KR101373653B1

KR101373653B1 - 해당화 추출물을 포함하는 전립선 비대증 예방 및 치료를 위한 조성물

Info

Publication number: KR101373653B1
Application number: KR1020120012066A
Authority: KR
Inventors: 이유현; 곽지은; 김용재; 오규철; 전우진; 김선오
Original assignee: 한국인스팜(주)
Priority date: 2012-02-07
Filing date: 2012-02-07
Publication date: 2014-03-14
Also published as: KR20130090935A

Abstract

본 발명은 해당화 추출물을 포함하는 전립선 비대증 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 해당화 추출물은 인체 전립선암 세포주 세포독성이 높은 세포 생존률, 전립선비대가 유발된 12주령의 SD 래트 간으로부터 추출된 5-알파(alpha)-리덕타제(reductase) 1형 및 2형에 대한 저해능, 5RD 2형 과발현 전립선 세포주에서의 5RD 활성 억제효과 및 PSA의 mRNA 발현 억제효과, 및 COX-2, iNOS, IL-6, IL-1beta 등의 염증시그널의 감소효과를 나타내므로 전립선 비대증 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

해당화 추출물을 포함하는 전립선 비대증 예방 및 치료를 위한 조성물 {A composition comprising the extract of Rosa rugosa for preventing and treating benign prostatic hyperplasia}

본 발명은 해당화 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립선 비대증 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Assinder, SJ, Prostate. 68:115-121 (2008)

[문헌 2] Tubaro A. et al. Drug Aging 20(3):185-195, 2003

[문헌 3] Zhu YS et al. Steroid enzyme and Cancer 1155:43-56, 2009

[문헌 4] 정보섭외 1인, 도해 향약 대사전, 영림사, p649-650, 1998년

[문헌 5] Ramos et al. Journal of Enthnopharmacology, 2003, 87, 241-246

[문헌 6] Kikuzaki et al. phytochemistry, 1999, 52, 1307-1312

[문헌 7] Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed., pp6-7, 1998

[문헌 8] 대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989

[문헌 9] Lee et al. J Ethnopharmacol. 118(3):412-7

[문헌 10] Tatemichi S, J Urol. 2006 Sep;176(3):1236-41

[문헌 11] Assinder SJ, Prostate. 2008,68(2):115-21;Asada Y et al. Clin Endocrinol Metab. 2001,86(6):2875-80

[문헌 12] Konig et al. Prostate. 2004, 58(2):121-9

[문헌 13] Choi KC et al. Cancer Res. 2009 69(2):583-92

본 발명은 해당화 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립선 비대증 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 해당화의 추출물을 함유하는 전립선비대 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 해당화 80% 주정 추출물이 전립선 비대 유도 백서와 전립선 세포에서 제2형 5-알파 리덕타아제를 저해하며, 염증세포에서 뛰어난 항염증 효과를 보임으로 의약품 및 건강식품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있는 해당화 줄기 추출물의 새로운 용도에 관한 것이다.

전립선 비대증은 우리나라 남성의 50세 이후 발병이 급격히 일어나는 남성질환으로 최근 우리나라에서 전립선비대증 질환자의 증가율이 년 20%를 상회할 정도로 가파른 증가를 하고 있다. 이 질환의 경우 전립선이행대 부분의 평활근(smooth cell)과 상피세포(epithelial)의 과도한 증식으로 야기되며, 방광폐색으로 인한 다양한 배뇨장애가 일어난다. 전립선 비대의 한 가지 기전은 남성호르몬인 테스토스테론(testosterone,T)과 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)이 관련되어 있다고 알려져 있다.

남성호르몬에 속하는 T는 전립선내의 5-알파 리덕타아제(5-α-reductase, 5αRD)에 의하여 활성형 DHT로 전환되며, 전환된 DHT는 안드로젠 수용체(androgen receptor, AR)와 복합체를 이루고 핵 내로 이동하여 전사가 진행된다. 이러한 과정에서 활성형 남성호르몬의 전환에 관여하는 효소인 5αRD는 type1과 type2 두 종류가 존재하는데, 5αRD type1은 전립선에서의 분포와 활성은 크지 않지만 간과 피부에 많이 존재하며, 5αRD type2의 경우는 주로 전립선에서 두드러진 활성과 분포를 보인다. 이들 효소는 정상적인 전립선에도 분포하고 있으나, 전립선비대의 경우 비대해진 부위에서 과발현을 보인다. 그러므로, 5αRD의 활성을 억제하는 5αRD inhibitor의 개발은 전립선약물치료의 큰 축을 담당하고 있으며, 전립선치료제로 개발되어 있는 Finasteride의 경우가 5αRD type2를 억제하는 것으로 serum에서 70%, 전립선에서 90%정도 억제할 수 있으며, type 1의 친화성도 낮추는 역할을 할 수 있다(Assinder, SJ, Prostate. 68:115-121 (2008); Tubaro A. et al. Drug Aging 20(3):185-195, 2003;Zhu YS et al. Steroid enzyme and Cancer 1155:43-56, 2009).

본 발명에 사용된 해당화(Rosa rugosa)는 장미과(Rosaceae)에 속하며 바닷가 모래땅에 자생하는 한국 전지역에 분포하며, 그 성분으로는 시트로넬롤(citronellol), 제라니올(geraniol), 네롤 (nerol), 유게놀(eugenol), 페닐에틸 알콜(phenyl ethyl alcohol) 등의 2-5%의 정유성분 및 다양한 phenolic compound들을 함유한 것으로 알려져 있다 (정보섭외 1인, 도해 향약 대사전, 영림사, p649-650, 1998년).

현재까지 해당화 추출물은 그 항균 및 항산화 효과가 입증된 바가 있다 (Ramos et al. Journal of Enthnopharmacology, 2003, 87, 241-246; Kikuzaki et al. phytochemistry, 1999, 52, 1307-1312), 5RD 저해를 이용한 전립선 비대 억제소재는 보고된 바가 없다.

그러나 상기 문헌의 어디에도 해당화 추출물의 전립선 비대증에 대한 의학적 효과가 개시 또는 교시된 바가 없다.

본 발명의 해당화 줄기 추출물은 인체 전립선암 세포주 세포독성이 높은 세포 생존률, 전립선비대가 유발된 12주령의 SD 래트 간으로부터 추출된 5-알파(alpha)-리덕타제(reductase) 1형 및 2형에 대한 저해능 5RD 2형 과발현 전립선 세포주에서의 5RD 활성 억제효과 및 PSA의 mRNA 발현 억제효과, 및 COX-2, iNOS, IL-6, IL-1beta 등의 염증시그널의 감소효과를 확인함으로서, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해당화 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립선 비대증 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 상기 해당화는 줄기, 꽃, 뿌리, 전초 등, 바람직하게는 줄기 부위를 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 추출물은 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물 및 주정 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 해당화 줄기, 꽃, 뿌리, 전초 등, 바람직하게는 줄기 재료를 동결 건조하여 마쇄한 후 시료 중량의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 2 내지 20배에 달하는 부피의 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물 및 주정 혼합용매, 보다 바람직하게는 1: 1-10 혼합비의 물 및 주정 혼합용매로 20 내지 120℃, 바람직하게는 30 내지 80℃에서 약 1 내지 72시간, 바람직하게는 2 내지 12시간 동안에서 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출하여 추출한 후 감압여과 및 농축하여 본 발명의 해당화 추출물들을 수득할 수 있다.

또한, 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다 (Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed., pp6-7, 1998).

상기와 같은 방법으로 얻은 본 발명의 해당화 줄기 추출물이 인체 전립선암 세포주 세포독성이 높은 세포 생존률, 전립선비대가 유발된 12주령의 SD 래트 간으로부터 추출된 5-알파(alpha)-리덕타제(reductase) 1형 및 2형에 대한 저해능 5RD 2형 과발현 전립선 세포주에서의 5RD 활성 억제효과 및 PSA의 mRNA 발현 억제효과, 및 COX-2, iNOS, IL-6, IL-1beta 등의 염증시그널의 감소효과를 확인함으로서 전립선 비대증의 치료 및 예방에 효과적임을 확인할 수 있었다.

또한, 해당화 추출물은 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

상기 본 발명의 추출물을 함유하는 전립선 비대증 예방 및 치료용 약학조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 % 중량백분율로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본원 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).

또한, 본 발명은 해당화 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립선 비대증 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 전립선 비대증 예방을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함한다.

또한, 전립선 비대증 예방을 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명은 전립선 비대증의 개선 및 예방 효과를 나타내는 상기 해당화 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 전립선 비대증의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 시료는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 시료 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 해당화 줄기 추출물이 인체 전립선암 세포주 세포독성이 높은 세포 생존률, 전립선비대가 유발된 12주령의 SD 래트 간으로부터 추출된 5-알파(alpha)-리덕타제(reductase) 1형 및 2형에 대한 저해능 5RD 2형 과발현 전립선 세포주에서의 5RD 활성 억제효과 및 PSA의 mRNA 발현 억제효과, 및 COX-2, iNOS, IL-6, IL-1beta 등의 염증시그널의 감소효과를 확인함으로서 전립선 비대증의 치료 및 예방을 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 해당화 줄기 물, 20%주정, 80%주정 추출물의 전립선세포주에서 유효범위 검토를 나타내는 도면이며 (A)는 LNCaP, (B) PC3 세포에서의 결과를 나타내는 도면이며,
도 2는 전립선비대유도 백서의 간에서 해당화 줄기 물, 20%주정, 80% 주정 추출물의 5-알파-리덕타아제의 억제효과를 나타내는 그래프이며,
도 3은 전립선세포주에서 5-알파-리덕타아제 type2에 대한 해당화 줄기 물, 20%주정, 80%주정 추출물의 억제효과를 나타내는 그래프이며,
도 4는 전립선세포주에서 해당화 80% 주정추출물의 PSA mRNA 발현에 미치는 영향에 관한 도면이며,
도 5는 해당화 80% 주정추출물의 염증억제효과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 해당화 줄기 추출물의 제조

해당화 줄기 추출물의 5RD type 1과 2의 억제활성을 확인하기 위한 추출물의 제조는 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

1-1. 해당화 80% 주정 추출물의 제조( RR80S )

해당화(경일약업사) 줄기 30kg을 건조하여 추출/농축기(1ton, (주)명일이엔지)에 정제수 60L, 및 주정(240L)를 투입하고 75 ℃에서 4시간 동안 추출하였으며, 여과망을 이용하여 여과하였다. 농축기(1ton, (주)명일이엔지)를 이용하여 45 ℃, 750 mmHg 조건에서 25 Brix로 농축한 후, 정제수 100L를 투입하여 25 Brix로 2차 농축하여 해당화 80% 주정 추출물 1,710g을 수득하여 하기 실험예 시료로 사용하였다(이하, RR80S라 함).

1-2. 해당화 20% 주정 추출물의 제조( RR20S )

해당화(경일약업사) 줄기 30kg을 건조하여 추출/농축기(1ton, (주)명일이엔지)에 정제수 240L, 및 주정(60L)를 투입하고 95 ℃에서 4시간 동안 추출하였으며, 여과망을 이용하여 여과하였다. 농축기(1ton, (주)명일이엔지)를 이용하여 45 ℃, 750 mmHg 조건에서 25 Brix로 농축한 후, 정제수 100L를 투입하여 25 Brix로 2차 농축하여 해당화 20% 주정 추출물 1,810g을 수득하여 하기 실험예 시료로 사용하였다(이하, RR20S라 함).

1-3. 해당화 물 추출물의 제조( RRW )

해당화(전라남도 장흥, 경일약업사) 줄기 30kg을 건조하여 추출/농축기(1ton, (주)명일이엔지)에 정제수 300L를 투입하고 100 ℃에서 4시간 동안 추출하였으며, 여과망을 이용하여 여과하였다. 농축기(1ton, (주)명일이엔지)를 이용하여 45 ℃, 750 mmHg 조건에서 25 Brix로 농축한 후, 정제수 100L를 투입하여 25 Brix로 2차 농축하여 해당화 물 추출물 2,060g을 수득하여 하기 실험예 시료로 사용하였다(이하, RRW라 함).

실험예 1: 해당화 줄기 추출물의 세포독성 실험

상기 실시예 시료들의 인체 전립선암 세포주에서의 세포독성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Lee et al. J Ethnopharmacol. 118(3):412-7).

사람의 전립선암 세포주 두 종(LNCaP, PC3; ATCC, USA)을 사용하여 세포독성범위를 검토하였다. LNCaP과 PC3 두 전립선 세포주는 cells/well로 96 웰-플레이트에 접종(seeding)한 후에 37℃에서 18시간 배양하고, 3종의 해당화 추출물(물, 20%, 80% 주정 추출물)을 0, 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도로 처리하여 24시간 경과 후 MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide: 1mg/mL, Sigma aldrich, USA)를 넣고 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 형성된 포마잔 (formazane)을 흡광도 570nm, 레퍼런스 (reference) 630nm에서 측정하여 확인하였다.

상기 실험 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 해당화 주정80% 추출물이 25 ㎍/mL까지 세포독성이 높은 세포 생존률을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 백서의 간을 이용한 5-알파- 리덕타제 ( RD ) 1형 및 2형 저해능 실험

상기 실시예 시료들의 백서 간을 이용한 5-알파-리덕타제 1형 및 2형에 대한 저해활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Tatemichi S, J Urol. 2006 Sep;176(3):1236-41).

5RD type1 및 2의 저해정도를 확인하기 위하여 전립선비대가 유발된 12주령의 수컷 SD rat (샘타코, 대한민국)의 간을 적출하여 이용하였다. 전립선비대유도를 위하여 7주령의 SD rat(샘타코, 대한민국)을 3일간 적응시킨 후에 4주동안 estrogen (E8875, Sigma aldrich, USA)과 testosterone propionate(F0675, Tokyo Chemical Industry, Japan)를 각각 00.625mg/㎕와 62.5 mg/㎕ 의 농도로 일주일에 1회 피하 주사하여 전립선 비대를 유발시키고 희생시켜 장기를 적출하였다. 적출된 장기는 10배의 인산완충액(phosphate buffer, pH 7.4)로 균질화시킨 후에 3,000 rpm에서 원심분리하여 효소원으로 사용하였다. 3종류 해당화 추출물은 실험예 1의 결과로부터 25μg/mL의 농도를 적용하였으며 5RD의 저해능을 측정하기 위해서 ELISA assay(Bio Vendor, Bruno, Czzecho)를 이용하였다. 본 ELISA assay는 T에서 DHT로의 전환을 측정하는 방식으로 양성 대조군(positive control)은 현재 사용되고 있는 5RD type 2의 저해제인 Finesteride (T0028, TCI, Tokyo, Japan) 50 nM의 농도로 사용하였다.

상기 실험 결과, 해당화 물 및 80% 주정추출물에서 양성 대조군보다 높은 저해능을 확인하였다.(도 2참조)

실험예 3: 5 RD type2 과발현 전립선 세포주에서 해당화 줄기 추출물의 5 RD 활성 억제능 실험

상기 실시예 시료들의 5RD type2 과발현 전립선 세포주에서의 5RD 활성 억제능에 대한 저해활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Assinder SJ, Prostate. 2008,68(2):115-21;Asada Y et al. Clin Endocrinol Metab. 2001,86(6):2875-80).

전립선비대에 주로 관련되어 있다고 알려져 있는 5RD type 2의 억제활성검토를 위하여 LNCaP 세포주(CRL-1740, ATCC, USA)에 SRD5A2가 과발현된 세포주를 제작하여 사용하였으며 제작된 세포주는 10%(w/v) 소태아혈청(fetal bovine serum) 함유 RPMI1640 배지(LM011-01, WelGENE, USA)에서 배양하였다. 제작된 세포주를 대상으로 5RD type 2의 활성을 검토하기 위하여 6 웰 플레이트에 6 X 10⁵세포/웰로 접종하여 70% 충만도(confluence)에 다다른 후에 Charcoal stripped Fetal Calf Serum(F6765, Sigma, USA)를 함유한 RPMI 배지로 48시간동안 처리하였다. Charcoal-strip의 기간동안 각 해당화 추출물을 25 μg/mL의 농도로 처리하였으며 이후 배지를 걷어 실험예 2에서 실시한 동일한 ELASA assay를 이용하여 활성을 측정하였다.

본 실험 결과는 도 3와 같으며, 80% 주정 추출물의 경우 저해능이 가장 높은 것으로 확인되었다.

실험예 4: 5 RD type2 과발현 전립선 세포주에서 80% 해당화 줄기 추출물의 PSA 변화에 미치는 영향 실험

상기 실시예 시료들의 5RD type2 과발현 전립선 세포주에서의 PSA 변화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Lee et al. J Ethnopharmacol. 2008, 118(3):412-7).

상기의 실험예에서 5RD type1과 2에서 탁월한 저해능을 보인 80% 주정추출물을 대상으로 제작된 전립선 세포주에서 전립선암의 타겟인 prostate specific antigen (PSA)의 변화를 검토하였다. PSA는 전립선의 상피세포에서 합성되는 단백분해 효소로 전립선암의 선별에 이용되는 유용한 종양표지자로 5RD 저해를 이용한 전립선비대예방소재의 선별시 반드시 검토하여 전립선암의 진단에 오류가 없도록 해야하는 요인이다(Lee et al. J Ethnopharmacol. 2008, 118(3):412-7).

전립선암세포를 6 웰 플레이트에 10%(w/v) 소태아혈청 함유 RPMI 1640 배지에 3일 배양하고 LNCaP 세포주를 10% CS-FCS 함유 RPMI 1640 배지로 교환하여 다시 3일간 배양한 후 50nM 농도의 합성 안드로젠 R1881(R0908, Sigma, USA)를 처리하였다. 다시 6시간 후 최종농도 25㎍/mL로 해당화 줄기 80% 주정 추출물을 처리하여 16시간 경과 후에 총 RNA를 추출하여 하기 표 1과 같은 조건으로 RT-PCR을 시행하였다. 관련 표적 유전자의 프라이머(target gene primer)는 다음과 같다:

PSA	Forward primer	5'-GCCCACCCAGGAGCCAGCACT-3'	서열번호 1
PSA	Reverse primer	5'-GGCCCCCAGAATCACCCGAGCAG-3'	서열번호 2
GAPDH	Forward primer	5'-CGCGGGGCTCTCCAGAACATCATCC-3'	서열번호 3
GAPDH	Reverse primer	5'-CTCCGACGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3'	서열번호 4

본 실시예에서 해당화 80% 주정추출물은 PSA의 mRNA 발현을 25 μg/mL의 농도에서 억제하는 것으로 나타났다 (도 4).

실험예 5: 해당화줄기 추출물의 항염증 활성 실험

상기 실시예 시료들의 항염증 인자에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Konig et al. Prostate. 2004, 58(2):121-9)

전립선비대는 흔히 전립선염을 동반하므로 해당화줄기 추출물의 염증활성을 함께 측정하여 확인하였다 (Choi KC et al. Cancer Res. 2009 69(2):583-92).

염증세포는 Raw264.7 (TIB-71, ATCC, USA)를 이용하여 검토하였다. 염증세포를 6 웰 플레이트에 confluence 70%에 이르도록 배양하고 해당화 추출물을 각각 25 μg/mL의 농도로 처리하였다. 18시간이 경과한 후 LPS (L2654,Sigma, USA, 0.1μg/mL)를 2시간 동안 처리하여 염증을 유도하고 세포를 회수(harvest)하여 RNA를 추출하고 하기 표 2과 같은 조건으로 RT-PCR을 시행하였다. COX-2, iNOS, IL-6, IL-1beta 등의 관련 타겟 유전자 프라이머는 다음과 같다:

COX-2	Forward primer	5'-GAGTAAGAGGCACTTGCATT -3'	서열번호 5
COX-2	Reverse primer	5'-TGGAGGCGAAGTGGGTTTTA -3'	서열번호 6
iNOS	Forward primer	5'-TCTTGGAGCGAGTTGTCCAT -3'	서열번호 7
iNOS	Reverse primer	5'-GGGTCGTAATGTCCAGGAAGT -3'	서열번호 8
IL-6	Forward primer	5'-TCCATCCAGTTGCCTTCTTG -3'	서열번호 9
IL-6	Reverse primer	5'-CCACGATTTCCCAGAGAACA -3'	서열번호 10
IL-1beta	Forward primer	5'-GTTGACGGACCCCAAAAGAT -3'	서열번호 11
IL-1beta	Reverse primer	5'-AAGGTCCACGGGAAAGACAC -3'	서열번호 12
GAPDH	Forward primer	5'-GTGTTCCTACCCCCAATGTGT- 3'	서열번호 13
GAPDH	Reverse primer	5'-AGGAGACAACCTGGTCCTCAGT -3'	서열번호 14

상기의 프라이머로 RT-PCR을 수행한 결과, LPS로 유도된 염증시그널이 해당화 주정 80%의 처리로 IL-1bet를 제외하고는 무처리군과 동일한 수준으로 감소하였다 (도 5).

실험예 6. 급성독성실험

6 주령의 특정병원체부재 (Specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 각 그룹당 2마리씩의 동물에 본 발명의 해당화 추출물을 100 ㎎/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하였다. 실험 물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.

본 실험 수행 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 추출물은 랫트에서 각각 100 ㎎/㎏ 까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량 (LD₅₀)은 100 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

RR80S 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

RR20S 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

RRW 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

RR80S 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

RR20S 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims

해당화 줄기 재료를 동결 건조하여 마쇄한 후 시료 중량의 2 내지 20배에 달하는 부피의 1: 1-10 혼합비의 물 및 주정 혼합용매로 30 내지 80℃에서 2 내지 12시간 동안에서 열수 추출하여 추출한 후 감압여과 및 농축하여 수득되는 해당화 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립선 비대증의 예방 및 치료를 위한 약학조성물.
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해당화 줄기 재료를 동결 건조하여 마쇄한 후 시료 중량의 2 내지 20배에 달하는 부피의 1: 1-10 혼합비의 물 및 주정 혼합용매로 30 내지 80℃에서 2 내지 12시간 동안에서 열수 추출하여 추출한 후 감압여과 및 농축하여 수득되는 해당화 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 전립선 비대증의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품.
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