JP6959632B2

JP6959632B2 - Prophylactic or therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis or frontotemporal dementia

Info

Publication number: JP6959632B2
Application number: JP2017096111A
Authority: JP
Inventors: 義隆永井; 盛夫上山
Original assignee: Kinki University
Current assignee: Kinki University
Priority date: 2017-05-15
Filing date: 2017-05-15
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2037-05-15
Also published as: JP2018193309A

Description

本発明は、筋萎縮性側索硬化症（以下、ALS）又は前頭側頭型認知症（以下、FTD）の予防又は治療剤に関する。より具体的には、C9orf72遺伝子非翻訳領域内にあるGGGGCCリピート配列（以下、G4C2リピート配列）の異常伸長を病因とするALS又はFTDに対して、効果的な予防又は治療効果を奏する、当該疾患の予防又は治療剤に関する。 The present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis (hereinafter, ALS) or frontotemporal dementia (hereinafter, FTD). More specifically, the disease that exerts an effective preventive or therapeutic effect on ALS or FTD caused by abnormal elongation of the GGGGCC repeat sequence (hereinafter referred to as G4C2 repeat sequence) in the C9orf72 gene untranslated region. Regarding preventive or therapeutic agents.

筋萎縮性側索硬化症及び前頭側頭型認知症（以下、ALS/FTD）は、遺伝的特性及び神経病理学的特性において共通性を有する難治性の神経変性疾患である。C9orf72遺伝子の非翻訳領域におけるG4C2リピート配列の異常伸長は、家族性及び孤発性ALS/FTDにおける最も高頻度な原因遺伝子異常として同定されている（非特許文献１及び２参照）。 Amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia (ALS / FTD) are intractable neurodegenerative diseases that have common genetic and neuropathological characteristics. Abnormal elongation of the G4C2 repeat sequence in the untranslated region of the C9orf72 gene has been identified as the most frequent causative gene abnormality in familial and sporadic ALS / FTD (see Non-Patent Documents 1 and 2).

G4C2リピート配列の異常伸長に起因するALS/FTD患者脳では、C9orf72変異遺伝子から転写された異常伸長リピートRNAがRNA凝集体（以下、RNA foci）を形成している（非特許文献１及び２参照）。また、当該ALS/FTD患者脳には、リピート関連非ATG翻訳(以下、RAN翻訳)によって当該リピートRNAから生じたジペプチドリピートタンパク質（以下、DPRs）が凝集体を形成していることも明らかにされている（非特許文献３〜５）これらの異常伸長リピートRNA及びDPRsは、神経変性の原因と考えられているが、ALS/FTDの病因となる分子メカニズムについては、依然として十分に解明されていない。 In the brain of ALS / FTD patients caused by abnormal elongation of G4C2 repeat sequence, abnormally elongated repeat RNA transcribed from the C9orf72 mutant gene forms RNA aggregates (hereinafter referred to as RNA foci) (see Non-Patent Documents 1 and 2). ). It was also clarified that dipeptide repeat proteins (hereinafter, DPRs) generated from the repeat RNA by repeat-related non-ATG translation (hereinafter, RAN translation) form aggregates in the brain of the ALS / FTD patient. (Non-Patent Documents 3 to 5) These abnormally elongated repeat RNAs and DPRs are considered to be the cause of neurodegeneration, but the molecular mechanism responsible for the etiology of ALS / FTD has not yet been fully elucidated. ..

従来、C9orf72遺伝子の非翻訳領域におけるG4C2リピート配列由来のRNAに対して翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下、ASO)が同定されている(非特許文献６〜８)。また、従来、当該G4C2リピート配列に結合する化合物についても同定されている(非特許文献９)。しかしながら、これらのASOや化合物では、動物モデルにおいて実際にALS/FTDの治療効果を確認されておらず、G4C2リピート配列の異常伸長に起因するALS/FTDに対して卓効を示す治療薬候補が見出されていないのが現状である。 Conventionally, antisense oligonucleotides (hereinafter referred to as ASO) that inhibit translation of RNA derived from the G4C2 repeat sequence in the untranslated region of the C9orf72 gene have been identified (Non-Patent Documents 6 to 8). In addition, conventionally, a compound that binds to the G4C2 repeat sequence has also been identified (Non-Patent Document 9). However, with these ASOs and compounds, the therapeutic effect of ALS / FTD has not actually been confirmed in animal models, and there are therapeutic drug candidates that are effective against ALS / FTD caused by abnormal elongation of the G4C2 repeat sequence. The current situation is that it has not been found.

DeJesus-Hernandez, M. et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 72, 245-56 (2011).DeJesus-Hernandez, M. et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 72, 245-56 (2011). Renton, A.E. et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron 72, 257-68 (2011).Renton, A.E. et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron 72, 257-68 (2011). Ash, P.E. et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron 77, 639-46 (2013).Ash, P.E. et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates in soluble polyethylene specific to c9FTD / ALS. Neuron 77, 639-46 (2013). Mori, K. et al. The C9orf72 GGGGCC repeat is translated into aggregating dipeptide-repeat proteins in FTLD/ALS. Science 339, 1335-8 (2013).Mori, K. et al. The C9orf72 GGGGCC repeat is translated into aggregating dipeptide-repeat proteins in FTLD / ALS. Science 339, 1335-8 (2013). Zu, T. et al. RAN proteins and RNA foci from antisense transcripts in C9ORF72 ALS and frontotemporal dementia. Proc Natl Acad Sci U S A 110, E4968-77 (2013).Zu, T. et al. RAN proteins and RNA foci from antisense transcripts in C9ORF72 ALS and frontotemporal dementia. Proc Natl Acad Sci U S A 110, E4968-77 (2013). Donnelly, C. J. et al. RNA toxicity from the ALS/FTD C9ORF72 expansion is mitigated by antisense intervention. Neuron 80, 415-428 (2013).Donnelly, C. J. et al. RNA toxicity from the ALS / FTD C9ORF72 expansion is mitigated by antisense intervention. Neuron 80, 415-428 (2013). Lagier-Tourenne, C. et al. Targeted degenerateon of sense and antisense C9orf72 RNA foci as therapy for ALS and frontotemporal degenerateon. Proc Natl Acad Sci U S A 110, E4530-9 (2013).Lagier-Tourenne, C. et al. Targeted degenerateon of sense and antisense C9orf72 RNA foci as therapy for ALS and frontotemporal degenerateon. Proc Natl Acad Sci U S A 110, E4530-9 (2013). Sareen, D. et al. Targeting RNA foci in iPSC-derived motor neurons from ALS patients with a C9ORF72 repeat expansion. Sci Transl Med 5, 208ra149 (2013).Sareen, D. et al. Targeting RNA foci in iPSC-derived motor neurons from ALS patients with a C9ORF72 repeat expansion. Sci Transl Med 5, 208ra149 (2013). Su, Z. et al. Discovery of a biomarker and lead small molecules to target r(GGGGCC)-associated defects in c9FTD/ALS. Neuron 83, 1043-50 (2013).Su, Z. et al. Discovery of a biomarker and lead small molecules to target r (GGGGCC)-associated defects in c9FTD / ALS. Neuron 83, 1043-50 (2013).

本発明の目的は、ALS又はFTDに対して優れた薬効を示す予防又は治療剤を提供することである。 An object of the present invention is to provide a prophylactic or therapeutic agent showing excellent efficacy against ALS or FTD.

本発明者等は、先ず、G4C2リピート配列の異常伸長によって引き起こされるALS/FTDの病態メカニズムを解明すべく、複眼及び神経系で異常伸長したG4C2リピート配列を発現するショウジョウバエを作成し、当該ショウジョウバエが、(i)強度の複眼神経変性を呈すること、(ii)成虫までの生存率が低下し、成虫の寿命が短縮すること、(iii)進行性運動障害を呈すること、及び(iv)G4C2リピート配列がリピートRNAに転写され、さらにDPRsにRAN翻訳されていること、を確認し、ALS/FTDの病態を示すモデル動物として使用できることを見出した。 The present inventors first created a Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence in the compound eye and the nervous system in order to elucidate the pathological mechanism of ALS / FTD caused by the abnormal elongation of the G4C2 repeat sequence. , (I) exhibiting severe compound ocular neurodegeneration, (ii) reducing survival to adulthood and shortening adult lifespan, (iii) exhibiting progressive dyskinesia, and (iv) G4C2 repeat It was confirmed that the sequence was transcribed into repeat RNA and further RAN-translated into DPRs, and it was found that it could be used as a model animal showing the pathophysiology of ALS / FTD.

更に、当該ショウジョウバエにおいて、RNA結合タンパク質であるFUSタンパク質を発現させることによって、複眼神経変性の抑制、運動障害の抑制、及びDPRsへのRAN翻訳抑制が認められ、ALS/FTDの症状が改善できることを確認した。即ち、FUSタンパク質は、ALS/FTDに対して優れた予防又は治療効果を奏することを見出し、FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及び／又はFUSタンパク質の産生促進物質は、ALS/FTDの予防又は治療剤として有用であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。 Furthermore, by expressing the FUS protein, which is an RNA-binding protein, in the Drosophila, suppression of compound eye neurodegeneration, suppression of movement disorders, and suppression of RAN translation into DPRs were observed, and the symptoms of ALS / FTD could be improved. confirmed. That is, the FUS protein was found to have an excellent prophylactic or therapeutic effect on ALS / FTD, and the FUS protein, the DNA molecule encoding the FUS protein, and / or the FUS protein production-promoting substance were ALS /. It has been found to be useful as a prophylactic or therapeutic agent for FTD. The present invention has been completed by further studies based on these findings.

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、ALS又はFTDの予防又は治療剤。
項２．家族性のALS、又は家族性のFTDに対して適用される、項１に記載の予防又は治療剤。
項３． ALS又はFTDにおける神経変性又は運動障害の改善のために使用される、項１又は２に記載の予防又は治療剤。
項４．前記有効成分が、FUSタンパク質、又はFUSタンパク質をコードしているDNA分子である、項１〜３のいずれかに記載の予防又は治療剤。
項５． FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、異常伸長したGGGGCCリピート配列に起因するタンパク質の翻訳抑制剤。 That is, the present invention provides the inventions of the following aspects.
Item 1. A prophylactic or therapeutic agent for ALS or FTD, which comprises at least one selected from the group consisting of FUS protein, a DNA molecule encoding FUS protein, and a substance promoting the production of FUS protein as an active ingredient.
Item 2. Item 2. The prophylactic or therapeutic agent according to Item 1, which is applied to familial ALS or familial FTD.
Item 3. Item 2. The prophylactic or therapeutic agent according to Item 1 or 2, which is used for improving neurodegeneration or movement disorder in ALS or FTD.
Item 4. Item 4. The prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 3, wherein the active ingredient is a FUS protein or a DNA molecule encoding the FUS protein.
Item 5. A translation inhibitor of a protein caused by an abnormally elongated GGGGCC repeat sequence, which comprises at least one selected from the group consisting of FUS protein, a DNA molecule encoding FUS protein, and a substance promoting the production of FUS protein as an active ingredient. ..

本発明によれば、異常伸長したG4C2リピート配列から転写されたリピートRNAにFUSタンパク質を結合させることにより、神経変性や運動障害等のALS/FTDの病態を改善することができる。従来、異常伸長したG4C2リピート配列に起因するALS/FTDは、有効な治療法が確立されておらず、更に、近年、高齢化社会の到来によって、加齢に伴って発症するALS/FTDの患者は増大しており、これらの治療法の確立は喫緊の課題となっているが、本発明は、初めてALS/FTDの治療効果を生体内で示しており、ALS/FTDの新規治療法として有用である。 According to the present invention, the pathophysiology of ALS / FTD such as neurodegeneration and dyskinesia can be improved by binding the FUS protein to the repeat RNA transcribed from the abnormally elongated G4C2 repeat sequence. Conventionally, an effective treatment method has not been established for ALS / FTD caused by abnormally elongated G4C2 repeat sequence, and in recent years, patients with ALS / FTD that develop with aging due to the advent of an aging society. Is increasing, and the establishment of these treatment methods is an urgent issue, but the present invention has shown the therapeutic effect of ALS / FTD in vivo for the first time, and is useful as a new treatment method for ALS / FTD. Is.

異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₅₀、(G4C2)₈₉(W)、及び(G4C2)₈₉(S)）を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼を光学顕微鏡にて観察した結果である。This is the result of observing the compound eyes of transgenic Drosophila expressing abnormally elongated G4C2 repeat sequences ((G4C2) ₅₀ , (G4C2) ₈₉ (W), and (G4C2) _{89 (S)) with an optical microscope.} 異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₅₀、(G4C2)₈₉(W)）又は正常なG4C2リピート配列（(G4C2)₉）を発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、成虫までの生存率(A)及び寿命(B)を評価した結果である。Survival to adulthood (A) and longevity of transgenic Drosophila expressing abnormally elongated G4C2 repeat sequences ((G4C2) ₅₀ , (G4C2) ₈₉ (W)) or normal G4C2 repeat sequences ((G4C2) ₉₎ This is the result of evaluating (B). 異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₅₀、(G4C2)₈₉(W)）又は正常なG4C2リピート配列（(G4C2)₉）を発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、クライミングアッセイを行った結果である。This is the result of a climbing assay on transgenic Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) ₅₀ , (G4C2) ₈₉ (W)) or a normal G4C2 repeat sequence ((G4C2) _9). 異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼の成虫原基において、当該リピート配列から転写されたRNA、及びDPRs（ポリ(GR)、ポリ(GA)、及びポリ(GP)）をFISH及び免疫染色にて分析した結果である。RNA transcribed from the repeat sequence and DPRs (poly (GR), poly (GA)) in the compound eye imaginal disc of transgenic Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) _{89 (S)).} , And poly (GP)) by FISH and immunostaining. 異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）又はEGFPと共に、FUS、ILF2、又はhnRNPKを発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼を光学顕微鏡にて観察した結果を示す。The results of observing the compound eyes of transgenic Drosophila expressing FUS, ILF2, or hnRNPK together with an abnormally elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) _{89 (S)) or EGFP with an optical microscope are shown.} 異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₅₀）と共に、FUS又はEGFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、クライミングアッセイを行った結果を示す。The results of a climbing assay on transgenic Drosophila expressing FUS or EGFP with an abnormally elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) _{50) are shown.} 異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）と共に、FUS、FUS-RRMmut、又はEGFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、複眼を光学顕微鏡にて観察した結果及び複眼のサイズを測定した結果を示す。Results of observing compound eyes with an optical microscope and measuring the size of compound eyes for transgenic Drosophila expressing FUS, FUS-RRMmut, or EGFP with an abnormally elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) _{89 (S)).} Is shown. 異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）と共に、FUS、FUS-RRMmut、又はEGFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼の成虫原基において、DPRs（ポリ(GR)、ポリ(GA)、及びポリ(GP)）を免疫染色した結果(A)、各DRPsの凝集体数を測定した結果(B)、並びにポリ(GP)量をELISA法にて測定した結果(C)を示す。DPRs (poly (GR), poly (GA)) in compound eye imaginal discs of transgenic Drosophila expressing FUS, FUS-RRMmut, or EGFP with abnormally elongated G4C2 repeat sequences ((G4C2) _{89 (S))} , And the result of immunostaining poly (GP)) (A), the result of measuring the number of aggregates of each DRPs (B), and the result of measuring the amount of poly (GP) by the ELISA method (C) are shown. 異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）又はEGFPを発現し、且つcaz²変異が導入されているトランスジェニックショウジョウバエについて、複眼を光学顕微鏡にて観察した結果及び複眼のサイズを測定した結果を示す。For transgenic Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) ₈₉ (S)) or EGFP and ^{introducing a caz 2} mutation, the results of observing the compound eyes with an optical microscope and measuring the size of the compound eyes. The result is shown.

本書において、「(G4C2)_n」という表記は、GGGGCCがn個繰り返し連結しているG4C2リピート配列を示す。また、「ポリ(GR)」、「ポリ(GA)」、及び「ポリ(GP)」は、それぞれ、グリシン−アルギニン、グリシン−アラニン、及びグリシン−プロリンのジペプチド単位を含むDPRsを示す。 In this document, _{the notation "(G4C2) n} " indicates a G4C2 repeat sequence in which n GGGGCCs are repeatedly concatenated. In addition, "poly (GR)", "poly (GA)", and "poly (GP)" indicate DPRs containing dipeptide units of glycine-arginine, glycine-alanine, and glycine-proline, respectively.

１．ALS又はFTDの予防又は治療剤
本発明の予防又は治療剤は、ALS又はFTDの予防又は治療に使用される薬剤であって、FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明について、詳述する。 1. 1. Prophylactic or therapeutic agents for ALS or FTD The prophylactic or therapeutic agents of the present invention are agents used for the prevention or treatment of ALS or FTD, which are FUS proteins, DNA molecules encoding FUS proteins, and FUS proteins. It is characterized in that at least one selected from the group consisting of production-promoting substances is used as an active ingredient. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

有効成分
本発明では、FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分として使用する。 Active Ingredient In the present invention, at least one selected from the group consisting of FUS protein, a DNA molecule encoding FUS protein, and a substance promoting the production of FUS protein is used as an active ingredient.

（FUSタンパク質）
FUSタンパク質は、それ自体、ALS/FTDにおいて、神経変性の抑制、進行性運動障害の抑制、DPRsへのRAN翻訳抑制等の作用を発揮するため、ALS又はFTDの予防又は治療剤の有効成分として使用できる。 (FUS protein)
The FUS protein itself exerts actions such as suppression of neurodegeneration, suppression of progressive movement disorder, and suppression of RAN translation into DPRs in ALS / FTD, and therefore, as an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for ALS or FTD. Can be used.

FUSタンパク質は、ALS6、ETM4、HNRNPP2、POMP75、TLS等とも称され、RNA結合タンパク質として公知のタンパク質である。 The FUS protein is also called ALS6, ETM4, HNRNPP2, POMP75, TLS, etc., and is a known protein as an RNA-binding protein.

本発明で使用されるFUSタンパク質としては、具体的には、ヒトFUSタンパク質、そのオルソログ、及びそれらの変異体が挙げられる。 Specific examples of the FUS protein used in the present invention include human FUS protein, its ortholog, and variants thereof.

ヒトFUSタンパク質については、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が知られている。 As for the human FUS protein, for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is known.

FUSタンパク質のオルソログとしては、特に制限されないが、例えば、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類 ; サケ、ナマズ等の魚類等に由来するものが挙げられる。FUSタンパク質は、投与対象となる生物種に応じて、その由来を適宜設定すればよい。 The ortholog of the FUS protein is not particularly limited, but for example, mammals such as rats, hamsters, guinea pigs, mice, cows, sheep, pigs, goats, monkeys and rabbits; birds such as chickens and ostriches; salmon, catfish and the like. Examples include those derived from fish and the like. The origin of the FUS protein may be appropriately set according to the species to be administered.

FUSタンパク質の変異体としては、G4C2リピート配列から転写されたリピートRNAに対する結合能を保持していることを限度として特に制限されないが、具体的には、ヒトFUSタンパク質の変異体としては、以下に示す(i)及び(ii)の変異体が挙げられる。
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されてなり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトFUSタンパク質と同等のRNA結合能を有する、ヒトFUSタンパク質の変異体。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列に対して、配列同一性が85％以上であり、且つ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトFUSタンパク質と同等のRNA結合能を有する、ヒトFUSタンパク質の変異体。 The mutant of FUS protein is not particularly limited as long as it retains the ability to bind to repeat RNA transcribed from the G4C2 repeat sequence. Specifically, the mutant of human FUS protein is described below. Examples include the variants (i) and (ii) shown.
(i) A human FUS protein consisting of one or several amino acid residues substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. A variant of the human FUS protein with equivalent RNA-binding ability.
(ii) A human FUS protein having a sequence identity of 85% or more with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an RNA-binding ability equivalent to that of the human FUS protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Mutant.

前記(i)の変異体において、導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から1種類の改変のみ（例えば置換のみ）を含むものであってもよく、2種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(i)のペプチドにおいて、導入される置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、1個又は数個であればよく、例えば1〜30個又は1〜20個、好ましくは1〜15個、1〜10個、1〜8個、1〜5個、又は1〜4個、更に好ましくは1〜3個、特に好ましくは1又は2個或いは1個が挙げられる。 In the mutant of (i) above, the modification of the amino acid introduced may include only one modification (for example, substitution only) from substitutions, additions, insertions, and deletions, and two modifications. The above modifications (eg, substitution and insertion) may be included. In the peptide of (i), the number of amino acids to be introduced, substituted, added, inserted or deleted may be one or several, for example, 1 to 30 or 1 to 20, preferably 1 to 15. 1, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 5, or 1 to 4, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 or 2 or 1.

また、前記(ii)の変異体において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、85％以上であればよいが、好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、特に好ましくは99％以上が挙げられる。 Further, in the mutant of (ii), the sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 99. % Or more.

ここで、前記(ii)の変異体において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、BLAST PACKAGE[sgi32 bit edition,Version 2.0.12;available from National Center for Biotechnology Information(NCBI)]のbl2seq program(Tatiana A.Tatsusova,Thomas L.Madden,FEMS Microbiol.Lett.,Vol.174,p247-250,1999）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Gap insertion Cost value:11、Gap extension Cost value:1に設定すればよい。 Here, in the variant of (ii), the sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the sequence identity calculated in comparison with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. "Sequence identity" refers to the bl2seq program (Tatiana A. Tatsusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol.) Of BLAST PACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCBI)]. The values of amino acid sequence identity obtained by Lett., Vol.174, p247-250, 1999) are shown. The parameters should be set to Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.

また、前記(i)及び(ii)の変異体においてアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の態様として保存的置換が挙げられる。即ち、前記(i)及び(ii)の変異体におけるアミノ酸置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。 When amino acid substitutions are introduced in the mutants (i) and (ii), conservative substitutions can be mentioned as an embodiment of the introduced amino acid substitutions. That is, as the amino acid substitutions in the variants of (i) and (ii), for example, if the amino acid before substitution is a non-polar amino acid, it is replaced with another non-polar amino acid, and the amino acid before substitution is an uncharged amino acid. If so, substitution with another uncharged amino acid, if the amino acid before substitution is an acidic amino acid, substitution with another acidic amino acid, and if the amino acid before substitution is a basic amino acid, with another basic amino acid Substitution can be mentioned.

本発明において、「配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトFUSタンパク質と同等のRNA結合能を有する」とは、RNA結合能が配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトFUSタンパク質と同等であり、当該ヒトFUSタンパク質と同等のALS又はFTDに対する予防又は治療効果を奏することを意味する。 In the present invention, "having an RNA-binding ability equivalent to that of the human FUS protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" means that the RNA-binding ability is equivalent to that of the human FUS protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It means that it has a preventive or therapeutic effect on ALS or FTD equivalent to that of the human FUS protein.

なお、配列番号１に示すアミノ酸配列（ヒトFUSタンパク質）において286位〜371位のアミノ酸残基は、RNA認識モチーフ領域を形成しているので、前記(i)及び(ii)の変異体では、当該RNA認識モチーフ領域には変異（置換、欠失、及び／又は挿入）が施されていないことが望ましい。 In the amino acid sequence (human FUS protein) shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid residues at positions 286 to 371 form an RNA recognition motif region. It is desirable that the RNA recognition motif region is not mutated (substituted, deleted, and / or inserted).

FUSタンパク質は、天然タンパク質であってもよいが、遺伝子工学的手法により製造された組換え体であってもよい。 The FUS protein may be a native protein or a recombinant produced by a genetic engineering technique.

（FUSタンパク質をコードしているDNA分子）
FUSタンパク質をコードしているDNA分子は、投与された生体内でFUSタンパク質を発現することにより、ALS又はFTDにおいて、神経変性の抑制、進行性運動障害の抑制、DPRsへのRAN翻訳抑制等の作用を発揮するため、ALS又はFTDの予防又は治療剤の有効成分として使用できる。 (DNA molecule encoding FUS protein)
The DNA molecule encoding the FUS protein expresses the FUS protein in the administered body, thereby suppressing neurodegeneration, suppressing progressive movement disorder, suppressing RAN translation into DPRs, etc. in ALS or FTD. Since it exerts its action, it can be used as an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for ALS or FTD.

FUSタンパク質をコードしているDNA分子における塩基配列は公知であり、例えば、ヒトFUSタンパク質をコードしているDNA分子としては、配列番号２に示す塩基配列を含むDNA分子が挙げられる。また、ヒトFUSタンパク質をコードしているDNA分子の他の例としては、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトFUSタンパク質と同等のRNA結合能を有し、且つ、配列番号２に示す塩基配列からなるDNA分子と相補的な塩基配列を含むDNA分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA分子が挙げられる。 The base sequence in the DNA molecule encoding the FUS protein is known. For example, the DNA molecule encoding the human FUS protein includes a DNA molecule containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Further, as another example of the DNA molecule encoding the human FUS protein, it has the same RNA-binding ability as the human FUS protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Examples thereof include a DNA molecule containing a base sequence complementary to the DNA molecule consisting of the above, and a DNA molecule that hybridizes under stringent conditions.

ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、0.5％ SDS、5×デンハルツ〔Denhartz's、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400〕および100 μg/ml サケ***DNAを含む6×saline sodium citrate (SSC)（1×SSCは、0.15 M NaCl、0.015 M クエン酸ナトリウム、pH7.0）中で、50℃〜65℃で4時間〜一晩保温する条件をいう。 Here, "stringent conditions" are 0.5% SDS, 5 × Denhartz [Denhartz's, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Phylcol 400] and 100 μg / ml salmon sperm DNA. In 6 × saline sodium citrate (SSC) (1 × SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), the condition is to keep warm at 50 ° C to 65 ° C for 4 hours to overnight.

ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、DNAライブラリー又はcDNAライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、6×SSC、0.5% SDS、5×デンハルツ、100 μg/ml サケ***DNAを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、65℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、³²Ｐでラベルした各プローブを加えて、65℃で一晩保温する。このナイロン膜を6×SSC中、室温で10分間、0.1％ SDSを含む2×SSC中、室温で10分間、0.1％ SDSを含む0.2×SSC中、45℃で30分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているDNAを検出する。 Hybridization under stringent conditions is specifically carried out by the following method. That is, a nylon membrane on which a DNA library or cDNA library is immobilized is prepared, and nylon is prepared at 65 ° C. in a prehybridization solution containing 6 × SSC, 0.5% SDS, 5 × Denhalz, and 100 μg / ml salmon sperm DNA. Block the membrane. Then ^{add each probe labeled with 32} P and keep warm at 65 ° C overnight. This nylon film was washed in 6 × SSC at room temperature for 10 minutes, in 2 × SSC containing 0.1% SDS, at room temperature for 10 minutes, in 0.2 × SSC containing 0.1% SDS for 30 minutes at 45 ° C., and then autoradiographed. Graffiti is taken to detect DNA that specifically hybridizes to the probe.

FUSタンパク質をコードしているDNA分子は、その塩基配列に基づいて、遺伝子工学的手法によって得ることができる。 The DNA molecule encoding the FUS protein can be obtained by genetic engineering techniques based on its base sequence.

また、FUSタンパク質をコードしているDNA分子は、生体内でFUSタンパク質を発現できるように、発現ベクターに組み込んで使用することが好ましい。 In addition, the DNA molecule encoding the FUS protein is preferably used by incorporating it into an expression vector so that the FUS protein can be expressed in vivo.

当該発現ベクターとしては、具体的には、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられる。これらの中でも、ヒト等の哺乳動物を投与対象とする場合には、ウイルスベクターが好適である。 Specific examples of the expression vector include a plasmid vector, an adenovirus vector, an adeno-related virus vector, a herpesvirus vector, a vaccinia virus vector, a retrovirus vector, a lentiviral vector, and a Sendai virus vector. Among these, a viral vector is suitable when a mammal such as a human is to be administered.

当該発現ベクターでは、FUSタンパク質をコードしているDNA分子が、投与対象となる生体内の細胞でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていればよい。発現ベクターに使用されるプロモーターは、投与対象である生体で機能可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、SV40由来プロモーター、サイトメガロウイルスLTR、ラウス肉腫ウイルスLTR、MoMuLV由来LTR、アデノウイルス由来プロモーター等のウイルスプロモーター；β−actin遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、transferrin遺伝子プロモーター、nestin遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター等；Synapsin I、prion遺伝子プロモーター等の神経特異的遺伝子プロモーターが挙げられる。 In the expression vector, the DNA molecule encoding the FUS protein may be functionally linked to a promoter capable of exerting promoter activity in cells in vivo to be administered. The promoter used for the expression vector is not particularly limited as long as it can function in the living body to be administered, and for example, SV40-derived promoter, cytomegalovirus LTR, Laus sarcoma virus LTR, MoMuLV-derived LTR, adenovirus. Virus promoters such as origin promoters; mammalian constituent protein gene promoters such as β-actin gene promoter, PGK gene promoter, transferrin gene promoter, nestin gene promoter, etc .; nerve-specific gene promoters such as Synapsin I, prion gene promoter, etc. Be done.

当該発現ベクターは、FUSタンパク質をコードしているDNA分子の下流に転写終結シグナルを含んでいることが好ましい。更に、当該発現ベクターには、更に形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子含んでいてもよい。 The expression vector preferably contains a transcription termination signal downstream of the DNA molecule encoding the FUS protein. Furthermore, the expression vector may further contain a selectable marker gene for selection of transformed cells.

（FUSタンパク質の産生促進物質）
FUSタンパク質の産生促進物質とは、生体内でFUSタンパク質の産生を促進させる物質である。当該産生促進物質は、投与された生体において、生体が本来有しているFUSタンパク質の産生能を向上させ、産生されたFUSタンパク質が、ALS又はFTDにおいて、神経変性の抑制、進行性運動障害の抑制、DPRsへのRAN翻訳抑制等の作用を発揮するため、ALS又はFTDの予防又は治療剤の有効成分として使用できる。 (FUS protein production promoter)
The FUS protein production-promoting substance is a substance that promotes the production of FUS protein in vivo. The production-promoting substance improves the ability of the living body to produce FUS protein that the living body originally has, and the produced FUS protein suppresses neurodegeneration and causes progressive motility disorder in ALS or FTD. Since it exerts actions such as suppression and suppression of RAN translation into DPRs, it can be used as an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for ALS or FTD.

当該産生促進物質は、生体内でFUSタンパク質の発現を促進させることを限度として、FUSの転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化、及びフォールディング等のいかなる段階で作用するものであってもよい。 The production-promoting substance acts at any stage of FUS transcription, post-transcriptional regulation, translation, post-translational modification, localization, folding, etc., as long as it promotes the expression of FUS protein in vivo. There may be.

他の成分
本発明の予防又は治療剤は、前記有効成分の他に、ALS又はFTDの予防又は治療に有効な他の薬理活性成分を含んでいてもよい。 Other Ingredients In addition to the active ingredient, the prophylactic or therapeutic agent of the present invention may contain other pharmacologically active ingredients effective in the prevention or treatment of ALS or FTD.

また、本発明の予防又は治療剤は、前記有効成分の他に、所望の投与形態及び製剤形態に調製するために、必要に応じて、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体としては、具体的には、メチルセルロース、ポリソルベート80、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等の懸濁化剤；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート80、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール等の溶解補助剤；ヒト血清アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等の安定化剤；ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等の吸着防止剤；ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；水、生理食塩水等の希釈剤；脂質；緩衝剤；乳化剤；着色料；着香料；甘味料等が挙げられる。 In addition to the active ingredient, the prophylactic or therapeutic agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier, if necessary, in order to prepare a desired dosage form and formulation form. Specific examples of pharmaceutically acceptable carriers include suspending agents such as methyl cellulose, polysorbate 80, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragant powder, sodium carboxymethyl cellulose, and polyoxyethylene sorbitan monolaurate; polyoxyethylene. Dissolving aids such as hardened castor oil, polysorbate 80, nicotinic acid amide, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, tuna glycol; stabilizers such as human serum albumin, dextran, methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, sodium metasulfite; human Anti-adsorption agents such as serum albumin, lecithin, dextran, ethylene oxide / propylene oxide copolymer, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyethylene glycol; sucrose, starch, mannit, sorbit, lactose, glucose , Capsuiles such as cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate; binders such as cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polypropylpyrrolidone, gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch; starch, carboxymethyl cellulose, hydroxy Disintegrants such as propyl starch, sodium hydrogen carbonate, calcium phosphate, calcium citrate, lubricants such as magnesium stearate; diluents such as water and physiological saline; lipids; buffers; emulsifiers; coloring agents; flavoring agents; sweetness Fees, etc. can be mentioned.

また、本発明の予防又は治療剤において、有効成分としてFUSタンパク質をコードしているDNA分子を使用する場合であれば、遺伝子治療剤において使用されるトランスフェクション試薬（リポソーム、ポリアミン等）が含まれていてもよい。 In addition, when a DNA molecule encoding a FUS protein is used as an active ingredient in the prophylactic or therapeutic agent of the present invention, a transfection reagent (liposomes, polyamines, etc.) used in the gene therapeutic agent is included. May be.

剤型
本発明の予防又は治療剤の剤型については、特に制限されず、使用する有効成分の種類や投与形態等に応じて適宜設定すればよい。本発明の予防又は治療剤の剤型として、具体的には、注射剤、シロップ剤、細胞懸濁液、リポソーム製剤等の液状製剤；錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、等の固形状製剤等が挙げられる。また、注射剤にする場合には、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。 The preventive or therapeutic agent dosage form dosage forms the present invention is not particularly limited, it may be appropriately set according to the active substance used type and dosage forms and the like. Specific examples of the dosage form of the prophylactic or therapeutic agent of the present invention include liquid preparations such as injections, syrups, cell suspensions, and liposome preparations; tablets, hard capsules, soft capsules, granules, powders, etc. Examples thereof include solid preparations such as pills. Further, when it is used as an injection, it may be in the form of a powder for preparation at the time of use (for example, lyophilized powder) which is dissolved in physiological saline or the like before use.

投与対象
本発明の予防又は治療剤は、ALS又はFTDにおいて、神経変性、運動障害、及びDPRsへのRAN翻訳を抑制し、ALS又はFTDの症状を改善できるので、ALS又はFTD予防又は治療目的で使用される。 Subject of administration The prophylactic or therapeutic agent of the present invention can suppress neurodegeneration, movement disorders, and RAN translation into DPRs in ALS or FTD and improve the symptoms of ALS or FTD. Therefore, for the purpose of preventing or treating ALS or FTD. used.

C9orf72遺伝子非翻訳領域内にあるG4C2リピート配列は、健常者において、2〜24回程度繰り返されている。一方、G4C2リピート配列の異常伸長によって発症するALS又はFTD患者においては、約30回以上、場合によっては数千リピート以上繰り返されている。本発明の予防又は治療剤は、このようなG4C2リピート配列の異常伸長によって発症するALS又はFTDに対して好適に使用される。とりわけ、家族性及び孤発性ALS又はFTDでは、G4C2リピート配列の異常伸長が高頻度で生じており、本発明の予防又は治療剤の好適な適用対象といえる。 The G4C2 repeat sequence in the C9orf72 gene untranslated region is repeated about 2 to 24 times in healthy subjects. On the other hand, in ALS or FTD patients who develop due to abnormal elongation of the G4C2 repeat sequence, it is repeated about 30 times or more, and in some cases several thousand repeats or more. The prophylactic or therapeutic agent of the present invention is preferably used for ALS or FTD caused by such abnormal elongation of the G4C2 repeat sequence. In particular, in familial and sporadic ALS or FTD, abnormal elongation of the G4C2 repeat sequence occurs frequently, and it can be said that the prophylactic or therapeutic agent of the present invention is a suitable application target.

本発明の予防又は治療剤において、投与対象となる生物は、ALS又はFTDに罹患している生物であればよく、ヒトの他、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類 ; サケ、ナマズ等の魚類等が挙げられる。本発明で使用される有効成分の由来は、投与対象となる生物の種類に応じて設定すればよい。例えば、ヒトのALS又はFTDの予防又は治療する場合であれば、有効成分は、ヒトFUSタンパク質、ヒトFUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びヒトFUSタンパク質の産生促進物質の中から選択して使用すればよい。 In the prophylactic or therapeutic agent of the present invention, the organism to be administered may be an organism suffering from ALS or FTD, and in addition to humans, rats, hamsters, guinea pigs, mice, cows, sheep, pigs, goats, etc. Mammals such as monkeys and rabbits; birds such as chickens and ostriches; fish such as salmon and catfish. The origin of the active ingredient used in the present invention may be set according to the type of the organism to be administered. For example, in the case of prevention or treatment of human ALS or FTD, the active ingredient is selected from human FUS protein, a DNA molecule encoding human FUS protein, and a substance promoting production of human FUS protein. You can use it.

投与方法
本発明の予防又は治療剤の投与形態としては、例えば、経口投与、局所投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経直腸的、皮内投与等が挙げられ、使用する有効成分の種類に応じて適宜設定すればよい。これらの投与形態の中でも、本発明の予防または治療として、好ましくは局所投与が挙げられる。 Administration Method Examples of the administration form of the prophylactic or therapeutic agent of the present invention include oral administration, local administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, intravenous administration, transrectal administration, intradermal administration and the like. It may be set appropriately according to the type of the active ingredient to be used. Among these administration forms, topical administration is preferable as the prevention or treatment of the present invention.

本発明の予防又は治療剤の投与量については、使用する有効成分の種類、投与対象者の年齢、性別、体重、症状の程度、投与形態等に応じて、ALS又はFTDの予防又は治療に有効な量を適宜設定すればよいが、例えば、FUSタンパク質を有効成分として使用する場合であれば、１日当たり、0.1〜100000 μｇ程度となる量を１又は数回に別けて投与すればよい。また、有効成分としてFUSタンパク質をコードしているDNA分子／又はFUSタンパク質の産生促進物質を使用する場合であれば、生体内でのFUSタンパク質の産生量が、前記範囲内になるように適宜設定すればよい。 Regarding the dose of the prophylactic or therapeutic agent of the present invention, it is effective for the prevention or treatment of ALS or FTD depending on the type of active ingredient used, the age, sex, weight, degree of symptoms, administration form, etc. of the subject to be administered. However, for example, when FUS protein is used as an active ingredient, an amount of about 0.1 to 100,000 μg per day may be administered in one or several divided doses. In addition, when a DNA molecule encoding the FUS protein / or a substance promoting the production of the FUS protein is used as the active ingredient, the amount of the FUS protein produced in vivo is appropriately set within the above range. do it.

２．異常伸長したG4C2リピート配列に起因するタンパク質の翻訳抑制剤
後述する実施例の欄で示す通り、FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質には、異常伸長したG4C2リピート配列に起因するタンパク質の翻訳を抑制する作用がある。従って、本発明は、更に、FUSタンパク質、FUSタンパク質をコードしているDNA分子、及びFUSタンパク質の産生促進物質よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、異常伸長したG4C2リピート配列に起因するタンパク質の翻訳抑制剤を提供する。当該翻訳抑制剤は、異常伸長したG4C2リピート配列から生じるジペプチドリピートタンパク質の凝集体の形成に関連する疾患の予防又は治療目的で使用することができる。当該翻訳抑制剤において、有効成分の種類、剤型、投与方法等は、前記「１．ALS又はFTDの予防又は治療剤」の欄に記載の通りである。 2. Protein translation inhibitor due to abnormally elongated G4C2 repeat sequence As shown in the column of Examples described later, abnormally elongated FUS protein, DNA molecule encoding FUS protein, and FUS protein production-promoting substance were abnormally elongated. It has the effect of suppressing the translation of proteins caused by the G4C2 repeat sequence. Therefore, the present invention further comprises an abnormally elongated G4C2 repeat sequence containing at least one selected from the group consisting of FUS protein, a DNA molecule encoding FUS protein, and a substance promoting the production of FUS protein as an active ingredient. Provided is a protein translation inhibitor due to. The translation inhibitor can be used for the prophylactic or therapeutic purpose of diseases associated with the formation of aggregates of dipeptide repeat proteins resulting from abnormally elongated G4C2 repeat sequences. In the translation inhibitor, the type, dosage form, administration method, etc. of the active ingredient are as described in the column of "1. Prophylactic or therapeutic agent for ALS or FTD".

以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

１．実験材料及び実験方法
１−１．ショウジョウバエのストック
ショウジョウバエのストックは、全て、23℃又は25℃で、標準的な餌（グルコース、コーンミール、及び乾燥酵母含有）で飼育及び交配した。 1. 1. Experimental materials and methods
1-1. Drosophila stock All Drosophila stocks were bred and bred at 23 ° C or 25 ° C on standard diets (containing glucose, cornmeal, and dried yeast).

GMR-Gal4の導入遺伝子を有するトランスジェニックショウジョウバエは、京都工芸繊維大の山口政光教授から、UAS-EGFP (#6874)、及びelav-Gal4 (#8765)を有するトランスジェニックショウジョウバエは、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター（Bloomington Drosophila Stock Center）から入手した。FUSのショウジョウバエのホモログであるcazに変異を有するショウジョウバエ（caz²変異体）はドイツ、マックスプランク研究所のErik Storkebaum博士から入手した。 The transgenic Drosophila carrying the GMR-Gal4 transgene is from Professor Masamitsu Yamaguchi of Kyoto Institute of Technology, and the transgenic Drosophila carrying UAS-EGFP (# 6874) and elav-Gal4 (# 8765) is Bloomington Drosophila stock. Obtained from the center (Bloomington Drosophila Stock Center). ^{A Drosophila (caz 2} variant) with a mutation in the FUS Drosophila homolog, caz, was obtained from Dr. Erik Storkebaum of the Max Planck Institute, Germany.

なお、GMRはショウジョウバエの複眼における組織特異的プロモーターであり、elavはショウジョウバエの神経系に特異的に発現する遺伝子のプロモーター部位である。UASはGal4の結合によってその下流の転写が活性化される配列である。 GMR is a tissue-specific promoter in the compound eye of Drosophila, and elav is a promoter site of a gene specifically expressed in the nervous system of Drosophila. UAS is a sequence in which transcription downstream of Gal4 is activated by binding.

１−２．G4C2リピート配列コンストラクト及びトランスジェニックショウジョウバエの作製
異常伸長G4C2リピート配列を複眼において発現するトランスジェニックショウジョウバエをGal4-UASシステムを使用して樹立した。具体的な作製手順は以下に示す通りである。 1-2. Preparation of G4C2 repeat sequence construct and transgenic Drosophila Transgenic Drosophila expressing the abnormally elongated G4C2 repeat sequence in compound eyes were established using the Gal4-UAS system. The specific production procedure is as shown below.

5'末端側がEagI認識配列、3'末端側がPspOMI認識配列で挟まれた人工合成された(G4C2)₅₀をT-ベクターpMD20にサブクローンした。繰り返し数を増やしたG4C2リピート配列を作製するために、pMD20-(G4C2)₅₀プラスミドをEagI及びPspOMIで処理し、(G4C2)₅₀インサートフラグメントを得て、EagIで線状化したpMD20-(G4C2)₅₀プラスミドベクター内にライゲーションした。ライゲーションされたプラスミドにおけるG4C2リピート配列は、理論的に50％の確率で、GGGGCCが100個繰り返し連結していることになる。得られたプラスミドをEcoRI及びHindIIIで処理し、精製した後に、pcDNA^TM3.1/myc-His(-)A vector (Invitrogen)にサブクローンした。サブクローンされたpcDNA^TM3.1/myc-His(-)A-(G4C2)_nプラスミドを増幅し、配列決定した。この段階で、偶発的に、(G4C2)₉からなるG4C2リピート配列を含むpcDNA^TM3.1/myc-His(-)A-(G4C2)₉プラスミドが得られた。再度、pcDNA^TM3.1/myc-His(-)A-(G4C2)_nプラスミドをEcoRI及びXbaIで処理し、精製した後に、ショウジョウバエpUAST vectorにサブクローンした。これらのコンストラクトは、G4C2リピート配列の上流に開始コドン（ATG）を有していない。これらのpUAST-(G4C2)_nプラスミドをrecombinase-mutated SURE2 E.coli株(Agilent Technologies)に導入し、増幅させた。 _{The artificially synthesized (G4C2) 50} sandwiched between the EagI recognition sequence on the 5'end side and the PspOMI recognition sequence on the 3'end side was subcloned into the T-vector pMD20. To generate a G4C2 repeat sequence with increased number of repeats, the pMD20- (G4C2) ₅₀ plasmid was treated with EagI and PspOMI _{to obtain (G4C2) 50} insert fragments and linearized with EagI pMD20- (G4C2). Ligation was performed in _{50 plasmid vectors.} The G4C2 repeat sequence in the ligated plasmid has a theoretically 50% chance of ligating 100 GGGGCCs repeatedly. The resulting plasmid was treated with EcoRI and HindIII, purified, and then ^{subcloned into pcDNA TM} 3.1 / myc-His (-) A vector (Invitrogen). The subcloned pcDNA ^TM 3.1 / myc-His (-) A- (G4C2) _n plasmid was amplified and sequenced. At this stage, accidentally, (G4C2) pcDNA containing G4C2 repeat sequence consisting of _{^{9 TM 3.1 / myc-His (}} -) A- (G4C2) 9 plasmid was obtained. Again, the pcDNA ^TM 3.1 / myc-His (-) A- (G4C2) _n plasmid was treated with EcoRI and XbaI, purified, and then subcloned into the Drosophila pUAST vector. These constructs do not have a start codon (ATG) upstream of the G4C2 repeat sequence. These pUAST- (G4C2) _n plasmids were introduced into the recombinase-mutated SURE2 E. coli strain (Agilent Technologies) and amplified.

Geteway Vector Conversion System (Invitrogen)を用いて、pUAST-FUSプラスミド、pUAST-ILF2プラスミド、及びpUAST-hnRNPKプラスミドを作製した。ヒトFUS cDNA（配列番号２）、ヒトILF2 cDNA（配列番号３）、及びヒトhnRNPK cDNA（配列番号４）をpENTR^TM/D-TOPO plasmid (Invitrogen)にサブクローンした。GatewayデスティネーションベクターpUAST-DESTを作製するために、Gateway cassette A sequences (Invitrogen)をpUASTベクターに挿入した。前記プラスミド、pUAST-DESTベクター、制限エンドヌクレアーゼ、及びリガーゼを用いて、pUAST-FUSプラスミド、pUAST-ILF2プラスミド、及びpUAST-hnRNPKプラスミドを得た。また、ヒトFUSタンパク質のアミノ酸配列305位、341位、359位、及び368位のフェニルアラニンをロイシンに変異させるようにDNA配列を変異させ、FUS RRM変異（FUS-RRMmut）コンストラクト(pUAST-FUS-RRMmut)も作製した。得られた各プラスミドDNAをPowerPrep HP Plasmid Maxiprep System (OriGene)を用いて精製し、G4C2リピート配列におけるGGGGCCの繰り返し数を求めた。なお、pUAST-(G4C2)₈₉プラスミドについては、EZ-Tn5^TM <KAN-2> Insertion Kit (Epicentre)を用いた転写因子の挿入変異の誘発後、挿入配列を利用して配列決定及びGGGGCCの繰り返し数を決定した。 The Geteway Vector Conversion System (Invitrogen) was used to generate the pUAST-FUS plasmid, pUAST-ILF2 plasmid, and pUAST-hnRNPK plasmid. Human FUS cDNA (SEQ ID NO: 2), human ILF2 cDNA (SEQ ID NO: 3), and human hnRNPK cDNA (SEQ ID NO: 4) were ^{subcloned into pENTR TM} / D-TOPO plasmid (Invitrogen). To generate the Gateway destination vector pUAST-DEST, Gateway cassette A sequences (Invitrogen) were inserted into the pUAST vector. The above plasmid, pUAST-DEST vector, restriction endonuclease, and ligase were used to obtain the pUAST-FUS plasmid, pUAST-ILF2 plasmid, and pUAST-hnRNPK plasmid. In addition, the DNA sequence was mutated so as to mutate phenylalanine at positions 305, 341, 359, and 368 of the human FUS protein to leucine, and the FUS RRM mutation (FUS-RRMmut) construct (pUAST-FUS-RRMmut) was mutated. ) Was also produced. Each of the obtained plasmid DNAs was purified using the PowerPrep HP plasmid Maxiprep System (OriGene), and the number of GGGGCC repeats in the G4C2 repeat sequence was determined. For the pUAST- (G4C2) ₈₉ plasmid, after induction of transcription factor insertion mutation using the EZ-Tn5 ^TM <KAN-2> Insertion Kit (Epicentre), sequencing and GGGGCC were repeated using the insertion sequence. Determined the number.

前記各pUASTベクターが導入されたトランスジェニックショウジョウバエを、標準的な方法にて作製した。pUAST-(G4C2)_nのトランスジェニックショウジョウバエをUAS-(G4C2)_nとし、UAS-(G4C2)₈₉はGMR-Gal4系統と交配した時の発現量が多いものを(G4C2)₈₉(S)、少ないものを(G4C2)₈₉(W)とした。また、Gal4系統とUAS系統を交配させることにより、所望の組織で導入遺伝子が発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製した。 Transgenic Drosophila into which each of the above pUAST vectors was introduced were prepared by a standard method. pUAST- (G4C2) _n of transgenic Drosophila and _{UAS- (G4C2) n, UAS- (} G4C2) 89 is what many expression amount when crossed with GMR-Gal4 line (G4C2) ₈₉ (S), less The thing was (G4C2) ₈₉ (W). In addition, by crossing the Gal4 strain and the UAS strain, a transgenic Drosophila in which the transgene was expressed in a desired tissue was prepared.

１−３．Repeat-primed PCR分析
FastDNA Green SPIN Kit (MP-Biomedicals)を用いてトランスジェニックショウジョウバエからゲノムDNAを単離した。ゲノムDNA中のG4C2リピート配列について、文献（Renton, A.E. et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron 72, 257-68 (2011).）に記載の方法に従って、Repeat-primed PCRを行った。また、Peak Scanner^TM software v1.0 (Applied Biosystems)を備えたABI 3130xl genetic analyzer (Applied Biosystems)にて、PCRフラグメントの蛍光フラグメント長分析（Fluorescence fragment length analysis）を行った。これによって、導入されたG4C2リピート配列におけるGGGGCCの繰り返し数を求め、(G4C2)₉、(G4C2)₅₀、及び(G4C2)₈₉からなるG4C2リピート配列が、それぞれ導入されていることが確認された。 1-3. Repeat-primed PCR analysis
Genomic DNA was isolated from transgenic Drosophila using the FastDNA Green SPIN Kit (MP-Biomedicals). The method described in the literature (Renton, AE et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron 72, 257-68 (2011).) For the G4C2 repeat sequence in genomic DNA. Repeat-primed PCR was performed according to the procedure. In addition, Fluorescence fragment length analysis of PCR fragments was performed with an ABI 3130xl genetic analyzer (Applied Biosystems) equipped with ^{Peak Scanner TM software v1.0 (Applied Biosystems).} From this, the number of repetitions of GGGGCC in the introduced G4C2 repeat sequence was calculated, and it was confirmed that the G4C2 repeat sequence consisting of (G4C2) ₉ , (G4C2) ₅₀ , and (G4C2) ₈₉ was introduced, respectively.

１−４．ショウジョウバエの複眼のイメージング、及び当該複眼の色素異常とサイズの定量
CCDカメラPD21(Olympus)を備える実体顕微鏡SZX10(Olympus)を用いて、ショウジョウバエの複眼の光学顕微鏡像を取得した。ショウジョウバエの複眼の色素異常とサイズの定量は、文献（Saitoh, Y. et al. p62 Plays a Protective Role in the Autophagic Degradation of Polyglutamine Protein Oligomers in Polyglutamine Disease Model Flies. Journal of Biological Chemistry 290, 1442-1453 (2015).）に記載の方法に従て行った。遺伝子型毎に少なくとも10個の複眼を分析し、結果を平均値±SEMとして表した。 1-4. Imaging of Drosophila compound eyes and quantification of dyschromia and size of the compound eyes
Using a stereomicroscope SZX10 (Olympus) equipped with a CCD camera PD21 (Olympus), an optical microscope image of a double-eyed Drosophila was obtained. Quantification of Drosophila compound eye dyschromia and size is described in the literature (Saitoh, Y. et al. P62 Plays a Protective Role in the Autophagic Degradation of Polyglutamine Protein Oligomers in Polyglutamine Disease Model Flies. Journal of Biological Chemistry 290, 1442-1453 ( It was carried out according to the method described in 2015).). At least 10 compound eyes were analyzed for each genotype and the results were expressed as mean ± SEM.

１−５．卵から成虫までの生存率分析
第二染色体バランサーであるCyOを有し、ヘテロ接合型のelav-Gal4ドライバーを有する雌ショウジョウバエと、ホモ接合型のUAS-(G4C2)_nを有する雄ショウジョウバエとを交配した。F1では、神経細胞においてG4C2リピート配列を発現するショウジョウバエ（即ち、elav-Gal4ドライバー及びUAS-(G4C2)_nを有するショウジョウバエ）が生まれた。G4C2リピート配列を発現するショウジョウバエはCyOバランサーを有しておらず（即ち、表現型が[Cy^-]）、G4C2リピート配列を発現しないショウジョウバエはCyOバランサーを有する（即ち、表現型が[Cy⁺]）。 1-5. Survival analysis from eggs to adults Mating female Drosophila with CyO, a chromosome balancer, and a heterozygous elav-Gal4 driver with male Drosophila with homozygous UAS- (G4C2) _n bottom. In F1, Drosophila expressing the G4C2 repeat sequence in neurons (ie, Drosophila with the elav-Gal4 driver and UAS- (G4C2) _n ) were born. Drosophila expressing G4C2 repeat sequence does not have a CyO balancer (i.e., phenotypically [Cy ^-]), Drosophila does not express G4C2 repeat sequence has a CyO balancer (i.e., phenotypically [Cy ^+] ).

卵から成虫になるまでの孵化率を以下の方法で算出した：表現型が[Cy^-]のショウジョウバエの数を表現型が[Cy⁺]のショウジョウバエの数で除し、更に100を掛けた相対値を卵から成虫までの生存率（％）として算出した。 Hatchability from egg until adult was calculated by the following method: phenotype [Cy ^-] a number of Drosophila phenotype of dividing the number of Drosophila [Cy ^+], further multiplied by 100 relative The value was calculated as the survival rate (%) from eggs to adults.

１−６．クライミングアッセイを利用した運動能力分析
高さ150 mm、内径22 mmのガラスバイアルに、10〜20個体の雄ショウジョウバエを個体に刺激を与えないように入れた。5分間静置した後に、ガラスバイアルの底部を穏やかにタップし、10秒間でショウジョウバエがガラスバイアルの壁を昇って到達した高さをデジタルビデオカメラで記録し、高さが2 cm未満を0、高さが2〜3.9 cmを1、高さが4〜5.9 cmを2、高さが6〜7.9 cmを3、高さが8〜9.9 cmを4、高さが10 cm以上を5としてスコア化した。本実験は、20秒間の間隔をあけて5回実施し、結果を平均値±SEMとして表した。 1-6. Exercise Ability Analysis Using Climbing Assay 10-20 male Drosophila were placed in a glass vial with a height of 150 mm and an inner diameter of 22 mm so as not to irritate the individual. After allowing to stand for 5 minutes, gently tap the bottom of the glass vial and record the height reached by the Drosophila ascending the wall of the glass vial with a digital video camera in 10 seconds, 0 less than 2 cm in height. Score 2 to 3.9 cm as 1, height 4 to 5.9 cm as 2, height as 6 to 7.9 cm as 3, height as 8 to 9.9 cm as 4, and height as 10 cm or more as 5. It became. This experiment was performed 5 times with an interval of 20 seconds, and the results were expressed as the average value ± SEM.

１−７．寿命分析
1バイアルあたり約30個体のショウジョウバエに羽化後から標準餌を与えて飼育し、寿命分析を行った。2又は3日毎に、新鮮な餌が入ったバイアルに移し、その時に死亡していた個体数を計測した。ショウジョウバエの飼育は全個体が死滅するまで行った。各グループについて、3バイアル以上を用いて実験を行い、統計解析を行った。 1-7. Life analysis
After emergence, about 30 Drosophila per vial were fed a standard diet and bred, and lifespan analysis was performed. Every two or three days, they were transferred to vials containing fresh food and the number of individuals dying at that time was counted. Drosophila were bred until all individuals died. For each group, experiments were conducted using 3 or more vials, and statistical analysis was performed.

１−８．蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)
3齢幼虫を氷冷PBS中で解剖により複眼成虫原基を取り出し、4%パラホルムアルデヒド(pH7.0)を含むPBS（RNase-free）で30分間固定し、更に100%メタノールで脱水処理した。固定サンプルを、75v/v%、50v/v%、及び25v/v%のエタノールを含むPBSで再水和後、PBS及び蒸留水（ジエチルピロカーボネート処理した蒸留水）でリンスした。次いで、0.2N HClを含む蒸留水を用いて、室温で20分間処理し、蒸留水でリンスした。更に、サンプルを0.2% Triton X-100を含むPBSで処理し、PBSで5分間リンスした後に、4%パラホルムアルデヒド(pH7.0)を含むPBSで20分間後固定した。その後、PBSを用いて5分間の洗浄を2回行い、2 mg/mLのグリシンを含むPBS内での15分間インキュベートを2回行った。アセチル化処理の後に、ハイブリダイゼーションバッファー（50%のホルムアミド、2×SSC、0.2mg/mLの酵母tRNA、及び0.5mg/mLのヘパリンを含有）内で、37℃で1時間インキュベートした。その後、サンプルを5'末端Alexa594標識(GGCCCC)₄ LNA(locked nucleic acid)プローブ又はAlexa488標識(CCGGGG)₄ LNAプローブ(5nM)と共に、ハイブリダイゼーションバッファー中で80℃、終夜インキュベートした。なお、これらのLNAプローブは、GeneDesign Incによって合成されたものを使用した。ハイブリダイゼーション後に、80℃の4×SSC内での5分間の洗浄を1回、80℃の2×SSC及び50％ホルムアミドを含む溶液内での20分間の洗浄を3回、80℃の0.1×SSC内での40分間の洗浄を3回、及び室温のPBT（0.5% Triton X-100を含むPBS）内での洗浄を1回行った。その後、サンプルをDAPIにて核染色し、SlowFadeゴールド退色防止剤(Thermo Fisher Scientific)を用いてスライドグラスにマウントし、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Zeiss LSM710）にて観察した。 1-8. Fluorescence in situ hybridization (FISH)
The 3rd instar larvae were dissected in ice-cold PBS to remove the compound eye imaginal disc, fixed with PBS (RNase-free) containing 4% paraformaldehyde (pH 7.0) for 30 minutes, and further dehydrated with 100% methanol. The fixed sample was rehydrated with PBS containing 75v / v%, 50v / v%, and 25v / v% ethanol, and then rinsed with PBS and distilled water (distilled water treated with diethylpyrocarbonate). It was then treated with distilled water containing 0.2N HCl at room temperature for 20 minutes and rinsed with distilled water. In addition, the sample was treated with PBS containing 0.2% Triton X-100, rinsed with PBS for 5 minutes, and then fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde (pH 7.0) for 20 minutes. It was then washed twice with PBS for 5 minutes and incubated twice in PBS containing 2 mg / mL glycine for 15 minutes. After the acetylation treatment, it was incubated in a hybridization buffer (containing 50% formamide, 2 × SSC, 0.2 mg / mL yeast tRNA, and 0.5 mg / mL heparin) at 37 ° C. for 1 hour. The sample was then incubated overnight in hybridization buffer with a 5'terminal Alexa 594 labeled (GGCCCC) ₄ LNA (locked nucleic acid) probe or Alexa 488 labeled (CCGGGG) _{4 LNA probe (5 nM).} As these LNA probes, those synthesized by GeneDesign Inc were used. After hybridization, one 5-minute wash in 4 × SSC at 80 ° C, three 20-minute washes in a solution containing 2 × SSC at 80 ° C and 50% formamide, 0.1 × at 80 ° C. Three 40-minute washes in SSC and one washes in room temperature PBT (PBS containing 0.5% Triton X-100). Then, the sample was nuclear-stained with DAPI, mounted on a slide glass using SlowFade Gold Anti-fading Agent (Thermo Fisher Scientific), and observed with a confocal laser scanning microscope (Zeiss LSM710).

１−９．免疫蛍光染色
3齢幼虫を氷冷PBS中で解剖により複眼成虫原基を取り出し、4%パラホルムアルデヒド(pH7.0)を含むPBSで30分間固定した後に、PBTで3回洗浄した。次いで、サンプルを5％ヤギ血清を含むPBTでブロックングした後に、一次抗体としてラットモノクローナル抗poly(GR)抗体(clone 5A2, Millipore MABN778)、ウサギポリクローナル抗poly(GP)抗体(Cosmo Bio CAC-TIP-C9-P01)、又はウサギポリクローナル抗poly(GA)抗体(Novus Biologicals NBP2-25018)と共に4℃で終夜インキュベートした。PBTで3回洗浄した後に、二次抗体として、Alexa 633標識抗ラットIgG抗体(Invitrogen A-21094)、又はAlexa 488標識抗ウサギIgG抗体(Invitrogen A-11008)と共にインキュベートした。その後、PBTで3回洗浄した後に、DAPIにて核染色し、SlowFadeゴールド退色防止剤を用いてスライドグラスにマウントし、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Zeiss LSM710）にて観察した。 1-9. Immunofluorescent staining
The 3rd instar larvae were dissected in ice-cold PBS to remove the compound eye imaginal disc, fixed in PBS containing 4% paraformaldehyde (pH 7.0) for 30 minutes, and then washed 3 times with PBT. The sample was then blocked with PBT containing 5% goat serum, followed by rat monoclonal anti-poly (GR) antibody (clone 5A2, Millipore MABN778) and rabbit polyclonal anti-poly (GP) antibody (Cosmo Bio CAC-TIP) as primary antibodies. -C9-P01) or rabbit polyclonal anti-poly (GA) antibody (Novus Biologicals NBP2-25018) was incubated overnight at 4 ° C. After washing 3 times with PBT, it was incubated with Alexa 633 labeled anti-rat IgG antibody (Invitrogen A-21094) or Alexa 488 labeled anti-rabbit IgG antibody (Invitrogen A-11008) as secondary antibody. Then, after washing with PBT three times, nuclear staining was performed with DAPI, mounted on a slide glass using SlowFade Gold anti-fading agent, and observed with a confocal laser scanning microscope (Zeiss LSM710).

１−１０．ポリ(GP)タンパク質の測定
G4C2リピート配列、或は(G4C2)₈₉と共にEGFP、FUS、又はFUS-RRMmutを発現している5日齢のショウジョウバエの頭部を回収し、-80℃で保存した。サンプルを文献（Tran, H. et al. Differential Toxicity of Nuclear RNA Foci versus Dipeptide Repeat Proteins in a Drosophila Model of C9ORF72 FTD/ALS. Neuron 87, 1207-14 (2015).）に記載の方法に従って調製した。Poly(GP)は、文献（Su, Z. et al. Discovery of a biomarker and lead small molecules to target r(GGGGCC)-associated defects in c9FTD/ALS. Neuron 83, 1043-50 (2014).）に記載のサンドイッチELISA法によって測定した。データは、EGFPと(G4C2)₈₉を発現している場合の値によって標準化した。 1-10. Measurement of poly (GP) protein
Heads of 5-day-old Drosophila expressing EGFP, FUS, or FUS-RRMmut with the G4C2 repeat sequence or (G4C2) _{89 were harvested and stored at -80 ° C.} Samples were prepared according to the method described in the literature (Tran, H. et al. Differential Toxicity of Nuclear RNA Foci versus Dipeptide Repeat Proteins in a Drosophila Model of C9ORF72 FTD / ALS. Neuron 87, 1207-14 (2015).). Poly (GP) is described in the literature (Su, Z. et al. Discovery of a biomarker and lead small molecules to target r (GGGGCC)-associated defects in c9FTD / ALS. Neuron 83, 1043-50 (2014).) Measured by the sandwich ELISA method. The data were standardized by the values when EGFP and (G4C2) _{89 were expressed.}

１−１１．DPRsの凝集体数の定量
ZENイメージンフソフトウェア(Zeiss)を使用して、ショウジョウバエの複眼原基におけるDPRsの凝集体数を定量的に測定した。手順は以下に示す通りである。先ず、DAPI染色によって複眼原基の後端から2列と3列の発生途中の13個眼の光受容体ニューロンを選択した。次いで、直径が2 μmよりも大きく且つ細胞質に局在するDPRsの凝集体数を計測した。各遺伝子型について10個以上の複眼原基について分析し、結果を平均値±SEMとして表した。 1-11. Quantification of the number of aggregates of DPRs
The number of aggregates of DPRs in the Drosophila compound eye primordium was quantitatively measured using ZEN Imagenf software (Zeiss). The procedure is as shown below. First, 13 rows of developing photoreceptor neurons in rows 2 and 3 from the posterior end of the compound eye primordium were selected by DAPI staining. Next, the number of aggregates of DPRs having a diameter of more than 2 μm and localized in the cytoplasm was measured. For each genotype, 10 or more compound eye primordia were analyzed and the results were expressed as mean ± SEM.

１−１２．統計解析
全ての統計解析は、public domain R program (http://www.r-project.org/)又はGraphPad Prism 6 softwareを用いて行った。 1-12. Statistical analysis All statistical analyzes were performed using the public domain R program (http://www.r-project.org/) or GraphPad Prism 6 software.

２．実験結果
２−１．異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエの特性
２−１−１．複眼の状態
異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₅₀、(G4C2)₈₉(W)、及び(G4C2)₈₉(S)）を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼を光学顕微鏡にて観察した結果を図１に示す。また、比較として、EGFP又は正常なG4C2リピート配列（(G4C2)₉）を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼を光学顕微鏡にて観察した結果も併せて図１に示す。 2. Experimental result
2-1. Characteristics of transgenic Drosophila expressing abnormally elongated G4C2 repeat sequences
2-1-1. Abnormal condition of compound eye The result of observing the compound eye of transgenic Drosophila expressing the elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) ₅₀ , (G4C2) ₈₉ (W), and (G4C2) _{89 (S)) with an optical microscope is shown in the figure.} Shown in 1. For comparison, FIG. 1 also shows the results of observing the compound eyes of transgenic Drosophila expressing EGFP or a normal G4C2 repeat sequence ((G4C2) _{9) with an optical microscope.}

図１から分かるように、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエでは、強度の複眼神経変性が認められ、特に(G4C2)₅₀を発現する場合では25℃での飼育では死滅していた。一方、EGFP又は正常なG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエでは、複眼に異常は認められなかった。 As can be seen from FIG. 1, transgenic Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence showed severe compound eye neurodegeneration, and in particular, when (G4C2) ₅₀ was expressed, it died when reared at 25 ° C. .. On the other hand, in transgenic Drosophila expressing EGFP or a normal G4C2 repeat sequence, no abnormality was observed in the compound eyes.

即ち、本結果から、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエでは、ALS/FTDの代表的な症状である神経変性を確認できた。 That is, from this result, it was confirmed that in transgenic Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence, neurodegeneration, which is a typical symptom of ALS / FTD, was confirmed.

２−１−２．成虫までの生存率及び成虫の寿命
異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₅₀、(G4C2)₈₉(W)）又は正常なG4C2リピート配列（(G4C2)₉）を発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、成虫までの生存率を評価した結果を図２Ａに示し、成虫の寿命を評価した結果を図２Ｂに示す。これらの結果から、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエは、正常なG4C2リピート配列を発現する場合に比して、成虫までの生存率が低く、成虫の寿命が1/4〜1/5程度にまで短縮されていることが明らかとなった。 2-1-2. Adult viability and adult lifespan For transgenic Drosophila expressing an elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) ₅₀ , (G4C2) ₈₉ (W)) or a normal G4C2 repeat sequence ((G4C2) ₉₎ The result of evaluating the survival rate up to is shown in FIG. 2A, and the result of evaluating the lifespan of adults is shown in FIG. 2B. From these results, transgenic Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence has a lower survival rate to adults and a lifespan of 1/4 to 1 in adults than when expressing a normal G4C2 repeat sequence. It became clear that it was shortened to about / 5.

２−１−３．運動能力
異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₅₀、(G4C2)₈₉(W)）又は正常なG4C2リピート配列（(G4C2)₉）を発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、クライミングアッセイを行った結果を図３に示す。この結果から、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエは、正常なG4C2リピート配列を発現する場合に比して、クライミングアッセイにおけるスコアが著しく低下していることが分かった。特に(G4C2)₈₉を発現するトランスジェニックショウジョウバエでは加齢に伴ってスコアが有意に低下していた。即ち、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエは、ALS/FTDの代表的な症状である進行性運動障害を呈することが確認された。 2-1-3. Exercise capacity abnormal elongated G4C2 repeat sequence _{((G4C2) 50, (G4C2} ) 89 (W)) for transgenic Drosophila expressing or normal G4C2 repeat sequence ((G4C2) _9), FIG. The results of the climbing assay Shown in 3. From this result, it was found that the transgenic Drosophila expressing the abnormally elongated G4C2 repeat sequence had a significantly lower score in the climbing assay than the case of expressing the normal G4C2 repeat sequence. In particular, _{transgenic Drosophila expressing (G4C2) 89} showed a significant decrease in score with aging. That is, it was confirmed that transgenic Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence exhibit progressive motility disorder, which is a typical symptom of ALS / FTD.

２−１−４．異常伸長G4C2リピート配列の転写及びRAN翻訳
異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼において、当該リピート配列から転写されたRNA、及びDPRs（ポリ(GR)、ポリ(GA)、及びポリ(GP)）をFISH及び免疫染色にて分析した結果を図４に示す。 2-1-4. Transcription and RAN translation of abnormally elongated G4C2 repeat sequences RNA and DPRs (poly (GR)) transcribed from the repeat sequences in the compound eye of transgenic Drosophila expressing abnormally elongated G4C2 repeat sequences ((G4C2) _{89 (S)).} ), Poly (GA), and Poly (GP)) are analyzed by FISH and immunostaining, and the results are shown in FIG.

この結果、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエでは、異常伸長したG4C2リピート配列から転写されたRNAが発現しており、更に当該RNAのRAN翻訳産物であるDPRs（ポリ(GR)、ポリ(GA)、及びポリ(GP)）も凝集体を伴って生成していることが確認された。 As a result, transgenic Drosophila expressing the abnormally elongated G4C2 repeat sequence expresses RNA transcribed from the abnormally elongated G4C2 repeat sequence, and further, DPRs (poly (GR), which are RAN translation products of the RNA, It was confirmed that poly (GA) and poly (GP)) were also formed with aggregates.

２−１−５．まとめ
異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエでは、G4C2リピート配列が転写されたRNA及び当該RNAのRAN翻訳産物であるDPRsの凝集体が認められ、更に神経変性及び運動障害を呈しており、寿命も短縮していた。これらの事象は、ALS/FTDにおいて典型的に認められるものであり、当該トランスジェニックショウジョウバエは、ALS/FTDのモデル動物として利用できることを示している。 2-1-5. Summary In transgenic Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence, RNA to which the G4C2 repeat sequence has been transcribed and aggregates of DPRs, which are RAN translation products of the RNA, are observed, and further exhibit neurodegeneration and movement disorders. , The life was also shortened. These events are typically observed in ALS / FTD, indicating that the transgenic Drosophila can be used as a model animal for ALS / FTD.

２−２．異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエに対してG4C2リピート配列に結合可能なタンパク質が及ぼす影響
異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）又はEGFPと共に、FUS、ILF2（Interleukin enhancer-binding factor 2）、又はhnRNPK（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K）を発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼を光学顕微鏡にて観察した結果を図５に示す。 2-2. Effect of proteins capable of binding to G4C2 repeat sequence on transgenic Drosophila expressing abnormally elongated G4C2 repeat sequence FUS, ILF2 (Interleukin) together with abnormally elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) _{89 (S)) or EGFP} FIG. 5 shows the results of observing the compound eyes of transgenic Drosophila expressing enhancer-binding factor 2) or hnRNPK (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K) with an optical microscope.

FUS、ILF2、及びhnRNPKは、G4C2リピート配列から転写されたRNAに対する結合能があることが報告されている。FUSは異常伸長したG4C2リピート配列による複眼神経変性を抑制していた。一方、ILF2、及びhnRNPKは異常伸長したG4C2リピート配列による複眼神経変性を抑制していなかった。即ち、この結果から、異常伸長したG4C2リピート配列に起因する症状の改善効果は、FUSに特有のものであることが明らかとなった。 FUS, ILF2, and hnRNPK have been reported to be capable of binding RNA transcribed from G4C2 repeat sequences. FUS suppressed compound eye neurodegeneration due to abnormally elongated G4C2 repeat sequences. On the other hand, ILF2 and hnRNPK did not suppress compound eye neurodegeneration due to the abnormally elongated G4C2 repeat sequence. That is, from this result, it was clarified that the effect of improving the symptom caused by the abnormally elongated G4C2 repeat sequence is peculiar to FUS.

２−３．異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエに対してFUSが及ぼす影響
２−３−１．運動能力
異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₅₀）と共に、FUS又はEGFPを神経系で発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、クライミングアッセイを行った結果を図６に示す。また、また、比較として、EGFPと共にFUSを発現するトランスジェニックショウジョウバエの結果についても図６に示す。 2-3. Effect of FUS on transgenic Drosophila expressing abnormally elongated G4C2 repeat sequences
2-3-1. With exercise capacity abnormal elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) _50), the transgenic Drosophila expressing FUS or EGFP in the nervous system, shows the results of climbing assay Figure 6. Also, for comparison, the results of transgenic Drosophila expressing FUS with EGFP are also shown in FIG.

図６に示すように、異常伸長したG4C2リピート配列と共にFUSを発現する場合には、運動障害を効果的に抑制できていた。 As shown in FIG. 6, when FUS was expressed together with an abnormally elongated G4C2 repeat sequence, motility disorder could be effectively suppressed.

２−３−２．複眼の状態
異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）と共に、FUS、FUS-RRMmut、又はEGFPを複眼で発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、複眼を光学顕微鏡にて観察した結果及び複眼のサイズを測定した結果を図７に示す。また、比較として、EGFPと共に、FUS、FUS-RRMmut、又はEGFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエの結果についても図７に示す。 2-3-2. Abnormal condition of compound eye The result of observing the compound eye with an optical microscope and the compound eye of a transgenic Drosophila expressing FUS, FUS-RRMmut, or EGFP in the compound eye together with the elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) _{89 (S)).} The result of measuring the size is shown in FIG. For comparison, the results of transgenic Drosophila expressing FUS, FUS-RRMmut, or EGFP together with EGFP are also shown in FIG.

この結果、異常伸長したG4C2リピート配列と共にFUSを発現する場合には、複眼神経変性を効果的に抑制できていた。また、FUSのRNA認識モチーフ領域に変異を加えたFUS-RRMmutを発現する場合では、複眼神経変性を抑制できていなかった。即ち、これらの結果から、FUSは、G4C2リピート配列から転写されたRNAに結合することによって、神経変性を抑制していることが明らかとなった。 As a result, when FUS was expressed together with an abnormally elongated G4C2 repeat sequence, compound eye neurodegeneration could be effectively suppressed. In addition, when FUS-RRMmut with a mutation in the RNA recognition motif region of FUS was expressed, compound eye neurodegeneration could not be suppressed. That is, from these results, it was clarified that FUS suppresses neurodegeneration by binding to RNA transcribed from the G4C2 repeat sequence.

２−３−３．異常伸長G4C2リピート配列の転写及びRAN翻訳
異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）と共に、FUS又はEGFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエの複眼において、DPRs（ポリ(GR)、ポリ(GA)、及びポリ(GP)）を蛍光免疫染色した結果を図８Ａに示す。また、当該トランスジェニックショウジョウバエにおいて、各DRPsの凝集体数を測定した結果についても、図８Ｂに示す。更に、異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）と共に、FUS、FUS-RRMmut、又はEGFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエにおけるポリ(GP)量をELISA法にて測定した結果も図８Ｃに示す。 2-3-3. Transcription and RAN translation of abnormally elongated G4C2 repeat sequences DPRs (poly (GR), poly (GA)) in the compound eye of transgenic Drosophila expressing FUS or EGFP with abnormally elongated G4C2 repeat sequences ((G4C2) _{89 (S))} ), And poly (GP)) are shown in FIG. 8A. The results of measuring the number of aggregates of each DRPs in the transgenic Drosophila are also shown in FIG. 8B. Furthermore, the result of measuring the amount of poly (GP) in transgenic Drosophila expressing FUS, FUS-RRMmut, or EGFP together with the abnormally elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) _{89 (S)) by the ELISA method is also shown in FIG. 8C.} Shown in.

この結果から、異常伸長したG4C2リピート配列を発現するトランスジェニックショウジョウバエにおいてFUSを発現させることによって、DPRsの凝集体数、及びポリ(GP)の量が低減されていることが明らかとなった。 From this result, it was clarified that the number of aggregates of DPRs and the amount of poly (GP) were reduced by expressing FUS in transgenic Drosophila expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence.

２−３−４．ショウジョウバエFUSホモログcaz変異体の影響
異常伸長したG4C2リピート配列（(G4C2)₈₉(S)）又はEGFPを発現し、且つcaz²変異の導入されたトランスジェニックショウジョウバエ（caz²/+）について、複眼を光学顕微鏡にて観察した結果及び眼のサイズを測定した結果を図９に示す。また、比較のために、caz²変異を導入していないトランスジェニックショウジョウバエ（+/+）の結果についても、図９に示す。 2-3-4. Effect of Drosophila FUS Homolog caz variant For transgenic Drosophila (caz ² / +) expressing an abnormally elongated G4C2 repeat sequence ((G4C2) ₈₉ (S)) or EGFP and having a caz ^{2 mutation introduced, compound eyes} The results of observation with an optical microscope and the results of measuring the size of the eye are shown in FIG. For comparison, the results of transgenic Drosophila (+ / +) without ^{the caz 2 mutation are also shown in FIG.}

この結果、ショウジョウバエFUSホモログであるcaz変異を導入すると複眼神経変性が増悪することが確認された。 As a result, it was confirmed that the introduction of the caz mutation, which is a Drosophila FUS homolog, exacerbates compound eye neurodegeneration.

Claims

FUSタンパク質、及びFUSタンパク質をコードしているDNA分子よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、GGGGCCリピート配列の異常伸長に起因する筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症の予防又は治療剤。 FUS proteins, and as an active ingredient at least one member selected from the group consisting of a DNA molecule encoding the FUS protein, amyotrophic lateral sclerosis or Frontotemporal caused by abnormal expansion of GGGGCC repeat sequence A prophylactic or therapeutic agent for dementia.

家族性の筋萎縮性側索硬化症、又は家族性の前頭側頭型認知症に対して適用される、請求項１に記載の予防又は治療剤。 The prophylactic or therapeutic agent according to claim 1, which is applied to familial amyotrophic lateral sclerosis or familial frontotemporal dementia.

筋萎縮性側索硬化症又は前頭側頭型認知症における神経変性又は運動障害の改善のために使用される、請求項１又は２に記載の予防又は治療剤。 The prophylactic or therapeutic agent according to claim 1 or 2, which is used for improving neurodegeneration or movement disorder in amyotrophic lateral sclerosis or frontotemporal dementia.

FUSタンパク質、及びFUSタンパク質をコードしているDNA分子よりなる群から選択される少なくとも1種を有効成分とする、異常伸長したGGGGCCリピート配列に起因するタンパク質の翻訳抑制剤。

FUS proteins, and as an active ingredient at least one member selected from the group consisting of a DNA molecule encoding the FUS protein translation inhibitor protein resulting in GGGGCC repeat sequences abnormally expanded.