KR101836756B1

KR101836756B1 - Il-17a를 표적화하는 백신

Info

Publication number: KR101836756B1
Application number: KR1020167020472A
Authority: KR
Inventors: 히로시 코리야마; 히로노리 나카가미; 류이치 모리시타
Original assignee: 오사카 유니버시티
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2018-03-08
Also published as: AU2014370875A1; US20160319013A1; CA2935046C; CN106132433A; EP3088000A4; JP6164593B2; EP3088000A1; US11421025B2; AU2014370875B2; KR20160126978A; CA2935046A1; CN106132433B; WO2015099167A1; JPWO2015099167A1

Abstract

본 발명은, 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 면역원으로 사용한 IL-17A에 대한 백신 및 상기 백신을 포함하고 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환의 예방 또는 치료제 등을 제공한다.

Description

IL-17A를 표적화하는 백신 {VACCINE TARGETING IL-17A}

본 발명은 IL-17A의 에피토프를 표적화하는 백신 등에 관한 것이다.

전신성 홍반성 루푸스(SLE)는 두피에서 발가락까지 신체의 모든 부분에 영향을 미치는 자가면역 질환이며, 다양한 증상을 갖고 다양한 기관에 영향을 미치는 만성 염증성 질환이다. SLE의 병태에 대해, 자가항원과 항체의 면역 복합체가 각 기관에 침착하여 국소 염증을 유도하고, 그것이 조직 장애를 유발하여 추가의 면역 반응을 초래하고, 이의 과정 동안 타입 1 인터페론 등의 사이토킨이 관여하는 것으로 예상되고 있다. 그러나, 자세한 것은 알려지지 않았다.

SLE 환자의 대부분은 가임 연령의 여성이기 때문에, 여성 호르몬과 병인의 관련성이 의심되고 있다. 한편, SLE는 북미에서 흑인 여성이 백인 여성보다 유병율이 높고, 유전적 소인의 존재가 의심되고 있다. 그러나, 병인은 아직 불분명하다.

SLE는 부신 피질 스테로이드, 면역억제제, 항암제로서의 사이클로포스파미드 등으로 치료되며, 비특이적 면역억제 작용은 SLE의 병세를 억제할 수 있다. 한편, 비특이적 면역억제 작용은 감염증을 앓기 쉬워지는 등의 문제를 유발한다. 게다가, 부신 코르티코 스테로이드는 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 우울증 등의 부작용을 유발하고, 사이클로포스파미드는 골수억제, 발암성 및 불임의 강한 부작용과 연관된다. SLE 환자의 대부분은 가임 연령 여성이기 때문에, 불임의 문제는 특히 심각하다.

이런 상황에서, 병태의 보다 상세한 해명과 그 병인에 기반하고 부작용이 적은 분자 특이적 치료 방법의 개발이 요구되고 있다.

최근, SLE 환자에 대한 임상 연구에서, SLE 환자의 혈중 IL-17 농도가 대조군에 비해 유의적으로 높은 것으로 보고되었다(비특허 문헌 1). 또한, SLE와 유사한 병변을 갖는 PP2A 유전자이식 마우스의 신장에서, IL-17의 혈중 농도의 증가, 및 상기 마우스에 IL-17에 대한 중화 항체의 투여에 의해 신장 병변의 개선이 보고되었다(비특허 문헌 2). 이러한 발견에서, 하나의 가능성으로서, SLE의 병태에서 타입 I 인터페론과 IL-17이 악순환을 형성하고, 그 병변의 진행에 중요한 역할을 한다는 가설이 제기되고 있다(비특허 문헌 3).

IL-17은 Th17 세포 등의 면역적격 세포, 마크로파지, 호중구 등으로부터 분비되는 사이토킨이며, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환(크론병, 궤양성 대장염), 다발성 경화증, 건선 등의 많은 자가면역 질환에서 병태의 증악에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다.

최근, 건선 환자에 대한 항-IL-17 항체 제제가 치료 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(비특허 문헌 4). 그러나, 항체 제제는 매우 고가이며, 지속적인 사용 과정에서 항체 제제에 대한 자가항체가 생성되고 유효성을 손실(이차 무효: secondary ineffective)하는 등의 문제가 알려지게 되었다. 이러한 점에서, IL-17을 표적화하는 백신은 이들 질환에 효과적이며, 저렴하고 장기간 동안 유효한 치료제를 제공할 것으로 생각된다.

IL-17에 대한 백신으로서, 전장 IL-17을 면역원으로 사용하는 펩티드 백신의 연구가 보고되어 있다(비특허 문헌 5). 그러나, 전장 IL-17를 면역화에 사용하는 경우, IL-17에 대한 세포 면역성도 또한 야기되고, 세포독성 T 세포는 IL-17을 발현하는 세포를 공격하며, 유해한 부작용이 강력하게 나타날 위험이 있다. 또한, IL-17과 유사한 다른 사이토킨에 교차 반응성을 나타내는 항체도 생성될 수 있다. 따라서, 다른 단백질과의 상동성이 없는 IL-17의 부분 에피토프만을 면역원으로 사용하는 백신이 안전면에서 바람직하다고 생각된다. IL-17 에피토프 백신을 2종류 생성하고 염증성 장 질환 모델 마우스에 투여했다고 보고되었다(비특허 문헌 6). 그러나, 상기 보고에서, 백신 투여 그룹에서 병태가 개선되는 것이 아니라 오히려 증악되었고, 대장의 염증 및 콜라겐 침착이 증가했다.

상기 언급된 바와 같이, IL-17 에피토프 백신에 대한 보고는 존재하지만, 본 출원인은 일부 질환의 치료 효과를 나타내는 어떠한 보고도 알지 못한다.

[문헌 리스트]

[비특허 문헌]

비특허 문헌 1: Nature Immunology, 2009, 10(7):778-785

비특허 문헌 2: J Immunology, 2012, 188(8):3567-3571

비특허 문헌 3: Eur J Immunology 2012, 42(9):2274-2284

비특허 문헌 4: J Dermatol 2014; 41: 1039-1046

비특허 문헌 5: Eur J Immunology 2006, 36(11):2857-2867

비특허 문헌 6: Immunotherapy, 2012, 4(12):1799-1807

본 발명은 IL-17A에 대한 백신 및 상기 백신을 함유하고 SLE 등과 같이 IL-17A가 병태의 증악에 관여하는 질환의 치료 및/또는 예방용 제제 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 예의 연구를 수행하고, IL-17A의 구조에서, IL-17A 수용체에 대한 결합에 중요한 아미노산 부위를 특정했다. 상기 아미노산 영역의 일부를 항원으로 사용하여, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 B형 간염 바이러스 코어 항원 폴리펩티드를 코딩하는 벡터에 삽입하여 DNA 백신을 생성했다. 상기 DNA 백신을 SLE 모델 마우스로서 NZBWF1 마우스에 투여했다. 그 결과, 항체 역가(antibody titer) 의 높은 증가가 관찰되었고, 당해 항체와 재조합 IL-17A와의 결합 실험에 의해 IL-17A를 정확하게 인식하는 항체의 생산을 확인했다. 또한, 상기 DNA 백신을 투여한 다른 SLE 모델 마우스로서 MRL/lpr 마우스에서 혈중 TNF-α가 감소했고, NZBWF1 마우스에서 혈중 IL-1β가 감소했다. 또한, NZBWF1 마우스의 상기 DNA 백신 투여 그룹의 장기 관찰에 의해, 상기 DNA 백신 투여 그룹에서 생존 기간의 유의한 연장을 관찰했다. 또한, NZBWF1 마우스의 신장에서 병리 소견의 개선과 F4/80 발현 저하, MRL/lpr 마우스의 비장 중량의 감소가 관찰되었고, 이에 의해 상기 DNA 백신에 의한 SLE 병태의 개선 효과를 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 대장염 모델 마우스, 관절염 모델 마우스, 대장암 이식 마우스, 폐암 이식 마우스에 있어서도, 상기 DNA 백신 또는 상기 DNA에 의해 코딩되는 펩티드 백신을 투여함으로써 병태를 개선할 수 있음을 확인했다.

놀랍게도, 본 발명자들은, 본 발명에서 백신 투여 그룹에서는 종래 보고된 IL-17의 에피토프 백신에서 관찰되는 병태의 증악이 관찰되지 않음을 확인했다.

이들 발견에 기초하여, 본 발명자들은 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다.

[1] 다음 (1) 내지 (3) 중의 어느 하나를 포함하는, IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환의 예방 또는 치료용 백신:

(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 1에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,

(2) 서열 번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 1에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및

(3) 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터,

[2] 다음 (1) 내지 (3) 중의 어느 하나를 포함하는, 상기 [1]의 백신:

(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;

(2) 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 및

[3] 발현 벡터가 B형 간염 바이러스 코어(HBc)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 상기 [1] 또는 [2]의 백신,

[4] 발현 벡터가 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열이 서열번호 17에 제시되는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 246과 뉴클레오티드 번호 247의 사이에 삽입되는, 상기 [1] 또는 [2]의 백신,

[5] 캐리어 단백질 및/또는 애쥬번트를 포함하는, 상기 [1] 내지 [4]의 백신,

[5-1] 상기 [1] 내지 [5] 중의 어느 하나의 백신을 포함하는 조성물,

[6] IL-17A가 증악 요인으로서 관여하는 질환이 SLE, 염증성 장 질환, 관절염, 종양, 건선 및 다발성 경화증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 [1] 내지 [5]의 백신,

[7] 다음 (1) 또는 (2)를 포함하고, 여기서 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 대장암 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 [1] 내지 [6]의 백신:

(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및

(2) 상기 (1)의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터,

[8] 다음 (1) 내지 (3) 중의 어느 하나를 포함하고, IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 류마티스성 관절염인, 상기 [1] 내지 [6]의 백신:

(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;

[9] 다음 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체를 포함하는, IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환의 예방 또는 치료제:

(2) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 1에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,

[10] 다음 (1) 또는 (2)에 따른 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체를 포함하는, 상기 [9]의 예방 또는 치료제:

(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 8 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;

(2) 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,

[10-1] IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 SLE, 염증성 장 질환, 건선, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 뇌척수염, 종양(비-소세포성 폐암, 대장암, 혈구계 종양 등 IL-17A가 증악에 관여하는 다양한 종양성 질환), 동맥경화증, 만성 염증성 질환 및 알레르기 질환(지연형 과민증, 접촉형 과민증)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 [9] 또는 [10]의 예방 또는 치료제,

[11] IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 SLE, 염증성 장 질환, 관절염, 종양, 건선 및 다발성 경화증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 [9] 또는 [10]의 예방 또는 치료제,

[11-1] IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 SLE인, 상기 [9] 또는 [10]의 예방 또는 치료제,

[12] IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 대장암 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체를 포함하는, 상기 [9] 내지 [11]의 예방 또는 치료제,

[13] IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 류마티스성 관절염이고, 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는, 상기 [9] 내지 [11]의 예방 또는 치료제,

[14] 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,

[14-1] 상기 [14]을 코딩하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 백신은 SLE 등과 같이 IL-17A가 병태의 증악 인자로서 관여하는 질환의 치료 등에 사용할 수 있다.

도 1은 IL-17A 에피토프를 함유하는 발현 벡터의 구조를 나타낸다. A) pcDNA3.1 + HBc 벡터의 구조, B) Hbc의 240번째 및 241번째 염기 사이에 스페이서 및 IL-17A의 부분 서열을 코딩하는 서열을 삽입한 벡터의 구조, C) 상기 B에 제시된 바와 같이 IL-17A의 에피토프를 삽입한 벡터를 나타내는 모식도이다.
도 2는 재조합 IL-17A 단백질과 IL-17A1 DNA 백신(에피토프 서열: RPSDYLNR) 또는 IL-17A2 DNA 백신으로 면역화시킨 Balb/c 마우스의 혈청 유래 항체의 결합을 나타낸다. A) 1차 항체로서 IL-17A1 DNA 백신의 투여에 의해 수득한 항혈청을 사용했다. B) 1차 항체로서 항-IL-17A 항체를 사용했다. C) 1차 항체로서 항-BSA 항체를 사용했다.
도 3은 IL-17A1 DNA 백신으로 면역화시킨 Balb/c 마우스의 6주에서 항체 역가의 증가를 나타낸다. No1 내지 No4 1차 항체(마우스 항혈청)를 10배 희석하고, 이어서 10배로 연속적으로 희석하여 사용했다. No1: IL-17A1 No1 항혈청, No2: IL-17A1 No2 항혈청, No3: IL-17A1 No3 항혈청, No4: IL-17A1 No4 항혈청
도 4는 A) NZBWF1 마우스에 IL-17A1 DNA 백신 투여의 계획을 나타낸다. B) IL-17A1 DNA 백신 투여 그룹에서 항체 역가의 증가를 나타낸다.
도 5는 IL-17A1 DNA 백신으로 면역화시킨 마우스에서 수득한 항혈청과 BSA-IL-17A1(RPSDYLNR) 접합체(No5 BSA 접합체) 또는 마우스 재조합 IL-17A(No5 rIL-17)과의 결합을 나타낸다. 1차 항체(마우스 항혈청)을 100배 희석하고, 이어서 5배 연속적으로 희석하여 사용했다.
도 6은 IL-17A1 DNA 백신을 투여한 NZBWF1 마우스 또는 MRL/lpr 마우스의 A) 소변 단백질(NZBWF1 마우스), B) 소변 MCP-1 농도(pg/ml)(NZBWF1 마우스), C) 혈중 IL-17A 농도(pg/ml)(NZBWF1 마우스), D) 혈중 TNF-α 농도(pg/ml)(MRL/lpr 마우스), E) 혈중 IL-1β 농도(pg/ml)(NZBWF1 마우스) 및 F) 혈중 TNF-α 농도(pg/ml)(NZBWF1 마우스)를 나타낸다.
도 7은 A) IL-17A1 DNA 백신을 투여한 NZBWF1 마우스의 생존율(도면에서, 화살표는 백신 투여를 의미한다) 및 B) 항-IL-17A1 항체 역가를 나타낸다.
도 8은 IL-17A1 DNA 백신을 투여한 MRL/lpr 마우스의, A) 혈중 TNF-α 농도(pg/ml) 및 B) 생존율(도면에서, 화살표는 백신 투여를 의미한다)를 나타낸다.
도 9는 IL-17A1 DNA 백신을 투여한 MRL/lpr 마우스의, A) 체중(g), B) 전체 체중당 심장 중량의 비율, C) 비장 중량(mg), 및 D) 전체 체중당 비장 중량의 비율을 나타낸다.
도 10은 조직 병리학적 분석 계획을 나타낸다. A)는 NZBWF1 마우스에 IL-17A1 DNA 백신, 식염수 투여의 계획을 나타내고, B)는 MRL/lpr 마우스에 IL-17A1 DNA 백신, 식염수 투여의 계획을 나타낸다.
도 11은 NZBWF1 마우스 또는 MRL/lpr 마우스의 신장에 IL-17A1 DNA 백신 또는 식염수를 투여한 후의 신장의 A) PAS 염색 사진(중간 확대), B) PAS 염색 사진(고도 확대), C) F4/80 면역염색 사진(NZBWF1 마우스), D) F4/80 면역염색 사진(MRL/lpr 마우스)를 나타낸다.
도 12는 NZBWF1 마우스에게 IL-17A1 DNA 백신 또는 식염수를 투여한 후에 턱밑샘의 HE 염색의 사진을 나타낸다.
도 13은 NZBWF1 마우스 또는 MRL/lpr 마우스에게 IL-17A1 DNA 백신 또는 식염수를 투여한 후에 간의 HE 염색의 사진을 나타낸다.
도 14는 A) Balb/c 마우스에 TNBS 투여와 IL-17A1 DNA 백신 투여의 계획을 나타낸다. 또한, TNBS와 IL-17A1 DNA 백신 또는 식염수를 투여한 Balb/c 마우스의, B) 체중의 증가율(%), C) 대장의 길이(mm), D) 대장의 HE 염색 사진, E) 대장의 HE 점수를 나타낸다.
도 15는 A) DBA/1 마우스에게 IL-17A1 DNA 백신 투여와 타입 II 콜라겐 투여의 계획을 나타낸다. 또한, IL-17A1 DNA 백신 또는 식염수와 타입 II 콜라겐을 투여한 DBA/1 마우스의, B) 관절염의 임상 점수 및 C) 관절의 사진을 나타낸다.
도 16은 A) Balb/c 마우스에게 IL-17A1 펩티드 백신 투여와 CT26 세포 접종의 계획을 나타낸다. 또한, IL-17A1 펩티드 백신 또는 식염수를 투여하고 CT26 세포를 접종한 Balb/c 마우스의 B) 종양 용적(mm³) 및 C) 생존율을 나타낸다.
도 17은 A) C57 BL/6 마우스에게 IL-17A1 DNA 백신 투여와 LLC 세포 접종의 계획을 나타낸다. 또한, IL-17A1 DNA 백신 또는 식염수를 투여하고 LLC 세포를 접종한 C57 BL/6 마우스의, B) 체중(g), C) 종양 용적(mm³), D) LLC 세포 접종 28일 후의 종양 중량(mg), E) 폐 전이의 사진 영상, F) 폐 전이 수(암), G) 간 전이 수(암)를 나타낸다.
도 18은 인간 IL-17A1 에피토프(서열번호 1)로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신으로 면역화시킨 마우스에서 수득한 항혈청(IL-17 인간) 또는 백신 투여 전의 혈청(Preimmune)과 BSA-인간 IL-17A1 접합체의 결합을 나타낸다. 1차 항체(마우스 항혈청)을 10배로 희석하고, 이어서 5배 연속적으로 희석하여 사용했다.
도 19는 A) 인간 IL-17A1 에피토프(서열번호 1)로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신으로 면역화시킨 마우스에서 수득한 항혈청과 BSA-인간 IL-17A1 접합체(No Y11-5주 인간), 또는 BSA-마우스 IL-17A1 접합체(No Y11-5주 마우스)의 결합을 나타낸다. 또한, 백신 투여 전의 혈청과 BSA-인간 IL-17A1 접합체(No Y11 Pre 인간) 또는 BSA-마우스 IL-17A1 접합체(No Y11 Pre 마우스)의 결합을 나타낸다. 1차 항체(마우스 항혈청)를 10배로 희석하고, 이어서 5배 연속적으로 희석하여 사용했다. B)는 마우스 IL-17A1 에피토프(서열번호 5)로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신으로 면역화시킨 마우스에서 수득한 항혈청과 BSA-마우스 IL-17A1 접합체(No G8-5주 마우스), 또는 BSA-인간 IL-17A1 접합체(No G8-5주 인간)과의 결합을 나타낸다. 또한, 백신 투여 전의 혈청과 BSA-마우스 IL-17A1 접합체(No G8 Pre 마우스), 또는 BSA-인간 IL-17A1 접합체(No G8 Pre 인간)와의 결합을 나타낸다. 1차 항체(마우스 항혈청)을 10배로 희석하고, 이어서 5배 연속적으로 희석하여 사용했다.
도 20은 인간 IL-17A2 에피토프(서열번호 8)로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신으로 면역화시킨 마우스에서 수득한 항혈청과 BSA-인간 IL-17A2 접합체(No AF975)와의 결합, 또는 인간 IL-17A3 에피토프(서열번호 9)로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신으로 면역화시킨 마우스에서 수득한 항혈청과 BSA-인간 IL-17A3 접합체(No AF976)와의 결합을 나타낸다. 1차 항체(마우스 항혈청)을 10배로 희석하고, 이어서 5배 연속적으로 희석하여 사용했다.
도 21은 인간 IL-17A4 에피토프(서열번호 11)로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신, 인간 IL-17A5 에피토프(서열번호 12)를 코딩하는 DNA를 함유하는 백신, 인간 IL-17A6 에피토프(SDY)를 코딩하는 DNA를 함유하는 백신, 또는 인간 IL-17A7 에피토프(DYY)를 코딩하는 DNA를 함유하는 백신으로 면역화시킨 Balb/c 마우스의 6주에서 항체 역가의 증가를 나타낸다. 각 1차 항체(마우스 항혈청)를 10배 희석하고, 이어서 5배 연속적으로 희석하여 사용했다.
도 22는 A) DBA/1 마우스에게 각종 IL-17A 펩티드 백신과 타입 II 콜라겐의 투여 계획을 나타낸다. B)는 각종 IL-17A 펩티드 백신을 투여하고, 타입 II 콜라겐을 투여한 DBA/1 마우스의 관절염의 임상 점수를 나타낸다. H17: 인간 IL-17A1 에피토프, AF4: 인간 IL-17A4 에피토프, AF5: 인간 IL-17A2 에피토프, 대조군(KLH): KLH, 콜라겐(-): 타입 II 콜라겐 비-투여
도 23은 배지에서 정상 인간 피부 섬유아세포(NHDF)가 분비하는 IL-6 농도를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸다. IL-17 (-) 대조군: IL-17 비-첨가, IL-17 단독: 재조합 인간 IL-17A 첨가, IL-17 + 항혈청: 재조합 인간 IL-17A 및 항-인간 IL-17A1 마우스 항체, IL-17 + 항혈청: 재조합 인간 IL-17A 및 비-면역 마우스 항체

본 발명은 IL-17A에 대한 백신, 및 상기 백신을 함유하고 SLE 등과 같이 IL-17A가 병태의 증악 인자로서 관여하는 질환의 치료 및/또는 예방제 등을 제공한다.

백신

본 발명의 IL-17A에 대한 백신(에피토프 백신이라고도 한다)은 다음 (1) 내지 (3)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

(3) 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터.

그 중에서도, 본 발명의 IL-17A에 대한 백신은 바람직하게는 다음의 (1') 내지 (3')로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

(1') 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,

(2') 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드,

(3') 상기 (1') 또는 (2')의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터.

가장 바람직하게는, 본 발명의 IL-17A에 대한 백신은 다음의 (1") 또는 (2")로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

(1") 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 및

(2") 상기 (1")의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터.

IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환은 IL-17A에 의해 병태가 증악되는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, SLE, 염증성 장 질환(궤양성 대장염, 크론병), 건선, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 뇌척수염, 종양[폐암 (특히, 비-소세포성 폐암이 적합하다), 대장암, 혈구계 종양 등을 포함하여 IL-17A가 증악에 관여하는 다양한 종양성 질환], 동맥경화증, 만성 염증성 질환 및 알레르기 질환(지연형 과민증, 접촉형 과민증 등) 등이 언급될 수 있다. 적합한 질환은 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 폐암, 대장암, 건선, 및 다발성 경화증을 포함하고, 가장 적합한 질환은 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 폐암, 및 대장암을 포함한다. 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이, 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 폐암, 대장암에 대한 치료 효과를 나타냈다. 또한, 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 뿐만 아니라, 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA도 류마티스성 관절염에 대한 치료 효과를 나타냈다. 증악은 병태가 추가로 증악하는 것을 말하고, 증악의 수준는 묻지 않는다.

본 발명의 백신의 투여 대상은 임의의 포유동물이며, 이는 IL-17A가 병태의 증악에 관여하는 질환을 앓고 있는 포유동물 또는 발병 위험이 있는 포유동물이다. 포유동물의 예는 설치류(예: 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그 등), 래빗 등, 개 및 고양이 등의 애완 동물, 소, 돼지, 염소, 말 및 양 등의 가축, 인간, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지 등의 영장류 등을 포함하고, 인간이 바람직하다. 투여 대상은 치료를 받고 있어도 받지 않아도 된다.

본 발명의 백신이 투여되는 경우, 상기 백신에 함유된 물질은 투여 대상체에서 유래하는 물질(즉, 인간에 투여하는 경우, 상기 백신은 인간 유래의 물질이며, 마우스에 투여하는 경우, 상기 백신은 마우스 유래의 물질이다)인 것이 바람직하다.

본 발명의 백신에 함유된 상기 (1)[또는 (1'), (1"), 이하 동일하다]의 폴리펩티드[이하, 상기 (2)(또는 (2'), (2"), 이하 동일하다]의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드라고도 함)는 IL-17A의 부분 아미노산 서열이다.

본 발명은 인간 IL-17A의 62 내지 69번째 아미노산 서열을 서열번호 1로 하고, 상응하는 마우스 IL-17A의 65 내지 72번째 아미노산 서열을 서열번호 5로 한다. 이들은, 예를 들면, 서열번호 2 및 서열번호 6에 제시되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 또한, 인간 IL-17A의 102 내지 118번째 아미노산 서열을 서열번호 8로 하고, 상응하는 마우스 IL-17A의 105 내지 121번째 아미노산 서열을 서열번호 10으로 한다. 이들은, 예를 들면, 서열번호 13 및 서열번호 14에 제시되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

서열번호 1(서열번호 8)에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열은 본 명세서의 서열번호 1(서열번호 8)에 개시된 서열의 정보를 이용하고 공지된 서열 데이터베이스 등을 이용하여 적절한 프라이머 및 프로브를 설계하고, RT-PCR 및 플라크 하이브리드화 등의 일반 유전자 공학 기술을 사용하여 용이하게 수득할 수 있다.

본 발명의 백신에 함유된 상기 (2)의 폴리펩티드는 IL-17A 아미노산 서열의 부분 서열이고, 여기서 하나 또는 수개[바람직하게는 1 내지 수(2~5)개]의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된다. 이러한 폴리펩티드는, 인간의 경우, 서열번호 1(서열번호 8)에 제시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 수개(바람직하게는 1 내지 수(2~5)개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 아미노산 서열의 예는 (1) 서열번호 1(서열번호 8)에 제시되는 아미노산 서열 중의 하나 또는 수개[바람직하게는 1 내지 수(2~5)개]의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, (2) 서열번호 1(서열번호 8)에 제시되는 아미노산 서열에 하나 또는 수개[바람직하게는 1 내지 수(2~5)개]의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, (3) 서열번호 1(서열번호 8)에 제시되는 아미노산 서열에 1 또는 수개[바람직하게는 1 내지 수(2~5)개]의 아미노산이 삽입된 아미노산 서열, (4) 서열번호 1(서열번호 8)에 제시되는 아미노산 서열 중의 하나 또는 수개[바람직하게는 1 내지 수(2~5)개]의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 또는 (5) 상기 (1) 내지 (4)의 돌연변이가 조합된 아미노산 서열[이 경우, 돌연변이된 아미노산의 총합은 하나 또는 수개(바람직하게는 1 내지 수(2~5)개)이다]을 포함한다.

또한, 상기 (2)의 폴리펩티드에 함유된 아미노산 서열은, 서열번호 1(서열번호 8)에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열 중의 하나 또는 수개[바람직하게는 1 내지 수(2-5)개]의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열도 바람직하게 언급할 수 있다.

이러한 폴리펩티드는, 마우스의 경우, 서열번호 5(서열번호 10)에 제시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 수개(바람직하게는 1 내지 수(2~5)개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열도 포함한다. 상기 아미노산 서열의 예는 (1) 서열번호 5(서열번호 10)에 제시되는 아미노산 서열 중의 하나 또는 수개(바람직하게는 1 내지 수(2~5)개)의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, (2) 서열번호 5(서열번호 10)에 제시되는 아미노산 서열에 하나 또는 수개(바람직하게는 1 내지 수(2~5)개)의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, (3) 서열번호 5(서열번호 10)에 제시되는 아미노산 서열에 하나 또는 수개(바람직하게는 1 내지 수(2~5)개)의 아미노산이 삽입된 아미노산 서열, (4) 서열번호 5(서열번호 10)에 제시되는 아미노산 서열 중의 하나 또는 수개(바람직하게는 1 내지 수(2~5)개)의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 및 (5) 상기 (1) 내지 (4)의 돌연변이가 조합된 아미노산 서열(이 경우, 돌연변이된 아미노산의 총합은 하나 또는 수개(바람직하게는 1 또는 수(2~5)개이다))을 포함한다.

"아미노산 잔기의 치환"의 예는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 특정 아미노산을 그 아미노산의 측쇄와 동일한 특성의 측쇄를 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 말한다. 구체적으로는, 보존적 아미노산 치환에서, 특정 아미노산은 그 아미노산과 동일한 그룹에 속하는 다른 아미노산에 의해 치환된다. 유사한 특성의 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 아미노산의 그룹의 예는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 중성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판)을 포함한다. 또한, 중성 측쇄를 갖는 아미노산은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인) 및 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류시느 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판)로 추가로 분류할 수 이TEk. 또한, 다른 그룹으로서, 예를 들면, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를들면, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신), 하이드록실 그룹(알콜성 하이드록실 그룹, 페놀성 하이드록실 그룹)를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 세린, 트레오닌, 티로신) 등도 언급할 수 있다.

"아미노산 잔기의 결실"의 예는, 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열 중의 임의의 아미노산 잔기를 선택하고 결실시키는 것을 포함한다. 이러한 아미노산 서열의 예는 서열번호 11, 서열번호 12, SDY 또는 DYY을 포함한다. 바람직하게는 서열번호 11 및 서열번호 12이다. 이들은 각각, 예를 들면, 서열번호 15 및 서열번호 16에 제시되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

"아미노산 잔기의 삽입" 또는 "아미노산 잔기 부가"의 예는 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열의 내부, 또는 N 말단 측면 또는 C 말단 측면에 아미노산 잔기를 삽입 또는 부가하는 것을 포함한다. 펩티드의 수 용해성을 강화하기 위해, 아미노산 서열의 N 말단 측면 또는 C 말단 측면에 염기성 아미노산인 아르기닌(Arg) 또는 리신(Lys)의 1 또는 2 잔기를 부가할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 부가적 아미노산을 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 부가는, 상기 폴리펩티드가 IL-17A에 대한 특이적 면역 반응을 유도하는 한, 허용된다. 부가되는 아미노산 서열은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 폴리펩티드의 검출 및 정제 등을 촉진하기 위한 태그를 언급할 수 있다. 태그의 예는 Flag 태그, 히스티딘 태그, c-Myc 태그, HA 태그 AU1 태그, GST 태그, MBP 태그 형광 표지 단백질(예를 들면, GFP, YFP, RFP, CFP, BFP 등), 및 이뮤노 글로불린 Fc 태그 등을 포함한다. 아미노산 서열이 부가되는 위치는 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단이다.

본 발명의 폴리펩티드에 사용되는 아미노산은 L형, D형 및 DL형을 포함하지만, 일반적으로 L형인 것이 바람직하다. 이러한 폴리펩티드는 일반 폴리펩티드 합성법으로 합성하여 본 발명에 제공할 수 있다. 본 발명에서, 제조 방법, 합성 방법, 조달 방법 등에 대해서는 특별히 한정되지 않는다.

상기 (3)[또는 (3'), (2"), 이하 동일하다]의 발현 벡터에서, 위의 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA)는 투여 대상인 포유동물의 세포에서 프로모터 활성을 발휘할 수 있는 프로모터의 하류에 기능적으로 연결된다. 즉, (3)의 발현 벡터는 프로모터의 제어하에 전사 생성물로서 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 발현할 수 있다. (3)의 발현 벡터를 포유동물에 투여하함으로써, 당해 포유동물의 체내에서 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드가 생산되고 이로써 당해 포유동물에서 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드에 대한 특이적 면역 반응이 유도된다.

사용되는 프로모터는 투여 대상인 포유동물의 세포에서 기능할 수 있는 한 임의의 것일 수 있고, polI형 프로모터, polII형 프로모터 및 polIII형 프로모터 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는, SV40 유래 초기 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 등의 바이러스 프로모터, β-액틴 유전자 프로모터 등의 포유동물의 구성 단백질 유전자 프로모터 등이 사용된다.

상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 전사 종결 신호, 즉 터미네이터 영역을 바람직하게 함유한다. 또한, 형질전환 세포의 선택을 위한 선별 마커 유전자(테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신 등의 약물에 대한 저항성을 부여하는 유전자, 영양요구성 돌연변이를 보완하는 유전자 등)를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에서 발현 벡터에 사용되는 벡터의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 인간 등의 포유동물에 대한 투여에 바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터 등이다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스 등을 포함한다. 제조 및 취급의 용이성과 경제성을 고려하여, 플라스미드 벡터가 바람직하게 사용된다. 특히 바람직하게는 B형 간염 바이러스 코어(이하 HBc라 한다)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터이다. 이는 국제 공개공보 제WO 2012/141280호 등을 참조할 수 있다.

HBc는 자기-조립에 의해 구형이 되는 성질을 가지고, 상기 자기 조립하여 형성되는 코어 입자의 외부에 IL-17A 에피토프가 그 구조를 유지하면서 안정적으로 존재할 수 있다. HBc 및 IL-17A 에피토프는 직접 공유결합으로 연결될 수 있거나 스페이서를 통해 연결될 수도 있다. 스페이서, IL-7A 에피토프가, HBc의 자가조립으로 형성되는 코어 입자의 외부에 IL-17A 에피토프가 그 구조를 유지하면서 안정적으로 존재하는 한 임의의 것일 수 있다. 이의 예로는, IT, GAT, CGG 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 당해 서열을 포함하는 플라스미드 벡터의 예는 pCAGGS, pCR-X8, pcDNA3.1, pZeoSV, pBK-CMV 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, pcDNA3.1-HBc 벡터이다. 상기 벡터에서, HBc의 80번째와 81번째 아미노산에 상응하는 HBc를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 240번째와 241번째 염기 사이에 스페이서가 삽입되어 있다. 따라서, 상기 (3)의 발현 벡터는 바람직하게는, 상기의 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 17에 제시되는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 246과 뉴클레오티드 번호 247 사이에 삽입된, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터이다.

본 발명의 백신은 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드 또는 (3)의 발현 벡터에 추가하여 임의의 담체, 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 제공될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예는 슈크로즈, 전분 등의 부형제, 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈 등의 결합제, 전분, 카복시메틸셀룰로오즈 등의 붕괴제, 마그네슘 스테아레이트, 에어로졸 등의 윤활제, 시트르산, 멘톨 등의 방향제, 나트륨 벤조에이트, 아황산수소나트륨 등의 보존제, 시트르산, 나트륨 시트레이트 등의 안정제, 메틸셀룰로오즈, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 식염수 등의 희석액, 베이스 왁스 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 백신이 상기 (3)의 발현 벡터인 경우, 당해 발현 벡터의 세포내 도입을 촉진하기 위해, 본 발명의 백신은 또한 핵산 도입용 시약을 포함할 수 있다. 발현 벡터로 바이러스 벡터를 사용하는 경우, 유전자도입 시약으로서 레트로넥틴, 피브로넥틴, 폴리브렌 등을 사용할 수 있다. 또한, 발현 벡터로서 플라스미드 벡터를 사용하는 경우, 리포펙틴, 리포펙타민(lipofectamine), DOGS(트랜스펙탐), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, 폴리브렌 또는 폴리(에틸렌이민)(PEI) 등 양이온성 지질을 사용할 수 있다.

본 발명의 백신은 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드 또는 (3)의 발현 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 면역원성을 증가시키기 위해 캐리어 단백질을 추가로 함유할 수 있다. 캐리어 단백질은 일반적으로 분자량이 작기 때문에 면역원성을 갖지 않는 분자에 결합하여 면역원성을 부여하는 물질이고, 본 기술분야에서 공지되어 있다. 캐리어 단백질의 예로는 소 혈청 알부민(BSA), 토끼 혈청 알부민(RSA), 난 알부민(OVA), 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH), 티로글로불린(TG), 면역글로불린 등을 포함한다. 상기 (3)의 발현 벡터의 경우, 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상기 캐리어 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수도 있다.

본 발명의 백신은 또한 활성 성분과 상용성인 약제학적으로 허용되는 애쥬번트를 추가로 함유할 수 있다. 애쥬번트는 일반적으로 숙주의 면역 반응을 비특이적으로 증강시키는 물질이고, 다수의 다양한 애쥬번트가 본 기술분야에서 공지되어 있다. 애쥬번트의 예로는 다음의 것을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: 완전 프로인트(Freund's) 애쥬번트, 불완전 프로인트 애쥬번트, 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타밀-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세롤-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE), Quill A(등록 상표), 리졸레시틴, 사포닌 유도체, 풀루로닉 폴리올, 몬타니드 ISA-50(Seppic, Paris, France), Bayol(등록 상표 ) 및 Markol(등록 상표).

본 발명의 백신은 경구 또는 비경구적으로 포유동물에 투여할 수 있다. 폴리펩티드 및 발현 벡터는 위장에서 분해될 수 있으므로, 비경구 투여하는 것이 바람직하다. 경구 투여에 적합한 제제는 액제, 캡슐, 사쉐 (sachet), 정제, 현탁액제, 에멀젼 등을 포함한다. 비경구 투여(예를 들면, 피하 주사, 근육 주사, 국소 주입, 복강내 투여 등)에 적합한 제제는 수성 및 비수성의 등장, 무균 주사 용액을 포함하고, 여기에는 항산화제, 완충액, 정균제, 등장성제 등을 임의로 함유한다. 또한, 수성 및 비수성 멸균 현탁액제가 언급될 수 있고, 여기에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제, 방부제 등을 임의로 함유한다. 이러한 제제는 앰플이나 바이알과 같이 단위 투여량 또는 복수 용량으로 용기에 봉입할 수 있다. 또한, 유효 성분 및 약제학적으로 허용되는 담체는 동결 건조시킬 수 있고, 사용 직전에 적당한 무균 비히클에 용해 또는 현탁하는 형태로 저장할 수도 있다.

약제학적 조성물의 활성 성분의 함유량은 일반적으로 약제학적 조성물 전체의 약 0.1 내지 100중량%, 바람직하게는 약 1 내지 99중량%, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 90중량% 정도이다.

본 발명의 백신의 투여량은 투여 대상, 투여 방법, 투여 형태 등에 따라 다르지만, 활성 성분이 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드의 경우, 일반적으로 성인 1인당 폴리펩티드를 1시간당 1㎍ 내지 1000㎍의 범위, 바람직하게는 20㎍ 내지 100㎍의 범위에서 통상 4주에서 12주에 걸쳐 2회에서 3회 투여한다. 항체 역가가 저하된 경우, 그때마다 1회 추가 투여가 수행된다. 활성 성분이 상기 (3)의 발현 벡터인 경우, 일반적으로 성인 1인당 발현 벡터를 회당 1㎍ 내지 1000㎍의 범위, 바람직하게는 20㎍ 내지 100㎍의 범위에서 통상 4주에서 12주에 걸쳐 2회에서 3회 투여한다. 항체가 저하된 경우, 그때마다 1회 추가 투여가 수행된다.

본 발명의 백신을 포유동물에 투여함으로써, IL-17A에 대해 특이적인 면역 반응(특이적 항체 생산, 특이적 T 세포의 증식 등)이 유도되고, 당해 포유동물은 IL-17A에 대한 중화 항체를 획득하고, IL-17A의 기능이 저해되며, 이에 의해 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환에 대한 예방 또는 치료 효과가 제공된다.

본 발명은 본 발명의 백신의 하나 이상의 성분을 함유하는 하나 이상의 용기로 구성된 키트를 제공한다. 본 발명의 키트를 사용하여, IL-17가 증악 인자로서 관여하는 질환을 예방하거나 또는 그 증상을 치료 또는 완화시킬 수 있다.

IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환의 예방 또는 치료용 IL-17A 중화 항체

본 발명은 다음의 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체를 함유하는, IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환의 예방 또는 치료제(본 발명의 예방 또는 치료제)를 제공한다.

(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 1에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(2) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 1에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 상응하는 비-인간 포유동물 유래의 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.

또한, 본 발명의 예방 또는 치료제는 바람직하게는 다음의 (1') 또는 (2')의 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체를 포함한다.

(1') 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;

(2') 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.

가장 바람직하게는, 본 발명의 예방 또는 치료제는 (1'') 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체를 포함한다.

상기 (1) 또는 (2)(또는 (1'), (2') 또는 (1"), 이하 동일하다)의 폴리펩티드를 인식하는 항체는 IL-17A에 결합하여 그 기능을 억제하여 상기 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환에 대한 효과적 예방 및/또는 치료 수단이 될 수 있다. 즉, 당해 항체를 투여하여 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환을 앓고 있는 환자에 대한 치료 효과 및 발병의 우려가 있는 대상체에 대한 예방 효과를 기대할 수 있다.

상기 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환 중에서, SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 폐암, 대장암, 건선, 다발성 경화증, 특히 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 폐암 대장암의 예방 및/또는 치료에 본 발명의 IL-17A 중화 항체를 사용할 수 있다.

본 발명의 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 등의 천연형 항체, 유전자변형 마우스와 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있는 키메라 항체, 인간화 항체 및 단일 가닥 항체, 인간 항체 생산 유전자를 도입한 마우스나 파지 디스플레이 등으로 제작한 인간 항체, 및 이들의 단편 등을 포함한다. 본 발명의 항체는 각각 본 발명의 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체인 한 특별히 한정되지 않지만, IL-17A에 대한 특이성 측면에서 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 또는, 인간의 임상 응용의 관점에서 본 발명의 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체인 것이 바람직하다.

상기 항체 단편은 전술한 항체의 일부분의 영역을 의미하며, 이의 구체적 예는 F(ab')₂, Fab', Fab, Fc 영역을 포함하는 항체 단편, Fv(variable fragment of antibody), sFv, dsFv(disulphide stabilised Fv), dAb(single domain antibody) 등을 포함한다[참조: Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996].

상기 인간화 항체는 인간 이외의 유전자 유래의 항원 인식 부위 및 인간 유전자 유래의 나머지를 갖도록 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조된 항체를 지칭한다. 또한, 상기 인간 항체는 인간 항체 생산 유전자를 도입한 형질전환 마우스[예: TransChromo Mouse(상표)]가 생산하는 인간 항체, 또는 인간의 B 림프구의 mRNA 및 게놈 유래의 VH 유전자와 VL 유전자를 무작위로 조합하여 작제한 라이브러리에서 파지 디스플레이법 등의 디스플레이 기술에 의해 항체 가변 영역을 발현시킨 인간 항체 라이브러리를 사용하여 제작된 항체를 지칭한다.

또한, 항체의 클래스도 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 등의 이소형을 갖는 항체를 포함한다. 바람직하게는, IgG 또는 IgM이며, 항체 정제의 용이성 등을 고려하여, 더욱 바람직하게는 IgG이다.

항체의 제조 방법

폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체는 자체 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 면역원(본 발명의 폴리펩티드)을 필요에 따라 프로인트 애쥬번트(Freund 's Adjuvant)와 함께, 포유동물, 예를 들면, 폴리클로날 항체의 경우, 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 토끼, 고양이, 개, 돼지 염소, 말 및 소 등, 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 염소, 말 또는 토끼에 면역화시킨다. 모노클로날 항체의 경우, 동일한 방법으로 마우스, 래트, 햄스터 등으로 면역화시킨다.

본 발명의 폴리펩티드는 그대로 면역원으로 사용하는 것도 가능하지만, 분자량 10,000 이상의 고분자 화합물(예: 캐리어 단백질 등)을 갖는의 복합체로서 면역화하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 상기 기재된 방법에 따라 합성하고, 소 혈청 알부민(BSA), 토끼 혈청 알부민(RSA), 난 알부민(OVA), 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH), 티로글로불린(TG), 면역글로불린 등의 캐리어 단백질의 복합체를 형성시켜 면역원으로 사용할 수도 있다.

상기 폴리펩티드 및 캐리어 단백질과 복합체를 형성시키는 등의 목적으로 본 발명의 폴리펩티드는 1 내지 2개, 바람직하게는 1개의 아미노산을 부가할 수 있다. 부가되는 아미노산의 위치는, 폴리펩티드의 어느 위치에서도 특별히 한정되지 않지만, 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단이 바람직하다.

복합체의 형성에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 항원성을 유지할 수 있는 한, 자체 공지의 방법을 적용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드에 시스테인 잔기를 도입하여 당해 시스테인 측쇄인 SH 그룹을 통해 상기 고분자 화합물(캐리어 단백질)의 아미노 그룹과 결합시킬 수도 있다(MBS 방법). 또한, 단백질의 라이신 잔기의 ε 아미노 그룹과 α 아미노 그룹 등의 아미노 그룹끼리를 결합시킬 수도 있다(글루타르 알데히드 방법).

폴리클로날 항체는 구체적으로는 다음과 같이 하여 제조할 수 있다. 즉, 면역원성을 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 염소, 말 또는 토끼, 바람직하게는 염소, 말 또는 토끼, 보다 바람직하게는 토끼의 피하내, 근육내, 정맥내, 풋패드내 또는 복강내에 1 내지 수회 주사함으로써 면역화를 실시한다. 일반적으로, 초기 면역에서 약 1 내지 14일마다 1 내지 5회 면역을 실시하여 최종 면역보다 약 1 내지 5일 후에 면역화된 당해 포유동물에서 혈청을 취득한다.

혈청 자체를 폴리클로날 항체로 이용하는 것도 가능하지만, 한외 여과, 황산암모늄 분획, 유글로불린 침전법, 카프로인산법, 카프릴산법, 이온 교환 크로마토 그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항-면역글로불린 컬럼 또는 단백질 A/G 컬럼, 면역원으로 가교시킨 컬럼 등을 사용한 친화성 컬럼 크로마토그래피하여 당해 항체를 분리 및/또는 정제하여 수득된 정제 항체를 사용하는 것도 가능하다.

모노클로날 항체의 제조 방법의 예는 아래의 방법을 들 수 있다. 우선, 상기 면역화된 동물에서 수득한 당해 항체 생산 세포와 자가 항체 생산 능력이 없는 골수종계 세포(골수종 세포)에서 하이브리도마를 제조하고, 상기 하이브리도마를 복제한다. 즉, 하이브리도마의 배양 상청액을 검체로서 및 면역학적 방법에 의해 포유동물의 면역화를 위해 사용한 본 발명의 펩티드에 대한 특이적 친화성을 나타내고 또한 캐리어 단백질과 교차 반응을 나타내지 않는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택한다. 이어서, 당해 하이브리도마의 배양 상청액 등으로 자체 공지의 방법에 의해 항체를 생산할 수 있다.

구체적으로, 다음과 같이 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 즉, 면역원성을 마우스, 래트 또는 햄스터(인간 항체 생산 유전자 변형 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 생성된 유전자변형 동물을 포함)의 피하내, 근육내, 정맥내, 풋패드내 또는 복강내에 1 내지 수회 주사하거나 또는 면역원을 이식함으로써 면역화를 실시한다. 일반적으로, 초기 면역에서 약 1 내지 14일마다 1 내지 4회 면역을 실시하여 최종 면역보다 약 1 내지 5일 후에 면역화된 당해 포유동물의 비장 등으로부터 항체 생산 세포를 수득할 있다.

모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마(융합 세포)의 준비는 쾰러 및 밀 슈타인 등의 방법[참조: Nature, Vol.256, p.495-497,1975] 및 이들에 준하는 변형 방법에 따라 할 수 있다. 즉, 전술한 바와 같이 면역화시킨 포유동물로부터 취득되는 비장, 림프절, 골수 또는 편도선 등, 바람직하게는 비장에 포함된 항체 생산 세포와 바람직하게는 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물, 보다 바람직하게는 마우스, 래트 또는 인간 유래의 자기 항체 생산 능력이 없는 골수종 세포와 세포 융합을 통해 하이브리도마를 수득한다.

세포 융합에 사용되는 골수종 세포의 예는 마우스 유래 골수종 P3/X63-AG8.653(653; ATCC No.CRL1580), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8. U1(P3U1), SP2/0-Ag14(Sp2/0, Sp2), PAI, F0 또는 BW5147, 래트 유래 골수종 210RCY3-Ag. 2.3. 인간 유래 골수종 U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 또는 CEM-T15를 포함한다.

모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 수득한 하이브리도마를, 예를 들면, 마이크로역가 플레이트에서 배양하여, 성장을 나타내는 웰에서, 상술한 면역화에서 사용한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 반응성 및 상기 상층액의 캐리어 단백질에 대한 반응성을, 예를 들면, ELISA 등의 면역검정 방법에 의해 측정하고 비교함으로써 스크리닝할 수 있다.

스크리닝에 의해 클로닝된 하이브리도마는 배지(예를 들면, 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM)을 사용하여 배양된다. 배양 배지의 원심분리 상청액을 모노클로날 항체 용액으로 사용할 수 있다. 상기 하이브리도마를 상기 하이브리도마에서 유래하는 동물의 복강에 주입하여 동물에 복수를 생성시켜 당해 동물에서 수득한 복수를 모노클로날 항체 용액으로 사용할 수 있다. 모노클로날 항체는 상기 폴리클로날 항체와 유사한 방법으로 분리 및/또는 정제되는 것이 바람직하다.

키메라 항체는, 예를 들면, 일본 공개특허공보 제JP-B-3-73280호 등을 참조하여 제조할 수 있고, 인간화 항체는, 예를 들면, 일본 특허공표 제JP-A-4-506458호, 특허 특허공표 제JP-A-62-296890호 등을 참조하여 제조할 수 있고, 인간 항체는, 예를 들면, 문헌[참조: "Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997", "Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994", 일본 특허공표 제JP-A-4-504365호, 국제 공개공보 제WO 94/25585호, "Nature, Vol.368, p.856-859, 1994", 일본 특허공표 제JP-A-6-500233호 등을 참조하여 제조할 수 있다.

파지 디스플레이 의한 항체는, 예를 들면, 인간 항체 스크리닝을 위해 제조된 파지 라이브러리에서 바이오패닝에 의해 항원에 대한 친화성을 갖는 파지를 회수 및 농축하여 생산할 수 있으며, 이를 통해 Fab 등의 항체 등을 용이하게 수득할 수 있다. 이 경우, 항체 라이브러리는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드를 항원으로 사용하여 스크리닝된다. 바람직한 항체 라이브러리 및 항체의 스크리닝 방법은 문헌[참조: "Science, 228: 4075, p.1315-1317, (1985)", "Nature, 348, p.552-554, (1990)", "Curr.Protein Pept.Sci; 1 (2) , p.155-169, (2000)", 국제 공개공보 제WO 01/062907호 등]을 참고로 할 수 있다. 항체는 이를 통해 수득된 항체 단편을 사용하거나 파지가 갖는 DNA를 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료제 중의 상기 항체의 양은 상기 효과를 발휘할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로, 이는 본 발명의 예방 또는 치료제 전체의 0.001 내지 90중량%이고, 바람직하게는 0.005 내지 50중량%이며, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10중량%이다.

본 발명의 예방 또는 치료제는 활성 성분으로서 상기 항체 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수도 있다. 이러한 담체로는 약제 분야에서 통상적으로 사용되는 담체를 사용할 수 있다. 이의 예는, 이에 한정되지 않지만, 슈크로즈, 전분, 만니트, 솔 비트, 락토즈, 글루코즈, 인산칼슘, 탄산칼슘 등의 부형제, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 바이설파이트, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 방부제, 시트르산, 나트륨 시트레이트, 아세트산 등의 안정제, 메틸셀룰로오즈, 폴리비닐피롤리돈, 알루미늄 스테아레이트 등의 현탁제, 계면활성제 등의 분산제, 물, 생리식염수 등의 희석액, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 등의 기반 왁스 등을 포함한다.

본 발명의 예방 또는 치료제의 투여 형태의 예는, 이로써 한정되지 않지만, 액체, 주사 제제 등을 포함한다. 본 발명의 예방 또는 치료제의 투여 형태는 즉시-방출 제제 또는 서방성 제제 등의 방출 제어 제제일 수 있다. 항체는 일반적으로 수성 용매에 가용성이기 때문에, 임의의 상술된 투여 형태에서 용이하게 흡수된다. 또한, 자체 공지의 방법에 의해 항체의 용해도를 추가로 증가시킬 수도 있다.

IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환의 예방, 치료 또는 경감을 위해 사용할 수 있는 본 발명의 예방 또는 치료제는 제제 제법으로 자체 공지된 수단에 따라 상기 항체를 활성 성분으로 사용하여 제조할 수 있다.

예를 들면, 전신 투여에 바람직한 본 발명의 예방 또는 치료제는 수성 또는 비수성의 등장 무균 주사액에 유효량의 본 발명의 항체를 용해시켜 제조(예: 주사 제제)할 수 있다. 본 발명의 항체를 동결-건조(예: 동결-건조 제제)시키고 이를 수성 또는 비수성의 등장 무균 희석액에 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 국소 투여에 바람직한 본 발명의 예방 또는 치료제는 물 및 식염수와 같은 희석액에 본 발명의 항체를 용해시켜 제조할 수 있다(예: 액체). 또한, 액체는 분무기를 사용하여 기관지와 폐 등으로 흡입 요법에 사용할 수도 있다. 이러한 제제는 항산화제, 완충액, 정균제, 등장성제 등을 함유할 수 있다. 이들 본 발명의 예방 또는 치료제는 앰플 또는 바이알과 같이 단위 투여량 또는 복수 투여량 용기에 봉입할 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료제의 투여량은 활성 성분으로 함유하는 항체 활성, 종류 또는 배합량, 투여 대상, 투여 경로, 투여 대상의 연령 및 체중 등에 따라 적절하게 설정할 수 있지만, 예를 들면, 성인(체중 60kg)의 1일 복용량(유효량)으로는 항체 양으로 0.1mg 내지 1000mg, 바람직하게는 0.1mg 내지 500mg, 더욱 바람직하게는 0.1mg 내지 300mg이다. 본 발명의 예방 또는 치료제는 필요에 따라 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있고, 수일 내에 투여할 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료제는 상기 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환에 대해 공지된 예방 또는 치료제와 병용하여 사용할 수 있다. 이들은 1종류 또는 수종류를 병용하여 사용할 수도 있다. 본 명세서에서, "병용"은 본 발명의 예방 또는 치료제와 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환의 공지된 예방 또는 치료제를 함께 사용하는 것을 의미하고, 그 사용 형태는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 예방 또는 치료제와 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환의 공지된 예방 또는 치료제를 함유하는 약제학적 조성물로 투여하거나, 혼합하지 않고서 별도로 제형화하여 동시 또는 시간 간격을 두고서 투여하는 것 둘 다를 포함한다.

실시예

다음에 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

[실험예 1]

DNA 백신의 제조

DNA 백신 벡터

B형 간염 바이러스 코어 항원(HBc)을 분리하기 위해, BCCM/LMBP 플라스미드 콜렉션(Plasmid Collection)으로부터 플라스미드 pPLc3(수탁번호 LMBP 2470)를 구입했다. 다음의 프라이머를 설계 및 합성했다(국제 공개공보 제WO 2012/141280호).

HBcF 5'-gcc atg gat atc gat cct tat aaa gaa ttc gga gc -3'(서열번호 3)

HBcR 5'-ggc ctc tca cta aca ttg aga ttc ccg aga ttg aga -3'(서열번호 4)

상기 프라이머 세트를 사용하여, PCR에 의해 HBc를 증폭했다.

pcDNA 3.1/V5-His TOPO TA 발현 키트(Invitrogen)에 상기에서 수득된 HBc를 클로닝했다. 돌연변이유발에 의해 pcDNA3.1-HBc 벡터로 하기 마우스 IL-17A의 2종류의 에피토프 A1 또는 에피토프 A2를 코딩하는 핵산 서열을 각각 삽입했다. 이하의 실시예에서, 특별히 언급하지 않는 한, 마우스 IL-17A1 에피토프를 코딩하는 핵산 서열을 삽입한 pcDNA3.1-HBc 벡터를 함유하는 백신을 IL-17A1 DNA 백신으로 표기하고, 마우스 IL-17A2 에피토프를 코딩하는 핵산 서열을 삽입한 pcDNA3.1-HBc 벡터를 함유하는 백신을 IL-17A2 DNA 백신으로 표기한다. 벡터의 구조를 도 1에 나타낸다.

마우스 IL-17A1 에피토프 RPSDYLNR(서열번호 5)

마우스 IL-17A2 에피토프 DHHMNSV(서열번호 7)

[실험예 2]

DNA 백신의 마우스에의 투여　

6주령의 하기 각 수컷 마우스의 대퇴 근육에 DNA 백신을 주사기로 전기천공에 의해 2주마다 3회 주사했다(120㎍/60㎕×1 부위/투여).

실험 1: 항체 역가 측정, 혈액 또는 소변 중의 각종 사이토킨 측정, 생존율 분석

NZBWF1 마우스(SLE 질환 모델)

HBc-IL-17A1(IL-17A1 DNA 백신) 그룹: 6마리 마우스

HBc(pcDNA3.1-HBc 벡터) 그룹: 6마리 마우스

식염수 그룹: 10마리 마우스

매주 체중을 측정하고, 4주마다 혈청을 수집했다. 　

투여 계획을 도 4A에 나타낸다.

MRL/lpr 마우스(SLE 질환 모델)

HBc-IL-17A1(IL-17A1 DNA 백신) 그룹: 9마리 마우스

식염수 그룹: 9마리 마우스

매주 체중을 측정하고, 4주마다 혈청을 수집했다.

실험 2: 항체 역가 측정, 각 기관의 분석

MRL/lpr 마우스

HBc-IL-17A1(IL-17A1 DNA 백신) 그룹: 6마리 마우스

식염수 그룹: 6마리 마우스

매주 체중을 측정하고, 4주마다 혈청을 수집했다.

실시예 1 마우스 IL-17A 펩티드의 항원성

ELISA에 의한 항-IL-17A 항체 역가의 측정

플레이트 제조: 마우스 IL-17A1 에피토프 + BSA 접합체 및 마우스 IL-17A2 에피토프 + BSA 접합체를 10㎍/ml의 농도로 96 웰 플레이트에 분주하고, 4℃에서 밤새 방치했다. 재조합 마우스 IL-17A를 0.25㎍/ml의 농도로 96 웰 플레이트에 분주하고, 4℃에서 밤새 방치했다.

상기 플레이트를 PBS 200㎕로 1회 세척하고, PBS 중의 5% 탈지유로 2시간 블로킹시켰다. 1차 항체(마우스 항혈청)을 PBS 중의 5% 탈지유로 연속 희석하여 50㎕씩 96 웰 플레이트에 적용하고, 4℃에서 밤새 항온처리했다.

상기 플레이트를 PBS-T(0.05% Tween)(200㎕)로 7회 세척하고, 2차 항체(항 마우스 IgG Ab-HRP 표지됨)를 1/1000 희석(5% 탈지유)하고, 50㎕씩 첨가하고, 주위 온도에서 3시간 항온처리했다. 상기 플레이트를 PBS-T(0.05% Tween)(200㎕)로 3회 세척하고, TMB 용액(50㎕)을 첨가하고, 차광하여 주위 온도에서 30분간 항온처리했다. 0.5N H₂SO₄(50㎕)를 첨가하여 반응을 정지시키고, 450nm의 흡광도를 측정했다.

Balb/c 마우스를 IL-17A1 DNA 백신 또는 IL-17A2 DNA 백신으로 면역화시키는 예비 실험에서, IL-17A1 DNA 백신을 투여한 Balb/c 마우스의 항체는 항체 역가의 증가를 나타냈다(도 3). 도 4A에 나타낸 투여 계획에 따라, NZBWF1 마우스에게 IL-17A1 DNA 백신을 투여했다. 그 결과, 6주에서 항체 역가의 증가가 관찰되었고(도 4B), 이에 의해 재조합 마우스 IL-17A를 정확하게 인식하는 항체의 생산이 확인되었다(도 5). 게다가, 항 IL-17A1 항체가 장시간 지속되는 것을 확인하였다(도 7B).

웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의한 항-마우스 IL-17A 항체의 재조합 마우스 IL-17A에 대한 반응성 확인

통상적 방법에 따라, 각 레인에 단백질을 적용하고, 전기영동을 실시했다. 전기영동 후, 단백질을 멤브레인에 전송했다. 차단 후, 각 1차 항체를 첨가하여 4℃에서 밤새 항온처리했다. 이어서, 2차 항체를 반응시켜 발색 반응에 의해 항체 결합을 검출했다. 결과를 도 2에 나타낸다.

레인 1: 재조합 마우스 IL-17A

레인 2: 마우스 IL-17A1 에피토프 + BSA 접합체

레인 3: 마우스 IL-17A2 에피토프 + BSA 접합체

1차 항체

A: IL-17A1 DNA 백신을 투여한 Balb/c 마우스의 항혈청

B: 상업적으로 이용가능한 항-마우스 IL-17A 항체

C: 상업적으로 이용가능한 항-BSA 항체

IL-17A1 DNA 백신을 투여한 마우스의 항혈청은 상업적으로 이용가능한 항-마우스 IL-17A 항체와 동일한 방식으로 재조합 마우스 IL-17A와 결합했다.

IL-17A1 DNA 백신을 투여한 마우스의 항혈청은 마우스 IL-17A1 에피토프 + BSA 접합체를 특이적으로 인식하고 마우스 IL-17A2 에피토프 + BSA 접합체와는 반응하지 않았다.

재조합 마우스 IL-17A는 대량의 BSA를 첨가하여 안정화시키고, 상업적으로 이용가능한 항-BSA 항체는 마우스 IL-17A1 에피토프 + BSA 접합체 및 마우스 IL-17A2 에피토프 + BSA 접합체 뿐만 아니라 이를 또한 인식한다.

실시예 2 SLE 모델 마우스에 대한 IL-17A 백신의 효과

혈중 IL-1β, TNF-α 및 IL-17A 농도, 소변중 MCP-1 농도의 측정

퀀티카인(Quantikine) ELISA 키트를 사용하여 제조업자의 지정 프로토콜에 따라, IL-1β, TNF-α, IL-17A 및 MCP-1의 농도를 측정했다. 혈청을 25㎕씩 사용했다. 소변은 50㎕씩 사용했다. 키트에 첨부된 표준 샘플을 사용하여 검량선을 제작하고, 각 사이토킨 농도를 측정했다. NZBWF1 마우스에 IL-17A1 DNA 백신 투여 그룹에서 혈중 IL-1β의 유의한 감소가 관찰되었다(도 6E). 혈중 IL-17A 농도, 소변중 MCP-1 농도 및 혈중 TNF-α 농도는 감소 경향을 나타냈다(도 6C, B, F). 또한, 실험 1에 기재한 MRL/lpr 마우스의 IL-17A1 DNA 백신 투여 그룹에서도 TNF-α의 유의한 감소가 나타났다(도 6D, 8A).

소변 정성 검사

마취시킨 마우스에서 수시로 소변을 수집했다. 소변 멀티스틱 시험 스트립을 사용하여, 단백뇨, 소변 크레아티닌, 소변 알부민, 소변 잠재 출혈, 소변 비중 등을 측정했다. NZBWF1 마우스에 IL-17A1 DNA 백신 투여 그룹은 소변 단백질의 감소 경향을 나타냈다(도 6A).

생존율

SLE 모델 마우스인 NZBWF1 마우스에게 IL-17A1 DNA 백신을 투여한 후, 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 사망한 날을 기록했다. 사망한 마우스의 수를 1주일마다 더하고, 생존율의 그래프를 작성했다. IL-17A1 DNA 백신 투여 그룹의 장기 관찰 결과, 상기 백신 투여 그룹의 생존 기간의 유의한 연장이 나타났다(도 7A). 또한, 실험 1에 기재한 MRL/lpr 마우스에 DNA 백신 투여 그룹에서도 수명 연장 추세가 나타났다(도 8B).

기관 중량 분석

실험 2에 기재한 MRL/lpr 마우스에게 IL-17A1 DNA 백신을 투여한 후, 기관의 중량 변화를 검사했다. HBc-IL-17A1 그룹 및 식염수 그룹의 2개 그룹 사이에서 체중의 유의한 차이는 없었다(도 9A). 대조적으로, 전체 체중당 심장 중량을 측정하였으나, 유의한 차이는 없었다(도 9B). 한편, IL-17A1 DNA 백신을 투여한 후 비장 중량의 유의한 감소가 나타났다(도 9C). 또한, 전체 체중당 비장 중량의 비율도 유의한 감소가 나타났다(도 9D). SLE 환자에서 확장된 비장이 나타났고, 이러한 모델 마우스에서 전체 체중당 비장 중량의 증가는 SLE의 증악을 반영한다. 따라서, 본 결과로부터 IL-17A1 DNA 백신이 SLE에 대한 치료 효과를 갖고 있음이 밝혀졌다.

통계 방법

생존율은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법으로 통계학적으로 처리해다.

조직 병리학적 분석 계획을 도 10에 나타낸다.

실험 3　

NZBWF1 마우스

HBc-IL-17A1(IL-17A1 DNA 백신) 그룹: 9마리 마우스

식염수 그룹: 9마리 마우스

매주 체중을 측정하고, 4주마다 혈청을 수집했다.

MRL/lpr 마우스

HBc-IL-17A1(IL-17A1 DNA 백신) 그룹: 9마리

식염수 그룹: 9마리

매주 체중을 측정하고, 4주마다 혈청을 수집했다.

조직 염색

면역조직 염색 분석에서, 적출한 각 기관을 4% 파라포름알데히드 중에서 24 시간 동안 고정하고, 파라핀 중에 매립하고, 4㎛의 절편을 절단했다. 절편을 1차 항체(항-F4/80 항체) 및 2차 항체(HRP 표지된 항-랫트 IgG 항체)와 반응시켰다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 최종 염색하여 현미경 관찰에 이용했다. 조직 병리학적 검사 분석에서, 신장, 턱밑샘 및 간을 해부하고, 4% 파라포름알데히드 중에서 밤새 고정하고, 파라핀 중에 매립했다. 신장 4㎛ 절편을 PAS로 염색했다. 턱밑샘 및 간 4㎛ 절편을 HE로 염색했다.

신장

PAS 염색에 의해 NZBWF1 마우스 또는 MRL/lpr 마우스의 신장 병변의 정도를 확인했다. 결과를 도 11A, B에 나타낸다. 백신 투여 그룹에서 사구체 및 간질의 파괴가 억제되어 있었다. F4/80 면역염색에 의해서 마크로파지의 침윤 정도를 확인했다. 결과를 도 11C, D에 나타낸다. 백신 투여 그룹에서 사구체 주위 및 간질에 마크로파지 침윤이 억제되었다.

턱밑샘

HE 염색에 의해 NZBWF1 마우스의 턱밑샘 염증의 정도를 확인했다. 결과를 도 12에 나타낸다. 백신 투여 그룹에서 턱밑샘 염증의 억제가 관찰되었다.

간

백신의 안전성을 확인하기 위해, 간의 조직 절편을 HE 염색하여 관찰했다. 결과를 도 13에 나타낸다. NZBWF1 마우스(도 13A) 및 MRL/lpr 마우스(도 13B) 중의 어떠한 마우스의 백신 투여 그룹 및 식염수 투여 그룹에서 병적 소견의 부재가 확인되었다.

실시예 3 대장염 모델 마우스에서 IL-17A 백신의 효과

6주령의 다음 각 수컷 마우스의 창자에 TNBS 용액(2mg/100㎕/주사)을 주사하고, IL-17A1 DNA 백신을 전기천공에 의해 2주마다 3회 투여했다(120㎍/60㎕ × 1부위/투여). 8주에서, 마우스를 희생시켰다. 투여 계획을 도 14(A)에 나타낸다.

실험 4　

Balb/c 마우스

정상 그룹(TNBS (-)): 1마리 마우스

백신 그룹(HBc-IL-17A1 그룹; TNBS (+)): 3마리 마우스

식염수 그룹(TNBS (+)): 3마리 마우스

체중

실험 4에 기재한 Balb/c 마우스의 체중 변화를 TNBS 투여 8주 후에 조사했다. 마우스의 체중 증가량은 TNBS에 의한 대장염의 유도에 의해 감소했고(식염수 그룹); 그러나 감소 효과는 백신 그룹에서 볼 수 없었다(도 14(B)).

대장의 길이

실험 4에 기재한 Balb/c 마우스의 대장의 길이를 TNBS 투여 8주 후에 조사했다. 대장의 길이는 TNBS에 의한 대장염의 유도에 따라 짧아졌고(식염수 그룹); 그러나 이 효과는 백신 그룹에서 억제되었다(도 14(C)).

대장

희생시킨 마우스의 대장을 해부하고, 4% 파라-포름알데히드 중에서 밤새 고정하고, 파라핀 중에 매립했다. 대장의 4㎛ 절편을 HE 염색으로 처리하고, 조직학적으로 검사했다. 식염수 그룹은 염증 세포의 침윤 등의 병리 소견을 나타냈다(도 14(D)). 또한, HE 염색 절편의 병리학적 소견을 점수화했다. 백신 그룹에서 H & E 점수의 하락이 관찰되었다(도 14(E)).

이상의 결과에서, IL-17A 백신은 TNBS 유도 대장염 모델 마우스에서 대장염에 대해 억제 효과를 나타냈다.

실시예 4 관절염 마우스 모델에서 IL-17A 백신의 효과

6주령의 다음 각 수컷 마우스의 대퇴 근육에 마우스 IL-17A1 DNA 백신을 전기천공에 의해 2주마다 3회 투여했다(120㎍/60㎕ × 1부위/투여). 1차 백신 투여 28일 후에 타입 II 콜라겐과 CFA(완전 프로인트 애쥬번트)를 투여하고, 1차 백신 투여 42일 후에 타입 II 콜라겐과 IFA(불완전 프로인트 애쥬번트)를 투여하여 관절염을 유도했다. 이어서, 매주 3회 관절염의 정도를 관찰하고, 점수화했다. 투여 계획을 도 15(A)에 나타낸다.

실험 5　

DBA/1 마우스

백신 그룹(HBc-IL-17A1 그룹): 6마리 마우스

식염수 그룹(식염수 그룹): 6마리 마우스

임상 점수

실험 5에 기재한 DBA/1 마우스에서 관절염의 임상 점수 및 임상 소견을 조사했다. 백신 그룹은 관절염의 발병과 진행에 대해 억제 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 15(B), (C)).

이상의 결과에서, IL-17A 백신은 타입 II 콜라겐에 기인한 관절염 마우스 모델에서 관절염에 대한 억제 효과를 나타냈다.

실시예 5 대장암 모델 마우스에 대한 IL-17A 백신의 효과

6주령의 다음 각 수컷 마우스의 대퇴 근육에 마우스 IL-17A1 에피토프로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신(KLH 접합)를 2주마다 3회 투여했다(25㎍/25㎕ + 애쥬번트 25㎕/투여)(애쥬번트는 1차 투여시에 CFA였고, 2차 및 3차 투여시에 IFA였다). 1차 백신 투여 5주 후에 마우스 대장암 세포주 CT26 세포(5×10⁵ 세포/신체)를 접종했다. 이어서, 매주 종양 용적(0.5×장축×단축×단축)을 측정했다. 또한, 모든 마우스가 사망할 때까지 관찰을 계속하고, 생존 기간을 확인했다. 투여 계획을 도 16(A)에 나타낸다.

실험 6　

Balb/c 마우스

백신 그룹(IL-17A1-KLH 그룹): 6마리 마우스

식염수 그룹(식염수 그룹): 6마리 마우스

종양 용적

실험 6에 기재한 Balb/c 마우스에 CT26 세포의 접종 8일 및 15일에서 마우스의 종양 용적을 조사했다. 백신 그룹은 종양 용적의 증가에 대해 억제 효과를 갖는 것으로 관찰되었다(도 16(B)).

생존율

백신을 투여한 Balb/c 마우스에 CT26 세포를 접종하고, 마우스를 매일 관찰하고, 마우스가 사망한 날을 기록했다. 백신 투여 그룹의 장기 관찰 결과, 생존 기간의 유의한 연장이 관찰되었다(도 16(C)).

이상의 결과에서, IL-17A 백신은 CT26 세포 접종에 기인한 대장암 모델 마우스에서 종양 증가의 억제 효과 및 생존 기간 연장 효과를 나타냈다.

실시예 6 폐암 모델 마우스에 대한 IL-17A 백신의 효과

6주령의 다음 각 수컷 마우스의 대퇴 근육에 마우스 IL-17A1 DNA 백신을 전기천공에 의해 2주마다 3회 투여했다(120㎍/60㎕×1부위/투여). 1차 백신 투여 5주 후에 마우스 폐암 세포주 LLC 세포(5×10⁵ 세포/신체)를 접종했다. 이어서, 매주 종양 용적(0.5×장축×단축×단축)을 측정했다. 9주에서, 마우스를 희생시킨 후, 종양 중량, 폐 전이, 간 전이를 확인했다. 투여 계획을 도 17(A)에 나타낸다.

실험 7　

C57 BL/6 마우스

백신 그룹(HBc-IL-17A1 그룹): 5마리 마우스

식염수 그룹(식염수 그룹): 5마리 마우스

체중

실험 7에 기재한 마우스를 희생시키고, 체중을 조사했다. 마우스의 체중은 두 그룹간에 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 17(B)).

종양 용적

실험 7에 기재한 C57 BL/6 마우스에 LLC 세포를 접종하고, 매주 종양 용적을 조사했다. 백신 그룹은 종양 증가에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 관찰되었다(도 17(C)).

종양 중량

　실험 7에 기재한 마우스를 희생시키고, 종양 중량을 조사했다. 백신 그룹은 종양 중량의 증가에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 관찰되었다(도 17(D)).

전이의 유무

백신 그룹에서 폐 전이 및 간 전이가 관찰되지 않았다. 백신 비-투여 그룹에서, 폐 전이가 관찰되었다(도 17(E), (F), (G)).

이상의 결과에서, IL-17A 백신은 LLC 세포 접종에 의해 유발된 폐암 모델 마우스에서 종양 증가 억제 효과 및 전이 억제 효과를 나타냈다.

실시예 7 인간 IL-17A 펩티드의 항원성

ELISA에 의한 항-IL-17A 항체 역가의 측정

마우스 IL-17A1 에피토프(RPSDYLNR(서열번호 5))에 상응하는 다음의 인간 IL-17A1 에피토프로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신(KLH 접합)를 생성하고, Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피부내 투여했다. 1차 투여 6주 후에 실시예 1에 기재된 방법에 따라 혈청 항체 역가를 측정했다.

인간 IL-17A1 에피토프 RSSDYYNR(서열번호 1)

그 결과, 백신을 투여한 Balb/c 마우스의 항체 역가는 증가했다(도 18). 또한, 상기 혈청은 마우스 IL-17A1 에피토프에 대해 교차 반응성을 나타냈다(도 19(A)). 추가로, 마우스 IL-17A1 에피토프로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신을 투여하여 수득한 혈청은 인간 IL-17A1 에피토프에 대해 교차 반응성을 나타냈다(도 19(B)).

또한, 다음의 인간 IL-17A의 2종류의 에피토프(인간 IL-17A2 에피토프, 인간 IL-17A3 에피토프)으로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신(KLH 접합)를 생성하고, Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피부내 투여했다. 1차 투여 6주에서 실시예 1에 기재된 방법에 따라 혈청 항체 역가를 측정했다.

인간 IL-17A2 에피토프 ADGNVDYHMNSVPIQQE(서열번호 8)

인간 IL-17A3 에피토프 LRREPPHCPNSFRL(서열번호 9)

그 결과, 인간 IL-17A2 에피토프로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신을 투여한 Balb/c 마우스의 항체 역가는 증가했다(도 20).

추가로, 다음의 인간 IL-17A1 에피토프의 부분 서열인 인간 IL-17A4으로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신(KLH 접합)을 생성했다. 또한, 인간 IL-17A1 에피토프의 부분 서열인 인간 IL-17A5, 인간 IL-17A6 또는 인간 IL-17A7을 코딩하는 DNA를 함유하는 백신을 실험예 1에 따라 생성하고, Balb/c 마우스에 2주 간격으로 3회 피부내 투여했다. 1차 투여 6주에서 실시예 1에 기재된 방법에 따라 혈청 항체 역가를 측정했다.

인간 IL-17A4 에피토프 SDYYN(서열번호 11)

인간 IL-17A5 에피토프 SDYY(서열번호 12)

인간 IL-17A6 에피토프 SDY

인간 IL-17A7 에피토프 DYY

그 결과, 인간 IL-17A4 에피토프로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신, 또는 인간 IL-17A5 에피토프, 인간 IL-17A6 에피토프 또는 인간 IL-17A7 에피토프를 코딩하는 DNA를 함유하는 백신을 투여한 Balb/c 마우스의 항체 역가는 증가했다(도 21).

실시예 8 관절염 마우스 모델에 대한 인간 IL-17A 백신의 효과

6주령의 다음 각 수컷 마우스의 대퇴 근육에 인간 IL-17A1 에피토프, 인간 IL-17A2 에피토프 또는 인간 IL-17A4 에피토프로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신(KLH 접합)을 2주마다 3회 투여했다(120㎍/60㎕×1부위/투여). 1차 백신 투여 28일에서 유형 II 콜라겐과 CFA(완전 프로인트 애쥬번트)를 투여하고, 1차 백신 투여 42일에서 타입 II 콜라겐과 IFA(불완전 프로인트 애쥬번트)를 투여하여 관절염을 유도했다. 이어서, 매주 3회 관절염의 정도를 관찰하고, 점수화했다. 투여 계획을 도 22(A)에 나타낸다.

실험 8　

DBA/1 마우스

H17(인간 IL-17A1 에피토프) 그룹: 3마리 마우스

AF4(인간 IL-17A4 에피토프) 그룹: 3마리 마우스

AF5(인간 IL-17A2 에피토프) 그룹: 3마리 마우스

대조군(KLH) 그룹: 4마리 마우스

콜라겐(-) 그룹: 3마리 마우스

임상 점수

실험 8에 기재한 DBA/1 마우스 관절염의 임상 점수를 조사했다. 인간 IL-17A1 에피토프, 인간 IL-17A2 에피토프 또는 인간 IL-17A4 에피토프로 이루어진 백신 그룹은 관절염의 발병과 진행에 대해 억제 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다(도 22(B)).

이상의 결과에서, 인간 IL-17A 백신은 타입 II 콜라겐에 의해 유발된 관절염 마우스 모델에서 관절염에 대한 억제 효과를 나타냈다.

실시예 9 IL-17A에 대한 시험관내 중화 활성

배지 중의 정상 인간 피부 섬유아세포(NHDF)에 재조합 인간 IL-17A를 첨가했을 때의 IL-6의 분비량을 ELISA로 측정했다. 그 결과, IL-17A의 첨가는 IL-16의 분비를 촉진시켰다(IL-17 단독). 그러나, 인간 IL-17A1 에피토프로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신으로 면역화시킨 마우스의 항혈청에서 정제한 IgG를 IL-17A와 동시에 첨가한 경우, IL-6의 분비는 억제되었다(IL-17+항혈청). 또한, 비-면역 마우스 항혈청에서 정제한 IgG를 IL-17A와 동시에 첨가한 경우, IL-6의 분비는 거의 억제되지 않았다(IL-17+대조군 혈청). 이러한 결과를 도 23에 나타낸다.

이상의 결과에서, 인간 IL-17A1 에피토프로 이루어진 펩티드를 함유하는 백신을 사용한 면역화에 의해 수득한 항체는 시험관내에서 배양 세포로부터 IL-6의 분비를 억제했다. 따라서, 당해 항체는 IL-17A 활성에 대한 중화 작용을 갖는 것으로 제안되었고, IL-17A가 악화(aggravation)와 연관되는 질환의 치료 효과에 효과적인 것으로 제안되었다.

본 발명을 바람직한 실시형태를 강조하여 기재되었지만, 바람직한 실시형태가 변경될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

여기에서 인용된 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 간행물에 개시된 내용은, 이들이 본원에 개시된 것과 동일한 정도로 이들의 전체가 참조로서 본원에 포함된다.

상업상 이용가능성

상기에서 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 백신은 IL-17A에 대한 항체 역가를 증가시키고, SLE 뿐만 아니라 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 암, 건선, 다발성 경화증, 동맥경화증 등과 같이 IL-17A가 병태의 증악에 관여하는 다른 질환에도 사용할 수 있으며, 이러한 질환의 치료 등에 크게 기여할 수 있다.

본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 번호 제2013-273133호(출원일: 2013년 12월 27일)을 기초로 하고 있으며, 그 내용은 모두 본 명세서에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> OSAKA UNIVERSITY <120> Vaccine targeting IL-17A <130> IPA160742-JP <150> JP 2013-273133 <151> 2013-12-27 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg 1 5 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aggtcctcag attactacaa ccga 24 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gccatggata tcgatcctta taaagaattc ggagc 35 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ggcctctcac taacattgag attcccgaga ttgaga 36 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg 1 5 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 cggccctccg actacctgaa ccgg 24 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp His His Met Asn Ser Val 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln 1 5 10 15 Glu <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln 1 5 10 15 Glu <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ser Asp Tyr Tyr Asn 1 5 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Asp Tyr Tyr 1 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gctgatggga acgtggacta ccacatgaac tctgtcccca tccagcaaga g 51 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 gcggagggaa agctggacca ccacatgaat tctgttctca tccagcaaga g 51 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tcagattact acaac 15 <210> 16 <211> 12 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tcagattact ac 12 <210> 17 <211> 570 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 17 atggatatcg atccttataa agaattcgga gctactgtgg agttactctc gtttctcccg 60 agtgacttct ttccttcagt acgagacctt ctggataccg ccagcgcgct gtatcgggaa 120 gccttggagt ctcctgagca ctgcagccct caccatactg ccctcaggca agcaattctt 180 tgctgggggg agctcatgac tctggccacg tgggtgggtg ttaacttgga agatccagct 240 atcactggtg ctactagcag ggacctggta gtcagttatg tcaacactaa tatgggttta 300 aagttcaggc aactcttgtg gtttcacatt agctgcctca ctttcggccg agaaacagtt 360 atagaatatt tggtgtcttt cggagtgtgg atccgcactc ctccagctta taggcctccg 420 aatgccccta tcctgtcgac actcccggag actactgttg ttagacgtcg aggcaggtca 480 cctagaagaa gaactccttc gcctcgcagg cgaaggtctc aatcgccgcg gcgccgaaga 540 tctcaatctc gggaatctca atgttagtga 570

Claims

다음 (1) 내지 (3) 중의 어느 하나를 포함하는 IL-17A가 증악 인자(aggravation factor)로서 관여하는 질환의 예방 또는 치료용 백신으로서,
상기 질환이 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 종양, 건선, 다발성 경화증, 대장암 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 백신:
(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;
(2) 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 및
(3) 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터.
삭제
제1항에 있어서, 발현 벡터가 B형 간염 바이러스 코어(HBc)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 백신.
제1항에 있어서, 발현 벡터가 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 17에 제시되는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 246과 뉴클레오티드 번호 247의 사이에 삽입되는 것인, 백신.
제1항에 있어서, 캐리어 단백질, 애쥬번트 또는 둘 다를 포함하는, 백신.
삭제
제1항 및 제3항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 다음 (1) 또는 (2)를 포함하고, 여기서 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 대장암 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 백신:
(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 및
(2) 상기 (1)의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터.
제1항 및 제3항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 다음 (1) 내지 (3) 중의 어느 하나를 포함하고, 여기서 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 류마티스성 관절염인, 백신:
(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;
(2) 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; 및
(3) 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터.
다음 (1) 또는 (2)의 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체를 포함하는, IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환의 예방 또는 치료제로서,
상기 질환이 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 종양, 건선, 다발성 경화증, 대장암 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 예방 또는 치료제:
(1) 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드;
(2) 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
삭제
삭제
제9항에 있어서, 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체를 포함하고, 여기서 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 SLE, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 대장암 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 예방 또는 치료제.
제9항에 있어서, 서열번호 1에 제시되는 아미노산 서열, 서열번호 11에 제시되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 12에 제시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 인식하고 IL-17A의 기능을 억제하는 항체를 포함하고, 여기서 IL-17A가 증악 인자로서 관여하는 질환이 류마티스성 관절염인, 예방 또는 치료제.