KR102281405B1

KR102281405B1 - 항-vista 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102281405B1
Application number: KR1020180125974A
Authority: KR
Inventors: 이영애; 변상순; 하정민; 안성호; 오근희; 이원섭; 박미주; 이은희; 김도윤; 유진산
Original assignee: 주식회사 파멥신
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2021-07-26
Also published as: MX2020005495A; CN111465617B; US11407833B2; CN111465617A; RU2750723C1; US20200407449A1; WO2019078699A2; KR20190044563A; WO2019078699A3; AU2018351418A1; CA3079652C; SG11202003585VA; BR112020007755A2; JP2021500068A; JP7009642B2; CA3079652A1; AU2018351418B2; EP3699193A4; EP3699193A2

Abstract

본 발명은 항-VISTA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체와의 병용투여용 조성물에 관한 것이다.

Description

항-VISTA 항체 및 이의 용도 {Anti- VISTA antibody and Use Thereof}

면역시스템은 외부에서 침입하는 병원균 등에 대항하기 위하여 세포와 조직이 관여하는 네트워크 시스템이다. 반복적으로 노출되는 비자기 항원 (non-self antigen)에 대응하기 위한 면역체계로는 크게 항체를 이용한 B-세포 반응 (B-cell response)이 있으며, 세포를 매개로 작동되는 T-세포 반응 (T-cell response)이 있다. 이들 외에 병원체에 대하여 즉각적으로 반응할 수 있는 체계도 있는데 대식세포 (macrophage), NK세포 (NK cell) 및 호중구 (neutrophil) 등의 세포가 항원을 제거하는데 직접적으로 관여하게 된다. 면역시스템은 자기 항원 (self antigen)에 대하여는 면역시스템이 작동되지 못하도록 클론 선별 (clonal selection) 등이 개체 발달 초기에 작동한다. 그러나, 면역시스템이 자기 항원에 대하여 작동할 수도 있는데 이 경우 질환의 원인이 된다.

류마티스 관절염은 이러한 자가면역질환의 대표적 질환이다. 종양에서도 이러한 면역회피기작이 작동된다는 것이 다양한 연구에서도 밝혀졌다. 이들은 면역세포의 활성을 억제 또는 증가시킴으로써 항원에 대한 면역을 억제 또는 증가시킬 수 있다. 이들 인자에 관여하는 물질들을 면역체크포인트 (immune checkpoint)라 한다. 최근에는 이러한 종양에 대한 면역억제기능을 방해하거나 면역활성에 관여하는 인자들을 보다 더 강화함으로써 종양을 치료하려는 다양한 시도가 이루어지고 있다.

2010년 면역체크포인트인 CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)에 대한 차단 항체가 악성 흑색종 환자에 처음으로 적용되어 약 20%의 환자에서 뚜렷한 치료효과가 입증되면서, 음성적 면역 조절 (negative immune regulator) 기능을 가지는 면역체크포인트를 표적하는 치료 항체를 이용하여 그 작용을 억제시킴으로써 항암면역반응을 항진시켜서 암을 치료하는 새로운 치료개념이 대두되었다.

이어서 개발된 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체는 항-CTLA-4 항체에 비해 더욱 탁월한 효과를 보였고, 특히 CTLA-4 항체 치료중 환자에서 나타나는 심한 부작용이 현저하게 줄어서 악성 흑색종, 비소세포폐암, 방광암에서 매우 적극적으로 사용되고 있다.

특히 지금까지의 항암면역요법은 기존의 암 치료법, 즉, 수술, 항암제, 방사선 치료 등이 실패한 경우의 환자를 대상으로 간헐적으로 선택되었으나, 부작용이 줄어든 항-PD-1/PD-L1 항체의 개발로 점차로 일차적 치료 양식 (modality)으로 선택되고 있으며, 기존 치료제에 반응하지 않는 다양한 암종, 예로 위암, 간암 등으로도 치료의 범위를 넓혀서 적극적으로 임상 시험을 진행하고 있는 있다.

PD-1 표적 치료제는 T-세포의 면역조절을 활성화시키는 기작을 가지고 있으며, PD-L1은 PD-1의 리간드이며 종양세포에서 발현되는 PD-L1에 결합하여 T-세포에 의한 면억억제를 방해함으로써 항암 활성을 나타낸다. 이러한 활성을 보다 극대화하기 위하여는 PD-1/PD-L1과는 중복되지 않는 면역 억제 기작의 조성물이 필요하다. 이들 물질과 기존 치료제의 병용 치료는 종양 환자의 치료 효능을 개선하는데 있어서 매우 유용한 수단이 될 것이다.

VISTA (V-domain-containing Ig Suppressor of T-cell Activation)는 최근에 밝혀진 면역체크포인트 물질로 직접적으로 T-세포의 활성을 억제하는 것으로 알려졌다. VISTA의 발현은 조혈 모세포 (hemotopoietic compartment)에서 지속적으로 발현되는데 이 중 골수성 (myeloid) 계열 세포에서 가장 많이 발현되며, CD4⁺, CD8⁺ T 세포 및 Foxp3⁺CD4⁺조절 T 세포 (Foxp3⁺CD4⁺regulatory T cells)에서는 상대적으로 발현량이 낮다고 알려져 있다. T 세포를 포함한 대부분의 면역세포에서 발현되지만, 골수성 (myeloid) 세포에서 가장 높게 발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서, VISTA를 억제하는 분자는 PD-1 또는 PD-L1과 다른 표적점을 가지고 있으며, 이는 PD-1/PD-L1 치료제와의 병용 치료에서의 효능 확대를 기대할 수 있다.

구조적으로는 세포외 면역글로불린 V (IgV) 도메인 (extracellular immunoglobulin V (IgV) domain)을 가지고 있다는 점에서 TIM 패밀리와 유사하다고 할 수 있으며, 인간과 마우스의 VISTA 아미노산 서열은 대략 90%의 상동성이 있는 것으로 밝혀졌다. 실험에 의하면 VISTA의 세포외 도메인을 항체 중쇄의 Fc 부위와 결합된 형태의 VISTA-Fc나 VISTA 전체 아미노산 서열을 발현하고 있는 APCs (antigen presenting cell)가 리간드로 작용하여 VISTA에 의해 T 세포 증식 (T-cell proliferation)과 싸이토카인 (cytokine)의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, VISTA 특이적인 항체의 경우 자가면역 뇌척수염 (autoimmune encephalomyelitis) 모델에서 질환의 중증도를 높이기도 하고, 항종양 면역 활성을 높이기도 한다고 알려져 있다 (Le Mercier I, et al., 2014).

이와 같은 VISTA의 면역억제 활성을 이용하여 종양 억제 치료제로 개발도 가능하지만, 본래 VISTA가 가지고 있는 면역억제 활성을 보다 더 높임으로서 GvHD (Graft versus Host Disease) 및 자가면역 질환의 치료제로 사용될 수도 있다. 마우스 VISTA에 대한 항체가 야생형 T-세포 (wild type T-cell)에 의해 유도되는 GvHD를 억제할 수 있음이 밝혀진 것이 예라고 할 수 있다 (Files, DB et al., 2011). 이것은 에피토프 (epitope)에 의하여 항체의 활성이 아고니스트 (agonist) 또는 안타고니스트 (antagonist)로 작용할 수 있음을 보여준다. 따라서, VISTA에 대한 항체를 선별하는데 있어서 두 가지의 기능을 가진 항체를 선별할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 항-VISTA 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 VISTA에 목적하는 결합력을 나타내는 항-VISTA 항체를 개발하고, 이러한 항-VISTA 항체가 목적하는 면역항암제 또는 자가면역질환 치료제의 역할을 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 VISTA에 대한 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 종양 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체와 병용투여하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 7, 13 및 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR1,

서열번호 2, 8, 14 및 20으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2, 및

서열번호 3, 9, 15 및 21로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및

서열번호 4, 10, 16 및 22로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR1,

서열번호 5, 11, 17 및 23으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2, 및

서열번호 6, 12, 18, 24, 34 내지 40으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, VISTA (V-domain Ig Suppressor of T-cell Activation)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 종양 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종양 또는 자가면역질환 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VISTA의 면역억제 기작 방해 용도 및 이를 통한 종양의 예방 또는 치료 용도, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VISTA의 면역억제능을 증가시키는 용도 및 이를 통한 자가면역질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체와의 병용투여용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체와 함께 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명은 더욱이, 종양 치료에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체와 병용투여하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 항-VISTA 항체 또는 이의 항원 결합단편은 VISTA에 목적하는 결합력을 나타내며, 목적하는 암/종양 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명을 통해 기존의 면역체크포인트를 표적으로 하는 치료제와 다른 표적 포인트를 가진 치료제를 개발함으로써, 종양을 치료하는데 있어서 기존 치료제와의 병용 치료 및 단독 치료법을 제공할 수 있고, 면역활성을 억제하는 체크포인트의 활성을 강화함으로써 새로운 면역억제 치료법을 제공할 수 있다.

도 1은 VISTA를 발현하고 있는 CHO-K1 세포에 단클론 scFv 파지를 반응시켜 VISTA 발현 세포와 단클론 scFv 파지가 결합하는지 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 선별된 항-VISTA 항체와 인간 및 마우스 VISTA 항원의 교차반응성 (cross reactivity)이 존재하는지 여부를 확인하기 위한 ELISA 측정 결과이다.
도 3은 인간 및 마우스 VISTA를 발현하고 있는 CHO-K1 세포에 선별된 항-VISTA 항체와 결합력을 확인한 결과이다.
도 4는 인간말초혈액 allo-MLR 반응에서 생산된 IFN-γ를 ELISA 방법으로 측정한 결과이다.
도 5는 항-VISTA 항체 투여군에서 유의한 체중 감소가 있음을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 항-VISTA 항체 투여군에서 유의한 종양 무게 감소가 있음을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 최적화 항-VISTA 항체의 기능을 평가하기 위해, 혼합림프구반응 시험법(mixed Lymphocyte Reaction, MLR)을 통해 유효하게 세포가 증식됨을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 최적화 항-VISTA 항체의 기능을 평가하기 위해, 혼합림프구반응 시험법(mixed Lymphocyte Reaction, MLR)을 통해 사이토카인 분비가 증가함을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 최적화 항-VISTA 항체 투여군에서 유의한 체중 감소가 있음을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 최적화 항-VISTA 항체 투여군에서 유의한 종양 무게 감소가 있음을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1, 7, 13 및 19로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR1,

서열번호 4, 10, 16 및 22로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR1,

서열번호 6, 12, 18, 24, 34 내지 40으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, VISTA (V-domain Ig Suppressor of T-cell Activation)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 VISTA에 특이적으로 결합하는 항-VISTA 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 VISTA에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.

"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.

상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.

상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.

중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.

"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.

본 발명에 있어, 상기 VISTA에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 33의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 35의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 36의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 37의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 38의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 39의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 40의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 9의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,

서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 및 서열번호 15의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는

서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2 및 서열번호 21의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 23의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.

"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.

"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.

"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.

VISTA 항체는 단쇄 또는 이중 쇄를 포함할 수 있다. 기능적으로, VISTA 항체의 결합 친화성은 10^-5M 내지 10^-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, VISTA 항체의 결합 친화성은 10^-6M 내지 10^-12 M, 10^-7 M 내지 10^-12 M, 10^-8 M 내지 10^-12 M, 10^-9 M 내지 10^-12 M, 10^-5M 내지 10^-11 M, 10^-6 M 내지 10^-11 M, 10^-7 M 내지 10^-11 M, 10^-8 M 내지 10^-11 M, 10^-9M 내지 10^-11 M, 10^-10 M 내지 10^-11 M, 10^-5M 내지 10^-10 M, 10^-6 M 내지 10^-10M, 10^-7 M 내지 10^-10 M, 10^-8 M 내지 10^-10 M, 10^-9M 내지 10^-10 M, 10^-5M 내지 10^-9 M, 10^-6 M 내지 10^-9M, 10^-7 M 내지 10^-9 M, 10^-8 M 내지 10^-9 M, 10^-5M 내지 10^-8 M, 10^-6 M 내지 10^-8M, 10^-7 M 내지 10^-8 M, 10^-5M 내지 10^-7 M, 10^-6 M 내지 10^-7M 또는 10^-5 M 내지 10^-6 M이다.

상기 VISTA에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 25, 27, 29, 31 및 49로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 VISTA에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 26, 28, 30, 32, 41 내지 48 및 50로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변영역;

서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 41의 경쇄 가변영역;

서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 42의 경쇄 가변영역;

서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 43의 경쇄 가변영역;

서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 44의 경쇄 가변영역;

서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 45의 경쇄 가변영역;

서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역;

서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 47의 경쇄 가변영역;

서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 48의 경쇄 가변영역;

서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 50의 경쇄 가변영역;

서열번호 49의 중쇄 가변영역 및 서열번호 48의 경쇄 가변영역;

서열번호 49의 중쇄 가변영역 및 서열번호 50의 경쇄 가변영역;

서열번호 27의 중쇄 가변영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변영역;

서열번호 29의 중쇄 가변영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변영역; 또는

서열번호 31의 중쇄 가변영역 및 서열번호 32의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.

"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.

파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.

섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.

파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.

파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.

파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.

고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 항-VISTA항체 클론 1B8의 친화도 증진을 위해 항체 최적화를 수행하였으며 1B8의 경쇄 CDR3와 중쇄 CDR3에 무작위 변이를 도입하고, 변이체 scFv 파지 라이브러리를 사용하여 바이오패닝한 결과, 서열번호 33 내지 40으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 가변영역 CDR3를 포함하는 8종의 최적화 클론을 얻을 수 있었다.

또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편은 VISTA를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-VISTA 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.

이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.

"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.

다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.

상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 항체는 IgG 또는 가변영역을 포함한 단편 즉 ScFv, Fab일 수 있다. 또한 중쇄의 가변영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 일 수 있다.

본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 VISTA에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 종양 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료방법일 수 있다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VISTA의 면역억제 기작 방해 용도 및 이를 통한 종양의 예방 또는 치료 용도일 수 있다.

상기 조성물에 적용되는 질환인 종양은 전형적으로 면역치료요법에 반응하는 종양 또는 암, 및 지금까지 면역요법에 관련되지 않은 종양 또는 암을 포함한다. 치료용으로 바람직한 종양 또는 암의 비-제한적인 예는 흑색종(예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들면, 투명세포암종), 전립선암(예를 들면, 호르몬 불응 전립선샘암종), 췌장샘암종, 유방암, 결장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부편평세포암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상샘암, 아교모세포종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 및 기타 신생물암종을 포함한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 치료할 수 있는 불응 또는 재발암을 포함한다.

본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 VISTA에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 자가면역질환 환자에 투여하는 단계를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료방법일 수 있다. 본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VISTA의 면역억제능을 증가시키는 용도 및 이를 통한 자가면역질환의 예방 또는 치료 용도일 수 있다.

상기 자가면역질환은 예를 들어, 백혈병; 만성피로 증후군; 이식편대숙주병(Graft-versus-host disease, GVHD); 통각과민; 염증성 장질환; 신경염증성 질환; 대뇌 국소빈혈을 포함하는 국소빈혈/재관류 손상, 각각 신경변성을 초래할 수도 있는 외상, 간질, 출혈 또는 발작의 결과로서의 뇌 손상; 당뇨병, 예를들어, 제 1 형 연소성 당뇨병; 다발성경화증; 안 질환; 동통; 췌장염; 폐섬유증; 류마티스성 질환, 예를들어, 류마티스양 관절염, 골관절염, 연소성(류마티스양) 관절염, 혈청반응음성 다발성관절염, 강직성 척추염, 라이터 증후군 및 반응성 관절염, 건선성 관절염, 장질환성 관절염, 다발성근염, 피부근염, 공피증, 전신성 경화증, 맥관염, 대뇌 맥관염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성 발열, 다연골염 및 다발성근육통, 류마티스성 및 거대세포 동맥염; 패혈증성 쇼크; 방사선요법으로 인한 부작용; 전신성 홍반성루푸스; 측두하악골 관절 질환; 갑상선염 등일 수 있다.

"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 또는 자가면역질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암의 발전의 억제, 암의 경감 또는 암의 제거, 또는 자가면역질환의 억제, 자가면역질환의 경감 또는 자가면역질환의 제거를 의미한다.

경우에 따라서, 상기 항체 이외에 다른 항암 치료제를 병용함으로써 종양 세포를 효과적으로 표적화하고, 항-종양 T 세포 활성을 증가시켜, 종양 세포를 표적화하는 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 기타 항-신생물제 또는 면역원성 제제[(예를 들면, 약화된 암 세포, 종양 항원(재조합 단백질, 펩타이드 및 탄수화물 분자를 포함함), 항원 전달 세포, 예를 들면, 종양 기원된 항원 또는 핵산으로 펄스된 가지세포, 면역 자극 사이토킨(예를 들면, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극 사이토킨을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포(예를 들면, GM-CSF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)]; 표준 암 치료요법(예를 들면, 화학 치료요법, 방사선치료요법 또는 수술); 또는 기타 항체(VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB, 및 ICOS를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)와 함께 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체와의 병용 투여용 조성물이다. 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체와 함께 환자에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 본 발명은 더욱이, 종양의 예방 또는 치료에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체와 병용투여하기 위한 용도에 관한 것이다.

상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체는 일정 시간 간격을 두고 별도로 투여할 수도 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 투여 전 또는 후 PD-1 항체 또는 PD-L1 항체가 별도로 투여될 수 있다.

상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-VISTA 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.

경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. VISTA에 결합하는 항체의 선별

VISTA에 결합하는 항체를 선별하기 위한 항체 라이브러리 및 라이브러리의 준비는 한국 공개특허 제10-2008-0109417호와 같은 자체의 인간 미감작 scFv (human naㅿve ScFv) 라이브러리를 이용하였다. 96-웰 면역 플레이트에 항원 (hVISTA-Fc, RND systems. Cat. No 7126-B7)을 2 mg/㎖로 100 ml씩 웰에 넣고 4℃ 오버나이트 (overnight) 시킨다. 다음날 항원 코팅 플레이트 (coating plate)는 PBS로 3번 워싱한 후 2% BSA 차단 버퍼 (blocking buffer) 200 ml를 넣고 실온에서 2시간 반응시킨다. 2x YT-TET(tetracycline 10㎍/㎖) 성장 배지 (growth medium) 2ml에 XL1-Blue 스톡 (stock) 50 ml를 넣고 37 ℃, 200 rpm에서 2시간 정도 키운 후 13 ml를 더 첨가하여 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 키워준다. 차단 (blocking) 2시간이 지나면 1XPBS로 3번 워싱한다. 워싱한 각 웰에 파지 라이브러리 그룹 (phage library group)을 합쳐 파지 라이브러리 양과 4% BSA 양을 동일하게 섞은 후 200 ml씩 첨가하여 실온에서 30분간 로킹(rocking)한 후 2시간을 반응시킨다. 파지 라이브러리 반응이 끝나면 상층액은 버리고 0.05% PBST로 5번 워싱하고 PBS로 5번 워싱해 각 웰에 100 mM TEA(trimethylamine) 100ml를 넣은 후 실온에서 10분간 흔들어준다. 10분 지나면 각 웰에 1M Tris(pH 7.5) 50 ml를 넣고 섞어준다. 상등액 (supernatant)은 OD₆₀₀ 0.5가 된 XL1-blue 10ml에 넣어 37℃에서 30분간 감염 (infection)시킨다. 감염이 끝나면 100 ml는 아웃풋 타이터 (output titer)로 사용하고 나머지는 7,000 rpm, 10분간 원심분리 한다. 상층액은 버리고 침전물은 라지 스퀘어 플레이트 (large square plate: CM 34㎍/㎖ + 1% Glucose)에 스프레딩 (spreading)하여 30℃에서 오버나이트 인큐베이션 (overningt incubation)한다. 아웃풋 타이터로 남겨둔 100ml는 1/10, 1/100, 1/1000으로 희석 (dilution)하여 CM 플레이트에 스프레딩하여 37℃에서 오버나이트한다. 다음날 스퀘어 플레이트에 자란 콜로니 (colony)는 2x YT 배지 50ml을 넣은 후 룹 (loop)을 사용하여 긁어 모은 후 7000 rpm, 10분 원심분리하여 상층액은 버리고 침전액 (precipitate)에 대하여 1차 패닝 스톡 (panning stock)을 만들고 2x YT 배양 배지 (growth media: CM 34㎍/㎖ + 1% Glucose) 100 ml을 500 ml 삼각플라스크에 넣은 후 OD₆₀₀ 0.2 되게 세포를 넣고 200 rpm, 37℃에서 OD 0.5가 될 때까지 키워준다. OD₆₀₀ 값이 0.5가 될 때까지 세포를 배양한 후에 헬퍼 파지 (helper phage: M13KO7 mutant)을 세포의 20배가 되게 넣어준다. 헬퍼 파지를 넣고 37℃, 30분 감염 (infection)시킨 후 7000 rpm, 10 min 원심분리 한다. 상층액을 버리고 세포는 2xYT 배지 (CM 34㎍/㎖ + Kan. 70㎍/㎖ + 1mM IPTG + 5mM MgCl₂) 100ml로 교체하여 넣어준 후 200 rpm, 30℃, 오버나이트한다. 다음날 자란 세포는 7000 rpm, 10분, 원심분리하고 같은 방법으로 한번 더 원심분리한다. 모은 상층액은 상층액의 1/5 (v/v) 20% PEG/2.5m NaCl 를 넣고 아이스 (ice)에서 1시간 침전시킨다. 침전시킨 후 7000 rpm, 1시간 원심분리한다. 상층액은 버리고 PBS 3ml로 침전액 (precipitate)을 풀어준 후 0.45 mm 필터 (filter)에 여과한 후 4℃에 보관하여 이를 다음 번 패닝 (panning) 과정에서 사용한다. 이 과정을 3~4번 반복하여 항원에 결합하는 항체를 ELISA를 수행하여 확인하였다.

실시예 2. Monoclonal ScFv phage ELISA

패닝 (panning) 과정이 끝나면 마지막 라운드 세포 스톡 (round cell stock)을 CM 아가 플레이트 (agar plate)에 200~500개의 콜로니가 형성될 수 있도록 희석하여 깔아준 후 37℃에서 오버나이트한다. 다음날 콜로니 (colony)가 자라면 96 웰 딥 플레이트 (96 well deep plate)에 2xYT 배지 (CM 34㎍/㎖ + 1% glucose) 200㎕를 넣고 각 웰에 콜로니를 하나씩 넣은 후 37℃, 3000rpm에서 오버나이트한다. 다음날 새로운 96 웰 딥 플레이트에 2xYT 배지 (CM 34㎍/㎖ + 1% glucose) 200㎕를 넣고 각 웰에 전날 키운 세포를 각 웰에 마다 20㎖씩 넣은 후 37℃, 3000rpm, 1시간 10분 키운다. 나머지 세포는 50% 글리세롤 100㎕씩 첨가하여 -70℃에 보관한다. 세포가 자라면 헬퍼 파지 1㎕와 2xYT 배지 19㎕를 섞은 후 각 웰에 20㎕씩 첨가 후 37℃에서 30분 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝나면 3000rpm, 10분 원심분리한다. 상층액을 버리고 2xYT 배지 (CM 34㎍/㎖ + Kan. 70㎍/㎖ + 1mM IPTG + 5mM MgCl₂) 200㎕를 넣고 메가그로우 (megagrow)에서 30℃, 3000rpm에서 오버나이트한다.

96 웰 면역 플레이트에 Ag (hVISTA-Fc, mVISTA-Fc) 1㎍/㎖로 만들어 100㎕/well씩 넣고 4℃에서 오버나이트한다. 다음날 전날 키운 세포는 3000rpm, 10분 원심분리하여 4℃에 보관한다. 깔아 놓은 Ag은 0.05% PBST로 3번 워싱한 후에 2% BSA 차단 버퍼 (blocking buffer) 200㎕씩 넣은 후 25℃ 2시간 인큐베이션한다. 차단 (blocking)이 끝나면 0.05% PBST로 3번 워싱 한다. 각 웰에 4% BSA 50㎕와 다운 (down)하여 4℃에서 보관했던 파지 50㎕을 섞은 후 실온에서 1시간 흔들어 반응시킨다. 파지 결합 (phage binding)이 끝나면 0.05% PBST로 3번 워싱한 후에 HRP-접합 마우스 항-M13 항체 1:3000 (HRP-conjugated mouse anti-M13 Ab) (#GE 27-9421-01)을 100㎕씩 넣은 후 25℃ 1시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 0.05% PBST로 3번 워싱한 후에 TMB(#BD TMB substrate reagent set 555214) 100㎕씩 넣은 후 3~5분 발색 시킨 후 정지 용액 (stop solution)을 50㎕씩 넣은 후에 ELISA 리더 (ELISA reader)로 분석한다.

[표 1] 패닝 과정이 끝난 후 VISTA 항원에 결합하는 monoclonal scFv phage를 선별하기 위하여 ELISA로 측정한 결과

선별된 항체는 다음 표 2와 같다.

[표 2]

[표 3]

실시예 3. Binding of anti-VISTA ScFV Phages to VISTA expressing CHO-K1 Cells

선별된 항체가 VISTA를 발현하고 있는 세포에 결합하는지 확인하기 위하여 인간 VISTA 및 마우스 VISTA를 발현하는 CHO-K1 세포를 제작하였다. 제작된 세포를 FACS 버퍼 (2% FBS, 0.05% sodium azide in PBS)에 4x10⁶cells/ml로 만들어 96 웰 딥 플레이트에 50 ml씩 넣은 후 파지 인큐베이션 (phage induction)한 파지 상층액을 50 ml씩 넣고 실온에서 1시간 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝나면 각 웰에 FACS 버퍼를 400 ml씩 첨가한 후 2000 rpm, 5분간 원심분리한다. 상층액은 버리고 anti-M13 antibody (1:1000)를 100 ml씩 넣은 후 4℃에서 1시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 각 웰에 FACS 버퍼 400 ml씩 첨가한 후 2000rpm, 5분간 원심분리한다. 상층액을 버리고 anti-mouse IgG-PE antibody(1:500)를 100 ml씩 넣은 후 4℃에서 1시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 각 웰에 FACS 버퍼 400 ml씩 첨가한 후 2000rpm, 5분간 원심분리한다. 상층액을 버리고 FACS 버퍼 200 ml씩 넣은 후 FACS (Beckton Dickinson, FACSCalibur)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이 선별된 항체들은 모두 인간VISTA를 과발현 시키도록 제조된 CHO-K1세포에 모두 결합이 되는 것이 확인되었다. 음성대조군으로 사용된 6A6는 결합하지 않았으며, 양성대조군으로 사용된 VISTA 항체 (rnd systems #FAB71261A)는 예상대로 세포에 결합을 잘 하였다.

실시예 4. 항 VISTA IgG발현

선별한 scFv 파지의 IgG형태로의 전환은 분자생물학적 기법을 사용하여 수행하였다. 선별한 E. Coli 클론에서 파지미드 (Phagemid)를 추출, 제한효소 Sfi I (R0123, New England Biolabs, US)으로 이중절단하여 중쇄 가변영역 DNA 단편을 확보하였으며, 중쇄 불변영역을 포함하는 벡터 pIgGHD-6A6Hvy를 Sfi I 처리 후 가변영역 DNA 단편을 삽입하였다. 동일한 방법으로 파지미드를 제한효소 BstX I (R0113, New England Biolabs)으로 이중절단하여 경쇄 가변영역 DNA 단편을 확보하였고, 경쇄 불변 영역을 포함하는 pIgGLD-6A6Lgt 벡터를 BstX I으로 이중절단 후 가변영역 DNA 단편을 삽입하여 IgG 형태의 DNA 클로닝을 완료하였다.

IgG의 일시 발현은 Expi293F 발현 시스템 키트 (Expi293F expression system kit: Thermo Fisher Scientific, US)을 사용하였다. Kit에 포함된 Expi293 세포를 전용 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 환경 하에서 125 rpm 오비탈 쉐이커 상 부유배양 하였다. 3일마다 3 X 10⁵ cells/ml 되도록 계대배양 하였으며, 발현 벡터 도입시에는 3 X 10⁶ cells/ml 되도록 세포수를 조정한 후 사용하였다. 유전자 도입은 전용 시약인 Expifectamine을 사용하였으며, 세포현탁액 1 ml 당 발현 벡터 DNA 1 mg과 Expifectamine 2.7 μl을 함유하는 Lipid-DNA 복합체를 제작, 세포현탁액에 첨가하였으며, 도입 16-18시간 후 인헨서 (Enhancer) 1/2를 첨가하여 발현을 유도하였다. 이후 동일 조건에서 3-4일간 배양 후 원심분리하여 IgG 함유 상등액을 취하였다.

실시예 5. 항-PD-L1 항체의 정제

취득한 상등액을 Protein A 컬럼(GE Healthcare)에 주입하여 친화력 크로마토그래피를 통해 IgG를 정제하였다. 컬럼을 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 7.0)으로 평형화 시킨 후 상등액을 주입, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% polysorbate 20 (pH 7.0) 용액으로 세정한 후, 50 mM NaCl, 0.1 M glycine-HCl (pH 3.5)로 용출 후 1 M Tris로 중화하였다. 용출된 단백질은 MWCO 10,000 spectra/por dialysis membrane (Spectrum Labs, US)를 사용한 투석 과정을 통해 PBS로 용매를 교체하였다. 이후 Vivaspin (Satorius, DE)을 사용하여 필요 농도로 농축하여 분주 후 -80℃에서 보관하였다.

정제 후 각 항체는 비환원 및 환원 LDS 샘플 버퍼 (Non-reducing 및 Reducing LDS sample buffer: Thermo Fisher Scientific)에 처리하여 NuPAGE System (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 전기영동 하였다. 그 결과 50 kDa의 중쇄 및 25 kDa의 경쇄 사슬을 포함하는 총 분자량 약 150 kDa의 IgG를 획득하였다.

실시예 6. Anti-VISTA 항체의 항원에 대한 결합력

선별된 항체의 항원에 대한 결합력을 Octet (Fortebio)을 이용하여 측정하였다. 이를 위하여 항체를 바이오센서 (biosensor)에 고정 (immobilize)한 후 다양한 농도의 항원을 96웰에 넣고 측정하였다.

[표 4] 선별된 항-VISTA 항체와 VISTA 항원의 결합력을 측정하기 위하여 다양한 농도로 항원과의 결합력을 확인한 결과

실시예 7. Anti-VISTA 항체의 human 및 mouse VISTA에 대한 cross reactivity

ELISA assay : 96 웰 플레이트에 Ag (human VISTA-Fc, mouse VISTA-Fc)을 각각 1㎍/㎖로 만들어 100㎕/well씩 넣어 4℃에서 오버나이트한다. 다음날 깔아 놓은 Ag은 0.05% PBST로 3번 워싱한 후에 2% BSA 차단 버퍼 (blocking buffer) 200㎕씩 넣은 후 25℃ 2시간 인큐베이션한다. 차단 (blocking)이 끝나면 0.05% PBST로 3번 워싱한다. 각 항체를 1㎍/㎖로 만들어 100㎕/well씩 넣고 25℃ 1시간 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝나면 0.05% PBST로 3번 워싱한 후에 goat anti-human IgG(kappa) peroxidase conjugated 1:2000 (bethyl lab #A80-115P)을 100㎕씩 넣은 후 25℃ 30분 인큐베이션시킨다. 인큐베이션이 끝나면 0.05% PBST로 3번 워싱한 후에 TMB(BD TMB substrate reagent set #555214) 100㎕씩 넣은 후 3~5분 발색 시킨 후 정지 용액 (stop solution) 50㎕씩 넣은 후에 ELISA 리더 (ELISA reader)로 분석한다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서와 같이 선별된 항체들은 모두 인간 VISTA에 결합을 하였으며, 이중 2C12 항체는 인간 VISTA외에도 마우스 VISTA에 결합을 잘 함을 확인하였다.

FACS assay : CHO-K1 세포에서 인간 및 마우스 VISTA 과발현을 확인하기 위해 FACS 버퍼(2% FBS, 0.05% sodium azide in PBS)에 5x10⁶/㎖ (5X10⁵cells/100㎕/FACS tube)로 만들고 선별된 항체는 2㎍/㎖ 만들어 FACS 튜브에 세포와 항체를 각각 100㎕씩 넣은 후 4℃에서 30분 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝나면 각 튜브에 FACS 버퍼 2㎖씩 첨가한 후 1500rpm, 5분간 원심분리한다. 상층액을 버리고 Goat anti-human IgG-Fc PE conjugated(A80-248PE) 1:500으로 만들어 각 튜브에 100㎕씩 넣은 후 4℃에서 20분 반응시킨다. 양성 대조군 (positive control)은 hVISTA 과발현 (overexpression) 세포(sample과 동일양) 에 APC-conjuagted anti-hVISTA (R&D #71261A) 5㎕를 넣고 마우스는 mVISTA 과발현 세포(sample과 동일양)에 APC-conjugated anti-mVISTA (Biolegend #143710) 1㎕를 넣은 후 4℃에서 20분 반응시킨다. 반응이 끝나면 각 웰에 FACS 버퍼 2㎖씩 첨가한 후 1500rpm, 5분간 원심분리한다. 상층액을 버리고 FACS 버퍼 200㎕씩 넣은 후 BD FACSCalibur을 이용하여 분석한다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, VISTA를 과발현하도록 제조된 CHO-K1 세포에 선별된 anti-VISTA를 처리하였을 때, ELISA에서와 마찬가지로 모든 선별된 항체들은 인간 VISTA가 표면에 발현하는 CHO-K1과 결합을 하였으며, 2C12 항체는 마우스 VISTA가 표면에 발현하는 CHO-K1과도 결합하였다.

실시예 8. Anti-VISTA 항체의 Allo-MLR assay

사람의 말초혈액 50㎖을 공여자로부터 채취하여 2mM EDTA가 포함된 PBS로 3배 희석한다. 새로운 50㎖ 튜브에 피콜 플라크 (ficoll-paque: GE #17-1440-03) 15㎖을 넣고 희석된 혈액 30㎖을 천천히 올려준 후 2,000rpm에서 40분간 원심분리한다. PBMCs 층을 회수하여 50㎖ 튜브에 옮기고, 워싱 버퍼 (2% FBS와 10 mM HEPES를 포함한 RPMI1640 배지)를 채워서 1,600rpm에서 10분간 원심분리 함으로써 세포를 씻어준다. 원심분리 후 상층액을 버리고 반복해서 씻어준다. 원심분리 후 남은 세포 펠렛 (pellets)은 50㎖의 워싱 버퍼로 풀어 단일세포로 만든 후, 세포 스트레이너 (strainer : 40 um)를 이용하여 죽은 세포 덩어리를 제거한다. Allo-MLR의 응답자 (responder)로 사용할 세포 (공여자 A 혹은 B)는 4 x 10⁶ cells/㎖ 농도로 MLR 배지 (10% FBS, 10 mM HEPES, 1 mM pyruvate, NEAA(100X), 2 mM L-glutamine, 1% antibiotics, 10^-5M β-ME를 포함한 RPMI1640 배지)에 희석한다. 자극제 (stimulator)로 사용할 세포 (공여자 B 혹은 A)는 미토마이신 C (mitomycine C : MMC)를 처리하여 세포 증식을 억제한다. 상세한 방법은 다음과 같다. 자극제 (stimulator)로 사용할 세포를 50㎖ 튜브에 4 x 10⁶ cells/㎖ 농도로 MLR 배지에 희석한 후, MMC를 25㎍/㎖ 되도록 첨가하여 37℃에서 30분 반응시킨다. 반응이 끝난 후 워싱 버퍼를 50㎖ 튜브 가득 채운 후, 1200rpm, 10분간 원심분리하여 씻어준다. 이 과정을 4번 반복하여 MMC를 완전히 제거한다. 마지막으로 4 x 10⁶ cells/㎖ 농도가 되도록 MLR 배지에 희석한다. 준비된 세포들은 각각 2 x 10⁵cells/well (50㎕)이 되도록 96 웰 세포 배양 플레이트에 분주한다. 분석할 항체를 최종 농도 30㎍/㎖과 10㎍/㎖이 되도록 50㎕를 첨가한다. 각 항체의 농도별로 3웰씩 시험한다. 그리고 37℃ CO₂ 인큐베이터 (incubator)에서 5일간 배양한 후, 50㎕의 세포배양 상층액은 IFN-γ 생산량 측정을 위해 따로 보관하고, 나머지 세포는 세포 증식을 분석한다. 세포 증식은 allo-MLR 후 남아 있는 세포에서 생성되는 ATP의 양을 측정함으로써 분석한다. 상세한 방법은 다음과 같다. 100㎕ (세포배양액과 동량)의 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 용액을 배양된 세포에 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킴으로써 세포를 용해시킨다. 광도계 (luminometer)로 세포 생존도 (viability)를 측정한다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이 비특이적 항체 (whole IgG)를 처리한 군 보다 더욱 많은 인터페론-감마의 발현을 유도하는 것은 competitor (양성대조군)와 1B8 클론이었으며, 다른 클론들은 모두 whole IgG 보다 낮은 인터페론-감마 발현을 유도하였다. 즉, 이 클론들은 인터페론-감마의 발현을 억제하는 클론이다. 이중 2C12, 1A12, 3C5는 우수한 인터페론-감마의 발현 억제능을 보여주었다.

실시예 9. 항-VISTA 항체의 항종양 활성

항-VISTA항체의 항 종양 활성을 평가하기 위해 인체 유래 유방암 세포주인 MDA-MB-231 유방 지방 (mammary fat)을 패드 (pad)에 이식한 NSG 마우스에서 인간 PBMC와 JNJ61610588, pembrolizumab, 항-VISTA mAb 1B8 치료제들의 미정맥 투여에 의한 항암 약효를 평가하고자 하였다. 실험은 한국생명공학연구원 실험동물자원센터와 공동 진행하였다.

인체 유래 유방암 세포주 MDA-MB-231(breast cancer cell line)를 해동 (thawing)한 후 CO₂인큐베이터 (Forma, USA) 내에서 온도 37℃와 CO₂농도5%로 맞춰서 배양하였다. 배양 최종일에 모든 암세포를 수거하여 계수하고 무혈청 배지 (serum-free media)를 이용하여 세포 농도를 3X10⁷cells/ml로 조절하였다. 이렇게 조절된 세포 배양액을 마우스 유방 지방 패드 좌/우 2 부위에 각각 0.1 ml(3X10⁶cells/mouse)씩 주입하였다.

암세포 이식 후 군별평균 종양 크기가 46.9mm³ 도달했을 때 A type(각군의 1번 마우스), B type(각군의 2번 마우스), C type(각군의 3번 마우스), D type(각군의 4번 마우스), E type(각군의 5번 마우스) 및 F type(각군의 6번 마우스)의 PBMC(4X10⁷cells/ml)를 마우스당 0.16 ml (0.64X10⁷cells/mouse)씩 미정맥 경로로 주입하였다.

PBMC 분리는 사람의 말초혈액 50㎖을 공여자로부터 채취하여 2mM EDTA가 포함된 PBS로 3배 희석 후 새로운 50㎖ 튜브에 피콜 플라크 (ficoll-paque: GE #17-1440-03) 15㎖을 넣고 희석된 혈액 30㎖을 천천히 올려준 후 2,000rpm에서 40분간 원심분리하였다. PBMCs 층을 회수하여 50㎖ 튜브에 옮기고, 워싱 버퍼 (2% FBS와 10 mM HEPES를 포함한 RPMI1640 배지)를 채워서 1,600rpm에서 10분간 원심분리 함으로써 세포를 씻어주었다. 원심분리 후 상층액을 버리고 반복해서 4회 반복하여 씻어주었다. 원심분리 후 남은 세포 펠렛 (pellets)은 50㎖의 워싱 버퍼로 풀어 단일 세포로 만든 후, 마지막으로 2 x 10⁷ cells/㎖ 농도가 되도록 PBS 배지에 희석하였다.

마우스 군 구성 및 투여는 PBMC 주입 수 약물투여 시작 하였으며 1군 PBMC + human whole IgG (control), 2군 PBMC + competitor (JNJ 61610588), 3군 PBMC + pembrolizumab, 4군 PBMC + anti VISTA mAb(1B8), 5군 PBMC + pembrolizumab + anti VISTA mAb(1B8)으로 각 군 5mg/kg으로 미정맥 투여하였다.

PBMC 주입 후 약물은 바로 첫 투여 개시하였으며 2회/주 투여 스케줄로 마우스당 0.2ml씩 총 7회 미정맥 투여하였다.

모든 동물에 대하여 투여 개시시 및 시험기간 중 투여 직전 일반증상 관찰 및 체중 변화 종양 크기 변화를 측정하였다.

종양 크기 변화는 암세포 이식 수 군별평균 종양 크기가 46.9 mm³ 도달 시부터 25일째까지 총 12회 개체별로 vernier caliper를 이용하여 좌/우 종양의 3 방향을 측정한 후 lengthXwidthXheight/2의 계산식으로 표현하였다.

약물 투여 개시 25일째 군당 건강한 마우스를 3수 선발하여 안와정맥에서 채혈(EDTA tube)한 뒤 CO₂가스를 이용하여 마우스를 치사시킨 후 spleen를 적출하여 PBS에 고정하였고, 종양은 우측과 좌측으로 나누어 분리하여 chemical balance에 무게를 측정 한 뒤 사진 촬영 후 각각 액체질소와 포르말린에 고정하였다.

그 결과, 모든 그 결과 모든 투여군에서 시험기간 동안 특이한 일반증상은 관찰되지 않았으나, 용매 대조군 (PBMC+PBS) 2번 마우스와 PBMC+Anti-VISTA mAb 1B8 투여군 5번 마우스가 각각 day 17과 21부터 최종일까지 초기 체중에 비하여 체중 감소가 나타났다 (표 5 및 도 5).

[표 5] 날짜별 마우스의 체중 변화(%)

약물투여 개시 후 25일째 MDA-MB-231 종양 (tumor)을 절제하여 그 무게를 측정한 결과 용매대조군 (PBMC + human whole IgG)과 비교하여 PBMC+JNJ61610588(5 mg/kg), PBMC+ pembrolizumab(5 mg/kg), PBMC+ Anti-VISTA mAb 1B8(5 mg/kg) 및 PBMC+ pembrolizumab+Anti-VISTA mAb 1B8(5+5 mg/kg) 투여군에서 각각 18.9%(p<0.05), 32.9%(p<0.001), 37.8% (p<0.001) 및 60.6%(p<0.001)의 통계적으로 유의한 종양무게 감소가 있었다 (표 6, 도 6).

[표 6] 종양크기 변화 및 최종일 종양무게

Significant figures(t-TEST) : * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 (vs PBMC+PBS)

^†△t=Vt-Vo, Vt(Measurement of the tumor volume), Vo(Initial tumor volume)

^‡ Inhibition Rate (vs PBMC+PBS)

실시예 10. 친화도 증진을 위한 변이체 제작 및 선별

항-VISTA항체 클론 1B8의 친화도 증진을 위해 항체 최적화를 수행하였다. 1B8 원래 DNA 서열을 80% 보존하며 랜덤화(randomize)시키는 소프트-랜덤화(soft-randomization)법을 활용하여, 1B8의 경쇄 CDR3와 중쇄 CDR3에 무작위 변이를 도입한 프라이머를 제작하였다. 이를 사용한 PCR을 통해 변이가 도입된 1B8의 경쇄 가변영역, ME4의 중쇄 가변영역 코딩 DNA 단편을 확보하였다. 이 DNA 단편을 각각 1B8 scFv 파지 파지미드의 경쇄 가변영역과 중쇄 가변영역에 치환하여, 1B8 경쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리와 중쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 각각 제작하였다.

변이체 scFv 파지 DNA 라이브러리를 페놀-클로로포름 정제 후 전기천공법을 사용하여 대장균주 XL-1 Blue에 형질전환 하였다. 형질전환 효율 분석 및, DNA 서열 분석을 통해 다양성이 확보된 것을 확인한 후, 500 ml 규모로 배양하여 파지 발현을 유도하고, PEG-침전법을 이용하여 1B8 경쇄 CDR3 변이체 scFv 파지 라이브러리를 제작하였다.

각 변이체 scFv 파지 라이브러리를 사용하여 실시예 1에서 제시한 방법으로 바이오패닝을 실시하였다. 그 후 선별과정에서는 결합을 유지하는 능력의 정량적 평가지표로서 scFv의 해리 속도 상수 kdis를 측정하였다. 그 결과 선별된 최적화 클론 7종은 1B8의 중쇄 가변영역을 유지하였다. 선별된 최적화 클론 7종에 대한 해리 속도 상수 측정 결과(표 7)와 아미노산 서열(표 8 및 표 9)를 도시하였다.

최적화 항-VISTA 항체의 7종의 해리속도 상수 측정결과 가장 좋은 항-VISTA.H2의 CDR3부분의 N((Aps)을 Y(Tyr)로 치환하여 PMC-309.3.3 서열을 확보하였으며 PMC-309.3.3의 서열을 IMGT 소프트웨어 (http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/)를 이용하여 인간 점라인 (germline) 염기서열과 비교 분석한 결과, 중쇄 가변영역은 IGHV1-69*06 으로부터 유래된 것임을 알 수 있었다. 점라인 그룹의 IGHV1-69*06의 아미노산 서열과 비교한 결과 골격영역 (framework region, FR)의 아미노산 4개 잔기들이 치환된것으로 분석되었다. 이를 토대로 항원 결합성은 유지하면서 폴딩효율을 높이기 위해 FR 부분을 치환하여 효율을 높인 PMC 309.3.4를 생산하였다. PMC 309.3.4의 구체적 서열은 표 10에 표시된 바와 같다.

[표 7]

[표 8]

[표 9]

[표 10]

실시예 11. 최적화된 항-VISTA항체의 물리화학적 특성 분석

각 최적화 scFv 파지 클론을 IgG 형태로 변환하였다. 구체적인 형태 변환을 위한 DNA클로닝 및 생산, 정제 방법은 실시예 4와 실시예 5에 제시한 것과 동일한 방법을 이용하였다.

이 중 생산성이 떨어지는 클론은 배재하고 최적화된 항-VISTA 항체의 결합 강도를 평가 하기 위해 Octet을 사용하였으며 실험은 실시예 6에서 제시한 방법과 동일한 방법으로 측정하였다(표 11). 표 11에 따르면, 최적화를 통해 인간 VISTA에 대한 결합력이 크게 상승한 것을 확인할 수 있었다.

[표 11]

실시예 12. 최적화된 항-VISTA 항체의 Allo-MLR assay

최적화된 항체의 기능 평가를 위해 in vitro 상에서 말초혈액내에 포함되어 있는 면역세포들의 반응성을 측정하기 위하여 혼합림프구반응 시험법 (mixed Lymphocyte Reaction, MLR)을 실시예 8번에서 제시한 방법과 동일한 방법으로 진행 하여 세포의 증식과 사이토카인 (IFN-γ) 유도함을 확인하였다.

그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다. 도 7 및 도 8에 따르면, PMC-309.3.3 약물이 비교군보다 훨씬 우월하며, 농도 의존적 세포의 증식과 사이토카인 분비가 증가함을 확인하였다.

실시예 13. 최적화 항-VISTA 항체의 항종양 활성

항-VISTA항체의 항 종양 활성을 평가하기 위해 인체 유래 유방암 세포주인 MDA-MB-231 유방 지방 (mammary fat)을 패드 (pad)에 이식한 NSG 마우스에서 실시예 7에 제시된 방법과 동일한 방법으로 진행하여 인간 PBMC와 JNJ61610588, PMC-309.3.3, anti-VISTA 3.4를 포함하여 경쇄 가변영역을 교환한 약물 (PMC-309.3.4W, PMC-309.3.4SA)에 대한 미정맥 투여에 의한 항암약효를 평가하였다.

그 결과, 표 12, 표 13, 도 9 및 도 10에 따르면 혼합 림프 반응에서의 결과와 일치하는 PMC-309.3.3 이 가장 높은 항암 활성을 나타내었다.

[표 12]

[표 13]

Significant figures: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 (vs PBMC+whole IgG)

^†△t=Vt-Vo, Vt(Measurement of the tumor volume), Vo(Initial tumor volume)

^‡Inhibition Rate (vs PBMC+whole Ig)

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Pharmabcine Inc. <120> Anti-VISTA antibody and Use Thereof <130> 227 <150> KR 17/136632 <151> 2017-10-20 <160> 50 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain CDR1 of 1B8 <400> 1 Gly Gly Ser Ser Ser Asn Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain CDR2 of 1B8 <400> 2 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy-chain CDR3 of 1B8 <400> 3 Ala Lys Gly Ala Ile Glu Pro Trp Pro Phe Tyr Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain CDR1 of 1B8 <400> 4 Asn Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain CDR2 of 1B8 <400> 5 Asp Val Asn 1 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light-chain CDR3 of 1B8 <400> 6 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Leu Val 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> 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Claims

서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 33의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 34의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 35의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 36의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 37의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 38의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 39의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 4의 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 40의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 8의 중쇄 CDR2 및 서열번호 9의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 10의 경쇄 CDR1, 서열번호 11의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 12의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 및 서열번호 15의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 16의 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 18의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는
서열번호 19의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2 및 서열번호 21의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 22의 경쇄 CDR1, 서열번호 23의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, VISTA (V-domain Ig Suppressor of T-cell Activation)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
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제1항에 있어서, 서열번호 25, 27, 29, 31 및 49로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
제1항에 있어서, 서열번호 26, 28, 30, 32, 41 내지 48 및 50로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
제5항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
제6항의 발현벡터로 형질전환된, 분리된 세포주.
다음 단계를 포함하는 VISTA에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
(a) 제7항의 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
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