JP7060500B2 - 薬学的組成物の製造方法、医薬部外品組成物の製造方法、飼料組成物の製造方法、及び、飲用水添加剤の製造方法 - Google Patents
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Description
疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、IL-6媒介性疾患の治療方法に関する。また、本発明は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、IL-6媒介性疾患の予防又は改善用食品組成物、医薬部外品組成物、飼料組成物及び飲用水添加剤に関する。
関与する分化因子として発見された(非特許文献1)。IL-6は、細胞膜上の2種類のタンパク質を媒介としてその生物学的活性を伝達するが、そのうちの一つは、IL-6が結合するタンパク質であるIL-6受容体であり、細胞膜を貫通して発現される、分子量約80kDの膜結合型タンパク質である。他の一つは、非リガンド結合性のシグナル(signal)伝達系に属する、分子量約130kDの膜タンパク質であるgp130である。IL-6とIL-6受容体は、IL-6/IL-6受容体複合体を形成し、続いてgp13
0と結合する(非特許文献2)。リガンドと受容体が結合すると、細胞内では、Janus Kinases 2(JAK2)がリン酸転移反応(transphosphorylation)によって活性化される。また、前記活性化されたJAK2によって受容体の細胞質ドメインの様々なチロシン残基(tyrosine residues)がリン酸化(phosphorylation)され、これはSH2や、他のリン酸チロシン結合モチーフ(phosphotyrosine binding motif)を有してい
るSTAT3(signal transducers and activators of transcription 3)のような細胞質内タンパク質のドッキングサイト(docking site)の役割を果たす。受容体の細胞質ドメインに結合したSTAT3はJAK2によってリン酸化(phosphorylation)された後
、受容体から離れて出てくる。活性化されたSTAT3は、細胞質内に互いに結合してホモ(homo-)又はヘテロダイマー(heterodimer)を成した後、核内に入って目的遺伝子の認識配列(recognition sequence)に結合して転写を増加させる(非特許文献3及び非特許文献4)。
因子としての役割を果たすことが知られている。特に、STAT3はサイトカインであるIL-6によって活性化されることがよく知られており、表皮成長因子(Epidermal growth factor、EGF)もIL-6によって活性化されると知られている。最近、骨粗しょう症とIL-6との関連性についての研究結果が多く報告されているが、特に、IL-6により誘導されるSTAT3活性が破骨細胞の分化と骨の生成に重要な役割を果たすということが、動物モデルを用いて証明され(非特許文献5)、STAT3欠乏マウス(STAT3-deficient mice)の場合、骨密度及び骨体積が減少し、骨粗しょう症に悪影響を与え
る破骨細胞数が増加されることが観察されたことがある(非特許文献6)。一方、IL-6により誘導されるSTAT3のリン酸化を阻害する化合物であるマジンドリンA(madindoline A)を閉経期の骨粗しょう症の実験のための動物モデルであるOVXマウスに処
理すると、骨の再吸収を阻害し(非特許文献7)、エストロゲン欠乏の骨粗しょう症モデルでは、IL-6による破骨細胞の分化が骨髄細胞から増加し(非特許文献8)、IL-6-/-マウスモデルでは、エストロゲン枯渇による骨の損失と破骨細胞の前駆体数の増加
などの変化が現われないことも報告された(非特許文献9)。前記のようなことは、IL-6が、特に、STAT3のリン酸化を介して骨の形成及び再吸収に重要に作用すること
を示す。
体(anti-IL-6 receptor antibody)を用いたことが最も広く知られている。具体的
には、抗IL-6 R抗体を用いた関節リウマチに対する滑液細胞の成長阻害剤(特許文
献1)、抗IL-6 R抗体を用いた形質球増加症、超免疫グロブリン血症、貧血、腎炎
、悪液質、関節リウマチ、牧畜業者の疾病及び脈管増殖腎炎のようなIL-6産物に起因する疾病の治療などが既に知られている(特許文献2)。また、抗IL-6 R抗体が多
発性硬化症、ブドウ膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性過敏症及びアトピー性皮膚炎のような敏感T細胞関連疾患(特許文献3)、全身性エリテマトーデスの治療、クローン病の治療(特許文献4)、膵臓炎の治療(特許文献5)、乾癬の治療(特許文献6)及び若年性慢性関節炎の治療(特許文献7)に適用されうることも報告された。しかし、前記抗IL-6
R抗体が個体内に導入される場合には、外来タンパク質として認知されうる部分である
エピトープを有することがあるため、治療剤として用いられる場合は、まだ免疫原として作用するという問題点がある。前記のような問題点を解決するために、免疫システムに認識できないタンパク質ではなく、小分子化合物(small molecule compound)を用いて、
IL-6によって媒介される疾患の治療剤を開発するために、多くの研究がなされている。
謝性疾患、炎症性腸疾患、又はアトピー性皮膚炎の予防又は治療に有用に用いられる。特に、ハマナスの花抽出物は、他の部位の抽出物とは異なり細胞毒性がなく、長い間、食品に用いられてきた天然物に由来し副作用がなく、前記の疾患の治療に用いられるという利点がある。
組成物の使用を提供する。
、リンゴ酸(malic acid)、リコペン(lycopene)、トルメント酸(tormentic acid)、オイスカフ酸(euscaphic acid)、 bisaborosaol Aなどの様々な成分を含有し、観賞用及び香水の原料や、吐血、下痢、月経不順、赤痢、疲労回復、又は糖尿病の治療の民間療法で用いられると知られている。しかし、ハマナスの抽出物、特に、ハマナスの花抽出物がIL-6媒介性疾患、具体的には、炎症性腸疾患、骨粗しょう症などの骨代謝性疾患、又はアトピー性皮膚炎の治療用途については知られておらず、本発明者らによって初めて究明された。本発明で、ハマナスは商業的に販売されるものを購入したり、自然から採取又は栽培されたりしたものを用いてもよい。
間は約12時間~4日間、熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出又は超音波抽出などの抽出方法を用いて抽出してもよいが、IL-6媒介性疾患の治療活性のある物質を抽出する方法であれば、制限なく用いてもよい。具体的には、1回~5回連続抽出して減圧ろ過し、そのろ過抽出物を真空回転濃縮機で20~100℃、より具体的には、室温で減圧濃縮して、水、低級アルコール又はこれらの混合溶媒に可溶なハマナスの花抽出物を収得した結果物になってもよいが、本発明のIL-6媒介性疾患の治療効果を示すことができる限り、これに限定されず、抽出液、抽出液の希釈液又は濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物又は精製物をすべて含む。前記ハマナスの花抽出物は、天然、雑種、変種植物から抽出されてもよく、単独で、又は他の薬学的活性抽出物、分画物又は化合物との結合だけでなく、適切な集合で用いてもよい。本発明の一実施例では、粉末化されたハマナスの花にエタノール又は水を入れ、室温で抽出した(実施例1)。
transcription 3)の活性を阻害して、IL-6媒介性疾患の予防又は治療に効果的に用いられる。
して多様な転写因子を活性化させて破骨細胞の分化を促進し、特に、IL-6は、RANKLによって媒介される破骨細胞の分化を促進させることが知られている(非特許文献12)。したがって、IL-6によって活性化されるシグナル伝達を抑制し、破骨細胞の分化を抑制させて、破骨細胞による骨の破壊を減少させることができる物質の場合、骨粗しょう症の治療剤として用いてもよい。本発明のハマナスの花抽出物は、RANKLによって誘導される破骨細胞の分化抑制を効果的に抑制させるため、骨粗しょう症の予防又は治療に有効に用いられることが確認された。
細胞で外部の微生物と抗原提示細胞によってCD4+ Tリンパ球の異常な活性化が起こ
り、これに伴う炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-6、IL-12、IL-17、I
L-23及びIL-27)が持続的に発現されて誘発される病気で、本発明では、DSS処
理によって誘導される炎症性腸疾患の動物モデルで予防又は治療効果を確認した。
の分化を抑制することができる。
吸収の間に正常的なアクチン細胞骨格の構造、波状の端、及び酸性条件を維持する。
factor ligand superfamily member 11、TNFSF11)、TNF関連活性化誘導性サイトカ
イン(TNF-related activation-induced cytokine、TRANCE)、オステオプロテゲリンリ
ガンド(osteoprotegerinligand、OPGL)、及び破骨細胞分化因子(osteoclast differentiation factor、ODF)としても知られている。 RANKLはTNFSF11遺伝子によってコードされるヒトのタンパク質であって、タイプIIの膜タンパク質であり、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor、TNF)スーパーファミリーの一構成として知られている。
際、前記組成物に含まれるハマナスの花抽出物の含量は、特に限定されないが、組成物の総重量に対して、0.0001~10重量%で含まれてもよく、より具体的には、0.001~1重量%で含まれてもよい。
ース(sucrose)又はラクトース(lactose)、ゼラチンなどを混ぜて調剤してもよい。また、単純な賦形剤の他にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当してもよく、一般的に用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他、さまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれてもよい。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール(propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテプソール(witepsol)、マクロゴール、ツイン(tween)61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼ
ラチンなどが用いられてもよい。
び重症度、年齢、性別、疾患の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定されてもよい。本発明の組成物は、個々の治療薬として投与するか、他の治療薬と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次的又は同時に投与されてもよい。そして、単一又は複数に投与されてもよい。前記要素をすべて考慮して副作用なく最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されてもよい。本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、病気の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、好ましい効果のために、本発明のハマナスの花抽出物は、1日0.0001~100mg/kgで
あり、好ましくは0.001~100mg/kgで投与されてもよく、より具体的には、
0.001~500mg/kgが投与されてもよい。投与は、1日に1回投与してもよく
、数回に分けて投与してもよい。前記組成物は、ラット、家畜、ヒトなどの様々な哺乳動物に多様な経路で投与してもよく、投与の方式は、当業界の通常の方法であれば、制限なく含まれ、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜又は脳血管内注射によって投与されてもよい。
マナスの花抽出物が破骨細胞の分化に影響を与えるかどうかをハマナスの果実抽出物と比較した結果、ハマナスの花エタノール抽出物は、60及び30μg/ml濃度でRANK
Lによって誘導される破骨細胞の分化を抑制する活性が優れた反面、ハマナスの果実抽出物はその効果が微々たることを確認した(図3)。
IBDの症状が治療されて、また炎症性サイトカイン(IL-6、IL-17、IFN-γ)も効果的に抑制されることを確認した(図5及び6)。アトピー性皮膚炎の場合、前記皮膚炎の誘発時に重要なHaCaT細胞から1000μg/ml濃度でも毒性を示すこと
なく、また炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-1β、IL-6、CCL17を抑制する効果があった(図7及び8)。
F-α/INF-γによって活性化されるSTAT1のリン酸化及びIκBα分解抑制を介し
てNK-κBを減少する効果があることも確認された(図10)。
をすべて含んでもよく、機能性食品、健康機能食品などの当業界に知られている用語と混用してもよい。
に殺菌、殺虫及びこれらと類似する用途に用いられる製剤のいずれかに該当する物品であって、人や動物の病気を診断、治療、軽減、処置又は予防の目的で使用する物品の中で、器具、機械又は装置でないもの及び人や動物の構造と機能に薬理学的な影響を与える目的で使用する物品の中で、器具、機械又は装置でないものを除く物品を意味し、皮膚外用剤及び個人衛生用品も含む。
本発明で用語、「動物」は、家畜及びペットを含む概念であり、具体的には、犬、猫などのペットと豚、牛などであってもよいが、これに限定されたものではない。本発明の飼料組成物又は飲用水添加剤には、品質の低下を防止するために添加される結着剤、乳化剤、保存剤などをさらに含んでもよく、効用増大のために添加されるアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、プロバイオティクス、香味剤、非タンパク態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、オリゴ糖などをさらに含んでもよく、その他にも飼料の混合剤などをさらに含んでもよく、これに限定されるものではない。
(実施例)
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
ハマナスの花と果実を水できれいに洗浄して日陰で乾燥した後、ワーリンブランドで粉末化させた。粉末化されたハマナスの花と果実500gをエタノール5lに入れて抽出器により10時間、70℃で抽出した後、ろ紙(ワットマン社、アメリカ)で減圧ろ過した後、ろ過抽出物は、真空回転濃縮機で室温にてエタノール溶媒を除去した後、抽出された残渣としてハマナスの花と果実のエタノール抽出物を得た。また、粉末化されたハマナスの花500gを蒸留水5lに入れ、常温で24時間抽出した後、ろ紙(ワットマン社、アメリカ)で減圧ろ過した後、ろ過抽出物は真空回転濃縮機で室温にて水を除去した後、抽出された残渣としてハマナスの花の水抽出物を収得した。
ハマナスの部位別抽出物のIL-6により誘導されるSTAT3の発現抑制効果を測定するために、次のような実験を行った。
Hep3B細胞(ATCC HB-8064)にpSTAT3-LucとpcDNA3.
1(+)(Clontech laboratories、Palo Alto、CA)をリポフェクタミンプラス(Invitrogen社、Carlsbad、CA、USA)で一緒に形質転換させた。2日後からハイグロマイシン(hygromycin)を処理(100μg/ml)してルシフェラーゼ(luciferase)が安定して発現されるクローン(clone)を得た。このクローンからルシフェラーゼが安定して発現さ
れるかは、ルシフェラーゼ分析によって確認した。
前記形質転換した細胞をDMEM(GIBCO 119950965)で無血清培養(serum starvation)し、試料を下記のように1時間処理した後、10ng/mlIL-6(R&D system、USA)を添加して12時間培養した。
2:陽性対照群(IL-6 10ng/ml);
3:抽出物(10、30、60μg/ml)
前記反応した細胞をPBSで洗浄し、50μlの溶解緩衝液(luciferase assay system、promega、USA)を入れて20分間攪拌した後、30-100μlのルシフェラーゼ基質(luciferase assay system、promega、USA)を入れて発色程度をルミノメーター(luminometer; EG&G BERTHOLD、USA)で5分以内に測定した。薬物陽性対照群では、IL-6
活性阻害効果を有する化合物であるOleanolic Acid Acetate(OAA)を用いた(非特許文献14)。実験の結果、ハマナスの花エタノール抽出物及び水抽出物は、濃度依存的にSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害し、特に、ハマナスの花抽出物が60μg/mlの時、97.9%の阻害効果が示されるほど顕著な効果があることを
確認した。これに対し、ハマナスの果実エタノール抽出物は、ハマナスの花抽出物と比較するとやや弱い活性を示した(図1)。
前記形質転換した細胞を96ウェルプレート(96-well plate)にDMEM(GIBCO 119
950965)で無血清培養(serum starvation)して、試料を下記のように処理した後、24時間培養した。
2:陽性対照群(IL-6 10ng/ml);
3:抽出物(10、30、60μg/ml )
24時間を反応した後、MTT溶液(5mg/ml)を20μlずつ各ウェル(well)
に入れた後、4時間培養した。培養後、上澄液を除去した後、100μlのDMSOを入れて、MTT反応で生じたホルマザンクリスタル(formazan crystal)を溶かした。その後、発色程度をプレートリーダー(plate reader、Model 680、BIO-RAD)を用いて570nmで吸光度を測定した。実験の結果、ハマナスの花エタノール抽出物では、花の抽出物が60μg/mlのときも、細胞の生存率が80%以上となり、深刻な細胞毒性を示さな
いが、ハマナスの果実エタノール抽出物の場合は、全体的に細胞毒性が大きいだけでなく、60μg/mlのときに66.8%の生存率を示し、花抽出物より細胞毒性がはるかに
大きいことが確認できた(図2)。これにより、ハマナスの花抽出物は、果実抽出物に比べて安全な物質であることが分かり、前記実施例2の結果と組み合わせてハマナス果実抽出物の結果を見ると、前記ハマナスの果実抽出物が、実施例2でのIL-6により誘導されるSTAT3ルシフェラーゼ阻害活性を有することは細胞毒性によって誘導されたものであることを予測できた。
前記実施例2で骨粗しょう症に関連されるIL-6により誘導されたSTAT3転写活性の抑制効果を確認したところ、ハマナスの花エタノール抽出物がより直接的に骨粗しょう症の治療効果を有することを確認した。
分離し、骨髄スペースを1cc注射器で水洗し、骨髄細胞を得た。分離された骨髄細胞は、10%FBS、抗生剤、M-CSF(30ng/ml)が含まれたa-MEM(a-minimum
essential medium)培地で3日間培養した。3日後、付着された細胞を捕食細胞(bone marrow macrophage、BMM)として用いた。捕食細胞は、 M-CSF(30ng/ml)と
RANKL(50ng/ml)を添加して培養し、ハマナスの花エタノール抽出物を60
、30、10μg/mlで処理した。 4日後、培養した細胞は、TRAP溶液(Sigma Aldrich、USA)で染色して、赤色に染色された細胞を分化した骨破骨細胞と判断した。その結果、ハマナスの花エタノール抽出物は、60、30μg/ml濃度でRANKLによっ
て誘導される破骨細胞の分化を抑制する活性が優れていた。これに対し、ハマナスの果実エタノール抽出物は、破骨細胞の分化抑制活性が微々たることを確認した(図3)。
ハマナスの花エタノール抽出物の骨粗しょう症誘導抑制の効果を確認するために、炎症性骨粗しょう症のマウスモデルを作成した。7週齢C57BL/6雌マウスの頭蓋骨の皮
下部分にLPS 25mg/kgを1週間に1回ずつ、計3回にわたって皮下注射した。実験群は、PBS、LPS、LPS+ アレンドロネート(2mg/kg)、LPS+ハマナ
スの花エタノール抽出物(100mg/kg、300mg/kg、600mg/kg)の6
グループに分けた。PBS群は、LPSを投与してない正常対照群、残りのグループはLPS誘導骨粗しょう症のグループであり、骨粗しょう症の治療剤であるアレンドロネート(alendronate)投与群は、陽性対照群及びハマナス試験群は、4週間、1日1回、それ
ぞれの薬物を経口投与した。
抽出物の治療効果を評価した。その結果、LPS誘導グループで低下した骨密度及び骨質量は骨粗しょう症治療剤の投与群で有意に回復され、ハマナスの花エタノール抽出物投与群(300mg/kg、600mg/kg)でも有意な回復効果が確認された(LPSグループと比較すると、* p <0.05)(図4)。
ハマナスの花エタノール及び水抽出物の炎症性腸疾患の抑制効果を確認するために、炎症性腸疾患のマウスモデルを作成した。4週齢のICR雄マウス(オリエントバイオ購入)を12時間、暗光周期(dark-light cycle)に適応させ、実験開始前の7日間の適応期をもった。対照群のグループを除いて、残りのグループは蒸留水にDSSを添加して3%DSS溶液を作り、14日間任意量(ad libitum)を摂取させ、IBD動物モデルを作製した。3%DSSを添加させる2日前から対照群、3%DSSグループはPBS、スルファサラジン(sulfasalazine、SS)グループは、スルファサラジン 50mg/kg、ハマ
ナスの花エタノール及び水抽出物のグループは、500mg/kgを毎日経口投与した。
16日後、マウスは頚椎脱臼でサクリファイスして、血液、脾臓、腸の部位を切断して状態を確認した。腸は盲腸から直腸まで切断して長さを測定し、結腸部位と直腸部位を組織学に用いた。
は、DSS処理により誘導されるIBD症状を治療する効果が優れており、(図5)、ハマナスの花エタノール及び水抽出物を処理した実験群では、DSS処理により誘導される炎症性サイトカイン(IL-6、IL-17、IFN-γ)を効果的に抑制することを確認した(図6)。
7-1:HaCaT細胞を用いたハマナスの花エタノール及び水抽出物の抗アトピー効
果
ヒトケラチン細胞株(human keratinocyte cell line)であるHaCaT細胞を用いて、ハマナスの花エタノール及び水抽出物の抗アトピー効果を確認した。前記HaCaT細胞は、10%の熱非活性化された(heat-inactivated)FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシン(penicillin-streptomycin)が添加されたDMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium)培地で37℃及び5%のCO2の条件下で培養した。培養が終わった細胞
の生存率は、MTT [3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]還元方法を用いて測定した
。MTT溶液は、生きている細胞でミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ(dehydrogenases)によってホルマザン(formazan)を形成し、細胞の生存有無を確認することができる。細胞毒性を確認するために、HaCaT細胞を96ウェルプレートに5×104細胞/ウ
ェルで37℃にて培養した後、ハマナスの花エタノール抽出物を100~2000μg/
ml、水抽出物を100~10000μg/mlで処理し、24時間培養した。24時間
が経過した後、各ウェルに20μlのMTT溶液を添加して2時間さらに培養した後、培養液を除去して、100μlのジメチルスルホキシド(dimethylsulfoxide)を添加して
570nmで吸光度を測定した。ハマナスの花エタノール抽出物及び水抽出物は、HaCaT細胞において500μg/ml以下の濃度では細胞毒性を示さなかった(図7)。
ル抽出物、水抽出物をそれぞれ1000μg/mlで処理して培養し、細胞からRNAを抽出した。この時、デキサメタゾン(Dexamethasone)10μg/mlは抗アトピー効果を有するもので、陽性対照群として用いた。RNA分離キット(RNAiso Plus reagent、Takarabio社)を用いて細胞から全RNAを分離し、分離された全RNAの吸光度を測定して定量した後、2μgのRNAでcDNAを合成した。各チューブあたり2μlのcDNA、
1μlのセンス及びアンチセンスプライマー溶液(0.4μM)、12.5μlのSYBR Premix Ex Taq(Takarabio社)と9.5μlのdH2Oを一緒に混合して、合計25μlになるようにした。 TNF-α、IL-1β、IL-6及びCCL17 mRNAの発現程度はTP850ソフトウェアを使用してリアルタイムPCRを介して測定した。HaCaT細胞でアトピー誘発時に発現するTNF-α、IL-1β、IL-6及びCCL17サイトカインを確認した。
サイトカインの抑制効果がより優れており(図8)、ハマナスの水抽出物を濃度別に1、10、100μg/mlで処理した結果、濃度依存的にサイトカイン発現量を抑制するこ
とを確認した(図9)。
に関与するシグナル伝達機序
ハマナスの花水抽出物が炎症誘発性サイトカインの発現を抑制する過程に関与するシグナル伝達機序を明らかにするために、STAT1のリン酸化と炎症性サイトカインの転写を調節する因子として重要なシグナル伝達物質であるNF-κBの活性化について測定し
た。非活性状態のNF-κBは、内因性抑制タンパク質であるIκBαに結合して非活性
化状態を維持して、活性化されるとIκBαがリン酸化されて分解され、これらから遊離して核に移動し、転写因子として活動するため、IκBαに対する分解の影響を併せて測定した。HaCaT細胞を0.5mMフェニルメタンスルホニルフルオライド(Phenylmethanesulfonyl fluoride、Sigma社、Cat No. P7626)と5μg/mlのロイペプチン(leupeptin、Sigma社、Cat No. L2884)を含有した抽出緩衝液(0.5% triton X-
100、1mM Na3VO4などを含有したPBS溶液)で溶解させた後、超音波処理
(sonication)してDNAを切断した。タンパク質の量は、ウシ血清アルブミン(bovine
serum albumin)を標準とし、Bio-Rad社のprotein assay kit(Cat No. 500-0002)を用いて測定した。細胞の総タンパク10~50μgを0.1%SDSを含有した8~12%(w/v)ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)で電気
泳動し、ゲルに存在するタンパク質をエレクトロブロッティング(electroblotting)の
方法でニトロセルロース(nitrocellulose、NC)フィルタに移した後、非特異的な結合を遮断するためにニトロセルロースフィルターを5%脱脂粉乳を含有したtris-buffered saline-tween(TBS-tween、Sigma社)溶液に入れ、室温で1時間反応させた。フィルタを標的タンパク質に対する抗体を含有したTBS-tween溶液に入れ、4℃で12時間放
置した後、HRP(horseradish peroxidase、Sigma社、Cat No. P0889)で標識された2次抗体で標識し、ECL(Enhanced chemiluminescence、Thermo scientific社、Cat No.
34080)を用いてバンドを測定した。その結果、ハマナスの花水抽出物は、TNF-α/INF-γによって活性化されたSTAT1のリン酸化を阻害してIκBαの分解を抑制し、
核内のNF-κBが減少することを確認した(図10)。これにより、ハマナスの花水抽
出物は、STAT1とNK-κBの活性化を抑制して炎症性サイトカインの発現量を減少
させて抗アトピー効果があると予測することができる。
Claims (6)
- ハマナスの花の水又はエタノール抽出物を有効成分として含む、IL-6(interleukin-6)媒介性疾患の予防又は治療用薬学的組成物の製造方法であって、前記IL-6(interleukin-6)媒介性疾患は、骨粗しょう症又は炎症性腸疾患である、薬学的組成物の製造方法。
- 前記抽出物が、STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)の活性を阻害するものである、請求項1に記載の薬学的組成物の製造方法。
- 前記抽出物が、破骨細胞の分化を抑制するものである、請求項1に記載の薬学的組成物の製造方法。
- ハマナスの花の水又はエタノール抽出物を有効成分として含む、IL-6(interleukin-6)媒介性疾患の予防又は改善用医薬部外品組成物の製造方法であって、前記IL-6(interleukin-6)媒介性疾患は、骨粗しょう症、又は、炎症性腸疾患である、医薬部外品組成物の製造方法。
- ハマナスの花の水又はエタノール抽出物を有効成分として含む、IL-6(interleukin-6)媒介性疾患の予防又は改善用飼料組成物の製造方法であって、前記IL-6(interleukin-6)媒介性疾患は、骨粗しょう症又は炎症性腸疾患である、飼料組成物の製造方法。
- ハマナスの花の水又はエタノール抽出物を有効成分として含む、IL-6(interleukin-6)媒介性疾患の予防又は改善用飲用水添加剤の製造方法であって、前記IL-6(interleukin-6)媒介性疾患は、骨粗しょう症又は炎症性腸疾患である、飲用水添加剤の製造方法。
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