JP6985295B2 - 向上した性能を有する変異体ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

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Description

配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
本発明は、親ポリペプチドと比して向上した特性を有する変異体ポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリペプチドの製造方法、および、このポリペプチドの使用方法に関する。
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプン、ならびに、他の直鎖および分岐１，４−グリコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する。
洗剤、製パン、醸造、例えば異性化糖の調製またはデンプンからのエタノール製造の一部におけるデンプン液化および糖化などの数々の公知の用途におけるα−アミラーゼの産業的な使用には長い歴史がある。α−アミラーゼのこれらの用途および他の用途は公知であり、特に細菌性α−アミラーゼといった微生物由来のα−アミラーゼが利用される。
初期の細菌性α−アミラーゼであって、広範に特徴付けられていると共にこの酵素について結晶構造が決定されてきているＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌとしても公知である）が用いられるもののうち、ＴｅｒｍａｍｙｌおよびＳＰ７０７などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のアミラーゼが、洗剤における用途が見出されているα−アミラーゼの特定の群を構成している。これらの公知の細菌性アミラーゼの多くは、特定の用途におけるその機能を向上させるために修飾されている。
α−アミラーゼの性能を高める方法はかなり研究されている。従来技術においては、特に置換が、単独で、または、組み合わせによって性能を向上させる効果を有することが記載されている。例えば、国際公開第２０１５／１８９３７１号パンフレット（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）においては、向上した性能を有するα−アミラーゼ変異体が開示されている。
環境上の理由から、洗浄、食器洗浄および／またはクリーニングプロセスにおける温度を下げることはますます重要になっている。しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素が、低温洗浄において通常用いられる温度よりも高い至適温度を有する。α−アミラーゼは洗剤組成物において用いられる重要な酵素であり、その使用は、ランドリーの洗濯または食器洗浄の最中におけるデンプン質の汚れを除去するためにますます重要となっている。従って、温度が低い場合であっても洗浄性能、汚れ除去効果および／または活性が保持されるα−アミラーゼ変異体を見出すことが重要である。しかしながら、現在の洗剤酵素組成物の効率にも関わらず、多くの汚れは完全に除去することが困難である。これらの問題は、低い洗浄温度（例えば冷水）および短期間の洗浄サイクルの使用が増加することにより複雑な問題となっている。それ故、低温下で機能することが可能であり、同時に特定の活性（デンプン分解活性）、洗浄性能および／または安定性などの他の望ましい特性が維持または増加可能であるデンプン分解酵素を得ることが望ましい。
それ故、本発明は、親ポリペプチドと比した場合に、特定の活性などの向上した特性を示す、α−アミラーゼ活性を有する変異体ポリペプチドを提供することを目的とする。
本発明は、その親ポリペプチドと比して、α−アミラーゼ活性および特定の活性などの向上した特性を有する変異体ポリペプチドを提供する。
一態様において、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチド変異体に関し、前記ポリペプチド変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
さらなる態様において、本発明は、ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド、宿主細胞、ポリペプチド変異体を含む組成物、ポリペプチド変異体の使用、および、ポリペプチド変異体の製造方法に関する。
定義
α−アミラーゼ：本明細書において用いられるところ、「α−アミラーゼ活性」という用語は、デンプンならびに他の直鎖および分岐１，４−グルコシドオリゴ糖および多糖類の加水分解を触媒する酵素群を構成する、α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）の活性を指す。本発明の目的のために、α−アミラーゼ活性は、実施例に記載されている手法に従って測定される。一態様において、本発明のポリペプチド変異体は、以下に記載されている配列番号：１、５、６、７、８、９もしくは１０、または、配列番号３の成熟型ポリペプチド（配列番号３の成熟型ポリペプチドは本明細書において配列番号１として列挙されている）のポリペプチドのα−アミラーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％を有する。
配列番号１（ＡＡＩ１０−成熟タンパク質）
Figure 0006985295
 配列番号３（ＡＡＩ−１０完全長）
Figure 0006985295
ここで、下線を付した太字のアミノ酸は、アミノ酸配列の予測されたシグナルペプチドを表す。
配列番号５（ＡＡ５６０）
Figure 0006985295
 配列番号６（ＳＰ７２２）
Figure 0006985295
 配列番号７（融合タンパク質１）
Figure 0006985295
 配列番号８（融合タンパク質２）
Figure 0006985295
 配列番号９（ＬＡＳＢ００００）
Figure 0006985295
 配列番号１０（ＳＰ７０７）
Figure 0006985295
α−アミラーゼ活性：本明細書において用いられるところ、「α−アミラーゼ活性」という用語は、α−アミラーゼの活性を指し、ここで、活性は、実施例に記載の手法に従って測定される。α−アミラーゼ活性は、実施例２に記載されているＰｈａｄｅｂａｓを用いる方法に従って測定され得る。
アミノ酸：本明細書において用いられるところ、「アミノ酸」という用語は、標準的な２０種の遺伝的にコードされたアミノ酸、および、「ｄ」型（天然「ｌ」型と比して）のその対応する立体異性体、ω−アミノ酸、他の天然アミノ酸、非従来型アミノ酸（例えば、α，α二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸等）、ならびに、化学的に誘導されたアミノ酸を指す。１種以上のアミノ酸の化学的誘導体は、官能側基を伴う反応により達成され得る。このような誘導された分子は、例えば、遊離アミノ基が誘導されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基が形成されている分子を含む。遊離カルボキシル基は、誘導されて、塩、メチルおよびエチルエステル、または、他のタイプのエステルおよびヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。また、化学誘導体としては、２０種の標準的なアミノ酸の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドが含まれる。例えば：４−ヒドロキシプロリンがプロリンを置換し得；５−ヒドロキシリシンはリシンを置換し得；３−メチルヒスチジンがヒスチジンを置換し得；ホモセリンがセリンを置換し得、および、オルニチンがリシンを置換し得る。誘導体はまた、必要とされる活性が維持される限りにおいては、１つ以上の付加または欠失を含有するペプチドを含む。他の含まれる変性は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えばアセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンを伴う）等といった末端変性である。
アミノ酸が「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」など特定的に列挙されている場合は、この用語は、他に明記されていない限り、Ｌ−アラニンおよびＤ−アラニンの両方を指す。他の非従来型アミノ酸はまた、所望の官能特性がポリペプチドによって保持される限りにおいては、本発明のポリペプチドの好適なコンポーネントであり得る。示されているペプチドについて、コードされたアミノ酸残基の各々は、適切な場合、従来のアミノ酸の慣用名に対応する１文字の記号によって表される。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含むかＬ−アミノ酸から構成される。
アミノ酸モチーフ：本明細書において用いられるところ、「アミノ酸モチーフ」または「モチーフ」という用語は、ポリペプチドの特定的に定義されたアミノ酸ストレッチを指す。それ故、アミノ酸モチーフは、親ポリペプチドにおける短いアミノ酸配列に関する。本発明によれば、アミノ酸モチーフは配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応する配列番号２に対応し、および、ＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）と表記される。モチーフは、本明細書に記載の配列アラインメントによって本明細書に開示されている親ポリペプチドのいずれにも見出されることが可能である。
ｃＤＮＡ：本明細書において用いられるところ、「ｃＤＮＡ」という用語は、真核または原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されることが可能であるＤＮＡ分子を指す。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。
コード配列：本明細書において用いられるところ、「コード配列」という用語は、変異体のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを指す。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧなどの開始コドンで開始され、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはこれらの組み合わせであり得る。
制御配列：本明細書において用いられるところ、「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を指す。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して在来（すなわち、同一の遺伝子由来）もしくは外来（すなわち、異なる遺伝子由来）のものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてもよい。
対応する：本明細書において用いられるところ、「対応する」という用語は、特定のアミノ酸配列に対して参照がなされている配列の特定のアミノ酸を決定する方法を指す。例えば、本発明の目的のために、特定のアミノ酸位置に対して参照がなされている場合、他のアミノ酸配列においてどの特定のアミノ酸が目的のものであり得るかを決定するために、参照がなされている前記アミノ酸配列に対して前記他のアミノ酸配列をアラインメントすることが当業者は可能であろう。例えば、配列番号１、３、５、６、７、８、９もしくは１０に前出の配列、または、本明細書において列挙されているいずれかの他の配列に対する他のアミノ酸配列のアラインメントは、本明細書において他の箇所において記載されている。代替的なアラインメント法を使用し得、これらは当業者に周知である。
食器洗浄組成物：本明細書において用いられるところ、「食器洗浄組成物」という用語は、硬質面をクリーニングするためのすべての形態の組成物を指す。本発明は、いずれかの特定のタイプの食器洗浄組成物またはいずれかの特定の洗剤に限定されるものではない。それ故、一実施形態において、食器洗浄組成物は、液体食器洗浄組成物、粉末食器洗浄組成物であり、ここで、組成物は、任意選択により単位投与量の形態であり得る。
酵素洗浄力による有益性：本明細書において用いられるところ、「酵素洗浄力による有益性」という用語は、酵素を含まない同一の洗剤と比して洗剤に対して酵素が付加し得る有利な効果を指す。酵素によってもたらされることが可能である重要な洗浄力による有益性は、洗浄および／またはクリーニング後に視認可能な汚染物がないかほとんどない汚れ除去、洗浄プロセスで遊離した汚染物再付着の防止または低減（再付着防止とも呼ばれる効果）、元々は白色であったが反復的な使用および洗浄の後に灰色がかったもしくは黄色がかった外観となってしまった生地の白色度の完全なまたは部分的な回復（白色化とも呼ばれる効果）である。触媒による汚れ除去もしくは汚染物の再付着防止に直接関係はしない、生地の取り扱いによる有益性（Ｔｅｘｔｉｌｅ ｃａｒｅ ｂｅｎｅｆｉｔ）もまた酵素洗浄力による有益性に重要である。このような生地の取り扱いによる有益性の例は、一の織物から他の織物へ、もしくは、同一の織物の他の部分への移染の防止もしくは低減（移染防止または逆汚染防止とも呼ばれる効果）；ピル性を低減するための織物表面からの突出繊維もしくは破断繊維の除去、または、既に存在しているピルもしくは毛羽の除去（抗ピルとも呼ばれる効果）；織物柔軟性の向上；織物の色の清澄化；および、織物もしくは衣服の繊維中に詰まった粒状の汚染物の除去である。酵素漂白はさらなる酵素洗浄力による有益性であり、ここで、触媒活性は、一般に、過酸化水素もしくは他の過酸化物などの漂白成分の形成を触媒するために用いられる。
発現：本明細書において用いられるところ、「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含む、変異体の産生に関与するいずれかのステップを指す。
発現ベクター：本明細書において用いられるところ、「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ、その発現をもたらす制御配列作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を指す。
断片：本明細書において用いられるところ、「断片」という用語は、配列番号：１、３、５、６、７、８、９または１０などの本明細書に開示されている親配列のいずれか１つの成熟型ポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端に存在しない１つ以上の（例えば、数々の）アミノ酸を有するポリペプチドを指し；ここで、この断片はα−アミラーゼ活性を有する。一態様において、断片は、例えば配列番号１、３、５、６、７、８、９または１０の少なくとも３００の隣接するアミノ酸残基または少なくとも３５０の隣接するアミノ酸残基または少なくとも４００の隣接するアミノ酸残基または少なくとも４５０の隣接するアミノ酸残基といった、配列番号１、３、５、６、７、８、９または１０の少なくとも２００の隣接するアミノ酸残基を含有する。
硬質面クリーニング：本明細書において用いられるところ、「硬質面クリーニング」という用語は硬質面のクリーニングを指し、ここで、硬質面は、床、机、壁、屋根等、ならびに、自動車（自動車洗浄）および食器（食器洗浄）などの硬質の物体の表面を含み得る。食器洗浄は、これらに限定されないが、プレート、カップ、ガラス、ボール、スプーン、ナイフ、フォークなどのカトラリー、配膳用具、セラミック、プラスチック、金属、陶磁器、ガラスおよびアクリルのクリーニングを含む。
宿主細胞：本明細書において用いられるところ、「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等に対する感受性を有するいずれかの細胞タイプを指す。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞とは等しくない親細胞の子孫のいずれかを包含する。
強度値：洗浄性能は、白色の光を照射した際のサンプルからの反射光の強度として表される輝度として計測される。サンプルが汚れている場合、きれいなサンプルのものよりも反射光の強度は低い。従って、反射光の強度を用いて洗浄性能を計測することが可能であり、ここで、より高い強度値がより高い洗浄性能と相関する。色の計測は、洗浄した生地のイメージを撮像するために用いられるプロ用の平面スキャナ（Ｋｏｄａｋ ｉＱｓｍａｒｔ，Ｋｏｄａｋ）で行われる。スキャンしたイメージからの光強度の値を抽出するために、イメージからの２４ビットピクセル値をレッド、グリーンおよびブルー（ＲＧＢ）の値に変換する。強度値（Ｉｎｔ）は、ＲＧＢ値をベクターとして一緒に加算し、次いで、得られるベクターの長さから算出される。
Figure 0006985295
向上した特性：本明細書において用いられるところ、「向上した特性」という用語は、親と比して向上した変異体に関連する特徴を指す。このような向上した特性としては、これらに限定されないが、洗浄性能および保管条件下での安定性が挙げられる。向上した特性は、安定性などの本明細書において定義および記載されているもののいずれかであり得る。
単離された：本明細書において用いられるところ、「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態または環境にある物質を指す。単離された物質の非限定的な例としては、（１）いずれかの非天然物質、（２）特にこれらに限定されないが、自然界において関連している天然構成成分の１種または複数種もしくはすべてが少なくとも部分的に除去されたいずれかの酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補助因子を含むいずれかの物質；（３）自然界において見出される物質と相対的に人工的に修飾されたいずれかの物質；または、（４）自然界においては関連している他の成分に対する物質の量を増やすことにより修飾されたいずれかの物質（例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然界で関連しているプロモータより強力なプロモータの使用）が挙げられる。単離された物質が発酵ブロスサンプルに存在していてもよい。
成熟型ポリペプチド：本明細書において用いられるところ、「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾後における、その最終形態にあるポリペプチドを指す。宿主細胞が、同一のポリヌクレオチドから発現される、２種以上の異なる成熟型ポリペプチドの混合物（すなわち、異なるＣ−末端および／またはＮ−末端アミノ酸を伴う）を産生し得ることは技術分野において公知である。
成熟型ポリペプチドコード配列：本明細書において用いられるところ、「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、α−アミラーゼ活性を有する成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
修飾：「修飾」という用語は、本発明のポリペプチドの文脈において、アミノ酸の挿入または欠失、好ましくは少なくとも１つの欠失によって、基準アミノ酸配列（すなわち、配列番号：１、３、５、６、７、８、９または１０）中の１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸よる置換で改変されることを意味する。「修飾」、「改変」および「突然変異」という用語は同義的に用いられ得ると共に、本発明の範囲内において同一の意味および目的を構成し得る。
核酸構築物：本明細書において用いられるところ、「核酸構築物」という用語は、一重螺旋または二重螺旋を有する核酸分子を指し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、または、合成され、１つ以上制御配列を含む。
作動可能にリンク：本明細書において用いられるところ、「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列を発現させるよう、ポリヌクレオチドのコード配列と相対的に適切な位置に制御配列が位置する構造を指す。
親または親α−アミラーゼ：本明細書において用いられるところ、「親」または「親α−アミラーゼ」という用語は、配列番号：１、３、５、６、７、８、９もしくは１０のα−アミラーゼ、または、配列番号：１、３、５、６、７、８、９もしくは１０のいずれかのポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するいずれかのα−アミラーゼを指す。親アミラーゼはまた、配列番号：１、３、５、６、７、８、９または１０の断片を含むポリペプチドであり得る。親α−アミラーゼは、配列番号：７、８および９のものなどのα−アミラーゼ活性を有する融合ポリペプチドであり得る。
デンプン改質：「デンプン改質」という用語は、本明細書において用いられるところ、紙産業における紙パルプの製造過程でデンプンが分解されるプロセスを指す。紙の糊抜きは、紙パルプの至適粘度を達成するために紙産業プロセスにおいて用いられ得る。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスであり得る。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
あるいは、用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、および、ＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスであり得る。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
サブ配列：本明細書において用いられるところ、「サブ配列」という用語は、成熟型ポリペプチドコード配列の５’および／または３’末端に不在である１つ以上（例えば数々の）ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを指し；ここで、サブ配列はα−アミラーゼ活性を有する断片をコードする。
生地：生地サンプルＣＳ−２８（綿上の米デンプン）は、Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手される。
生地の取り扱いによる有益性：本明細書において用いられるところ、「生地の取り扱いによる有益性」という用語は、触媒による汚れ除去もしくは汚染物の再付着防止に直接関係はしないと定義され、これも酵素洗浄力による有益性に重要である。このような生地の取り扱いによる有益性の例は、一の生地から他の生地へ、または、同一の生地の他の部分への移染の防止もしくは低減（移染防止または逆汚染防止とも呼ばれる効果）；ピル性を低減するための生地表面からの突出繊維もしくは破断繊維、または、既に存在しているピルもしくは毛羽の除去（抗ピルとも呼ばれる効果）；生地柔軟性の向上；生地の色の清澄化；および、生地の繊維中に詰まった粒状の汚染物の除去である。酵素漂白はさらなる酵素洗浄力による有益性であり、ここで、触媒活性は、一般に、過酸化水素もしくは他の過酸化物もしくは他の漂白種などの漂白成分の形成を触媒するために用いられる。
変異体：「変異体」または「ポリペプチド変異体」または「ポリペプチド」という用語は、本発明の変異体と関連して用いられる場合、本明細書において用いられるところ、突然変異、すなわち、配列番号：１、３、５、６、７、８、９または１０の「親」α−アミラーゼに対する１つ以上の（例えば数々の）位置における置換、挿入および／または欠失といった突然変異を含むα−アミラーゼ活性を有するポリペプチドを指し、好ましくは、突然変異は本明細書において定義されているモチーフである。本発明に係る変異体はまた、本明細書において定義されているモチーフ以外の突然変異をさらに含んでいてもよい。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；および、挿入とは、ある位置のアミノ酸に直に続くように隣接したアミノ酸の付加を意味する。本発明の変異体は、配列番号１、２、または３の成熟型ポリペプチドのα−アミラーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも１００％の活性を有する。
野生型α−アミラーゼ：本明細書において用いられるところ、「野生型」α−アミラーゼという用語は、自然界において見出されるバクテリア、イースト菌または糸状真菌などの天然微生物によって発現されたα−アミラーゼを指す。
従来の変異体の決定
α−アミラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、本明細書の他の箇所に列挙されている配列番号：１、３、５、６、７、８、９および１０のいずれかに示されている、主にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するα−アミラーゼの変異体に相当する。
本発明のポリペプチドにおける変異体（すなわち突然変異化）アミノ酸は、配列番号１のアミノ酸番号（これは、バチルス属の一種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の成熟タンパク質ＡＡＩ１０に対応する）を参照することにより定義される。アミノ酸配列モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）は、以下に、示されている配列番号１の在来のアミノ酸（ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は配列番号２に記載されている）に下線を付した太字で示されている。
配列番号１
Figure 0006985295
 本発明の目的のために、配列番号１に開示されている成熟型ポリペプチドは、他のα−アミラーゼポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を決定するために用いられる。しかしながら、本明細書に開示されているいずれかの他の配列の配列もまた、他のα−アミラーゼポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を決定するために用いられ得ることを当業者は認識するであろう。他のα−アミラーゼのアミノ酸配列が配列番号１に開示されている成熟型ポリペプチドとアラインされ、このアラインメントに基づいて、配列番号１に開示されている成熟型ポリペプチドにおけるいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）において実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて、判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
他のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、特にこれらに限定されないが、ＭＵＳＣＬＥ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｙ ｌｏｇ−ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ；バージョン３．５以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７９２−１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：５１１−５１８；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３７：３９−６４；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：１８９９−１９００）、および、ＣｌｕｓｔａｌＷを採用するＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０）を含む数々のコンピュータプログラムを、それぞれのデフォルトパラメータを利用して用いることで、複数のポリペプチド配列のアラインメントによって判定することが可能である。
配列番号１の成熟型ポリペプチドから他のα−アミラーゼが分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを使用することが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つ以上の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９による方法が、アライン未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８−９６）または組み合わせ拡張法（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６−５６７）。
本発明のα−アミラーゼ変異体の説明において、下記に記載の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているＩＵＰＡＣの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
置換：アミノ酸置換に関しては、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、例えば、アラニンによる位置２２６におけるスレオニンの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と示されている。複数の突然変異は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」はそれぞれ、位置２０５および４１１における、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による置換、および、セリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換を表している。
欠失：アミノ酸欠失に関しては、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、＊。位置１８１における従って、グリシンの欠失は、「Ｓｅｒ１８１＊」または「Ｓ１８１＊」と示される。複数の欠失は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｓｅｒ１８１＊＋Ｔｈｒ１８２＊」または「Ｓ１８１＊＋Ｔ１８２＊」とされる。
挿入：アミノ酸挿入に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸１番、挿入されたアミノ酸２番；等］と示される。例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」と示される。
このような事例において、挿入されたアミノ酸残基には、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基に下付文字を付与することにより番号が付される。それ故、上記の例において配列は以下のとおりとなる。
Figure 0006985295
複数の改変：複数の改変を含む変異体は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」はそれぞれ、チロシンおよびグルタミン酸による位置１７０および１９５におけるアルギニンおよびグリシンの置換を表している。
異なる改変：異なる改変がある位置で導入可能である場合、異なる改変はコンマによって分けられており、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、チロシンまたはグルタミン酸による位置１７０におけるアルギニンの置換を表している。それ故、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を示す：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドに関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
一実施形態において、ポリペプチド変異体はさらに、配列番号１の位置１６７および１６８に対応する位置のいずれかに欠失を含む。
本発明は、公知のα−アミラーゼ変異体と比して特定の活性、洗浄性能および安定性などの向上した特性を有する、親ポリペプチドのポリペプチド変異体を提供する。
一実施形態において、ポリペプチド変異体は、配列番号１などの親ポリペプチドに対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、９０％など、９１％など、９２％など、９３％など、９４％など、９５％など、９６％など、９７％など、９８％など、９９％などであるが、１００％未満の配列同一性を有する。
一実施形態において、親ポリペプチドにおける配列番号２のＸ１は、Ｑ、ＫまたはＲである。それ故、一実施形態において、親ポリペプチドは、Ｑ、ＫまたはＲであるＸ１を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドにおける配列番号２のＸ２は、ＬまたはＦである。それ故、一実施形態において、親ポリペプチドは、ＬまたはＦであるＸ２を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドにおける配列番号２のＸ３は、Ａ、Ｎ、またはＧである。それ故、一実施形態において、親ポリペプチドは、Ａ、ＮまたはＱであるＸ３を含む。
一実施形態において、親ポリペプチドは、ＱであるＸ１、ＬであるＸ２、および、ＡであるＸ３を含む。
一実施形態において、親ポリペプチドは、ＫであるＸ１、ＬであるＸ２、および、ＮであるＸ３を含む。
一実施形態において、親ポリペプチドは、ＱであるＸ１、ＦであるＸ２、および、ＱであるＸ３を含む。
一実施形態において、親ポリペプチドは、ＲであるＸ１、ＬであるＸ２、および、ＮであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＱであるＸ１、ＬであるＸ２、および、ＮであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＱであるＸ１、ＬであるＸ２、および、ＱであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＱであるＸ１、ＦであるＸ２、および、ＡであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＱであるＸ１、ＦであるＸ２、および、ＮであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＫであるＸ１、ＬであるＸ２、および、ＡであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＫであるＸ１、ＬであるＸ２、および、ＱであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＫであるＸ１、ＦであるＸ２、および、ＡであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＫであるＸ１、ＦであるＸ２、および、ＮであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＫであるＸ１、ＦであるＸ２、および、ＱであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＲであるＸ１、ＬであるＸ２、および、ＡであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＲであるＸ１、ＬであるＸ２、および、ＱであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＲであるＸ１、ＦであるＸ２、および、ＡであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＲであるＸ１、ＦであるＸ２、および、ＮであるＸ３を含む。
他の実施形態において、親ポリペプチドは、ＲであるＸ１、ＦであるＸ２、および、ＱであるＸ３を含む。
一実施形態において、ポリペプチド変異体の修飾は少なくとも１つの欠失である。従って、ポリペプチド変異体は、同定されているモチーフにおける少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む。このような欠失はそれ自体がポリペプチド変異体の性能に対して効果を有することが見出された。特に、親ポリペプチドと比してポリペプチド変異体の特定の活性が向上していることが見出された。
一実施形態において、少なくとも１つの欠失は、配列番号２に記載されているアミノ酸モチーフのいずれかの２つのアミノ酸における２つの欠失である。
一実施形態において、ポリペプチドは：
ａ．配列番号３の成熟型ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号：１、５、６、７、８、９または１０のポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号４の成熟型ポリペプチドコード配列に対して少なくとも６０％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；および
α−アミラーゼ活性を有する、配列番号１、５、６、７、８、９もしくは１０のポリペプチド、または、配列番号３の成熟型ポリペプチドの断片
からなる群から選択される親ポリペプチドのポリペプチド変異体である。
一実施形態において、ポリペプチドは、親ポリペプチドのアミノ酸配列に対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
本発明のポリペプチド変異体は、１つ以上の追加の修飾を１つ以上の（例えば数々の）他の位置でさらに含んでいてもよい。
アミノ酸変異は、副次的な性質のものであり得、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／もしくは活性に顕著に影響しない保存的アミノ酸置換もしくは挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の小さな欠失；アミノ−端子メチオニン残基などの小さなアミノ−もしくはカルボキシル−末端伸長；２０〜２５個以下の残基の小さなリンカーペプチド；または、ポリヒスチジン配列、抗原性エピトープもしくは結合性ドメインなどの変異もしくは他の機能を変化させることによって精製を促進させる小さな伸長である。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および、小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は当技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。一般的な置換はＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
あるいは、アミノ酸変異は、ポリペプチドの物理化学的特性が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変異は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を改変し、至適ｐＨを変化させることであり得る。
ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するために［酵素］活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、関連するポリペプチドとのアラインメントから推測されることも可能である。
それ故、本発明のポリペプチド変異体は、置換、挿入および／または欠失などのさらなる修飾を含み得る。本発明のポリペプチド変異体は、このようなさらなる修飾を、向上した洗浄性能、向上した液化特性および向上した糊抜き特性などの向上した性能を有するポリペプチド変異体を得るために含み得る。
一実施形態において、本発明のポリペプチド変異体におけるさらなる修飾の数は、１〜３０、例えば１〜２０、例えば１〜１０および１〜５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の修飾などである。
それ故、一実施形態において、修飾の数は、１〜２０、１〜１０など、１〜５など、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の修飾などである。
従って、一実施形態において、ポリペプチド変異体は；１、７、１３、１４、１５、１６、１９、２０、２２、２６、２９、３０、３１、３２、４６、４８、５０、５１、５２、５３、５５、５９、６０、６４、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７８、９０、１００、１０７、１０８、１０９、１１２、１１３、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４４、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６３、１６４、１６５、１６６、１７８、１７９、１８１、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９１、１９４、１９９、２００、２０２、２０３、２０４、２０５、２１０、２１５、２１７、２１９、２２３、２３８、２４２、２４５、２５８、２６２、２６９、２７０、２７４、２８５、２８７、２９６、３１２、３１８、３２１、３２２、３２５、３３７、３４１、３４２、３４９、３５０、３６１、３６２、３６８、３６９、３７７、３８１、３８４、３８７、４００、４０８、４１５、４１８、４３５、４４５、４５４、４７７および４８１から選択されるいずれか１つ以上の位置にあり得るさらなる修飾を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従う。
一態様において、親ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドまたは配列番号３の成熟型ポリペプチドに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、または、１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、親ポリペプチドは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列番号１または３のポリペプチドに対する配列同一性を有する。一態様において、親ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０といった１０以下のアミノ酸で配列番号１または３のポリペプチドとは異なる。
一実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号５のポリペプチドに対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、または、１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、親ポリペプチドは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列番号５のポリペプチドに対する配列同一性を有する。一態様において、親ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０といった１０のアミノ酸で配列番号５のポリペプチドとは異なる。
一実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号６のポリペプチドに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、または、１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、親ポリペプチドは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列番号６のポリペプチドに対する配列同一性を有する。一態様において、親ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０といった１０のアミノ酸で配列番号６のポリペプチドとは異なる。
一実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号７のポリペプチドに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、または、１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、親ポリペプチドは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列番号７のポリペプチドに対する配列同一性を有する。一態様において、親ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０といった１０のアミノ酸で配列番号７のポリペプチドとは異なる。
一実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号８のポリペプチドに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、または、１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、親ポリペプチドは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列番号８のポリペプチドに対する配列同一性を有する。一態様において、親ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０といった１０のアミノ酸で配列番号８のポリペプチドとは異なる。
一実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号９のポリペプチドに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、または、１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、親ポリペプチドは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列番号９のポリペプチドに対する配列同一性を有する。一態様において、親ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０といった１０のアミノ酸で配列番号９のポリペプチドとは異なる。
一実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号１０のポリペプチドに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９６％など、少なくとも９７％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、または、１００％の配列同一性を有する。
一実施形態において、親ポリペプチドは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列番号１０のポリペプチドに対する配列同一性を有する。一態様において、親ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０といった１０のアミノ酸で配列番号１０のポリペプチドとは異なる。
他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸１〜４８５を含むか、または、これから構成される。
他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号３のアミノ酸１〜４８５を含むか、または、これから構成される。
他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号５のアミノ酸１〜４８５を含むか、または、これから構成される。
他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号６のアミノ酸１〜４８５を含むか、または、これから構成される。
他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号７のアミノ酸１〜４８５を含むか、または、これから構成される。
他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号８のアミノ酸１〜４８５を含むか、または、これから構成される。
他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号９のアミノ酸１〜４８５を含むか、または、これから構成される。
他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親α−アミラーゼは、配列番号１０のアミノ酸１〜４８５を含むか、または、これから構成される。
他の態様において、親α−アミラーゼは、少なくとも３７５アミノ酸残基、例えば、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０および少なくとも４６０アミノ酸残基を含有する、配列番号１の成熟型ポリペプチドの断片である。
他の態様において、親α−アミラーゼは、少なくとも１００アミノ酸残基、例えば、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００および少なくとも４５０アミノ酸残基を含有する、配列番号３の成熟型ポリペプチドの断片である。
他の態様において、親α−アミラーゼは、少なくとも１００アミノ酸残基、例えば、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００および少なくとも４５０アミノ酸残基を含有する、配列番号５の成熟型ポリペプチドの断片である。
他の態様において、親α−アミラーゼは、少なくとも１００アミノ酸残基、例えば、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００および少なくとも４５０アミノ酸残基を含有する、配列番号６の成熟型ポリペプチドの断片である。
他の態様において、親α−アミラーゼは、少なくとも１００アミノ酸残基、例えば、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００および少なくとも４５０アミノ酸残基を含有する、配列番号７の成熟型ポリペプチドの断片である。
他の態様において、親α−アミラーゼは、少なくとも１００アミノ酸残基、例えば、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００および少なくとも４５０アミノ酸残基を含有する、配列番号８の成熟型ポリペプチドの断片である。
他の態様において、親α−アミラーゼは、少なくとも１００アミノ酸残基、例えば、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００および少なくとも４５０アミノ酸残基を含有する、配列番号９の成熟型ポリペプチドの断片である。
他の態様において、親α−アミラーゼは、少なくとも１００アミノ酸残基、例えば、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００および少なくとも４５０アミノ酸残基を含有する、配列番号１０の成熟型ポリペプチドの断片である。
他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号１のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号３のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号５のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号６のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号７のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号８のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号９のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
他の実施形態において、親α−アミラーゼは、配列番号１０のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
配列番号：１、３、５、６、７、８、９もしくは１０のいずれか一つのポリペプチドまたはその断片は、技術分野において周知である方法に従って、異なる属もしくは種の系統から親α−アミラーゼをコードするＤＮＡを同定およびクローン化するために核酸プローブの設計に用いられ得る。特に、このようなプローブは、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、標準的なサザンブロッティング法の後に、対象の細胞のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを伴うハイブリダイゼーションに用いられ得る。このようなプローブは配列全体よりもかなり短くてもよく、例えば、長さが少なくとも２５、少なくとも３５または少なくとも７０ヌクレオチドと少なくとも１５ヌクレオチドであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチドまたは少なくとも９００ヌクレオチドの長さといった、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの両方が用いられることが可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。
このような他の菌株から調製したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブとハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の菌株由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。これらのライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡが、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移され固定化され得る。配列番号１またはそのサブ配列とハイブリダイズするクローンまたはＤＮＡを同定するために、キャリア材料がサザンブロットにおいて用いられる。
ポリペプチドは、一のポリペプチドの領域が、他のポリペプチドの領域のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
親は、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合ポリペプチドはまた、翻訳後に融合ポリペプチドが形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）。
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
親α−アミラーゼは、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされた親がソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された菌株によって生成されることを意味することとする。一態様において、親は、細胞外に分泌される。
親は細菌性α−アミラーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のα−アミラーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチドであり得る。
配列番号：１、３、５、６、７、８、９または１０のポリペプチド、ならびに、そのポリペプチド変異体は、技術分野において公知である方法によって人為的に製造され得る。
一態様において、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
本発明のポリペプチド変異体は、親ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有し得ると共に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０などの１〜２０の修飾などの多数の修飾を含む。特に、修飾の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の修飾などの１〜１０であり得る。修飾の数は、１、２、３、４または５などの１〜５の修飾であり得る。
実施例から分かるとおり、本発明のポリペプチド変異体は、親ポリペプチドと比して向上した特性を有することが示されている。
一実施形態において、ポリペプチド変異体は親ポリペプチドと比較して向上した特性を有し、ここで、向上した特性は、触媒効率、触媒速度、化学的安定性、酸化安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、特定の活性、保管条件下での安定性、基質結合、基質開裂、基質特異性、基質安定性、表面特性、熱活性および熱安定性からなる群から選択される。
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドと比して、向上した触媒速度を有する。
本明細書において用いられるところ、「触媒速度」という用語は、ポリペプチド変異体または親ポリペプチドが基質を分解する速度を指す。触媒速度は、例えば実施例の節に記載されているＧ７−ｐＮＰアッセイといったアミラーゼアッセイによって測定され得る。アミラーゼの触媒速度は、基質が律速因子ではない条件下（すなわち、分解／開裂のためのポリペプチドに対して過剰量）における、例えばＧ７−ｐＮＰ基質といった好適な基質における切断数として定義される。
ある実施形態において、変異体は親α−アミラーゼと比して向上した触媒効率を有する。
本明細書において用いられるところ、「触媒効率」という用語は、活性とされたポリペプチド変異体または親ポリペプチドの効率を指す。触媒効率は、例えば実施例の節に記載されているＧ７−ｐＮＰアッセイといったアミラーゼアッセイによって測定され得る。触媒効率は、例えば洗剤溶液中といった関連した条件下における反応の速度である。触媒効率が高ければ、同じ数の反応を実施するために要求される必要な酵素は少ない。
従って、本発明のポリペプチド変異体は親ポリペプチドと比して向上した触媒速度および触媒効率の両方を有し得、ここで、この両者は、実施例の節に記載されているアッセイによって測定され得るが、ポリペプチドの異なる特性を表し得る。
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は親ポリペプチドと比して向上した特定の活性を有する。
本明細書において用いられるところ、「特定の活性」という用語は、特定の条件下において単位時間当たりに酵素調製物によって生成物に転換される基質のモル数を指す。特定の活性は単位（Ｕ）／１ｍｇのタンパク質として表記される。特定の活性は、実施例２に記載されているとおり測定され得る。
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は親ポリペプチドと比して向上した基質活性を有する。
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドと比して向上した熱活性を有する。
本明細書において用いられるところ、「熱活性」という用語は、ポリペプチド変異体または親ポリペプチドが例えば熱応力または熱変化に曝された場合におけるポリペプチド変異体または親ポリペプチドの活性を指す。熱活性は実施例中に示されているものと同様に測定され得、すなわち、ポリペプチド変異体または親ポリペプチドを例えば６０℃といった高温で、例えば２時間といった所与の時間インキュベートし、次いで、α−アミラーゼ活性アッセイを用いることにより残存活性を測定する。
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドと比して向上した熱安定性を有する。
本明細書において用いられるところ、「熱安定性」という用語は、α−アミラーゼ変異体または親が６０℃などの特定の高温でテストされるか静置された場合におけるポリペプチド変異体または親ポリペプチドの安定性を指す。熱安定性は実施例中に示されているものと同様に測定され得、すなわち、組成物中のポリペプチド変異体または親ポリペプチドを例えば６０℃といった高温で、例えば２４時間といった所与の時間インキュベートし、次いで、α−アミラーゼ活性アッセイを用いることにより残存活性を測定する。
一実施形態において、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドと比して洗剤中において向上した安定性を有する。
本明細書において用いられるところ、「洗剤中における安定性」という用語は、ポリペプチド変異体または親ポリペプチドが洗剤組成物または配合物中にある場合におけるポリペプチド変異体または親ポリペプチドの安定性を指す。安定性は、実施例中に示されているものと同様に測定され得、すなわち、洗剤組成物中のポリペプチド変異体または親ポリペプチドを例えば２５℃といった特定の温度で、例えば２時間といった所与の時間インキュベートし、次いで、α−アミラーゼ活性アッセイを用いることにより残存活性を測定する。
一実施形態において、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドと比して向上したキレート剤安定性を有する。
それ故、一実施形態において、ポリペプチド変異体は向上した安定性を有し、ここで、安定性はＰｈａｄｅｂａｓアッセイにより測定される。従って、向上した安定性は、ポリペプチド変異体を１００ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝剤中に希釈するステップ、および、得られる青色の溶液を６２０ｎｍで分光測光法により計測するステップを含むアッセイにより測定され得る。
代替的な実施形態において、本発明は、配列番号１の位置１６７〜１７６に対応する位置に少なくとも１つの欠失を含む、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチド変異体に関し、ここで、変異体は、向上した特定の活性、ならびに、任意選択により向上した洗浄性能、および／または、安定性を有し、変異体は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
本発明の変異体の調製
本発明はまた、ポリペプチド変異体を得るための方法に関し、これは、親ポリペプチドにおいて、親ポリペプチドの配列番号１の位置１６９〜１７６に対応する１つ以上の位置で少なくとも１つの欠失を導入するステップを含み、ここで、前記ポリペプチドはα−アミラーゼ活性を有し；および、前記ポリペプチドを回収するステップを含む。
ポリペプチド変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。
部位特異的突然変異誘発は、親α−アミラーゼをコードするポリヌクレオチドにおける１つ以上の定義された部位に１つ以上（例えば、数々）の突然変異を導入する技術である。
部位特異的突然変異誘発は、所望される突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによりインビトロで達成可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親α−アミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中における部位での制限酵素による開裂を含むカセット突然変異誘発により、および、その後の、ポリヌクレオチド中に突然変異を含有するオリゴヌクレオチドの連結により、インビトロで行うことが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と、インサートとの互いの連結が可能とされる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９−４９５５；および、Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発はまた、当技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；および、Ｃａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。
部位特異的突然変異誘発法のいずれかを本発明において用いることが可能である。変異体の調製に用いることが可能である多数の市販キットが入手可能である。
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０−１０５４）により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組み換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、当技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明のポリペプチド変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
核酸構築物
本発明は、本発明のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。それ故、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つ以上の制御配列に作動的に結合された本発明のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有し、ここで、ポリヌクレオチドは、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つ以上の制御配列に作動的に結合されている。
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されて変異体の発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組み換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は当技術分野において周知である。
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ ａｎｄ Ｌｅｒｅｃｌｕｓ， １９９４， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４−９４；および、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。タンデムプロモータの例は国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに開示されている。
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸安定α−α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコα−アミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α−α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータ；非限定的な例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られたプロモータ；ならびに、そのミュータント、切断およびハイブリッドプロモータである。
イースト菌宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞に対する他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８により記載されている。
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
細菌性宿主細胞に好ましいターミネータは、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−α−アミラーゼ（ａｍｙＬ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）リボソーム性ＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から入手される。
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコα−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼおよびフザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）チトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られ得る。イースト菌宿主細胞の他の有用なターミネータが、前述のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２に記載されている。
制御配列はまた、プロモータの下流および遺伝子のコード配列の上流における、遺伝子の発現を高めるｍＲＮＡスタビライザ領域であり得る。
好適なｍＲＮＡスタビライザ領域の例は、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：３４６５−３４７１）から得られる。
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域であるリーダーであり得る。リーダー配列は、ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのリーダーが用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼおよびアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られ得る。
イースト菌宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
制御配列はまた、変異体コーディング配列の３’−末端に作動可能にリンクし、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに負荷するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列であり得る。宿主細胞において機能するポリアデニル化配列のいずれかが用いられ得る。
糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコα−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼおよびフザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様プロテアーゼの遺伝子から得られ得る。
イースト菌宿主細胞の有用なポリアデニル化配列が、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、ポリペプチド変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現ポリペプチド変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列が用いられてもよい。
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックα−アミラーゼ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７に記載されている。
糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコα−アミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼおよびリゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
イースト菌宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られ得る。他の有用なシグナルペプチドコード配列が、前述のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２により記載されている。
制御配列はまた、ポリペプチド変異体のＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は変異体のＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ−末端に隣接して位置されている。
宿主細胞の増殖に対した変異体の発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。イースト菌においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が用いられ得る。糸状菌においては、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコα−アミラーゼプロモータ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−α−アミラーゼプロモータおよびアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）グルコα−アミラーゼプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。
発現ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。それ故、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
本発明はまた、本発明のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組み換え型発現ベクターに関する。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する）、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む発現ベクターに関する。
種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組み換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含み得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
細菌性選択マーカーの例は、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシンもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。イースト菌宿主細胞の好適なマーカーとしては、これらに限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状真菌宿主細胞において使用される選択マーカーとしては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびに、これらの均等物が挙げられる。アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびに、ストレプトマイセスハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞における使用に好ましい。
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含むことが好ましい。
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組み換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組み換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組み換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組み換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
イースト菌宿主細胞において用いられる複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、および、ＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチド変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
上記の要素を連結して本発明の組み換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
宿主細胞
本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。それ故、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
本発明はまた、本発明のポリペプチド変異体を産生させる１つ以上の制御配列に作動的に結合された、本発明のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え型宿主細胞に関する。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有し、ここで、ポリヌクレオチドは、変異体を産生させる１つ以上の制御配列に作動的に結合されている。
ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、変異体の組み換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法により（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔法（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入により（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、電気穿孔法（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、天然コンピテンス（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９−２０７を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）行われ得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知である方法のいずれかを用いることが可能である。
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、または真菌細胞などの真核生物であり得る。
宿主細胞は真菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）ならびに、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）およびすべての栄養胞子形成真菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに定義されているとおり）を含む。
真菌宿主細胞はイースト菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「イースト菌」は、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌イースト菌を含み、イースト菌は、不完全菌類（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する。イースト菌の分類は将来において変更される可能性があるため、本発明の目的について、イースト菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）に記載されているとおりに定義されるものとする。
イースト菌宿主細胞は、クルイベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）またはヤロウイアリポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であり得る。
真菌宿主細胞は糸状真菌細胞であり得る。「糸状菌」は、真菌植物門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５で定義されているとおり）のすべてのフィラメント形を含む。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複雑な多糖類から組成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸展によるものであり、および、炭素異化は絶対好気性である。対照的に、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのイースト菌による栄養成長は単細胞葉状体の出芽によるものであり、および、炭素異化は発酵性であり得る。
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり得る。
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシスアネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシスカレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシスギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシスパンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシスリブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシススブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシススブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌスシネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルスヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビアラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツスエリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテスビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテスベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞であり得る。
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１４１９−１４２２に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。イースト菌は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；および、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０に記載の手法を用いて形質転換され得る。
生成方法
本発明はまた：（ａ）ポリペプチド変異体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ；および、（ｂ）ポリペプチド変異体を回収するステップを含むポリペプチド変異体の製造方法に関する。従って、本発明は、（ａ）親ポリペプチドにおいて、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応し、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を、変異体の発現に好適な条件下で導入するステップ；ならびに、（ｂ）ポリペプチド変異体を回収するステップにより、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドを製造する方法に関する。
宿主細胞は、当技術分野において公知である方法を用いてポリペプチド変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびに変異体の発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、または、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、当技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
ポリペプチド変異体は、ポリペプチド変異体に特異的な、当技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、これらに限定されないが、特定の抗体の使用、酵素産生物の形成、または、酵素基質の消失を含む。例えば、酵素アッセイを用いてポリペプチド変異体の活性を判定してもよい。
ポリペプチド変異体は当技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、採取、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。
ポリペプチド変異体は、実質的に純粋な変異体を得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
代替的な態様においては、ポリペプチド変異体は回収されず、ポリペプチド変異体を発現する本発明の宿主細胞がポリペプチド変異体のソースとして用いられ得る。
本発明の組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチド変異体を含む組成物に関する。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドを含む組成物に関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
好ましくは、組成物においてはこのような変異体が富化される。「富化される」という用語は、組成物のα−アミラーゼ活性が高められることを意味する（例えば、１．１の富化係数で）。
組成物は、ポリペプチド変異体を主酵素成分として含み得る（例えば、単成分組成物）。あるいは、組成物は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解性酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解性酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼなどの複数の酵素活性を含み得る。追加の酵素が、例えば、アスペルギルスアクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）といったアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；例えば、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｅｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）もしくはフザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）といったフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）；フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、例えば、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）もしくはフミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）；または、例えば、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）といったトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に属する微生物によって例えば生成され得る。
組成物は、技術分野において公知である方法に従って調製され得、また、液体または乾燥組成物の形態であり得る。例えば、組成物は、粒質物または微粒剤の形態であり得る。ポリペプチド変異体は、技術分野において公知である方法に従って安定化され得る。
洗剤酵素は、１種以上の酵素を含有する個別の添加剤を加えることにより、または、これらの酵素のすべてを含む複合添加剤を加えることにより、洗剤組成物に含まれていてもよい。本発明の洗剤添加剤（すなわち、個別の添加剤または複合添加剤）は、例えば、粒質物、液体、スラリー等として配合されることが可能である。好ましい洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非発塵性粒質物、液体、特に安定化された液体またはスラリーである。それ故、本発明はまた、本発明の変異体を、任意選択により非発塵性粒質物、安定化された液体または保護された酵素の形態で含む洗剤添加剤に関する。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドを含む洗剤添加剤に関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有し、任意選択により、ここで、洗剤添加剤は、非発塵性粒質物、安定化された液体または保護された酵素の形態である。
一態様において、本発明は、本発明のポリペプチド変異体を、１種以上の追加のクリーニング組成物成分と組み合わせて含む洗剤組成物に関する。従って、本発明は、１種以上の追加のクリーニング組成物成分と組み合わせて；α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドを含む洗剤組成物に関し、ここで、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
追加の成分の選択は当業者により、以下に記載されている例示的な非限定的な成分を含む従来の処方成分を含む。
成分の選択は、ランドリーなどの生地の取り扱いに関して、クリーニングされる生地のタイプ、汚染物のタイプおよび／または程度、クリーニングを行う温度、ならびに、洗剤生成物の配合に関する考慮が含まれ得る。以下に記載の成分は特定の官能基に従う一般的なヘッダによって分類されるが、当業者によって認識されるであろうとおり、成分は追加の官能基を含み得るために、これは限定として解釈されるべきではない。
従って、本発明はまた、クリーニング組成物である組成物に関する。
本発明に係る組成物は、界面活性剤、漂白剤、スルホン化ポリマーなどの分散性ポリマー、錯化剤、マンガン漂白剤触媒などの漂白剤触媒、結晶成長阻害剤、および／または、織物色調剤などの洗剤成分をさらに含み得る。
一実施形態において、組成物は、リン酸塩を含まない組成物である。
本発明の洗剤組成物は、例えば、本発明の酵素を１種以上の追加のＡＤＷ組成物成分との組み合わせで含むＡＤＷ（自動食器洗浄）組成物に関し得る。追加の成分の選択は当業者により、以下に記載されている例示的な非限定的な成分を含む従来の処方成分を含む。従って、一態様において、本発明は、本発明の変異体、および、任意選択により界面活性剤を含む手洗い用または機械洗い用食器洗浄洗剤組成物に関する。
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布地の前処理に好適なランドリー添加剤組成物およびリンスが追加された布地軟化剤組成物を含む手洗い用もしくは機械洗い用ランドリー洗剤組成物として配合され得、または、通所の家庭での硬質面クリーニング作業で使用される洗剤組成物として配合され得、または、手洗いもしくは機械洗いでの皿洗い作業用に配合され得る。従って、一態様において、本発明は、本発明に係る変異体を含む手洗い用または機械洗い用ランドリー洗剤組成物に関する。
特定の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む洗剤濃縮物／添加剤を提供する。洗剤添加剤、ならびに、洗剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他のデンプン分解酵素、例えば、他のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、ＣＧＴａｓｅおよび／またはセルラーゼ、マンナナーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ製のＭＡＮＮＡＷＡＹ（商標）など））、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、クチナーゼおよび／またはラッカーゼなどの１種以上の他の酵素を含み得る。
普通、選択される酵素の特性は選択される洗剤と適合性であるべきであり（すなわち、他の酵素処方成分および非酵素処方成分等と最適で親和性のｐＨ）、および、この酵素は有効量で存在しているべきである。
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼは、動物、野菜または微生物性由来のものを含む。微生物性由来のものが好ましい。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物性プロテアーゼまたはトリプシン−様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシンであって、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から誘導されたもの、例えば、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８（国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、国際公開第８９／０６２７０号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５８３号パンフレットに記載のトリプシン（例えば、ブタまたはウシ由来）およびフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼである。
有用なプロテアーゼの例は、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレットおよび国際公開第９８／３４９４６号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の１つ以上の位置に置換を伴う変異体である：２７、３６、５７、７６、８７、９７、１０１、１０４、１２０、１２３、１６７、１７０、１９４、２０６、２１８、２２２、２２４、２３５および２７４。好ましい市販されているプロテアーゼ酵素としては、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）（配列番号３）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）およびＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ製）、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ、ＭＡＸＡＰＥＭ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ ＯＸＰ（登録商標）、ＦＮ２（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）が挙げられる。
リパーゼ：好適なリパーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なリパーゼの例としては、例えば、欧州特許第２５８ ０６８号明細書および欧州特許第３０５ ２１６号明細書に記載のＨ．ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ．ラヌギノスス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ））または国際公開第９６／１３５８０号パンフレットに記載のＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）といったフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（同義語、テルモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ））由来のリパーゼ；例えば、Ｐ．アルカリ（Ｐ．ａｌｃａｌｉ）遺伝子またはＰ．シュードアルカリ（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉ）遺伝子（欧州特許第２１８ ２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１ ３７６号明細書）、Ｐ．スツツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス属の一種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＳＤ７０５株（国際公開第９５／０６７２０号パンフレットおよび国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）といったシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ；例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１３１：２５３−３６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（特開昭６４／７４４９９２号公報）またはＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（国際公開第９１／１６４２２号パンフレット）といったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼが挙げられる。
好ましい市販されているリパーゼ酵素としては、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（商標）およびＬＩＰＯＬＡＳＥ ＵＬＴＲＡ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
アミラーゼ：好適なアミラーゼ（αおよび／またはβ）は、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書により詳細に記載されているバチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特別な系統といった、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られるα−アミラーゼが挙げられる。有用なアミラーゼの例は、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９６／２３８７３号パンフレットおよび国際公開第９７／４３４２４号パンフレットに記載の変異体であって、特に、以下の１つ以上の位置に置換を伴う変異体である：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８および４４４。市販されているα−アミラーゼは、ＤＵＲＡＭＹＬ（商標）、ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（商標）およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ Ｓ１００、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ Ｓ１１０、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ Ｓ１０００（配列番号１１）、Ｅｘｃｅｌｌｅｎｚ Ｓ１１０、Ｅｘｃｅｌｌｅｎｚ Ｓ１０００、Ｅｘｃｅｌｌｅｎｚ Ｓ２０００、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）およびＰＵＲＡＳＴＡＲ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）である。
セルラーゼ：好適なセルラーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。好適なセルラーゼとしては、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびフザリウム オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生成された真菌セルラーゼといった、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼが挙げられる。特に好適なセルラーゼは、色の取り扱いに関する有益性を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第０ ４９５ ２５７、欧州特許第０ ５３１ ３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載されているセルラーゼである。他の例は、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０ ５３１ ３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレットおよび国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号パンフレットに記載されているものなどのセルラーゼ変異体である。
市販されているセルラーゼとしては、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）およびＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（登録商標）およびＰＵＲＡＤＡＸ ＨＡ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）およびＫＡＣ−５００（Ｂ）（登録商標）（花王株式会社）が挙げられる。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、例えば、Ｃ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）といったコプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、および、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレットおよび国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載されているものなどのその変異体が挙げられる。市販されているペルオキシダーゼとしては、ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
レキナーゼ（Ｌｅｃｈｉｎａｓｅ）／β−グルカナーゼ：好適なレキナーゼは細菌性または真菌性由来のものを含む。これらは、化学的に修飾されているか、または、タンパク質改変されていてもよい。有用なβ−グルカナーゼの例としては、国際公開第２０１５／１４４８２４号パンフレットに記載されているもの（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、および、国際公開第９９／０６５１６号パンフレットに記載されているもの（Ｈｅｎｋｅｌ ＫＧＡＡ）が挙げられる。
洗剤酵素は、１種以上の酵素を含有する個別の添加剤を添加することにより、または、これらの酵素のすべてを含む複合添加剤を添加することにより洗剤組成物中に含まれていてもよい。本発明の洗剤添加剤、すなわち、個別の添加剤または複合添加剤は、例えば、粒質物、液体、スラリー等として配合可能である。好ましい洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非発塵性粒質物、液体、特に安定化された液体、または、スラリーである。
非発塵性粒質物は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および米国特許第４，６６１，４５２号明細書に開示のとおり生成され得、任意により、当技術分野において公知である方法によりコーティングされてもよい。ワックス状コーティング材の例は、１０００〜２００００の平均モル重量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシドユニットを有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、および、１５〜８０個のエチレンオキシドユニットが存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；ならびに、脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による用途に対して好適なフィルム形成性コーティング材の例は英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールなどのポリオール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより安定化され得る。保護された酵素は、欧州特許第２３８ ２１６号明細書に開示されている方法に従って調製され得る。
本発明の洗剤組成物は、例えば、バー、錠剤、粉末、顆粒、ペーストまたは液体といったいずれかの簡便な形態であり得る。液体洗剤は水性であり得、典型的には、７０％以下の水および０〜３０％の有機溶剤を含有し、または、非水性であり得る。
洗剤組成物は、半極性を含むノニオン性および／またはアニオン性および／またはカチオン性および／または両性イオン性であり得る１種以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、典型的には、０．１％〜６０重量％のレベルで存在する。
含まれている場合、洗剤は通常、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキル硫酸エステル（脂肪族アルコール硫酸エステル）、アルコールエトキシ硫酸エステル、第２級アルカンスルホン酸、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸またはセッケンなどのアニオン性界面活性剤を約１％〜約４０％で含んでいるであろう。
含まれている場合、洗剤は通常、アルコールエトキシレート、ノニル−フェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミン−オキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノール−アミド、脂肪酸モノ−エタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、または、グルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルカミド」）などのノニオン性界面活性剤を約０．２％〜約４０％で含んでいるであろう。
洗剤は、ＭＧＤＡ、ＧＬＤＡ、ゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、カーボネート、クエン酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸または層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫＳ−６）。
洗剤は１種以上のポリマーを含んでいてもよい。例は、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、スルホン化ポリマーなどのポリカルボキシレート、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。
洗剤は、漂白触媒、例えば、Ｍｎ系またはＣｏ系、テトラアセチルエチレンジアミンまたはノナノイルオキシベンゼンスルホネートなどの過酸形成漂白剤活性化剤と組み合わされ得る、過ホウ酸塩または過炭酸塩などのＨ２Ｏ２供給源を含み得る漂白剤系を含有していてもよい。あるいは、漂白剤系は、例えば、アミド、イミドまたはスルホンタイプの過酸を含み得る。
本発明の洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコールもしくはグリセロールなどのポリオール、糖質もしくは糖質アルコール、乳酸、ホウ酸、もしくは、例えば芳香族ホウ酸エステルといったホウ酸誘導体、または、４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体といった従来の安定化剤を用いて安定化され得、および、組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７０８号パンフレットに記載されているとおり配合され得る。
洗剤はまた、クレイ、気泡増強剤、泡抑制剤、耐食剤、汚れ沈殿防止剤、再付着防止剤、染料、殺菌剤、光学増白剤、ヒドロトロープ、色あせ防止剤または芳香剤を含む例えば布コンディショナーなどの他の従来の洗剤処方成分を含有し得る。
ヒドロトロープは、疎水性化合物を水溶液（または、反対に、極性物質を非極性環境）中に可溶化させる化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水特性および疎水特性の両方を有する（いわゆる、界面活性剤から公知である両親媒性特性）が；しかしながら、ヒドロトロープの分子構造は、一般に、自発的な自己凝集を好まず、例えば、Ｈｏｄｇｄｏｎ ａｎｄ Ｋａｌｅｒ（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ＆ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２：１２１−１２８による概説を参照のこと。ヒドロトロープは、ミセル相、層状相または他の良好に画定されたメソ相を形成する界面活性剤および脂質について見出されるような、超えると自己凝集を生じる限界濃度を示さない。代わりに、多くのヒドロトロープは、凝集物の大きさが濃度の増加に伴って大型化する連続タイプの凝集プロセスを示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水、脂、界面活性剤およびポリマーの混合物を含む、極性および非極性特性の物質を含有する系の相挙動、安定性およびコロイド特性を改変させる。ヒドロトロープは、伝統的に、製薬、パーソナルケア、食品から技術的用途にわたり産業で用いられている。洗剤組成物中においてヒドロトロープを使用することにより、相分離または高粘度などの望ましくない現象を誘起することなく、例えば、界面活性剤のより濃縮された配合物（水を排除することにより液体洗剤をコンパクトにするプロセスのとおり）が可能となる。
洗剤組成物は、約５％〜約５０％などの約０〜６５重量％の洗剤ビルダーもしくはコビルダー、または、これらの混合物を含み得る。食器洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは、典型的には４０〜６５％、特に５０〜６５％である。ビルダーおよび／またはコビルダーは特に、ＣａおよびＭｇと共に水溶性錯体を形成するキレート化剤であり得る。ランドリー／ＡＤＷ／硬質面クリーニング洗剤における使用について技術分野において公知である任意のビルダーおよび／またはコビルダーを利用し得る。ビルダーの非限定的な例としては、ゼオライト、二リン酸塩（ピロリン酸塩）、三リン酸ナトリウム（ＳＴＰまたはＳＴＰＰ）などの三リン酸塩、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩、メタケイ酸ナトリウムなどの可溶性ケイ酸塩、層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製ＳＫＳ−６）、２−アミノエタン−１−オール（ＭＥＡ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ、２，２’−イミノジエタン−１−オールとしても知られている）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ、２，２’，２”−ニトリロトリエタン−１−オールとしても知られている）などのエタノールアミン、および、（カルボキシメチル）イヌリン（ＣＭＩ）、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
洗剤は、約１％〜約２０％などの０〜３０重量％の漂白系を含み得る。ランドリー／ＡＤＷ／硬質面クリーニング洗剤における使用について技術分野において公知である任意の漂白系を利用し得る。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光漂白剤、漂白剤活性化剤、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウムおよび過酸化水素―尿素（１：１）などの過酸化水素源、事前に形成した過酸、ならびに、これらの混合物が挙げられる。好適な事前に形成した過酸としては、これらに限定されないが、ペルオキシカルボン酸および塩、ジペルオキシジカルボン酸、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、例えば、オキソン（Ｒ）、ならびに、これらの混合物が挙げられる。漂白系の非限定的な例としては、例えば、過ホウ酸（通常は一水和物または四水和物）、過炭酸、過硫酸、過リン酸、過ケイ酸のナトリウム塩などのアルカリ金属塩を含む無機塩を、過酸−形成性漂白活性化剤と組み合わせて含み得るペルオキシド系漂白系が挙げられる。漂白剤活性化剤という用語は、本明細書において、過酸化水素と反応して過加水分解を介して過酸を形成する化合物を意味する。このようにして形成された過酸は、活性化された漂白剤を構成する。本明細書において用いられる好適な漂白活性化剤は、エステルアミド、イミドまたは無水物の分類に属するものを含む。好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ナトリウム４−［（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）オキシ］ベンゼン−１−スルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ）、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼン−１−スルホネート（ＬＯＢＳ）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼン−１−スルホネート、４−（デカノイル）安息香酸塩（ＤＯＢＳまたはＤＯＢＡ）、４−（ノナノイルオキシ）ベンゼン−１−スルホネート（ＮＯＢＳ）、および／または、国際公開９８／１７７６７号パンフレットに開示されているものである。対象の漂白活性化剤の特定のファミリーは欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、アセチルトリエチルシトレート（ＡＴＣ）が特に好ましいファミリーである。ＡＴＣまたは短鎖トリグリセリド様トリアシンは、環境にやさしいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルクエン酸およびトリアセチンは、保管に際して生成物における良好な加水分解安定性を有しており、効果的な漂白活性化剤である。最後に、過加水分解反応において遊離されるクエン酸がビルダーとして機能し得るために、ＡＴＣは多官能性である。あるいは、漂白系は、例えば、アミド、イミドまたはスルホンタイプのペルオキシドを含み得る。漂白系はまた、６−（フタルイミド）ペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含み得る。漂白系はまた、漂白触媒を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、漂白剤成分は、以下の式を有する有機触媒：
Figure 0006985295
 （ｉｉｉ）およびこれらの混合物（式中、各Ｒ１は、独立して、９〜２４個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜２４個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ１は、独立して、９〜１８個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜１８個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、より好ましくは各Ｒ１は、独立して、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イソノニル、イソデシル、イソトリデシルおよびイソペンタデシルからなる群から選択される）からなる群から選択される有機触媒であり得る。他の例示的な漂白系は、例えば、国際公開第２００７／０８７２５８号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２４４号パンフレット、国際公開第２００７／０８７２５９号パンフレット、欧州特許第１８６７７０８号明細書（ビタミンＫ）および国際公開第２００７／０８７２４２号パンフレットに記載されている。好適な光漂白剤は、例えばスルホン化亜鉛またはアルミニウムフタロシアニンであり得る。
好ましくは、漂白剤成分は、漂白剤触媒、特に有機漂白剤触媒に追加して、過酸の供給源を含む。過酸の供給源は、（ａ）事前に形成された過酸；（ｂ）過炭酸塩、過ホウ酸塩または過硫酸塩（過酸化水素源）（好ましくは、漂白剤活性化剤との組み合わせで）；および、（ｃ）ペルヒドロラーゼ酵素、ならびに、生地または硬質面処理ステップ中において、水の存在下にインサイツで過酸を形成するエステルから選択され得る。
洗剤は、０．５〜５％、２〜５％、０．５〜２％または０．２〜１％などの０〜１０重量％のポリマーを含み得る。洗剤における使用について技術分野において公知である任意のポリマーを利用し得る。ポリマーは、上記のとおりコビルダーとして機能し得、または、再汚染防止、繊維保護、汚染物遊離、移染防止、グリースクリーニングおよび／もしくは消泡特性を提供し得る。いく種かのポリマーは、上記の特性を２つ以上、および／または、下記のモチーフを２つ以上有し得る。例示的なポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、および、ＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡ、ポリアスパラギン酸およびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーなどのポリカルボキシレート、疎水性修飾ＣＭＣ（ＨＭ−ＣＭＣ）およびシリコーン、テレフタル酸とオリゴマー系グリコールとのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）とポリ（オキシエテンテレフタレート）とのコポリマー（ＰＥＴ−ＰＯＥＴ）、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）（ＰＶＰＯまたはＰＶＰＮＯ）およびポリビニルピロリドン−ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）が挙げられる。さらに例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ）およびジクオタニウムエトキシスルフェートが挙げられる。他の例示的なポリマーが、例えば国際公開第２００６／１３０５７５号パンフレットに開示されている。上記のポリマーの塩もまた想定される。
本発明の洗剤組成物はまた、染料または顔料などの布地色調剤を含んでいてもよく、これは、洗剤組成物に配合された場合に、前記布地が前記洗剤組成物を含む洗浄液と接触させられる際に布地に付着し、これにより、可視光の吸収／反射を介して前記布地の色合いを変えることが可能である。蛍光性白色化剤は少なくともいくらかの可視光を放つ。対照的に、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部分を吸収することで表面の色合いを変える。好適な布地色調剤としては、染料および染料−クレイ複合体が挙げられ、また、顔料もまた挙げられ得る。好適な染料としては、微小分子染料および高分子染料が挙げられる。好適な微小分子染料としては、例えば国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７５号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７６号パンフレットおよび欧州特許第１８７６２２６号明細書（本明細書において参照により援用される）に記載されている、Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌｕｅ、Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｄ、Ｄｉｒｅｃｔ Ｖｉｏｌｅｔ、Ａｃｉｄ Ｂｌｕｅ、Ａｃｉｄ Ｒｅｄ、Ａｃｉｄ Ｖｉｏｌｅｔ、Ｂａｓｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｂａｓｉｃ ＶｉｏｌｅｔおよびＢａｓｉｃ Ｒｅｄ、または、これらの混合物の染料索引（Ｃ．Ｉ．）分類に属する染料からなる群から選択される微小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％またはさらには約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色調剤を含むことが好ましい。組成物は、０．０００１重量％〜０．２重量％の布地色調剤を含み得、これは、組成物が単位用量ポーチの形態である場合に特に好ましい場合がある。好適な色調剤はまた、例えば国際公開第２００７／０８７２５７号パンフレットおよび国際公開第２００７／０８７２４３号パンフレットに開示されている。
洗剤組成物中においては、いずれかの酵素、特に本発明のαアミラーゼポリペプチドが、０．０１〜１００ｍｇの酵素タンパク質／１リットルの洗浄液、好ましくは０．０５〜５ｍｇの酵素タンパク質／１リットルの洗浄液、特に０．１〜１ｍｇの酵素タンパク質／１リットルの洗浄液に相当する量で添加され得ることがここでは予期される。
本発明のαアミラーゼポリペプチドは、本明細書において参照として援用されている国際公開第２００６／００２６４３号パンフレットに開示されている洗剤配合物に追加的に組み込まれてもよい。
使用
本発明はまた、本発明のポリペプチド変異体の使用方法に関する。使用は、洗剤、特にランドリー洗剤組成物および食器洗浄洗剤組成物におけるものであり得る。従って、本発明は、α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能、および、任意選択により向上した安定性を示すポリペプチドの使用に関し、前記変異体は、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフＱＳＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＲ（ここで、Ｘ１はＱ、ＫまたはＲであり、Ｘ２はＬまたはＦであり、および、Ｘ３はＡ、ＮまたはＱである）（配列番号２）に少なくとも１つの修飾を含み、および、前記親ポリペプチドに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
それ故、本発明は、家庭用または産業用クリーニングプロセスにおける、本発明の親ポリペプチドのポリペプチド変異体または組成物の使用を提供する。特に、本発明は、ランドリー、機械洗い用または手洗い用食器洗浄などの食器洗浄、硬質面クリーニング、産業上および組織的なクリーニング、生地糊抜き、デンプン改質、デンプン液化、糖化、給餌、製パンまたは醸造における本発明に係るポリペプチド変異体の使用に関する。
一実施形態において、使用は、布のクリーニング、例えばランドリーである。
他の実施形態において、使用は、セラミック、塑性材料またはガラス材料のクリーニング、例えば食器洗浄である。
従って、本発明のポリペプチド変異体は、洗浄、食器洗浄および硬質面クリーニング洗剤組成物（家庭用または工業用の設定のいずれか）におけるコンポーネントとして適用可能である。
本発明のポリペプチド変異体は、多様な他の工業用用途を可能とする価値のある特性を有する。例えば、本発明のポリペプチドは、デンプンの加工、特にデンプンの転化、特にデンプンの液化に用いられ得る（例えば、米国特許第３，９１２，５９０号明細書、欧州特許出願第２５２ ７３０号明細書、欧州特許出願第６３ ９０９号明細書、国際公開第９９／１９４６７号パンフレット、ならびに、国際公開第９６／２８５６７号パンフレットを参照のこと（すべての文献は本明細書における参照により援用されている））。本発明の変異体に加えて、グルコアミラーゼ、プルラナーゼおよび他のα−アミラーゼをも含み得る、デンプンの転化を目的とした組成物もまた予期される。
さらに、本発明のポリペプチド変異体はまた、デンプンまたは全穀粒から甘味料ならびに燃料、飲用エタノールおよび工業用エタノールなどのエタノール（例えば、本明細書において参照により援用されている米国特許第５，２３１，０１７号明細書を参照のこと）を生産する場合に特に有用である。
本発明のポリペプチド変異体はまた、生地、布および衣服の糊抜き（例えば、本明細書において参照により援用されている国際公開第９５／２１２４７号パンフレット、米国特許第４，６４３，７３６号明細書、欧州特許第１１９，９２０号明細書を参照のこと）、ビール製造または醸造、パルプおよび紙製造に有用であり得る。
デンプンの転化
液化および糖化プロセスなどの従来のデンプン転化プロセスは、例えば米国特許第３，９１２，５９０号明細書および欧州特許出願第２５２，７３０号明細書および欧州特許出願第６３，９０９号明細書（これにより、参照により援用されている）に記載されている。
一実施形態において、糖または脂肪代替物などの低分子量炭水化物成分にデンプンを分解するデンプンの転化プロセスは、脱分枝ステップを含む。
デンプンを糖に転化する場合においては、デンプンは解重合される。このような解重合プロセスは、前処理ステップ、および、２つまたは３つの連続する加工ステップ（すなわち、液化プロセス、糖化プロセス、ならびに、所望される最終生成物に応じて、任意選択により、異性化プロセス）から構成され得る。
（ｉ）天然デンプンの前処理
天然デンプンは、室温では水に不溶性である非常に小さな顆粒から構成されている。水性デンプンスラリーを加熱すると、これらの顆粒が膨潤し、最終的には破裂して、デンプン分子が溶液中に分散される。この「糊化」プロセスの最中には、粘度が著しく高くなる。典型的な工業用プロセスにおける固形分レベルは３０〜４０％であるため、デンプンは、取り扱いが可能であるように、希釈されるか、または、「液化」される必要がある。今日において、この粘度の低減はほとんどの場合酵素分解によって行われる。
（ｉｉ）液化
液化ステップの最中、長鎖デンプンは、α−アミラーゼによって、分岐および直鎖のより短鎖のユニット（マルトデキストリン）に分解される。液化プロセスは、１０５〜１１０℃で５〜１０分間、続いて、９５℃で１〜２時間実施される。ｐＨは５．５〜６．２である。これらの条件下における最適な酵素安定性を確保するため、１ｍＭのカルシウムが添加される（４０ｐｐｍ遊離カルシウムイオン）。この処理の後、液化デンプンは１０〜１５の「ブドウ糖当量」（ＤＥ）を有することとなる。
（ｉｉｉ）糖化
液化プロセス後、マルトデキストリンは、グルコアミラーゼ（例えば、ＡＭＧ）、および、イソアミラーゼ（米国特許第４，３３５，２０８号明細書）またはプルラナーゼ（例えば、Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ（商標））（米国特許第４，５６０，６５１号明細書）などの脱分枝酵素を添加することによりブドウ糖に転換される。このステップの前に、ｐＨは４．５未満の値に低下させ、高温（９５℃超）に維持して液化α−アミラーゼを不活性化させて、脱分枝酵素による適当な加水分解が不可能である「パノース前駆体」と呼ばれる単鎖オリゴ糖の形成が低減される。
温度を６０℃に下げ、グルコアミラーゼおよび脱分枝酵素が添加される。糖化プロセスは２４〜７２時間行われる。
通常、液化ステップ後にα−アミラーゼを変性する場合、約０．２〜０．５％の糖化生成物は分岐三糖６＜２＞−α−グルコシルマルトース（パノース）であり、これは、プルラナーゼによる分解が不可能である。液化ステップからの活性アミラーゼが糖化中に存在している場合（すなわち、変性無し）、このレベルは１〜２％もの高さであることが可能であり、これは、糖化収率を顕著に低下させるためにきわめて望ましくない。
（ｉｖ）異性化
所望される最終的な糖生成物が例えば異性化糖である場合、ブドウ糖シロップ剤はフルクトースに転換され得る。糖化プロセスの後、ｐＨは６〜８の範囲内の値、好ましくはｐＨ７．５に高められると共に、カルシウムがイオン交換により除去される。次いで、ブドウ糖シロップ剤が、例えば、固定化グルコースイソメラーゼ（Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（商標）ＩＴなど）を用いて異性化糖に転換される。
エタノール製造
通常、全穀粒からのアルコール製造（エタノール）は、４つの主なステップに分けることが可能である。
− 製粉
− 液化
− 糖化
− 発酵
（ｉ）製粉
穀粒は、構造を開放し、さらなる加工を可能とするために製粉される。湿式または乾式製粉の２つのプロセスが用いられる。乾式製粉においては、全穀粒が製粉され、プロセスの残りの部分で用いられる。湿式製粉は胚とあら粉（デンプン顆粒およびタンパク質）をきわめて良好に分離させ、および、数少ない例外を伴ってシロップ剤の製造が並行して行われている現場で適用される。
（ｉｉ）液化
液化プロセスにおいては、デンプン顆粒は、ほとんどの場合４を超えるＤＰのマルトデキストリンに加水分解されることにより可溶化される。加水分解は、酸処理により、または、α−アミラーゼにより酵素的に実施され得る。酸加水分解は限定的に用いられる。原料は、製粉された全穀粒、または、デンプン加工由来の副生成物であることが可能である。
酵素による液化は典型的には、３つのステップのホットスラリープロセスとして実施される。スラリーは、６０〜９５℃、好ましくは８０〜８５℃に加熱され、および、酵素が添加される。次いで、スラリーが９５〜１４０℃、好ましくは１０５〜１２５℃でジェット処理（ｊｅｔ ｃｏｏｋｅｄ）され、６０〜９５℃に冷却され、さらなる量の酵素を添加して最終的な加水分解が達成される。液化プロセスはｐＨ４．５〜６．５、典型的には５〜６のｐＨで実施される。製粉され、液化された穀粒はマッシュとしても知られている。
（ｉｉｉ）糖化
イースト菌によって代謝可能である低分子糖ＤＰ１〜３を生成するために、液化からのマルトデキストリンはさらに加水分解されなければならない。加水分解は典型的にはグルコアミラーゼにより酵素的に行われるが、あるいは、α−グルコシダーゼまたは酸α−アミラーゼを用いることが可能である。完全な糖化ステップは最長で７２時間継続し得るが、しかしながら、典型的には４時間の前糖化のみを行い、次いで、発酵（ＳＳＦ）中に糖化を完了させることが一般的である。糖化は、典型的には、３０〜６５℃、典型的には約６０℃の温度、および、ｐＨ４．５で実施される。
（ｉｖ）発酵
典型的にはサッカロミセス属の一種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）由来のイースト菌がマッシュに添加され、発酵が、典型的には３５〜６０時間などの２４〜９６時間行われる。温度は２６〜３４℃、典型的には約３２℃であり、ｐＨはｐＨ３〜６、好ましくは約ｐＨ４〜５である。
最も広範に用いられているプロセスでは糖化および発酵（ＳＳＦ）プロセスが同時に行われ、ここでは、糖化に係る保持ステージがなく、これは、イースト菌および酵素が一緒に添加されることを意味していることに注意すべきである。ＳＳＦを行う場合、５０℃超の温度における前糖化ステップを発酵の直前に導入することが一般的である。
（ｖ）蒸留
発酵に続いて、マッシュを蒸留してエタノールが抽出される。
本発明のプロセスに従って得られたエタノールは、例えば、燃料エタノール；飲用エタノール、すなわち、飲料用の中性スピリッツ；または、工業用エタノールとして使用され得る。
（ｖｉ）副生成物
発酵においては穀粒が残されるが、これは典型的には、液体形態で、または、乾燥させて動物の給餌に用いられる。
液化、糖化、発酵、蒸留およびエタノールの回収をどのように行うかに関するさらなる詳細は当業者に周知である。
本発明のプロセスによれば、糖化および発酵は、同時にまたは別々に実施され得る。
パルプおよび紙の製造
本発明のアルカリα−アミラーゼポリペプチドはまた、デンプンで強化された廃紙および厚紙からのパルプ、紙および厚紙などのリグノセルロース系材料の製造であって、特に、再パルプ化が７超のｐＨで行われ、および、アミラーゼが、強化用のデンプンの分解を介して廃棄材料の砕解を促進させる場合に用いられ得る。本発明のα−アミラーゼは、印刷されたデンプン塗工紙から製紙用パルプを製造するためのプロセスにおいて特に有用である。このプロセスは国際公開第９５／１４８０７号パンフレットに記載されているとおり行われ得、以下のステップを含む。
ａ）紙を砕解してパルプを製造するステップ
ｂ）ステップａ）の前後またはその最中にデンプン分解性酵素で処理するステップ、および
ｃ）ステップａ）およびｂ）の後にパルプからインク粒子を分離させるステップ。
本発明のポリペプチド変異体はまた、製紙において、炭酸カルシウム、カオリンおよびクレイなどのアルカリ性充填材と一緒に酵素的に改質されたデンプンが用いられるデンプンの改質においてきわめて有用であり得る。本発明のポリペプチド変異体では、充填材の存在下でデンプンの改質が可能となり、それ故、よりシンプルで一貫的なプロセスが可能となる。
生地、布および衣服の糊抜き
本発明のポリペプチド変異体はまた、生地、布または衣服の糊抜きにおいてきわめて有用であり得る。生地加工産業において、α−アミラーゼは、製織中における横糸の保護用コーティングとされるデンプンを含有する織物用糊の除去を促進させる糊抜きプロセスにおける助剤として、伝統的に用いられている。布がスカーリングに供され、漂白され、および、染色されるその後のプロセスにおいて最適な結果を実現するために、製織後に織物用糊コートを完全に除去することが重要である。繊維材料に対して悪影響を全くおよぼさないために、酵素によるデンプンの分解が好ましい。加工コストを低減するために、および、ミルスループットを高めるために、糊抜き加工は時々、スカーリングおよび漂白ステップと組み合わされる。このような事例においては、従来のα−アミラーゼは、高いｐＨレベルおよび漂白剤に対する適合性が高くないため、典型的には、アルカリまたは酸化剤などの非酵素性助剤がデンプンの分解に用いられている。薬剤の攻撃性が高いために、デンプン織物用糊の非酵素性分解によりいくらかの繊維の損傷がもたらされてしまう。従って、アルカリ性の溶液中において向上した性能を有するために、本発明のポリペプチド変異体を用いることが望ましいであろう。α−アミラーゼは単独で用いられても、または、セルロース含有布もしくは生地の糊抜きを行う際にはセルラーゼと組み合わせて用いられてもよい。
糊抜きおよび漂白プロセスは当技術分野において周知である。例えば、このようなプロセスは、本明細書において参照により援用されている、国際公開第９５／２１２４７号パンフレット、米国特許第４，６４３，７３６号明細書、欧州特許第１１９，９２０号明細書に記載されている。
市販されている糊抜き用の製品としては、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ製のＡＱＵＡＺＹＭＥ（登録商標）およびＡＱＵＡＺＹＭＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡが挙げられる。
ビール製造
本発明のポリペプチド変異体はまたビール形成プロセスにおいてきわめて有用であり得；α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドは典型的には、マッシュ化プロセスの最中に添加されることとなる。
本発明をさらに以下の実施例により説明するが、これは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書に記載され、特許請求されている本発明は、本明細書において開示されている特定の態様は本発明の数々の態様の例示であることが意図されているため、これらの態様によってその範囲が限定されるものではない。いずれかの均等な態様は本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本明細書に表示され記載されているものに追加した本発明の種々の変更は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。このような変更もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に属することが意図されている。競合する場合には、定義を含む本開示が優先されることとなる。
実施例１：本発明に係るポリペプチド変異体の生成
本発明の変異体は部位特異的突然変異誘発によって生成された。
Ｐｅｌ遺伝子座にアミラーゼ遺伝子を含有する生体から調製したゲノムＤＮＡを、部位特異的突然変異体を生成するための鋳型として用いた。
配列番号１の位置Ａ１７４（ＣＣＡＧＴＣＴＣＧＣＣＡＡＣＴＣＡＡＴＣＧＴＡＴＴＴＡＴＡＡＧＴ−配列番号１３）に欠失を導入する変異原性順方向プライマーおよびＰｎＭｉ４４９０（ＣＡＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＣＧＧＡＴＧ−配列番号１１）逆方向プライマーを用いて、約３．８ｋｂの断片を生成した。この断片をメガプライマーとして、ＰｎＭｉ４４９１（ＣＧＧＡＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＣＡＣＧ−配列番号１２）順方向プライマーと一緒に用いて、６ｋｂの挿入カセットを得た。形質転換におけるダブルクロスオーバーによるＰｅｌ遺伝子座における組込みを可能とするために、アミラーゼおよびｃａｔ遺伝子と共に、カセットは、末端において上流および下流Ｐｅｌ配列を含有していた。セレクションは、クロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上で行い、また、突然変異は、アミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列決定によって確認した。
実施例２：ポリペプチド変異体の特定の活性
実施例２において記載のとおり生成されおよび列挙された変異体が、維持されたまたは向上した活性を有しているかを判定するために、変異体をＰｈａｄｅｂａｓアッセイにより評価した。以下の洗剤組成物を調製した。
Figure 0006985295
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３ −＝２：１：４．５）をテスト系に添加することにより、水硬度を１２°ｄＨに調節した。洗浄後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
６０００ｄＨ（水硬度）を有する１：２モル比のＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２ストック溶液。
１０４．９ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（０．７１３Ｍ）を１リットルのボトル中に計量し、これに５００ｍｌのタイプＩ水を添加し、十分に撹拌した。これに７２．５ｇのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ（０．３５７Ｍ）を計量し、添加し、十分に溶解し、タイプＩ水で最終体積を１０００ｍｌとした。
ＮａＨＣＯ３の０．５３５Ｍ溶液
４４．９ｇの炭酸水素ナトリウムを１００ｍｌのタイプＩ水中に溶解した。
１２の水硬度（１２°ｄＨ）を有するＸ ｉｏｎｉｃｓを伴うモデルＸ洗剤
１．７５ｇのモデルＸ洗剤（上記のとおり）を計量し、１リットルのボトルに移し、これに８００ｍｌのタイプＩ水を添加し、十分に混合した。これに３５ｍｇのＸ−ｉｏｎｉｃｓを添加し、十分に混合した。水硬度を１２°ｄＨに調節するために、６０００°ｄＨを有する、２ｍｌの１：２モル比のＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２ストック溶液、ＮａＨＣＯ３の６ｍｌの０．５３５モル溶液を添加し、十分に混合した。最終的に、体積を１０００ｍｌとし、混合物を１０分間撹拌した。
Figure 0006985295
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３−＝４：１：７．５）をテスト系に添加することにより、水硬度を１５°ｄＨに調節した。洗浄後、生地を水道水ですすぎ、乾燥させた。
６０００ｄＨ（水硬度）を有する４：１モル比のＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２ストック溶液。
１２５．８ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを１リットルのボトル中に計量し、これに５００ｍｌのタイプＩ水を添加し、十分に撹拌した。これに４３．８ｇのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏを計量し、添加し、十分に溶解し、タイプＩ水で最終体積を１０００ｍｌとした。
ＮａＨＣＯ３の０．５３５Ｍ溶液
４４．９ｇの炭酸水素ナトリウムを１００ｍｌのタイプＩ水中に溶解した。
１５の水硬度（１５°ｄＨ）を有するモデルＡ洗剤
３．３３５ｇのモデルＡ洗剤を計量し、１リットルのボトルに移し、これに８６５ｍｌのタイプＩ水を添加し、十分に混合した。これに７．５ｍｌの０．５３５Ｍ ＮａＨＣＯ３を添加し、十分に混合し、タイプ１水で体積を１リットルとした。水硬度を１５°ｄＨに調節するために、６０００°ｄＨを有する２．５ｍｌの４：１モル比のＣａＣｌ２．２Ｈ２ＯおよびＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏストック溶液を添加し、混合物を１５分間撹拌した。
基質：Ｐｈａｄｅｂａｓ錠剤（Ｍａｇｌｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
１つの錠剤を１０ｍｌの洗剤溶液中に懸濁させた。
緩衝剤：１００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝剤 ｐＨ８
実験手法
マザープレートの調製：コロニーピッカー（ＫＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、形質転換したプレートからコロニーをピッキングし、および、増殖のためのＴＢＧｌｙ媒体を含む９６−ウェル培養プレート中に播種した。培養を３日間、３７℃で育成し、上澄みを、遠心分離によりプレートから回収した。
基質プレートの調製：
基質溶液を、１錠のＰｈａｄｅｂａｓを１０ｍｌのモデルＸ／モデルＡ洗剤中に溶解させ、その１８０μｌを、常に攪拌しながらｍｕｌｔｉｄｒｏｐ機器を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート中に分取することにより調製した。
培養上澄みを緩衝剤で１００倍に希釈し、２０μｌの希釈培養を１８０μｌの予め分取しておいた基質プレートに添加し、十分に混合した。プレートを、振盪（９００ｒｐｍ）しながら、２５℃で２０分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを５分間静置した。５０μｌの上澄みを３８４ウェルプレートに移し、吸光度を６２０ｎｍで計測した。発現された酵素の濃度を、特定の抗体を用いるＥＬＩＳＡにより測定した。特定の活性は濃度当たりの活性の比をとることにより算出し、親α−アミラーゼの特定の活性よりも高いものを的中とした。改善係数（ＩＦ）を：［変異体の特定の活性］／［親α−アミラーゼの特定の活性］として算出した。
上記の方法によって得られた本発明に係るポリペプチド変異体の相対的な特定の活性を、以下の表１に示す。アミノ酸置換は配列番号１を参照する。
Figure 0006985295
実施例３：本発明に係るポリペプチド変異体の生成
本発明の変異体は、部位特異的突然変異誘発により生成される。
Ｐｅｌ遺伝子座にアミラーゼ遺伝子を含有する生体から調製されたゲノムＤＮＡを、部位特異的突然変異体を生成するための鋳型として用いる。
モチーフに改変を導入する変異原性順方向プライマーおよびＰｎＭｉ４４９０（ＣＡＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＣＧＧＡＴＧ−配列番号１１）逆方向プライマーを用いて、約３．８ｋｂの断片を生成した。この断片をメガプライマーとして、ＰｎＭｉ４４９１（ＣＧＧＡＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＣＡＣＧ−配列番号１２）順方向プライマーと一緒に用いて、６ｋｂ挿入カセットを得る。形質転換におけるダブルクロスオーバーによるＰｅｌ遺伝子座における組込みを可能とするために、アミラーゼおよびｃａｔ遺伝子と共に、カセットは、末端において上流および下流Ｐｅｌ配列を含有していた。セレクションは、クロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上で行い、また、突然変異は、アミラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列決定によって確認する。
変異体のライブラリを生成するが、ここで、特定の改変および改変の異なる組み合わせは以下の位置であり：Ｑ１６９、Ｓ１７０、Ｒ１７１、Ｑ１７２、Ｌ１７３、Ａ１７４、Ｎ１７５、Ｒ１７６；ここで、位置は配列番号１に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸位置に対応する。
実施例４−α−アミラーゼ活性に係るアッセイ
ｐＮＰ−Ｇ７アッセイ
α−アミラーゼ活性は、Ｇ７−ｐＮＰ基質を利用する方法により測定され得る。４，６−エチリデン（Ｇ７）−ｐ−ニトロフェニル（Ｇ１）−α，Ｄ−マルトヘプタオシドの略記であるＧ７−ｐＮＰは、α−アミラーゼなどのエンド−アミラーゼによって開裂可能であるブロックされたオリゴ糖である。開裂に続いて、キットに含まれるα−グルコシダーゼが加水分解された基質を消化し、さらに、黄色を呈色する遊離ＰＮＰ分子を遊離させ、これにより、λ＝４０５ｎｍ（４００〜４２０ｎｍ．）での可視分光測光による計測が可能である。Ｇ７−ｐＮＰ基質およびα−グルコシダーゼを含有するキットは、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ（ｃａｔ．Ｎｏ．１１８７６４７３）製である。
試薬：
このキットからのＧ７−ｐＮＰ基質は、２２ｍＭ ４，６−エチリデン−Ｇ７−ｐＮＰおよび５２．４ｍＭヘペス（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、ｐＨ７．０）を含有する。
α−グルコシダーゼ試薬は、５２．４ｍＭヘペス、８７ｍＭ ＮａＣｌ、１２．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０７５ｍＭ ＣａＣｌ２（＞４ｋＵ／Ｌα−グルコシダーゼ）を含有する。
基質検量線用溶液を、１ｍＬのα−グルコシダーゼ試薬と０．２ｍＬのＧ７−ｐＮＰ基質とを混合することにより形成する。この基質検量線用溶液は使用直前に形成する。
希釈緩衝剤：５０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（ｎ＝９〜１０）））、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０。
手法：
分析されるアミラーゼサンプルは、希釈サンプル中のｐＨが７であることを保証するために、希釈緩衝剤中において希釈する。アッセイは、２０μｌの希釈酵素サンプルを９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、８０μｌの基質検量線用溶液を添加することにより行う。この溶液を混合し、室温で１分間プレインキュベートし、ＯＤ ４０５ｎｍで５分間にわたって２０秒毎に吸収を計測する。
時間依存吸収曲線の勾配（吸光度／分）は、所与の条件下において、対象とされるα−アミラーゼの特定の活性（活性／ｍｇ酵素）に対して正比例である。アミラーゼサンプルは、勾配が０．４吸光度単位／分未満であるレベルまで希釈されるべきである。
Ｐｈａｄｅｂａｓ活性アッセイ：
α−アミラーゼ活性はまた、Ｐｈａｄｅｂａｓ基質（例えばＭａｇｌｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ製）を用いる方法により測定され得る。Ｐｈａｄｅｂａｓ錠剤は、不水溶性である球状の微小球の形態である架橋されたデンプンポリマーを含む。青色染料はこれらの微小球と共有結合されている。微小球中の架橋されたデンプンポリマーが、α−アミラーゼ活性に比例した速度で分解される。α−アミラーゼがデンプンポリマーを分解すると、放出される青色染料は水溶性であり、染料の濃度は、６２０ｎｍで吸光度を計測することにより測定することが可能である。青色の濃度はサンプル中のα−アミラーゼ活性に比例する。
分析されるアミラーゼサンプルは、所望のｐＨを有する活性緩衝剤中に希釈される。１錠の基質錠剤を５ｍＬの活性緩衝剤中に懸濁させ、磁気攪拌機で混合する。基質の混合中に、１５０μｌをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）またはＰＣＲ−ＭＴＰに移す。３０μｌの希釈アミラーゼサンプルを１５０μｌの基質に加え、混合する。３７℃で１５分間インキュベートする。３０μｌの１Ｍ ＮａＯＨを添加し、混合することにより反応を停止させる。ＭＴＰを５分間、４０００×ｇで遠心分離する。１００μｌを新たなＭＴＰに移し、吸光度を６２０ｎｍで計測する。
アミラーゼサンプルは、６２０ｎｍでの吸光度が０〜２．２であり、活性アッセイの線形範囲内であるよう希釈するべきである。
還元糖活性アッセイ：
α−アミラーゼ活性はまた、例えばコーンスターチ基質を伴う還元糖アッセイによって測定され得る。α−アミラーゼによるデンプン中のα−１，４−グリコシドリンケージの加水分解で形成される還元末端の数は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＨＢＡＨ）による反応で測定される。ＰＨＢＡＨによる反応の後、還元末端の数は４０５ｎｍでの吸光度により計測可能であり、還元末端の濃度はサンプル中のα−アミラーゼ活性に比例する。
トウモロコシデンプン基質（３ｍｇ／ｍｌ）をｍｉｌｌｉＱ水中において５分間加熱することにより可溶化し、アッセイ前に冷却する。停止溶液については、Ｋａ−Ｎａ−タータレート／ＮａＯＨ溶液（Ｋ−Ｎａ−タータレート（Ｍｅｒｃｋ ８０８７）５０ｇ／ｌ、ＮａＯＨ ２０ｇ／ｌ）を調製し、また、１５ｍｇ／ｍｌまで、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＨＢＡＨ、Ｓｉｇｍａ Ｈ９８８２）をＫａ−Ｎａ−タータレート／ＮａＯＨ溶液に添加することにより、停止溶液を新たに調製すること。
ＰＣＲ−ＭＴＰにおいて、５０μｌの活性緩衝剤を５０μｌの基質と混合する。５０μｌの希釈酵素を添加し、混合する。ＰＣＲ器械中において、所望の温度で５分間インキュベートする。７５μｌの停止溶液（Ｋａ−Ｎａ−タータレート／ＮａＯＨ／ＰＨＢＡＨ）を添加することにより反応を停止させる。ＰＣＲ器械中において、１０分間、９５℃でインキュベートする。１５０μｌを新たなＭＴＰに移し、吸光度を４０５ｎｍで計測する。
アミラーゼサンプルは、４０５ｎｍでの吸光度が０〜２．２であり、活性アッセイの線形範囲内であるよう希釈するべきである。
ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）アッセイ：
残存アミラーゼ活性の測定に関しては、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ａｍｙｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｅ３３６５１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてもよい。
基質は、蛍光が消光する程度にＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ染料で標識されたコーンスターチであるＤＱＴＭデンプンといったコーンスターチ誘導体である。１本のバイアルに含有される約１ｍｇの凍結乾燥した基質を、１００マイクロリットルの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中に溶解する。バイアルを２０秒間ボルテックスにかけ、暗中において室温で静置し、溶解するまで不定期に混合する。次いで、９００マイクロリットルの１００ｍＭのアセテート、０．０１％（ｗ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、０．１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ５．５を添加し、十分にボルテックスし、使用の準備が整うまで暗中において室温で保管する。ストック基質検量線用溶液を、残存活性緩衝剤（１００ｍＭのアセテート、０．０１％（ｗ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、０．１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ５．５）中において１０倍に希釈することにより調製する。インキュベーションの直後に、酵素を、１００ｍＭのアセテート、０．０１％（ｗ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００、０．１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ５．５中において、１０〜２０ｎｇ酵素タンパク質／ｍｌの濃度に希釈する。
アッセイについては、黒色３８４ウェルマイクロタイタープレート中において、２５マイクロリットルの基質検量線用溶液を２５マイクロリットルの希釈酵素と１０秒間混合する。蛍光強度を、各ウェル中において２５℃で、１５分間にわたって１分間に１度計測（励起：４８５ｎｍ、発光：５５５ｎｍ）し、Ｖｍａｘを、時間に対する蛍光強度のプロットの勾配として算出する。プロットは直線であるべきであり、残存活性アッセイは、希釈した基準酵素溶液が活性アッセイの線形範囲内であるよう調節されている。
実施例５−変異体の特定の活性
生成された変異体が維持されたまたは向上した活性を有しているかを判定するために、変異体を、以下に記載の方法に従うＣＳ２８−ＧＯＤＰｅｒｉｄアッセイによって評価した。以下の洗剤組成物を調製した。
Figure 0006985295
３．４５ｇ／Ｌのモデル洗剤Ａ２を２１°ｄＨを有する１リットルの水中に可溶化し、アッセイにおいて最終濃度として用いた。
無色のＣＳ−２８生地（本明細書に記載のとおり、ＣＦＴから入手した米デンプンを含む綿スワッチ）から打ち抜いた直径５ｍｍの１枚の小さなスワッチを各ウェルに含むマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に、１８０μｌの洗剤溶液、続いて、２０μｌの希釈酵素サンプルを加えた。洗剤−酵素−生地混合物を、４５℃で１０分間、８００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆミキサ）で振盪しながらインキュベートした。この後、５０μｌの上澄みを、１０μｌの０．５ｍｇ／ｍｌのグルコアミラーゼ（精製したＮｏｖｏｚｙｍｅｓ製のＡＭＧ３００Ｌ）を含有するＭＴＰプレートに移し、室温で（ＲＴ）１０分間インキュベートした。
最後に１４０μｌのＧＯＤ−ＰＥＲＩＤ試薬を添加し、ＲＴで１０分間インキュベートし、その後、吸光度を４２０ｎｍで計測した。４２０ｎｍでの吸光度は還元末端の濃度を示し、これは、サンプル中のα−アミラーゼ活性と比例している。
ＧＯＤＰｅｒｉｄ試薬は、４０ｍｇのグルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｇ７１４１）、２０ｍｇのペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｐ ８１２５）および１ｇのＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ １０２９４６）を、１Ｌの１００ｍＭリン酸塩緩衝剤（ｐＨ７．０）中に可溶化させることにより調製した。この試薬は、暗中および低温（４℃）で保管した。
上記の方法により得られた本発明に係るポリペプチド変異体の相対的な特定の活性は、以下の表２に示されている。アミノ酸置換は配列番号１を参照し、配列番号１を有するアミラーゼに導入した。
Figure 0006985295

Claims (14)

  1. α−アミラーゼ活性を有すると共に、親ポリペプチドと比して向上した洗浄性能を示すポリペプチド変異体であって、配列番号１のアミノ酸位置１６９〜１７６に対応するアミノ酸モチーフに少なくとも１つの欠失を含み、および、配列番号１の前記親ポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記少なくとも１つの欠失が、配列番号１の位置１７４並びに位置１８３および１８４に相当するアミノ酸の欠失を含む、ポリペプチド変異体。
  2. 前記ポリペプチドが、前記親ポリペプチドの前記アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性であるが、１００％未満の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド変異体。
  3. 請求項１または２に記載のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド。
  4. 請求項３に記載の前記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
  5. 請求項３に記載の前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  6. 請求項３に記載の前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  7. α−アミラーゼ活性を有するポリペプチド変異体の製造方法であって：
    ａ．前記ポリペプチド変異体の発現に好適な条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養するステップ；および
    ｂ．前記ポリペプチド変異体を回収するステップ
    を含む方法。
  8. 請求項１または２に記載のポリペプチド変異体を含む組成物。
  9. 請求項８に記載の組成物であって、前記組成物が洗剤組成物である、組成物。
  10. 前記洗剤組成物が、界面活性剤、漂白剤、分散性ポリマー、錯化剤、漂白剤触媒、および／または、結晶成長阻害剤をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物がリン酸塩を含まない組成物である、組成物。
  12. 請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物が、さらなる酵素を含む、組成物。
  13. ランドリーまたは食器洗浄洗剤組成物における、請求項１または２に記載のポリペプチド変異体の使用。
  14. 織物または固体表面のクリーニングにおける、請求項１または２に記載のポリペプチド変異体の使用。
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