KR102006998B1 - 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 ｉｌ-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 ｉｌ-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 조성물을 IL-6 매개성 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6 매개성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 의약외품 조성물, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제에 관한 것이다.

Description

개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 ＩＬ-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition for preventing or treating IL-6-mediated disease, comprising extract, fraction, or compounds derived from Ampelopsis brevipedunculata}
본 발명은 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 조성물을 IL-6 매개성 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6 매개성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 의약외품 조성물, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제에 관한 것이다.
인터류킨-6(IL-6)는 B 세포 자극 인자 2(BSF2) 또는 인터페론-2(IFN-2)로도 불리는 사이토카인으로, B 임파구의 활성화에 관여하는 분화인자로 발견되었다. 그 후, 여러 가지 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인이라는 것이 밝혀졌다. IL-6는 세포막 위에 두 종류의 단백질을 매개로 그 생물학적 활성을 전달한다. 하나는 IL-6가 결합하는 단백질인 IL-6 수용체로, IL-6 수용체는 세포막을 관통하여 발현되어 있으며 약 80kDa의 분자량을 가지는 막결합형 단백질이다. 다른 하나는, 비리간드 결합성의 시그날 전달에 속하는 약 130kDa의 분자량을 가지는 막단백질 gp130이다. IL-6와 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성하고, 이어서 gp130과 결합한다. 이러한 리간드와 수용체들의 결합 후, 세포 내에서는 JAK2(Janus Kinase 2)가 인산전이반응(transphosphorylation)에 의해 활성화된다. 활성화된 JAK2에 의해 수용체 세포질 도메인(cytoplasmic domains)의 여러 타이로신 잔기(tyrosine residues)가 인산화(phosphorylation)되고, 이것은 SH2나 다른 인산타이로신 결합 모티프(phosphotyrosine binding motif)를 가지고 있는 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)와 같은 세포질 내 단백질의 도킹 사이트(docking site) 역할을 하게 된다. 수용체의 세포질 도메인(cytoplasmic domain)에 결합한 STAT3는 JAK2에 의해 인산화가 된 후 수용체에서 떨어져 나오며, 이러한 활성화된 STAT3들은 세포질 내에 서로서로 결합하여 호모다이머(homodimer) 또는 헤테로다이머(heterodimer)를 이룬 후 핵 내로 들어가 목적 유전자의 인식 서열(recognition sequence)에 결합하여 전사를 증가시킨다.
이러한 IL-6에 의해 유도되는 신호전달체계와 염증성 질환, 자가면역질환 및 골다공증에 대한 관련성에 대하여 다양한 연구가 진행되어 왔다. 이에, 염증성, 자가면역질환 및 골다공증의 치료를 위해서 IL-6에 의해 유도되는 신호전달체계를 억제시키기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재 IL-6의 신호전달체계의 억제에 대하여 항 IL-6 R 항체(anti-IL-6 receptor antibody)를 이용한 것이 가장 많이 알려져 있다. 상기 항 IL-6 R 항체를 이용한 류마티스성 관절염에 대한 활액 세포 성장 억제제(국제특허공개 제96/011020호), 항 IL-6 R 항체를 이용한 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 류마티스성 관절염, 목축업자 질병 및 맥관증식신염과 같은 IL-6 산물에 기인하는 질병의 치료 등이 이미 알려진 바 있다(국제공개특허 제96/012503호). 또한, 항 IL-6 R 항체는 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연성 과민증 및 아토피성 피부염과 같은 민감성 T 세포 관련 질병(국제특허공개공보 제98/042377호), 전신성 에리테마토스의 치료, 크론병의 치료(국제특허공개공보 제99/047170호), 췌장염의 치료(국제특허공개공보 제00/010607호), 건선의 치료(국제특허공개공보 제02/034292호) 및 연소성 만성 관절염의 치료(국제특허공개공보 제02/080969호)에 적용될 수 있음이 보고되었다. 그러나, 상기 항 IL-6 R 항체의 경우 개체 내에 도입되는 경우 외래 단백질로서 인지될 수 있는 부분인 에피토프를 가질 수 있으므로, 치료제로서 사용될 경우 여전히 면역원성으로 작용하는 단점이 있다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 면역체계에 인지되지 않는 단백질이 아닌 작은 분자 화합물(small molecule compound)을 이용하여 IL-6에 의해 매개되는 질병의 치료제를 개발하기 위하여 많은 연구가 이루어지고 있다.
또한 암과 관련되어 IL-6 신호전달체계는 그 중간 매개인자인 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)와 많은 관련이 있다. STAT3는 골수종, 유방 암종, 전립선 암, 뇌 종양, 두경부 암종, 흑색종, 백혈병 및 림프종, 특히 만성 골수성 백혈병 및 다발성 골수종을 포함하여 여러 형태의 암에 관여하는 것으로 보고되었다(Niu, 등, Cancer Res., 1999, 59, 5059-5063). 쥐 및 인간 전립선 암 양쪽에서 유래된 세포들은 구조적으로 활성화된 STAT3을 갖는 것으로 밝혀졌으며, STAT3는 일부 급성 백혈병(Gouilleux-Gruart, V. 등, Leuk.Lymphoma, 1997, 28, 83-88) 및 T 세포 림프종(Yu,C.L.등, J.Immunol., 1997, 159, 5206-5210)에서 구조적으로 활성화되는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, STAT3은 만성 림프성 백혈병에서 세린 잔기 위에 구조적으로 인산화되는 것으로 밝혀졌다(Frank, D.A., 등, J.Clin.Invest., 1997, 100, 3140-3148). STAT3은, 다발성 골수종을 가진 환자로부터의 골수 단핵 세포 및 배양액 양쪽 모두에서, 골수종 종양 세포에서 구조적으로 활성인 것으로 밝혀졌다. 이러한 세포는 Fas-매개 세포고사에 내성이고 높은 수준의 Bcl-xL을 발현한다. STAT3 신호전달은 세포고사에 대한 내성을 부여함으로써 골수종 종양 세포의 생존을 위해 필수적인 것으로 밝혀졌다(Catlett-Falcone, R. 등, Immunity, 1999, 10, 105-115). 한편, 최근에는 췌장암을 비롯한 Ras에 의해 유도되는 암 환자군에서 이상적으로 IL-6가 분비되고, IL-6를 제거함으로서 Ras에 의한 종양세포의 성장과 혈관생성이 억제될 뿐 아니라 종양의 크기가 감소됨이 보고되었다 (Brooke Ancrile 등, Gene & Development, 2007, 21, 1714-1719). 또한 EGFR이 변이된 폐 선암(lung adenocarcinoma)에서 IL-6가 과발현됨으로서 STAT3가 활성화됨이 밝혀지면서 IL-6에 의한 gp130/JAK/STAT3 경로가 항암치료에 있어서 새로운 타켓으로 부각되고 있다(Sizhi Paul Gao 등, J. Clin. Invest. 2007, 117, 38463856).
또한, STAT3는 류마티스성 관절염을 포함한 자가면역질환 또는 골다공증에 있어 NF-κB와는 또 다른 하나의 중요한 전사인자로서 역할을 하는 것이 알려져 있다. 특히, STAT3는 사이토카인인 IL-6에 의해서 활성화되는 것이 잘 알려져 있으며, 표피 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF)에도 활성화되는 것으로 알려져있다. 최근, 골다공증과 IL-6와의 연관성에 대한 연구결과가 많이 보고되고 있으며, 특히 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 활성이 파골세포의 분화와 뼈 생성에 중요한 역할을 한다는 것이 동물모델을 통하여 입증된바 있으며(Bone 2006, 39, 505-512), STAT3 결핍 마우스(STAT3-deficient mice)의 경우, 골밀도 및 골부피가 감소되어 있으며, 골다공증에 부정적인 영향을 미치는 파골세포 수의 증가가 관찰되었다(BBRC 2005, 328, 800-807). 반면, IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 인산화를 저해하는 화합물인 마딘돌린 A(madindoline A)를 폐경기 골다공증 실험을 위한 동물모델인 OVX 마우스에 처리하면 뼈의 재흡수를 저해하는 활성이 나타난 났으며(PNAS, 2002, 99(23), 14728-14733), IL-6-/- 마우스 모델에서는 에스트로겐 고갈에 따른 뼈 손실과 파골세포의 전구체 수 증가 등의 변화가 나타나지 않았다(EMBO J 1994, 13, 1189-1196). 상기와 같은 사실은 IL-6가 특히, STAT3의 인산화를 통하여 뼈의 형성 및 재흡수에 중요하게 작용함을 나타내는 것이다.
이에 본 발명자들은 IL-6에 의해 활성화되는 STAT3 경로를 표적으로 하여 IL-6 매개성 질환 치료 기능이 있는 천연물을 찾기 위하여 예의 노력한 결과, 개머루덩굴 추출물 및 이의 분획물이 STAT3의 전사활성 및 인산화를 저해하여 IL-6에 의하여 매개되는 신호전달경로를 효과적으로 저해시키고, 특히, 파골세포의 분화를 저해하는 우수한 활성을 가짐을 확인하여, 이를 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 개머루덩굴 추출물로부터 IL-6 매개 신호전달경로를 효과적으로 저해하며, 또한 파골세포의 분화를 저해하는 활성을 가지는 유효 화합물을 규명하여 이를 골 대사성 질환을 비롯한 IL-6 매개성 질환의 치료에 적용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 의약외품 조성물, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure 112016054048305-pat00001
[화학식 2]
Figure 112016054048305-pat00002
[화학식 3]
Figure 112016054048305-pat00003
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 의약외품 조성물, 사료첨가제 및 음용수 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6 매개성 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata)"은 포도과 개머루속에 속하는 덩굴성 낙엽 관목이다. 상기 개머루덩굴은 약리학적 활성에 있어, 지혈작용, 항균작용, 항산화작용 등을 가지는 것으로 알려져 있지만, 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물이 특히 염증성 질환, 골 대사성 질환, 아토피 및 암에서의 치료 용도에 대해서는 알려진 바 없으며, 본 발명자들에 의하여 최초로 규명된 것이다. 본 발명에서 개머루덩굴은 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개머루덩굴 추출물"은 개머루덩굴을 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 개머루덩굴 추출물은 개머루덩굴 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 6(C6)의 알코올 극성 용매, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 극성 용매, 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있으나, IL-6 매개성 질환의 치료 활성이 있는 물질을 추출하는 방법이라면 제한없이 이용될 수 있다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20℃ 내지 100℃, 더 바람직하게는 실온에서 감압 농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 개머루덩굴 조추출물을 수득한 결과물이 될 수 있으나, 본 발명의 IL-6 매개성 질환의 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 이에 제한되지는 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들의 조정제물 또는 정제물의 형태를 모두 포함한다. 상기 개머루덩굴 추출물은 천연, 잡종, 변종식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어, 뿌리, 지상부, 줄기, 잎, 꽃, 열매의 몸통, 열매의 껍질뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터 추출 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는 분말화된 개머루덩굴의 줄기에 에탄올을 넣고 7일간 냉침추출하였다(실시예 1).
본 발명에서 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명의 개머루덩굴 분획물은 개머루덩굴 추출물을 물로 현탁한 후, 헥산, 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 각각 수득할 수 있다. 구체적으로, 개머루덩굴 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산 및 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. p6-7, 1998). 보다 구체적으로, 상기 개머루덩굴 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산 및 에틸아세테이트 용매를 이용하여 연속 추출로 개머루덩굴 각 용매 가용 추출물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 개머루덩굴 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 개머루덩굴 조추출물을 물에 현탁하여, 물 분획물, 헥산 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다(실시예 1-2).
또한, 상기 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물은 대표적인 활성 성분으로 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016054048305-pat00004
[화학식 2]
Figure 112016054048305-pat00005
[화학식 3]
Figure 112016054048305-pat00006
본 발명의 일 실시예에서는, 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물로부터 IL-6 신호전달경로를 효과적으로 차단하는 3종의 유효 화합물을 분리하였다.
구체적으로, 3종의 유효 화합물은 화학식 1의 에틸 갈레이트(ethyl gallate), 화학식 2의 갈릭산(gallic acid) 및 화학식 3의 아로마덴드린(aromadendrin)으로, 에틸 갈레이트는 에틸 3,4,5-트리히드록시벤조에이트(ethyl 3,4,5-trihydroxybenzoate)로, 갈릭산은 4-히드록시-3-메톡시벤조산(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)으로, 아로마덴드린은 3,5,7-트리히드록시-2-(4-히드록시페닐)크로만-4-온(3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one)으로 명명된다.
상기 화합물들을 분리하기 위한 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다.
구체적으로, 개머루덩굴 헥산 분획물과 에틸아세테이트 분획물로부터 실리카겔 크로마토그래피로 화합물을 분리하고 정제하여 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 얻을 수 있다. 상기 화합물 분리를 위한 실리카겔 크로마토그래피를 수행하는 경우, 이동상으로는 n-헥산, n-헥산 에틸아세테이트, 클로로포름ㆍ아세톤 혼합용매 및 메탄올을 사용하는 것이 바람직하고, 추가되는 크로마토그래피에서는 n-헥산ㆍ아세톤 혼합용매를 사용할 수 있다. 이때 사용되는 n-헥산ㆍ에틸아세테이트 혼합용매의 부피비는 50 : 1 ~ 1 : 5 부피비가 바람직하며, 클로로포름ㆍ아세톤 혼합용매일 경우에는 150 : 1 ~ 1 : 4 부피비가 바람직하다. 상기 크로마토그래피는 단일 화합물이 정제될 때까지 1회 내지 수 회에 걸쳐 수행할 수 있으며, 필요에 따라 농축, 재결정을 실시할 수 있다.
본 발명의 상기 3종의 유효 화합물은 IL-6 처리에 의한 STAT3 활성화를 효과적으로 저해하여(도 4), IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다. 또한, 상기 3종의 유효 화합물은 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하여(도 11), 이를 골다공증을 비롯한 골 대사성 질환의 예방 또는 치료에 적용될 있는 효과를 지닌다.
본 발명의 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 상기 3종의 화합물은 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3) 및 JAK2(Janus kinase 2) 저해 활성을 나타내어, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "IL-6 매개성 질환"은 IL-6에 의한 신호전달경로가 활성화되어 발명하는 질환을 총칭하는 의미로서, 구체적으로 IL-6에 의하여 JAK2 및 STAT3가 인산화되어 활성화됨에 따라 발병하는 질병을 의미한다. 구체적으로, IL-6는 gp130, gp80과 같은 수용체에 결합하면, JAK2가 인산화되어 활성화되고, 이는 다시 STAT3 단백질의 인산화를 가져와 STAT3 단백질을 활성화시킨다. 활성화된 STAT3 단백질은 핵 내로 들어가 표적 유전자를 발현시킴을 통하여 IL-6 매개성 질환의 발병 또는 진행을 가져올 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 IL-6 매개성 질환은 본 발명의 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물에 의하여 예방 또는 치료될 수 있는 질환이라면 제한없이 포함하며, 그 예로 염증성 질환, 골 대사성 질환, 아토피 또는 암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 것으로, 본 발명의 목적상 상기 IL-6에 의해 활성화된 STAT3에 의하여 매개되는 염증성 질환을 의미할 수 있다. 상기 염증성 질환의 예로 알레르기, 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 신염, 악액질, 목축업자 질병, 맥관증식신염, 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연과민증, 접촉피부염, 전신성 에리테마토스, 크론병, 건선, 연소성 특발성 위축증, 당뇨병 또는 알쯔하이머가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 염증성 질환에서 활성화된 STAT3 단백질은 주요 전사인자로 작용하여 염증성 질환의 발병 및 진행을 가져오므로, STAT3 단백질의 활성화를 효과적으로 저해하는 본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "골 대사성 질환"은 조골세포 및 파골세포의 불균형으로 인해 유발되는 골 관련 질환을 의미한다. 이러한 질환의 예로는 과도한 파골세포의 골 흡수에 의한 골다공증(osteoprosis), 관절염(arthritis), 치주질환(periodontal disease), 골절 또는 파제트병(Paget disease) 등과 같은 병리학적 골 질환으로 골 파괴를 촉진하는 질환이 포함되나, 상기 골 대사성 질환에 한정되는 것은 아니다.
그 중, "골다공증"은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 뼈의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 의미한다. 뼈는 인체 내 여러 기관들을 보호하고 칼슘과 같은 체내에 필요한 물질들을 보관하는 저장소로서 기능하며, 뼈 조직에 존재하는 뼈를 분해하는 파골세포(osteoclast) 및 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 간의 균형에 이어 항상성이 유지된다. 골다공증의 경우에는 두 세포 활성이 균형이 깨지게 되면서 파골세포에 의한 지나친 뼈의 파괴가 일어나 발병 및 진행된다. 골다공증에서 주요한 분자로는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)이 있으며, RANKL이 이의 수용체에 결합하여 다양한 전사인자를 활성화시켜 파골세포의 분화를 촉진시키며, 특히, IL-6는 RANKL에 의해 매개되는 파골세포 분화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Kim K et al., J Immunol. 2007 May 1;178(9):5588-94.). 따라서, IL-6에 의해 활성화되는 신호전달을 억제시키고, 파골세포의 분화를 억제시켜 파골세포에 의한 뼈의 파괴를 감소시킬 수 있는 물질의 경우 골다공증의 치료제로서 이용될 수 있다. 본 발명의 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화학식 1 내지 3의 화합물은 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제를 효과적으로 억제시키므로, 골다공증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 "관절염"은 하나 이상의 관절 부위에 염증을 수반하는 관절 질환을 의미한다. 상기 관절염의 일반적인 형태는 관절을 보고하고 있는 연골의 점진적인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대에 손상이 일어나서 염증과 통증이 생기는, 골관절염(osteoarthritis)이다. 본 발명의 목적상 상기 관절염은 관절 부위에 뼈 손실을 수반하는 질환으로, 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나, 골관절염 또는 류마티스 관절염 등이 있다.
상기 "치주질환"은 세균에 의해 야기되는 치아지지 조직의 염증상태를 말하며, 치은염 및 치주염으로 분리할 수 있다. 발병원인은 불량한 구강 위생상태로 인한 구강 세균이 치면 세균막을 형성하는 데 있다. 치면 세균막이란 침에 있는 끈끈한 물질을 접착제로 이용하여 세균이 치아 표면에 달라붙은 후 증식한 세균덩어리를 말한다. 치면 세균막은 그냥 방치해 두면, 염증이 생겨 가끔 잇몸에서 피가 나고, 구취가 나는 경우가 있으며 이러한 증상을 치은염이라고 한다. 치은염이 더 진행되면, 치아와 잇몸 사이의 벌어진 틈이 더 깊어져서 치주낭이 생기고, 여기에 치주질환을 일으키는 세균들이 번식하여 치주염이 발생 된다. 치주염이 진행되면 칫솔질과 같은 약한 자극에도 잇몸에서 피가 나기도 하며 붓고, 종종 급성염증으로 변화되어 통증을 유발한다. 이러한 염증은 골을 만드는 기능은 저하시키고, 골을 흡수하는 작용이 높아져서 치조골이 점점 낮아지게 되어 치조골이 파괴되고 결국 치아를 상실하게 된다.
상기 "골절"은 뼈나 골단판 또는 관절면의 연속성이 비정상적으로 끊어진 상태로, 뼈의 깨짐을 일컫는다. 골절을 유발하는 원인으로는 교통사고 등의 외상, 산업장애에서 일어나는 안전사고, 골다공증, 골암, 대사이상증 등의 질병으로 인한 뼈의 변화 및 스포츠나 하중으로 인한 반복적인 뼈에 대한 스트레스 등이 있다. 또한, 골절 상태는 골절선(골 절단에 의해 발생된 뼈 끝단을 따른 선)에 근거하여, 균열 골절, 그린스틱(greenstick) 골절, 횡상 골절, 사상 골절, 나선상 골절, 분절 골절, 분쇄골절, 견열 골절, 압박 골절, 함몰 골절 등으로 분류된다.
상기 "파제트 병"은 골 재형성이 과도하게 항진되어 광범위한 부위의 골격계가 침범되는 국소성 골 질환을 의미한다. 파제트병의 병리학적인 기전은 뼈를 청소하는 기능을 가진 파골 세포에 의한 골 흡수의 과다한 증가와 이에 따른 보상작용으로 뼈를 만드는 기능을 가진 조골 세포에 의한 새로운 골 형성의 증가가 결합된 것으로 알려져 있으며, 또한, 골 파제트병에서 새롭게 형성된 뼈는 구조적으로 무질서하고 뼈 변형과 골절에 매우 취약한 상태로 알려져 있다.
상기와 같은 골 대사성 질환의 예방 또는 치료에 있어, 본 발명의 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 파골세포의 분화를 억제하며, 파골세포의 골 흡수를 저해하는 활성을 나타내므로 상기 질환들에 대해 예방 또는 치료 효과를 가져올 수 있다.
본 발명에서 용어, "아토피"는 피부질환의 일종으로서, 피부의 부스럼, 습진, 간지러움을 동반하는 질병이다. 상기 아토피의 발병에는 환경적 요인 및 유전학적 요인 모두가 관여하는 것으로 알려져 있으나, 정확한 발병기전은 규명되지 않았다. 상기 아토피는 케라틴세포 또는 내피세포에서 유래한 단백질을 항원을 인식하고 면역 반응을 일으키는 증상을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 기존에 보고된 바에 따르면 아토피는 CD28에 대한 자가항체를 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 CD28 자가항체는 T 세포의 활성화를 가져올 수 있을 뿐만 아니라 아토피와 다른 염증성 피부 질환과 구별할 수 있는 특징으로 제시된 바 있다(Clin Exp Immunol. 2006 Nov;146(2):262-9.). 아토피는 최근에는 유소아 뿐만 아니라 성인에서도 빈번하게 발병하여, 그 예방 또는 치료가 중요한 사회적인 문제가 되고 있으나 그 원인이 명확하게 규명되지 않았다. 또한, 기존에 사용되고 있는 스테로이드 제제 등의 효과가 뛰어나지 않을 뿐만 아니라 부작용의 문제가 있어, 효과가 뛰어나면서도 유소아에도 사용가능한 안전한 아토피의 치료제의 개발이 요구되는 실정이다. 본 발명의 조성물은 천연물 유래로, 스테로이드 제제 등에 비하여 유소아에 적용하기 안전한 이점을 지닌다. 또한, 본 발명의 조성물에 있어, 아토피의 예방 또는 치료를 위해 포함되는 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물은 IL-6 매개 경로를 차단함으로써, IL-6 매개 신호전달경로에 의한 부종을 비롯한 아토피 피부염에 수반되는 다양한 염증 현상을 완화시킴으로써 아토피 피부염을 효과적으로 치료할 수 있도록, 개머루덩굴의 줄기 부분으로부터 추출하여 수득한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 조성물에 의하여 치료될 수 있는 암이라면 제한없이 포함하며, 그 예로 췌장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 간암, 위암, 결장암, 골암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 또는 중추신경계 종양일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 IL-6 매개성 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 IL-6 매개성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 개머루덩굴의 에탄올 추출물; 이의 헥산, 에틸아세테이트 및 물 분획물; 및 헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물에 대한 크로마토그래피 분획이 IL-6에 의해 유도되는 STAT3 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 1 내지 3). 특히, 개머루덩굴의 에탄올 추출물은 STAT3의 인산화 및 JAK2의 인산화를 농도의존적으로 저해시키는 결과를 나타내어(도 5 및 6), 상기 개머루덩굴의 에탄올 추출물 및 이의 분획물을 IL-6에 의하여 매개되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 개머루덩굴 에탄올 추출물이 효과적으로 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 억제시키는 것을 확인하였다(도 7). 파골세포는 골을 흡수하여 골다공증과 같은 골 질환을 유도 한다. 특히, 다핵성 파골세포의 수를 개머루덩굴 에탄올 추출물이 의미 있게 감소시킴을 확인할 수 있었으며(도 7B), 사용된 개머루덩굴 추출물 농도에서 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다(도 7C). 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면 RANKL에 의해 발현되며 파골세포의 분화에 핵심적인 역할을 하는 전사인자인 c-Fos와 NFATc1의 유전자 및 단백질 발현이 개머루덩굴 에탄올 추출물 처리에 의해 효과적으로 억제되는 것을 볼 수 있었으며(도 8A, 8B), 파골세포의 분화에 중요한 유전자인 OSCAR, TRAP, cathepsin K, 그리고 DC-STAMP의 유전자 발현 모두 개머루덩굴 에탄올 추출물에 의해 효과적으로 억제됨을 볼 수 있었다(도 8C). 개머루덩굴 에탄올 추출물에 의한 파골세포 분화 억제 작용기전을 규명하기 위하여 RANKL의 하위신호전달기전인 p38, AKT, ERK, 그리고 IκB의 인산화를 측정한 결과, 개머루덩굴 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 유도되는 p38과 IκB의 인산화를 억제하였으며 AKT와 ERK의 인산화에는 영향을 주지 않았다(도 9). 또한, 개머루덩굴 에탄올 추출물은 파골세포의 형성을 억제할 뿐만 아니라 파골세포의 골 흡수 작용 또한 억제함을 볼 수 있었다(도 10). 따라서, 본 발명의 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물은 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료, 특히 골다공증을 비롯한 골 대사성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 개머루덩굴, 이의 추출물, 분획물 및 IL-6 매개성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명의 추출물 또는 분획물을 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로, 바람직하게는 염증성 질환, 골 대사성 질환, 아토피 또는 암의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물 또는 이의 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
본 발명의 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함한다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄 산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 또한, 상기 식품은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환 등의 제형으로도 제조될 수 있다. 본 발명에 의한 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 것 이외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 개머루덩굴, 이의 추출물, 분획물 및 IL-6 매개성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명의 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.
본 발명의 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제가 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다.
상기 개머루덩굴, 이의 추출물, 분획물 및 IL-6 매개성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "사료 첨가제"는 영양적 또는 특정 목적을 위하여 사료에 미량으로 첨가되는 물질을 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 첨가되는 물질을 의미한다. 여기서, 동물이란 가축 및 애완동물을 포함하는 개념이다.
본 발명의 사료첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위해 첨가되는 결착제, 유화제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있고, 효용 증대를 위하여 첨가되는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태 질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "음용수 첨가제"는 영양적 또는 특정 목적을 위하여 동물을 대상으로 하는 음용수에 미량으로 첨가되는 물질을 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 첨가되는 물질을 의미한다. 여기서, 동물이란 가축 및 애완동물을 포함하는 개념이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 화학식 1 내지 3의 화합물, IL-6 매개성 질환, 예방 또는 치료 및 약학적 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 이를 포함하는 당업계에 공지된 천연물로부터 분리 정제하여 사용하거나, 또는, 상업적으로 시판되는 화합물을 구입하거나 합성하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 염"은, 표적 개체가 생리학적으로 수인 가능한 본 발명의 화합물의 모든 염을 의미하며, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형임이 바람직하다. 상기 약학적 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨,칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 화학식 1 내지 3의 화합물, IL-6 매개성 질환, 및 식품 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 화학식 1 내지 3의 화합물, IL-6 매개성 질환, 및 의약외품 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, IL-6 매개성 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다.
상기 화학식 1 내지 3의 화합물, IL-6 매개성 질환, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 IL-6 매개성 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6 매개 질환의 치료 방법을 제공한다.
상기 조성물, IL-6 매개성 질환 및 치료에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 IL-6 매개성 질환 의심 개체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫트, 닭 또는 인간을 포함하는 포유류 전체를 의미하나, 상기 예에 의해 본 발명의 포유류가 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 IL-6에 의한 신호전달을 효과적으로 저해시키고 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로, 상기 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 본 발명의 조성물은 IL-6 매개성 질환, 예컨대 염증성 질환, 골 대사성 질환, 아토피 또는 암의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물은 오랫동안 천연약재로 사용되어온 천연물에서 유래되어 부작용이 없이 상기 질환의 치료에 이용될 수 있는 이점이 있다.
도 1은, 개머루덩굴 에탄올 추출물, 헥산, 에틸아세테이트 및 물 분획물의 IL-6 유도 루시퍼라제의 발현 저해활성을 나타낸 도이다.
도 2는, 개머루덩굴 헥산 분획물의 1차 컬럼크로마토그래피 분획(fraction)의 IL-6 유도 루시퍼라제의 발현 저해활성을 나타낸 도이다.
도 3은, 개머루덩굴 에틸아세테이트 분획물의 1차 컬럼크로마토그래피 분획의 IL-6 유도 루시퍼라제의 발현 저해활성을 나타낸 도이다.
도 4는, 개머루덩굴 추출물에서 분리한 유효 화합물들(에틸 갈레이트, 갈릭산 및 아로마덴드린)의 IL-6 유도 루시퍼라제의 발현 저해활성을 나타낸 도이다.
도 5는, 개머루덩굴 에탄올 추출물의 IL-6 유도 STAT3 인산화 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 6은, 개머루덩굴 에탄올 추출물의 IL-6 유도 JAK2 인산화 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 7은, 개머루덩굴 에탄올 추출물의 RANKL 유도 파골세포 분화 억제활성을 나타낸 도이다.
도 8은, 개머루덩굴 에탄올 추출물이 RANKL 유도 파골세포의 분화에 필요한 유전자 및 단백질의 발현을 억제하는 것을 보여주는 도이다.
도 9는, 개머루덩굴 에탄올 추출물이 RANKL의 하위신호전달기전인 p38과 IκB의 인산화 기전을 억제하여 파골세포의 분화를 억제한다는 것을 보여주는 도이다.
도 10은, 개머루덩굴 에탄올 추출물이 파골세포의 골 흡수를 저해하는 활성을 보여주는 도이다.
도 11은, 분리한 유효화합물인 에틸 갈레이트(EG), 갈릭산(GA) 및 아로마덴드린(AD)의 RANKL 유도 파골세포 분화 억제활성을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 개머루덩굴 추출물 및 이의 분획물의 제조
실시예 1-1: 개머루덩굴 추출물의 제조
개머루덩굴은 줄기 부분을 물로 깨끗이 세척하여 그늘에서 건조한 후, 와링 브랜드로 분말화시켰다. 분말화된 개머루덩굴 6㎏을 에탄올 60ℓ에 넣고 실온에서 7일간 냉침 추출한 후, 여지(와트만사, 미국)로 감압 여과한 다음, 여과 추출물을 진공회전농축기로 실온에서 에탄올 용매를 제거하고, 추출된 잔사로서 개머루덩굴 조추출물 250g을 수득하였다.
실시예 1-2: 개머루덩굴 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획(fraction)의 제조
상기 조추출물에서 활성 분획물을 분리하기 위하여, 개머루덩굴 조추출물을 물 1ℓ에 현탁 시킨 후 동량의 헥산을 가하여 혼합하여 분획하고, 이 과정을 3회 반복하여 수가용성 분획물 1ℓ 및 헥산 가용성 분획물 3ℓ를 얻은 후, 이 헥산 가용성 분획물을 감압농축하여 헥산 가용 추출물 32g을 수득하였다. 이 수가용성 분획물 1ℓ에 에틸아세테이트를 가하여 혼합하여 분획하고, 이 과정을 3회 반복하여 수가용성 분획물 1ℓ 및 에틸아세테이트 가용성 분획물 3ℓ를 얻은 후, 이 에틸아세테이트 가용성 분획물을 감압농축하여 에틸아세테이트 가용 추출물 75g을 수득하였고, 남은 수가용성 분획물을 감압농축하여 100g을 수득하였으며, 이를 물 분획물로 사용하였다.
상기 헥산 분획물을 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 행하였다. 이때, 클로로포름과 메탄올은 50:1 내지 0:100(v/v)인 용매를 사용하였다. 각각의 용출 용매를 TLC(Thin-layer chromatography)로 분석한 후 10개의 소분획으로 나누고, 이를 감압 농축하여 헥산 층 1차 컬럼 크로마토그래피 분획으로 사용하였다. 또한, 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 행하였다. 이때, 클로로포름과 메탄올은 50:1 내지 0:100(v/v)인 용매를 사용하였다. 각각의 용출 용매를 TLC로 분석한 후 13개의 소분획으로 나누고, 이를 감압 농축하여 에틸아세테이트 층을 1차 컬럼 크로마토그래피 분획(fraction)으로 사용하였다.
실시예 2: 개머루덩굴 추출물 및 이의 분획물로부터 유효 화합물의 분리 및 구조 동정
실시예 2-1: 유효화합물의 분리 및 정제
상기 헥산 분획물과 에틸아세테이트 분획물을 합쳐서 얻은 107 g의 분획물을 가지고 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 행하였다. 이때, 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름과 메탄올의 혼합용매 비율은 100 : 0 : 0 : 0 내지 0 : 0 : 0 : 100(v/v)인 용매를 사용하였다. 각각의 용출 용매를 TLC로 분석한 후 38개의 소분획으로 나누고, 이를 감압 농축하여 헥산과 에틸아세테이트 층 1차 컬럼 크로마토그래피 분획으로 사용하였다. 1차 컬럼 크로마토그래피 분획 중 23번째 소분획물 10.85g을 헥산, 아세톤의 혼합용매(100 : 0 ~ 1 : 1, v/v)를 이동상으로 하였으며, 중압 액체크로마토그래피를 사용하여 13개의 소분획물을 수득하였다. 이들 중 다섯 번째 분획물(Fr.5)에서 화합물 1(335 mg)을 수득하였다.
헥산과 에틸아세테이트 층 1차 컬럼 크로마토그래피 분획 중 25번째 소분획물 2g을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매(100 : 0 ~ 70 : 30, v/v)를 이동상으로 하였으며, 중압 액체크로마토그래피를 사용하여 6개의 소분획물을 수득하였다. 이들 중 네 번째 분획물(Fr.4)에서 화합물 2(453.1 mg)를 수득하였다.
헥산과 에틸아세테이트 층 1차 컬럼 크로마토그래피 분획 중 23번째 소분획물 10.85 g으로부터 얻은 13개의 소분획물 중 일곱 번째 분획물(Fr.23-7)을 가지고 역상계 충전제(COSMOSIL 140C18-Prep.)를 이용한 크로마토그래피 분획을 실시하였다. 이를 통하여 6개의 소분획물을 얻었으며 이중 네 번째 분획물(Fr.23-7-4)에서 화합물 3(157.4 mg)을 수득하였다.
실시예 2-2: 유효화합물의 구조 분석
상기 실시예 2-1에서 얻은 화합물 1, 2, 3의 분자량 및 분자식을 액체크로마토질량분석기(AGILENT1100)를 사용하여 결정하였다. 또한, 핵자기공명(NMR) 분석 (JEOL, JNM EX-400)을 통한 1H NMR, 13C NMR의 분광학 자료를 이용하여 분자구조를 결정하였다.
이상의 기기분석 결과를 발표된 문헌의 것과 비교 분석한 결과, 하기 화학식 1로 표시되는 에틸갈레이트(Ethyl gallate), 하기 화학식 2로 표시되는 갈산(Gallic acid), 하기 화학식 3으로 표시되는 아로마덴드린(Aromadendrin)을 확인하였다. 구체적인 분석결과는 다음과 같았다.
화합물 1 : 에틸 갈레이트(Ethyl gallate)
[화학식 1]
Figure 112016054048305-pat00007
1) 물성 : white granular (m.p. 149-153 ℃)
2) 분자량 : 198.17
3) 분자식 : C9H10O5
4) 1H-NMR (methanol-d3, 400 ㎒) δ 1.35(t), 4.27(dd), 7.04(s) 13C-NMR (methanol-d3, 100 ㎒) δ 14.78, 61.80, 110.17, 121.95, 139.84, 146.64, 168.71
화합물 2 : 갈릭산(Gallic acid)
[화학식 2]
Figure 112016054048305-pat00008
1) 물성 : White, yellowish-white crystals (m.p. 258 - 265 ℃)
2) 분자량 : 170.12
3) 분자식 : C8H6O5
4) 1H-NMR (methanol-d3, 400 ㎒) δ 7.05(s) 13C-NMR (methanol-d3, 100 ㎒) δ 110.48, 122.28, 139.69, 146.53, 170.60
화합물 3 : 아로마덴드린(Aromadendrin)
[화학식 3]
Figure 112016054048305-pat00009
1) 물성 : White-gray, crystals (m.p. 228 ℃)
2) 분자량 : 288.25
3) 분자식 : C15H12O6
4) 1H-NMR (methanol-d3, 400 ㎒) δ 4.55(d), 5.88(d), 5.92(d), 6.83(d), 6.83(d), 7.35(d), 7.35(d). 13C-NMR (methanol-d3, 100 ㎒) δ 73.6, 85.0, 96.3, 97.4, 101.8, 116.1, 116.1, 129.3, 130.4, 130.4, 159.2, 164.6, 165.3, 168.9, 198.5
실험예 1: 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분 획의 IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 전사활성 억제 효과 확인
개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 및 1차 컬럼 크로마토그래피 분획의 IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 활성 억제 효과를 측정하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실험예 1-1: 형질전환체의 제조
Hep3B 세포(ATCC HB-8064)에 STAT3에 의해 루시퍼라아제가 발현되는 pStat3-Luc, 및 pcDNA3.1(+)(Clontech laboratories, Palo Alto, CA)을 lipofectamin plus(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 함께 형질감염시켰다. 형질감염 이틀 후부터 하이그로마이신(hygromycin)을 처리(100㎍/㎖)하여 루시퍼라아제(luciferase)가 안정하게 발현되는 클론을 얻었다. 이 클론에서 루시퍼라아제가 안정하게 발현되는지는 루시퍼라아제 어세이를 통해 확인하였다.
실험예 1-2: IL-6 반응성 STAT3 리포터 유전자 검사
상기 형질감염된 세포를 DMEM 배지(GIBCO 119950965)로 무혈청 배양(serum starvation)하고 시료를 하기와 같이 1시간 처리한 후 10ng/㎖ IL-6(R&D system, USA)를 첨가하여 12시간 동안 배양하였다.
1: 음성대조군(비처리군);
2: 양성대조군(IL-6 10ng/㎖);
3: 추출물, 분획물 및 헥산 층 1차 컬럼 크로마토그래피 분획(25, 50㎍/㎖), 에틸아세테이트 층 1차 컬럼 크로마토그래피 분획(10, 30㎍/㎖)
상기 반응한 세포를 PBS로 세척하고 50㎕ 용해 완충용액(luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 20분간 교반한 후, 30㎕ 내지 100㎕의 루시퍼라제 기질(luciferase assay system, promega, USA)을 넣고 발색 정도를 루미노미터 (luminometer; EG&G BERTHOLD, USA)로 5분 안에 측정하였고, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 개머루덩굴 에탄올 추출물, 및 헥산, 에틸아세테이트 및 물 분획물은 모두 IL-6에 의해 매개되는 STAT3의 활성을 저해되는 결과를 나타내었다. 구체적으로, 개머루덩굴 에탄올 추출물의 경우 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 각각에서 83.9%, 101.0%의 저해활성을 나타내었으며, 개머루덩굴 헥산 분획물은 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 각각에서 100.9%, 101.6%의 저해활성을 나타내었으며, 에틸아세테이트 분획물은 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 각각에서 89.1%, 101.1%의 저해활성을 나타내었고, 물 분획물은 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 각각에서 19.4%, 99.2%의 저해활성을 나타내었다.
또한, 헥산 층 1차 컬럼 크로마토그래피 분획의 경우, 분획 1 내지 10 모두에서 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 농도에서 STAT3의 활성을 효과적으로 저해시키는 결과를 나타내었으며(도 2), 에틸아세테이트 층 1차 컬럼 크로마토그래피 분획의 경우, 10㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 모두에서 STAT3의 활성을 효과적으로 저해시키는 결과를 나타내었다(도 3). 분리한 유효화합물의 경우, 에틸 갈레이트와 갈릭산이 60㎍/㎖ 농도에서 각각 62.2%와 59.7%의 STAT3 저해활성을 나타내었으며, 아로마덴드린의 경우는 상기 두 화합물보다 좀 더 낮은 STAT3 저해활성을 나타내었다(도 4).
실험예 1-3: IL-6 유도 Stat3 및 JAK2 인산화 저해활성 검정
6웰 플레이트에 5×105세포/웰로 Hep3B 및 U266 세포를 배양접시에 80%의 분포(Confluency)로 배양한 후, 무혈청 배지로 교환하여 추가로 12시간 배양하고 하기와 같이 시료를 60분간 처리하였다.
1: 음성대조군(비처리군);
2: 양성대조군(IL-6 10ng/㎖);
3: 추출물 및 분획물(10, 30, 60㎍/㎖)
8: Genestein 처리군 (100μM)
그 다음, 20ng/㎖ IL-6를 처리하여 20분간 반응한 뒤 40㎕ 용해 완충용액 (pH 8, 20mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% Triton X-100, 1mM Na3VO4, 2mM EDTA, 1mM PMSF, 20mM 류펩틴(leupeptin), 20mg/㎖ 아포토닌(aprotonin); Sigma, USA)을 사용하여 세포를 용해시킨 후, 원심분리(13,000g, 15분)하여 단백질이 녹아있는 상등액을 수득하였다. 단백질의 농도는 DC 단백질 검사 키트(Bio-Rad, USA)를 이용하여 정량하였고, 4 내지 12% SDS 폴리아크릴아마이드 겔(SDS-PAGE)에 단백질을 로딩하여 175mA에서 2시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후 겔의 단백질을 PVDF 멤브레인(Westran　 S, pore size 0.2 ㎜; Whatman, USA)으로 35 V에서 90분 동안 전사시켰다. 전사된 멤브레인을 Tris-완충용액(T-TBS; 50mM Tri-HCl, pH 7.6, 150mM NaCl, 0.2% Tween-20, 5% skim milk; Sigma, USA)으로 상온에서 1시간 차단하고 T-TBS로 5번 세척하였다. 상기 멤브레인에 일차항체로 phospho-JAK2, phospho-Stat3(1:1,000 희석)의 다중클론 항체를 4℃에서 12시간 동안 처리하였다. T-TBS로 5번 세척 후 이차항체로 HRP-결합 항-마우스 항체(1:5,000 희석)를 1시간 반응시켰다. 그 다음, T-TBS로 세척하고 암실에서 ECL 키트 (Amersham, USA)를 이용하여 필름을 현상시켰다. 상기 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
그 결과, 본 발명의 개머루덩굴 에탄올 추출물은 IL-6에 의한 STAT3의 인산화를 농도의존적으로 효과적으로 저해시키는 결과를 나타내었으며(도 5), JAK2(Tyr1007/1008)의 인산화 역시 농도의존적으로 저해하는 결과를 나타내었다(도 6).
상기와 같은 결과는 본 발명의 개머루덩굴 에탄올 추출물이 IL-6에 의한 신호전달활성을 효과적으로 저해시킬 수 있음을 나타내는 것으로, 실험예 1-2의 결과와 종합하여 볼 때, 본 발명의 개머루덩굴 추출물 또는 이의 분획물을 사용하는 경우 IL-6 매개성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 시사한다.
실험예 2: 개머루덩굴 추출물 및 분획물의 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제 효과
골의 유지는 파골세포가 오래된 골을 흡수하고 조골세포가 새로운 골을 꾸준하게 생산함으로써 조절된다. 따라서 파골세포와 조골세포의 비정상적인 조화가 여러 가지 골 질환을 유발할 뿐만 아니라 파골세포의 증가는 골다공증, 류마티스 관절염, 치주염 등과 같은 골 질환을 유발한다. RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 분화에서 IL-6/STAT3의 활성이 중요하게 관여하는 것으로 알려져 있다. 실험예 1을 통하여 본 발명의 개머루덩굴 추출물 및 이의 분획물이 IL-6에 의해 유도되는 STAT3의 활성을 효과적으로 저해시킬 수 있음을 확인하였다. 이에 RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 분화에서 개머루덩굴 추출물이 억제효능이 있는지를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
실험예 2-1: RANKL 유도 파골세포 분화 억제 효능 검사
구체적으로, 5주령 생쥐의 넓적다리뼈와 정강이뼈를 분리하고 뼈 속질 공간을 1cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF(30ng/㎖)가 포함된 a-MEM 배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 포식세포는 M-CSF(30ng/㎖)와 RANKL(50ng/㎖)을 첨가하여 배양하고 개머루덩굴 추출물(50, 25 및 10㎍/㎖) 및 분획물(50㎍/㎖)을 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP 용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 분화된 뼈파골세포로 판단하였고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 본 발명의 개머루덩굴 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화를 효과적으로 억제하였다(도 7A 및 B).
실험예 2-2: XTT 분석에 의한 세포독성 검사
포식세포를 1X104 세포/웰의 밀도로 96-well plate에 첨가하고 개머루덩굴 에탄올 추출물과 M-CSF(30ng/㎖)를 첨가하여 3일간 배양하였다. 3일 후, XTT 용액 50㎕를 각각의 웰에 첨가하고 4시간 배양 후 ELISA reader(Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 확인하였고, 그 결과를 도 7C에 나타내었다.
그 결과, 본 발명의 개머루덩굴 에탄올 추출물은 세포독성을 전혀 나타내지 않았으며, 이는 개머루덩굴 에탄올 추출물이 세포독성과 무관하게 파골세포의 분화 억제 효능을 가진다는 것을 시사한다(도 7C).
실험예 2-3: RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화에서 중요한 역할을 하는 유전자/단백질들의 발현 분석
RANKL은 세포막의 RANK와 결합한 후 세포 내 신호 전달 체계를 거쳐 전사인자인 c-Fos와 NFATc1의 발현을 촉진하고 파골세포의 지표인 TRAP 유전자의 발현을 유도시킨다. RANKL로 자극한 BMM에서 Real-time PCR 분석법에 의하여 c-Fos, NFATc1, OSCAR, TRAP, cathepsin K, 및 DC-STAMP의 mRNA 발현을 정량하였다. 실험예 2-1과 같이 BMM을 준비한 후 개머루덩굴 에탄올 추출물 (50㎍/㎖)을 1시간 동안 전처리하고 RANKL (100ng/㎖)을 첨가한 후 12, 24, 그리고 48시간 배양하였다. 배양 후 각각의 세포에서 TRIzol(Invitrogen) 용액으로 RNA를 분리하고 분리한 RNA 1 ㎍을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다.
유전자 서열 서열번호
c-Fos
 sense 5'- CTGGTGCAGCCCACTCTGGTC-3' 1
antisense 5'- CTTTCAGCAGATTGGCAATCTC-3' 2
NFATc1
 sense 5'- CAACGCCCTGACCACCGATAG-3' 3
antisense 5'- GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3' 4
OSCAR
 sense 5'-CTGCTGGTAACGGATCAGCTCCCCAGA-3' 5
antisense 5'-CCAAGGAGCCAGAACCTTCGAAACT-3' 6
TRAP
sense 5'-ACTTCCCCAGCCCTTACTAC-3' 7
antisense 5'-TCAGCACATAGCCCACACCG-3' 8
cathepsin K
sense 5'-CAGCAGAACGGAGGCATTGA-3' 9
antisense 5'-CCTTTGCCGTGGCGTTATAC-3' 10
DC-STAMP
 sense 5'-GCAAGGAACCCAAGGAGTCG-3' 11
antisense 5'-CAGTTGGCCCAGAAAGAGGG-3' 12
GAPDH
sense 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 13
antisense 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' 14
PCR 분석 결과, 본 발명의 개머루덩굴 에탄올 추출물이 파골세포의 분화에 중요한 유전자인 c-Fos, NFATc1, OSCAR, TRAP, cathepsin K, 및 DC-STAMP의 mRNA 발현을 모두 효과적으로 억제함을 볼 수 있었다(도 8). 특히, 개머루덩굴 에탄올 추출물은 전사인자 c-Fos보다 전사인자 NFATc1의 발현을 더 효과적으로 억제함을 볼 수 있었다.
실험예 2-4: RANKL의 하위신호전달기전 활성 분석; p38, AKT , ERK , 그리고 IκB의 인산화 측정
실험예 2-1과 같이 BMM을 준비한 후 무혈청 배지로 교환해주었다. 무혈청 배지에서 3시간 동안 배양한 후 개머루덩굴 에탄올 추출물을 각각의 농도별로 1시간 동안 전 처리하였다. 이 후 RANKL(100ng/㎖)을 첨가하여 15분 자극한 후 각각의 세포를 모아서 실험예 1-3과 같은 방법으로 각 단백질의 인산화를 측정하였다.
그 결과, 개머루덩굴 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 유도되는 p38과 IκB의 인산화를 억제하였으나, AKT와 ERK의 인산화에는 영향을 주지 않았다(도 9).
실험예 2-5: 골 흡수 검사
골 흡수 검사를 위하여, 조골세포는 생후 1일령 생쥐의 안와(calvaria)를 떼어서 0.1% 콜라게나아제(collagenase)와 0.2% 디스파아제(dispase)를 첨가 후 추출된 세포를 10% FBS와 항생제(penicillin/streptomycin)가 들어있는 α-MEM 배양액에서 3일간 배양하여 얻었다. 골수세포와 조골세포를 콜라겐으로 코팅한 90-mm 배양접시에 첨가하고 비타민 D3(10-8M)와 PGE2(10-6M)를 처리한 후 6일간 동조 배양하였다. 6일 후, 콜라게나아제를 이용하여 부착된 성숙 파골세포를 떼어낸 후, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)가 코팅된 48-웰 플레이트에 넣고 1시간 동안 배양하였다. 1시간 배양 후, 트립신을 처리하여 조골세포를 제거하고 순수 파골세포에 RANKL(100 ng/㎖)을 처리하고 개머루덩굴 에탄올 추출물을 농도별로 처리해 24시간 배양했다. 파골세포는 0.1% Triton X-100을 처리해 제거하고 광학 현미경으로 촬영했다. 골 흡수 영역의 정량화는 Image Pro-plus program version, version. 4.0(Media Cybernetics)을 이용했다.
그 결과, 본 발명의 개머루덩굴 에탄올 추출물이 50㎍/㎖의 농도에서 파골세포의 골 흡수 작용을 효과적으로 억제함을 볼 수 있었다(도 10).
또한, 본 발명에서는 실험예 1-3을 통하여 개머루덩굴로부터 분리한 유효화합물인 에틸 갈레이트, 갈릭산 및 아로마덴드린이 우수한 STAT3 저해활성을 나타내는 것을 확인하였으며, 이에 이들 화합물들이 RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 분화에서도 억제효능이 있는지를 알아보았다.
이때, 실험예 2-1과 같이 검사하여 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 억제 효능을 검사하였고, 그 결과, STAT3 저해활성과 유사하게 에틸 갈레이트와 갈릭산은 10μM과 30μM의 농도에서 우수한 파골세포 분화 억제 효능을 나타내었으며, 아로마덴드린은 두 화합물보다는 낮았으나, 60μM 농도에서 파골세포의 분화를 효과적으로 저해하는 결과를 보였다(도 11).
상기와 같은 결과를 종합하면, 본 발명의 개머루덩굴 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리한 화합물들이 IL-6 매개성 질환을 치료할 수 있음을, 특히 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하여 골다공증을 비롯한 골 대사성 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (11)

  1. 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 포함하는 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 줄기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 염증성 질환인 아토피의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112019015320184-pat00010

    [화학식 2]
    Figure 112019015320184-pat00011
    .
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 개머루덩굴 줄기를 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 수득한 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 알코올은 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 개머루덩굴 줄기 추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 물 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 분획하여 수득한 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 동물의약품인 것인 조성물.
  6. 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 포함하는 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 줄기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 염증성 질환인 아토피의 예방 또는 개선용 식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112019015320184-pat00012

    [화학식 2]
    Figure 112019015320184-pat00013
    .
  7. 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 포함하는 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 줄기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 염증성 질환인 아토피의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112019015320184-pat00014

    [화학식 2]
    Figure 112019015320184-pat00015
    .
  8. 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 포함하는 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 줄기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 염증성 질환인 아토피의 예방 또는 개선용 사료첨가제:
    [화학식 1]
    Figure 112019015320184-pat00016

    [화학식 2]
    Figure 112019015320184-pat00017
    .
  9. 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 포함하는 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 줄기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 염증성 질환인 아토피의 예방 또는 개선용 화장료 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112019015320184-pat00029

    [화학식 2]
    Figure 112019015320184-pat00030
    .
  10. 제1항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 염증성 질환인 아토피의 치료 방법.
  11. 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 포함하는 개머루덩굴(Ampelopsis brevipedunculata) 줄기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, IL-6(interleukin-6) 매개성 염증성 질환인 아토피의 예방 또는 개선용 음용수 첨가제:
    [화학식 1]
    Figure 112019015320184-pat00031

    [화학식 2]
    Figure 112019015320184-pat00032
    .
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