CN114262676B - 一种利用芽孢杆菌高效降解羽毛角蛋白产氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用芽孢杆菌高效降解羽毛角蛋白产氨基酸的方法，以及该方法在降解鸡羽毛粉中的应用。本发明采用的技术方案是：将芽孢杆菌接种在羽毛粉培养基中培养并将发酵工程调整为包括好氧发酵和静置反应两个阶段，得到的发酵产物即为氨基酸水溶液。本发明6d内将10％(w/w)羽毛降解转化，产物中游离氨基酸含量高达39g/L，同时含有大量游离多肽。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用芽孢杆菌高效降解羽毛角蛋白产氨基酸的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
羽毛中90％以上的蛋白质以角蛋白的形式存在，角蛋白是一类不溶于水的纤维状结构蛋白，这种蛋白富含苏氨酸、精氨酸、半胱氨酸和一些疏水性氨基酸，具有很高潜在的营养价值。角蛋白普遍存在于自然界中，通常为动物皮肤的外胚层，如羽毛、头发、鳞、指甲、爪子等。角蛋白存在分子链内和分子链之间的二硫键、氢键、盐键及其他交联作用，使得羽毛具有很强的抗降解能力，很难被普通蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)水解。
我国年产羽毛废弃物在百万吨以上，大部分的羽毛通常被填埋及焚烧，造成了严重的资源浪费、环境污染甚至引起疾病。因此，充分利用羽毛废弃物不仅可以减轻环境污染，还能促进资源的循环利用。
现在降解羽毛的方法主要有物理法(高温蒸煮法和膨化法)、化学法(酸碱水解法)，这些方法不仅能耗高、工艺复杂、容易污染环境，而且会破坏部分氨基酸，而造成营养的损失。微生物法和酶法是两种新兴降解羽毛的方法，其降解废弃羽毛的过程温和、环境友好、不破坏氨基酸结构，生产的氨基酸产品可广泛应用于肥料、医药、饲料等行业。然而酶法降解存在工艺复杂、成本高等的问题，现阶段酶法降解羽毛完全无法满足工业需求。微生物降解羽毛存在的主要问题包括羽毛降解不完全、氨基酸产量较低，因此急需对样品前处理和发酵工艺优化，进一步提高氨基酸转化率。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种利用好氧微生物地衣芽孢杆菌ZSZ6高效降解羽毛角蛋白产氨基酸的方法，提高氨基酸转化率，缩短发酵周期。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用芽孢杆菌高效降解羽毛角蛋白的方法，包括好氧发酵和静置反应两个阶段，优选的，好氧发酵的培养基中加入培养基总重量份数0.5％～1％的Na2SO3；静置反应的体系中加入体系总重量份数0.5％～1％的含锰离子的盐。
本发明所述的含锰离子的盐可以为任何可溶性的含锰离子的盐，例如包括但不限于MnSO4、MnCl2或Mn(NO3)2。
本发明所用芽孢杆菌可以为本领域已知的具有降解羽毛作用的芽孢杆菌，发明人经过不同的芽孢杆菌菌株实验发现，均可显著提高其降解率，方法适用范围广。在本发明的一种具体的实例中，所用的菌株为已授权专利CN110183252B中地衣芽孢杆菌ZSZ6，保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.172458。
在本发明的一些实施例中，本发明所述的好氧发酵的培养基的配比为鸡毛90～120g/L，NaCl为0.8～1.2g/L，KH2PO4为0.8～1.2g/L，K2HPO4为0.8～1.2g/L，pH值为6.8～7.4；在一种具体的实例中，所述的好氧发酵的培养基的配比为鸡毛100g/L，NaCl为1g/L，KH2PO4为1g/L，K2HPO4为1g/L，pH值为6.8。
在本发明的一些实施例中，本发明所述的羽毛经过预处理，具体为将鸡羽毛进行清洗、粉碎处理。
本发明所述的好氧发酵的培养基的配置可以按照常规方法进行，例如按配方进行配比后，121℃处理20min灭菌。在本发明的一些具体的优选的实例中，培养基中加入0.5％～1％的Na2SO3后120～125℃处理15～25min，冷却至室温并静置20～25h。
本发明的好氧发酵是菌株种子液接种到培养基中，接种量可以按照常规进行选择，例如接种量为2％～5％。种子液的制备可以按照本领域的常规方法进行制备，例如：将菌液接种至种子培养基中，于37℃，180～260rpm培养16～24h。所述种子培养基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH值为7.0，在121℃灭菌20min。在一些实施例中，接种用的种子液的菌体密度为107～1010cfu/ml。
在本发明的一些实施例中，本发明好氧发酵的发酵温度为35～38℃，发酵时间24～48h。
本发明好氧发酵的溶氧可以按照本领域常规方法进行控制，例如控制在20～50％。
在本发明的一些实施例中，好氧发酵结束后加入0.1％～0.5％含锰离子的盐后直接进行静置反应。
在本发明的一些实施例中，静置反应温度调整为37～60℃，时间为72～96h；优选的反应温度为40～55℃。
在本发明的一些实施例中，好氧发酵控制pH为6.8～7.4,静置反应控制pH为8～9；pH的调控可以按照本领域的常规方法进行。
本发明还提供利用上述发明所制得的氨基酸多肽水溶液。
本发明所制备的氨基酸多肽水溶液可以应用于制备有机肥、加工饲料、提纯氨基酸等。
本发明通过优化反应条件，形成新型氨基酸水溶液生产技术。与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明通过将原料进行预处理，具体为在发酵前添加Na2SO3后静置1d，并将发酵反应设置为好氧发酵和静置反应两个阶段，进一步的在静置反应阶段加入含锰离子的盐，实现了羽毛降解后氨基酸产量和速率的提升。
(2)进一步的，通过对每个反应阶段温度的调整，进一步提高了氨基酸产量，利用该方法经过5～6d的水解，产物中游离氨基酸含量获得显著提升。
(3)本发明所述方法适用范围广，可以实现不同芽孢杆菌发酵产物中游离氨基酸含量的提高。
附图说明
图1为地衣芽孢杆菌ZSZ6在不同反应条件下氨基酸的产量；
图2为地衣芽孢杆菌ZSZ6在不同预处理条件下氨基酸的产量；
图3为地衣芽孢杆菌ZSZ6在静置阶段加入不同试剂时氨基酸的产量；
图4为地衣芽孢杆菌ZSZ6添加不同含锰盐类时氨基酸产量比值；
图5为地衣芽孢杆菌ZSZ6发酵条件优化前后多肽的产量；
图6为该方法在其它芽孢杆菌上的应用。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下列实施案例中，游离氨基酸检测方法采用茚三酮法(GB/TB314～2002)，多肽采用双缩脲法。
若无特别说明，以下实施例中所用菌株为已授权专利CN110183252B中地衣芽孢杆菌ZSZ6，其种子液的制备具体为：挑取斜面保存的地衣芽孢杆菌ZSZ6一环，接种到含有种子培养基的试管中37℃活化16h得到一级种子液，再将一级种子液按照2％接种量接种至100ml种子培养基中37℃培养16h，即得二级种子液，即用于接种的种子液，菌体密度大约为2*109cfu/ml。
所用种子培养基包括：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值为7.0，在121℃灭菌20min。
若无特别说明，以下实施例中好养阶段用的羽毛粉培养基包括：鸡毛粉100g/L，NaCl 1g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，pH值为6.8。
实施例1不同反应条件的对比
将地衣芽孢杆菌ZSZ6的二级种子液按照5％的接种量接种到羽毛粉培养基中，摇瓶初始发酵条件为：5％接种量，在37℃、180rpm条件下摇床培养。
反应条件实验组的设置：CK对照组为37℃、180rpm条件下摇床培养6d；其它发酵条件为37℃、180rpm条件下摇床培养2d后调整降解方式，分别调整为37℃静置、45℃静置和55℃静置条件下继续反应4d后，测定氨基酸产量。测定结果如图1所示，2d后调整为静置阶段可以不同程度的提高氨基酸的产量其中调整为37℃静置时氨基酸产量约为20.93g/L，调整为55℃静置时，氨基酸产量最高，约为25.87g/L。
实施例2羽毛粉不同预处理条件的对比
羽毛粉培养基中分别添加1％DTT、巯基乙醇、Na2SO3(CK为仅静置，不加入试剂)，121℃处理20min后冷却至室温后静置1d。然后采用37℃、180rpm摇床培养2d后，55℃静置4d。结果如图2所示，测定条件下DTT和巯基乙醇处理未能提高氨基酸产量，用1％Na2SO3预处理1d时可以进一步显著提高氨基酸产量，约为29.42g/L。
实施例3静置阶段加入不同试剂的对比
加入1％Na2SO3121℃处理20min后冷却至室温后静置1d后的鸡羽毛粉培养基，在37℃、180rpm摇床培养2d后分别添加0.1％的MgSO4、FeSO4、FeCl3、MnSO4、CuSO4后，55℃静置4d。测定结果如图3所示(CK表示静置前不加Na2SO3，静置后也不加试剂)，添加本发明所述的MnSO4时显著提高氨基酸产量，达到35.41g/L。此外，测定了添加其它含有锰离子的盐包括MnCl2和Mn(NO3)2时对菌株氨基酸产量的影响，结果如图4，其氨基酸产量与MnSO4接近(纵坐标为其氨基酸产量与添加MnSO4时氨基酸产量的比值)，即静置阶段加入Mn2+有助于提高氨基酸的产量。
实施例4该方法对多肽产量的影响，具体步骤如下：
本实施例所述方法：CK对照组为37℃、180rpm条件下摇床培养6d；处理组为经1％Na2SO3预处理1d后的鸡羽毛粉培养基，在37℃、180rpm摇床培养2d后添加0.1％MnSO4，55℃继续静置4d，分别测定产物中多肽含量。
结果如图5所示，本实施例所述方法能提高多肽产量，为45.91g/L，较常规处理提升73.31％。
实施例5其它芽孢杆菌的应用情况
采用实施例4所述的方法，将菌株替换为另外三种芽孢杆菌C1、C2、C3，即将芽孢杆菌C1、C2、C3分别在37℃、180rpm摇床培养2d转55℃静置，分别测定产物中多肽含量。芽孢杆菌C1、C2、C3为本单位筛选出具有羽毛降解能力的菌株，本领域技术人员可以从本单位获取。测定结果如图5所示，在5d时该发酵方法能大幅提高其它芽孢杆菌的氨基酸产量，最终氨基酸产量分别提高36.40％、38.73％、56.07％。
实施例6 50L发酵罐中地衣芽孢杆菌ZSZ6发酵产氨基酸
(1)提前泡发两组3kg的鸡羽毛粉，第一组不添加Na2SO3，第二组添加0.5％的Na2SO3，静置过夜。
(2)将地衣芽孢杆菌ZSZ6一级种子液按照2％的比例接种到LB液体培养基中，37℃、180rpm培养16小时得到二级种子液。
(3)发酵罐进行过滤器灭菌和空消后，将含有鸡羽毛粉的羽毛培养基加入发酵罐内并加水至22L进行实消。待冷却至室温后，按照5％的比例加入二级种子液进行发酵。
第一组发酵条件为控制pH为7，搅拌转速180rpm，发酵温度37℃，溶氧DO在20～40％，共6天。
第二组调整发酵条件：第一阶段为菌体生长阶段(48h内)，初始pH为7，搅拌转速180rpm，发酵温度37℃，溶氧DO控制在20～50％；第二阶段为鸡羽毛粉降解产氨基酸阶段(48h后)，调整pH至8，温度至55℃，加入0.1％MnSO4，并停止搅拌和通气,可以每隔12h进行一次搅拌，共发酵4d。
实验结果：在50L发酵罐条件下，第一组生产氨基酸在第六天约为18g/L，第二组在第五天可以达到约39g/L，可见，即使在扩大化处理的复杂情况下，本发明所述的方法仍然能够大幅提高了氨基酸产量。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (13)
1.一种利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，包括好氧发酵和静置反应两个阶段，好氧发酵的培养基中加入培养基总重量份数0.5%～1%的Na2SO3，好氧发酵的培养基的配比为鸡毛90～120g/L，NaCl为0.8～1.2g/L，KH2PO4为0.8～1.2g/L，K2HPO4为0.8～1.2g/L，pH值为6.8～7.4，好氧发酵的发酵时间24～48h；好氧发酵结束后加入0.1%～0.5%含锰离子的盐后直接进行静置反应，静置反应的反应温度为37～60℃，静置反应时间为72～96h。
2.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，所述的含锰离子的盐选自MnSO4、MnCl2或Mn(NO3)2。
3.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，好氧发酵的培养基的配比为鸡毛100g/L，NaCl为1g/L，KH2PO4为1g/L，K2HPO4为1g/L，pH值为6.8。
4.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，培养基中加入0.5%～1%的Na2SO3后120～125℃处理15～25min，冷却至室温并静置20～25h。
5.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，羽毛经过粉碎处理后加入到培养基中。
6.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，好氧发酵是将菌株种子液接种到培养基中；接种量为2%～5%。
7.根据权利要求6所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，菌株种子液为地衣芽孢杆菌ZSZ6种子液。
8.根据权利要求7所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，种子液菌体密度为107～1010cfu/ml。
9.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，好氧发酵的发酵温度为35～38℃。
10.根据权利要求9所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，溶氧控制在20～50%。
11.根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，静置反应温度为40～55℃。
12. 根据权利要求1所述的利用芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的方法，其特征在于，好氧发酵控制pH为6.8～7.4, 静置反应控制pH为8～9。
13.权利要求1-12任一所述的方法获得的氨基酸多肽水溶液。
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