JP7009642B2 - 抗-vista抗体及びその用途 - Google Patents
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Description
配列番号2、8、14及び20から構成される群から選ばれる重鎖CDR2、及び
配列番号3、9、15及び21から構成される群から選ばれる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号4、10、16及び22から構成される群から選ばれる軽鎖CDR1、
配列番号5、11、17及び23から構成される群から選ばれる軽鎖CDR2、及び
配列番号6、12、18、24、34~40から構成される群から選ばれる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、VISTA(V-domain Ig Suppressor of T-cell Activation)に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
配列番号2、8、14及び20から構成される群から選ばれる重鎖CDR2、及び
配列番号3、9、15及び21から構成される群から選ばれる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号4、10、16及び22から構成される群から選ばれる軽鎖CDR1、
配列番号5、11、17及び23から構成される群から選ばれる軽鎖CDR2、及び
配列番号6、12、18、24、34~40から構成される群から選ばれる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、VISTA(V-domain Ig Suppressor of T-cell Activation)に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号33の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号34の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号35の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号36の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号37の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号38の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号39の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号40の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号7の重鎖CDR1、配列番号8の重鎖CDR2及び配列番号9の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号10の軽鎖CDR1、配列番号11の軽鎖CDR2及び配列番号12の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号15の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号19の重鎖CDR1、配列番号20の重鎖CDR2及び配列番号21の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号22の軽鎖CDR1、配列番号23の軽鎖CDR2及び配列番号24の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
配列番号25の重鎖可変領域及び配列番号41の軽鎖可変領域;
配列番号25の重鎖可変領域及び配列番号42の軽鎖可変領域;
配列番号25の重鎖可変領域及び配列番号43の軽鎖可変領域;
配列番号25の重鎖可変領域及び配列番号44の軽鎖可変領域;
配列番号25の重鎖可変領域及び配列番号45の軽鎖可変領域;
配列番号25の重鎖可変領域及び配列番号46の軽鎖可変領域;
配列番号25の重鎖可変領域及び配列番号47の軽鎖可変領域;
配列番号25の重鎖可変領域及び配列番号48の軽鎖可変領域;
配列番号25の重鎖可変領域及び配列番号50の軽鎖可変領域;
配列番号49の重鎖可変領域及び配列番号48の軽鎖可変領域;
配列番号49の重鎖可変領域及び配列番号50の軽鎖可変領域;
配列番号27の重鎖可変領域及び配列番号28の軽鎖可変領域;
配列番号29の重鎖可変領域及び配列番号30の軽鎖可変領域;又は
配列番号31の重鎖可変領域及び配列番号32の軽鎖可変領域を含むことができる。
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離し得る技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーの大きさ、細菌性細胞中における生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーの大きさは抗体又は抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディングと停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞における発現は抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は可変/定常界面の表面又は選別されたCDR残基における残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一つの要素である。
本発明に係る具体的実施例において、抗-VISTA抗体クローン1B8の親和度増進のために抗体最適化を行い、また、1B8の軽鎖CDR3と重鎖CDR3に無作為変異を導入し、変異体scFvファージライブラリーを用いてバイオパンニングした結果、配列番号33~40で構成された群から選ばれる一つ以上の軽鎖可変領域CDR3を含む8種の最適化クローンが得られた。
“作動的に連結”は、核酸発現調節配列(例:プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ)と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び/又は解読を調節するようになる。
原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター(例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、lacUV5プロモーター、lppプロモーター、pLλプロモーター、pRλプロモーター、rac5プロモーター、ampプロモーター、recAプロモーター、SP6プロモーター、trpプロモーター及びT7プロモーターなど)、解読の開始のためのリボゾーム結合座及び転写/解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター(例:メタロチオネインプロモーター、β-アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター)又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター(例:アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、HSVのtkプロモーター、マウス***腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、HIVのLTRプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス(EBV)のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス(RSV)のプロモーター)を利用することができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
場合によって、ベクターはそれから発現する抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えばグルタチオンS-トランスフェラーゼ(Pharmacia,USA)、マルトース結合タンパク質(NEB,USA)、FLAG(IBI,USA)及び6x His(hexahistidine;Qiagen,USA)などがある。
前記ベクターは選択標識として当業界において通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
本発明はさらに他の観点において、前記言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使われた細胞は原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり得るが、これに制限されるものではない。
エスケリチアコライ(Escherichia coli)、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)(例えば、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida))、プロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)及びスタフィロコッカス(Staphylococcus)(例えば、スタフィロコッカスカルノーサス(Staphylocus carnosus))のような原核宿主細胞を利用することができる。
ただし、動物細胞への関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例は、COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、又はHT1080であり得るが、これに制限されるものではない。
本発明はさらに他の観点において、(a)前記細胞を培養する段階;及び(b)前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。
前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用の培地はいずれも制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知であるその他全ての必須補充物が適度の濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、pHなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者にとって明らかであろう。
前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果を例えば親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。更なるその他精製技術、例えば陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどを用いることができる。
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合には静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。
経口投与時に、タンパク質又はペプチドが消化されることから、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化する必要がある。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動し得る任意の装置によって投与することができる。
VISTAに結合する抗体を選別するための抗体ライブラリー及びライブラリーの準備は、韓国公開特許第10-2008-0109417号のような自体のヒト未感作scFv(human naive ScFv)ライブラリーを用いた。96ウェル免疫プレートに抗原(hVISTA-Fc,RND systems.Cat.No 7126-B7)を2μl/mlで100μlずつウェルに入れ、4℃で一晩置く。翌日、抗原コーティングプレート(coating plate)はPBSで3回洗浄した後、2%BSA遮断バッファ(blocking buffer)200μlを入れて室温で2時間反応させる。2xYT-TET(テトラサイクリン10μg/ml)成長培地(growth medium)2mlにXL1-Blueストック(stock)50μlを入れて37℃、200rpmで2時間程度育てた後に13mlをさらに添加し、OD600が0.5になるまで育てる。遮断(blocking)し、2時間が経つと1XPBSで3回洗浄する。洗浄した各ウェルにファージライブラリーグループ(phage library group)を合わせてファージライブラリー量と4%BSA量を同一に混ぜた後に200μlずつ添加し、室温で30分間ロッキング(rocking)した後、2時間反応させる。ファージライブラリー反応が終わると、上澄液を捨て、0.05%PBSTで5回洗浄し、PBSで5回洗浄した後、各ウェルに100mM TEA(trimethylamine)100μlを入れて室温で10分間振り動かす。10分経過すると、各ウェルに1Mトリス(pH7.5)50μlを入れて混ぜる。上澄液(supernatant)はOD6000.5になったXL1-blue 10mlに入れて37℃で30分間感染(infection)させる。感染が終わると、100μlはアウトプットタイター(output titer)として使用し、残りは7,000rpm、10分間遠心分離する。上澄液を捨て、沈殿物はラージスクエアプレート(large square plate:CM 34μg/ml+1%グルコース)にスプレッド(spreading)して30℃で一晩インキュベーション(overningt incubation)する。アウトプットタイターとして残した100μlは、1/10、1/100、1/1000に希釈(dilution)し、CMプレートにスプレッドして37℃で一晩置く。翌日、スクエアプレートに育ったコロニー(colony)は2xYT培地50mlを入れた後、ループ(loop)を用いてかき集めた後に7000rpm、10分間遠心分離し、上澄液を捨て、沈殿液(precipitate)に対して1次パンニングストック(panning stock)を作り、2xYT培養培地(growth media:CM 34μg/ml+1%グルコース)100mlを500ml三角フラスコに入れた後、OD6000.2となるように細胞を入れ、200rpm、37℃でOD6000.5になるまで育てる。OD600値が0.5になるまで細胞を培養した後、ヘルパーファージ(helper phage:M13KO7ミュータント)を細胞の20倍になるように入れる。ヘルパーファージを入れて37℃、30分感染(infection)させた後、7000rpm、10分遠心分離する。上澄液を捨て、細胞は2xYT培地(CM 34μg/ml+Kan. 70μg/ml+1mM IPTG+5mM MgCl2)100mlに入れ替えた後、200rpm、30℃で一晩置く。翌日、育った細胞は7000rpm、10分、遠心分離し、同一方法でもう1回遠心分離する。集めた上澄液は、上澄液の1/5(v/v)20% PEG/2.5m NaClを入れてアイス(ice)で1時間沈殿させる。沈殿させた後、7000rpm、1時間遠心分離する。上澄液を捨て、PBS 3mlで沈殿液(precipitate)を溶かした後、0.45μmフィルター(filter)に濾過した後に4℃で保管し、これを次のパンニング(panning)過程で使用する。この過程を3~4回反復し、抗原に結合する抗体をELISAを行って確認した。
パンニング(panning)過程が終わると、最後のラウンド細胞ストック(round cell stock)をCM寒天プレート(agar plate)に200~500個のコロニーが形成され得るように希釈して敷いた後、37℃で一晩置く。翌日、コロニー(colony)が育つと、96ウェルディーププレート(96 well deep plate)に2xYT培地(CM 34μg/ml+1%グルコース)200μlを入れ、各ウェルにコロニーを一つずつ入れた後37℃、3000rpmで一晩置く。翌日、新しい96ウェルディーププレートに2xYT培地(CM 34μg/ml+1%グルコース)200μlを入れ、各ウェルに、前日に育てた細胞を20mlずつ入れた後、37℃、3000rpm、1時間10分育てる。残りの細胞は、50%グリセロールを100μlずつ添加して-70℃で保管する。細胞が育つと、ヘルパーファージ1μlと2xYT培地19μlを混ぜた後、各ウェルに20μlずつ添加後に37℃で30分インキュベーションする。インキュベーションが終わると、3000rpm、10分遠心分離する。上澄液を捨て、2xYT培地(CM 34μg/ml+Kan. 70μg/ml+1mM IPTG+5mM MgCl2)200μlを入れてメガグロー(megagrow)で30℃、3000rpmで一晩置く。
選別された抗体がVISTAを発現している細胞に結合するか否かを確認するために、ヒトVISTA及びマウスVISTAを発現するCHO-K1細胞を作製した。作製された細胞をFACSバッファ(2% FBS、0.05%アジ化ナトリウム含有PBS)に4×106cells/mlにして96ウェルディーププレートに50μlずつ入れた後、ファージインキュベーション(phage incubation)したファージ上澄液を50μlずつ入れて室温で1時間インキュベーションする。インキュベーションが終わると、各ウェルにFACSバッファを400μlずつ添加した後、2000rpm、5分間遠心分離する。上澄液を捨て、anti-M13抗体(1:1000)を100μlずつ入れた後、4℃で1時間反応させる。反応が終わると、各ウェルにFACSバッファを400μlずつ添加した後、2000rpm、5分間遠心分離する。上澄液を捨て、抗-マウスIgG-PE抗体(1:500)を100μlずつ入れた後、4℃で1時間反応させる。反応が終わると、各ウェルにFACSバッファを400μlずつ添加した後、2000rpm、5分間遠心分離する。上澄液を捨て、FACSバッファを200μlずつ入れた後、FACS(Beckton Dickinson,FACSCalibur)を用いて分析した。その結果を図1に示した。
選別したscFvファージのIgG形態への転換は、分子生物学的手法を用いて行った。選別したE.Coliクローンからファージミド(Phagemid)を抽出し、制限酵素Sfi I(R0123,New England Biolabs,US)で二重切断して重鎖可変領域DNA断片を確保し、重鎖定常領域を含むベクターpIgGHD-6A6HvyをSfi I処理後に可変領域DNA断片を挿入した。同一の方法でファージミドを制限酵素BstX I(R0113,New England Biolabs)で二重切断して軽鎖可変領域DNA断片を確保し、軽鎖定常領域を含むpIgGLD-6A6LgtベクターをBstX Iで二重切断後に可変領域DNA断片を挿入してIgG形態のDNAクローニングを完了した。
取得した上澄液をProtein Aカラム(GE Healthcare)に注入し、親和力クロマトグラフィーを用いてIgGを精製した。カラムを20mM Tris-HCl、50mM NaCl、5mM EDTA(pH7.0)に平衡化した後、上澄液を注入し、50mM Tris-HCl、500mM NaCl、5mM EDTA、0.2% polysorbate 20(pH7.0)溶液で洗浄した後、50mM NaCl、0.1M glycine-HCl(pH3.5)で溶出後に1Mトリスで中和した。溶出したタンパク質は、MWCO 10,000 spectra/por dialysis membrane(Spectrum Labs,US)を用いた透析過程によってPBSに溶媒を入れ替えた。その後、Vivaspin(Sartorius,DE)を用いて必要濃度に濃縮し、分注後に-80℃で保管した。
選別された抗体の抗原に対する結合力をOctet(Fortebio)を用いて測定した。そのために抗体をバイオセンサー(biosensor)に固定(immobilize)した後、様々な濃度の抗原を96ウェルに入れて測定した。
ELISA assay:96ウェルプレートに、Ag(ヒトVISTA-Fc、マウスVISTA-Fc)をそれぞれ1μg/ml作って100μl/wellずつ入れ、4℃で一晩置く。翌日、敷いておいたAgは、0.05%PBSTで3回洗浄し、2% BSA遮断バッファ(blocking buffer)200μlずつ入れた後、25℃で2時間インキュベーションする。遮断(blocking)が終わると、0.05%PBSTで3回洗浄する。各抗体を1μg/ml作って100μl/wellずつ入れて25℃で1時間インキュベーションする。インキュベーションが終わると、0.05%PBSTで3回洗浄し、goat anti-human IgG(kappa)peroxidase conjugated 1:2000(bethyl lab #A80-115P)を100μlずつ入れた後、25℃で30分インキュベーションした。インキュベーションが終わると、0.05%PBSTで3回洗浄し、TMB(BD TMB substrate reagent set #555214)を100μlずつ入れて3~5分発色させた後、停止溶液(stop solution)50μlずつ入れ、ELISAリーダ(ELISA reader)で分析する。その結果を図2に示した。
ヒトの末梢血液50mlを供与者から採取し、2mM EDTA含有PBSで3倍希釈する。新しい50mlチューブにフィコールパック(ficoll-paque:GE#17-1440-03)15mlを入れ、希釈された血液30mlを徐々に乗せた後、2,000rpmで40分間遠心分離する。PBMCs層を回収して50mlチューブに移し、洗浄バッファ(2% FBSと10mM HEPESを含むRPMI1640培地)を満たし、1,600rpmで10分間遠心分離することによって細胞を洗浄する。遠心分離後、上澄液を捨て、反復して洗浄する。遠心分離後に残った細胞ペレット(pellets)は50mlの洗浄バッファで溶かして単一細胞にした後、細胞ストレーナー(strainer:40um)を用いて死んだ細胞の塊りを除去する。Allo-MLRの応答者(responder)として使用する細胞(供与者A或いはB)は、4×106cells/ml濃度でMLR培地(10% FBS、10mM HEPES、1mMピルベート、NEAA(100X)、2mM L-グルタミン、1%抗生物質(antibiotics)、10-5M β-MEを含むRPMI1640培地)に希釈する。刺激剤(stimulator)として使用する細胞(供与者B或いはA)は、ミトマイシンC(mitomycin C:MMC)を処理して細胞増殖を抑制する。詳細な方法は次の通りである。刺激剤(stimulator)として使用する細胞を50mlチューブに4×106cells/ml濃度でMLR培地に希釈した後、MMCを25μg/mlになるように添加して37℃で30分反応させる。反応が終わった後に洗浄バッファを50mlチューブに一杯満たした後、1200rpm、10分間遠心分離して洗浄する。この過程を4回反復してMMCを完全に除去する。最後に4×106cells/ml濃度になるようにMLR培地に希釈する。準備した細胞はそれぞれ2×105cells/well(50μl)になるように96ウェル細胞培養プレートに分注する。分析する抗体を、最終濃度30μg/mlと10μg/mlとなるように50μlを添加する。各抗体の濃度別に3ウェルずつ試験する。そして、37℃、CO2インキュベーター(incubator)で5日間培養した後、50μlの細胞培養上澄液はIFN-γ生産量測定のために別に保管し、残りの細胞は細胞増殖を分析する。細胞増殖は、allo-MLR後に残っている細胞で生成されるATPの量を測定することによって分析する。詳細な方法は次の通りである。100μl(細胞培養液と同量)のCellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay(Promega)溶液を培養された細胞に添加して室温で10分間反応させることによって細胞を溶解させる。光度計(luminometer)で細胞生存度(viability)を測定する。その結果を図4に示した。
抗-VISTA抗体の抗腫瘍活性を評価するためにヒト由来乳癌細胞株であるMDA-MB-231***脂肪(mammary fat)をパッド(pad)に移植したNSGマウスにおいてヒトPBMCとJNJ61610588、pembrolizumab、抗-VISTA mAb 1B8治療剤の微静脈投与による抗癌薬効を評価しようとした。実験は、韓国生命工学研究院実験動物資源センターと共同で行った。
抗-VISTA抗体クローン1B8の親和度増進のために抗体最適化を行った。1B8の元のDNA配列を80%保存してランダム化(randomize)させるソフト-ランダム化(soft-randomization)法を用いて、1B8の軽鎖CDR3と重鎖CDR3に無作為変異を導入したプライマーを作製した。これを用いたPCRによって、変異の導入された1B8の軽鎖可変領域、ME4の重鎖可変領域コードDNA断片を確保した。このDNA断片をそれぞれ1B8 scFvファージファージミドの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と置換し、1B8軽鎖CDR3変異体scFvファージライブラリー及び重鎖CDR3変異体scFvファージDNAライブラリーをそれぞれ作製した。
各最適化scFvファージクローンをIgG形態に変換した。具体的な形態変換のためのDNAクローニング及び生産、精製方法は、実施例4及び実施例5に提示したのと同じ方法を用いた。
最適化された抗体の機能評価のためにin vitro上で末梢血液に含まれている免疫細胞の反応性を測定するために、混合リンパ球反応試験法(mixed Lymphocyte Reaction,MLR)を、実施例8で提示したのと同じ方法で行い、細胞の増殖とサイトカイン(IFN-γ)誘導を確認した。
抗-VISTA抗体の抗腫瘍活性を評価するために、ヒト由来乳癌細胞株であるMDA-MB-231***脂肪(mammary fat)をパッド(pad)に移植したNSGマウスにおいて実施例7に提示されたのと同じ方法を行い、ヒトPBMCとJNJ61610588、PMC-309.3.3、anti-VISTA3.4を含めて軽鎖可変領域を交換した薬物(PMC-309.3.4W、PMC-309.3.4SA)に対する微静脈投与による抗癌薬効を評価した。
Claims (8)
- 配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号6の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号7の重鎖CDR1、配列番号8の重鎖CDR2及び配列番号9の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号10の軽鎖CDR1、配列番号11の軽鎖CDR2及び配列番号12の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号14の重鎖CDR2及び配列番号15の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号16の軽鎖CDR1、配列番号17の軽鎖CDR2及び配列番号18の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号19の重鎖CDR1、配列番号20の重鎖CDR2及び配列番号21の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号22の軽鎖CDR1、配列番号23の軽鎖CDR2及び配列番号24の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号33の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号34の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号35の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号36の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号37の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号38の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号39の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号2の重鎖CDR2及び配列番号3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、 配列番号4の軽鎖CDR1、配列番号5の軽鎖CDR2及び配列番号40の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域
を含む、VISTA(V-domain Ig Suppressor of T-cell Activation)に結合する抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号25、27、29、31及び49から構成される群から選ばれる重鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号26、28、30、32、41~48及び50から構成される群から選ばれる軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1~3のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
- 請求項4の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項5の発現ベクターで形質転換された細胞。
- 次の段階を含むVISTAに結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法:
(a)請求項6の細胞を培養する段階;及び
(b)前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。 - 請求項1~3のいずれか一項の抗体又はその抗原結合断片を含む、PD-1抗体又はPD-L1抗体との併用投与用組成物。
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