JP6952315B2 (ja) | 2021-10-20 |
JP2022078058A (ja) | 2022-05-24 |
EP4056701A1 (en) | 2022-09-14 |
US20190284581A1 (en) | 2019-09-19 |
EP3498837A4 (en) | 2020-04-15 |
JP7029741B2 (ja) | 2022-03-04 |
JP2022023037A (ja) | 2022-02-07 |
WO2018030536A1 (ja) | 2018-02-15 |
JPWO2018030536A1 (ja) | 2019-08-15 |
JP7078946B2 (ja) | 2022-06-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6952315B2 (ja) | ゲノム編集方法 | |
KR102666695B1 (ko) | Rna를 편집하기 위한 방법 및 조성물 | |
KR102210323B1 (ko) | Rna-안내 게놈 편집을 위해 특이성을 증가시키기 위한 절단된 안내 rna(tru-grnas)의 이용 | |
US20200172935A1 (en) | Modified cpf1 mrna, modified guide rna, and uses thereof | |
KR20220004674A (ko) | Rna를 편집하기 위한 방법 및 조성물 | |
JP2018532419A (ja) | CRISPR−Cas sgRNAライブラリー | |
CN111511906A (zh) | 核酸引导性核酸酶 | |
KR20210106527A (ko) | 바코드화 가이드 rna 구축물을 사용한 고효율의 유전자 스크리닝을 위한 조성물 및 방법 | |
US11834652B2 (en) | Compositions and methods for scarless genome editing | |
US20190241911A1 (en) | Engineered guide rna and uses thereof | |
JP6855037B2 (ja) | ゲノム編集方法 | |
Lee et al. | Characterization of the long terminal repeat of the endogenous retrovirus-derived microRNAs in the olive flounder | |
US20190218533A1 (en) | Genome-Scale Engineering of Cells with Single Nucleotide Precision | |
JP7236718B2 (ja) | ゲノム編集技術 | |
US20230348873A1 (en) | Nuclease-mediated nucleic acid modification | |
WO2024092217A1 (en) | Systems and methods for gene insertions | |
CN115491377A (zh) | 一种诱导rna干扰和降低并清除细胞中病毒污染的核苷酸序列及应用 | |
WO2023225410A2 (en) | Systems and methods for assessing risk of genome editing events | |
CN113574175A (zh) | 基因敲入方法、基因敲入细胞制作方法、基因敲入细胞、癌变风险评价方法、癌细胞制造方法和用于在它们中使用的试剂盒 | |
WO2021154809A1 (en) | Cell specific, self-inactivating genomic editing crispr-cas systems having rnase and dnase activity | |
JP2024518413A (ja) | 修飾ヌクレアーゼ | |
Feehan | Development of methodology for genome editing in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9, targeting the rhodopsin gene | |
JP2005034008A (ja) | 新規遺伝子発現抑制法およびその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190522 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20190522 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190522 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20200304 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20200304 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200807 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200807 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20200807 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20200814 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200825 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20201026 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201127 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210218 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210316 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210426 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210518 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210604 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6899564 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |