JP7012044B2 - イオン濃度依存性結合分子ライブラリ - Google Patents
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Description
本出願は、日本特許出願2011-218006(2011年9月30日出願)および2012-123479(2012
年5月30日出願)に基づく優先権を主張しており、これらの内容は本明細書に参照として
取り込まれる。
本発明は、イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子のライブラリおよびその製造方法、そのような抗原結合分子の選択方法および製造方法、ならびにそのような抗原結合分子を含む医薬組成物に関する。
いる(非特許文献1、非特許文献2)。一方、第2世代の抗体医薬に適用可能な技術として
様々な技術が開発されており、エフェクター機能、抗原結合能、薬物動態、安定性を向上させる、あるいは、免疫原性リスクを低減させる技術等が報告されている(非特許文献3
)。抗体医薬は一般に投与量が非常に高いため、皮下投与製剤の作製が困難であること、製造コストが高いこと等が課題として考えられる。抗体医薬の投与量を低減させる方法として、抗体の薬物動態を向上する方法と、抗体と抗原の親和性(アフィニティー)を向上する方法が考えられる。
り、さらにin vivoでの薬効を向上させることも可能である(非特許文献7)。
ーを強くすることで少ない抗体量で抗原を中和することが可能であり、様々な方法で抗体のアフィニティーを強くすることが可能である(非特許文献6)。さらに抗原に共有結合
的に結合し、アフィニティーを無限大にすることができれば1分子の抗体で1分子の抗原(2価の場合は2抗原)を中和することが可能である。しかし、これまでの方法では1分子の
抗体で1分子の抗原(2価の場合は2抗原)の化学量論的な中和反応が限界であり、抗原量
以下の抗体量で抗原を完全に中和することは不可能であった。つまり、アフィニティーを強くする効果には限界が存在していた(非特許文献9)。中和抗体の場合、その中和効果
を一定期間持続させるためには、その期間に生体内で産生される抗原量以上の抗体量が投与される必要があり、上述の抗体の薬物動態向上、あるいは、アフィニティー成熟化技術だけでは、必要抗体投与量の低減には限界が存在していた。そのため、抗原量以下の抗体量で抗原の中和効果を目的期間持続するためには、1つの抗体で複数の抗原を中和する必
要がある。
対して血漿中の中性条件下においては強く結合し、エンドソーム内の酸性条件下において
抗原から解離するpH依存的抗原結合抗体は、エンドソーム内で抗原から解離することが可能である。pH依存的抗原結合抗体は、抗原を解離した後に抗体がFcRnによって血漿中にリサイクルされると再び抗原に結合することが可能であるため、1つの抗体で複数の抗原に
繰り返し結合することが可能となる。
較して抗原の血漿中からの消失を促進することができるため、通常の抗体では成し得なかった作用を有する。既存の抗体配列を置換することによって抗原に対するpH依存的な結合活性を付与することができる。一方、こうした抗体を新たに取得するためには、免疫動物から抗体を取得する方法またはヒト抗体ライブラリから抗体を取得する方法において下記のような制限が考えられる。
におけるヒスチジン残基の出現頻度は、重鎖CDR1では5.9%、重鎖CDR2では1.4%、重鎖CDR3では1.6%、軽鎖CDR1では1.5%、軽鎖CDR2では0.5%、軽鎖CDR3では2.2%と高くないこと
が知られており、ヒト抗体ライブラリ中にpH依存的抗原結合能を持ち得る配列は非常に少ないと考えられる。よって、抗原との結合部位におけるヒスチジン出現頻度を高めたpH依存的な抗原に対する結合能を持ち得る配列を多く含む抗体ライブラリの提供が望まれている。
具体的には、以下に関する。
〔1〕互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリであって、前記抗原結合分子中の抗原結合ドメインは、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基を含むことを特徴とするライブラリ、
〔2〕イオン濃度が、カルシウムイオン濃度である〔1〕に記載のライブラリ、
〔3〕前記アミノ酸残基が前記抗原結合分子の重鎖の抗原結合ドメインに含まれている〔2〕に記載のライブラリ、
〔4〕重鎖の抗原結合ドメインが重鎖可変領域である〔3〕に記載のライブラリ、
〔5〕前記アミノ酸残基が重鎖可変領域のCDR3に含まれている〔4〕に記載のライブラリ、
〔6〕前記アミノ酸残基が重鎖CDR3のKabatナンバリングで表される95位、96位、100a位
および/または101位に含まれている〔2〕から〔5〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔7〕前記アミノ酸残基以外のアミノ酸配列がナイーブ配列のアミノ酸配列を含む〔2〕から〔6〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔8〕前記抗原結合分子の軽鎖可変領域がナイーブ配列のアミノ酸配列を含む〔3〕から〔7〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔9〕前記アミノ酸残基が前記抗原結合分子の軽鎖の抗原結合ドメインに含まれている〔2〕に記載のライブラリ、
〔10〕軽鎖の抗原結合ドメインが軽鎖可変領域である〔9〕に記載のライブラリ、
〔11〕前記アミノ酸残基が軽鎖可変領域のCDR1に含まれている〔10〕に記載のライブラリ、
〔12〕前記アミノ酸残基がCDR1のKabatナンバリングで表される30位、31位および/または32位に含まれている〔11〕に記載のライブラリ、
〔13〕前記アミノ酸残基が軽鎖可変領域のCDR2に含まれている〔10〕から〔12〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔14〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR2のKabatナンバリングで表される50位に含まれて
いる〔13〕に記載のライブラリ、
〔15〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR3である〔10〕から〔14〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔16〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR3のKabatナンバリングで表される92位に含まれて
いる〔15〕に記載のライブラリ、
〔17〕前記抗原結合分子の軽鎖のフレームワークが生殖細胞系列のフレームワーク配列を含む〔2〕または〔9〕から〔16〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔18〕前記抗原結合分子の重鎖可変領域がナイーブ配列のアミノ酸配列を含む請求項〔2〕または〔9〕から〔17〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔19〕前記アミノ酸残基が、カルシウム結合モチーフを形成する〔1〕から〔18〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔20〕カルシウム結合モチーフが、カドヘリンドメイン、EFハンド、C2ドメイン、Gla
ドメイン、C型レクチン、ドメイン、アネキシン、トロンボスポンジン3型ドメインおよびEGF様ドメイン、Vk5の部分、配列番号10、配列番号11のいずれかのカルシウム結合モチーフである〔19〕に記載のライブラリ、
〔21〕前記アミノ酸残基が、金属キレート作用を有するアミノ酸である〔2〕から〔20〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔22〕金属キレート作用を有するアミノ酸が、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかひとつ以上のアミノ酸である〔21〕に記載のライブラリ、
〔23〕イオン濃度の条件がpHである〔1〕に記載のライブラリ、
〔24〕前記アミノ酸残基が前記抗原結合分子の重鎖の抗原結合ドメインに含まれている〔23〕に記載のライブラリ、
〔25〕重鎖の抗原結合ドメインが重鎖可変領域である〔24〕に記載のライブラリ、
〔26〕前記アミノ酸残基が重鎖可変領域のKabatナンバリングで表される27位、31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、96
位、97位、98位、99位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位または107位のいずれか一つ以上に含まれている〔25〕に記載のライブラリ、
〔27〕重鎖可変領域のKabatナンバリングで表される27位、31位、32位、33位、35位、50位、52位、53位、55位、57位、58位、59位、61位、62位、95位、96位、97位、98位、99
位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位または107位のいずれかのアミノ酸残基以外のアミノ酸配列がナイーブ配列のアミノ酸配列を含む〔26〕に記載のライブラリ、
〔28〕前記抗原結合分子の軽鎖可変領域が生殖細胞系列の配列を含む〔23〕から〔27〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔29〕前記アミノ酸残基が前記抗原結合分子の軽鎖の抗原結合ドメインに含まれている〔23〕に記載のライブラリ、
〔30〕軽鎖の抗原結合ドメインが軽鎖可変領域である〔29〕に記載のライブラリ、
〔31〕前記アミノ酸残基が軽鎖可変領域のKabatナンバリングで表される24位、27位、28位、30位、31位、32位、34位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、89位、90
位、91位、92位、93位、94位または95a位のいずれか一つ以上に含まれている〔30〕に
記載のライブラリ、
〔32〕前記アミノ酸残基が軽鎖可変領域のCDR1に含まれている〔30〕または〔31〕に記載のライブラリ、
〔33〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR1のKabatナンバリングで表される24位、27位、28
位、30位、31位、32位または34位のいずれか一つ以上に含まれている〔32〕に記載のライブラリ、
〔34〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR2に含まれている〔30〕から〔33〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔35〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR2のKabatナンバリングで表される50位、51位、52
位、53位、54位、55位または56位のいずれか一つ以上に含まれている〔34〕に記載のライブラリ、
〔36〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR3に含まれている〔30〕から〔35〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔37〕前記アミノ酸残基が軽鎖のCDR3のKabatナンバリングで表される89位、90位、91
位、92位、93、94位または95a位のいずれか一つ以上に含まれている〔36〕に記載のラ
イブラリ、
〔38〕軽鎖のフレームワークが生殖細胞系列のフレームワーク配列を含む〔29〕から〔37〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔39〕重鎖可変領域がナイーブ配列である〔29〕から〔38〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔40〕前記アミノ酸残基が、側鎖のpKaが4.0-8.0であるアミノ酸である〔23〕から〔39〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔41〕前記アミノ酸残基が、グルタミン酸である〔23〕から〔40〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔42〕前記アミノ酸残基が、側鎖のpKaが5.5-7.0であるアミノ酸である〔23〕から〔39〕に記載のライブラリ、
〔43〕前記アミノ酸残基が、ヒスチジンである〔23〕から〔40〕または〔42〕のいずれかに記載のライブラリ、
〔44〕〔1〕から〔43〕のいずれかに記載の抗原結合分子を含む複数の融合ポリペプチドから主としてなるライブラリであって、前記融合ポリペプチドは抗原結合分子の重鎖可変領域とウイルスコートタンパク質の少なくとも一部とが融合したものであることを特徴とするライブラリ、
〔45〕前記ウイルスコートタンパク質がタンパク質pIII、主コートタンパク質pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pv1およびその変異体からなる群から選択される、〔44〕に記載されるライブラリ、
〔46〕〔1〕から〔43〕に記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしくは請求項〔44〕または〔45〕に記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドを各々コードする複数のポリヌクレオチド分子を含む組成物、
〔47〕〔46〕に記載される複数のポリヌクレオチド分子を作用可能なように連結されている状態で各々含む複数のベクターを含む組成物、
〔48〕ベクターが複製可能な発現ベクターである、〔47〕に記載の組成物、
〔49〕複製可能な発現ベクターが、lac Zプロモーター系、アルカリフォスファターゼpho Aプロモーター(Ap)、バクテリオファージλPLプロモーター(温度感受性プロモーター)、tacプロモーター、トリプトファンプロモーター、pBADプロモーターおよびバク
テリオファージT7プロモーターからなる群から選択されるプロモーター領域が発現ベクターにおいて前記ポリヌクレオチドが作用可能なように連結されている〔48〕に記載の組成物、
〔50〕複製可能な発現ベクターが、M13、f1、fd、Pf3ファージもしくはその誘導体、またはラムダ型ファージもしくはその誘導体である、〔48〕または〔49〕に記載の組成物、
〔51〕〔47〕から〔50〕のいずれかに記載されるベクターを各々含む複数のウイルスを含む組成物、
〔52〕〔1〕から〔43〕に記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしくは請求項〔44〕または〔45〕に記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドが各々その表面に提示されている複数のウイルスを含む組成物、
〔53〕〔1〕から〔43〕に記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしくは請求項〔44〕または〔45〕に記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドを含むライブラリであって、1 x 106ないし1 x 1014の互いに異なる可変領域配列を有するライ
ブラリ、
〔54〕1 x 108以上の互いに異なる可変領域配列を有する〔53〕に記載のライブラ
リ、
〔55〕互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリの作製方法であって、前記抗原結合分子中の抗原結合ドメインが、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基を含むよう設計された複数の抗原結合分子中を製造することを含む方法、
〔56〕前記抗原結合分子が〔2〕から〔43〕のいずれかに記載の抗原結合分子である〔55〕に記載の作製方法、
〔57〕前記抗原結合分子の重鎖可変領域がウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合している、〔55〕または〔56〕の作製方法、
〔58〕前記ウイルスコートタンパク質がタンパク質pIII、主コートタンパク質pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pv1およびその変異体からなる群から選択される、〔55〕から〔57〕のいずれかに記載の作製方法、
〔59〕イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子を選択する方法であって、
a)〔1〕から〔43〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしく
は〔44〕または〔45〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドから主としてなるライブラリを作製するステップ、
b)前記ライブラリをイオン濃度の異なる二以上の条件下において抗原に接触させるステ
ップ、
c)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の集団を前
記ライブラリから分画するステップ、
d)c)において分画された集団からイオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変
化する抗原結合分子を単離するステップ、
とを含む方法、
〔60〕イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、
a)〔1〕から〔43〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしく
は〔44〕または〔45〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドを各々コードする複数のポリヌクレオチドを作用可能なように連結されている状態で各々含む複数の複製可能な発現ベクターを含むライブラリを作製するステップ、
b)前記ライブラリに含まれる各々の発現ベクターが導入された複数のウイルスの表面に
、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記互いに配列の異なる抗原結合分子または融合ポリペプチドを発現するステップ、
c)前記複数のウイルスをイオン濃度の異なる二以上の条件下において抗原に接触させる
ステップ、
d)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスの集団を前記ラ
イブラリから分画するステップ、
e)d)において分画されたウイルスの集団からイオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスを単離するステップ、
f)単離されたウイルスからポリヌクレオチドを単離するステップ、
とを含む方法、
〔61〕追加的に前記c)からd)のステップを少なくとも1回反復する〔60〕に記載の
方法、
〔62〕イオン濃度がカルシウムイオン濃度である〔59〕から〔61〕のいずれかに記載の方法、
〔63〕低カルシウム濃度の条件での抗原に対する結合活性が高カルシウム濃度の条件での結合活性よりも低下する抗原結合分子を選択する〔62〕に記載の方法、
〔64〕低カルシウム濃度の条件が0.1μMから30μMである〔63〕に記載の方法、
〔65〕高カルシウム濃度の条件が100μMから10 mMである〔63〕または〔64〕に記載の方法、
〔66〕イオン濃度の条件がpHである〔59〕から〔61〕のいずれかに記載の方法、
〔67〕pH酸性域条件での抗原に対する結合活性がpH中性域条件での結合活性よりも低下する抗原結合分子を選択する〔66〕に記載の方法、
〔68〕pH酸性域条件がpH4.0から6.5である〔66〕に記載の方法、
〔69〕pH中性域条件がpH6.7から10.0である〔67〕または〔68〕に記載の方法、
〔70〕イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の製造方法であって、
a)〔1〕から〔43〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしく
は〔44〕または〔45〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドを各々コードする複数のポリヌクレオチドを作用可能なように連結されている状態で各々含む複数の複製可能な発現ベクターを含むライブラリを作製するステップ、
b)前記ライブラリに含まれる各々の発現ベクターが導入された複数のウイルスの表面に
、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記互いに配列の異なる抗原結合分子または融合ポリペプチドを発現するステップ、
c)前記複数のウイルスをイオン濃度の異なる二以上の条件下において抗原に接触させる
ステップ、
d)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスの集団を前記ラ
イブラリから分画するステップ、
e)d)において分画されたウイルスの集団からイオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスを単離するステップ、
f)単離されたウイルスからポリヌクレオチドを単離するステップ、
g)単離されたポリヌクレオチドが作用可能なように連結されている状態で挿入されたベ
クターが導入された宿主細胞を培養するステップ、
h)g)で培養された培養液から抗原結合分子を回収するステップ、
とを含む製造方法、
〔71〕イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の製造方法であって、
a)〔1〕から〔43〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる抗原結合分子もしく
は〔44〕または〔45〕のいずれかに記載される互いに配列の異なる融合ポリペプチドを各々コードする複数のポリヌクレオチドを作用可能なように連結されている状態で各々含む複数の複製可能な発現ベクターを含むライブラリを作製するステップ、
b)前記ライブラリに含まれる各々の発現ベクターが導入された複数のウイルスの表面に
、前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記互いに配列の異なる抗原結合分子または融合ポリペプチドを発現するステップ、
c)前記複数のウイルスをイオン濃度の異なる二以上の条件下において抗原に接触させる
ステップ、
d)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスの集団を前記ラ
イブラリから分画するステップ、
e)d)において分画されたウイルスの集団からイオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化するウイルスを単離するステップ、
f)単離されたウイルスからポリヌクレオチドを単離するステップ、
g)単離されたポリヌクレオチドをインフレームで抗体定常領域をコードするポリヌクレ
オチドと連結するステップ、
h)g)において連結されたポリヌクレオチドが作用可能なように連結されている状態で挿入されたベクターが導入された宿主細胞を培養するステップ、
i)h)で培養された培養液から抗原結合分子を回収するステップ、
とを含む製造方法、
〔72〕追加的に前記c)からd)のステップを少なくとも1回反復する〔70〕または〔
71〕に記載の製造方法、
〔73〕イオン濃度がカルシウムイオン濃度である〔70〕から〔72〕のいずれかに記載の製造方法、
〔74〕低カルシウム濃度の条件での抗原に対する結合活性が高カルシウム濃度の条件での結合活性よりも低下する抗原結合分子を選択する〔73〕に記載の製造方法、
〔75〕低カルシウム濃度の条件が0.1μMから30μMである〔74〕に記載の製造方法、
〔76〕高カルシウム濃度の条件が100μMから10 mMである〔74〕または〔75〕に記載の製造方法、
〔77〕イオン濃度の条件がpHの条件である〔70〕から〔72〕のいずれかに記載の製造方法、
〔78〕pH酸性域条件での抗原に対する結合活性がpH中性域条件での結合活性よりも低下する抗原結合分子を選択する〔77〕に記載の製造方法、
〔79〕pH酸性域条件がpH4.0から6.5である〔78〕に記載の製造方法、
〔80〕pH中性域条件がpH6.7から10.0である〔78〕または〔79〕に記載の製造方法
、
〔81〕〔70〕から〔80〕のいずれかに記載の製造方法によって製造された抗原結合分子、
〔82〕〔81〕に記載の抗原結合分子またはその改変体を含む医薬組成物を提供するものである。
抗原に対する結合活性が変化する互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリの新規で体系的な製造方法が提供される。そのようなライブラリは、例えば、金属イオン濃度および/または水素イオン濃度の条件に応じた望ましい活性、例えば結
合親和性およびアビディティーのある合成の抗原結合分子のクローンを選択および/また
はスクリーニングするために役立つ、組合せライブラリとして使用され得る。
あり、またそのための高スループットの、効率的で自動化可能な系が本発明によって提供される。本発明の方法にしたがえば、対象抗原に対して条件依存的に結合する抗原結合分子を提供し得る。さらに本発明によって当該抗原結合分子を有効成分として含む医薬組成物が提供される。
アミノ酸
本明細書において、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/Vと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記されている。
本発明で使用されている方法によると、抗体のCDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置
はKabatにしたがって規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年)。本明細書において、抗原結合分子が抗体または抗原結合断片である場合、可変領域のアミノ酸はKabatナンバリングにしたがい、定常領域のアミノ酸はKabatのアミノ酸位置に準じたEUナンバリングにしたがって表される。
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法(
Kunkelら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸
に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン(アンバーコドン)の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム(Clover Direct(Protein Express))等も好適に用いられる。また、アミノ酸の改変を表す表現として、特定の位置を表す数字の前後に改変前と改変後のアミノ酸の1文字コードを用いた表現が適宜使用され得る。例えば、抗
体定常領域に含まれるFc領域にアミノ酸の置換を加える際に用いられるP238Dという改変
は、EUナンバリングで表される238位のProのAspへの置換を表す。すなわち、数字はEUナ
ンバリングで表されるアミノ酸の位置を表し、その前に記載されるアミノ酸の一文字コードは置換前のアミノ酸、そのあとに記載されるアミノ酸の1文字コードは置換後のアミノ
酸を表す。
本明細書において、「および/または」の用語の意義は、「および」と「または」が適
宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば「33位、55位、および/ま
たは96位のアミノ酸が置換されている」とは以下のアミノ酸の改変のバリエーションが含まれる;
(a) 33位、(b) 55位、(c) 96位、(d) 33位および55位、(e) 33位および96位、(f) 55位および96位、(g) 33位および55位および96位。
本明細書において、用語「抗原結合分子」は抗原結合ドメインを含む分子を表す最も広義な意味として使用されており、具体的には、それらが抗原に対する結合活性を示す限り、様々な分子型が含まれる。例えば、抗原結合ドメインがFcRn結合ドメインと結合した分子の例として、抗体が挙げられる。抗体には、単一のモノクローナル抗体(アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体等が含まれ得る。また抗体の断片として使用される場合としては、抗原結合ドメインおよび抗原結合断片(例えば、Fab、F(ab’)2、scFvおよびFv)が好適に挙げられ得る。既存の安定なα/βバレルタンパク質構造等の立体構造がスキャフォールド(scaffold;土台)として用いられ、その一部分の構造のみが抗原結合ドメインの構築のためにライブラリ化されたスキャフォールド分子も、本発明の抗原結合分子に含まれ得る。
発現する糖タンパク質であるフィブロネクチン(fibronectin)中のタンパク質に結合す
るドメインである10Fn3ドメインを含むAdnectin(WO2002032925)、ProteinAの58アミノ
酸からなる3つのヘリックスの束(bundle)を構成するIgG結合ドメインをスキャフォールドとするAffibody(WO1995001937)、33アミノ酸残基を含むターンと2つの逆並行ヘリッ
クスおよびループのサブユニットが繰り返し積み重なった構造を有するアンキリン反復(ankyrin repeat:AR)の分子表面に露出する領域であるDARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002020565)、好中球ゲラチナーゼ結合リポカリン(neutrophil
gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等のリポカリン分子において高度に保存された8つの逆並行ストランドが中央方向にねじれたバレル構造の片側を支える4つのループ領域であるAnticalin等(WO2003029462)、ヤツメウナギ、ヌタウナギなど無顎類の獲
得免疫システムとしてイムノグロブリンの構造を有さない可変性リンパ球受容体(variab
le lymphocyte receptor(VLR))のロイシン残基に富んだリピート(leucine-rich-repeat(LRR))モジュールが繰り返し積み重なった馬てい形の構造の内部の並行型シート
構造のくぼんだ領域(WO2008016854)が好適に挙げられる。本発明の抗原結合ドメインの好適な例として、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合ドメインが挙げられる。
記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。特にヒトIgG1の配列としては、EUナンバリングで表される356-358位のアミノ酸配列がDELであってもEEMであっ
てもよい。ヒトIgK(Kappa)定常領域とヒトIgL7 (Lambda)定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれで
あっても良い。所望の結合活性を有する抗体を作製する方法は当業者において公知である。
適当な希釈倍率で希釈された感作抗原が、所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントと混合され、乳化された後に、該感作抗原が哺乳動物に4から21日
毎に数回投与される。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用され得る。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合した該感作抗原ペプチドを免疫することが望ましい場合もある。
し、以下のようにしても作製され得る。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコ
ードする遺伝子が発現され得るような態様で構築されたベクターDNAが投与された当該免
疫動物中で、感作抗原が当該免疫動物の生体内で発現されることによって、免疫刺激が与えられる免疫方法である。タンパク質抗原が免疫動物に投与される一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性が期待される。
-抗原が膜タンパク質の場合、その構造を維持して免疫刺激が与えられ得る。
-免疫抗原を精製する必要が無い。
る)などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン-アミノプテ
リン-チミジン感受性(以下HAT感受性と省略する)を有する。HAT感受性の細胞はHAT選
択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞の
サルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
ログを取り込めないこれらの酵素を欠損した細胞は、選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質(ゲンタマイシン類似体)に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。
ダイウイルス(HVJ)等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルス
ルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
ては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その
他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用され、さらに、牛胎児血清(FCS
)等の血清補液が好適に添加され得る。
ポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択され得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞(非融合細胞)が死滅するのに十分な時間(通常、係る十分な時間は数日から数週間である)上記HAT培養液を用いた培養が継続され
得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施される。
胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選
択的に増殖し得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞(非融合細胞)が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週
間の培養によって、所望のハイブリドーマが選択され得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施され得る。
る。たとえば、ELISAプレートのウエルに抗原が固定化される。ハイブリドーマの培養上
清をウエル内の抗原に接触させ、抗原に結合する抗体が検出される。モノクローナル抗体がマウス由来の場合、抗原に結合した抗体は、抗マウスイムノグロブリン抗体によって検出され得る。これらのスクリーニングによって選択された、抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等によりクローニングされ得る。このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中で継代培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存され得る。
ドされる抗体も好適に利用され得る。クローニングした抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、当該遺伝子によってコードされる抗体が発現する。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は例えば、Vandammeらによって既に確立されている(Eur.J. Biochem.(1990)192 (3), 767-775)。下記に述べるように組換え抗体の製造方法もまた公知である。
域)をコードするcDNAが取得される。そのために、通常、まずハイブリドーマから全RNA
が抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
-グアニジン超遠心法(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
-AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
を使用して精製され得る。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit (GEヘルスケアバイオサイエンス)などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからmRNAが取得され得る。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAが合成され得る。cDNAは
、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社
)等によって合成され得る。また、cDNAの合成および増幅のために、SMART RACE cDNA
増幅キット(Clontech)およびPCRを用いた5’-RACE法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002、Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)が適宜利用され得る。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入され得る。
れる。公知の抗体遺伝子配列をもとにマウス抗体遺伝子増幅用のプライマーがデザインされ得る。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列である。したがって、サブクラスは予めIso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(ロシュ・ダイアグノスティックス)などの市販キットを用いて決定しておくことが望ましい。
鎖としてγ1、γ2a、γ2b、γ3、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーが利用され得る。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側の
プライマーには可変領域に近い定常領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、5’ RACE cDNAライブラリ作製キットに付属する
プライマーが利用される。
ンが再構成され得る。再構成されたイムノグロブリンの、抗原に対する結合活性を指標として、所望の抗体がスクリーニングされ得る。たとえば抗原に対する抗体の取得を目的とするとき、抗体の抗原への結合は、特異的であることがさらに好ましい。抗原に結合する抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングされ得る;
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体を抗原に
接触させる工程、
(2)抗原と抗体との結合を検出する工程、および
(3)抗原に結合する抗体を選択する工程。
た制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化する。更に1コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素の挿入が好ましい。上記のように消化された抗体のV領域をコードするcDNAを適当
な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターが取得され得る。このとき、抗体定常領域(C領域)をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とがインフレームで融合されれば、キメラ抗体が取得される。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来が異なることをいう。したがって、マウス-ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト-ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入することによって、キメラ抗体発現
ベクターが構築され得る。具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域(C領域)をコー
ドするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制
限酵素認識配列が適宜配置され得る。同じ組み合わせの制限酵素で消化された両者がインフレームで融合されることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。
ル配列が付加される。発現されたポリペプチドは上記配列のカルボキシル末端部分で切断され、切断されたポリペプチドが成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。次いで、この発現ベクターによって適当な宿主細胞が形質転換されることによって、所望の抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞が取得され得る。
、それぞれ別の発現ベクターに組み込まれる。重鎖と軽鎖が組み込まれたベクターによって、同じ宿主細胞に同時に形質転換(co-transfect)されることによって、重鎖と軽鎖を備えた抗体分子が発現され得る。あるいは重鎖および軽鎖をコードするDNAが単一の発現
ベクターに組み込まれることによって宿主細胞が形質転換され得る(WO19994011523を参
照のこと)。
合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が適宜使用され得る。具体的には、動物細胞としては、次のような細胞が例示され得る。
(1)哺乳類細胞、:CHO(Chinese hamster ovary cell line)、COS(Monkey kidney cell line)、ミエローマ(Sp2/O、NS0等)、BHK (baby hamster kidney cell line)、HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad)5 DNA)、PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes)、Hela、Vero、
など(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table
5.9.1))
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
胞の形質転換には、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。
-酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミ
セス(Saccharomyces)属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
-糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属
の抗体が取得され得る。
が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ(またはその子孫)が産生する乳汁からは、所望の抗体が乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに対して投与され得る(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702)。
、公知の方法を用いて適宜製造される。
。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は
多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の
結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。
化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばオーバーラップ・伸長(Overlap Extension) PCRが公知である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは4つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRの
ヒトFRへの移植においては、マウスのFRと同一性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機
能の維持において有利であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに
隣接しているFRのアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
をコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合
成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
うに発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。当該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、当該組換え細胞を培養し、当該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、当該ヒト化抗体が当該
培養細胞の培養物中に産生される(EP239400、WO1996002576)。
切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択され得る(Satoら(Cancer Res (1993) 53, 851-856)。
イ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体
のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後
、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、当該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である(WO1992001047、WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236、WO1993019172、WO1995001438、WO1995015388参照)。
変領域が挙げられ得る。抗体の抗原結合ドメインがCDRである場合、抗体に含まれる6つのCDR全てが含まれ得るし、1つ若しくは2つ以上のCDRも含まれ得る。抗体の結合領域としてCDRが含まれる場合、抗原に対する結合活性を有する限り、含まれるCDRにはアミノ酸の欠失、置換、付加及び/又は挿入などが行われ得るし、又、CDRの一部分も使用され得る。抗原の分子量が大きい場合、抗体は抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは一または複数の抗体の可変ドメインより提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域(VL)と抗体重鎖可変領域(VH)とを含む。こうした抗原結合ドメインの例としては、「scFv(single chainFv)」、「単鎖抗体(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain
Fv2)」、「Fab」、「ダイアボディ」、「線状抗体」または「F(ab')2」等が好適に挙
げられる。
、CDR1、CDR2およびCDR3)ならびにフレームワーク領域(FR)のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の部分をいう。VHは重鎖の可変領域(Heavy chain variable region)をいう。VLは軽鎖の可変領域(Light chain variable region)をいう。本発明で使用されている方法によると、CDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はKabatにしたがって規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National
Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年)。本明細書におい
て、抗体または抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、Kabatのアミノ酸位置に準じ
たKabatナンバリングで表される。
びCDR3)」とは、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変領域のアミノ酸残基をいう。各可変領域は、一般的にCDR1、CDR2およびCDR3と表される3つのCDR領域を含む。各相補性決定領域は、Kabatが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残
基(すなわち、軽鎖可変領域の残基約24~34(CDR1)、50~56(CDR2)、および89~97(CDR3)ならびに重鎖可変領域の31~35(CDR1)、50~65(CDR2)および95~102(CDR3)
;Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institute of Health、Bethesda、MD.(1991))、およ
び/または「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変領域の残基約26~32(CDR1
)、50~52(CDR2)および91~96(CDR3)ならびに重鎖可変領域の26~32(CDR1),53~55(CDR2)および96~101(CDR3);ChothiaおよびLesk、J.Mol.Biol. (1987) 196, 901-917)を含み得る。ある場合には、相補性決定領域はKabatの記載によって定義されて
いるCDR領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。
。抗体断片の他の化学的結合も本発明が属する技術分野で公知である。
りに短いリンカーを用いて、この領域を他の鎖の相補性領域と強制的に対合させ、2つの
抗原結合部位が形成される。ダイアボディは、例えば欧州特許第404097号、WO1993011161等の特許文献やHolligerら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1993) 90, 6444-6448)等の非特許文献において詳細に記載されている。
含む。線状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
本明細書において「抗原」は抗原結合ドメインが結合するエピトープを含む限りその構造は特定の構造に限定されない。別の意味では、抗原は無機物でもあり得るし有機物でもあり得る。抗原としては下記のような分子;17-IA、4-1BB、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1 アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビ
ンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アルファ-1-アンチトリプシン、アルファ-V/ベータ-1アンタゴニスト、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン、抗Id、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、av/b3インテグリン、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-リンパ球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax
、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3 オステオゲニン(Osteogenin)、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、ボンベシン、骨由来
神経栄養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、カルシトニン、cAMP、癌胎児性抗原(CEA)、癌関連抗原、カテプシンA、カテ
プシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、
カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7
、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67タンパク質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD16
4、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1
、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補体制御因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(脳IGF-1)、Dhh、ジゴ
キシン、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン1、EpCAM、エフリンB2/EphB4、EPO、ERCC、E-セレクチン、ET-1、ファクターIIa、ファクターVII、ファクターVIIIc、ファクターIX、線維芽細胞活性化タ
ンパク質(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、フィブリン、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(ミオスタチン)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-アルファ1、GFR-アルファ2、GFR-アルファ3、GITR、グルカゴン、Glut4、糖タンパク質IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長ホルモン放出因子、ハプテン(NP-capまたはNIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV gHエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、単純ヘルペスウイルス(HSV) gB糖タンパク質、HSV gD糖タンパク質、HGFA、高分子量黒色腫関連抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、ヒト心臓ミオシン、ヒトサ
イトメガロウイルス(HCMV)、ヒト成長ホルモン(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、イン
ターフェロン(INF)-アルファ、INF-ベータ、INF-ガンマ、インヒビン、iNOS、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様増殖因子1、インテグリンアルファ2、インテグリンアルファ3、インテグリンアルファ4、インテグリンアルファ4/ベータ1、インテグリンア
ルファ4/ベータ7、インテグリンアルファ5(アルファV)、インテグリンアルファ5/ベー
タ1、インテグリンアルファ5/ベータ3、インテグリンアルファ6、インテグリンベータ1、インテグリンベータ2、インターフェロンガンマ、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレイン11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、ラミニン5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜在的TGF-1、潜在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、レフティ、ルイス-Y抗原、ルイス-Y関連
抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチ
ン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受容体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-アルファ、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、ムチン(Muc1)、MUC18、ミ
ュラー管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cアドヘリン、NCA 90、NCAM、NCAM、ネプリライシン、ニューロトロフィン-3、-4、または-6、ニュールツリン、神経成長因子(NGF)、NGFR、NGF-ベータ、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG
、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性アルカリホスファターゼ(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、プロ
インスリン、プロレラキシン、プロテインC、PS、PSA、PSCA、前立腺特異的膜抗原(PSMA
)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、レラキシンA鎖、レラキシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス(RSV)F、RSV Fgp、Ret、リウマイド因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質-72)、TARC、TCA-3、T細胞受容体(例えば、T
細胞受容体アルファ/ベータ)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-アルファ、TGF-ベータ、TGF-ベータ Pan Specific、TGF-ベータRI(ALK-5)、TGF-ベータRII、TGF-ベータRIIb、TGF-ベータRIII、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ4、TGF-ベータ5、トロンビン、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-アルファ、TNF-アルファベータ、TNF-ベータ2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCER)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK
R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2リガンド、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANKリガンド ODF、OPGリガンド)、TNFSF12(TWEAK Apo-3リガンド、DR3リガンド)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEMリガンド、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITRリガンド AITRリガンド、TL6)、TNFSF1A(TNF-a コネクチン(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40リガンド gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40リガンド CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fasリガンド Apo-1リガンド、APT1リガンド)、TNFSF7(CD27リガンド CD70)、TNFSF8(CD30リガンド
CD153)、TNFSF9(4-1BBリガンド CD137リガンド)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL
R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘍関連抗原CA125、腫瘍関連抗原発現ルイスY関連炭水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B
/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP
、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG、Hsp90, IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、酸化LDL, PCSK9, prekallikrein , RON, TMEM16F、SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B、tau, VAP1、高分子キニノーゲン、IL-31、IL-31R
、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9,factor B, factor D, factor H, properdin、sclerostin、fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 組織因子, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, トロンボモデュリン、TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P、Acetylcholine recep
tor、AdipoR1、AdipoR2、ADP ribosyl cyclase-1、alpha-4/beta-7 integrin、alpha-5/beta-1 integrin、alph
a-v/beta-6 integrin、alphavbeta1 integrin、Angiopoietin ligand-2、Angptl2、Anthrax、Cadherin、Carbonic anhydrase-IX、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51、CD70、CD72、Claudin 18、Clostridium difficile toxin、CS1、Delta-like protein ligand 4、DHICA oxidase、Dickkopf-1 ligand、Dipeptidyl peptidase IV、EPOR、F protein of RSV、Factor Ia、FasL、Folate receptor alpha、Glucagon receptor、Glucagon-like peptide 1 receptor、Glutamate carboxypeptidase II、GMCSFR、Hepatitis C virus E2 glycoprotein、Hepcidin、IL-17 receptor、IL-22 receptor、IL-23 receptor、IL-3 receptor、Kit tyrosine kinase、Leucine Rich Alpha-2-Glycoprotein 1 (LRG1)、Lysosphingolipid receptor、Membrane glycoprotein OX2、Mesothelin、MET、MICA、MUC-16、Myelin associated glycoprotein、Neuropilin-1、Neuropilin-2、Nogo receptor、PLXNA1、PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B
、PLXNB1、PLXNB2、PLXNB3 、PLXNC1 、PLXND1 、Programmed cell death ligand 1、Proprotein convertase PC9、P-selectin glycoprotein ligand-1、RAGE、Reticulon 4、RF、RON-8、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F、SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SEMA6C、SEMA6D、SEMA7A、Shiga like toxin II、Sphingosine-1-phosphate receptor-1、ST2、Staphylococcal lipoteichoic acid、Tenascin、TG2、Thymic stromal lymphoprotein receptor、TNF superfamily receptor 12A、Transmembrane glycoprotein NMB、TREM-1、TREM-2、Trophoblast glycoprotein、TSH receptor、TTR、Tubulin、ULBP2ならびにホルモンおよび成長因子のための受容体が例示され得る。そのほか、前記
受容体のうち生体の体液中で細胞に係留されずに可溶型で存在する分子も例示され得る。
主鎖は、並列となり、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの立体構造を決定する方法には、例えばX線結晶学、二次元核磁気共鳴分光学並びに部位特異的な
スピン標識および電磁常磁性共鳴分光学が含まれるが、これらには限定されない。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第66巻、Morris(編)を参照。
用語「コドンセット」とは、所望のアミノ酸をコードするために用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列をいう。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であって所望のアミノ酸群をコードする配列を含む。こうした一組のオリゴヌクレオチドは、例えば固相法によって合成され得る。標準的なコドン指定形式はIUBコードのそれであり、
このコードは当技術分野で公知である。コドンセットは、一般的に3つの大文字、例えばNNK、NNS、DVK、DVDなどで表される。
IUBコード
G グアニン
A アデニン
T チミン
C シトシン
R(AまたはG)
Y(CまたはT)
M(AまたはC)
K(GまたはT)
S(CまたはG)
W(AまたはT)
H(AまたはCまたはT)
B(CまたはGまたはT)
V(AまたはCまたはG)
D(AまたはGまたはT)
N(AまたはCまたはGまたはT)
ドされ得る。
103-109等)。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセ
ットは、市販の核酸シンセサイザー(Applied Biosystems, Foster City, CAなどか
ら入手可能)を使って合成することができ、または市販品を入手することができる(例えば、Life Technologies, Rockville, MD)。したがって、特定のコドンセットを有す
る合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドが含まれる。また、本発明の非限定な態様として、例えばクローニングに役立つ制限酵素部位も含まれ得る。
。当初の形質転換細胞でスクリーニングされたような、実質的に同じ機能または生物学的活性を有する変異体の子孫も含まれ得る。異なった呼称を意図する記載である場合は、当該記載の前後関係からそのような意図は明白となるであろう。
に連結したコード配列の発現のために必要なDNA塩基配列をいう。例えば原核生物に好適
な制御配列には、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、リボソーム結合部位、およびおそらくはまだよく理解されていない他の配列が含まれる。真核細胞ではコード配列の発現のために、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
それがあるコード配列の転写に影響する場合はその配列と作用可能に連結している。または、リボソーム結合部は、それが翻訳を容易にする位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したDNA配列が連続しており
、分泌リーダーの場合は連続して読取り枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。連結は適切な制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行に従って使用される。また前記のOverlap Extension PCRの手法によって
も連結された核酸が作製され得る。
ある。2つの断片のライゲーションのために、断片の末端は互いに適合していなければな
らない。場合によっては、この末端はエンドヌクレアーゼ消化の後に直ちに適合性を有する。しかし、ライゲーションに適合させるために、まずエンドヌクレアーゼ消化の後に一般的に形成される付着末端は平滑末端に変えられる必要がある。平滑末端にするためには、DNAが適切な緩衝液中で15℃にて少なくとも15分間、4つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でDNAポリメラーゼIまたはT4DNAポリメラーゼのクレノー断片の約10単位で処理される。次にDNAがフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿、またはシリカ
精製によって精製される。連結すべきDNA断片が溶液に等モル量加えられる。この溶液に
は、ATP、リガーゼ緩衝に加え、T4DNAリガーゼのようなリガーゼがDNA0.5 μgにつき約10単位含まれる。DNAをベクターに連結する場合は、ベクターは適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化作用によってまず線状にされる。線状にされた断片を次に細菌のアルカリホスファターゼまたは仔ウシ腸管のホスファターゼで処理することによって、ライゲーションのステップの間の当該断片のセルフライゲーションが予防される。
ンにつき少なくとも約5個、より好ましくは少なくとも約7個、より好ましくは少なくとも約10個かそれ以上のタンパク質のコピーが存在する。主要なコートタンパク質は、1ビリ
オンにつき数十、数百または数千のコピーが存在し得る。主要なコートタンパク質の例としては、繊維状ファージのp8タンパク質が挙げられる。
検出限界」とは、その抗原結合断片を提示していない対照ファージによって生じたものよりも多くのELISAシグナルを特定のファージが生産するファージ濃度をいう。
ランダムペプチドおよび小タンパク質を提示するために利用されてきた(WellsおよびLowman(Curr.Opin.Struct.Biol. (1992) 3, 355-362)とその中の引用文献)。一価のファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドのライブラリが遺伝子IIIまたはそ
の一部に融合され、ファージ粒子が融合タンパク質の1個または0個のコピーを提示するように野生型遺伝子IIIタンパク質の存在下で、低レベルで発現される。アビディティー効
果は多価のファージと比較して低下しているので、選別は内在性のリガンド親和性に基づいておりファージミドベクターが使われるが、このベクターはDNA操作を単純化する(LowmanおよびWells、Methods:A Companion to Methods in Enzymology (1991) 3, 205-216)。
子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドはいかなる公知のバクテリオファージ、例えば繊維状バクテリオファージおよびラムダ型バクテリオファージも適宜使用され得る。プラスミドは、通常、抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされたDNA断片は、プラスミドとして増殖することができる。
これらのベクターが導入された細胞がファージ粒子の生産のために必要なすべての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドDNAの1つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは感染性
または非感染性ファージ粒子を形成することができる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面で提示されるように遺伝子融合としてこの異種ポリペプチドの遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子、またはその断片を含むファージミドを含む。
、またはコード鎖と相補的な核酸の配列が利用できるならばこれらの方法が使われる。あるいは、対象アミノ酸配列が公知ならば、各アミノ酸残基の公知で好ましいコード残基を使って可能な核酸配列が適宜推測され得る。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルもしくは分子サイジングカラムで、または沈殿法によって精製することができる。
る。この特性は、例えばin vitroまたはin vivo活性などの生物学的性質であり得る。
また、この特性は、単一の化学的または物理的性質、例えば対象抗原との結合、反応の触媒などでもあり得る。この2つの部分は、単一のペプチド結合によって直接、または1つまたは複数のアミノ酸残基を含んでいるペプチドリンカーを介して結合され得る。通常、この2つの部分とリンカーは同じ読取り枠中に存在する。好ましくは、ポリペプチドの2つの部分は異種または異なるポリペプチドから得られる。
乳類または植物からのDNAを含み得る。DNAは任意選択にマーカーまたは選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、耐熱性遺伝子、その他を含み得る。
抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合に、その位置で提示されるいくつかの異なるアミノ酸を持つ軽鎖および重鎖可変領域上のアミノ酸の位置をいう。非常に多様な位置は一般的にCDR領域に存在する。一態様では、公知のかつ/または天然抗体の非常に多様な位置を決定する際には、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological
Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) (1987年および1991年)が提供するデータが有効である。また、インターネット上の複数のデータベース(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)では収集された多数のヒト軽鎖および重鎖の配列とその配置が提供されており、これらの配列とその配置の情報は本発明における非常に多様な位置の決定に有用である。本発明によると、アミノ酸がある位置で好ましくは約2から約20、好ましくは約3から約19、好ましくは約4
から約18、好ましくは5から17、好ましくは6から16、好ましくは7から15、好ましくは8から14、好ましくは9から13、好ましくは10から12個の可能な異なるアミノ酸残基の多様性
を有する場合は、その位置は非常に多様といえる。いくつかの実施形態では、あるアミノ酸位置は、好ましくは少なくとも約2、好ましくは少なくとも約4、好ましくは少なくとも約6、好ましくは少なくとも約8、好ましくは約10、好ましくは約12の可能な異なるアミノ酸残基の多様性を有し得る。本明細書においては、こうしたアミノ酸残基はフレキシブル残基とも呼ばれる。用語「非ランダムコドンセット」とは、本明細書で記載されているアミノ酸選択のための基準を部分的に、好ましくは完全に満たす選択されたアミノ酸をコードするコドンセットをいう。また、本明細書で使われるように、用語「ランダムコドンセット」とは、20個のアミノ酸(Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I
、Val/V)のうち任意のアミノ酸をコードするコドンが組み合わされたコドンセットをい
う。
ある一態様によれば、本発明は、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基が抗原結合ドメインに含まれている互いに配列の異なる複数の抗原結合分子から主としてなるライブラリを提供する。イオン濃度の例としては金属イオン濃度や水素イオン濃度が好適に挙げられる。
合分子を含む融合ポリペプチドである。
、アルカリ土類金属および亜鉛族等の第II族、ホウ素を除く第III族、炭素とケイ素を除
く第IV族、鉄族および白金族等の第VIII族、V、VIおよびVII族の各A亜族に属する元素と
、アンチモン、ビスマス、ポロニウム等の金属元素のイオンをいう。金属原子は原子価電子を放出して陽イオンになる性質を有しており、これをイオン化傾向という。イオン化傾向の大きい金属は、化学的に活性に富むとされる。
鎖等が知られており、その結合モチーフも数多く知られている。例えば、カドヘリンドメイン、カルモジュリンに含まれるEFハンド、Protein kinase Cに含まれるC2ドメイン、血液凝固タンパク質FactorIXに含まれるGlaドメイン、アシアログライコプロテインレセ
プターやマンノース結合レセプターに含まれるC型レクチン、LDL受容体に含まれるAドメ
イン、アネキシン、トロンボスポンジン3型ドメインおよびEGF様ドメインがよく知られている。
は500μMから2.5 mMの間から選択される濃度でもあり得るし、ほかの態様では200μMか
ら2 mMの間から選択される濃度でもあり得る。さらに400μMから1.5 mMの間から選択される濃度でもあり得る。特に生体内の血漿中(血中)でのカルシウムイオン濃度に近い500μMから2.5 mMの間から選択される濃度が好適に挙げられる。
態様では、0.2μMから20μMの間から選択される濃度でもあり得る。また、異なる態様で
は0.5μMから10μMの間から選択される濃度でもあり得るし、ほかの態様では1μMから5μMの間から選択される濃度でもあり得る。さらに2μMから4μMの間から選択される濃度で
もあり得る。特に生体内の早期エンドソーム内でのイオン化カルシウム濃度に近い1μMから5μMの間から選択される濃度が好適に挙げられる。
対する結合活性が、100μMから10 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、抗原結合分子の0.5μMから10μMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性が、200μMから5 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意味し、特に好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のカルシウムイオン濃度における抗原結合活性が、生体内の血漿中のカルシウムイオン濃度における抗原結合活性より弱いことを意味し、具体的には、抗原結合分子の1μMから5μMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性が、500μMから2.5 mMの間から選択されるカルシウ
ムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。
おいて測定することが可能である。例えば、Biacore(GE Healthcare)などを用いて測
定することが可能である。抗原結合分子と抗原との結合活性の測定は、抗原が可溶型抗原である場合は、抗原結合分子を固定化したチップへ、抗原をアナライトとして流すことで可溶型抗原への結合活性を評価することが可能であり、抗原が膜型抗原である場合は、抗原を固定化したチップへ、抗原結合分子をアナライトとして流すことで膜型抗原への結合活性を評価することが可能である。
μM)/KD (Ca 2 mM)の値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、400、1000、10000等、いかなる値でもよい。また、KD (Ca 3μM)/KD (Ca 1.2 mM)の値でも特定され得る。すなわち、KD (Ca 3μM)/KD (Ca 1.2 mM)の値が2以上であり、さらに好ましくはKD (Ca 3μM)/KD (Ca 1.2 mM)の値が10以上であり、さらに好ましくはKD (Ca 3μM)/KD (Ca 1.2 mM)の値が40以上である。KD (Ca 3μM)/KD
(Ca 1.2 mM)の値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、400、1000、10000等、いかなる値でもよい。
いることが可能である。
ある。kd(低カルシウム濃度条件下)/kd(高カルシウム濃度条件下における)の値の上
限は特に限定されず、当業者の技術常識において作製可能な限り、50、100、200等、いかなる値でもよい。
である。なお本発明において、異なるカルシウムイオン濃度における抗原結合分子の抗原に対する結合活性を測定する際は、カルシウム濃度以外の条件は同一とすることが好ましい。
強度にほぼ等しい。例えば25℃、1気圧における水のイオン積はKw=aH+aOH=10-14であるため、純水ではaH+=aOH=10-7である。この場合のpH=7が中性であり、pHが7より小さい水溶
液は酸性、pHが7より大きい水溶液はアルカリ性である。
高い場合もまた挙げられる。
間から選択され得る。また、異なる態様ではpH7.0からpH9.0の間から選択され得るし、ほかの態様ではpH7.0からpH8.0の間から選択され得る。特に生体内の血漿中(血中)でのpHに近いpH7.4が好適に挙げられる。
るpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、抗原結合分子のpH4.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH6.7からpH9.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味し、より好ましくは、抗原結合分子のpH5.0からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH7.0か
らpH9.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。また
、好ましくは抗原結合分子のpH5.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH7.0からpH8.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。特に好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のpHにおける抗原結合活性が、生体内の血漿中のpHにおける抗原結合活性より弱いことを意味し、具体的には、抗原結合分子のpH5.8での抗原に対する結合活性が、pH7.4での抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。
結合モチーフは、当業者に周知であり、詳細に記載されている(例えばSpringerら(Cell(2000) 102, 275-277)、KawasakiおよびKretsinger(Protein Prof. (1995) 2, 305-490)、Moncriefら(J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562)、Chauvauxら(Biochem. J. (1990) 265, 261-265)、BairochおよびCox(FEBS Lett. (1990) 269, 454-456)、Davis(New Biol. (1990) 2, 410-419)、Schaeferら(Genomics (1995)
25, 638~643)、Economouら(EMBO J. (1990) 9, 349-354)、Wurzburgら(Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058))。すなわち、ASGPR, CD23、MBR、DC-SIGN等のC型レクチン等の任意の公知のカルシウム結合モチーフが、本発明の抗原結合分子に含ま
れ得る。上記のほか、このようなカルシウム結合モチーフの好適な例として、後述されるように、Vk5-2等の生殖細胞系列の配列を有する抗体の軽鎖可変領域に存在するVk5の部分に含まれるカルシウム結合モチーフも挙げられ得る。
供される。
の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。
の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラリが提供される。
るライブラリもまた本発明の異なる態様として提供される。さらに、当該アミノ酸残基が軽鎖のKabatナンバリングで表される30位、31位、32位、50位および/または92位のいずれかひとつ以上に含まれている互いに配列の異なる抗原結合分子から主としてなるライブラリもまた提供される。
ワーク配列は、ヒトの生殖細胞系フレームワーク配列を有していることが望ましい。したがって、本発明の一態様においてフレームワーク配列が完全にヒトの配列であるならば、ヒトに投与(例えば疾病の治療)された場合、本発明の抗原結合分子は免疫原性反応を殆どあるいは全く引き起こさないと考えられる。上記の意味から、本発明の「生殖細胞系列の配列を含む」とは、本発明のフレームワーク配列の一部が、いずれかのヒトの生殖細胞系フレームワーク配列の一部と同一であることを意味する。例えば、本発明の抗原結合分子の重鎖FR2の配列が複数の異なるヒトの生殖細胞系フレームワーク配列の重鎖FR2配列が組み合わされた配列である場合も、本発明の「生殖細胞系列の配列を含む」抗原結合分子である。
のウェブサイトに含まれている、現在知られている完全にヒト型のフレームワーク領域の配列が好適に挙げられる。 これらのフレームワーク領域の配列が本発明の抗原結合分子に含まれる生殖細胞系列の配列として適宜使用され得る。生殖細胞系列の配列はその類似性にもとづいて分類され得る(Tomlinsonら(J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798
)WilliamsおよびWinter(Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461)およびCoxら
(Nat. Genetics (1994) 7, 162-168))。 7つのサブグループに分類されるVκ1
0のサブグループに分類されるVλ、7つのサブグループに分類されるVHから好適な生殖細胞系列の配列が適宜選択され得る。
ープ(例えば、VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2サブグループ(例えば、VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3サブグループ(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4サブグループ(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5サブグループ(VH5-51)、VH6サブグループ(VH6-1)、VH7サブグループ(VH7-4、VH7-81)のVH配列等が好適に挙げられる。これらは公知文献(Matsudaら(J. Exp. Med.
(1998) 188, 1973-1975))等にも記載されており、当業者はこれらの配列情報をも
とに本発明の抗原結合分子を適宜設計することが可能である。これら以外の完全にヒト型のフレームワークまたはフレームワークの準領域も好適に使用され得る。
ープに分類されるA20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22
、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18、Vk2サブグループに分類されるA1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11、Vk3サブグループに分類されるA11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25、Vk4サブグループに分類されるB3、Vk5サブグループに分類されるB2(本明細書においてはVk5-2とも指称される))、VK6サブグループに分類されるA10、A14、A26等(Kawasakiら(Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028)、SchableおよびZachau(Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022)およびBrensing-Kuppersら(Gene (1997) 191, 173-181))が好適に挙げられる。
ープに分類されるV1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、
V1-18、V1-19、V1-20、V1-22、VL2サブグループに分類されるV2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、VL3サブグループに分類されるV3-2、V3-3、V3-4、VL4サブグループに分類されるV4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、VL5サブグループに分類されるV5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasakiら(Genome Res. (1997) 7, 250-261))が好適に挙げられる。
これらのフレームワークの突然変異は生殖細胞系の遺伝子には存在せず、また患者の免疫原性になる可能性は少なくないとも考えられる。一方、通常のヒトの集団は生殖細胞系の遺伝子によって発現されるフレームワーク配列の大多数にさらされており、免疫寛容の結果、これらの生殖細胞系のフレームワークは患者において免疫原性が低いあるいは非免疫原性であると予想される。免疫寛容の可能性を最大にするため、可変領域をコード化する遺伝子が普通に存在する機能的な生殖細胞系遺伝子の集合から選択され得る。
る。
とランダム化可変領域配列ライブラリとして作製された重鎖可変領域とを組み合わせたライブラリが好適に挙げられる。上記のVk5-2等の生殖細胞系列の配列を有する抗体の軽鎖
可変領域に存在するVk5のドメインを含む軽鎖可変領域配列の好適な例として、配列番号
:1(Vk5-2)に記載された軽鎖可変領域配列のほかに、後述される配列番号:2で表さ
れるVk5-2バリアント1または配列番号:3で表されるVk5-2バリアント2等も適宜使用される。これらの分子に含まれる「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」を含むVk5-2の部分が、本発明の
カルシウム結合モチーフを含むドメインとして使用され得る。本発明の非限定の一態様では、カルシウム結合モチーフを形成する少なくとも一つのアミノ酸が本発明の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」として使用され得る。
またはそれ以上のフレキシブル残基が含まれ得る。例えば、イオン濃度がカルシウムイオン濃度である場合には、配列番号:1(Vk5-2)に記載された軽鎖可変領域配列に導入さ
れるフレキシブル残基の非限定的な例として、表13、表14、表17または表18に記載されたアミノ酸残基が挙げられる。
位のアミノ酸残基が挙げられる。さらに、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR3に含まれアミノ酸残基の非限定な例として、軽鎖可変領域のCDR3中のKabatナンバリングで表される92位
のアミノ酸残基が挙げられる。また、これらのアミノ酸残基が、カルシウム結合モチーフを形成し、および/または、カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合
分子の結合活性が変化する限り、これらのアミノ酸残基が単独で含まれ得るし、これらのアミノ酸が二つ以上組み合わされて含まれ得る。また、複数個のカルシウムイオン結合部位を有し、分子進化上共通の起源から由来したと考えられるトロポニンC、カルモジュリ
ン、パルブアルブミン、ミオシン軽鎖等が知られており、その結合モチーフが含まれるように軽鎖CDR1、CDR2および/またはCDR3を設計することも可能である。例えば、上記の目
的でカドヘリンドメイン、カルモジュリンに含まれるEFハンド、Protein kinase Cに含まれるC2ドメイン、血液凝固タンパク質FactorIXに含まれるGlaドメイン、アシアログラ
イコプロテインレセプターやマンノース結合レセプターに含まれるC型レクチン、LDL受容体に含まれるAドメイン、アネキシン、トロンボスポンジン3型ドメインおよびEGF様ドメ
インが適宜使用され得る。
発明の抗原結合分子の抗原に対する結合活性が、イオン濃度の条件によって変化する限り、当該フレキシブル残基の数および位置は特定の態様に限定されることはない。すなわち、重鎖および/または軽鎖のCDR配列および/またはFR配列に一つまたはそれ以上のフレキ
シブル残基が含まれ得る。例えば、イオン濃度がカルシウムイオン濃度である場合には、軽鎖可変領域配列に導入されるフレキシブル残基の非限定的な例として、表13、表14、表17または表18に記載されたアミノ酸残基が挙げられる。
つ/または抗原との接触が可能と判断される位置のことをいうが、一般的にはそのCDRである。好ましくは、表面に露出した位置は、InsightIIプログラム(Accelrys)のようなコ
ンピュータプログラムを用いて、抗原結合分子の3次元モデルからの座標を使って決定さ
れる。表面に露出した位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム(例えば、LeeおよびRichards(J.Mol.Biol. (1971) 55, 379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst. (1983) 16,
548-558))を使用して決定され得る。表面に露出した位置の決定は、タンパク質モデ
リングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる三次元構造情報を使って行われ得る。このような目的のために利用できるソフトウェアとして、SYBYL生体高分子モジュール
ソフトウェア(Tripos Associates)が好適に挙げられる。一般的に、また好ましくは、アルゴリズムがユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約1.4オングストローム以下に設定される。さらに、パ
ーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した表面に露出した領域およびエリアの決定法が、Pacios(Comput.Chem. (1994) 18 (4), 377-386およびJ.Mol.Model. (1995) 1, 46-53)に記載されている。
は配列番号:11(6KC4-1#85H-IgG1)に記載された重鎖可変領域配列とランダム化可変
領域配列ライブラリとして作製された軽鎖可変領域とを組み合わせたライブラリが好適に挙げられる。また、ランダム化可変領域配列ライブラリとして作製された軽鎖可変領域の代わりに、生殖細胞系列の配列を有する軽鎖可変領域の中から適宜選択することによって作製され得る。例えば、配列番号:10(6RL#9H-IgG1)または配列番号:11(6KC4-1#85H-IgG1)に記載された重鎖可変領域配列と生殖細胞系列の配列を有する軽鎖可変領域とを組み合わせたライブラリが好適に挙げられる。
上のフレキシブル残基が含まれ得る。例えば、イオン濃度がカルシウムイオン濃度である場合には、配列番号:10(6RL#9H-IgG1)に記載された重鎖可変領域配列に導入される
フレキシブル残基の非限定的な例として、重鎖CDR1およびCDR2の全てのアミノ酸残基のほか重鎖CDR3の95位、96位および/または100a位以外のCDR3のアミノ酸残基が挙げられる。
または配列番号:11(6KC4-1#85H-IgG1)に記載された重鎖可変領域配列に導入される
フレキシブル残基の非限定的な例として、重鎖CDR1およびCDR2の全てのアミノ酸残基のほか重鎖CDR3の95位および/または101位以外のCDR3のアミノ酸残基もまた挙げられる。
ンバリングで表される95位、96位、100a位および/または101位のアミノ酸が挙げられる。また、これらのアミノ酸残基が、カルシウム結合モチーフを形成し、および/または、カ
ルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変化する限り、これらのアミノ酸残基が単独で含まれ得るし、これらのアミノ酸が二つ以上組み合わされて含まれ得る。
て抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基」以外の重鎖可変領域のCDR1、CDR2および/またはCDR3のアミノ酸配列としてランダム化可変領域ライブラリも
好適に使用され得る。軽鎖可変領域として生殖細胞系列の配列が用いられる場合には、例えば、配列番号:6(Vk1)、配列番号:7(Vk2)、配列番号:8(Vk3)、配列番号:
9(Vk4)等の生殖細胞系列の配列が非限定な例として挙げられ得る。
ンバリングで表される50位、51位、52位、53位、54位、55位および/または56位のアミノ
酸残基が挙げられる。さらに、当該アミノ酸残基が軽鎖のCDR3に含まれアミノ酸残基の非限定な例として、軽鎖可変領域のCDR3中のKabatナンバリングで表される89位、90位、91
位、92位、93位、94および/または95a位のアミノ酸残基が挙げられる。また、これらのアミノ酸残基が、水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変化する限り、これらのアミノ酸残基が単独で含まれ得るし、これらのアミノ酸が二つ以上組み合わされて含まれ得る。
のフレキシブル残基が含まれ得る。例えば、軽鎖可変領域配列に導入されるフレキシブル残基の非限定的な例として、表4または表5に記載されたアミノ酸残基が挙げられる。また、水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基やフレキシブル残基以外の軽鎖可変領域のアミノ酸配列としては、非限定な例としてVk1(配列番号:6)、Vk2(配列番号:7)、Vk3(配列番号:8)、Vk4(配列番号:9)等の生殖細胞系列の配列が好適に使用され得る。
位、61位および/または62位のアミノ酸が挙げられる。重鎖のCDR3に含まれアミノ酸残基
の非限定な例として、重鎖可変領域のCDR3中のKabatナンバリングで表される95位、96位
、97位、98位、99位、100a位、100b位、100d位、100f位、100h位、102位および/または107位のアミノ酸が挙げられる。また、これらのアミノ酸残基が、水素イオン濃度の条件に
よって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が変化する限り、これらのアミノ酸残基が単独で含まれ得るし、これらのアミノ酸が二つ以上組み合わされて含まれ得る。
FR配列に一つまたはそれ以上のフレキシブル残基が含まれ得る。また、「水素イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基」以外の重鎖可変領域のCDR1、CDR2および/またはCDR3のアミノ酸配列としてランダム化可変領域
ライブラリも好適に使用され得る。また、軽鎖可変領域として生殖細胞系列の配列が用いられる場合には、例えば、配列番号:6(Vk1)、配列番号:7(Vk2)、配列番号:8(Vk3)、配列番号:9(Vk4)等の生殖細胞系列の配列が非限定な例として挙げられ得る。
、3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21)または3,5-I2-Tyr(pKa 7.38)等の非天然のアミノ酸(Bioorg.Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768が好適に例示される。また、当該アミ
ノ酸残基の特に好適な例としては、側鎖のpKaが5.5-7.0であるアミノ酸が挙げられる。こうした電子供与性を有するアミノ酸としては、ヒスチジンが好適に例示される。
等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン(アンバーコドン)の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム(Clover Direct(Protein Express))等も好適に用いられる。
かつ/または抗原との接触が可能と判断される位置のことをいうが、一般的にはそのCDRである。好ましくは、表面に露出した位置は、InsightIIプログラム(Accelrys)のような
コンピュータプログラムを用いて、抗原結合分子の3次元モデルからの座標を使って決定
される。表面に露出した位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム(例えば、LeeおよびRichards(J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400)、Connolly(J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558))を使用して決定され得る。表面に露出した位置の決定は、タン
パク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる三次元構造情報を使って行われ得る。このような目的のために利用できるソフトウェアとして、SYBYL生体高分子
モジュールソフトウェア(Tripos Associates)が好適に挙げられる。一般的に、また好ましくは、アルゴリズムがユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約1.4オングストローム以下に設定される。
さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した表面に露出した領域およびエリアの決定法が、Pacios(Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386およびJ. Mol. Model. (1995) 1,46-53)に記載されている。
581-597)等の公知の抗体ファージディスプレイライブラリ技術が適宜適用され得る。
すなわち、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基以外のアミノ酸配列として、上記の抗体ファージライブラリで採用される。
イ法等の公知の技術を適用することによってライブラリサイズを1014まで拡大することが可能である。しかしながら、ファージライブラリのパンニング選択時に使用されるファージ粒子の実際の数は、通常、ライブラリサイズよりも10ないし10,000倍大きい。この過剰倍数は、「ライブラリ当量数」とも呼ばれるが、同じアミノ酸配列を有する個々のクローンが10ないし10,000存在し得ることを表す。よって本発明における「互いに配列の異なる」との用語はライブラリ当量数が除外されたライブラリ中の個々の抗原結合分子の配列が相互に異なること、より具体的には互いに配列の異なる抗原結合分子が106から1014分子
、好ましくは107から1012分子、さらに好ましくは108から1011特に好ましくは108から1010存在することを意味する。
例えば、ある2つ以上の物質が特定の形質に関して互いに異なるならば、その物質には2種類以上が存在することを表す。例としては、アミノ酸配列中の特定のアミノ酸位置で観察される変異体アミノ酸が挙げられ得る。例えば、フレキシブル残基以外、または表面に露出した非常に多様なアミノ酸位置の特定の変異体アミノ酸以外は実質的に同じ、好ましくは同一の配列である本発明の2つ以上の抗原結合分子がある場合、本発明の抗原結合分子
は複数個存在する。他の実施例では、フレキシブル残基をコードする塩基以外、または表面に露出した非常に多様なアミノ酸位置の特定の変異体アミノ酸をコードする塩基以外は実質的に同じ、好ましくは同一の配列である本発明の2つ以上のポリヌクレオチド分子が
あるならば、本発明のポリヌクレオチド分子は複数個存在する。
ち、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が異なっている抗原結合分子の数が反映される。具体的には、そのような結合活性を示す抗原結合分子がライブラリ中に少なくとも104分子存在することが好ましい。また、より好ましくは、本発明
はそのような結合活性を示す抗原結合分子が少なくとも105分子存在するライブラリを提
供する。さらに好ましくは、本発明はそのような結合活性を示す抗原結合分子が少なくとも106分子存在するライブラリを提供する。特に好ましくは、本発明はそのような結合活
性を示す抗原結合分子が少なくとも107分子存在するライブラリを提供する。また、好ま
しくは、本発明はそのような結合活性を示す抗原結合分子が少なくとも108分子存在する
ライブラリを提供する。別の表現では、ライブラリ中の配列の異なる独立クローンの数のうち、イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性が異なっている抗原結合分子の割合としても好適に表現され得る。具体的には、本発明は、そのような結合活性を示す抗原結合分子がライブラリ中の配列の異なる独立クローンの数の0.1%から80
%、好ましくは0.5%から60%、より好ましくは1%から40%、さらに好ましくは2%から20%、特に好ましくは4%から10%含まれるライブラリを提供する。融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド分子またはベクターの場合も、上記と同様、分子の数や分子全体における割合で表現され得る。また、ウイルスの場合も、上記と同様、ウイルス個体の数や個体全体における割合で表現され得る。
本発明における一つの実施形態では、本発明の抗原結合分子と異種ポリペプチドとの融合分子が作製され得る。ある実施形態では、融合ポリペプチドはウイルスコートタンパク質、例えばpIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVIおよびその変異体からなる群から選択されるウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合され得る。
であり得るため、別の一つの実施形態では、これらの抗原結合分子と異種ポリペプチドとの融合分子であって互いに配列の異なる複数の融合分子から主としてなるライブラリが提供される。具体的には、これらの抗原結合分子とウイルスコートタンパク質、例えばpIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVIおよびその変異体からなる群から選択されるウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合された融合タンパク質であって互いに配列の異なる複数の融合分子から主としてなるライブラリが提供される。本発明の抗原結合分子はさらに二量体化ドメインを含み得る。ある実施形態では、前記二量体化ドメインは抗体の重鎖または軽鎖の可変領域とウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との間に存在し得る。この二量体化ドメインには、二量体化配列の少なくとも1つ、および/または1つまたは複数のシステイン残基を含む配列が含まれ得る。この二量体化ドメインは、好
ましくは重鎖可変領域または定常領域のC末端と連結され得る。二量体化ドメインは、前
記抗体可変領域がウイルスのコートタンパク質成分との融合タンパク質成分として作製されている(二量体化ドメインの後ろにアンバー終止コドンを有さない)かどうかによって、または、前記抗体可変領域が主にウイルスコートタンパク質成分を含まずに作製されている(例えば、二量体化ドメインの後にアンバー終止コドンを有する)かどうかによって、様々な構造をとることが可能である。前記抗体可変領域が主にウイルスのコートタンパク質成分との融合タンパク質として作製されるときは、1つまたは複数のジスルフィド結
合および/または単一の二量体化配列によって二価提示がもたらされる。本発明の抗原結
合分子が、主にウイルスのコートタンパク質成分と融合されずに作製される抗体可変領域である(例えば、アンバー終止コドンを有する)場合、システイン残基と二量体化配列の両方を含んでいる二量体化ドメインを持つことが好ましい。ある実施形態では、F(ab)2の重鎖は、ヒンジ領域を含まない二量体化ドメインによって二量体化される。この二量体化ドメインには、例えば公知であるGCN4配列:GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG(配
列番号:12)等のロイシンジッパー配列が含まれ得る。
抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを作製するために用いられるオリゴヌクレオチドまたはプライマーのセットは、標準の方法を使って合成され得る。例えば、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを含み、所望のアミノ酸群をコードする配列を含む一組のオリゴヌクレオチドが固相法によって合成され得る。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。ある位置での選択された「縮重」ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー(Applied Biosystems
)を使って合成され得るし、またはその市販品が入手され得る(例えば、Life Technologies)。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含み得る。
物の「ライブラリ」を作製するために使用され得る。PCR産物は確立された分子生物学的
手法を使って、他の関連した、または無関係な核酸配列、例えばウイルスのコートタンパク質構成成分および二量体化ドメインをコードする核酸配列と融合され得るため、こうしたオリゴヌクレオチドセットは「核酸カセット」と呼ばれることもある。
ために設計されたコドンセットの1つまたは複数を含む。前記のように、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。また、オリゴヌクレオチドセットの配列の長さは鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さであり、また、必須ではないが制限部位が含まれ得る。DNA鋳
型はバクテリオファージM13ベクターに由来するベクター、またはViera他(Meth.Enzymol. (1987) 153, 3)に記載されている一本鎖ファージの複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきDNAは、一本鎖鋳型を生成するためにこ
れらのベクターの1つに挿入される。一本鎖鋳型の生産は、Sambrook等の教科書に記載さ
れている。
条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」や非常に多様なフレキシブル残基を導入することによってライブラリが作製され得る。例えば、本発明の「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」が導入された軽鎖可変領域とランダム化可変領域配列ライブラリとして作製された重鎖可変領域との組合せによって、本発明の複数の互いに配列の異なる抗原結合分子を含むライブラリが作製される場合に、こうした方法が適宜採用され得るであろう。このような非限定的な例として、金属イオンがカルシウムイオンである場合に、例えば、配列番号:6(Vk1)、配列番号:7(Vk2)、配列番号:8(Vk3)、配列番号:9(Vk4)等の生殖細胞系列の特定の残基が「カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」に置換された軽鎖可変領域配列が作製されることが挙げられているが、こ
うした軽鎖可変領域の作製に、こうした方法が採用され得る。
得る。可変領域のテンプレート配列は、対象核酸配列(すなわち、置換の対象となるアミノ酸をコードしている核酸配列)を含む免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のいかなる部分も好適に用いられる。前記の例でいえば、配列番号:6(Vk1)、配列番号:7(Vk2)、配列番号:8(Vk3)、配列番号:9(Vk4)等の生殖細胞系列の可変領域が、テンプレート配列として使用され得る。可変領域のテンプレート配列は、少なくとも可変領域の一部を含み、また少なくとも1つのCDRを含む。場合によっては、可変領域のテンプレート配列は複数のCDRを含む。可変領域のテンプレート配列の上流部および下流部は、上流域のオ
リゴヌクレオチドセットおよび下流域のオリゴヌクレオチドセットの構成メンバーによるハイブリダイゼーションの対象とされ得る。上流のプライマーセットの第1のオリゴヌク
レオチドは第1の核酸鎖にハイブリダイズすることができ、下流のプライマーセットの第2のオリゴヌクレオチドは第2の核酸鎖にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレ
オチドプライマーは1つまたは複数のコドンセットを含み、可変領域のテンプレート配列の一部にハイブリダイズするように設計され得る。これらのオリゴヌクレオチドの使用によって、PCR後に2つ以上のコドンセットがPCR産物(すなわち核酸カセット)に導入され
得る。抗体可変領域をコードする核酸配列の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、アミノ酸置換の対象となるCDR残基をコードする部分が含まれ得る。
適宜採用され得る(WO1993003151)。少なくとも1つの抗原結合分子の表面に露出しかつ/または「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる
少なくとも一つのアミノ酸残基」または非常に多様なフレキシブル残基を導入することによってライブラリが作製され得る。Overlap Extension PCR法に使用される上流域およ
び下流域のオリゴヌクレオチドセットには「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」または非常に多様なフレキシブル残基とともに、可変領域のテンプレート配列にハイブリダイズするために十分な長さのフレームワークの配列が含まれ得る。
さのFR2のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドが連結され、3’末端にCDR2に隣接するFR3のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドが連結されたプライマーが作
製される。さらにオリゴヌクレオチドセットと相補的なオリゴヌクレオチドセットの5’
末端にCDR3に隣接する十分な長さのFR4のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド
が連結され、3’末端にCDR3に隣接するFR3のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドが連結された相補プライマーもまた作製される。当該プライマーのFR3のアミノ酸をコ
ードするオリゴヌクレオチドと当該相補プライマーのFR3のアミノ酸をコードするオリゴ
ヌクレオチドとが互いにハイブリダイズすることが可能な程度の長さのオーバーラップす
る配列を含んでいる場合、テンプレート配列が存在しない条件下でのPCR反応によって、CDR2およびCDR3に当該アミノ酸残基または付加的なフレキシブル残基が導入された軽鎖可
変領域が作製され得る。そのようなオーバーラップする配列を含んでいない場合は、例えば、配列番号:6(Vk1)、配列番号:7(Vk2)、配列番号:8(Vk3)、配列番号:9
(Vk4)等の生殖細胞系列の可変領域を、テンプレート配列としたPCR反応によって、同様にCDR2およびCDR3に当該アミノ酸残基または付加的なフレキシブル残基が導入された軽鎖可変領域が作製され得る。
る十分な長さのFR4のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドが連結され、3’末端にCDR3に隣接するFR3のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドが連結されたプラ
イマーと、FR1をコードするヌクレオチド配列を有するプライマーを用いたナイーブ配列
等のランダム化された可変領域を含むライブラリをテンプレート配列とするPCRによって
、同様にCDR2に当該アミノ酸残基および付加的なフレキシブル残基が導入され、CDR1およびCDR2がランダム化された軽鎖可変領域をコードするのポリヌクレオチドのライブラリが作製され得る。上記の軽鎖に「イオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させる少なくとも一つのアミノ酸残基」および/またはフレキシブル残基が
導入されたポリヌクレオチドライブラリの作製方法は、重鎖に当該アミノ酸残基および付加的なフレキシブル残基が導入されたポリヌクレオチドライブラリを作製するためにも適宜採用される。
しくは、制限部位は外来の核酸配列を導入することなく、または元のCDRまたはフレーム
ワーク核酸配列を取り除くことなく核酸カセットのクローニングを容易にするように設計されている。
された後に、ナイーブ配列等のランダム化された可変領域をコードする核酸カセットに連結され得る。ライブラリの場合のようにこれらの変異体アミノ酸または変異体アミノ酸の組合せを含んでいる抗原結合分子の作製のために、核酸カセットは、さらなる抗体配列、
例えば軽鎖および重鎖可変領域の可変または定常領域のすべてまたは一部を含んでいる発現ベクターに挿入され得る。これらのさらなる抗原結合分子の配列は他の核酸配列、例えばウイルスコートタンパク質構成成分をコードしている配列と融合され、その結果、融合タンパク質の生産が可能となる。
本発明の非限定な一態様では、遺伝子融合をコードしている核酸配列を含んでいる複製可能な発現ベクターを含み、前記遺伝子融合は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合し、1つの抗原結合分子の可変領域、または1つの抗原結合分子の可変領域と1つの定常領域を含む融合タンパク質をコードする。前記のように、多様な配列で生成さ
れた互いに配列の異なる複数の抗原結合分子の可変領域を含む複数の異なる融合タンパク質をコードする複数の遺伝子融合を含む、多様で複製可能な発現ベクターのライブラリも含まれる。ベクターは様々な構成成分を含むことが可能で、好ましくは異なるベクターの間で抗原結合分子の可変領域が移動できるように、かつ/または異なるフォーマットで融
合タンパク質が提示されるように構築される。
リオファージコートタンパク質6(pVI)(繊維状ファージ(J. Immunol. Methods. (1999) 231 (1-2), 39-51)、M13バクテリオファージ主コートタンパク質変異体(P8)
(Protein Sci. (2000) 9 (4), 647-654))が含まれる。融合タンパク質はファー
ジの表面で提示されるが、適切なファージ系にはM13KO7ヘルパーファージ、M13R408、M13-VCSおよびPhi X 174、pJuFoファージ系(J. Virol. (2001) 75 (15), 7107-7113)、ハイパーファージ(Nat. Biotechnol. (2001) 19 (1), 75-78)、KM13(Fold Des. (1998) 3 (5), 321-328)が含まれる。好ましいヘルパーファージはM13KO7であり、好ましいコートタンパク質はM13ファージ遺伝子IIIコートタンパク質である。好ましい宿主は大腸菌、および大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。例えばfth1ベクター(Nucleic Acids Res. (2001) 29 (10) e50)等のベクターは、融合タンパク質の発現に
有用であり得る。
タンパク質をコードしている遺伝子の隣接する5’側に位置し、したがって融合タンパク
質のアミノ末端で転写される。しかし、ある場合には、シグナル配列は分泌されるべきタンパク質をコードしている遺伝子の5’以外の位置にあることが証明された。この配列は
、それが細菌細胞の内膜を横切って結合するタンパク質を対象とする。シグナル配列をコードしているDNAは、シグナル配列を持つタンパク質をコードしている遺伝子のいずれか
から、制限エンドヌクレアーゼ断片として得られる。原核生物の適当なシグナル配列は、例えば、LamBまたはOmpF(Wongら(Gene (1983), 68 (2), 193-203)、MalE、PhoAをコードしている遺伝子および他の遺伝子も使用され得る。本発明の実施のための好ましい原核生物シグナル配列は、Changら(Gene (1987) 55 (2-3), 189-196)に記載されている大腸菌耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列、pelBおよびmalEである。
ーが含まれる。原核生物ベクターで一般的に使われるプロモーターには、lac Zプロモーター系、アルカリホスファターゼpho Aプロモーター(Ap)、バクテリオファージλPLプロモーター(温度感受性プロモーター)、tacプロモーター(lacリプレッサーによって制御されるハイブリッドtrp-lacプロモーター)、トリプトファンプロモーター、pBADプロ
モーターおよびバクテリオファージT7プロモーターが含まれる。プロモーターの総説に関しては、前記のSambrook他の教示書に記載されている。これらが最も一般的に使用されるプロモーターであるが、他の適切な微生物プロモーターも同様に使用され得る。
チジンタグ、蛍光タンパク質(例えば、GFP)またはファージまたは細胞の表面で発現す
る融合タンパク質の検出または精製に役立つβ-ガラクトシダーゼタンパク質をコードしている配列が含まれ得る。例えば、gDタグをコードしている核酸配列によって、融合タンパク質を発現する細胞またはウイルスの正または負の選択が可能となる。いくつかの実施形態では、gDタグは好ましくはウイルスコートタンパク質の構成成分に融合していない抗原結合分子の可変領域と融合する。例えば、ポリヒスチジン標識をコードしている核酸配列は、免疫組織化学手法を使って特異的抗原と結合する抗原結合分子の可変領域を含む融合タンパク質を同定するために有益である。抗原結合の検出に役立つタグは、ウイルスコートタンパク質構成成分に融合していない抗原結合分子の可変領域、またはウイルスコートタンパク質構成成分に融合した抗原結合分子の可変領域に融合され得る。
主ではそれはファージコートタンパク質と融合していない可溶型の抗原結合分子の断片を産生する終止コドンと解釈される。これらの合成配列は、ベクター内の1つまたは複数の
抗原結合分子の可変領域と融合され得る。
のコートタンパク質構成成分(遺伝子2)との間に、終結または終止コドンをコードして
いるDNAが挿入され得る。そのような終結コドンにはUAG(アンバー)、UAA(オーカー)
およびUGA(オペル)が含まれる。(Davisら(Microbiology (1980) , 237, 245-247, 374 Harper & Row, New York))。野生型宿主細胞で発現する終結または終止コドンは、遺伝子2タンパク質が結合しない遺伝子1タンパク質産物の合成をもたらす。しか
し、抑制宿主細胞での増殖によって検出可能な量の融合タンパク質が合成される。そのような抑制宿主細胞は公知であり、大腸菌抑制遺伝子株(Bullockら(BioTechniques (1987) 5, 376-379))等が記載されている。そのような終結コドンが、融合ポリペプチド
をコードするmRNAに挿入され得る。
ージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第2の遺伝子との間に挿入され得る
。あるいは、抑制性終結コドンは、抗原結合分子の可変領域の最後のアミノ酸トリプレットまたはファージコートタンパク質の最初のアミノ酸を置換することによって融合部位に隣接して挿入され得る。抑制性終結コドンは、二量体化ドメインのC末端またはその後に
挿入され得る。抑制性コドンを含んでいるプラスミドがサプレッサー宿主細胞中で複製した場合、検出可能な量のポリペプチドおよびコートタンパク質を含んでいる融合ポリペプチドが生産される。プラスミドが非サプレッサー宿主細胞中で複製した場合、挿入された抑制性トリプレットUAG、UAAまたはUGAにおける翻訳の終結のために、実質的にファージ
コートタンパク質と融合せずに抗原結合分子の可変領域が合成される。よって、非サプレッサー細胞中で発現した抗原結合分子の可変領域は、宿主メンブランに固定する融合ファージコートタンパク質を含まないために、合成された後に宿主細胞から分泌される。
たは細胞の表面での1つまたは複数の融合ポリペプチドの相互作用を可能にするペプチド
配列にさらに融合され得る。これらのペプチド配列は、本明細書では「二量体化ドメイン」と指称される。二量体化ドメインは、少なくとも1つまたは複数の二量体化配列、またはシステイン残基を含んでいる配列を少なくとも1つ、あるいはこの両方ともに含むこと
ができる。適当な二量体化配列には、疎水残基が一定の間隔をあけて存在し、各タンパク質の疎水残基の相互作用による二量体の形成を可能にする両親媒性のαヘリックスを有するタンパク質のそれらが含まれる。そのようなタンパク質およびタンパク質部分には、例えばロイシンジッパー領域が含まれる。二量体化ドメインは、また、1つまたは複数のシ
ステイン残基を含むことができる(例えば、二量体化ドメイン内に抗体ヒンジ配列を含むことにより提供される)。システイン残基は、1つまたは複数のジスルフィド結合の形成
による二量体化を可能にする。終止コドンが二量体化ドメインの後方に存在する一実施形態では、二量体化ドメインは少なくとも1つのシステイン残基を含む。二量体化ドメイン
は、好ましくは抗体可変または定常ドメインとウイルスコートタンパク質構成成分との間に位置する。
発現する「一シストロン性」と考えられる。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の間にリンカーペプチドを有し、VLおよびVHドメインをコードしている一シストロン性配列の発現を促進するためにアルカリホスファターゼ(AP)またはTacプロモーターを利用するベクタ
ーが例示される。このようなシストロン配列は、5’末端で大腸菌のmalEまたは耐熱性エ
ンテロトキシンII(STII)シグナル配列に連結され、3’末端で(例えば、pIIIタンパク
質等の)ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部に連結される。いくつかの実施形態では、ベクターは第2の可変領域配列とウイルスコートタンパク質配列との間のその3’末端に、(例えばロイシンジッパー等の)二量体化ドメインをコードしている配列番号:12で示されるような配列をさらに含むことができる。
ロン性mRNAの発現を促すために利用され得る。例えば、軽鎖可変領域および定常領域をコードしている第1のシストロンが、5’末端で大腸菌のmalE、pelBまたは耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列に連結され、3’末端でgDタグをコードしている核酸配列
に連結される。例えば、重鎖可変領域および定常領域CH1をコードしている第2のシストロンは、5’末端で大腸菌のmalEまたは耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列に
連結され、3’末端でウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部に連結されている。
なプロモーター、例えばtacまたはPhoA(AP)プロモーターは、5’末端で大腸菌malEまたは耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列と作用可能に連結され、3’末端でgD
タグをコードしている核酸配列と連結された軽鎖可変領域および定常領域をコードしている第1のシストロンの発現を促進する。第2のシストロンは、例えば5’末端で大腸菌のmalEまたは耐熱性エンテロトキシンII(STII)シグナル配列と作用可能に連結された重鎖可
変領域および定常領域をコードし、3’末端にはIgGヒンジ配列およびロイシンジッパー配列、さらにその後方に少なくとも一部のウイルスコートタンパク質を含む二量体化ドメインを含む。
抗原結合分子の可変領域の融合ポリペプチドは、細胞、ウイルスまたはファージミド粒子の表面で様々な態様で提示され得る。これらの態様には、単鎖Fv断片(scFv)、F(ab)
断片およびこれらの断片の多価の形態が含まれる。多価の形態は、好ましくはScFv、Fab
またはF(ab’)の二量体であり、これらは本明細書では(ScFv)2、F(ab)2およびF(ab’)2とそれぞれ指称される。多価の形態の提示が好まれる理由の一つは、多価の形態の提示によって、通常低親和性クローンの同定が可能となる点、または、選択過程で稀なクローンのより効率的な選択を可能にする複数の抗原結合部位を有する点であると考えられる。
よびWO1993011236)では、ファージ表面で提示された様々な抗原に対する、人工的に再配置された可変領域遺伝子レパートリーによる抗体の同定が示されている。
出に役立つ標識をコードしている他の配列が、抗原結合分子の軽鎖可変領域もしくは抗原結合分子の重鎖可変領域のいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の3’末端に融
合され得る。
よび抗原結合分子の定常領域をコードする核酸配列がこのベクターに含まれる。軽鎖可変領域をコードする核酸は、軽鎖定常領域をコードする核酸配列に融合される。抗原結合分子の重鎖可変領域をコードする核酸配列は、重鎖定常CH1領域をコードする核酸配列に融
合される。一般的には、重鎖可変領域および定常領域をコードしている核酸配列は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部をコードしている核酸配列に融合される。重鎖
可変領域および定常領域は好ましくはウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との融合体として発現され、軽鎖可変領域および定常領域は、重鎖ウイルスコート融合タンパク質とは別々に発現される。重鎖および軽鎖は互いと結合するが、その結合は共有結合でも非共有結合でもあり得る。任意に、例えば精製または検出に役立つポリペプチド標識をコードしている他の配列が、抗原結合分子の軽鎖定常領域もしくは抗原結合分子の重鎖定常領域のいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の3’末端に融合され得る。
前記のように構築されたベクターは、増幅および/または発現のために宿主細胞に導入
される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む公知の形質転換法によって、宿主細胞に導入され得る。ベクターがウイルスのような感染性の粒子である場合、ベクター自体が宿主細胞に侵入する。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挿入されている複製可能な発現ベクターによる宿主細胞のトランスフェクションおよび公知の手法によるファージ粒子の生産によって、融合タンパク質がファージ粒子の表面に提示される。
たは600 nmにおけるODが0.6ないし0.8になるまで)、37℃で培養し、次に培養液を遠心
分離することによって(例えばデカンテーションにより)培養上清が取り出される。精製の初期段階では、好ましくは緩衝液(例えば1.0 mMのHEPES(pH7.4))中に細胞ペレッ
トが再懸濁される。次に再度の遠心分離によって懸濁液から上清が取り出される。得られた細胞ペレットは例えば5-20%V/Vに希釈されたグリセリンに再懸濁される。再度遠心分離によって懸濁液から上清を取り除くことによって細胞ペレットが得られる。当該細胞ペレットを水または希釈されたグリセリンの中に再懸濁することによって得られる菌体濃度の測定値をもとづいて、最終的な菌体濃度が水または希釈されたグリセリンを用いて所望の濃度に調製される。
番号98795が与えられている。この菌株でのファージ複製を可能にするいかなるF’エピソームでも、本発明で用いられ得る。適切ななエピソームはATCCに寄託されている株から入手可能であるし、または市販品も入手可能である(TG1, CJ236、CSH18、DHF’、ER2738
、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1-BLUE、71-18等)。
上し、宿主細胞に形質転換されるDNAの量が増加する。高い菌体濃度の使用も効率を高め
る(約10倍)。移転されたDNA量の増加により、より大きな多様性を有し、配列の異なる
独立クローンの数が大きなライブラリが作製され得る。形質転換細胞は、通常、抗生物質を含む培地上の増殖の可否によって選択される。
抗原に対して所望の結合活性を示す抗原結合分子を同定するためのファージディスプレイの使用方法は、様々な改変が加えられた方法も含め、当技術分野で確立されている。非限定の一態様では、融合ポリペプチドをコードしている遺伝子融合体と作用可能に連結し
た転写調節要素を含むように構築された複製可能なベクターのライブラリが、適切な宿主細胞に形質転換される。形質転換された細胞を培養して前記融合ポリペプチドをファージ粒子表面で提示するファージ粒子が形成される。その後、選択の過程で抗原に結合しない粒子と比較して結合する粒子の集団を増加させる目的で、少なくとも粒子集団の一部が抗原と結合するように組換え体ファージ粒子を対象抗原と接触させることによる選択、分画を伴う「結合分子を選択する」ステップが実施される。異なるまたは同じ反応条件で同じ集団をさらに1回スクリーニングするために、分画された集団を、例えば新鮮なXL1-Blue
細胞等の宿主細胞に感染させることによって当該集団が増幅される。つぎに、得られた抗原結合分子の増幅された集団と、イオン濃度の異なる条件下において抗原に接触させるステップが実施され、所望の条件で抗原に結合する抗原結合分子がスクリーニングされる。また、イオン濃度の異なる条件下において抗原に接触させるステップを前記の選択方法の最初のステップとして実施することも可能であるし、「結合分子を選択する」ステップとイオン濃度の異なる条件下で結合活性が変化している結合分子を選択するステップの組合せは適宜変更され得る。また、前記の選択および分画のステップは何回でも実施され得る。これらのイオン濃度の異なる条件下において抗原に結合する抗原結合分子は、生体に投与されたときに病因となる抗原を生体から速やかに除去する能力を有する治療薬として有用である。
ポリペプチドは、ファージ、ファージミド粒子または細胞の表面に発現される。次にイオン濃度の異なる条件下における、融合ポリペプチドの集団中の構成メンバーの抗原に結合する能力について選択および/または分画がされ得る。融合ポリペプチドに対する選択、
分画およびスクリーニングの方法は、protein Lまたはファージ上で提示される抗原結合分子もしくはその断片と結合する標識抗体のような抗原結合分子の可変領域と親和性を有する一般的なタンパク質上での選択、分画およびスクリーニングの方法も含まれる。こうした方法は正しくフォールドされた抗原結合分子(を含む融合ポリペプチド)の断片を提示するライブラリサイズまたはライブラリ当量数を豊富にするために使用され得る。
方法、または当技術分野で公知の他の手段によって達成され得る。
化抗原との結合に適した条件下で、固定化された抗原と融合ポリペプチドを発現しているライブラリとを接触させる。通常、pH、イオン強度、温度等を含む条件は、生理学的条件を模倣する条件が選択される。前記の固定化抗原と結合する粒子(「結合体」)は、水洗により対象と結合しない粒子から分離される。洗浄条件は、高親和性の結合体以外のすべてが取り除かれるように調節され得る。結合体は様々な方法によって固定化された対象から解離させることができる。これらの方法には例えば過剰な抗原等の野生型リガンドを用いる競合的解離、pHおよび/またはイオン強度の変更、ならびに当技術分野で公知の方法
が含まれる。結合体は、一般的に0.1 MのHClなどの酸またはリガンドのような、適当な
溶出材料によってアフィニティーマトリックスから溶出され得る。リガンドの濃度を上昇
させて溶出することによって、提示されたより親和性の高い結合分子を溶出させることも可能である。
たはスクリーニングは何回も行われ得る。選択またはスクリーニング方法の1つとして、protein Lまたは提示されるポリペプチドに存在するポリペプチドタグに対する抗体、例
えばgDタンパク質またはポリヒスチジンタグに対する抗体のような一般の親和性タンパク質と結合する結合体を単離することも含まれ得る。
使用され得る。ランダムなライブラリから、あるいは所望の結合クローンまたはクローン群の結合活性を改善することを目的としたライブラリから改善された結合体を見つけるために溶液結合方法が使用され得る。複数のポリペプチド、例えばファージまたはファージミド粒子(ライブラリー)上で提示されるポリペプチドと、タグ分子で標識されたまたはタグ分子と融合された抗原との接触が、この方法には含まれる。タグはビオチンまたは他の特異的結合体が利用可能である。第1の溶液結合相で濃度を段階的に低くした標識され
たまたは融合された抗原を用いて、溶相のストリンジェンシーが変化され得る。さらにストリンジェンシーを高めるために、第1の溶相での最初のタグ分子で標識されたまたは標
識タグ分子と融合された抗原との結合の後に、追加的にタグ分子で標識されていないまたは標識タグ分子と融合されていない高濃度の抗原を有する第2の溶相と接触させることも
適宜実施され得る。その場合には、通常、標識対象の100から1000倍の量のタグ分子で標
識されていないまたは標識タグ分子と融合されていない抗原が第2相で使われる。第1の溶相のインキュベーション時間は、平衡に達するまで2、3分から1、2時間またはそれ以上の範囲である。結合速度の速い結合体はこの第1相における結合時間が短い性質を有する傾
向があるため、結合時間を短くする接触の条件が採用されうる。第2相のインキュベーシ
ョンの時間および温度は、ストリンジェンシーを高めるために変化させ得る。こうしたインキュベーションの条件の変化によって、対象から離れる速度(解離速度)が遅い結合体に対する選択の偏りが生じる。ファージ/ファージミド粒子上で提示された複数のポリペ
プチドと抗原とを接触させた後に、タグ分子で標識されたまたは標識タグ分子と融合された抗原と結合したファージまたはファージミド粒子が、結合しないファージまたはファージミド粒子から分離される。タグ分子で標識されたまたは標識タグ分子と融合された抗原との結合が可能になるような範囲で短い時間(例えば2~5分間)、ファージまたはファージミド粒子と抗原とを接触させることによって、溶相からファージまたはファージミド粒子と抗原との混合物が単離される。タグ分子で標識されたまたは標識タグ分子と融合された抗原の初期濃度の範囲は、約0.1 nMから約1000 nMまでである。当該混合物から溶出
された粒子は、次のスクリーニングのために増殖させることができる。各回のスクリーニングにおいて、タグ分子で標識されたまたは標識タグ分子と融合された低濃度の抗原を用いてスクリーニングを複数回繰り返すのが好ましい。後述する実施例に記載されるように、標識タグ分子としてビオチンが使用される場合には、ストレプトアビジンがコートされた磁気ビーズ等が溶液結合方法において適宜使用され得る。
択およびスクリーニングを繰り返した後、所望の性質/特性を有する特異的結合体を同定
するために選択された集団から個々のクローンのスクリーニングが通常実行される。好ましくは、スクリーニングのプロセスは、ライブラリに対する高スループットスクリーニン
グを可能にする自動化システムによって実行され得る。
のコード配列が、例えばPCRによって適切なプライマーを使って増幅されたのちに、典型
的シークエンシング方法によってその配列が決定され得る。次にそのコードする抗原結合分子の発現のために、結合体の可変領域をコードするDNAが、制限酵素を用いて消化され
たベクターに挿入され得る。
は500μMから2.5 mMの間から選択される濃度でもあり得るし、ほかの態様では200 μM
から2mMの間から選択される濃度でもあり得る。さらに400μMから1.5 mMの間から選択される濃度でもあり得る。特に生体内の血漿中(血中)でのカルシウムイオン濃度に近い500μMから2.5 mMの間から選択される濃度が好適に挙げられる。
態様では、0.2μMから20μMの間から選択される濃度でもあり得る。また、異なる態様で
は0.5μMから10μMの間から選択される濃度でもあり得るし、ほかの態様では1μMから5μMの間から選択される濃度でもあり得る。さらに2μMから4μMの間から選択される濃度で
もあり得る。特に生体内の早期エンドソーム内でのイオン化カルシウム濃度に近い1μMから5μMの間から選択される濃度が好適に挙げられる。
する結合活性が、100μMから10 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、抗原結合分子の0.5μMから10μM
の間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性が、200μMから5 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意
味し、特に好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のカルシウムイオン濃度における抗
原結合活性が、生体内の血漿中のカルシウムイオン濃度における抗原結合活性より弱いことを意味し、具体的には、抗原結合分子の1μMから5μMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合活性が、500μMから2.5 mMの間から選択されるカルシウ
ムイオン濃度での抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。
抗原に対する結合と100μMから10 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。また、別の非限定の態様では0.5
μMから10μMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合と、200μMから5 mMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合の活性の相違
にもとづいて分画され得る。さらに別の非限定の態様では、生体内の早期エンドソーム内のカルシウムイオン濃度における抗原に対する結合と、生体内の血漿中のカルシウムイオン濃度における抗原に対する結合の活性の相違、具体的には、1μMから5μMの間から選択されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合と、500μMから2.5 mMの間から選択
されるカルシウムイオン濃度での抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。
間から選択され得る。また、異なる態様ではpH7.0からpH9.0の間から選択され得るし、ほかの態様ではpH7.0からpH8.0の間から選択され得る。特に生体内の血漿中(血中)でのpHに近いpH7.4が好適に挙げられる。
るpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、抗原結合分子のpH
4.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH6.7からpH9.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味し、より好ましくは、抗原結合分子のpH5.0からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH7.0か
らpH9.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。また
、好ましくは抗原結合分子のpH5.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性が、pH7.0からpH8.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のpHにおける抗原結合活性が、生体内の血漿中のpHにおける抗原結合活性より弱いことを意味し、具体的には、抗原結合分子のpH5.8での抗原に対する結合活性が、pH7.4での抗原に対する結合活性より弱いことを意味する。
とづいて分画され得る。また、別の非限定の態様ではpH4.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合と、pH6.7からpH9.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。さらに、別の非限定の態様ではpH5.0からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合と、pH7.0からpH9.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。そのほか、pH5.5からpH6.5の間から選択されるpHでの抗原に対する結合と、pH7.0からpH8.0の間から選択されるpHでの抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。さらに別の非限定の態様では、生体内の早期エンドソーム内のpHにおける抗原に対する結合と、生体内の血漿中のpHにおける抗原に対する結合の活性の相違、具体的には、pH5.8での抗原に対する結合と、pH7.4での抗原に対する結合の活性の相違にもとづいて分画され得る。
本発明の非限定の一態様では、前記のように選択された条件によって結合活性が変化する抗原結合分子分子をコードするポリヌクレオチドが単離された後に、当該ポリヌクレオチドが適切な発現ベクターに挿入される。すなわち、目的とする抗原結合分子の可変領域をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に挿入された制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗原結合分子の遺伝子を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化する。更に1コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素の挿入が好ましい。上記のように消化された抗原結合分子の可変領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、本発明の抗原結合分子の発現ベクターが取得され得る。このとき、抗体定常領域(C領域)をコードする遺伝子と、前記可変領域をコード
する遺伝子とがインフレームで融合され得る。
れるが、これ以外にも適したシグナル配列が連結され得る。発現されたポリペプチドは上記配列のカルボキシル末端部分で切断され、切断されたポリペプチドが成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。次いで、この発現ベクターによって適当な宿主細胞が形質転換されることによって、所望の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを発現する組換え細胞が取得され得る。
(1)哺乳類細胞、:CHO(Chinese hamster ovary cell line)、COS(Monkey kidney cell line)、ミエローマ(Sp2/O、NS0等)、BHK (baby hamster kidney cell line)、HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad)5 DNA)、PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes)、Hela、Vero、
など(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table
5.9.1))
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
胞の形質転換には、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。
-酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミ
セス(Saccharomyces )属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
-糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus )属
され得る。
該注入された胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ(またはその子孫)が産生する乳汁からは、所望の抗原結合分子が乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗原結合分子を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに対して投与され得る(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702)。
抗原結合分子は、公知の方法を用いて適宜製造される。
れた3つの相補性決定領域(complementarity-determining region ; CDR)で構成されている。CDRは、実質的に、抗原結合分子の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗原結合分子の間でも、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移
植によって、ある抗原結合分子の結合特異性を、他の抗原結合分子の移植することができる。
化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap Extension PCRが公知である。Overlap Extension PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライ
マーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは
4つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植において
は、マウスのFRと同一性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利で
あるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ
酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
をコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合
成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するよ
うに発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の
培養物中に産生される(EP 239400、WO1996002576)。
な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択され得る(Satoら(Cancer Res, (1993) 53, 851-856))。
フリング(Marksら(Bio/Technology (1992) 10, 779-783))、E.coliの変異誘発株
の使用(Lowら(J. Mol. Biol. (1996) 250, 359-368))、DNAシャッフリング(Pattenら(Curr. Opin. Biotechnol. (1997) 8, 724-733))、ファージディスプレイ(Thompsonら(J. Mol. Biol. (1996) 256, 77-88))および有性PCR(sexual PCR)(Clameriら(Nature (1998) 391, 288-291))を含む種々のアフィニティー成熟化の公知の手順によって取得され得る。
)等の抗体の定常領域が好適に挙げられる。IgG分子の血漿中滞留性が比較的長い(血漿
中からの消失が遅い)のは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているFcRnが
機能しているためである。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分
子は、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム内に発現しているFcRnに結合する。FcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへと進み、そこで分解されるが、FcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下においてFcRnから解離することで再び血漿中に戻る。
し結合することが可能となる。また、抗原結合分子に結合した抗原がエンドソーム内で解離することで血漿中にリサイクルされないため、抗原結合分子による抗原の細胞内への取り込みを促進し、抗原結合分子の投与により抗原の消失を促進し、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。
繰り返し結合することが可能となる。また、抗原結合分子に結合した抗原がエンドソーム内で解離することで血漿中にリサイクルされないため、抗原結合分子による抗原の細胞内への取り込みを促進し、抗原結合分子の投与により抗原の消失を促進し、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。
よって細胞に取り込まれ、エンドソーム内のpH酸性域の条件下でFcRnに結合することで細胞表面に輸送される。FcRnは抗体をエンドソーム内から細胞表面に輸送するため、FcRnの一部は細胞表面にも存在していると考えられるが、細胞表面のpH中性域の条件下では抗体はFcRnから解離するため、抗体は血漿中にリサイクルされる。
の抗原結合分子によるこの回転数が多くなることによって、1分子の抗原結合分子によっ
て結合できる抗原の数も多くなると考えられる。
促進させ、抗原の消失速度を速くすることが可能であると考えられる。
結合ドメインは抗原に対する結合に影響を与えることはないため、また、上述のメカニズムから考えても、抗原の種類に依存することがなく、抗原結合分子のpH酸性域の条件下における抗原結合活性(結合能)をpH中性域の条件下における抗原結合活性より低下させ、および/または、血漿中でのpH中性域におけるFcRnへの結合活性を増大させることにより
、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込を促進させ、抗原の消失速度を速くすることが可能であると考えられる。
抗体定常領域等のFcRn結合ドメインのヒトFcRnに対する結合活性の測定は当業者公知の方法により行うことが可能であり、例えば、Biacore(GE Healthcare)などを用いて測定
され得る。抗体定常領域等のFcRn結合ドメインとヒトFcRnの結合活性の測定は、FcRn結合ドメインまたはFcRn結合ドメインを含む本発明の抗原結合分子あるいはヒトFcRnを固定化したチップへ、それぞれヒトFcRnあるいはFcRn結合ドメインまたはFcRn結合ドメインを含む本発明の抗原結合分子をアナライトとして流すことによって評価され得る。
性域とは、好ましくはpH7.0~pH8.0の任意のpH値によって示される範囲であり、好ましくはpH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、および8.0から選択され、特
に好ましくはインビボの血漿中(血中)のpHに近いpH7.4である。pH7.4でのヒトFcRn結合ドメインとヒトFcRnとの結合アフィニティーが低いためにその結合アフィニティーを評価することが難しい場合には、pH7.4の代わりにpH7.0を用いることができる。本発明において、ヒトFcRn結合ドメインまたはヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子とFcRnとの結合活性を有する条件としてのpH酸性域とは、通常pH4.0~pH6.5を意味する。好ましくはpH5.5~pH6.5を意味し、特に好ましくは、インビボの早期エンドソーム内のpHに近いpH5.8
~pH6.0を意味する。測定条件に使用される温度として、ヒトFcRn結合ドメインまたはヒ
トFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子とヒトFcRnとの結合アフィニティーは、10℃~50℃の任意の温度で評価してもよい。好ましくは、ヒトFcRn結合ドメインまたはヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子とヒトFcRnとの結合アフィニティーを決定するために、15℃~40℃の温度が使用される。より好ましくは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、および35℃のいずれか1つのような20℃から35℃までの任意の
温度も同様に、ヒトFcRn結合ドメインまたはヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子とヒトFcRnとの結合アフィニティーを決定するために使用される。25℃という温度は本発明の態様の非限定な一例である。
のヒトFcRn結合活性はpH酸性域(pH6.0)でKD 1.7μMであるが、pH中性域では活性をほ
とんど検出できていない。よって、好ましい態様においては、pH酸性域におけるヒトFcRn結合活性がKD 20μMまたはそれより強く、pH中性域におけるヒトFcRn結合活性が天然型
ヒトIgGと同等かそれより強い抗原結合分子を含む、pH酸性域およびpH中性域においてヒ
トFcRn結合活性を有する本発明の抗原結合分子がスクリーニングされ得る。より好ましい態様においては、pH酸性域におけるヒトFcRn結合活性がKD 2.0μMまたはそれより強く、pH中性域におけるヒトFcRn結合活性がKD 40μMまたはそれより強い抗原結合分子がスク
リーニングされ得る。さらにより好ましい態様においては、pH酸性域におけるヒトFcRn結合活性がKD 0.5μMまたはそれより強く、pH中性域におけるヒトFcRn結合活性がKD 15μMまたはそれより強い抗原結合分子がスクリーニングされ得る。上記のKD値は、The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671に記載された方法(抗原結合分子をチップに固定し、アナライトとしてヒトFcRnを流す)によって決定される。
合には、抗原結合分子中のアミノ酸を改変することによって所望のヒトFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインが取得され得るが、ヒトFcRn結合ドメイン中のアミノ酸を改変することによってpH酸性域および/またはpH中性域における所望のヒトFcRnに対する
結合活性を有するFcRn結合ドメインも好適に取得され得る。また、あらかじめpH酸性域および/またはpH中性域においてヒトFcRn結合活性を有しているFcRn結合ドメイン中のアミ
ノ酸の改変によって、所望のヒトFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインも取得され得る。そのような所望の結合活性をもたらすヒトFcRn結合ドメインのアミノ酸改変は、アミノ酸改変前と改変後のpH酸性域および/またはpH中性域におけるヒトFcRn結合活性
を比較することによって見出され得る。公知の手法を用いて当業者は適宜アミノ酸の改変を実施することができる。
結合することができる限り(ゆえに、出発FcRn結合ドメインはpH酸性域および/または中
性域の条件下におけるヒトFcRnに対する結合活性を必ずしも必要とするわけではない)いずれのFcRn結合ドメインも出発ドメインとして使用され得る。出発FcRn結合ドメインの例としては、IgG抗体の定常領域、すなわち配列番号:14から17のいずれかで表される
天然型の定常領域が好適に挙げられる。また、既に改変が加えられたFcRn結合ドメインを出発FcRn結合ドメインとしてさらなる改変が加えられた改変FcRn結合ドメインも本発明の改変FcRn結合ドメインとして好適に使用され得る。出発FcRn結合ドメインとは、ポリペプチドそのもの、出発FcRn結合ドメインを含む組成物、または出発FcRn結合ドメインをコードするアミノ酸配列を意味し得る。出発FcRn結合ドメインには、抗体の項で概説された組換えによって産生された公知のIgG抗体のFcRn結合ドメインが含まれ得る。出発FcRn結合
ドメインの起源は、限定されないが非ヒト動物の任意の生物またはヒトから取得され得る。好ましくは、任意の生物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類から選択される生物が好適に挙げられる。別の態様において、出発FcRn結合ドメインはまた、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー、またはヒトから取得され得る。好ましくは、出発Fc領域は、ヒトIgG1から取得され得るが、IgGの特定のクラスに
限定されるものでもない。このことは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域を出発Fc領域として適宜用いることができることを意味する。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4 Fc領域としては、遺伝子多形による複数のアロタイプ配列がSequences of
proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。特にヒトIgG1の配列としては、EUナンバリング356-358番目のアミノ酸配列がDELであってもEEMであってもよい
。同様に、本明細書において、前記の任意の生物からのIgGの任意のクラスまたはサブク
ラスのFcRn結合ドメインを、好ましくは出発FcRn結合ドメインとして用いることができることを意味する。天然に存在するIgGのバリアントまたは操作された型の例は、公知の文
献(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91、Curr. Opin. Immunol.
(2008) 20 (4), 460-470、Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202、WO2009086320、WO2008092117、WO2007041635、およびWO2006105338)に記載されるが
それらに限定されない。
いられる場合には、例えば、EUナンバリングで表される221位~225位、227位、228位、230位、232位、233~241位、243~252位、254~260位、262~272位、274位、276位、278~289位、291~312位、315~320位、324位、325位、327~339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375~378位、380位、382位、385~387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426~438位、440位および442位の位置のアミノ酸が天然型IgGの定常
領域の相当するアミノ酸とは異なる改変された定常領域が挙げられる。より具体的には、例えばEUナンバリングで表される256位のアミノ酸がPro、280位のアミノ酸がLys、339位
のアミノ酸がThr、385位のアミノ酸がHis、428位のアミノ酸がLeu、および/または434位
のアミノ酸がTrp、Tyr、Phe、AlaもしくはHisのいずれかである定常領域の改変体が挙げ
られる。これらの改変体を使用することで、IgG型免疫グロブリンのFc領域のpH中性域に
おけるヒトFcRnに対する結合活性を強くすることが可能である。
することができる改変体も適宜使用され得る。これらの改変体のうち、pH中性域においてもヒトFcRnに対する結合を強くすることが出来る改変体が適宜選択され、本発明に使用することが可能である。そのような例として、定常領域におけるEUナンバリングで表されるアミノ酸が天然型IgGの定常領域の相当するアミノ酸とは異なる改変された定常領域が挙
げられる。そのようなアミノ酸の改変例として表1に挙げられるアミノ酸を含む定常領域
の改変体が好適に使用され得る。
、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、325位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387
位、389位、424位、428位、433位、434位および436位で表されるアミノ酸を天然型IgGの
定常領域の相当するアミノ酸と異なるアミノ酸へ置換する改変が挙げられる。これらのアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に改変することによって、FcRn結合ドメインのpH中性域におけるヒトFcRnに対する結合活性を高めることができる。
る;
237位のアミノ酸がMet、
238位のアミノ酸がAla、
239位のアミノ酸がLys、
248位のアミノ酸がIle、
250位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
252位のアミノ酸がPhe、Trp、またはTyrのいずれか、
254位のアミノ酸がThr、
255位のアミノ酸がGlu、
256位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGlnのいずれか、
257位のアミノ酸がAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはValのいずれか、
258位のアミノ酸がHis、
265位のアミノ酸がAla、
270位のアミノ酸がPhe、
286位のアミノ酸がAlaまたはGluのいずれか、
289位のアミノ酸がHis、
297位のアミノ酸がAla、
298位のアミノ酸がGly、
303位のアミノ酸がAla、
305位のアミノ酸がAla、
307位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
308位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThrのいずれか、
309位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Pro、またはArgのいずれか、
311位のアミノ酸がAla、His、またはIleのいずれか、
312位のアミノ酸がAlaまたはHisのいずれか、
314位のアミノ酸がLysまたはArgのいずれか、
315位のアミノ酸がAlaまたはHisのいずれか、
317位のアミノ酸がAla、
325位のアミノ酸がGly、
332位のアミノ酸がVal、
334位のアミノ酸がLeu、
360位のアミノ酸がHis、
376位のアミノ酸がAla、
380位のアミノ酸がAla、
382位のアミノ酸がAla、
384位のアミノ酸がAla、
385位のアミノ酸がAspまたはHisのいずれか、
386位のアミノ酸がPro、
387位のアミノ酸がGlu、
389位のアミノ酸がAlaまたはSerのいずれか、
424位のアミノ酸がAla、
428位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr
、Val、Trp、またはTyrのいずれか、
433位のアミノ酸がLys、
434位のアミノ酸がAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyrのいずれか、および
436位のアミノ酸がHis
である改変が好適に挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、1箇
所のみのアミノ酸を改変してもよいし、2箇所以上のアミノ酸を改変してもよい。2箇所以上のアミノ酸の改変の組合せとしては、例えば表2に記載されるような組合せが挙げられ
る。
類似性を有する。好ましい実施形態において、変種は出発Fc領域のアミノ酸配列と約75%~100%未満のアミノ酸配列同一性または類似性、より好ましくは約80%~100%未満、より好ましくは約85%~100%未満の、より好ましくは約90%~100%未満、最も好ましくは約95%~100%未満の同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。本発明の非限定の一
態様において、出発Fc領域および本発明の改変されたFc領域の間には少なくとも1つのアミノ酸の差がある。出発Fc領域と改変Fc領域のアミノ酸の違いは、特に前述のEUナンバリングで特定されるアミノ酸残基の位置の特定されたアミノ酸の違いによっても好適に特定可能である。
Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))やOverlap extension PCR等の公知の
方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法も採用され得る(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン(アンバーコドン)の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム(Clover Direct(Protein Express))等も好適に用いられる。
本発明は特定の理論により拘束されるものではないが、例えば、pH酸性域における抗原に対する結合活性がpH中性域の条件における抗原に対する結合活性よりも低いように、イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインおよび付加的にpH中性域の条件下でヒトFcRnに対する結合活性を有する抗体定常領域等のFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子が生体に投与されたときに生体中の細胞への取込みが促進されることによって、1分子の抗原結合分子が結合可能な抗原の数が増加する理由、および、血
漿中抗原濃度の消失が促進される理由はたとえば以下のように説明することが可能である。
抗原に結合した場合、1分子の抗体が2分子の抗原に結合した状態でインターナライズされ、そのままライソソームで分解される。従って、通常の抗体の場合、1分子のIgG抗体が3
分子以上の抗原に結合することは出来ない。例えば、中和活性を有する1分子のIgG抗体の場合、3分子以上の抗原を中和することはできない。
内に発現しているヒトFcRnに結合する。ヒトFcRnに結合できなかったIgG分子はその後移
行するライソソーム内で分解される。一方、ヒトFcRnに結合したIgG分子は細胞表面へ移
行する。血漿中の中性条件下においてIgG分子はヒトFcRnから解離するため、当該IgG分子は再び血漿中にリサイクルされる。
できない。
してpH中性域の条件下で結合し、pH酸性域の条件下で解離する抗体)や抗原に対して血漿中の高カルシウムイオン濃度の条件下においては強く結合し、エンドソーム内の低カルシウムイオン濃度の条件下において抗原から解離するカルシウムイオン濃度依存的に抗原に対して結合する抗体(抗原に対して高カルシウムイオン濃度の条件下で結合し、低カルシウムイオン濃度の条件下で解離する抗体)はエンドソーム内で抗原から解離することが可能である。pH依存的に抗原に対して結合する抗体やカルシウムイオン濃度依存的に抗原に対して結合する抗体は、抗原を解離した後にFcRnによって血漿中にリサイクルされると、再び抗原に結合することが可能である。そのため一分子の抗体が複数の抗原分子に繰り返し結合することが可能となる。また、抗原結合分子に結合した抗原はエンドソーム内で抗体から解離することによって血漿中にリサイクルされずライソソーム内で分解される。こうした抗原結合分子を生体に投与することによって、抗原の細胞内への取込みが促進され、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。
がさらに促進される。すなわち、こうした抗原結合分子の生体への投与によって抗原の消失が促進され、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。pH依存的な抗原に対する結合能、またはカルシウムイオン濃度依存的な抗原に対する結合能を有しない通常の抗体およびその抗体-抗原複合体は、非特異的なエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ、エンドソーム内の酸性条件下でFcRnに結合することで細胞表面に輸送され、細胞表面の中性条件下でFcRnから解離することによって血漿中にリサイクルされる。そのため、十分にpH依存的に抗原に対して結合する(pH中性域の条件下で結合し、pH酸性域の条件下で解離する)、または十分にカルシウムイオン濃度依存的に抗原に対して結合する(高カルシウムイオン濃度の条件下で結合し、低カルシウムイオン濃度の条件下で解離する)抗体が血漿中で抗原に結合し、エンドソーム内において結合している抗原を解離する場合、抗原の消失速度は非特異的なエンドサイトーシスによる抗体およびその抗体-抗原複合体の細胞への取込み速度と等しくなると考えられる。抗体と抗原間の結合のpH依存性またはカルシウムイオン濃度依存性が不十分な場合は、エンドソーム内において抗体から解離しない抗原も抗体とともに血漿中にリサイクルされてしまうが、pH依存性が十分な場合は、抗原の消失速度は非特異的なエンドサイトーシスによる細胞への取込み速度が律速となる。また、FcRnは抗体をエンドソーム内から細胞表面に輸送するため、FcRnの一部は細胞表面にも存在していると考えられる。
する結合活性をほとんど有しない。本発明者らは、pH中性域においてFcRnに対する結合活性を有するIgG型免疫グロブリンは、細胞表面に存在するFcRnに結合することが可能であ
り、細胞表面に存在するFcRnに結合することによって当該IgG型免疫グロブリンがFcRn依
存的に細胞に取り込まれると考えた。FcRnを介した細胞への取り込み速度は、非特異的なエンドサイトーシスによる細胞への取り込み速度よりも早い。そのため、pH中性域においてFcRnに対する結合能を付与することによって、抗原結合分子による抗原の消失速度をさらに速めることが可能であると考えられる。すなわち、pH中性域においてFcRnに対する結合能を有する抗原結合分子は、通常の(天然型ヒト)IgG型免疫グロブリンよりも速やか
に抗原を細胞内に送り込み、エンドソーム内で抗原を解離し、再び細胞表面ないしは血漿中にリサイクルされ、そこで再び抗原に結合し、またFcRnを介して細胞内に取り込まれる
。pH中性域においてFcRnに対する結合能を高くすることによって、このサイクルの回転速度を速くすることが可能となるため、血漿中から抗原を消失させる速度が速くなる。更に抗原結合分子のpH酸性域における抗原に対する結合活性をpH中性域における抗原に対する結合活性より低下させることによって、更に血漿中から抗原を消失させる速度を高めることが可能である。またこのサイクルの回転速度を早くする結果生じるそのサイクルの数の増大によって、1分子の抗原結合分子が結合可能な抗原の分子数も多くなると考えられる
。本発明の抗原結合分子は、抗原結合ドメインとFcRn結合ドメインからなり、FcRn結合ドメインは抗原に対する結合に影響を与えることはないため、また、上述のメカニズムから考えても、抗原の種類に依存することがなく、抗原結合分子のpH酸性域または低カルシウムイオン濃度の条件等のイオン濃度の条件における抗原に対する結合活性(結合能)をpH中性域または高カルシウムイオン濃度の条件等のイオン濃度の条件における抗原に対する結合活性(結合能)より低下させ、および/または、血漿中でのpHにおけるFcRnへの結合
活性を増大させることによって、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させ、抗原の消失速度を速くすることが可能であると考えられる。よって本発明の抗原結合分子は、抗原がもたらす副作用の低減、抗体の投与量の上昇、抗体の生体内の動態の改善、といった点で従来の治療用抗体よりも優れた効果を発揮すると考えられる。
またはベンジルアルコールも併用され得る。また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩酸プロカイン)、安定剤(例えば、ベンジルアルコール及びフェノール)、酸化防止剤と配合され得る。調製された注射液は通常、適切なアンプルに充填される。
筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与され得る。
に設定され得る。または、例えば、患者あたり0.001~100000 mgの投与量が設定され得
るが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
よく知られた修飾である)を受ける場合もあるが、そのようにアミノ酸が翻訳後修飾された場合であっても当然のことながら本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれる。
り表される態様、ならびに「・・・からなる(consisting of)」との表現により表される態様を包含する。
(1-1)pH依存的結合抗体の取得方法
WO2009125825は抗原結合分子にヒスチジンを導入することにより、pH中性領域とpH酸性領域で性質が変化するpH依存的抗原結合抗体を開示している。開示されたpH依存的結合抗体は、所望の抗原結合分子のアミノ酸配列の一部をヒスチジンに置換する改変によって取得されている。改変する対象の抗原結合分子を予め得ることなく、pH依存的結合抗体をより効率的に取得するために、ヒスチジンを可変領域(より好ましくは抗原結合に関与する可能性がある位置)に導入した抗原結合分子の集団(Hisライブラリと呼ぶ)から所望の
抗原に結合する抗原結合分子を取得する方法が考えられる。Hisライブラリから得られる
抗原結合分子は通常の抗体ライブラリよりもヒスチジンが高頻度に出現するため、所望の性質を有する抗原結合分子が効率的に取得できると考えられる。
まず、Hisライブラリでヒスチジンを導入する位置が選択された。WO2009125825ではIL-6レセプター抗体、IL-6抗体およびIL-31レセプター抗体の配列中のアミノ酸残基をヒスチジンに置換することでpH依存的抗原結合抗体を作製したことが開示されている。さらに、抗原結合分子のアミノ酸配列をヒスチジンに置換することによって、pH依存的抗原結合能を有する、抗卵白リゾチウム抗体(FEBS Letter 11483, 309, 1, 85-88)および抗
ヘプシジン抗体(WO2009139822)が作製されている。IL-6レセプター抗体、IL-6抗体、IL-31レセプター抗体、卵白リゾチウム抗体およびヘプシジン抗体でヒスチジンを導入した
位置が表3に示される。表3に示す位置は、抗原と抗体との結合を制御できる位置の候補として挙げられ得る。さらに表3で示された位置以外でも、抗原と接触する可能性が高い位
置も、ヒスチジンを導入する位置として適切であると考えられた。
ト抗体配列が使用され、軽鎖可変領域にヒスチジンが導入された。Hisライブラリでヒス
チジンを導入する位置として、上記で挙げられた位置と、抗原結合に関与する可能性がある位置、すなわち軽鎖の30位、32位、50位、53位、91位、92位および93位(Kabatナンバ
リング、Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)が選択された。またヒスチジンを導入する軽鎖可変領域のテンプレート配列として、Vk1配列が選択された。テンプレート配列に複数のアミノ酸を出現させてライ
ブラリを構成する抗原結合分子の多様性が拡げられた。複数のアミノ酸を出現させる位置は、抗原と相互作用する可能性が高い可変領域の表面に露出する位置が選択された。具体的には、軽鎖の30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位および96位(Kabatナンバリング、Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)が、こうしたフレキシブル残基として選択された。
アミノ酸の性質が偏らないように解析結果では出現頻度が少ないと判定されたアミノ酸も選択された。また、選択されたアミノ酸の出現頻度は、Kabatデータベースの解析結果を
参考にして設定された。
ラリとして、ヒスチジンが各CDRで1つ必ず入るように固定されているHisライブラリ1とHisライブラリ1よりも配列の多様性が重視されたHisライブラリ2が設計された。Hisライブ
ラリ1およびHisライブラリ2の詳細なデザインは表4および表5に示されている(各表中の
位置はKabatナンバリングを表す)。また、表4および5で記載されるアミノ酸の出現頻度
は、Kabatナンバリングで表される92位がAsn(N)の場合は94位はSer(S)を除外するこ
とができる。
レイライブラリ(Hisライブラリ1)の作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型としてPCR法により抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリが増幅された。実施例1に記載のHisラ
イブラリ1として設計された抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリが、PCR法を用いて増
幅された。このように作製された抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリと抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリとの組合せがファージミドベクターへ挿入され、ヒト抗体配列からなるFabドメインを提示するヒト抗体ファージディスプレイライブラリが構築された。構
築方法として、(Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100)が参考とされた。上記
ライブラリの構築に際しては、ファージミドのFabとファージpIIIタンパク質をつなぐリ
ンカー部分、および、ヘルパーファージpIIIタンパク遺伝子のN2ドメインとCTドメインの間にトリプシン切断配列が挿入されたファージディスプレイライブラリの配列が使用された。抗体遺伝子ライブラリが導入された大腸菌から単離された抗体遺伝子部分の配列が確認され、132クローンの配列情報が得られた。設計されたアミノ酸分布と、確認された配
列中のアミノ酸の分布が、図1に示されている。設計されたアミノ酸分布に対応する多様
な配列を含むライブラリが構築された。
(3-1)ビーズパンニングによるライブラリからのpH依存的に抗原に結合する抗体断片の取得
構築されたHisライブラリ1からの最初の選抜は、抗原(IL-6R)への結合能をもつ抗体
断片のみの濃縮によって実施された。
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られた。ファージライブラリ液にBSAおよびCaCl2を添加することによって終濃度4%
BSA、1.2mMカルシウムイオンとなるよう調製された。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAで
ブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2、0.1%
Tween20を含むTBS)にて3回洗浄された後、1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)にて
さらに2回洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによっ
て、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレ
ートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージライブラリ液が調製された。
濃縮が行われた。具体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSA
でブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて複数回洗浄された。その後抗原結合能を指標として濃縮する場合は、1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビ
ーズが分離され、ファージ溶液が回収された。pH依存的抗原結合能を指標に濃縮する場合は、0.1mLの50mM MES/1.2mM CaCl2/150mM NaCl(pH5.5)が加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、回収されたファージ溶液に、100mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIII
タンパク質(ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質)が切断され、Fabを提示しないフ
ァージの大腸菌に対する感染能を失わせた。回収されたファージが、対数増殖期(OD600
が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mmx 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からフ
ァージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。抗原結合能もしくはpH依存的結合能を指標とするパンニングが2回繰り返された。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習い、ファージ含有培養上清が回収された。
たファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウエルをPBST(0.1%Tween20を含むPBS)にて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが4% BSA-TBS 250μLにて1時間以上ブロッキングされた。4% BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37
℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗原に
結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)もしくは1.2 mM CaCl2/TBS(pH5.5)が加えられ、当該プレートは37℃で30分間静
置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に4% BSAおよびイオン化カルシウム濃度1.2 mMとしたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が各ウエルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウエル中の
溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色
が測定された。
指標に濃縮した場合、パンニングを2回実施したものについてファージELISAを実施したところ、ELISA陽性となったものは94クローン中70クローンであったため、パンニングを2回実施したものが解析された。
れた遺伝子の塩基配列が解析された。
イブラリ1のほうが得られるpH依存的抗原結合能をもつクローンのバリエーションが多いことが確認された。
ファージELISAの結果、pH依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが
、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法
によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用
いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出
された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
(3-3)で取得された抗体6RpH#01(重鎖配列番号:18、軽鎖配列番号:19)、
および、6RpH#02(重鎖配列番号:20)、軽鎖配列番号:21)、および、6RpH#03(重鎖配列番号:22)、軽鎖配列番号:23)のヒトIL-6レセプターに対する結合活性がpH依存的であるかどうかを判断するため、これらの抗体とヒトIL-6レセプターとの相互作用がBiacore T100(GE Healthcare)を用いて解析された。ヒトIL-6レセプターに対するpH依存性の結合活性を有しない対照抗体として、トシリズマブ(重鎖配列番号:24)、
軽鎖配列番号:25)が用いられた。中性域pHおよび酸性域pHの条件として、それぞれpH7.4およびpH6.0の溶液中で抗原抗体反応の相互作用が解析された。アミンカップリング法でprotein A/G(Invitrogen)が適当量固定化されたSensor chip CM5(GE Healthcare)上に、目的の抗体がそれぞれ300RU程度キャプチャーされた。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)ま
たは20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2mM CaCl2(pH6.0)の2種類の緩衝液が用いられた。ヒトIL-6レセプターの希釈にもそれぞれのバッファーが使用された。測定は全て37℃で実施された。
を用いた抗原抗体反応の相互作用の解析に際して、IL-6レセプターの希釈液とブランクであるランニングバッファーを流速5μL/minで3分間インジェクトすることによって、セン
サーチップ上にキャプチャーさせたトシリズマブ抗体、6RpH#01抗体および6RpH#02抗体および6RpH#03抗体にIL-6レセプターを相互作用させた。その後、10 mM Glycine-HCl(pH1.5)を流速30μL/minで30秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。
また同様の方法で取得されたpH6.0の条件下でのセンサーグラムが、図3に示されている
。
をpH7.4からpH6.0にすることで、IL6レセプターに対する結合能が大幅に低減することが
観察された。
レイライブラリ(Hisライブラリ2)の作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型としてPCR法により抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリが増幅された。実施例1に記載される
ように、pH依存的抗原結合能をもつ抗体の出現頻度を向上させるため、抗体可変領域の軽鎖部分のうち、抗原接触部位となる可能性の高い部位のヒスチジン残基の出現頻度を高めた抗体可変領域軽鎖部分が設計される。また、フレキシブル残基のうちヒスチジンが導入
された残基以外のアミノ酸残基として、天然ヒト抗体でのアミノ酸出現頻度の情報から特定される出現頻度の高いアミノ酸が均等に分布させた抗体軽鎖可変領域のライブラリが設計される。上記のように設計された抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリが、合成される。ライブラリの合成は商業的な受託会社等に委託して作製することも可能である。このように作製された抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリと抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリとの組合せがファージミドベクターへ挿入され、公知の方法(Methods Mol Biol.
(2002) 178, 87-100)に準じて、ヒト抗体配列からなるFabドメインを提示するヒト
抗体ファージディスプレイライブラリが構築される。実施例2に記載された方法に準じて
、抗体遺伝子ライブラリが導入された大腸菌から単離された抗体遺伝子部分の配列が確認される。
(5-1)ビーズパンニングによるライブラリからのpH依存的に抗原に結合する抗体断片の取得
構築されたHisライブラリ2からの最初の選抜は、抗原(IL-6レセプター)への結合能をもつ抗体断片のみの濃縮によって実施される。
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られる。次に、ファージライブラリ液にブロッキング剤としてBSAもしくはスキム
ミルクが添加される。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照される(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用
いられる。
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させる。ブロッキング剤でブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させる。ビーズは1 mLのTBSTにて3回洗浄された後、1 mL
のTBSにてさらに2回洗浄される。その後、1 mg/mLのトリプシン0.5 mLが加えられたビ
ーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収される。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加される。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を
行うことによって、ファージを大腸菌に感染させる。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種される。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収
することによって、ファージライブラリ液が調製される。
濃縮が行われる。具体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させる。BSA
もしくはスキムミルクでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させる。ビーズは1 mLのTBSTとTBSにて洗浄される。その後、抗原結合能を指標として濃縮する場合は1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えら
れたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収される。pH依存的抗原結合能を指標に濃縮する場合は0.1 mLの50 mM MES/1.2 mM CaCl2/150 mM NaCl(pH5.5)が加えられたビーズは室温で懸濁された
後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収される。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示し
ないファージのpIIIタンパク質(ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質)が切断され、Fabを提示しないファージの大腸菌に対する感染能を失わせる。回収されたファージが、
対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加される。37℃で1
時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させる。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種される。次に、播種された
大腸菌の培養液からファージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。抗原結合能もしくはpH依存的結合能を指標とするパンニングが複数回繰り返される。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習い、ファージ含有培養上清が回収される。
れた。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされる。当該プレートの各ウエルをPBSTにて洗浄することによ
って抗原が除かれた後、当該ウエルが4% BSA-TBS 250μLにて1時間以上ブロッキングされる。4%BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗原に結合させる。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)もしくは1.2 mM CaCl2/TBS(pH5.5)が加えられ、当該プレートは37℃で30分間静
置しインキュベートされる。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に4% BSAおよびイオン化カルシウム濃度1.2 mMとしたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が各ウエルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせる。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウエル中の
溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色
が測定される。
断片を鋳型として特異的なプライマーによって増幅された遺伝子の塩基配列解析が行われる。
ファージELISAの結果、pH依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが
、動物細胞発現用プラスミドへ導入される。抗体の発現は以下の方法を用いて行われる。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ蒔きこまれる。調製されたプラスミドは、リポフェクション法
によって細胞へ導入される。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われる。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用
いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製される。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定される。PACE法により算出
された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出される(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
実施例5で取得された抗体のヒトIL-6レセプターに対する結合活性がpH依存的であるかどうかを判断するため、これらの抗体とヒトIL-6レセプターとの相互作用解析がBiacore
T100(GE Healthcare)を用いて行われる。ヒトIL-6レセプターに対するpH依存性の結
合活性を有しない対照抗体として、トリシズマブ(重鎖配列番号:24、軽鎖配列番号:25)が用いられる。中性域pHおよび酸性域pHの条件として、それぞれpH7.4およびpH6.0の溶液中で抗原抗体反応の相互作用解析が行われる。アミンカップリング法でprotein A/G(Invitrogen)が適当量固定化されたSensor chip CM5(GE Healthcare)上に、目的の抗体がキャプチャーされる。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v) Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)または20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2mM CaCl2(pH6.0)の2種類の緩衝液が用いられる。ヒトIL-6レセプターの希釈にもそれぞれのバッファーが使用される。測定は全て37℃で実施さ
れる。
秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生される。pH6.0の条件下での
センサーグラムも、同様の方法で取得する。
(6-1)カルシウム依存的に抗原に結合する抗体
カルシウム依存的に抗原に結合する抗体(カルシウム依存的抗原結合抗体)はカルシウムの濃度によって抗原との相互作用が変化する抗体である。カルシウム依存的抗原結合抗体は、カルシウムイオンを介して抗原に結合すると考えられるため、抗原側のエピトープを形成するアミノ酸は、カルシウムイオンをキレートすることが可能な負電荷のアミノ酸あるいは水素結合アクセプターとなりうるアミノ酸である(図4B)。こうしたエピトープを形成するアミノ酸の性質から、図4Aに示されるヒスチジンを導入することにより作製されるpH依存的に抗原に結合する結合分子以外のエピトープをターゲットすることが可能となる。さらに、図4Cに示されるように、カルシウム依存的およびpH依存的に抗原に結合する性質を併せ持つ抗原結合分子を用いることで、幅広い性質を有する多様なエピトープを個々にターゲットすることが可能な抗原結合分子を作製することが可能となると考えられる。そこで、カルシウムが結合するモチーフを含む分子の集合(Caライブラリ)を構築し、この分子の集団から抗原結合分子を取得すれば、カルシウム依存的抗原結合抗体が効率的に得られると考えられる。
カルシウムが結合するモチーフを含む分子の集合の例として、当該分子が抗体である例が考えられる。言い換えればカルシウムが結合するモチーフを含む抗体ライブラリがCaライブラリである場合が考えられる。
れた。クローニングされたDNA断片は動物細胞発現ベクターに挿入された。得られた発現
ベクターの塩基配列が、当業者公知の方法で決定され、アミノ酸配列の配列番号が表7に
示されている。配列番号:6(Vk1)、配列番号:7(Vk2)、配列番号:8(Vk3)、配
列番号:9(Vk4)ならびに配列番号:1(Vk5)をコードするポリヌクレオチドが、PCR
法によって天然型Kappa鎖の定常領域(配列番号:26)をコードするポリヌクレオチド
と連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。また、配列番号:2
7(Vk1)、配列番号:28(Vk2)、配列番号:29(Vk3)ならびに配列番号:30(Vk4)をコードする重鎖可変領域ポリヌクレオチドが、PCR法によって配列番号:14のC末
端の2アミノ酸が欠失したIgG1をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、
動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体の配列は当業者公知の方法で確認された。なお、ヒトのVk1はhVk1、ヒトのVk2はhVk2、ヒトのVk3はhVk3、ヒトのVk4はhVk4と記載することがある。
取得された5種類のヒト生殖細胞系列配列を含むDNA断片が挿入された動物細胞発現ベクターが動物細胞へ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ
導入される。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知
の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数
を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
精製された抗体のカルシウムイオン結合活性が評価された。抗体へのカルシウムイオンの結合の評価の指標として、示差走査型熱量測定(DSC)による熱変性中間温度(Tm値)
が測定された(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。熱変性中間温度(Tm値)は
安定性の指標であり、カルシウムイオンの結合によってタンパク質が安定化すると、熱変性中間温度(Tm値)はカルシウムイオンが結合していない場合に比べて高くなる(J. Biol.Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149)。抗体溶液中のカルシウムイオン濃度の変化に応じた抗体のTm値の変化を評価することによって、抗体へのカルシウムイオンの結合活性が評価された。精製された抗体が20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2
(pH7.4)または20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl, 3μM CaCl2(pH7.4)の溶液を外
液とする透析(EasySEP、TOMY)処理に供された。透析に用いられた溶液を用いておよそ0.1 mg/mLに調製された抗体溶液を被験物質として、20℃から115℃まで240℃/hrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづいて算出された各抗体のFabド
メインの熱変性中間温度(Tm値)が表8に示されている。
実施例6の(6-2)においてVk5-2(配列番号:1に配列番号:26が融合されたも
の)のほかにVk5-2に分類されるVk5-2バリアント1(配列番号:2)およびVk5-2バリア
ント2(配列番号:3)が得られた。これらのバリアントについてもカルシウム結合評価が行われた。Vk5-2、Vk5-2バリアント1およびVk5-2バリアント2のDNA断片がそれぞれ動物細胞用発現ベクターに組み込まれた。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定された。Vk5-2、Vk5-2バリアント1およびVk5-2バリアント2のDNA断片がそれぞれ組み込まれた動物細胞用発現ベクターは、重鎖としてCIM_H(配列番号:4)が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例6の(6-3)で記載した方法
で共に動物細胞中に導入され、抗体が精製された。精製された抗体のカルシウムイオン結合活性が評価された。精製された抗体が20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.5)または20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl(pH7.5)の溶液(表9ではカルシウ
ムイオン濃度0mMと表記)を外液とする透析(EasySEP、TOMY)処理に供された。透析に用いられた溶液を用いておよそ0.1 mg/mLに調製された抗体溶液を被験物質として、20℃から115℃まで240℃/hrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづ
いて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度(Tm値)が表9に示されている。
て変動したことから、Vk5-2に分類される配列を持つ抗体はカルシウムイオンと結合する
ことが示された。
(7-1)hVk5配列
Kabatデータベース中には、hVk5配列としてhVk5-2配列のみが登録されている。以下で
は、hVk5とhVk5-2は同義で扱われる。WO2010136598では、hVk5-2配列の生殖細胞系列配列中の存在比は0.4%と記載されている。他の報告でもhVk5-2配列の生殖細胞系列配列中の存在比は0~0.06%と述べられている(J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86、Proc. Natl. Acad. Sci. (2009) 106, 48, 20216-20221)。上記のように、hVk5-2配列は、生殖細胞系列配列中で出現頻度が低い配列であるため、ヒト生殖細胞系列配列で構成される抗体ライブラリやヒト抗体を発現するマウスへの免疫によって取得されたB細胞から、
カルシウムと結合する抗体を取得することは非効率であると考えられた。そこで、ヒトhVk5-2配列を含むCaライブラリを設計する可能性が考えられるが、報告されている合成抗体ライブラリ(WO2010105256やWO2010136598)ではhVk5配列は含まれていなかった。さらに、hVk5-2配列の物性は報告されておらず、その実現の可能性は未知であった。
hVk5-2配列は20位(Kabatナンバリング)のアミノ酸にN型糖鎖が付加する配列を有する。タンパク質に付加する糖鎖にはヘテロジェニティーが存在するため、物質の均一性の観点から糖鎖は付加されないほうが望ましい。そこで、20位(Kabatナンバリング)のAsn(N)残基がThr(T)残基に置換された改変体hVk5-2_L65(配列番号:5)が作製された。アミノ酸の置換はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用い
る当業者公知の方法で行われた。改変体hVk5-2_L65をコードするDNAが動物発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体hVk5-2_L65のDNAが組み込まれた動物発現用ベクターは、重鎖としてCIM_H(配列番号:4)が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例6で記載した方法で共に動物細胞中に導入された。導入された動物細胞
中で発現したhVk5-2_L65 およびCIM_Hを含む抗体が、実施例6で記載した方法で精製された。
取得された改変配列hVk5-2_L65を含む抗体が、改変に供されたもとのhVk5-2配列を含
む抗体よりも、そのヘテロジェニティーが減少しているか否かが、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析された。イオン交換クロマトグラフィーの方法は表10に示されている。分析の結果、図5に示されるように糖鎖付加部位が改変されたhVk5-2_L65は、元のhVk5-2配列よりもヘテロジェニティーが減少していることが示された。
と結合するか否かが、実施例6に記載された方法を用いて評価された。その結果、表11に
示されるように、糖鎖付加部位が改変されたhVk5-2_L65を含む抗体のFabドメインのTm値も、抗体溶液中のカルシウムイオンの濃度の変化によって変動した。すなわち、糖鎖付加部位が改変されたhVk5-2_L65を含む抗体のFabドメインにカルシウムイオンが結合するこ
とが示された。
(8-1)hVk5-2配列のCDR配列を含む改変抗体の作製、発現および精製
hVk5-2_L65配列はヒトVk5-2配列のフレームワークに存在する糖鎖付加部位のアミノ酸が改変された配列である。実施例7で糖鎖付加部位を改変してもカルシウムイオンが結合
することが示されたが、フレームワーク配列は生殖細胞系列の配列であることが免疫原性の観点から一般的には望ましい。そこで、抗体のフレームワーク配列を、当該抗体に対するカルシウムイオンの結合活性を維持しながら、糖鎖が付加されない生殖細胞系列配列のフレームワーク配列に置換することが可能であるか否かが検討された。
法によって天然型Kappa鎖の定常領域(配列番号:26)をコードするポリヌクレオチド
と連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体の
配列は当業者公知の方法で確認された。上記のように作製された各プラスミドは、CIM_H(配列番号:4)をコードするポリヌクレオチドが組み込まれたプラスミドと共に実施例6で記載された方法で動物細胞に導入された。上記のように導入された動物細胞の培養液
から、発現した所望の抗体分子が精製された。
hVk5-2配列以外の生殖細胞系列配列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)のフレームワーク配列およびhVK5-2配列のCDR配列を含む改変抗体に、カルシウムイオンが結合するか否かが実
施例6に記載された方法によって評価された。評価された結果が表12に示される。各改変
抗体のFabドメインのTm値は、抗体溶液中のカルシウムイオン濃度の変化によって変動す
ることが示された。よって、hVk5-2配列のフレームワーク配列以外のフレームワーク配列を含む抗体もカルシウムイオンと結合することが示された。
定性の指標である熱変性温度(Tm値)は、改変に供されたもとのhVk5-2配列を含む抗体のFabドメインのTm値よりも増加することが明らかになった。この結果から、hVk1、hVk2、hVk3、hVk4のフレームワーク配列およびhVk5-2配列のCDR配列を含む抗体はカルシウムイオンと結合する性質を有する上に、熱安定性の観点でも優れた分子であることが見出された。
(9-1)hVk5-2配列のCDR配列中の変異部位の設計
実施例8に記載されているように、hVk5-2配列のCDR部分が他の生殖細胞系列のフレームワーク配列に導入された軽鎖を含む抗体もカルシウムイオンと結合することが示された。この結果からhVk5-2に存在するカルシウムイオン結合部位はCDRの中に存在することが示
唆された。カルシウムイオンと結合する、すなわち、カルシウムイオンをキレートするアミノ酸として、負電荷のアミノ酸もしくは水素結合のアクセプターとなりうるアミノ酸が挙げられる。そこで、hVk5-2配列のCDR配列中に存在するAsp(D)残基またはGlu(E)残
基がAla(A)残基に置換された変異hVk5-2配列を含む抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが評価された。
hVk5-2配列のCDR配列中に存在するAspおよび/ またはGlu残基がAla残基に改変された
軽鎖を含む抗体分子が作製された。実施例7で記載されるように、糖鎖が付加されない改
変体hVk5-2_L65はカルシウムイオン結合を維持していたことから、カルシウムイオン結
合性という観点ではhVk5-2配列と同等と考えられる。本実施例ではhVk5-2_L65をテンプ
レート配列としてアミノ酸置換が行われた。作製された改変体は表13に示されている。アミノ酸の置換はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCRまたはIn fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA)等の当業者公知の方法によって行われ、アミノ酸が置換された改変軽鎖の発現ベクターが構築された。
入することによって、抗体を発現させた。得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GEヘルスケア)を用いて当業者公知の方法で、抗体が精製された。精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が、分光光度計を用いて測定された。PACE法によ
り算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが実施例6に記載された方法に
よって判定された。その結果が表14に示されている。hVk5-2配列のCDR配列中に存在するAspまたはGlu残基をカルシウムイオンの結合もしくはキレートに関与できないAla残基に置換することによって、抗体溶液のカルシウムイオン濃度の変化によってそのFabドメイン
のTm値が変動しない抗体が存在した。Ala置換によってTm値が変動しない置換部位(32位
および92位(Kabatナンバリング))はカルシウムイオンと抗体の結合に特に重要である
ことが示された。
(10-1)カルシウムイオン結合モチーフを有するhVk1配列の作製ならびに抗体の発現および精製
実施例9で記載されたAla置換体のカルシウムの結合活性の結果から、hVk5-2配列のCDR
配列の中でAspやGlu残基がカルシウム結合に重要であることが示された。そこで、30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリング)の残基のみを他の生殖細胞系列の可
変領域配列に導入してもカルシウムイオンと結合できるか否かが評価された。具体的には、ヒト生殖細胞系配列であるhVk1配列の30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナン
バリング)の残基がhVk5-2配列の30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリン
グ)の残基に置換された改変体LfVk1_Ca(配列番号:43)が作製された。すなわち、hVk5-2配列中のこれらの5残基のみが導入されたhVk1配列を含む抗体がカルシウムと結合できるか否かが判定された。改変体の作製は実施例9と同様に行われた。得られた軽鎖改変
体LfVk1_Caおよび軽鎖hVk1配列を含むLfVk1(配列番号:44)を、重鎖CIM_H(配列番号:4)と共に発現させた。抗体の発現および精製は実施例9と同様の方法で実施された
。
上記のように得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが実施例6に記載
された方法で判定された。その結果を表15に示す。hVk1配列を有するLfVk1を含む抗体のFabドメインのTm値は抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によっては変動しない一方で、LfVk1_Caを含む抗体配列の、Tm値は、抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によって1℃以上変化したことから、LfVk1_Caを含む抗体がカルシウムと結合することが示された。
上記の結果から、カルシウムイオンの結合には、hVk5-2のCDR配列がすべて必要ではなく
、LfVk1_Ca配列を構築する際に導入された残基のみでも十分であることが示された。
実施例10の(10-1)でヒト生殖細胞系配列であるhVk1配列の30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリング)の残基がhVk5-2配列の30位、31位、32位、50位およ
び92位(Kabatナンバリング)の残基に置換された改変体LfVk1_Ca(配列番号:43)が作製され、カルシウムイオンが結合することが示された。そこで、LfVk1_Ca配列を含むCaライブラリを設計する可能性が考えられるが、LfVk1_Ca配列の物性は報告されておらず、その実現可能性は未知であった。LfVk1_Ca配列は、30位、31位および32位(Kabatナンバリング)にAspが存在し、酸性条件下で分解することが報告されているAsp-Asp配列がCDR1配列中に存在する(J. Pharm. Biomed. Anal. (2008) 47(1), 23-30)。保存安
定性の観点から、酸性条件での分解は避けることが望ましい。そこで、分解する可能性があるAsp(D)残基がAla(A)残基に置換された改変体LfVk1_Ca1(配列番号:45)、LfVk1_Ca2(配列番号:46)およびLfVk1_Ca3(配列番号:47)が作製された。アミノ酸の置換はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いる当業
者公知の方法で行われた。改変体をコードするDNAが動物発現用ベクターに組み込まれた
。作製された改変体のDNAが組み込まれた動物発現用ベクターは、重鎖としてGC_H(配列番号:48)が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例6で記載し
た方法で共に動物細胞中に導入された。導入された動物細胞中で発現した抗体が、実施例6で記載した方法で精製された。
実施例10の(10-3)で取得された抗体が、改変に供されたもとのLfVk1_Ca配列を
含む抗体よりも、pH6.0溶液中での分解が抑制されているか否かが熱加速後の各抗体のヘ
テロジェニティーの比較によって評価された。各抗体が20 mM Histidine-HCl、150 mM
NaCl、pH6.0の溶液に一晩4℃の条件で透析された。透析された抗体は0.5mg/mLに調製され、5℃または50℃で3日間保存された。保存後の各抗体を実施例7に記載された方法でイ
オン交換クロマトグラフィーが行われた。分析の結果、図6に示されるように分解部位が
改変されたLfVk1_Ca1は、元のLfVk1_Ca配列よりもヘテロジェニティーが少なく、熱加
速による分解が著しく抑制されていることが示された。すなわち、LfVk1_Ca配列中の30
位に存在するAsp(D)残基が分解することが示され、アミノ酸改変によって回避できることが示された。
精製
実施例10の(10-4)で記載されたAla置換体の分解抑制の結果から、LfVk1_Ca配列のCDR配列の中で30位(Kabatナンバリング)のAsp(D)残基が酸性条件で分解し、30位(Kabatナンバリング)を他のアミノ酸((10-4)では、Ala(A)残基に置換された)
に置換することで分解が抑制できることが示された。そこで、30位(Kabatナンバリング
)の残基をカルシウムイオンがキレートできる残基の代表であるSer(S)残基に置換した配列(LfVk1_Ca6とよぶ。配列番号:49)としても、分解が抑制されるか否かが評価された。改変体の作製は実施例10と同様に行われた。得られた軽鎖改変体LfVk1_Ca6および軽鎖LfVk1_Ca配列を、重鎖GC_H(配列番号:48)と共に発現させた。抗体の発現および精製は実施例10と同様の方法で実施された。
上記のように得られた精製抗体の酸性条件下における保存安定性が実施例10の(10-4)に記載された方法で判定された。その結果、図7に示すように、LfVk1_Ca6配列を含
む抗体は、元のLfVk1_Ca配列を含む抗体よりも分解が抑制されていることが示された。
ンと結合するか否かが実施例6に記載された方法で判定された。その結果を表16に示す。LfVk1_Ca配列を含む抗体および分解抑制型であるLfVk1_Ca6配列を含む抗体のFabドメイ
ンのTm値は、それぞれ抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によって1℃以上変化した。
カルシウム結合モチーフとして、例えばhVk5-2配列やそのCDR配列、さらに残基が絞ら
れた30位、31位、32位、50位、92位(Kabatナンバリング)が好適に挙げられる。他にも
、カルシウムと結合するタンパク質が有するEFハンドモチーフ(カルモジュリンなど)やCタイプレクチン(ASGPRなど)もカルシウム結合モチーフに該当する。
うしたフレキシブル残基として選択された。
考にして設定された。
。また、表17および18で記載されるアミノ酸の出現頻度は、Kabatナンバリングで表され
る92位がAsn(N)の場合、94位はSer(S)ではなくLeu(L)とすることができる。
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型としてPCR法により抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリが増幅された。抗体軽鎖可変領域部分
については、実施例11に記載されるように、カルシウム結合モチーフを維持しカルシウム濃度依存的に抗原に対して結合可能な抗体の出現頻度を高めた抗体可変領域軽鎖部分が設計された。また、フレキシブル残基のうちカルシウム結合モチーフが導入された残基以外のアミノ酸残基として、天然ヒト抗体でのアミノ酸出現頻度の情報((KABAT, E.A. ET
AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION)が参考にされ、天然ヒト抗体の配列中で出現頻度の高いアミノ酸
を均等に分布させた抗体軽鎖可変領域のライブラリが設計された。このように作製された抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリと抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリとの組合せがファージミドベクターへ挿入され、ヒト抗体配列からなるFabドメインを提示するヒト
抗体ファージディスプレイライブラリ(Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100)
が構築された。
離された抗体遺伝子部分についての配列が確認された。得られた290種類のクローンの配
列のアミノ酸分布と、設計したアミノ酸分布が、図8に示されている。
(13-1)Caライブラリに含まれる分子のカルシウムイオン結合活性
実施例7に示されているように、カルシウムイオンと結合することが示されたhVk5-2配
列は生殖細胞系列配列中で出現頻度が低い配列であるため、ヒト生殖細胞系列配列で構成
される抗体ライブラリやヒト抗体を発現するマウスへの免疫によって取得されたB細胞か
ら、カルシウムと結合する抗体を取得することは非効率であると考えられた。そこで、実施例12でCaライブラリが構築された。構築されたCaライブラリにカルシウム結合を示すクローンが存在するか評価された。
Caライブラリに含まれるクローンが、動物細胞発現用プラスミドへ導入される。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製された
プラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養
上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光
度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
上記のように得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが実施例6に記載された方法で判定された。その結果を表19に示す。Caライブラリに含まれる複数の抗体のFabドメインのTmはカルシウムイオン濃度によって変動し、カルシウムイオンと結合する
分子が含まれることが示された。
(14-1)ビーズパンニングによるライブラリからのCa依存的に抗原に結合する抗体断片の取得
構築されたCaライブラリからの最初の選抜は、抗原(IL-6レセプター)への結合能をもつ抗体断片のみの濃縮によって実施された。
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られた。次に、ファージライブラリ液にBSA、およびCaCl2を添加することによって
終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンとなるよう調製された。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001)
247 (1-2),191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAで
ブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2を含むTBST)にて3回洗浄された後、1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS(1.2 mM CaCl2を含むTBS)に
てさらに2回洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによ
って、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプ
レートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージライブラリ液が調製された。
が行われた。
との複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTにて3回、1.2 mM CaCl2/TBSにて2回洗浄された。その後、1 mg/mLのトリプシン0.5
mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタンパク質(ヘルパ
ーファージ由来のpIIIタンパク質)が切断され、Fabを提示しないファージの大腸菌に対
する感染能を失わせた。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養
を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収
することによってファージライブラリ液が回収された。
体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2
mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その後、0.1 mLの2 mM EDTA/TBS(2 mMのEDTAを含むTBS)が加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズ
が分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタンパク質(ヘルパ
ーファージ由来のpIIIタンパク質)が切断され、Fabを提示しないファージの大腸菌に対
する感染能を失わせた。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養
を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収
することによってファージライブラリ液が回収された。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習い、ファージ含有培養上清が回収された。
れた。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウエルをPBSTにて洗浄することによ
って抗原が除かれた後、当該ウエルが4% BSA-TBS 250μLにて1時間以上ブロッキングされた。4% BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレート
を37℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗
原に結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBS
もしくは1 mM EDTA/TBSが加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベー
トされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に、イオン化カルシウム濃度1.2 mMとしたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が各ウ
エルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗
浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
れた遺伝子の塩基配列解析が行われた。ファージELISA、配列解析の結果を以下の表20に
示した。
ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが
、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクション法に
よって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用い
て当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出さ
れた吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995)4, 2411-2423)。
実施例14で取得された抗体6RC1IgG_010(重鎖配列番号:72、軽鎖配列番号:73)、および、6RC1IgG_012(重鎖配列番号:74、軽鎖配列番号:75)、および、6RC1IgG_019(重鎖配列番号:76、軽鎖配列番号:77)のヒトIL-6レセプターに対する結合活性がCa依存的であるかどうかを判断するため、これらの抗体とヒトIL-6レセプターとの相互作用解析がBiacore T100(GE Healthcare)を用いて行われた。ヒトIL-6レセプ
ターに対するCa依存性の結合活性を有しない対照抗体として、トリシズマブ(重鎖配列番号:24、軽鎖配列番号:25)が用いられた。高カルシウムイオン濃度および低カルシウムイオン濃度の条件として、それぞれ1.2 mMおよび3μMのカルシウムイオン濃度の溶
液中で相互作用解析が行われた。アミンカップリング法でprotein A/G(Invitrogen)が適当量固定化されたSensor chip CM5(GE Healthcare)上に、目的の抗体がキャプチ
ャーされた。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mMCaCl2(pH7.4)または20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、3μM CaCl2(pH7.4)の2種類の緩衝液が用いられた。ヒトIL-6レセプターの希釈にもそれぞれのバッファーが使用された。測定は全て37℃で実施された。
よって、センサーチップ上にキャプチャーさせたトシリズマブ抗体、6RC1IgG_010抗体および6RC1IgG_012抗体および6RC1IgG_019抗体にIL-6レセプターを相互作用させた。その後、10 mM Glycine-HCl(pH1.5)を流速30μL/minで30秒間インジェクトすることによ
って、センサーチップが再生された。
示されている。
(15-1)ナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリの作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として当業者に公知な方法にしたがい、互いに異なるヒト抗体配列のFabドメインを提示する複
数のファージからなるヒト抗体ファージディスプレイライブラリが構築された。
構築されたナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリからの最初の選抜は、抗原(IL-6レセプター)への結合能をもつ抗体断片のみの濃縮、または、Ca濃度依存的な抗原(IL-6レセプター)への結合能を指標とした抗体断片の濃縮によって実施された。Ca濃度依存的な抗原(IL-6レセプター)への結合能を指標として抗体断片の濃縮は、CaイオンをキレートするEDTAを用いてCaイオン存在下でIL-6レセプターと結合させたファージライブラリからファージを溶出することによって実施された。抗原としてビオチン標識された
IL-6レセプターが用いられた。
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られた。次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSAおよび1.2mMカルシウムイオ
ン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が添加された。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された(J. Immunol.
Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAで
ブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS(1.2 mM CaCl2を含むTBS)にて1回洗浄された。その後、IL-6レセプターへの結合能をもつ抗体断片を濃縮する
場合には、一般的な方法による溶出によって、Ca濃度依存的なIL-6レセプターへの結合能を指標として抗体断片を濃縮する場合には、2 mM EDTA/TBS(2mMEDTAを含むTBS)に懸
濁されたビーズからの溶出によって、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株TG1に添加された。37℃
で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染さ
せた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種
された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージライブラリ液が調製された。
体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされ
た磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その後0.1mLの2 mM EDTA/TBSが加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株TG1に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸
菌の培養液からファージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。Ca依存的結合能を指標とするパンニングが複数回繰り返された。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習い、ファージ含有培養上清が回収された。
られたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウエルをPBSTにて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが1時間以上250μLの4%BSA-TBSにてブロッキングされた。4%BSA-TBSが除かれ
た各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37℃で1時間静置すること
によって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗原に結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBSもしくは1 mM EDTA/TBSが加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に、終濃度4%のBSAおよび1.2 mMのイオン化カルシウム濃度としたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が各ウエルに
添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加によ
り停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
断片を鋳型として特異的なプライマーによって増幅された遺伝子の塩基配列解析が行われた。
ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが
、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法
によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われる。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用
いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出
された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
実施例15で取得された抗体6RL#9-IgG1(重鎖(配列番号:78、配列番号:10にIgG1由来定常領域が連結された配列)、軽鎖配列番号:79)、および、FH4-IgG1(重鎖配列番号:80、軽鎖配列番号:81)のヒトIL-6レセプターに対する結合活性がCa依存的であるかどうかを判断するため、これらの抗体とヒトIL-6レセプターとの抗原抗体反応の速度論的解析がBiacore T100(GE Healthcare)を用いて行われた。ヒトIL-6レセプター
に対するCa依存性の結合活性を有しない対照抗体として、WO2009125825に記載されているH54/L28-IgG1(重鎖配列番号:82、軽鎖配列番号:83)が用いられた。高カルシウムイオン濃度および低カルシウムイオン濃度の条件として、それぞれ2 mMおよび3μMのカ
ルシウムイオン濃度の溶液中で抗原抗体反応の速度論的解析が行われた。アミンカップリング法でprotein A(Invitrogen)が適当量固定化されたSensor chip CM4(GE Healthcare)上に、目的の抗体がキャプチャーされた。ランニングバッファーには10 mM ACES、150 mMNaCl、0.05% (w/v) Tween20、2 mM CaCl2(pH7.4)または10 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、3μmol/L CaCl2(pH7.4)の2種類の緩衝液が
用いられた。ヒトIL-6レセプターの希釈にもそれぞれのバッファーが使用された。測定は全て37℃で実施された。
セプターの解離が観察された後、10 mM Glycine-HCl(pH1.5)を流速30μL/minで30秒
間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。測定で得られたセンサ
ーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka(1/Ms)、および解離速度定数 kd(1/s)が算出された。これらの値を用いてH54/L28-IgG1抗体のヒトIL-6
レセプターに対する解離定数KD(M)が算出された。各パラメーターの算出にはBiacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)が用いられた。
(pH1.5)を流速30μL/minで30秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。測定で得られたセンサーグラムからsteady state affinity modelを使って解離定数KD(M)が算出された。各パラメーターの算出には Biacore T100 Evaluation
Software(GE Healthcare)が用いられた。
法で算出することが可能である。Ca濃度が3μMの条件下では、FH4-IgG1抗体および6RL#9-IgG1抗体は、IL-6レセプターに対する結合はほとんど観察されなかったため、上記の方法によるKDの算出は困難である。しかし、下記の式1(Biacore T100 Software Handbook, BR-1006-48, AE 01/2007)を用いることによって、Ca濃度が3μMの条件下でのこれらの抗体のKDを予測することが可能である。
[式1]
Req=C x Rmax/(KD+C)+RI
上記式1中の各項目の意味は下記;
Req(RU): 定常状態結合レベル(Steady state binding levels)
Rmax(RU):アナライトの表面結合能(Analyte binding capacity of the surface
)
RI(RU): 試料中の容積屈折率寄与(Bulk refractive index contribution in the sample)
C(M): アナライト濃度(Analyte concentration)
KD(M): 平衡解離定数(Equilibrium dissociation constant)
で表される。
を2 mMから3μMに減少することで、IL-6レセプターに対するKDがそれぞれ約60倍、約120倍上昇(60倍、120倍以上アフィニティーが低減)すると予測された。
び3μM CaCl2存在下におけるKD値、および、KD値のCa依存性についてまとめた。
次に、抗体へのカルシウムイオンの結合の評価の指標として、示差走査型熱量測定(DSC)による熱変性中間温度(Tm値)が測定された(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。熱変性中間温度(Tm値)は安定性の指標であり、カルシウムイオンの結合によってタンパク質が安定化すると、熱変性中間温度(Tm値)はカルシウムイオンが結合していない場合に比べて高くなる(J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149)。抗体溶液中のカルシウムイオン濃度の変化に応じた抗体のTm値の変化を評価することによって、抗体へのカルシウムイオンの結合活性が評価された。精製された抗体が20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.4)または20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl, 3μM CaCl2(pH7.4)の溶液を外液とする透析(EasySEP、TOMY)処理に供された。透析
に用いられた溶液を用いておよそ0.1 mg/mLに調製された抗体溶液を被験物質として、20℃から115℃まで240℃/hrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にも
とづいて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度(Tm値)が表24に示されてい
る。
さないH54/L28-IgG1抗体のFabのTm値はカルシウムイオンの濃度の変化により変動しない
ことが示された。FH4-IgG1抗体および6RL#9-IgG1抗体のFabのTm値の変動は、これらの抗
体にカルシウムイオンが結合し、Fab部分が安定化したことを示している。上記の結果よ
り、FH4-IgG1抗体および6RL#9-IgG1抗体にはカルシウムイオンが結合し、一方でH54/L28-IgG1抗体にはカルシウムイオンが結合していないことが示された。
(18-1)X線結晶構造解析
実施例17に示されたように、6RL#9抗体はカルシウムイオンと結合することが熱変性温
度Tm値の測定から示唆された。しかし、6RL#9抗体のどの部位がカルシウムイオンと結合
しているか予想できなかったため、X線結晶構造解析の手法を用いることによって、カル
シウムイオンが相互作用する6RL#9抗体の配列中の残基が特定された。
X線結晶構造解析に用いるために発現させた6RL#9抗体が精製された。具体的には、6RL#9抗体の重鎖(配列番号:78)と軽鎖(配列番号:79)をそれぞれ発現させることが
出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。最終細胞密度1 x 106細胞/mLとなるようにFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)へ懸濁された800 mLのヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)に
、リポフェクション法により調製されたプラスミドが導入された。プラスミドが導入された細胞はCO2インキュベーター(37℃、8%CO2、90 rpm)中で5日間培養された。rProtein
A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いた当業者公知の方法に
したがって、上記のように得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係
数を用いて測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
分子量分画サイズ10000MWCOの限外ろ過膜 を用いて6RL#9抗体が21 mg/mLまで濃縮さ
れた。L-Cystein 4 mM、EDTA 5 mM、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.5)を用いて5 mg/mLによって希釈された2.5 mLの当該抗体の試料が調製された。0.125 mgのPapain(RocheApplied Science)を加えて攪拌された当該試料が35℃にて2時間静置された。静置後、プロテアーゼインヒビターカクテルミニ、EDTAフリー(Roche Applied Science)1錠を溶かした10 mLの25 mM MES 緩衝液(pH6)をさらに当該試料に加え、氷中に静置することによって、Papainによるプロテアーゼ反応が停止された。次に、当該試料が、下流に1 mLサイズのProteinA担体カラムHiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)がタンデムにつながれた25 mM MES 緩衝液pH6で平衡化された1 mLサイズの陽イオ
ン交換カラムHiTrap SP HP(GE Healthcare)に添加された。同緩衝液中NaCl濃度を300 mMまで直線的に上げて溶出をおこなうことで6RL#9抗体のFabフラグメントの精製画分
が得られた。次に、得られた精製画分が5000MWCOの限外ろ過膜 により0.8 mL程度まで
濃縮された。50 mM NaCl を含む100 mM HEPES緩衝液(pH 8)で平衡化されたゲル
ろ過カラムSuperdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)に濃縮液が添加された。結晶
化用の精製6RL#9抗体のFabフラグメントが同緩衝液を用いてカラムから溶出された。なお、上記のすべてのカラム操作は6から7.5℃の低温下にて実施された。
予め一般的な条件設定で6RL#9 Fabフラグメントの種結晶が得られた。つぎに5 mM
となるようにCaCl2が加えられた精製6RL#9抗体のFabフラグメントが5000MWCOの限外ろ過
膜を用いて12 mg/mLに濃縮された。つぎに、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって、
前記のように濃縮された試料の結晶化が実施された。リザーバー溶液として20-29%のPEG4000を含む100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)が用いられた。カバーグラス上で0.8μlのリザーバー溶液および0.8μlの前記濃縮試料の混合液に対して、29% PEG4000および5 mM CaCl2を含む100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中で破砕された前記種結晶が100-10000倍に希釈された希釈系列の溶液0.2μlを加えることによって結晶化ドロップが調製された。当該結晶化ドロップを20℃に2日から3日静置することによって得られた薄い板状の結晶のX線
回折データが測定された。
精製6RL#9抗体のFabフラグメントが5000MWCOの限外ろ過膜 を用いて15 mg/mlに濃縮
された。つぎに、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって、前記のように濃縮された試料の結晶化が実施された。リザーバー溶液として18-25%のPEG4000を含む100 mM HEPES緩
衝液(pH7.5)が用いられた。カバーグラス上で0.8μlのリザーバー溶液および0.8μlの
前記濃縮試料の混合液に対して、25% PEG4000を含む100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中
で破砕されたCa存在下で得られた6RL#9抗体のFabフラグメントの結晶が100-10000倍に希
釈された希釈系列の溶液0.2μlを加えることによって結晶化ドロップが調製された。当該結晶化ドロップを20℃に2日から3日静置することによって得られた薄い板状の結晶のX線
回折データが測定された。
35% PEG4000および5 mM CaCl2を含む100mM HEPES緩衝液(pH7.5)の溶液に浸され
た6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下で得られた単結晶一つを、微小なナイロンループ付きのピンを用いて外液ごとすくいとることによって、当該単結晶が液体窒素中で凍結された。高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのビームラインBL-17Aを用いて、前記の凍結結晶のX線回折データが測定された。なお、測定中は常に-178℃の窒素気流中に凍結結晶を置くことで凍結状態が維持された。ビームラインに備え付
けられたCCDディテクタQuantum315r(ADSC)を用い、結晶を1°ずつ回転させながらトー
タル180枚の回折画像が収集された。格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折
データの処理がプログラムXia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)ならびにScala(CCP4 Software Suite)によって行われた。最終的に分解能2.2Åまでの回折強度データが得られた。本結晶は、空間群P212121に属し、格子定数a=45.47Å、b=79.86Å、c=116.25Å、α=90°、β=90°、γ=90°であった。
定
35% PEG4000を含む100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)の溶液に浸された6RL#9抗体のFab
フラグメントのCa非存在下で得られた単結晶一つを、微小なナイロンループ付きのピンを用いて外液ごとすくいとることによって、当該単結晶が液体窒素中で凍結された。高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのビームラインBL-5Aを用いて
、前記の凍結結晶のX線回折データが測定された。なお、測定中は常に-178℃の窒素気流
中に凍結結晶を置くことで凍結状態が維持された。ビームラインに備え付けられたCCDデ
ィテクタQuantum210r(ADSC)を用い、結晶を1°ずつ回転させながらトータル180枚の回
折画像が収集された。格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折データの処理がプログラムXia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)ならび
にScala(CCP4 Software Suite)によって行われた。最終的に分解能2.3Åまでの回折
強度データが得られた。本結晶は、空間群P212121に属し、格子定数a=45.40Å、b=79.63Å、c=116.07Å、α=90°、β=90°、γ=90°であり、Ca存在下の結晶と同型で
あった。
プログラムPhaser(CCP4 Software Suite)を用いた分子置換法によって、6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造が決定された。得られた結晶格子の大きさ
と6RL#9抗体のFabフラグメントの分子量から、非対称単位中の分子数が一個であると予想された。一次配列上の相同性をもとにPDB code: 1ZA6の構造座標から取り出されたA鎖112-220番およびB鎖116-218番のアミノ酸残基部分が、CLおよびCH1領域の探索用モデル分
子とされた。次にPDB code: 1ZA6の構造座標から取り出されたB鎖1-115番のアミノ酸残基部分が、VH領域の探索用モデル分子とされた。最後にPDB code 2A9Mの構造座標から
取り出された軽鎖3-147番のアミノ酸残基が、VL領域の探索用モデル分子とされた。この
順番にしたがい各探索用モデル分子の結晶格子内での向きと位置を回転関数および並進関数から決定することによって、6RL#9抗体のFabフラグメントの初期構造モデルが得られた。当該初期構造モデルに対してVH、VL、CH1、CLの各ドメインを動かす剛体精密化をおこ
なうことにより、25-3.0Åの反射データに対する結晶学的信頼度因子R値は46.9%、Free R値は48.6%となった。さらにプログラムRefmac5(CCP4 Software Suite)を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcおよび位相を用い計算された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップを参照しながらモデル修正
を繰り返しプログラムCoot(Paul Emsley)上でおこなうことによってモデルの精密化がおこなわれた。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとにCaイオンおよ
び水分子をモデルに組み込むことによって、プログラムRefmac5(CCP4 Software Suite)を用いて精密化がおこなわれた。分解能25-2.2Åの21020個の反射データを用いること
によって、最終的に3440原子のモデルに対する結晶学的信頼度因子R値は20.0%、Free R
値は27.9%となった。
6RL#9抗体のFabフラグメントのCa非存在下での結晶の構造は、同型であるCa存在下結晶の構造を使って決定された。6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造座標から水分子とCaイオン分子がのぞかれ、VH、VL、CH1、CLの各ドメインを動かす剛体精密
化がおこなわれた。25-3.0Åの反射データに対する結晶学的信頼度因子R値は30.3%、FreeR値は31.7%となった。さらにプログラムRefmac5(CCP4 Software Suite)を用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcおよび位相を用い計算された2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップを参照しながらモデル修正
を繰り返しプログラムCoot(Paul Emsley)上でおこなうことによってモデルの精密化がおこなわれた。最後に2Fo-Fc、Fo-Fcを係数とする電子密度マップをもとに水分子をモデ
ルに組み込むことによって、プログラムRefmac5(CCP4 Software Suite)を用いて精密化がおこなわれた。分解能25-2.3Åの18357個の反射データを用いることによって、最終
的に3351原子のモデルに対する結晶学的信頼度因子R値は20.9%、Free R値は27.7%となった。
データの比較
6RL#9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶およびCa非存在下での結晶の構造を比較すると、重鎖CDR3に大きな変化がみられた。X線結晶構造解析で決定された6RL#9抗体の
Fabフラグメントの重鎖CDR3の構造が図11で示されている。具体的には、Ca存在下での6RL#9抗体のFabフラグメントの結晶では、重鎖CDR3ループ部分の中心部分にカルシウムイオ
ンが存在していた。カルシウムイオンは、重鎖CDR3の95位、96位および100a位(Kabatナ
ンバリング)と相互作用していると考えられた。Ca存在下では、抗原との結合に重要である重鎖CDR3ループがカルシウムと結合することによって安定化し、抗原との結合に最適な構造となっていることが考えられた。抗体の重鎖CDR3にカルシウムが結合する例は今までに報告されておらず、抗体の重鎖CDR3にカルシウムが結合した構造は新規な構造である。
(19-1)ナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリの作製
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として当業者に公知な方法にしたがい、互いに異なるヒト抗体配列のFabドメインを提示する複
数のファージからなるヒト抗体ファージディスプレイライブラリが構築された。
構築されたナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリからの最初の選抜は、抗原(IL-6)への結合能をもつ抗体断片のみの濃縮によって実施された。抗原としてビオチン標識されたIL-6が用いられた。
によって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ
液が得られた。次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSAおよび1.2mMカルシウムイオ
ン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が添加された。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された(J. Immunol.
Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
ることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAで
ブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1.2 mM CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2を含むTBST)
にて3回洗浄された後、1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS(1.2 mM CaCl2を含むTBS)にてさ
らに2回洗浄された。その後、0.5 mLの1 mg/mLのトリプシンが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株TG1に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレ
ートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによっ
て、ファージライブラリ液が調製された。
体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされ
た磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その後0.1mLの2 mM EDTA/TBSが加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタン
パク質(ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質)が切断され、Fabを提示しないファー
ジの大腸菌に対する感染能を失わせた。トリプシン処理されたファージ溶液から回収されたファージが、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株TG1に添加され
た。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌
に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に
、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。Ca依存的結合能を指標とするパンニングが3回繰り返された。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習い、ファージ含有培養上清が回収された。
られたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウエルをPBSTにて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが1時間以上250μLの4%BSA-TBSにてブロッキングされた。4%BSA-TBSが除かれ
た各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37℃で1時間静置すること
によって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗原に結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBSもしくは1 mM EDTA/TBSが加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に、終濃度4%のBSAおよび1.2 mMのイオン化カルシウム濃度としたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が各ウエルに
添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加によ
り停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
依存的な結合能を有する6KC4-1#85抗体が得られた。上記のファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断される抗体断片を鋳型として特異的なプライマーによって増幅された遺伝子の塩基配列解析が行われた。6KC4-1#85抗体の重鎖可変領域の配
列は配列番号:11に、および、軽鎖可変領域の配列は配列番号:84に記載されている。6KC4-1#85抗体の重鎖可変領域(配列番号:11)をコードするポリヌクレオチドが、PCR法によってIgG1由来配列をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、動物
細胞発現用ベクターに組み込まれ、配列番号:85で表される重鎖を発現するベクターが構築された。6KC4-1#85抗体の軽鎖可変領域(配列番号:84)をコードするポリヌクレ
オチドが、PCR法によって天然型Kappa鎖の定常領域(配列番号:26)をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製さ
れた改変体の配列は当業者公知の方法で確認された。作製された改変体の配列は当業者公知の方法で確認された。
ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローン6KC4-1#85が、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクシ
ョン法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われる。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences
)を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法によ
り算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
ヒト抗体ライブラリから取得されたカルシウム依存的抗原結合抗体6KC4-1#85抗体がカ
ルシウムと結合するか評価された。イオン化カルシウム濃度が異なる条件で、測定されるTm値が変動するか否かが実施例6に記載された方法で評価された。
実施例20で示されるように、6KC4-1#85抗体はカルシウムイオンと結合することが示さ
れたが、6KC4-1#85はhVk5-2配列の検討から明らかになったカルシウム結合モチーフを持
たない。そこで、カルシウムイオンが6KC4-1#85抗体の重鎖に結合するのか、軽鎖に結合
するのかまたは両者に結合するのかを確認するために、カルシウムイオンと結合しない抗グリピカン3抗体(重鎖配列GC_H(配列番号:48)、軽鎖配列GC_L(配列番号:86
))の重鎖と軽鎖とそれぞれ交換した改変抗体に対するカルシウムイオンの結合が評価された。実施例6に示される方法に準じて測定された改変抗体のTm値が表26に示されている
。その結果、6KC4-1#85抗体の重鎖をもつ改変抗体のTm値がカルシウムイオンの濃度によ
って変化するため、6KC4-1#85抗体の重鎖でカルシウムと結合していると考えられた。
同定するために、6KC4-1#85抗体のCDRに存在するAsp(D)残基をカルシウムイオンの結合もしくはキレートに関与できないAla(A)残基に置換した改変重鎖(6_H1-11(配列番号:87)、6_H1-12(配列番号:88)、6_H1-13(配列番号:89)、6_H1-14(配列番号:90)、6_H1-15(配列番号:91))、または改変軽鎖(6_L1-5(配列番号:
92)および6_L1-6(配列番号:93))が作製された。改変抗体遺伝子を含む発現ベ
クターが導入された動物細胞の培養液から、改変抗体が実施例19に記載された方法にしたがって精製された。精製された改変抗体のカルシウム結合が、実施例6に記載された方法
にしたがって測定された。測定された結果が表27に示されている。表27に示されているように、6KC4-1#85抗体の重鎖CDR3の95位または101位(Kabatナンバリング)をAla残基に置換することによって6KC4-1#85抗体のカルシウム結合能が失われることから、この残基が
カルシウムとの結合に重要であると考えられる。6KC4-1#85抗体の改変抗体のカルシウム
結合性から明らかになった6KC4-1#85抗体の重鎖CDR3のループ付け根付近に存在するカル
シウム結合モチーフも、実施例11で記載されるようなCaライブラリのデザインの新たな要素となりうる。すなわち、実施例11では軽鎖可変領域にカルシウム結合モチーフが導入されたが、たとえば6KC4-1#85抗体の重鎖CDR3を含み、軽鎖を含むそれ以外のCDRにフレキシブル残基を含むライブラリが考えられる。
(22-1)MRA-hIgA、GC-hIgAおよびビオチンを付加したヒトIgA-Fcの調製
ヒトIgAとして、MRA-hIgA(重鎖配列番号97、軽鎖配列番号25)GC-hIgA(重鎖配列番号98、軽鎖配列番号99)およびビオチンを付加したヒトIgA-Fc(ビオチン標識hIgA-Fcともいう、hIgA_CH2-CH3-Avitag:配列番号100)が以下のように調製された。
ヒトIgAの組換え体であるMRA-hIgA(以下MRA-hIgA)は以下のように調製された。発現
させたH(WT)-IgA1(配列番号:97)とL(WT)(配列番号:25)とを含むhIgAが、当業
者公知の方法によってイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製された。
ヒトIgAの組換え体であるGC-hIgAは、以下のように調製された。GC-hIgA(重鎖配列番
号:98、軽鎖配列番号:99)をコードする遺伝子断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターは、FreeStyle293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用いて、EBNA1を発現する遺伝子と共に導入された。その後、遺伝子導入された細胞を37℃、CO2 8%で6日間培養して、GC-hIgAタンパク質を培養上清中に分
泌させた。
溶液で希釈された培養上清を負荷し、NaClの濃度勾配によりGC-hIgAが溶出された。その
後、Superdex200によるゲルろ過クロマトグラフィーにて会合体の除去と20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH6.0への置換を行い、精製GC-hIgAが得られた。
ビオチンを目的タンパク質(ヒトIgA-Fc)のC末端に付加するために、ヒトIgA-Fc領域
をコードする遺伝子断片の下流に、ビオチンリガーゼによってビオチンが付加される特異的な配列(Avitag配列)をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトIgAとAvitag配列が
連結されたタンパク質(hIgA_CH2-CH3-Avitag(配列番号:100))をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターが、FreeStyle293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用いて、遺伝子導入された。こ
のときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA)を発現する遺伝子を同時
に導入し、ビオチンを添加することでビオチン標識させた。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞を、37℃、CO2 8%で6日間培養し、目的のタンパク質を培養上清中に分泌させた。
上清が得られた。20 mM Tris-HCl, pH7.4で平衡化されたHiTrap Q HP (GE healthcare)に同溶液で希釈された培養上清を負荷し、NaClの濃度勾配により目的のヒトIgA-Fc
が溶出された。50 mM Tris-HCl, pH8.0で希釈されたHiTrap Q HP溶出液を、同溶液
で平衡化したSoftLink Avidin columnに負荷し、5 mM Biotin, 150 mM NaCl, 50
mM Tris-HCl, pH8.0で溶出させた。その後、Superdex200によるゲルろ過クロマトグ
ラフィーにて会合体の除去と20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH6.0への置換を行い
、精製ヒトIgA-Fcが得られた。
構築されたCa依存的に抗原に結合する抗体ライブラリ(Caライブラリ)からの最初の選抜は、抗原(ヒトIgA-Fc)への結合能を指標として実施された。
せたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。
次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンまたは3%SkimMilk、1.2 mMカルシウムイオンとなるようBSAまたはSkimMilk、およびCaCl2が添加され、ブ
ロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
チン標識IgA-Fc)を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAまたはSkimMilkでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原
とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM
CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20、を含むTBS)と1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS(1.2 mM CaCl2を含むTBS)にて洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが
加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離
され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌
の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からフ
ァージを回収することによって、ファージライブラリ液が調製された。
ファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加え
られ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その後、0.1 mLの2 mM
EDTA/TBS(2 mMのEDTAを含むTBS)が加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファ
ージのpIIIタンパク質(ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質)が切断され、Fabを提
示しないファージの大腸菌に対する感染能を失わせた。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間
緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸
菌の培養液からファージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。
2回目のパンニング終了後に得られた大腸菌から取得されたファージミドから抽出され
た抗体断片遺伝子が動物細胞発現用ベクターへ挿入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293
Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、2.63x105細胞/mLの細胞密度で96
ウエルプレートの各ウエルへ190uLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェ
クション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37度、8%CO2)中で4日間
培養が行われた。
ァーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)の緩衝液が用いられた。GC-hIgAの希釈にもそれぞれのバッファーが使用された。測定は全て25℃で実施された。
た抗体について、発現に用いた動物細胞発現用ベクターから、特異的なプライマーを用いて増幅された抗体遺伝子の塩基配列が解析された。
(22-2)で実施された3回目のパンニング後に得られた大腸菌のシングルコロニー
から、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習いファージの培養を
行い、ファージ含有培養上清が回収された。終濃度4%BSAおよび1.2 mMカルシウムイオ
ン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が加えられたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン
標識IgA-Fcを含む100μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウエルをPBSTに
て洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが1時間以上250μLの4%BSA-TBS
にてブロッキングされた。4%BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウ
エルに存在するIgA-Fcに結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBSもしくは1 mM EDTA/TBSが加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に、終濃度4%のBSA
および1.2 mMのイオン化カルシウム濃度としたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が各ウエルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された
各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によ
って当該発色が測定された。
されたクローンに対し、抗体断片遺伝子の塩基配列解析が行われた。
構築されたCa依存的に抗原に結合する抗体ライブラリ(Caライブラリ)からの最初の選抜は、抗原(ヒトIgA-Fc)への結合能を指標として実施された。
よって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液
が得られた。次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンまたは3%SkimMilk、1.2 mMカルシウムイオンとなるようBSAまたはSkimMilk、およびCaCl2が
添加され、ブロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パンニング方法として、1回目のパンニングでは一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパ
ンニング方法が参照された(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
チン標識IgA-Fc)を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。SkimMilkでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20を含むTBS)と1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS(1.2 mM
CaCl2を含むTBS)にて洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えられたビ
ーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を
行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収
することによって、ファージライブラリ液が調製された。
た。具体的には、ストレプトアビジンがコーティングされた10ウエルのプレート(Streptawell, Roche)に各ウエルあたり 5pmolのビオチン標識抗原が加えられ、室温で60分間抗原と接触させた後、TBST(0.1% Tween20を含むTBS)にて3回洗浄された抗原固相化プレ
ートが作製された。ここに、1.2mM Caを含むSkimMilkでブロッキングされたファージラ
イブラリを加え、室温で60分間抗原と接触させた。プレートは1.2 mM CaCl2/TBSTにて
、プレートウォッシャー(Skan WASHER, SKARON)により3回洗浄された。その後、さらに2Lの1.2 mM CaCl2/TBST に浸漬され、60分間緩やかに振とうされた。0.1 mLの2 mM
EDTA/TBS(2 mMのEDTAを含むTBS)が加えられたウエルは室温で懸濁された後、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタンパク質(ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質)が切断され、Fabを提示しないファージの大腸菌に対する感染能を失わせた。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、
ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ
播種された。
上記パンニング後に得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習いファージの培養を行い、ファージ含有培養上清が
回収された。(22-4)に記載の方法で、PhageELISAを実施し、Ca依存的抗原結合能があると判断されたクローンに対し塩基配列解析が行われ、動物細胞発現用ベクターに挿入され、抗体として発現、精製された。
(23-1)取得された抗ヒトIgA抗体の発現および精製
実施例22においてヒトIgAに対する結合能があると判断された抗体として取得された
抗体のうち、GA1-IgG1((22-3)で取得された、重鎖配列番号101、軽鎖配列番号102),GA2-IgG1((22-4)で取得された、重鎖配列番号103、軽鎖配列番号1
04)、GA3-IgG1((22-6)で取得された、重鎖配列番号105、軽鎖配列番号106)、GA4-IgG1((22-3)で取得された、重鎖配列番号107、軽鎖配列番号108)を以下の方法を用いて発現して、当該抗体の精製が行われた。FreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)が1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLず
つ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37度、8%CO2、90 rpm)中で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法を用
いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いるこ
とによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4,
2411-2423)。
Biacore T200(GE Healthcare)を用いて、(23-1)で取得された抗体(GA1-IgG1, GA2-IgG1, GA3-IgG1およびGA4-IgG1)のヒトIgAに対する結合活性(解離定数KD (M))が評価された。ランニングバッファーとして3μMもしくは1.2 mM CaCl2を含有する0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl(pH7.4およびpH5.8)、0.1μMもしくは10 mM CaCl2を含有する0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl、pH8.0を用いて当該結合活性が測定された。
れた組換え型プロテインA/G(Thermo Scientific)に、抗体を結合させた。アナライト
として適切な濃度のMRA-hIgA((22-1)に記載)をインジェクトし、センサーチップ上の抗体と相互作用させた。その後、10 mmol/L Glycine-HCl, pH1.5をインジェクト
し、センサーチップが再生された。測定は37℃で行われた。Biacore T200 Evaluation
Software(GE Healthcare)を用いた、測定結果のカーブフィッティングによる解析および平衡値解析により、解離定数KD (M)が算出された。その結果を表28に示した。ま
た、得られたセンサーグラムを図12に示した。GA2-IgG1、GA3-IgG1、GA4-IgG1はCa2+濃度が1.2 mMにおいてはヒトIgAに強く結合するが、Caイオン濃度が3μMにおいてはヒトIgAに弱く結合することが明らかに示された。
(24-1)ヒトグリピカン3の調製
抗原として用いる組換えヒトグリピカン3(以下GPC3)が以下のように調製された。ヒ
トグリピカン3の膜貫通領域を含まないアミノ酸配列に6残基のヒスチジンが連結した配列(配列番号:109)を発現するプラスミドが定常的に導入されているCHO細胞の培養上
清が回収された。得られた培養上清を、イオン交換クロマトグラフィー精製後、Hisタグ
を用いたアフィニティー精製およびゲルろ過クロマトグラフィー精製を行って、GPC3が得られた。EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Thermo SCIENTIFIC)を用いて当該GPC3に対してビオチンが標識されたビオチン標識GPC3が調製された。
構築されたCa依存的にGPC3に結合する抗体ライブラリからの最初の選抜は、抗原(GPC3)への結合能を指標に実施された。
よって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液
が得られた。次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンまたは3%SkimMilk、1.2 mMカルシウムイオンとなるようBSAまたはSkimMilk、およびCaCl2が
添加され、ブロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
チン標識GPC3)を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAまたはSkimMilkでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原と
ファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2を含むTBST)と1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS(1.2 mM CaCl2を含むTBS)にて洗浄された。その後、1mg/mLのトリプシン0.5mLが加えられたビーズは
室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うこ
とによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収するこ
とによって、ファージライブラリ液が調製された。
体的には、1回目のパンニングと同様にブロッキングを行い調製したファージライブラリ
液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSAまたはSkimMilkでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ
、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて洗浄された。その後、0.1 mLの2 mM EDTA/TBS(2 mMのEDTAを含むTBS)が加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタンパク質(ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質)が切断され、Fabを提示しないファージの大腸菌に対する感染能を失わせた。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに
上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養
液からファージを回収することによってファージライブラリ液が回収された。
上記の方法で実施された2回目および3回目のパンニング後に得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習いファー
ジの培養を行い、ファージ含有培養上清が回収された。
られたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウエルをPBST(0.1% Tween20を含むPBS)にて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが1時間以上250μLの4%BSA-TBSにてブロッキング
された。4%BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレート
を37℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在する抗
原に結合させた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBS
もしくは1 mM EDTA/TBSが加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベー
トされた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄された後に、終濃度4%のBSAおよび1.2 mMのイオン化カルシウム濃度としたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が各ウエルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。1.2 mM CaCl2/TBSTにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定
された。
断片を鋳型として特異的なプライマーによって増幅された遺伝子の塩基配列が解析された。
ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断された4抗体、CSCM-01_005(重鎖配列:110、軽鎖配列:111)、CSCM-01_009(重鎖配列:112
、軽鎖配列:113)、CSCM-01_015(重鎖配列:114、軽鎖配列:115)、およびCSCM-01_023(重鎖配列:116、軽鎖配列:117)ならびにコントロールとして抗ヒトGPC3抗体であるGC-IgG1(重鎖配列:118、軽鎖配列:119)がそれぞれ動物細胞
発現用プラスミドへ挿入された。抗体を以下の方法を用いて発現させた。FreeStyle 293
Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)が1.33 x 106個 /mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導
入された。CO2インキュベーター(37℃、8%CO2, 90 rpm)で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用
いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science 1995
; 4 : 2411-2423)。なお、GC-IgG1抗体については、GC-IgG1抗体を定常的に発現するCHO細胞培養上清から同様の方法で抗体を精製し、濃度が算出された 。
取得された抗体が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。該当プレートの各ウエルをACES buffer(10 mM ACES, 150 mM NaCl, 100 mM CaCl2,0.05% Tween20, pH7.4)にて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが2%BSA
を含むACES Buffer 250μLにて1時間以上ブロッキングされた。2%BSAを含むACES Bufferが除かれた各ウエルに、あらかじめ10μg/mLから4倍ずつ希釈を行った精製IgG各100μLが加えられた当該プレートを一時間静置することによって、IgGを各ウエルに存在する抗
原に結合させた。ACES Bufferにて洗浄された各ウエルに、「10 mM ACES,150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH7.4」、「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 3μM CaCl2, pH7.4」、「10 mM ACES, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH5.8」もしくは「10 mM
ACES, 150 mM NaCl, 3μM CaCl2, pH5.8」が加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。ACES Bufferにて洗浄された後に、2%BSAを含むACES
Bufferによって希釈されたHRP結合抗ヒトIgG抗体(BIOSOURCE)が各ウエルに添加され
たプレートを1時間インキュベートさせた。ACES Bufferにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。
度が同じであるのに対して、CSCM-01_005、CSCM-01_009、CSCM-01_015およびCSCM-01
_023は1.2 mMカルシウムイオン濃度(高カルシウムイオン濃度)における吸光度と比較して、3μMカルシウムイオン濃度(低カルシウムイオン濃度)における吸光度は、顕著に低い結果となった。この結果から、CSCM-01_005、CSCM-01_009、CSCM-01_015およびCSCM-01_023はカルシウムイオンの濃度によって抗原との結合が変化する性質を有することが示され、ヒトグリピカン3に対してもカルシウム依存的抗体が取得できることが示され
た。
(25-1)GC-mIgAおよびビオチンを付加したマウスIgA-Fcの調製
マウスIgAとして、GC-mIgA(重鎖配列番号120、軽鎖配列番号121)およびビオチンを付加したマウスIgA-Fc(ビオチン標識mIgA-Fcともいう、mIgA_CH2-CH3-Avitag:配
列番号122)が以下のように調製された。
マウスIgAの組換え体であるGC-mIgAは、以下のように調製された。GC-mIgA(重鎖配列
番号:120、軽鎖配列番号:121)をコードする遺伝子断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターは、FreeStyle293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用いて、EBNA1を発現する遺伝子と共に導入された。その後、遺伝子導入された細胞を37℃、CO2 8%で4日間培養して、GC-mIgAタンパク質を培養上清
中に分泌させた。
れたGC-mIgAを含むバッファーを20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH6.0へ置換して、精製GC-mIgAが得られた。
ビオチンを目的タンパク質(マウスIgA-Fc)のC末端に付加するために、マウスIgA-Fc
領域をコードする遺伝子断片の下流に、ビオチンリガーゼによってビオチンが付加される特異的な配列(Avitag配列)をコードする遺伝子断片が連結された。マウスIgAとAvitag
配列が連結されたタンパク質(mIgA_CH2-CH3-Avitag(配列番号:122))をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターが、FreeStyle293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用いて、遺伝子導入され
た。このときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA)を発現する遺伝子
を同時に導入し、ビオチンを添加することでビオチン標識させた。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞を、37℃、CO2 8%で6日間培養し、目的のタンパク質を培養上清中に分泌させた。
養上清が得られた。20 mM Tris-HCl, pH7.4で平衡化された後に同溶液で希釈された培養上清が負荷されたHiTrap Q HP (GE healthcare)から、NaClの濃度勾配により目的
のマウスIgA-Fcを溶出させた。次に、50 mM Tris-HCl, pH8.0で平衡化された後に、同溶液で希釈された前記HiTrap Q HP溶出液が負荷されたSoftLink Avidin columnから
、5 mM Biotin, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH8.0で目的のマウスIgA-Fcを溶出させた。その後、Superdex200を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって会合体
が除去されたマウスIgA-Fcを含むバッファーを20 mM His-HCl, 150 mM NaCl, pH6.
0へ置換して、精製マウスIgA-Fcが得られた。
体断片の取得
構築されたpH依存的に抗原に結合する抗体ライブラリ(Hisライブラリ1)からの最初
の選抜は、抗原(マウスIgA-Fc)への結合能を指標として実施された。
せたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。
次に、ファージライブラリ液に終濃度3%SkimMilk、となるようSkim Milkが添加され、ブロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
せた。1回目のパニングでは250pmol、2回目のパニングでは40 pmol、3回目のパニングでは10pmolのビオチン標識抗原が用いられた。Skim Milkでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBST(1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20を含むTBS, pH7.6)と1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS(1.2 mM CaCl2を含むTBS, pH7.6)にて洗浄された。その後、1 mg/mLのトリプシン0.5 mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即
座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸
菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。
次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージライブラリ液が調製された。パンニングは、合計3回繰り返された。
3回目のパンニング終了後に得られた大腸菌から取得されたファージミドから抽出され
た抗体断片遺伝子が、動物細胞発現用ベクターへ挿入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)がFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁され、2.63x105細胞/mLの細胞密度で96ウエルプレートの各ウエルへ190μLずつ播種された。調製されたプラスミドは、リポフ
ェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター(37℃、8%CO2)中で4日
間培養が行われた。
chip CM5(GE Healthcare)に対し培養上清中の抗体をキャプチャーさせた。ランニン
グバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)および20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM CaCl2(pH5.8)の2種の緩衝液が用いられ、中性域pHおよび酸性域pHの条件中での抗原抗体
反応の相互作用が解析された。GC-mIgAの希釈にもそれぞれのバッファーが使用され、流
速10μL/minで60秒間インジェクトすることによって、センサーチップ上にキャプチャー
された抗体と相互作用させた。その後、10 mM Glycine-HCl(pH1.5)を流速30μL/min
で30秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。測定は全て25℃で実施された。
鎖配列番号:127、軽鎖配列番号:128)が得られた。これらの抗体のpH7.4およびpH5.8におけるセンサーグラムを図14に示した。バッファー中のpHをpH7.4からpH5.8にすることで、マウスIgAに対する結合能が低減することが観察された。
用が変化する抗体が取得されたが、pH依存的に抗原に結合する抗体は、IL-6Rだけでなく
マウスIgAでも取得できることが明らかになった。
(26-1)ヒトHMGB1およびビオチンを付加したヒトHMGB1の調製
ヒトHMGB1(配列番号:129)、およびビオチンを付加したヒトHMGB1-Avi(ビオチン標識hHMGB1ともいう、hHMGB1-Avitag:配列番号130)が以下のように調製された。
ヒトHMGB1の組換え体であるhHMGB1は、以下のように調製された。hHMGB1(配列番号:
129)をコードする遺伝子断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターは、FreeStyle293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用
いて、EBNA1を発現する遺伝子と共に導入された。その後、遺伝子導入された細胞を37℃
、CO2 8%で培養して、hHMGB1タンパク質を培養上清中に分泌させた。PBSで平衡化された後に、得られた培養上清が負荷されたHiTrap SP Sepharose HP(GE Healthcare社)
をPBSで洗浄後、塩化ナトリウムの直線的濃度勾配によってカラムに吸着した蛋白質を溶
出させた。20 mM Histidine-HCl, pH5.0で平衡化された後に、同緩衝液で3倍に希釈された前記のhHMGB1を含む溶出画分が負荷された。同緩衝液で洗浄されたカラムから、カラムに吸着した蛋白質を塩化ナトリウムの直線的濃度勾配によって溶出させた。限外ろ過膜で濃縮されたhHMGB1を含む画分が、300 mM NaCl, 20 mMヒスチジン, pH6.0で平衡化されたSuperdex200カラム(GE Healthcare社)に負荷された。同緩衝液で分離すること
でhHMGB1精製画分が得られた。
ビオチンを目的タンパク質(ヒトHMGB1)のC末端に付加するために、ヒトHMGB1領域を
コードする遺伝子断片の下流に、ビオチンリガーゼによってビオチンが付加される特異的な配列(Avitag配列)をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトHMGB1とAvitag配列が
連結されたタンパク質(hHMGB1-Avitag(配列番号:130))をコードする遺伝子断片
が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターが、FreeStyle293 (Invitrogen)に293Fectin (Invitrogen)を用いて、遺伝子導入された。このときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA)を発現する遺伝子を同時に導入し、ビオチンを添加することでビオチン標識させた。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞を、37℃、CO2 8%で培養し、目的のタンパク質を培養上清中に分泌させた。
HP(GE Healthcare社)をPBSで洗浄後、塩化ナトリウムの直線的濃度勾配によってカ
ラムに吸着した蛋白質を溶出させた。TBSで平衡化されたSoftLink Soft Release Avidin Resinカラム(Promega社)に100 mM Tris-HCl, pH7.4で2倍に希釈されたHMGB1-Aviを含む画分が負荷された。TBSで洗浄されたカラムから、カラムに吸着した蛋白質を5 mM Biotinを含むTBS(pH8.0)で溶出させた。限外ろ過膜で濃縮されたHMGB1-Aviを含む画分が、300 mM NaCl, 20 mMヒスチジン, pH6.0で平衡化されたSuperdex200カラム(GE Healthcare社)に負荷された。同緩衝液で分離することでBiotin化されたHMGB1-Avi精製画分が得られた。
体断片の取得
構築されたpH依存的に抗原に結合する抗体ライブラリ(Hisライブラリ1)からの最初
の選抜は、抗原(ヒトHMGB1)への結合能を指標として実施された。
せたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。
次に、ファージライブラリ液に終濃度4%BSA、1.2 mMカルシウムイオンとなるようBSA、
およびCaCl2が添加され、ブロッキングされたファージライブラリ液が調製された。パン
ニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照された(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol.
Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)が用いられた。
チン標識hHMGB1)を加えることによって、当該ファージライブラリ液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの
複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは1mLの1.2 mM CaCl2/TBST(50mM Tris, 300mM NaCl, 1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20, pH7.6)と1 mLの1.2 mM CaCl2/TBS(50mM Tris, 300mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH7.6)にて洗浄された。その後、1 mg/mLのトリプシン0.5 mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後
、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを
大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225 mm x 225 mmのプレートへ播種され
た。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージライブラリ液が調製された。
濃縮が行われた。具体的には、調製したファージライブラリ液に40 pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリを室温で60分間抗原と接触させた。BSA
でブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1 mLの1.2 mM CaCl2/TBSTと1.2 mM CaCl2/TBSにて複数回洗浄された。その後抗原結合能を指標として濃縮する場合は、1mg/mLのトリプシン0.5 mLが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いて
ビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。pH依存的抗原結合能を指標に濃縮する場合は、Round2では0.4 mL, Round3以降では0.1 mLの50 mM MES/1.2 mM CaCl2/150
mM NaCl(pH5.5)が加えられ、ビーズは室温で懸濁された後、磁気スタンドを用いて
ビーズが分離された。回収されたファージ溶液に、100 mg/mLのトリプシンをRound2では20μL、Round3以降では5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタンパク質(ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質)が切断され、Fabを提示しないファー
ジの大腸菌に対する感染能を失わせた。回収されたファージが、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10 mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間緩やかに上記大腸菌
の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225 mmx 225 mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファー
ジを回収することによってファージライブラリ液が回収された。抗原結合能もしくはpH依存的結合能を指標とするパンニングは3回繰り返された。
(26-2)で実施された3回目、4回目のパンニング後に得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習いファージの
培養を行い、ファージ含有培養上清が回収された。終濃度4%BSAおよび1.2 mMカルシウ
ムイオン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が加えられたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell 96マイクロタイタープレート(Roche)がビ
オチン標識hHMGB1を含む100μLのPBSにて4時間以上コートされた。当該プレートの各ウエルをPBSTにて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウエルが1時間以上250μLの4%BSA-TBS(50mM Tris, 300mM NaCl, 2.5mM CaCl2, 4%BSA)にてブロッキングされ
た。4%BSA-TBSが除かれた各ウエルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37℃で1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウエルに存在するHMGB1に結合させた。1.2 mM CaCl2/TBST(pH7.6)にて洗浄された各ウエルに、1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)もしくは1.2 mM CaCl2/150 mM NaCl/50 mM MES(pH5.5)が加えられ、当該プレートは37℃で30分間静置しインキュベートされた。1.2 mM CaCl2/TBST(pH7.6)にて洗浄された後に、4%BSA-TBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)が各ウエルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。1.2 mM
CaCl2/TBST(pH7.6)にて洗浄後、TMB single溶液(invitrogen)が添加された各ウエル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該
発色が測定された。
ファージELISAの結果、pH依存的な抗原に対する結合能があると判断された3抗体、HM
_3_2_R_017(重鎖配列番号:131、軽鎖配列番号:132)、HM_3_2_R_054(
重鎖配列番号:133、軽鎖配列番号:134)、およびHM_4_1_R_001(重鎖配列番号:135、軽鎖配列番号:136)がそれぞれ動物細胞発現用プラスミドへ挿入された。抗体を以下の方法を用いて発現させた。FreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に懸濁されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)が1.33 x 106個 /mLの細胞密度で6ウエルプレートの各ウエルへ3 mLずつ播種された。調製さ
れたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベータ
ー(37℃、8%CO2, 90 rpm)で4日間培養が行われた。rProtein A SepharoseTM Fast
Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた
培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの
吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
(26-4)で取得された抗体HM_3_2_R_017(重鎖配列番号:131、軽鎖配列番号:132)、HM_3_2_R_054(重鎖配列番号:133、軽鎖配列番号:134)、およびHM_4_1_R_001(重鎖配列番号:135、軽鎖配列番号:136)のhHMGB1に対する結合活性がpH依存的であるかどうかを判断するため、これらの抗体とhHMGB1との相互作用がBiacore T100(GE Healthcare)を用いて解析された。中性域pHおよび酸性域pHの
条件として、それぞれpH7.4およびpH5.8の溶液中で抗原抗体反応の相互作用が解析された。アミンカップリング法でprotein A/G(PIERCE)が適当量固定化されたSensor chip CM4(GE Healthcare)上に、目的の抗体がそれぞれ200RU程度キャプチャーされた。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2 mM
CaCl2(pH7.4)または20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、1.2mM
CaCl2(pH5.8)の2種類の緩衝液が用いられた。hHMGB1の希釈にもそれぞれのバッファ
ーが使用された。測定は全て25℃で実施された。
にキャプチャーさせた。HM_3_2_R_017抗体およびHM_3_2_R_054抗体およびHM_4
_1_R_001抗体にhHMGB1を相互作用させた。その後、10 mM Glycine-HCl(pH1.5)を
流速30μL/minで30秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。
れている。
前記の結果から、HM_3_2_R_017抗体、HM_3_2_R_054抗体およびHM_4_1_R_001抗体は、バッファー中のpHをpH7.4からpH5.8にすることで、hHMGB1に対する結合能が低減することが観察され、ヒトHMGB1に対してもpH依存的結合抗体が取得できることが示さ
れた。
(1-1)ノーマルマウスを用いたin vivo試験
ノーマルマウス(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)にhsIL-6R(可溶型ヒトIL-6レセプター:参考実施例4にて作製)を単独投与もしくはhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体を同時投与した後のhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体の体内動態が
評価された。hsIL-6R溶液(5μg/mL)、もしくは、hsIL-6Rと抗ヒトIL-6レセプター抗体
の混合溶液が尾静脈に10 mL/kgで単回投与された。抗ヒトIL-6レセプター抗体としては
、前記のH54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1が使用された。
のとき、hsIL-6Rに対して抗ヒトIL-6レセプター抗体は十分量過剰に存在することから、hsIL-6Rは大部分が抗体に結合していると考えられる。投与後15分、7時間、1日、2日、4日、7日、14日、21日、28日の時点で採血が行われた。採取された血液を直ちに4℃、12,000
rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。分離された血漿は、測定を
実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫で保存された。
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプター抗体濃度はELISA法にて測定された。まずAnti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)に分注し、4℃で1晩静置することによってAnti-Human IgG固相化プレートが作成された。血漿中濃度として0.64、0.32
、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mLの検量線試料および100倍以上希釈されたマウス
血漿測定試料のそれぞれが分注されたAnti-Human IgG固相化プレートが25℃で1時間インキュベーションされた。その後Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)を25℃で1時間反応させた後にStreptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)を25℃で0.5時間反応させた。TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用いて発色反応が行われた。1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)によって発色反応が停止された後、マイクロプレートリーダーを用いて発色液の450 nmにおける吸光度が測定された。解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて、マウス血漿中濃度が検量線の吸光度を基準として算出され
た。この方法で測定された静脈内投与後のノーマルマウスにおけるH54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1の血漿中の抗体濃度の推移が図16に示されている。
マウスの血漿中hsIL-6R濃度は電気化学発光法にて測定された。2000、1000、500、250
、125、62.5、31.25 pg/mLに調整されたhsIL-6R検量線試料および50倍以上希釈されたマウス血漿測定試料と、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム
化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)およびBiotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)およびトシリズマブ(重鎖配列番号:24、軽鎖配列番号:25)溶液との混合液を4℃で1晩反応させた。サンプル中のFree Ca濃度を低下させ、サンプル中のほぼ全てのhsIL-6Rが6RL#9-IgG1もしくはFH4-IgG1から解離し、添加した
トシリズマブと結合した状態とするために、その際のAssay bufferには10 mM EDTAが
含まれていた。その後、当該反応液がMA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)に分注された。さらに25℃で1時間反応させたプレートの各ウエルが洗浄され
た後、各ウエルにRead Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)が分注された。ただちに反応液はSECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)を用いて測定され
た。hSIL-6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。前記の方法で測定された静脈内投与後のノーマルマウス
における血漿中のhsIL-6Rの濃度推移が図17に示されている。
幅に遅くした。それに対して、hsIL-6Rと100倍以上のCa依存的な結合を有する6RL#9-IgG1あるいはFH4-IgG1を同時に投与した場合は、hsIL-6Rの消失が大幅に加速された。H54/L28-IgG1を同時に投与した場合と比較して、6RL#9-IgG1およびFH4-IgG1を同時に投与した場
合は、一日後の血漿中のhsIL-6R濃度はそれぞれ39倍および2倍低減された。これよりカルシウム依存的結合抗体が血漿中からの抗原の消失を加速可能であることが確認された。
(2-1)IgG抗体のFcRnへの結合に関して
IgG抗体はFcRnに結合することで長い血漿中滞留性を有する。IgGとFcRnの結合は酸性条件下(pH6.0)においてのみ認められ、中性条件下(pH7.4)においてその結合はほとんど認められない。IgG抗体は非特異的に細胞に取り込まれるが、エンドソーム内の酸性条件
下においてエンドソーム内のFcRnに結合することによって細胞表面上に戻り、血漿中の中性条件下においてFcRnから解離する。IgGのFc領域に変異を導入し、酸性条件下におけるFcRnへの結合を失わせると、エンドソーム内から血漿中にリサイクルされなくなるため、
抗体の血漿中滞留性は著しく損なわれる。
向上させる方法が報告されている。IgG抗体のFc領域にアミノ酸置換を導入し、酸性条件
下のFcRnへの結合を向上させることによって、エンドソーム内から血漿中へのIgG抗体の
リサイクル効率が上昇する。その結果、IgG抗体の血漿中の滞留性が改善する。アミノ酸
の置換を導入する際に重要と考えられているのは、中性条件下におけるFcRnへの結合を高めないことであった。中性条件下においてFcRnに結合するIgG抗体は、エンドソーム内の
酸性条件下においてFcRnに結合することによって細胞表面上に戻ることはできても、中性条件下の血漿中においてIgG抗体がFcRnから解離せず血漿中にリサイクルされないために
、逆にIgG抗体の血漿中滞留性は損なわれると考えられていた。
れているように、マウスに投与された、アミノ酸置換を導入することによって中性条件下(pH7.4)においてマウスFcRnに対する結合が認められるようになったIgG1抗体の血漿中
滞留性が悪化することが報告されている。また、Yeungら(J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671)、Datta-Mannanら(J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717)、Dall’ Acquaら(J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180)に記載されて
いるように、アミノ酸置換を導入することによって酸性条件下(pH6.0)におけるヒトFcRnの結合が向上するIgG1抗体改変体は、同時に中性条件下(pH7.4)におけるヒトFcRnに対する結合が認められるようになる。カニクイザルに投与された当該抗体の血漿中滞留性は改善されず、血漿中滞留性に変化が認められなかったことが報告されている。そのため、抗体の機能を向上させる抗体工学技術においては、中性条件下(pH7.4)におけるヒトFcRnに対する結合を増加させることなく酸性条件下におけるヒトFcRnへの結合を増加させる
ことで抗体の血漿中滞留性を改善させることに注力されていた。すなわち、そのFc領域にアミノ酸置換を導入することによって中性条件下(pH7.4)におけるヒトFcRnに対する結
合が増加したIgG1抗体の利点はこれまで報告されていない。
に対する結合を増強する方法が検証された。
カルシウム依存的抗原結合能を有するFH4-IgG1、6RL#9-IgG1、および対照として用いられたカルシウム依存的抗原結合能を有しないH54/L28-IgG1のFc領域にアミノ酸変異を導入することによって、中性条件下(pH7.4)におけるFcRnに対する結合を有する改変体が作
製された。アミノ酸の変異の導入はPCRを用いた当業者公知の方法を用いて行われた。具
体的には、IgG1の重鎖定常領域に対して、EUナンバリングで表される434位のアミノ酸で
あるAsnがTrpに置換されたFH4-N434W(重鎖配列番号:94、軽鎖配列番号:81)と6RL#9-N434W(重鎖配列番号:95、軽鎖配列番号:79)とH54/L28-N434W(重鎖配列番号
:96、軽鎖配列番号:83)が作製された。QuikChange Site-Directed Mutagenesis
Kit(Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法を用いてそのアミノ酸が置換され
た変異体をコードするポリヌクレオチドが挿入された動物細胞発現ベクターが作製された。抗体の発現、精製、濃度測定は実施例15に記載された方法に準じて実施された。
(3-1)ノーマルマウスを用いたin vivo試験
ノーマルマウス(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)にhsIL-6R(可溶型ヒトIL-6レセプター:参考実施例4にて作製)が単独で投与された、もしくはhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体が同時投与された後のhsIL-6Rおよび抗ヒトIL-6レセプター抗体
の体内動態が評価された。hsIL-6R溶液(5μg/mL)、もしくは、hsIL-6Rと抗ヒトIL-6レ
セプター抗体の混合溶液が尾静脈に10 mL/kgで単回投与された。抗ヒトIL-6レセプター
抗体として、上述のH54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434Wが使用された。
量過剰に存在するため、hsIL-6Rの大部分は抗体に結合していると考えられた。投与後15
分、7時間、1日、2日、4日、7日、14日、21日、28日の時点で採血が行われた。採取され
た血液を直ちに4℃、12,000 rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。分離された血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫で保存された。
定
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプター抗体濃度は参考実施例1と同様のELISA法によっ
て測定された。この方法で測定された静脈内投与後のノーマルマウスにおけるH54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W抗体の血漿中の抗体濃度の推移が図18に示されている。
マウスの血漿中hsIL-6R濃度が電気化学発光法にて測定された。2000、1000、500、250
、125、62.5、31.25 pg/mLに調製されたhsIL-6R検量線試料および50倍以上希釈されたマウス血漿測定試料と、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム
化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)およびBiotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)との混合液を4℃で1晩反応させた。サンプル中のFree Ca濃度を低下させ、サンプル中のほぼ全てのhsIL-6Rが6RL#9-N434WもしくはFH4-N434Wか
ら解離し、free体として存在する状態とするために、その際のAssay bufferには10 mM
EDTAが含まれていた。その後、当該反応液がMA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)に分注された。さらに25℃で1時間反応させたプレートの各ウエルが
洗浄された後、各ウエルにRead Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)が分注された。ただちに反応液はSECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)を用いて
測定された。hSIL-6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。前記の方法で測定された静脈内投与後のノーマ
ルマウスにおける血漿中のhsIL-6Rの濃度推移を図19に示されている。
た場合よりもhsIL-6Rの消失が加速された。hsIL-6Rが単独で投与された場合と比較して、6RL#9-N434W抗体またはFH4-N434W抗体が同時に投与された場合は、投与後一日での血漿中のhsIL-6R濃度がそれぞれ3倍および8倍低減した。この結果、カルシウム依存的に抗原に
対して結合する抗体に対して、pH7.4におけるFcRnに対する結合活性を付与することによ
って、血漿中からの抗原の消失がさらに加速し得ることが確認された。
は、hsIL-6Rの消失をhsIL-6R単独の投与よりも加速することが確認された。これらのデータは、pH依存的に抗原に結合する抗体と同様、Ca依存的に抗原に結合する抗体がエンドソーム内で抗原を解離することを示唆している。
抗原であるヒトIL-6レセプターの組換えヒトIL-6レセプターは以下のように調製された。Mullberg ら(J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968)で報告されているN末端側1
番目から357番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6レセプター(以下、hsIL-6R)のCHO定常発現株が当業者公知の方法で構築された。当該発現株を培養することによって、hsIL-6Rが発現した。得られた培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによってhsIL-6Rが精製された。最終工程に
おいてメインピークとして溶出された画分が最終精製品として用いられた。
抗体のカルシウムイオン結合活性の評価
(5-1)抗体の発現と精製
NMR測定に用いるために発現させたLfVk1_Caを含む抗体とLfVk1を含む抗体が精製され
た。具体的には、LfVk1_Caを含む抗体(LfVk1_Ca抗体とも呼ぶ)は重鎖(配列番号:24)と軽鎖(配列番号:43)をそれぞれ発現させることが出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。また、LfVk1を含む抗体(LfVk1抗体とも呼ぶ)は重鎖(配列番号:24)と軽鎖(配列番号:44)をそれぞれ発現させることが出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。最終細胞密度1 x 106細胞/mLとなるようにFreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)へ懸濁された100 mLのヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen
)の細胞懸濁液に、標識アミノ酸が加えられた。具体的には、Asp/Glu/Gln/Asn標識体に
ついてはL-Aspartic acid-13C4,15N(10 mg)、L-Glutamic acid-13C5,15N(2.5 mg
)、L-Glutamine-13C5,15N2(60 mg)、L-Asparagine-13C4,15N2・H2O(2.5 mg)、β-chloro-L-alanine(6 mg)を10 mLの水に懸濁した溶液を0.22μmフィルターでろ過した液を加えた。Leu標識体については、L-Leucine-15N(30 mg)、β-chloro-L-alanine(6
mg)を10 mLの水に懸濁した溶液を0.22μmフィルターでろ過した液を加えた。リポフ
ェクション法により調製されたプラスミドが細胞に導入された。プラスミドが導入された細胞はCO2インキュベーター(37℃、8%CO2、90 rpm)中で5日間培養された。rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いた当業者公知の方法にし
たがって、上記のように得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数
を用いて測定値から抗体濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423
)。
分子量分画サイズ30,000MWCOの限外ろ過膜 を用いて、各種抗体が8.2-11.8 mg/mLま
で濃縮された。L-Cystein 1 mM、EDTA 2 mM、50 mM酢酸/125 mMトリス緩衝液(pH
6.8)を用いて8 mg/mLに希釈された当該抗体の試料が調製された。各抗体に対して1/240量のPapain(Roche Applied Science)を加えて攪拌された当該試料が37℃にて1時間静置された。静置後、それぞれ下流に1 mLサイズのProteinA担体カラムHiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)がタンデムにつながれた50 mM酢酸/125 mMトリス緩衝液(pH 6.8)で平衡化されたGly-Gly-Tyr-Arg(Sigma)ペプチドを結合した1 mLサイズのHiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)に添加された。上流のGly-Gly-Tyr-Argペプチドによって活性化Papainを除去するとともに、下流のProteinA担体カラムでFcフラグメントおよび未消化抗体を除去することでFabフラグメントの精製画分が得られた。Fab画分に含まれる不活性Papainが活性化するのを防ぐために、Fab画分にはシステインプロテア
ーゼ阻害剤E64(Sigma)を10μM添加した。なお、上記のすべてのカラム操作は20から25
℃の室温下にて実施された。
抗体溶液をMWCO 5000の限外濾過器Vivaspin(Sartorius)を用いて0.5 mLまで遠心により濃縮した。次に上記限外濾過器にダイアフィルトレーションカップを設置して、NMR
用緩衝液:5 mM d-BisTris, 20 mM NaCl, 0.001 % (w/v) NaN3, 5 % (v/v)
2H2O, pH 7.0(NaOH、HClを用いてpHを調製した)へ緩衝液置換(ダイアフィルトレ
ーションカップに上記緩衝液を5 mL足して0.5 mLまで遠心濃縮することを3回繰り返し
た)を行い、最後に0.25 mLまで濃縮した。最後に、NMR緩衝液で限外濾過器を洗いこみ
、濃縮液とあわせて抗体溶液をLfVk1_Ca抗体については420μL、LfVk1抗体については270μLとした。この段階で再度、pHを確認し、必要に応じてNaOH、HClによりpH 7.0に調整した。UV測定器Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)を用いて280 nmにおける吸光
度を測定し、280 nmにおけるモル吸光係数を70000 M-1・cm-1としてFabフラグメントを定量した。Leu標識LfVk1_Ca抗体、Leu標識LfVk1抗体は0.12 mM、Asp、Glu、Asn、Gln標識LfVk1_Ca抗体、Asp、Glu、Asn、Gln標識LfVk1抗体は0.24 mMとなった。これらの試料の内、LfVk1_Ca抗体については、直径5 mmのNMR試料管(shigemi)に、LfVk1抗体につ
いては直径5 mmの水溶液用対称形ミクロ試料管(shigemi)にパスツールピペットを用いて充填した。LfVk1_Ca抗体のCa2+滴定実験においては、抗体溶液に、抗体に対して、Ca2+が1、2、5、10、20モル等量となるよう、CaCl2溶液を順次、添加した。添加に用いたCaCl2溶液にはNMRバッファーに溶解した10、20、50、100 mM CaCl2溶液を準備した。シリ
ンジ部分を既製品から延長した特注マイクロシリンジ(ITO)により、添加容量が3-10μLの範囲となるように、CaCl2溶液の必要量を直接、NMR試料管に充填された抗体溶液に添加し、試料管をボルテックスミキサーにより攪拌後、手動遠心器(Shimadzu)により遠心分離した。
を観測するためのNMR測定
NMR測定には、TCI CryoProbeを設置したNMR分光器DRX750(Bruker Biospin)を用い
た。設定温度を307K(GasFlow 535 L/h)とした。アミド基シグナルを観測するためのNMR測定には1H-15N HSQCを用いた。測定法としては、15N展開期にα炭素とカルボニル炭
素の同時13Cデカップリング、および溶媒水シグナル消去のための3-9-19パルストレイン
を伴う1H-15N FHSQCを用い、それを制御するパルスプログラムには、メーカー(Bruker
Biospin)により標準として準備されているものを用いた。NMRの測定条件は以下の通りとした。スペクトル幅:12019Hz (f2), 1976 Hz (f1)、データポイント数: 2048 (f2), 128 (f1)。データ処理にはTopspin 3.0(Bruker Biospin)を用いた。データ処
理条件は以下の通りとした。f2、f1共に、ウィンドウ関数としてshifted Sine (QSINE)
を乗じ、2倍のデータポイント数となるようにゼロフィリングを行った後に、フーリエ
変換を行った。シグナルの化学シフトはNMR解析ソフトウェアSparky(UCSF)を用いて算
出した。
これまでにトシリズマブ(重鎖配列番号:24、軽鎖配列番号:25)のFabフラグメ
ントの主鎖アミド基のNMRシグナルの内、80%が帰属された(データ未公開)。LfVk1_Ca
抗体のFabフラグメントのアミノ酸配列は、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3の一部、および軽鎖73
、83番のアミノ酸残基およびを除き、トシリズマブとFabフラグメントのアミノ酸配列と
同じである。両抗体でアミノ酸配列が同じ部分については、そのNMRシグナルが同一の化
学シフトを有する、あるいはそれらが近いため、トシリズマブの帰属情報を移行することが可能であった。Leu標識試料については、軽鎖11、(33)、(46)、(47)、(54)、(78)、125、135、136、154、175、179、181、201、重鎖18、46、64、71、81、83、114、144、147、165、176、181、184、195が帰属を移行することが可能であった。上記、括弧が付いてい
ない番号はトシリズマブと同一の化学シフトであるため、帰属が移行できた残基番号、括弧が付いた番号は、トシリズマブと近い化学シフトを有しており、それ以外に近い化学シフトを有するシグナルがないため、帰属が可能であった残基番号であった。一方、Asp、G
lu、Asn、Gln標識試料については、LfVk1_Ca抗体とLfVk1抗体のスペクトルを比較し、4
個のシグナルがLfVk1_Caで新たに観測されていた。これは、この両抗体間でAsp、Glu、Asn、Gln残基の内、Ca2+結合モチーフとして導入した配列の異なる軽鎖Asp30、31、32、92、Glu50の5残基の内のいずれか4残基由来であると分類できた。
LfVk1_Ca抗体のFabフラグメントのCa2+未添加状態と、20モル等量添加の1H-15N HSQCスペクトルを比較して、化学シフトが変化しているシグナルを抽出した。その結果、Leu
標識試料からは、軽鎖Leu33が結合に関与しており、それ以外のLeu残基は結合に関与していないことが分かった。また、Asp、Glu、Asn、Gln標識試料からは、軽鎖Asp30、31、32
、92、Glu50の5残基の内のいずれか4残基が結合に関与し、それ以外のAsp、Glu、Asn、Gln残基の内の1残基を除くすべてが結合に関与していないことが明らかとなった。以上のことから、Ca2+結合モチーフとして導入されたアミノ酸配列の内、少なくとも軽鎖CDR1、これに加えて軽鎖CDR2、CDR3の両方もしくはいずれかのアミノ酸がCa2+結合に関与していると同定された。このことは実施例15において確認された30位、31位、32位、50位および92位(Kabatナンバリング)のうち4つがhVk5-2配列のアミノ酸であることがカルシウム
イオンの結合に重要であった結果と一致している。
Ca2+濃度がLfVk1_Ca抗体のFabフラグメントに対して、0、1、2、5、10、20モル等量の時の1H-15N HSQCスペクトルを利用した。結合部位として同定された軽鎖Leu33のシグナ
ルの1Hまたは15N化学シフトを縦軸に、上記Ca2+のモル等量を横軸にプロットし、グラフ
作成ソフトウェアGnuplotを用いて以下の式2で示される関数のフィッティングを行った
。
f(x)=s×[1-0.5/a×{(a×x+a+Kd)-((a×x+a+Kd)2-4×x×a2)0.5}+t×[0.5/a×{(a×x+a+Kd)-((a×x+a+Kd)2-4×x×a2)0.5}
飽和結合時の推定化学シフト[ppm]、aは抗体 Fabフラグメント濃度[M]、Kdは解離定数、xは抗体 Fabフラグメントに対して添加したCa2+のモル等量を示している。フィッティングの際には、s, t, Kdをフィッティングパラメータとした。その結果、1H化学シフトからはKd=7.1×10-5[M]、15N化学シフトからは、Kd=5.9×10-5[M]として見積もられた。
Claims (8)
- 所望の抗原に結合する抗原結合分子のスクリーニングのためのライブラリの作製方法であって、
前記ライブラリは、互いに配列の異なる複数の抗原結合分子を含んでなり、
前記抗原結合分子中の抗原結合ドメインは、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であり、
前記軽鎖可変領域は、生殖細胞系列の配列を含み、
前記重鎖可変領域は、ナイーブ配列であり、
pHによって前記抗原に対する前記抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基を、前記重鎖可変領域の相補鎖決定領域(CDR)1、CDR2、CDR3および前記軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のいずれか一つ以上のCDRに含み、前記アミノ酸残基がヒスチジンであるよう設計された前記複数の抗原結合分子を製造することを含む、
方法。 - 前記抗原結合分子の軽鎖のフレームワークが、生殖細胞系列のフレームワーク配列を含む、
請求項1に記載の作製方法。 - 前記抗原結合分子の重鎖可変領域が、ウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合している、請求項1または2に記載の作製方法。
- 前記ウイルスコートタンパク質が、タンパク質pIII、主コートタンパク質pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pv1およびその変異体からなる群から選択される、請求項3に記載の作製方法。
- pHによって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子を選択する方法であって、
a)請求項1-4のいずれかに記載される作製方法により前記ライブラリを作製するステップ、
b)前記ライブラリをpHの異なる二以上の条件下において抗原に接触させるステップ、
c)pHの条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子の集団を前記ライブラリから分画するステップ、
d)c)において分画された集団からpHの条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合分子を単離するステップ、
を含む方法。 - pH酸性域条件での抗原に対する結合活性がpH中性域条件での結合活性よりも低下する抗原結合分子を選択する、請求項5に記載の方法。
- pH酸性域条件がpH4.0から6.5である、請求項6に記載の方法。
- pH中性域条件がpH6.7から10.0である、請求項6または7に記載の方法。
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