JP6956368B6 - 育毛剤 - Google Patents
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Description
(1)実験動物
C57BL/6Nマウス(オス)およびBalb/c nu/nuマウス(メス)を日本エスエルシー株式会社(日本)より購入し、飼育の後に以下の実験に供した。なお、動物の飼育および試験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
以下の試薬をそれぞれ用意した。
比較例1:60%エタノール水溶液
比較例2:ミノキシジル 5%溶液
比較例3:ミノキシジル 3%溶液
比較例4:ミノキシジル 1%溶液
実施例1:パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 3%溶液
実施例2:パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 1%溶液
毛周期の1周期目は、60%エタノール水溶液をプラセボとして塗布する。上記の皮膚試験片を移植したBalb/c nu/nuマウスに、マイクロピペットを用いて25μLの60%エタノールを、皮膚試験片の生着させた左右の背部にそれぞれ塗布した。その後、ドライヤーを用いて冷風をあててエタノールを素早く乾燥させた。この作業を、マウス左右背部に各4回ずつ繰り返した。
Balb/c nu/nuマウスの皮膚試験片の移植部位から3領域をそれぞれ選択し、それら領域からそれぞれ5本の毛を選択して、発毛の状態を確認し記録した。観察と記録は、目視およびデジタルマイクロスコープ(株式会社キーエンス、日本)により行った。
(1)実験動物
6〜8週齢のC57BL/6Nマウス(日本エスエルシー株式会社、日本)より背部体毛皮膚を採取した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
以下の薬剤をそれぞれ用意した。
実施例1:パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 3%溶液
実施例2:パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 1%溶液
比較例1:60%エタノール水溶液
比較例5:RiUPX5PLUS(大正製薬、日本)
C57BL/6Nマウスの背部の体毛を抜毛した。C57BL/6Nマウスの左右背部に、マイクロピペットを用いて25μLの薬剤を塗布した。その後、塗布部位にドライヤーを用いて冷風をあてて薬剤を素早く乾燥させた。この作業を左右背部に各4回ずつ繰り返した。この薬剤塗布作業を抜毛した翌日から7日間行った。
7日間薬剤を塗布したC57BL/6Nマウスから背部体毛皮膚を採取する24時間および48時間前に、各マウスの後足部分の腹部に10mg/mLのBrdU/生理食塩水 0.5mLを注射器(テルモ株式会社、日本)を用いて投与した。
8日目に投与した時間と同じ時間にC57BL/6Nマウスを頸椎脱臼により安楽死させた後に、毛球部を傷つけないように皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をSuperFix(東洋紡株式会社、日本)に16〜24時間固定液に浸した後、1×PBSで4回洗い、新しい1×PBSに入れ保管した。その皮膚組織を必要な部分を切り出しし、パラフィン液交換機(Leica Microsystems GmbH、ドイツ)にてパラフィンブロックを作製した。
パラフィン化した皮膚組織のブロックをミクロトーム(Leica Microsystems GmbH、ドイツ)で切片化し、プラチナコートしたスライドガラス(プラチナ プロ(松浪硝子工業株式会社、日本))に切片を張り付けて、40℃のウォームスチームで8〜10時間放置し、乾燥させた。
脱パラフィン処理を施すため、サンプルの乗ったスライドガラスを、キシレン、キシレン、100%エタノール、95%エタノール、70%エタノールに、順に3分間ずつ浸した。脱パラフィン処理を施したスライドガラスを、室温にて2M HClに30分間浸した。スライドガラスをベンタディスカバリーULTRA(自動染色装置)にセットし、プログラムを起動した。1次抗体Anti−BrdU antibody−Proliferation Marker(abcam、英国)を希釈溶液(1%BSA、0.1%TX100/PBS)にて160倍希釈し、1次抗体を加えるタイミングで100μL/サンプル数 添加した。2次抗体Donkey Anti−Sheep IgG H&L(Alexa Flour 594)(Thermo Fisher Scientific、米国)およびへキスト(Hoechst33342)を希釈溶液(1%BSA、0.1%TX100/PBS)にて500倍希釈し、100μL/サンプル数 添加した。プログラム終了後、0.1%TX100/PBSにて流しながら洗浄し、1×PBSに浸した。水溶性封入剤(0.5%没食子酸、90%グリセロール/PBS)を80μL/サンプル数 滴下した後、カバーガラスを乗せ、黄色チップで空気を押し出し、アスピレーターでカバーガラスの位置を修正しながら余分な封入剤を除き、トップコート(マニュキュア用)を使ってカバーガラスの4辺に封をした。トップコートが乾いていることを確認し、Axio Scanで画像をスキャンし、解析した。
5000μmの線を引き、その範囲にある表皮層、真皮層、毛包にあるBrdUの数を計測した。
本試験例では、抜毛したC57BL/6Nマウスを用いて、60%エタノールへ溶解した濃度1%および3%のパルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸を試験用の薬剤液とし、連日塗布を施した。陰性対照として60%エタノールおよび陽性対象としてRiUP(5%製剤)を塗布を施した。これら塗布は、1回/日で総塗布量100μlとなるようにして7日間行った。また、6、7日目の同じ時間にBrdUを腹部から投与し、その翌日に皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をパラフィン化し切片を作製し、BrdUの免疫染色を行い、BrdU数の計測により細胞活性を観察した。結果を図7及び図8に示す。
(1)実験動物
上記試験例1と同様の手順にて、7〜8週齢のC57BL/6Nマウス(SLC)より背部体毛皮膚を採取し、作製した背部体毛皮膚由来の毛群を4〜6週齢のBal
b/c nu/nuマウス(SLC)に移植した後、薬剤を塗布した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
以下の薬剤を試験に使用した。
実施例1:パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 3%溶液
実施例2:パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 1%溶液
比較例1:60%エタノール水溶液
比較例5:RiUPX5PLUS(登録商標)(大正製薬、日本)
(3)太毛化の計測方法
試験例1において3周期目終了した成長した毛幹を用いて、太毛化の計測を行った。採取した毛幹のうち、Zigzag毛の2本を用いた。その中心部分の太くなっている範囲を1辺 100μmの正方形で3か所を選択した。選択した範囲の5か所を計測した。
薬剤塗布後の毛を用い、毛幹径を計測した結果を図9に示す。また、対照となる60%エタノール水溶液を塗布した比較例1における毛幹径からの増加率を評価した結果を表7に示す。
(1)ヒト毛乳頭細胞及び培地について
ヒト毛乳頭細胞(カタログ番号:CA60205a、白色人種、29歳男性由来、東洋紡株式会社(日本))を購入し、プロトコールに記載されるようにして細胞を維持・培養して試験評価を行った。
試験用薬剤として、以下の各濃度(終濃度)の薬剤溶液を調製し、使用した。
実施例1:パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 3%溶液
実施例3:パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 0.1%溶液
実施例4:パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 0.025%溶液
ミノキシジル 30μM
アデノシン 100μM
ヒト毛乳頭細胞を5×104個/ウェルとなるように、96ウェルプレートに播種した。CO2インキュベーター(5%CO2、37℃)内で、1日間培養後、各試験用薬剤を含む培地に置換した。その後、細胞プレートをCO2インキュベーターに戻し、さらに24時間又は72時間培養した。培養後、各ウェルより、全RNAを抽出、回収して、それをcDNAに逆転写した。調製したcDAを用いて、リアルタイムPCR法にてFGF−7遺伝子の発現を測定した。内部標準としてGAPDH遺伝子を用い、陰性対照群との相対値としてFGF−7遺伝子の発現量を算出した。
FGF−7遺伝子発現検出用プライマー
順方向:tctgtcgaacacagtggtacctgag(配列番号1)
逆方向:gccactgtcctgatttccatga(配列番号2)
VEGF遺伝子発現検出用プライマー
順方向:atcttcaagccatcctgtgtgc(配列番号3)
逆方向:caaggcccacagggattttc(配列番号4)
GAPDH遺伝子発現検出用プライマー
順方向:catccctgcctctactggcgctgcc(配列番号5)
逆方向:ccaggatgcccttgagggggccctc(配列番号6)
各遺伝子の増幅曲線と閾値線との交点より、Ct値(PCRサイクル数)を算出した。目的遺伝子のCt値より内部標準GAPDH遺伝子のCt値で除した値が相対発現量となる。
ヒト毛乳頭細胞にパルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を24時間及び72時間作用させた後のFGF−7遺伝子並びにVEGF遺伝子の発現量の変化を測定し、その結果を、それぞれ図10(24時間)及び図11(72時間)に示した。
Claims (12)
- パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸を含む外用剤である育毛剤。
- パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の含有量が全体に対して0.001〜20重量%である、請求項1に記載の育毛剤。
- パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸の含有量が全体に対して0.005〜10重量%である、請求項1または請求項2に記載の育毛剤。
- パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸とを含有してなり、その質量比(パルミトイルジペプチド−5ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニン/パルミトイルジペプチド−5ジアミノヒドロキシ酪酸)が99/1〜1/99である、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の育毛剤。
- 毛幹成長促進または発毛に用いるための、請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の育毛剤。
- 毛幹伸長速度を向上させるために使用する、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の育毛剤。
- 毛幹最大長を向上させるために使用する、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の育毛剤。
- 毛幹径を増大させるために使用する、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の育毛剤。
- 毛数を増加させるために使用する、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の育毛剤。
- 溶液である、請求項1〜請求項9のいずれか1項に記載の育毛剤。
- 頭髪、眉毛および/または睫毛用の、請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載の育毛剤。
- 請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の育毛剤を非ヒト動物に投与することを含む育毛方法。
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