JP6959632B2 - 筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症の予防又は治療剤 - Google Patents
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Description
項1. FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、ALS又はFTDの予防又は治療剤。
項2. 家族性のALS、又は家族性のFTDに対して適用される、項1に記載の予防又は治療剤。
項3. ALS又はFTDにおける神経変性又は運動障害の改善のために使用される、項1又は2に記載の予防又は治療剤。
項4. 前記有効成分が、FUSタンパク質、又はFUSタンパク質をコードしているDNA分子である、項1〜3のいずれかに記載の予防又は治療剤。
項5. FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、異常伸長したGGGGCCリピート配列に起因するタンパク質の翻訳抑制剤。
本発明の予防又は治療剤は、ALS又はFTDの予防又は治療に使用される薬剤であって、FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明について、詳述する。
本発明では、FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分として使用する。
FUSタンパク質は、それ自体、ALS/FTDにおいて、神経変性の抑制、進行性運動障害の抑制、DPRsへのRAN翻訳抑制等の作用を発揮するため、ALS又はFTDの予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
(i)配列番号1に示すアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されてなり、且つ配列番号1に示すアミノ酸配列からなるヒトFUSタンパク質と同等のRNA結合能を有する、ヒトFUSタンパク質の変異体。
(ii)配列番号1に示すアミノ酸配列に対して、配列同一性が85%以上であり、且つ配列番号1に示すアミノ酸配列からなるヒトFUSタンパク質と同等のRNA結合能を有する、ヒトFUSタンパク質の変異体。
FUSタンパク質をコードしているDNA分子は、投与された生体内でFUSタンパク質を発現することにより、ALS又はFTDにおいて、神経変性の抑制、進行性運動障害の抑制、DPRsへのRAN翻訳抑制等の作用を発揮するため、ALS又はFTDの予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
FUSタンパク質の産生促進物質とは、生体内でFUSタンパク質の産生を促進させる物質である。当該産生促進物質は、投与された生体において、生体が本来有しているFUSタンパク質の産生能を向上させ、産生されたFUSタンパク質が、ALS又はFTDにおいて、神経変性の抑制、進行性運動障害の抑制、DPRsへのRAN翻訳抑制等の作用を発揮するため、ALS又はFTDの予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
本発明の予防又は治療剤は、前記有効成分の他に、ALS又はFTDの予防又は治療に有効な他の薬理活性成分を含んでいてもよい。
本発明の予防又は治療剤の剤型については、特に制限されず、使用する有効成分の種類や投与形態等に応じて適宜設定すればよい。本発明の予防又は治療剤の剤型として、具体的には、注射剤、シロップ剤、細胞懸濁液、リポソーム製剤等の液状製剤;錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、等の固形状製剤等が挙げられる。また、注射剤にする場合には、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末(例えば凍結乾燥粉末)の形態であってもよい。
本発明の予防又は治療剤は、ALS又はFTDにおいて、神経変性、運動障害、及びDPRsへのRAN翻訳を抑制し、ALS又はFTDの症状を改善できるので、ALS又はFTD予防又は治療目的で使用される。
本発明の予防又は治療剤の投与形態としては、例えば、経口投与、局所投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経直腸的、皮内投与等が挙げられ、使用する有効成分の種類に応じて適宜設定すればよい。これらの投与形態の中でも、本発明の予防または治療として、好ましくは局所投与が挙げられる。
後述する実施例の欄で示す通り、FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質には、異常伸長したG4C2リピート配列に起因するタンパク質の翻訳を抑制する作用がある。従って、本発明は、更に、FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、異常伸長したG4C2リピート配列に起因するタンパク質の翻訳抑制剤を提供する。当該翻訳抑制剤は、異常伸長したG4C2リピート配列から生じるジペプチドリピートタンパク質の凝集体の形成に関連する疾患の予防又は治療目的で使用することができる。当該翻訳抑制剤において、有効成分の種類、剤型、投与方法等は、前記「1.ALS又はFTDの予防又は治療剤」の欄に記載の通りである。
1−1.ショウジョウバエのストック
ショウジョウバエのストックは、全て、23℃又は25℃で、標準的な餌(グルコース、コーンミール、及び乾燥酵母含有)で飼育及び交配した。
異常伸長G4C2リピート配列を複眼において発現するトランスジェニックショウジョウバエをGal4-UASシステムを使用して樹立した。具体的な作製手順は以下に示す通りである。
FastDNA Green SPIN Kit (MP-Biomedicals)を用いてトランスジェニックショウジョウバエからゲノムDNAを単離した。ゲノムDNA中のG4C2リピート配列について、文献(Renton, A.E. et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron 72, 257-68 (2011).)に記載の方法に従って、Repeat-primed PCRを行った。また、Peak ScannerTM software v1.0 (Applied Biosystems)を備えたABI 3130xl genetic analyzer (Applied Biosystems)にて、PCRフラグメントの蛍光フラグメント長分析(Fluorescence fragment length analysis)を行った。これによって、導入されたG4C2リピート配列におけるGGGGCCの繰り返し数を求め、(G4C2)9、(G4C2)50、及び(G4C2)89からなるG4C2リピート配列が、それぞれ導入されていることが確認された。
CCDカメラPD21(Olympus)を備える実体顕微鏡SZX10(Olympus)を用いて、ショウジョウバエの複眼の光学顕微鏡像を取得した。ショウジョウバエの複眼の色素異常とサイズの定量は、文献(Saitoh, Y. et al. p62 Plays a Protective Role in the Autophagic Degradation of Polyglutamine Protein Oligomers in Polyglutamine Disease Model Flies. Journal of Biological Chemistry 290, 1442-1453 (2015).)に記載の方法に従て行った。遺伝子型毎に少なくとも10個の複眼を分析し、結果を平均値±SEMとして表した。
第二染色体バランサーであるCyOを有し、ヘテロ接合型のelav-Gal4ドライバーを有する雌ショウジョウバエと、ホモ接合型のUAS-(G4C2)nを有する雄ショウジョウバエとを交配した。F1では、神経細胞においてG4C2リピート配列を発現するショウジョウバエ(即ち、elav-Gal4ドライバー及びUAS-(G4C2)nを有するショウジョウバエ)が生まれた。G4C2リピート配列を発現するショウジョウバエはCyOバランサーを有しておらず(即ち、表現型が[Cy-])、G4C2リピート配列を発現しないショウジョウバエはCyOバランサーを有する(即ち、表現型が[Cy+])。
高さ150 mm、内径22 mmのガラスバイアルに、10〜20個体の雄ショウジョウバエを個体に刺激を与えないように入れた。5分間静置した後に、ガラスバイアルの底部を穏やかにタップし、10秒間でショウジョウバエがガラスバイアルの壁を昇って到達した高さをデジタルビデオカメラで記録し、高さが2 cm未満を0、高さが2〜3.9 cmを1、高さが4〜5.9 cmを2、高さが6〜7.9 cmを3、高さが8〜9.9 cmを4、高さが10 cm以上を5としてスコア化した。本実験は、20秒間の間隔をあけて5回実施し、結果を平均値±SEMとして表した。
1バイアルあたり約30個体のショウジョウバエに羽化後から標準餌を与えて飼育し、寿命分析を行った。2又は3日毎に、新鮮な餌が入ったバイアルに移し、その時に死亡していた個体数を計測した。ショウジョウバエの飼育は全個体が死滅するまで行った。各グループについて、3バイアル以上を用いて実験を行い、統計解析を行った。
3齢幼虫を氷冷PBS中で解剖により複眼成虫原基を取り出し、4%パラホルムアルデヒド(pH7.0)を含むPBS(RNase-free)で30分間固定し、更に100%メタノールで脱水処理した。固定サンプルを、75v/v%、50v/v%、及び25v/v%のエタノールを含むPBSで再水和後、PBS及び蒸留水(ジエチルピロカーボネート処理した蒸留水)でリンスした。次いで、0.2N HClを含む蒸留水を用いて、室温で20分間処理し、蒸留水でリンスした。更に、サンプルを0.2% Triton X-100を含むPBSで処理し、PBSで5分間リンスした後に、4%パラホルムアルデヒド(pH7.0)を含むPBSで20分間後固定した。その後、PBSを用いて5分間の洗浄を2回行い、2 mg/mLのグリシンを含むPBS内での15分間インキュベートを2回行った。アセチル化処理の後に、ハイブリダイゼーションバッファー(50%のホルムアミド、2×SSC、0.2mg/mLの酵母tRNA、及び0.5mg/mLのヘパリンを含有)内で、37℃で1時間インキュベートした。その後、サンプルを5'末端Alexa594標識(GGCCCC)4 LNA(locked nucleic acid)プローブ又はAlexa488標識(CCGGGG)4 LNAプローブ(5nM)と共に、ハイブリダイゼーションバッファー中で80℃、終夜インキュベートした。なお、これらのLNAプローブは、GeneDesign Incによって合成されたものを使用した。ハイブリダイゼーション後に、80℃の4×SSC内での5分間の洗浄を1回、80℃の2×SSC及び50%ホルムアミドを含む溶液内での20分間の洗浄を3回、80℃の0.1×SSC内での40分間の洗浄を3回、及び室温のPBT(0.5% Triton X-100を含むPBS)内での洗浄を1回行った。その後、サンプルをDAPIにて核染色し、SlowFadeゴールド退色防止剤(Thermo Fisher Scientific)を用いてスライドグラスにマウントし、共焦点レーザー走査型顕微鏡(Zeiss LSM710)にて観察した。
3齢幼虫を氷冷PBS中で解剖により複眼成虫原基を取り出し、4%パラホルムアルデヒド(pH7.0)を含むPBSで30分間固定した後に、PBTで3回洗浄した。次いで、サンプルを5%ヤギ血清を含むPBTでブロックングした後に、一次抗体としてラットモノクローナル抗poly(GR)抗体(clone 5A2, Millipore MABN778)、ウサギポリクローナル抗poly(GP)抗体(Cosmo Bio CAC-TIP-C9-P01)、又はウサギポリクローナル抗poly(GA)抗体(Novus Biologicals NBP2-25018)と共に4℃で終夜インキュベートした。PBTで3回洗浄した後に、二次抗体として、Alexa 633標識抗ラットIgG抗体(Invitrogen A-21094)、又はAlexa 488標識抗ウサギIgG抗体(Invitrogen A-11008)と共にインキュベートした。その後、PBTで3回洗浄した後に、DAPIにて核染色し、SlowFadeゴールド退色防止剤を用いてスライドグラスにマウントし、共焦点レーザー走査型顕微鏡(Zeiss LSM710)にて観察した。
G4C2リピート配列、或は(G4C2)89と共にEGFP、FUS、又はFUS-RRMmutを発現している5日齢のショウジョウバエの頭部を回収し、-80℃で保存した。サンプルを文献(Tran, H. et al. Differential Toxicity of Nuclear RNA Foci versus Dipeptide Repeat Proteins in a Drosophila Model of C9ORF72 FTD/ALS. Neuron 87, 1207-14 (2015).)に記載の方法に従って調製した。Poly(GP)は、文献(Su, Z. et al. Discovery of a biomarker and lead small molecules to target r(GGGGCC)-associated defects in c9FTD/ALS. Neuron 83, 1043-50 (2014).)に記載のサンドイッチELISA法によって測定した。データは、EGFPと(G4C2)89を発現している場合の値によって標準化した。
ZENイメージンフソフトウェア(Zeiss)を使用して、ショウジョウバエの複眼原基におけるDPRsの凝集体数を定量的に測定した。手順は以下に示す通りである。先ず、DAPI染色によって複眼原基の後端から2列と3列の発生途中の13個眼の光受容体ニューロンを選択した。次いで、直径が2 μmよりも大きく且つ細胞質に局在するDPRsの凝集体数を計測した。各遺伝子型について10個以上の複眼原基について分析し、結果を平均値±SEMとして表した。
全ての統計解析は、public domain R program (http://www.r-project.org/)又はGraphPad Prism 6 softwareを用いて行った。
2−1.異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエの特性
2−1−1.複眼の状態
異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)50、(G4C2)89(W)、及び(G4C2)89(S))を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼を光学顕微鏡にて観察した結果を図1に示す。また、比較として、EGFP又は正常なG4C2リピート配列((G4C2)9)を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼を光学顕微鏡にて観察した結果も併せて図1に示す。
異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)50、(G4C2)89(W))又は正常なG4C2リピート配列((G4C2)9)を発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、成虫までの生存率を評価した結果を図2Aに示し、成虫の寿命を評価した結果を図2Bに示す。これらの結果から、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエは、正常なG4C2リピート配列を発現する場合に比して、成虫までの生存率が低く、成虫の寿命が1/4〜1/5程度にまで短縮されていることが明らかとなった。
異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)50、(G4C2)89(W))又は正常なG4C2リピート配列((G4C2)9)を発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、クライミングアッセイを行った結果を図3に示す。この結果から、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエは、正常なG4C2リピート配列を発現する場合に比して、クライミングアッセイにおけるスコアが著しく低下していることが分かった。特に(G4C2)89を発現するトランスジェニックショウジョウバエでは加齢に伴ってスコアが有意に低下していた。即ち、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエは、ALS/FTDの代表的な症状である進行性運動障害を呈することが確認された。
異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)89(S))を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼において、当該リピート配列から転写されたRNA、及びDPRs(ポリ(GR)、ポリ(GA)、及びポリ(GP))をFISH及び免疫染色にて分析した結果を図4に示す。
異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエでは、G4C2リピート配列が転写されたRNA及び当該RNAのRAN翻訳産物であるDPRsの凝集体が認められ、更に神経変性及び運動障害を呈しており、寿命も短縮していた。これらの事象は、ALS/FTDにおいて典型的に認められるものであり、当該トランスジェニックショウジョウバエは、ALS/FTDのモデル動物として利用できることを示している。
異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)89(S))又はEGFPと共に、FUS、ILF2(Interleukin enhancer-binding factor 2)、又はhnRNPK(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼を光学顕微鏡にて観察した結果を図5に示す。
2−3−1.運動能力
異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)50)と共に、FUS又はEGFPを神経系で発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、クライミングアッセイを行った結果を図6に示す。また、また、比較として、EGFPと共にFUSを発現するトランスジェニックショウジョウバエの結果についても図6に示す。
異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)89(S))と共に、FUS、FUS-RRMmut、又はEGFPを複眼で発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、複眼を光学顕微鏡にて観察した結果及び複眼のサイズを測定した結果を図7に示す。また、比較として、EGFPと共に、FUS、FUS-RRMmut、又はEGFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエの結果についても図7に示す。
異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)89(S))と共に、FUS又はEGFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼において、DPRs(ポリ(GR)、ポリ(GA)、及びポリ(GP))を蛍光免疫染色した結果を図8Aに示す。また、当該トランスジェニックショウジョウバエにおいて、各DRPsの凝集体数を測定した結果についても、図8Bに示す。更に、異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)89(S))と共に、FUS、FUS-RRMmut、又はEGFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエにおけるポリ(GP)量をELISA法にて測定した結果も図8Cに示す。
異常伸長したG4C2リピート配列((G4C2)89(S))又はEGFPを発現し、且つcaz2変異の導入されたトランスジェニックショウジョウバエ(caz2/+)について、複眼を光学顕微鏡にて観察した結果及び眼のサイズを測定した結果を図9に示す。また、比較のために、caz2変異を導入していないトランスジェニックショウジョウバエ(+/+)の結果についても、図9に示す。
Claims (4)
- FUSタンパク質、及びFUSタンパク質をコードしているDNA分子よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、GGGGCCリピート配列の異常伸長に起因する筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症の予防又は治療剤。
- 家族性の筋萎縮性側索硬化症、又は家族性の前頭側頭型認知症に対して適用される、請求項1に記載の予防又は治療剤。
- 筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症における神経変性又は運動障害の改善のために使用される、請求項1又は2に記載の予防又は治療剤。
- FUSタンパク質、及びFUSタンパク質をコードしているDNA分子よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、異常伸長したGGGGCCリピート配列に起因するタンパク質の翻訳抑制剤。
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