JP6947729B2 - 筋萎縮性側索硬化症及び／または前頭側頭葉変性症の治療のための材料及び方法 - Google Patents

筋萎縮性側索硬化症及び／または前頭側頭葉変性症の治療のための材料及び方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３８７，４２４号、及び２０１６年４月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３２４，２８１号の利益を主張し、これらのそれぞれの内容物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、エクスビボ及びインビボの両方で、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び／または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するための材料及び方法を提供する。さらに、本出願は、ゲノム編集による細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の発現、機能、または活性を調節するために編集するための材料及び方法を提供する。
配列表の参照による組み込み
本出願は、コンピュータ可読形態の配列表（ファイル名：５０３１６Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；１４，７８５，５７３バイト−ＡＳＣＩＩテキストファイル、２０１６年１２月２１日に作成）を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本開示の一部を形成する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、典型的には、症状の発症から２〜３年以内に、呼吸不全から死に至る進行性麻痺によって臨床的に特徴付けられる致命的な神経変性疾患である（Ｒｏｗｌａｎｄ ａｎｄ Ｓｈｎｅｉｄｅｒ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００１，３４４，１６８８−１７００）。ＡＬＳは、西洋諸国において３番目に一般的な神経変性疾患である（Ｈｉｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００７，６８，３２６−３３７）。症例のうちの約１０％は、実際には、家族性であるが、一方、この疾患と診断された患者の大部分が、集団全体を通して無作為に生じるように見えるため、散発性として分類されている（Ｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００８，７０，５３３−５３７）。臨床的、遺伝学的、及び疫学的データに基づいて、ＡＬＳ及び前頭側頭葉変性症が、中枢神経系全体を通してＴＤＰ−４３陽性封入体の存在によって病理学的に特徴付けられる、重複する一連の疾患を表すという認識が広まりつつある（Ｌｉｌｌｏ ａｎｄ Ｈｏｄｇｅｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００９，１６，１１３１−１１３５、Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１４，１３０−１３３）。
今まで、いくつかの遺伝子、例えば、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＦＵＳ、ＯＰＴＮ、及びＶＣＰが、古典的な家族性ＡＬＳにおける原因物質として発見されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２０１０，６８，８５７−８６４、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２３，１２０５−１２０８、Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６５，２２３−２２６、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，５９−６２、Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３１９，１６６８−１６７２、Ｖａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，２００９，１２９，８６８−８７６）。過去１０年にわたって、複数例のＡＬＳ、ＦＴＤ、及びＡＬＳ−ＦＴＤを含む同族の連鎖解析は、現在、Ｃ９ｏｒｆ７２として既知である、染色体９の短いアーム上に疾患にとって重要な遺伝子座を特定した（Ｂｏｘｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２０１１，８２，１９６−２０３、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００６，６６，８３９−８４４、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２０１１，２５８，６４７−６５５、Ｖａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，２００６，１２９，８６８−８７６）。
前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）は、頭頂葉及び後頭葉の温存を伴う、前頭葉中の灰白質、及び大脳の側頭葉の前方部分の変性を含む、神経変性疾患の一種である。ＦＴＬＤは、アルツハイマー病に次いで２番目に一般的な認知症の形態であり、したがって、高齢者における神経学的問題の主要な原因である。ＦＴＬＤの症候群は、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を有するＦＴＤ、意味認知症、及び原発性進行性失語症の臨床的サブグループを包含し、記憶力及び知覚の相対的な保存を伴う、行動、人格、及び言語の変化によって特徴付けられる。
病理学的には、ＦＴＬＤと関連付けられる２つの主要な組織学的プロファイルが存在する。これらのうちの１つは、タウオパチーであり、ニューロン、及び時折、グリア中の過リン酸化タウの蓄積である。しかしながら、全ての症例の半分以上を占める、ＦＴＬＤと関連する最も一般的な神経病変は、ＦＴＬＤ−Ｕとして既知であり、そこには、ユビキチン（ｕｂ−ｉｒ）に対して免疫反応性であるが、タウに対しては免疫反応性でない、神経細胞質内封入体及び神経突起がある。この種類のＦＴＬＤ病理は、最初に、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）及び認知症に罹患している患者において説明されたが、その後は、運動症状を有しない患者におけるＦＴＬＤの一般的な神経病理学的特性として認識されている。このｕｂ−ｉｒ病理は、海馬の歯状回の顆粒細胞中、ならびに前頭及び側頭の新皮質の層２のニューロン中に特徴的に見出される。
現在、ＡＬＳの治療用に市場に出されている、たった１つのＦＤＡが認可した薬物、Ｒｉｌｕｔｅｋ（リルゾール）がある。しかしながら、作用の機構は、十分に理解されていない。この薬物は、脳内のグルタミン酸塩のレベルを低下させることによって、一部の人々において疾患の進行を遅延させると考えられる。
Ｃ９ｏｒｆ７２（染色体９オープンリーディングフレーム７２）は、ヒトにおいて、遺伝子Ｃ９ＯＲＦ７２によってコードされる、タンパク質である。ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子は、塩基対２７，５４６，５４２から塩基対２７，５７３，８６３の染色体９オープンリーディングフレーム７２の短（ｐ）アーム上に位置している。その細胞遺伝学的位置は、９ｐ２１．２にある。タンパク質は、脳の多くの領域中、ニューロンの細胞質、ならびにシナプス前末端に見出される。遺伝子内の変異を引き起こす疾患は、最初に、２０１１年において２つの独立した研究チームによって発見された（ＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｅｕｒｏｎ ７２（２）：２４５−５６、Ｒｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｎｅｕｒｏｎ ７２（２）：２５７−６８）。Ｃ９ＯＲＦ７２における変異は、ＦＴＬＤとＡＬＳとの間の遺伝子リンクであると特定される第１の病理学的機構であるため、有意である。２０１２年現在で、それは、家族性ＦＴＬＤ及び／またはＡＬＳと関連する特定される最も一般的な変異である。
Ｃ９ＯＲＦ７２の変異は、６つの文字列のヌクレオチドＧＧＧＧＣＣのヘキサヌクレオチド反復拡大である。健常な個人において、このヘキサヌクレオチドの反復はほとんどなく、典型的には、３０の反復であるが、罹患した表現型を有する人において、反復は、ほぼ数百程度で生じ得る（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ４（４）：２７）。Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子におけるヘキサヌクレオチド拡大事象は、約４０％の家族性ＡＬＳ及び８〜１０％の散発性ＡＬＳに存在する。ヘキサヌクレオチド拡大は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の代替的にスプライシングされたイントロン１で発生し、したがって、コード配列または結果として生じるタンパク質を変更しない。Ｃ９ＯＲＦ７２の３つの代替的にスプライシングされた変異体（Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３）が、通常、生成される。拡大したヌクレオチド反復は、Ｖ１の転写を減少させることが示されているが、生成されたタンパク質の総量は、影響を受けなかった（ＤｅＪｅｓｕｓ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎｅｕｒｏｎ ７２（２）：２４５−５６）．全体として、Ｃ９ＯＲＦ７２のタンパク質レベルの減少は、ＡＬＳ患者からの脳剖検において観察され（Ｗａｉｔｅ（２０１４）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，３５ １７７９ ｅ１７７５−１７７９ ｅ１７１３）、これは、ＡＬＳ／ＦＴＤの原因としてハプロ不全を示唆している。しかしながら、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質の生理学的機能は十分に理解されておらず、ニューロン特異的ノックアウトマウスは、病理のような疾患を発症せず（Ｋｏｐｐｅｒｓ（２０１５），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，７８：４２６−４３８）、ハプロ不全が、疾患機構に著しく寄与する可能性を低くする。
ハプロ不全に加えて、Ｃ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチド拡大が、ＦＴＤ及び／またはＡＬＳを引き起こす方法に関する他の理論がある。別の理論は、核及び細胞質におけるＧＣリッチなＲＮＡの蓄積が毒性であり、ＲＮＡ結合タンパク質隔離が生じることである。近年より一層の注目を得ている非コード反復拡大疾患の共通の特徴は、罹患細胞の核及び／または細胞質においてＲＮＡ病巣として反復ヌクレオチドからなるＲＮＡ断片の蓄積である（Ｔｏｄｄ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ，２０１０，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６７，２９１−３００）。いくつかの障害において、ＲＮＡ病巣は、ＲＮＡ結合タンパク質を隔離することが示されており、代替のｍＲＮＡスプライシングの異常調節をもたらす。そのようなＲＮＡ病巣の特徴は、中枢神経系全体にわたってＴＤＰ−４３陽性封入体である（Ｌｉｌｌｏ ａｎｄ Ｈｏｄｇｅｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００９，１６，１１３１−１１３５、Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１４，１３０−１３３）。
さらなる理論は、拡大したヘキサヌクレオチド反復を含むＣ９ＯＲＦ７２遺伝子から転写されたＲＮＡは、非ＡＴＧ開始機構によって翻訳される。これは、変異上の複数のリボソームリーディングフレームに対応するジペプチド反復タンパク質の形成及び蓄積を促進する。この反復は、反復により誘発された毒性を引き起こすジペプチド反復（ＤＰＲ）タンパク質に翻訳される。ＤＰＲは、プロテアソームを阻害し、他のタンパク質を隔離する。Ｃ９ＯＲＦ７２におけるＧＧＧＧＣＣ反復拡大は、いくつかの可能な機構による核細胞質間輸送に障害を来たし得る（Ｅｄｂａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１６，３６：９９−１０６）。
従来、家族性及び散発性ＡＬＳの症例は、臨床的に区別できず、診断を困難にさせる。したがって、この遺伝子の識別は、家族性ＡＬＳの今後の診断に役立つであろう。低速診断はまた、ＦＴＤにおいて一般的であり、病初では、別の病態と誤診されていた多くの患者において最高１年を要する場合がある。疾患を引き起こすことが既知である特定の遺伝子の試験は、より迅速な診断に役立ち得る。最も重要なことには、このヘキサヌクレオチド反復拡大は、家族性ＦＴＤ及び家族性ＡＬＳの両方を治療するための療法を開発するための極めて有望な今後の標的である。
ゲノム操作は、生物生成物の遺伝子情報（ゲノム）の標的とされる特定の修飾における戦略及び技法を指す。ゲノム操作は、特にヒトの健康の領域において、広範な範囲の適用可能性のため、例えば、有害な変異を担持する遺伝子の修正、または遺伝子の機能を探索するために、研究の非常に活性な分野である。トランス遺伝子を生細胞に挿入するために開発された初期技術は、しばしば、新しい配列のゲノムへの挿入のランダム性によって限定された。ゲノムへのランダム挿入は、重度の望ましくない効果をもたらす隣接した遺伝子の正常な調整の混乱をもたらし得る。さらに、ランダム統合技術は、配列が２つの異なる細胞中で同じ場所で挿入され得るという保証がないため、ほとんど再現性をもたらさない。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、及びＭｅｇａＴＡＬ等の最近のゲノム操作戦略は、ＤＮＡの特定の領域が修飾されるのを可能にし、それによって、早期技術と比較して、修正または挿入の精度を増加させる。これらのより新しいプラットホームは、はるかに大きい度合いの再現性を提供する。
ＡＬＳ及びＦＴＬＤに対処しようと試みた世界中の研究者及び医療専門家からの努力にもかかわらず、かつゲノム操作アプローチの見込みにもかかわらず、ＡＬＳ及びＦＴＬＤの安全かつ効果的な治療を開発するための重要な必要性が依然として存在する。
現在、ＡＬＳ及びＦＴＬＤに対処するための全ての療法は、疾患を治癒することよりはむしろ、疾患の進行を遅延させることを目的とする。対照的に、本発明は、疾患の遺伝子的基礎を修正するためのアプローチを提示する。単一治療によりＣ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチド反復拡大を復元し得るゲノムへの永久変化を作成するためのゲノム操作ツールによって、得られた療法は、疾患進行を完全に停止させるべきである。
Ｒｏｗｌａｎｄ ａｎｄ Ｓｈｎｅｉｄｅｒ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００１，３４４，１６８８−１７００ Ｈｉｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００７，６８，３２６−３３７ Ｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００８，７０，５３３−５３７ Ｌｉｌｌｏ ａｎｄ Ｈｏｄｇｅｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００９，１６，１１３１−１１３５ Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１４，１３０−１３３ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２０１０，６８，８５７−８６４ Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２３，１２０５−１２０８ Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６５，２２３−２２６ Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，５９−６２ Ｓｒｅｅｄｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３１９，１６６８−１６７２ Ｖａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，２００９，１２９，８６８−８７６ Ｂｏｘｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２０１１，８２，１９６−２０３ Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００６，６６，８３９−８４４ Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２０１１，２５８，６４７−６５５ Ｖａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，２００６，１２９，８６８−８７６
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を治療するために使用することができる、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復を欠失、挿入、または修正する、またはＣ９ＯＲＦ７２ ｃＤＮＡもしくはミニ遺伝子を、ゲノム編集及びＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性を復元することによってセーフハーバー遺伝子座にノックインすることによって、ゲノムへの永久変化をもたらすための、細胞内、エクスビボ、及びインビボ方法、ならびにかかる方法を行うために構成要素、キット、及び組成物、ならびにそれらによって生成される細胞が、本明細書に提供される。
ゲノム編集によって、ヒト細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍のまたはその発現もしくは機能に影響を及ぼす、１つ以上の変異体もしくはエクソンの発現もしくは機能の永久挿入、修正、または調節のうちの少なくとも１つをもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の永久挿入をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、ヒト細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
ゲノム編集によってヒト細胞におけるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を挿入するための方法もまた、本明細書に提供され、本方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子またはミニ遺伝子の永久挿入をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、ヒト細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入するステップを含む。
一態様では、ゲノム編集によってヒト細胞におけるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するための方法が、本明細書に提供され、本方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子もしくはミニ遺伝子の永久挿入、及びＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらすセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
別の態様では、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのエクスビボ法が、本明細書に提供され、本方法は、患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作成するステップと、ｉＰＳＣのＣ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはｉＰＳＣのＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、またはｉＰＳＣのセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、ゲノム編集されたｉＰＳＣを、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を分化させるステップと、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を患者に移植するステップと、を含む。
いくつかの実施形態では、患者特異的誘導多能性幹細胞を作成するステップは、体細胞を患者から単離することと、体細胞に、一連の多分化能関連遺伝子を導入し、細胞を誘導して、多能性幹細胞にすることと、を含む。いくつかの実施形態では、体細胞は、線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、一連の多分化能関連遺伝子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、及びｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上である。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップ、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１エクソンの遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍のまたはその発現もしくは機能に影響を及ぼす、１つ以上の変異体またはエクソンの発現または機能の永久挿入、修正、または調節をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の永久挿入をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、ｉＰＳＣに、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含むことができる。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択され得る。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１〜２、ＡＬＢのエクソン１〜２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１〜２、ＡｐｏＣ３のエクソン１〜２、ＡＳＧＲ２のエクソン１〜２、ＣＣＲ５のエクソン１〜２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１〜２、Ｇ６ＰＣのエクソン１〜２、Ｇｙｓ２のエクソン１〜２、ＨＧＤのエクソン１〜２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１〜２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１〜２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１〜２、ＴＦのエクソン１〜２、及びＴＴＲのエクソン１〜２からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣのＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、ｉＰＳＣに、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集されたｉＰＳＣを、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を分化させるステップは、小分子の組み合わせによる処理またはマスター転写因子の送達のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を患者に移植するステップは、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、患者に移植することを含む。
別の態様では、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのエクスビボ法が、本明細書に提供され、本方法は、白血球を患者から単離するステップと、白血球のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するステップと、編集された白血球を患者に移植するステップと、を含む。
いくつかの実施形態では、白血球を単離するステップは、細胞分化遠心分離及び細胞培養を含む。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップ、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１エクソンの遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍のまたはその発現もしくは機能に影響を及ぼす、１つ以上の変異体またはエクソンの発現または機能の永久挿入、修正、または調節をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の永久挿入をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、白血球に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼに導入することを含むことができる。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択され得る。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１〜２、ＡＬＢのエクソン１〜２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１〜２、ＡｐｏＣ３のエクソン１〜２、ＡＳＧＲ２のエクソン１〜２、ＣＣＲ５のエクソン１〜２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１〜２、Ｇ６ＰＣのエクソン１〜２、Ｇｙｓ２のエクソン１〜２、ＨＧＤのエクソン１〜２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１〜２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１〜２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１〜２、ＴＦのエクソン１〜２、及びＴＴＲのエクソン１〜２からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、神経系細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、神経系細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
いくつかの実施形態では、白血球を患者に移植するステップは、白血球を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、患者に移植することを含む。
一態様では、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのエクスビボ法が、本明細書に提供され、本方法は、任意に、患者の骨髄の生検を実行するステップと、間葉幹細胞を単離するステップと、幹細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップと、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、幹細胞を、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化させるステップと、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を患者に移植するステップと、を含む。
いくつかの実施形態では、間葉幹細胞を単離するステップは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）を用いた密度遠心分離による、骨髄の吸引及び間葉細胞の単離を含む。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップと、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１エクソンの遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍のまたはその発現もしくは機能に影響を及ぼす、１つ以上の変異体またはエクソンの発現または機能の永久挿入、修正、または調節をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の永久挿入をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、間葉幹細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含むことができる。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択され得る。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１〜２、ＡＬＢのエクソン１〜２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１〜２、ＡｐｏＣ３のエクソン１〜２、ＡＳＧＲ２のエクソン１〜２、ＣＣＲ５のエクソン１〜２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１〜２、Ｇ６ＰＣのエクソン１〜２、Ｇｙｓ２のエクソン１〜２、ＨＧＤのエクソン１〜２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１〜２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１〜２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１〜２、ＴＦのエクソン１〜２、及びＴＴＲのエクソン１〜２からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、幹細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、幹細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
いくつかの実施形態では、幹細胞を、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化させるステップは、ゲノム編集された幹細胞を神経系細胞に分化させるために、小分子の組み合わせによる処理またはマスター転写因子の送達のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、細胞を患者に移植するステップは、細胞を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、患者に移植することを含む。
別の態様では、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのエクスビボ法が、本明細書に提供され、本方法は、任意に、患者を、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）で治療するステップと、造血前駆細胞を患者から単離するステップと、造血前駆細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、または造血前駆細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、細胞を患者に移植するステップと、を含む。
いくつかの実施形態では、患者を顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）で治療するステップは、Ｐｌｅｒｉｘａｆｌｏｒと組み合わせて行われる。
いくつかの実施形態では、造血前駆細胞を患者から単離するステップは、ＣＤ３４＋細胞を単離することを含む。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップ、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１エクソンの遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍のまたはその発現もしくは機能に影響を及ぼす、１つ以上の変異体またはエクソンの発現または機能の永久挿入、修正、または調節をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の永久挿入をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、造血前駆細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含むことができる。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択され得る。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１〜２、ＡＬＢのエクソン１〜２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１〜２、ＡｐｏＣ３のエクソン１〜２、ＡＳＧＲ２のエクソン１〜２、ＣＣＲ５のエクソン１〜２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１〜２、Ｇ６ＰＣのエクソン１〜２、Ｇｙｓ２のエクソン１〜２、ＨＧＤのエクソン１〜２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１〜２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１〜２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１〜２、ＴＦのエクソン１〜２、及びＴＴＲのエクソン１〜２からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、造血前駆細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を導入するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、幹細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入すること、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正、及びＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子のセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集すること、を含む。
いくつかの実施形態では、細胞を患者に移植するステップは、神経系細胞を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、患者に移植することを含む。
別の態様では、患者の細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するステップを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのインビボ方法が、本明細書に提供される。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップ、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１エクソンの遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍のまたはその発現もしくは機能に影響を及ぼす、１つ以上の変異体またはエクソンの発現または機能の永久挿入、修正、または調節をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の永久挿入をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含むことができる。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択され得る。セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１〜２、ＡＬＢのエクソン１〜２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１〜２、ＡｐｏＣ３のエクソン１〜２、ＡＳＧＲ２のエクソン１〜２、ＣＣＲ５のエクソン１〜２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１〜２、Ｇ６ＰＣのエクソン１〜２、Ｇｙｓ２のエクソン１〜２、ＨＧＤのエクソン１〜２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１〜２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１〜２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１〜２、ＴＦのエクソン１〜２、及びＴＴＲのエクソン１〜２からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、患者の細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含み、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす。
いくつかのインビボ実施形態では、細胞は、神経系細胞、骨髄細胞、造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；またはホモログ、コドン最適化、またはこれらの修正した変形である。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のＲＮＡは、１つ以上の修飾ポリヌクレオチドまたは１つ以上の修飾ＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入することをさらに含み、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、タンパク質またはポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の修飾ｇＲＮＡまたは１つ以上の修飾ｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡと事前に複合体形成される。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子またはｃＤＮＡの一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子またはｃＤＮＡの一部は、全Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子もしくはｃＤＮＡ、または天然変異体１、変異体２、もしくは変異体３のｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖または二本鎖のいずれかである。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、９ｐ２１．２領域に対して相同アームを有する。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）、及び野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）、及びコドン最適化または修飾Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の遺伝子座で１つの一本鎖切断（ＳＳＢ）または１つの二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＤＳＢ遺伝子座でポリヌクレオチドドナー鋳型から染色体ＤＮＡへの新しい配列の挿入を容易にし、遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の近位にあるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の染色体ＤＮＡの一部の永久挿入または修正をもたらし、ｇＲＮＡは、遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列、及びＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元を含む。いくつかの実施形態では、近位は、ＤＳＢ遺伝子座の上流及び下流の両方のヌクレオチドを意味する。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）、及び野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含み、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、第１が５’遺伝子座及び第２が３’遺伝子座であり、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、少なくとも２つ（例えば一対）の一本鎖切断（ＳＳＢ）または一対の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすまたは作成する２つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、５’遺伝子座と３’遺伝子座との間で、ポリヌクレオチドドナー鋳型から染色体ＤＮＡへの新しい配列の挿入を容易にし、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、５’遺伝子座と３’遺伝子座との間の染色体ＤＮＡの永久挿入または修正をもたらし、第１のガイドＲＮＡが、５’遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが、３’遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つまたは２つのｇＲＮＡは、１つまたは２つの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡは、１つもしくは２つの修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは２つの修飾ｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと事前に複合体形成される。
いくつかの実施形態では、野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子またはｃＤＮＡの一部は、全Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子もしくはｃＤＮＡ；天然変異体１、変異体２、もしくは変異体３のｃＤＮＡ；または約３０のヘキサヌクレオチド反復である。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖または二本鎖のいずれかである。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、９ｐ２１．２領域に対して相同アームを有する。
いくつかの実施形態では、ＤＳＢ、または５’ＤＳＢ及び３’ＤＳＢは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１イントロン内にある。
ドナー鋳型は、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかであり得る。ドナー鋳型は、例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１〜２、ＡＬＢのエクソン１〜２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１〜２、ＡｐｏＣ３のエクソン１〜２、ＡＳＧＲ２のエクソン１〜２、ＣＣＲ５のエクソン１〜２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１〜２、Ｇ６ＰＣのエクソン１〜２、Ｇｙｓ２のエクソン１〜２、ＨＧＤのエクソン１〜２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１〜２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１〜２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１〜２、ＴＦのエクソン１〜２、及びＴＴＲのエクソン１〜２のような、セーフハーバー遺伝子座に相同アームを有し得る。
いくつかの実施形態では、挿入または修正は、相同配向型修復（ＨＤＲ）によるものである。
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含み、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座との間で染色体ＤＮＡの永久欠失をもたらす、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座との間で染色体ＤＮＡの欠失をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の、第１が５’ＤＳＢ遺伝子座及び第２が３’ＤＳＢ遺伝子座である、一対の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす、２つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、第１のガイドＲＮＡが、５’ＤＳＢ遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが、３’ＤＳＢ遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含む。
いくつかの実施形態では、２つのｇＲＮＡは、２つの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡは、２つの修飾ｇＲＮＡまたは２つの修飾ｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと事前に複合体形成される。
いくつかの実施形態では、５’ＤＳＢ及び３’ＤＳＢはともに、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１エクソン、第１イントロン、または第２エクソンのいずれかの中にあるか、またはその近傍にある。
いくつかの実施形態では、欠失は、拡大したヘキサヌクレオチド反復の欠失である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びドナー鋳型は、それぞれ、脂質ナノ粒子に別々に製剤化されるか、または全てが脂質ナノ粒子に同時に製剤化される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びドナー鋳型は、エクソソームに別々に製剤化されるか、またはエクソソームに同時に製剤化される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に製剤化されるか、ｇＲＮＡ及びドナー鋳型の両方は、ウイルスベクターによって細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６ベクターである。
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に製剤化され得、ｇＲＮＡは、電気穿孔法によって細胞に送達され得、ドナー鋳型は、ウイルスベクターによって細胞に送達され得る。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６ベクターであり得る。
いくつかの実施形態では、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子は、染色体９：２７，５４６，５４２〜２７，５７３，８６３（ゲノム参照コンソーシアム−ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）上に位置する。
いくつかの実施形態では、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元は、野生型または正常Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質活性と比較される。
別の態様では、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者から細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するために、配列番号１〜１８８０７中の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡは、１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の修飾ｇＲＮＡまたは１つ以上の修飾ｓｇＲＮＡである。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者から細胞中のセーフハーバー遺伝子座を編集するために、配列番号１８８１０〜７３６６８中の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提供され、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡは、１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の修飾ｇＲＮＡまたは１つ以上の修飾ｓｇＲＮＡである。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内で１つ以上の変異体を永久に修正し、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質活性を復元するために、前述の方法によって修飾されている細胞も、本明細書に提供される。ＡＬＳまたはＦＴＬＤ患者に前述の方法によって修飾されている細胞の投与によって筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を改善するための方法が、本明細書にさらに提供される。
いくつかの実施形態では、本開示の方法及び組成物は、１つ以上の修飾ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含む。修飾の非限定例は、糖の２’位で修飾された１つ以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース上の２’−フルオロ、２’−アミノ、もしくは２’Ｏ−メチル修飾、ＲＮＡの３’末端にデスオキシヌクレオチド、または反転した塩基を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）は、天然オリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化にさらに耐性を示す修飾ｇＲＮＡを作製する修飾を含む。かかる修飾の非限定例は、修飾骨格を含むもの、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロチオス、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連鎖、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間連鎖を含む。
別の態様では、ドナーからの骨髄を患者に移植することを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するための方法が、本明細書に提供される。
様々な他の態様は、本明細書に記載され、例示されている。
分解によるインデルの追跡（ＴＩＤＥ）分析に供されるガイドＲＮＡの切断率を示すグラフである。
配列表の簡単な説明
配列番号１〜６１４８は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６１４９〜６８９２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７７６０〜８０９７は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号８０９８〜８２６１は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６８９３〜７７５９は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号８２６２〜１８８０７は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号１８８１０〜２０８４１は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２０８４２〜２１０１２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２１０１３〜２１０３０は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２１０３１〜２１０３９は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２１０４０〜２１１１４は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２１１１５〜２２２９０は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ，Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２２２９１〜２２４５８は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｌｂ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２２４５９〜２２４８６は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｌｂ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２２４８７〜２２５０４は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｌｂ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２２５０５〜２２５０９は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｌｂ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２２５１０〜２２５３３は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｌｂ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２２５３４〜２２９１２は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＡｌｂ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２２９１３〜２３２５７は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｎｇｐｔ１３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２３２５８〜２３２９３は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｎｇｐｔ１３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２３２９４〜２３３１６は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｎｇｐｔ１３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２３３１７〜２３３２９は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｎｇｐｔ１３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２３３３０〜２３３９２は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｎｇｐｔ１３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２３３９３〜２４２４０は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＡｎｇｐｔ１３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２４２４１〜２４６４３は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２４６４４〜２４６６８は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２４６６９〜２４６７１は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２４６７２〜２４６７３は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２４６７４〜２４６８５は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２４６８６〜２４９１７は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２４９１８〜２６６８５は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２６６８６〜２６８９１は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２６８９２〜２６９１５は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２６９１６〜２６９２７は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２６９２８〜２７０１０は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２７０１１〜２８４５０は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２８４５１〜２８６５３は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２８６５４〜２８６８５は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２８６８６〜２８６９９は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２８７００〜２８７０１は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２８７０２〜２８７２９は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２８７３０〜２９０２９は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２９０３０〜３０４９５は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＦ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３０４９６〜３０６５８は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＦ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３０６５９〜３０７１９は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＦ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３０７２０〜３０７４４は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＦ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３０７４５〜３０８９７は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＦ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３０８９８〜３３０３８は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＦ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３３０３９〜３４０５４は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧ６ＰＣ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３４０５５〜３４１７１は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧ６ＰＣ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３４１７２〜３４１９５は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧ６ＰＣ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３４１９６〜３４２０４は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧ６ＰＣ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３４２０５〜３４２９４は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧ６ＰＣ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３４２９５〜３５３８９は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＧ６ＰＣ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号３５３９０〜４０８８２は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号４０８８３〜４１５５８は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号４１５５９〜４１８３６は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号４１８３７〜４１９５０は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号４１９５１〜４２６３０は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＧｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号４２６３１〜５１０６２は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＧｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５１０６３〜５２７５５は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５２７５６〜５２９６９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５２９７０〜５３０５２は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５３０５３〜５３０７１は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５３０７２〜５３２７２は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５３２７３〜５５５９７は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５５５９８〜５９３９２は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＬｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５９３９３〜５９８０２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＬｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５９８０３〜５９９３８は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＬｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５９９３９〜５９９７３は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＬｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５９９７４〜６０３４１は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＬｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６０３４２〜６４９６２は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＬｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６４９６３〜６６９８２は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６６９８３〜６７１６９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６７１７０〜６７２０５は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６７２０６〜６７２１９は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６７２２０〜６７３５９は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６７３６０〜６９１５３は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６９１５４〜７０２９１は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７０２９２〜７０３８４は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７０３８５〜７０３９６は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７０３９７〜７０３９９は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７０４００〜７０４５０は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７０４５１〜７１２５４は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７１２５５〜７２０８６は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７２０８７〜７２１７２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７２１７３〜７２１８４は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７２１８５〜７２１９１は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７２１９２〜７２２３５は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７２２３６〜７２８７１は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７２８７２〜７３１７１は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７３１７２〜７３２１２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７３２１３〜７３２２９は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７３２３０〜７３２３１は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７３２３２〜７３２６６は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７３２６７〜７３６６８は、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を標的化するための２２ｂｐのスペーサー配列である。
Ｃ９ＯＲＦ７２
ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子は、塩基対２７，５４６，５４２から塩基対２７，５７３，８６３の染色体９オープンリーディングフレーム７２の短（ｐ）アーム上に位置している。その細胞遺伝学的位置は、９ｐ２１．２にある。Ｃ９ＯＲＦ７２の変異は、６つの文字列のヌクレオチドＧＧＧＧＣＣのヘキサヌクレオチド反復拡大である。健常な個人において、このヘキサヌクレオチドの少数の反復がある、典型的には、３０以下であるが、罹患した表現型を有する人において、反復は、ほぼ数百程度で生じ得る。Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子におけるヘキサヌクレオチド拡大事象は、約４０％の家族性ＡＬＳ及び８〜１０％の散発性ＡＬＳに存在する。
ヘキサヌクレオチド拡大は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の代替的にスプライシングされたイントロン１で発生し、したがって、コード配列または結果として生じるタンパク質を変更しない。Ｃ９ＯＲＦ７２の３つの代替的にスプライシングされた変異体（Ｖ１、Ｖ２、及びＶ３）が、通常、生成される。拡大したヌクレオチド反復は、Ｖ１の転写を減少させることが示されているが、生成されたタンパク質の総量は、影響を受けなかった。
「ヘキサヌクレオチド反復拡大」という用語は、一連の６塩基（例えば、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＣＧ、またはＧＧＧＧＧＣ）が少なくとも２回反復したことを意味する。ある特定の実施形態では、ヘキサヌクレオチド反復拡大は、Ｃ９ＯＲＦ７２核酸のイントロン１に位置し得る。ある特定の実施形態では、病原性ヘキサヌクレオチド反復拡大は、Ｃ９ＯＲＦ７２核酸において、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＣＧ、またはＧＧＧＧＧＣの少なくとも３０回の反復を含み、疾患と関連している。他の実施形態では、病原性ヘキサヌクレオチド反復拡大は、少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００またはそれ以上の反復を含む。ある特定の実施形態では、反復は、連続的である。ある特定の実施形態では、反復は、１つ以上の核酸塩基によって中断される。ある特定の実施形態では、野生型ヘキサヌクレオチド反復拡大は、Ｃ９ＯＲＦ７２核酸において、ＧＧＧＧＣＣ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＣＧ、またはＧＧＧＧＧＣの２９回以下の反復を含む。他の実施形態では、野生型ヘキサヌクレオチド反復拡大は、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１回の反復を含む。ある特定の実施形態では、全ヘキサヌクレオチド反復拡大が欠失される。ある特定の実施形態では、反復は、連続的である。ある特定の実施形態では、反復は、１つ以上の核酸塩基によって中断される。
治療的アプローチ
１）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復を完全に欠失する、２）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復を、野生型または同様の数のヘキサヌクレオチド反復で修正／置き換える、または３）遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座へのヘキサヌクレオチド反復領域及びノッキングインＣ９ＯＲＦ７２ ｃＤＮＡの欠失によって、ゲノムへの永久変化を引き起こすためにゲノム操作ツールを用いるための細胞、エクスビボ、及びインビボ方法が、本明細書に提供される。かかる方法は、拡大したヘキサヌクレオチド反復もしくはその一部を永久に欠失もしくは置き換える、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のゲノム遺伝子座に挿入するために、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１等）ヌクレアーゼを使用する。このようにして、本発明は、野生型または類似のＣ９ＯＲＦ７２イントロン配列を復元するか、または（患者の寿命のための潜在的治療を送達するよりはむしろ）拡大したヘキサヌクレオチド反復を単一処理で欠失する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するための方法が、本明細書に提供される。かかる方法の一実施形態は、エクスビボ細胞系療法である。例えば、患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が、作成される。次いで、これらのｉＰＳ細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載される材料及び方法を用いて修正される。次に、修正されたｉＰＳＣは、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化される。最終的に、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞は、患者に移植される。
ドナー鋳型とともに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１を用いて、野生型Ｃ９ＯＲＦ７２ ｃＤＮＡを、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座、またはＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に挿入するために、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の正確な発現を復元する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、かかる方法は、ノックインされ得、影響を受けたエクソンを含有する、ｃＤＮＡの使用である。部分的なｃＤＮＡアプローチに加えて、完全長ｃＤＮＡは、翻訳開始部位にノックされ得る。いずれにしても、挿入されたｃＤＮＡの発現は、Ｃ９ＯＲＦ７２プロモーターの制御下にあり、Ｃ９ＯＲＦ７２タンパク質レベルの正確な制御を表示する。
Ｃ９ＯＲＦ７２ ｃＤＮＡを、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１〜２、ＡＬＢのエクソン１〜２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１〜２、ＡｐｏＣ３のエクソン１〜２、ＡＳＧＲ２のエクソン１〜２、ＣＣＲ５のエクソン１〜２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１〜２、Ｇ６ＰＣのエクソン１〜２、Ｇｙｓ２のエクソン１〜２、ＨＧＤのエクソン１〜２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１〜２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１〜２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１〜２、ＴＦのエクソン１〜２、及びＴＴＲのエクソン１〜２、からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に挿入することによって、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の正確な発現を復元する方法もまた、本明細書に提供される。
かかる方法の別の実施形態は、エクスビボ細胞系療法である。例えば、白血球は、患者から単離される。次に、これらの白血球の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載される材料及び方法を使用して修正される。最終的に、編集された白血球は、患者に移植される。
かかる方法のさらに別の実施形態は、エクスビボ細胞系療法である。例えば、任意に、患者の骨髄の生検を実行する。次いで、間葉幹細胞は、生検材料から単離される。次に、これらの幹細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載される材料及び方法を用いて修正される。次に、幹細胞は、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化される。最終的に、これらの造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞は、患者に移植される。
かかる方法のさらなる実施形態は、エクスビボ細胞系療法である。例えば、患者は、任意に、顆粒球コロニー刺激因子で治療される。次いで、造血前駆細胞は、患者から単離される。次に、これらの細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載される材料及び方法を用いて修正される。最終的に、細胞は、患者に移植される。
エクスビボ細胞療法アプローチの１つの利点は、投与前に治療法の総合的分析を行う能力である。全てのヌクレアーゼ系治療法は、いくつかのレベルのオフ標的効果を有する。エクスビボで遺伝子修正を行うことは、移植前に修正された細胞集団を十分に特徴付けることを可能にする。本発明の態様は、もしあれば、オフ標的切断が患者への最小リスクと関連する遺伝子位置にあることを確実にするために、修正された細胞の全ゲノムを配列決定することを含む。さらに、クローン集団を含む特定の細胞の集団は、移植前に単離され得る。
エクスビボ細胞療法の別の利点は、他の初代細胞源と比較したｉＰＳＣ中の遺伝子修正に関する。ｉＰＳＣは、豊富であり、細胞系療法に必要とされるであろう多数の細胞を取得することを容易にする。さらに、ｉＰＳＣは、クローン単離を行うために理想的な細胞型である。これは、生存率の減少のリスクを冒さずに、正確なゲノム修正のためのスクリーニングを可能にする。対照的に、他の初代細胞は、ほんの継代のみで生存可能であり、クローン的に拡大させるのが困難である。それ故に、ＡＬＳまたはＦＴＬＤの治療のためのｉＰＳＣの操作は、さらに容易であり、かつ所望の遺伝的修正を行うために必要とされる時間の量を短縮するであろう。
かかる方法の別の実施形態は、インビボ系療法である。この方法では、患者における細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載される材料及び方法を用いて修正される。好ましくは、細胞は、神経系細胞、骨髄細胞、造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞である。
インビボ系遺伝子療法の利点は、治療的生成及び投与の容易さである。同じ治療的アプローチ及び療法は、１人を超える患者、例えば、同じまたは同様の遺伝子型または対立遺伝子を共有する多くの患者を治療するために使用される可能性を有するであろう。対照的に、エクスビボ細胞療法は、典型的には、単離し、操作し、同じ患者に戻す、患者自体の細胞を用いることを必要とする。
ゲノム編集によって細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するための細胞方法も、本明細書で提供される。例えば、細胞は、患者または動物から単離される。次いで、細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載される材料及び方法を用いて修正される。
本発明の方法は、細胞またはエクスビボまたはインビボ方法にかかわらず、以下のもののうちの１つまたはこれらの組み合わせを含む：Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内またはその近傍の全拡大したヘキサヌクレオチド反復もしくはその断片を欠失すること、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内またはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復を、野生型レベルもしくは同等のレベルまで修正すること、または外因性Ｃ９ＯＲＦ７２ ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ配列またはその断片を、遺伝子の遺伝子座にまたはゲノム中の異種位置（セーフハーバー遺伝子座、例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座）で導入すること。修正戦略及びノックイン戦略はともに、相同配向型修復（ＨＤＲ）中のドナーＤＮＡ鋳型を利用する。いずれかの戦略におけるＨＤＲは、１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用することによってゲノム中の特異的部位で１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製することによって達成され得る。第１エクソンへのｃＤＮＡのＨＤＲ媒介性ノックインの有効性の評価は、「セーフハーバー」部位、例えば、ＡｐｏＣ３（ｃｈｒ１１：１１６，８２９，９０８〜１１６，８３３，０７１）、Ａｎｇｐｔｌ３（ｃｈｒ１：６２，５９７，４８７〜６２，６０６，３０５）、Ｓｅｒｐｉｎａ１（ｃｈｒ１４：９４，３７６，７４７〜９４，３９０，６９２）、Ｌｐ（ａ）（ｃｈｒ６：１６０，５３１，４８３〜１６０，６６４，２５９）、Ｐｃｓｋ９（ｃｈｒ１：５５，０３９，４７５〜５５，０６４，８５２）、ＦＩＸ（ｃｈｒＸ：１３９，５３０，７３６〜１３９，５６３，４５８）、ＡＬＢ（ｃｈｒ４：７３，４０４，２５４〜７３，４２１，４１１）、ＴＴＲ（ｃｈｒ１８：３１，５９１，７６６〜３１，５９９，０２３）、ＴＦ（ｃｈｒ３：１３３，６６１，９９７〜１３３，７７９，００５）、Ｇ６ＰＣ（１７：４２，９００，７９６〜４２，９１４，４３２）、Ｇｙｓ２（ｃｈｒ１２：２１，５３６，１８８〜２１，６０４，８５７）、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）（ｃｈｒ１９：５５，０９０，９１２〜５５，１１７，５９９）、ＨＧＤ（ｃｈｒ３：１２０，６２８，１６７〜１２０，６８２，５７０）、ＣＣＲ５（ｃｈｒ３：４６，３７０，８５４〜４６，３７６，２０６）、ＡＳＧＲ２（ｃｈｒ１７：７，１０１，３２２〜７，１１４，３１０）の領域のうちの１つへの相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡにｃＤＮＡノックインを利用する。修正戦略及びノックイン戦略はともに、相同配向型修復（ＨＤＲ）中のドナーＤＮＡ鋳型を利用する。いずれかの戦略におけるＨＤＲは、１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用することによってゲノム中の特異的部位で１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製することによって達成され得る。
例えば、修正戦略は、細胞内ＤＳＢ反応を、相同配向型修復（ドナーＤＮＡ鋳型は、短一本鎖オリゴヌクレオチド、短二本鎖オリゴヌクレオチド、長一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ分子であり得る）に向けるために外因的に導入されるドナーＤＮＡ鋳型の存在下で、１つ以上のＣａｓ９及びｓｇ ＲＮＡを有する対象となる遺伝子中の１つの二本鎖切断、または２つ以上の適切なｓｇＲＮＡを用いて対象となる遺伝子中の２つ以上の二本鎖切断を誘導することによって、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子中の拡大したヘキサヌクレオチド反復を修正することを含む。このアプローチは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の異種ヘキサヌクレオチド反復拡大のために、ｇＲＮＡＳ及びドナーＤＮＡ分子の開発及び最適化を必要とする。
例えば、ノックイン戦略は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１または他のエクソン及び／もしくはイントロンの、もしくはその中、またはセーフハーバー部位（例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲ）からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座のエクソン１〜２）中のｓｇＲＮＡまたは一対のｓｇＲＮＡ標的上流を用いて遺伝子座に、Ｃ９ＯＲＦ７２ ｃＤＮＡをノックインすることを含む。ドナーＤＮＡは、９ｐ２１．２領域に、相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡであろう。ドナーＤＮＡは、標的セーフハーバー遺伝子座に対して相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得る。ドナー鋳型は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に対して相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得る。
例えば、欠失戦略は、１つ以上のエンドヌクレアーゼ及び２つ以上のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを用いてＣ９ＯＲＦ７２遺伝子中の１つ以上の、好ましくは全てのヘキサヌクレオチド反復を欠失することを含む。
上記の戦略（修正及びノックイン及び欠失）のための利点は、原則として、短期間及び長期間の両方の有益な臨床及び実験的効果を含む。ノックインアプローチは、修正または欠失アプローチにわたる１つの利点、つまり患者のサブセットのみを対象とする全ての患者を処置する能力を提供する。この様式で遺伝子編集を有する他の問題は、ＨＤＲのためにＤＮＡドナーに対する必要性である。
上記のゲノム編集戦略に加えて、別の戦略は、拡大したヘキサヌクレオチド反復領域以外の遺伝子において編集することによって、または調節配列において編集することによって、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現、機能、または活性を調節することを含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＰＡＭが、ＤＮＡオリゴ（ＰＡＭｅｒ）（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５１６，２６３−２６６（２０１４））としてトランスで示される場合に、一本鎖ＲＮＡ標的を標的化するために使用することができる。このシステムの操作は、転写されたＲＮＡにおける切断を特異的に誘導するが、ゲノム遺伝子座を無傷のままにするために利用することができる。これは、細胞中の有害なＲＮＡからの特異的なノックダウン発現のために有用な戦略である。ＡＬＳを治療する文脈において、あるアプローチは、切断を誘発するために、ＤＮＡ ＰＡＭｅｒとともにＣ９ＯＲＦ７２ プレＲＮＡにおいてヘキサヌクレオチド反復を特異的に標的化するｇＲＮＡを送達するためのものであり得る。これは、有害なＣ９ＯＲＦ７２ ｍＲＮＡの発現の低下をもたらし得る。
本発明の別の方法は、ドナーからの骨髄を患者に移植することを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療することを含む。
多くの種類のゲノム標的部位が、コード及びスプライシング配列における変異に加えて存在する。
転写及び翻訳の調節は、細胞タンパク質またはヌクレオチドと相互作用するいくつかの異なるクラスの部位に関与する。多くの場合、転写因子または他のタンパク質のＤＮＡ結合部位は、部位の役割を研究するために特異または欠失に対して標的化され得るが、それらはまた、遺伝子発現を変化させるために標的化され得る。部位は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を通して添加されるか、または相同配向型修復（ＨＤＲ）によるゲノム編集を配向し得る。ゲノム配列決定の使用の増加、転写因子結合のＲＮＡ発現及びゲノム規模研究は、いかに部位が発生的または時間的遺伝子調節をもたらすかを特定する能力を増加させた。これらの制御システムは、直接的であっても、複数のエンハンサーからの活性の統合を必要とすることができる広範な共同調節を伴ってもよい。転写因子は、典型的には６〜１２ｂｐ長さの縮重ＤＮＡ配列と結合する。個々の部位によって提供される低レベルの特異性は、複雑な相互作用及び役割が結合及び機能的結果に関与することを示唆する。縮重が少ない結合部位は、調節のより単純な手段を提供し得る。人工転写因子は、ゲノム内にあまり類似していない配列を有し、オフ標的切断の可能性がさらに低い、より長い配列を特定するように設計され得る。これらの種類の結合部位のうちのいずれかは、遺伝子調節または発現の変化を可能にするために、変異され、欠失され、またはさらには作製され得る（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。
これらの特性を有する別のクラスの遺伝子調節領域は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位である。ｍｉＲＮＡは、転写後遺伝子調節において重要な役割を果たす非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、全ての哺乳動物タンパク質をコードする遺伝子の３０％の発現を調節し得る。二本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）による特異的及び強力な遺伝子サイレンシングが発見され、さらに小分子非コードＲＮＡが発見された（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。遺伝子サイレンシングにとって重要である最大クラスの非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。哺乳動物において、ｍｉＲＮＡは、まず、別個の転写単位、タンパク質イントロンの一部、または他の転写物であり得る、長いＲＮＡ転写物として転写される。長い転写物は、不完全に塩基対ヘアピン構造を含む一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａを含む、マイクロプロセッサ、核内のタンパク質複合体によって１つ以上のより短い前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に切断される。
Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、成熟１９〜２５ヌクレオチドｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖に、エクスポートされた２−ヌクレオチド３’−オーバーハングを有する約７０長のヌクレオチドの短い幹ループである。より低い塩基対の安定性を有するｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）上に装填される。パッセンジャーガイド鎖（＊で印を付けた）は、機能的であり得るが、通常、分解される。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に主に見出される標的ｍＲＮＡに部分的に相補的配列モチーフに連結し、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ １３６，２１５−２３３（２００９）、Ｓａｊ，Ａ．＆ Ｌａｉ，Ｅ．Ｃ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１，５０４−５１０（２０１１））。
ｍｉＲＮＡは、発達、分化、細胞周期、及び成長制御、ならびに哺乳動物及び他の多細胞生物における事実上全ての生物学的経路において重要である。ｍｉＲＮＡはまた、細胞周期制御、アポトーシス及び幹細胞分化、造血、低酸素症、筋肉発生、神経形成、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルス複製、及び免疫応答に関与している。
単一のｍｉＲＮＡは、数百の異なるｍＲＮＡ転写物を標的し得るが、個々の転写物は、多くの異なるｍｉＲＮＡによって標的化され得る。２８６４５を超えるｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｍｉＲＢａｓｅ（ｖ．２１）の最新の放出に注釈付けられている。いくつかのｍｉＲＮＡは、複数の遺伝子座によってコードされ、これらのうちのいくつかは、直列に同時転写されたクラスタから発現される。これらの特性は、複数の経路及びフィードバック制御を有する複合調節ネットワークを可能にする。ｍｉＲＮＡは、これらのフィードバック及び調節回路の一体部分であり、限界内でタンパク質産生を維持することによって遺伝子発現の調節に役立ち得る（Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｈ．＆ Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｍ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４，１３３９−１３４４（２０１０）、Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ．＆ Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２７，１−６（２０１４））。
ｍｉＲＮＡはまた、異常なｍｉＲＮＡ発現に関連する多数のヒト疾患において重要である。この関連は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を強調する。近年のｍｉＲＮＡ欠失研究は、ｍｉＲＮＡを免疫応答の調節と関連付けられている（Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７，３７６−３８１（２００７））。
ｍｉＲＮＡはまた、がんに対する強い関連も有し、異なる種類のがんにおいて役割を果たし得る。ｍｉＲＮＡは、多くの腫瘍において下方調節されることが見出されている。ｍｉＲＮＡは、主要ながん関連経路の調節、例えば、細胞周期及びＤＮＡ損傷応答において重要であり、したがって、診断に使用され、臨床的に標的としている。ＭｉｃｒｏＲＮＡは、全てのマイクロＲＮＡを欠失する実験が、腫瘍の血管新生を抑制するように、血管新生の均衡を微妙に調節する（Ｃｈｅｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２８，１０５４−１０６７（２０１４））。
タンパク質コード遺伝子について示されているように、ｍｉＲＮＡ遺伝子もまた、がんにより生じる後成的変化に供される。多くのｍｉＲＮＡ遺伝子座は、ＤＮＡメチル化による調節のそれらの機会を増加させるＣｐＧアイランドと関連している（Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．，Ｓｔｒｅｓｅｍａｎｎ，Ｃ．，Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ，Ｂ．＆ Ｌｙｋｏ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ６，１００１−１００５（２００７））。研究の大部分は、後成的にサイレンシングされたｍｉＲＮＡを示すために、クロマチン再構築剤による治療で使用されている。
ＲＮＡサイレンシングにおけるそれらの役割に加えて、ｍｉＲＮＡはまた、翻訳を活性化することもできる（Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ．＆ Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２７，１−６（２０１４））。これらの部位のノックアウトは、標的遺伝子の発現の減少をもたらし得るが、これらの部位の導入は、発現を増加し得る。
個々のｍｉＲＮＡは、シード配列（マイクロＲＮＡの塩基２〜８）を変異させることによって最も有効にノックアウトされ得、これは、結合特異性に重要である。この領域における切断、続いて、ＮＨＥＪによる誤修復は、標的部位への結合を遮断することによってｍｉＲＮＡ機能を効果的に停止させ得る。ｍｉＲＮＡはまた、パリンドローム配列に隣接する特定のループ領域の特異的標的化によって阻害され得る。触媒不活性Ｃａｓ９はまた、ｓｈＲＮＡ発現を阻害するために使用することもできる（Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ４，３９４３（２０１４））。ｍｉＲＮＡの標的化に加えて、結合部位はまた、ｍｉＲＮＡによるサイレンシングを阻止するために標的とされ、変異され得る。
ヒト細胞
ＡＬＳまたはＦＴＬＤを改善するために、本明細書に記載及び例示されるように、遺伝子編集のための主要な標的は、ヒト細胞である。例えば、エクスビボ方法において、ヒト細胞は、記載される技術を用いて修飾した後に、神経系細胞または前駆細胞を生じさせ得る、体細胞である。例えば、インビボ方法において、ヒト細胞は、神経系細胞である。
必要とする患者から由来し、したがって、患者と既に完全に一致している自己細胞内の遺伝子編集を行うことによって、患者に安全に再導入され得る細胞を生成し、患者の疾患と関連する１つ以上の臨床状態を改善する際に有効であろう細胞の集団に有効に生じさせることが可能である。
前駆細胞（本明細書において幹細胞とも称される）は、より多くの前駆細胞を増殖し、生じさせることができ、これらは次いで、分化したまたは分化可能な娘細胞を次に生じさせ得る多数の母細胞を作製する能力を有する。娘細胞自体は、増殖し、かつ、親の発生能を有する１つ以上の細胞を保持しつつ、１つ以上の成熟細胞型へ続いて分化する後代を生成するように誘導され得る。「幹細胞」という用語は、次いで、特定の状況下で、より特殊化したまたは分化した表現型へ分化する能力または可能性を有し、かつ、ある状況下で、実質的に分化することなく増殖する能力を有する、細胞を指す。一実施形態では、前駆または幹細胞という用語は、胚細胞及び組織の漸進的多様化において生じるように、その子孫（後代）が、分化によって、例えば完全に個々の特徴を獲得することによって、しばしば異なる方向に、特殊化する、一般化された母細胞を指す。細胞分化は、多くの細胞***によって典型的に生じる複雑なプロセスである。分化細胞は、それ自体が複能性細胞等から誘導される複能性細胞に由来し得る。これらの複能性細胞の各々は、幹細胞と考えられ得る一方、各々が生じさせ得る細胞型の範囲は、かなり異なり得る。いくつかの分化細胞はまた、より大きな発生能の細胞を生じさせる能力も有する。このような能力は、天然のものであり得るか、または様々な因子での処理時に人工的に誘導され得る。多くの生物学的な事例において、幹細胞はまた、１つを超える別個の細胞型の後代を生成し得るため、「複能性」であるが、これは「幹性（ｓｔｅｍ−ｎｅｓｓ）」について必要とされない。
自己再生は、幹細胞の別の重要な態様である。理論的には、自己再生は、２つの主要な機構のいずれかによって生じ得る。幹細胞は、非対称的に***し得、一方の娘細胞は幹細胞状態を保持し、他方の娘細胞は、ある別個の他の特定の機能及び表現型を発現する。あるいは、集団中の幹細胞のいくつかは、２つの幹細胞へ対称的に***し得、したがって、全体として集団中にいくつかの幹細胞が維持され、一方、集団中の他の細胞は分化された後代のみを生じさせる。一般的に、「前駆細胞」は、より原始的である（すなわち、完全に分化した細胞であるよりも発生経路または進行に沿って初期の段階である）細胞表現型を有する。多くの場合、前駆細胞はまた、顕著なまたは非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、発生経路に応じて、細胞が発生かつ分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞型、または単一の分化細胞型を生じ得る。
細胞個体発生の文脈において、「分化した」または「分化している」という形容詞は、相対的な用語である。「分化細胞」は、それが比較されている細胞よりも発生経路のさらに先へ進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、系統限定前駆細胞（筋細胞前駆細胞等）へ分化することができ、これは次に、この経路のさらに先の他の前駆細胞型（筋細胞前駆体等）へ、その後、最終段階の分化細胞へ分化することができ、これはある種の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持しても、保持していなくてもよい。
「造血前駆細胞」という用語は、赤血球（赤血球または赤血球細胞（ＲＢＣ））、骨髄（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球／血小板、及び樹状細胞）、ならびにリンパ（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む、全ての血液細胞型を生じさせる幹細胞系統の細胞を指す。
「赤血球系統の細胞」は、接触させる細胞が、最終分化によって赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）を形成するような、赤血球生成を起こす細胞であることを示す。そのような細胞は、骨髄造血前駆細胞が起源である。特定の成長因子及び造血微環境の他の構成要素に曝露すると、造血前駆細胞は、一連の中間分化細胞型、赤血球系統の全ての中間体を通じて、ＲＢＣに成熟することができる。それ故に、「赤血球系統」の細胞は、造血前駆細胞、前赤芽球、塩基好性赤芽球、赤芽球、後赤血球、網状赤血球、及び赤血球を含む。
いくつかの実施形態では、造血前駆細胞は、造血前駆細胞の細胞表面マーカー：ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙｌ／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８１ｏ／−、及びＣ−ｋｉｔ／ＣＤｌ １７＋のうちの少なくとも１つを発現する。いくつかの実施形態では、造血前駆体は、ＣＤ３４＋である。
いくつかの実施形態では、造血前駆細胞は、患者が、顆粒球コロニー刺激因子等の１つ以上の因子（任意に、Ｐｌｅｒｉｘａｆｌｏｒと組み合わせて）で治療された後に、この患者から得られた末梢血幹細胞である。例示的な実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて濃縮される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ゲノム編集前に、サイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＦＬＴ３）で、無血清培地（例えば、ＣｅｌｌＧｒｏｗ ＳＣＧＭ培地、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）中で刺激される。いくつかの実施形態では、ＳＲ１及びｄｍＰＧＥ２ならびに／または他の因子の添加は、長期間の生着を改善することが企図される。
いくつかの実施形態では、赤血球系統の造血前駆細胞は、ＣＤ７１及びＴｅｒｌ １９等の赤血球系統の細胞表面マーカー特徴を有する。
ＡＬＳ及びＦＴＬＤはともに、運動ニューロンの疾患であり、筋肉を制御するために、神経線維を送る脊髄の大細胞である。また、随意運動を調節する脳の一部における運動ニューロンは、ＡＬＳ及びＦＴＬＤにおいて破壊される。これら（上位運動ニューロンと呼ばれる）は、脳から神経線維を送って、脊髄中の下位運動ニューロンを制御する。インビボ方法は、運動ニューロンを直接標的し得る。インビボ方法はまた、グリア、星状膠細胞、及び他の支持細胞を標的し得る。
未公開データでは、ホモ接合性Ｃ９ＯＲＦ７２変異を持つマウスが生存可能であることが示されている。しかしながら、これらのマウスは、平均余命の減少、脾腫、好中球増加症、血小板減少症、及び炎症性サイトカインのレベルの上昇によって特徴付けられ、ＡＬＳの病理に対する免疫成分が存在し得ることを示唆する。興味深いことには、骨髄移植は、Ｃ９ＯＲＦ７２ホモ接合性変異体マウスにおいて観察される、死亡率及びサイトカインのレベルを遅延させることができる。この作業を基に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１技術を用いた免疫系の細胞中のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の修正が、ＡＬＳの治療における新しいアプローチであり得ることが仮説されている。
誘導された多能性幹細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作されたヒト細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ｉＰＳＣを用いる利点は、細胞は、前駆細胞が投与される同じ対象に由来し得ることである。つまり、体細胞は、対象から得られ、誘導多能性幹細胞に再プログラムされ、次いで、対象に投与される前駆細胞（例えば、自己細胞）に再分化され得る。前駆体が本質的に自己源に由来するため、生着拒絶またはアレルギー性反応のリスクは、別の対象または対象群の細胞の使用と比較して低減される。加えて、ｉＰＳＣの使用は、胚源から得られた細胞の必要性を否定する。それ故に、一実施形態では、開示された方法で使用される幹細胞は、胚幹細胞ではない。
分化は、概して、生理学的状況下で不可逆的であるが、いくつかの方法が、体細胞をｉＰＳＣに再プログラムするように最近開発されている。例示的な方法は、当業者に既知であり、本明細書において以下に簡潔に説明されている。
「再プログラミング」という用語は、分化された細胞（例えば、体細胞）の分化状態を改変または逆転させるプロセスを指す。つまり、再プログラミングは、細胞の、より未分化なまたはより原始的な型へと細胞の分化を逆に推進するプロセスを指す。多くの初代細胞を培養液中に置くことで、完全に分化した特徴の一部の喪失を招き得ることに注意すべきである。それ故に、分化細胞という用語に含まれるような細胞を単に培養することは、これらの細胞を非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞とするものではない。多能性への分化細胞の移行には、培養液中での分化した特徴の部分的な喪失を招く刺激を超えた再プログラミング刺激が要求される。再プログラミングされた細胞はまた、一般的に培養液中での限られた数だけの***のための能力を有する初代細胞の親と比べて、成長能の喪失を伴わずに、延長した継代の能力の特徴を有する。
再プログラミングされる細胞は、再プログラミング前に、部分的または末端に分化される。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、多能性状態または複能性状態への分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の完全な逆転を含む。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、未分化細胞（例えば、胚様細胞）への分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の完全なまたは部分的な逆転を含む。再プログラミングは、細胞による特定の遺伝子の発現をもたらし得、この発現は、さらに再プログラミングの一因となる。本明細書に記載されるある特定の実施形態では、分化細胞（例えば、体細胞）の再プログラミングは、分化細胞に、未分化状態（例えば、未分化細胞である）を取らせる。結果として得られた細胞は、「再プログラミング細胞」または「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）」と称される。
再プログラミングは、細胞分化の間に生じる、核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、エピジェネティック変化、ゲノムインプリンティング等の遺伝的パターンの、改変、例えば、逆転を含む。再プログラミングは、既に多能性である細胞の既存の未分化状態を単に維持すること、または既に複能性細胞である細胞（例えば、筋原性幹細胞）の既存の、完全に満たない分化状態を維持することからは区別される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法はまた、そのような目的のために有用であるが、再プログラミングはまた、既に多能性または複能性である細胞の自己複製または増殖を促すことから区別されている。
体細胞から多能性幹細胞を生成するために使用することができる、多くの方法が、当該技術分野で既知である。多能性表現型に体細胞を再プログラミングする任意のこのような方法は、本明細書に記載される方法で用いるために適切であり得る。
転写因子の定義された組み合わせを用いて多能性細胞を生成するための再プログラミング方法が、説明されている。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの直接形質導入によって、マウス体細胞を、発達能が増大したＥＳ細胞様細胞へと変換させ得る；例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６（４）：６６３−７６（２００６）を参照のこと。ｉＰＳＣは、それらが多能性関連転写回路及び後成的背景の多くを回復するため、ＥＳ細胞と類似する。加えて、マウスｉＰＳＣは、多能性に関する全ての標準アッセイ、具体的に、３胚葉の細胞型へのインビトロ分化、テラトーマ形成、キメラへの関与、生殖系列伝播［例えば、Ｍａｈｅｒａｌｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．３（６）：５９５−６０５（２００８）を参照のこと］、及び四倍体相補性を満たす。
ヒトｉＰＳＣは、類似の形質導入法を用いて得られ得、転写因子トリオ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧは、多能性を支配する転写因子のコアセットとして確立されている；例えば、Ｂｕｄｎｉａｔｚｋｙ ａｎｄ Ｇｅｐｓｔｅｉｎ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．３（４）：４４８−５７（２０１４）、Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ３：１−６ ｓｃｔｍ．２０１４−０１２１（２０１４）、Ｆｏｃｏｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：ｅ２１１（２０１４）、及びその中に言及された参照文献を参照のこと。ｉＰＳＣの生成は、歴史的にはウイルスベクターを用いて、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸配列を、成熟の体細胞に導入することによって達成することができる。
ｉＰＳＣは、最終分化体細胞、ならびに成熟幹細胞、または体幹細胞から作製または誘導することができる。つまり、非多能性前駆細胞は、再プログラミングによって多能性または複能性にされ得る。そのような例では、最終分化細胞を再プログラミングするために必要な場合ほど多くの再プログラミング因子を含める必要ではあり得ない。さらに、再プログラミングは、非ウイルス性の再プログラミング因子の導入によって、例えば、タンパク質それ自体を導入することによって、または再プログラミング因子をコードする核酸を導入することによって、または翻訳時に再プログラミング因子を生成するメッセンジャーＲＮＡを導入することによって誘導することができる（例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０）を参照のこと。再プログラミングは、例えば、Ｏｃｔ−４（Ｏｃｔ−３／４またはＰｏｕｆ５１としても既知である）、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、及びＬＩＮ２８を含む、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組み合わせを導入することによって達成され得る。一実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物を用いた再プログラミングは、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘファミリーメンバー、Ｋｌｆファミリーメンバー、Ｍｙｃファミリーメンバーのうちの１つ以上を、体細胞に導入することをさらに含み得る。一実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物は、再プログラミングのためにＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ＭＹＣ、及びＫｌｆ４の各々の１つ以上を導入することをさらに含む。上述のように、再プログラミングのために使用される的確な方法は、必ずしも本明細書に記載される方法及び組成物にとって重要ではない。しかしながら、再プログラミングした細胞から分化された細胞は、例えば、ヒトの治療に用いる場合、一実施形態では、再プログラミングは、ゲノムを変化させる方法によって達成されない。それ故に、このような実施形態では、再プログラミングは、例えば、ウイルスまたはプラスミドベクターを用いずに達成される。
開始細胞集団から誘導される再プログラミングの効率（すなわち、再プログラミング細胞の数）は、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ−Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：５２５−５２８（２００８）、Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（７）：７９５−７９７（２００８）、及びＭａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ−Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３：１３２−１３５（２００８）によって示されるように、様々な薬剤、例えば小分子の添加によって増強させることができる。このようにして、誘導多能性幹細胞産生の効率または割合を増強する薬剤または薬剤の組み合わせは、患者特異的または疾患特異的ｉＰＳＣの産生に用いることができる。再プログラミングの効率を増強する薬剤のいくつかの非限定的な例としては、とりわけ、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ条件培地、ＢＩＸ−０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５’−アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、及びトリコスタチン（ＴＳＡ）が挙げられる。
再プログラミング増強剤の他の非限定的な例としては、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えば、ＭＫ０６８３、ボリノスタット）及び他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ−２１０、デプデシン（例えば、（−）−デプデシン）、ＨＣ毒素、ヌルスクリプト（４−（ｌ，３−ジオキソ−ｌＨ，３Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタナミド）、フェニルブチレート（例えば、フェニル酪酸ナトリウム）及びバルプロ酸（（ＶＰＡ）及び他の短鎖脂肪酸）、スクリプタイド、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、アピシジン、酪酸ナトリウム、ピバロイルオキシメチルブチレート（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ−９）、トラポキシンＢ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としても既知である）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ−９９４（例えば、Ｎ−アセチルジナリン）及びＭＳ−２７−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４、ＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、ツバシン、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（例えば、６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロイックヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１、及びＣＨＡＰ５０が挙げられる。他の再プログラミング増強剤には、例えば、ＨＤＡＣのドミナントネガティブ型（例えば、触媒的に不活性な型）、ＨＤＡＣのｓｉＲＮＡ阻害剤、及びＨＤＡＣに特異的に結合する抗体が挙げられる。そのような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる。
本明細書に記載される方法とともに用いるための多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離クローンを、幹細胞マーカーの発現に関して試験することができる。体細胞から誘導された細胞中のそのような発現は、誘導多能性幹細胞として細胞を特定する。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔｌ、Ｅｓｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘｌ、Ｕｔｆｌ、及びＮａｔｌを含む、非限定的な群から選択される。一実施形態では、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現する細胞は、多能性であると特定される。そのようなマーカーの発現を検出するための方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、及びウエスタンブロットまたはフローサイトメトリー分析等のコードされるポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法を含み得る。いくつかの実施形態では、検出は、ＲＴ−ＰＣＲを伴うのみならず、タンパク質マーカーの検出を含む。細胞内マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲによって、または免疫細胞化学等のタンパク質検出方法によって最もよく特定され得るが、細胞表面マーカーは、例えば、免疫細胞化学によって容易に同定される。
単離細胞の多能性幹細胞特徴は、３胚葉の各々の細胞へのｉＰＳＣの分化能を評価する試験によって確認することができる。一例として、ヌードマウスにおけるテラトーマ形成は、単離クローンの多能性特徴を評価するために使用することができる。細胞をヌードマウスに導入して、細胞から生じた腫瘍に関して組織学及び／または免疫組織化学を行う。３胚葉全てからの細胞を含む使用の成長は、例えば、細胞が多能性幹細胞であることをさらに示す。
神経系細胞
ヒト神経系は、およそ３６００億個の非神経性グリア細胞及び９００億個の神経細胞を有すると推測される。形態に基づいて、単独で数百の異なる種類のニューロンが存在する。しばしば、同様に見えるニューロンは、著しく異なる特性を有する。例えば、それらは、異なる神経伝達物質に使用し、それらに応答する。
神経幹細胞（ＮＳＣ）は、神経系の主な表現型を生成する、自己複製の複能性細胞である。幹細胞は、それらの環境からの外部刺激を介して複数の細胞型への分化する能力によって特徴付けられる。それらは、一方は非特殊化であり、もう一方は特殊化である、２つの娘細胞に非対称の細胞***を行う。ＮＳＣは、主に、ニューロン、星状膠細胞、及び乏突起膠細胞に分化する。
典型的なニューロンは、１つの細胞から別の細胞に電気シグナルを送信する。ニューロンは、細胞体、樹状突起、軸索小丘、神経終末、及び神経筋接合部を含む。ニューロンは、樹枝木の形状または性質に従って名付けられ得る。
中枢神経系の最も多くの細胞成分は、ニューロン間の空間を占める非神経細胞、神経グリア（「神経膠」）細胞である。ＣＮＳ中の細胞の８０〜９０％を含む、およそ３６００億個のグリア細胞が存在すると推定されている。神経膠は、シナプスを形成せず、本質的に１種類のみのプロセスを有し、分割能力を保持し、ニューロンほど電気的に励起しないという点でいくつかの一般的な方法において、ニューロンとは異なる。神経膠は、光学顕微鏡レベルで、それらの核のサイズ及び形状に基づいて分類され、ニューロンと区別される。神経膠は、サイズに基づいて２つの主な区分、大膠細胞及び小膠細胞に分割される。大膠細胞は、外胚葉起源からのものであり、星状膠細胞、乏突起膠細胞、及び上衣細胞からなる。小膠細胞は、恐らくは、中胚葉起源からのものである。
患者特異的ｉＰＳＣを作成すること
本発明のエクスビボ方法の１つのステップは、患者特異的ｉＰＳ細胞、患者特異的ｉＰＳ細胞、または患者特異的ｉＰＳ細胞株を作成することを含む。Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ ２００６、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．２００７に記載される、患者特異的ｉＰＳ細胞を作成するための当該技術分野で多くの構築された方法がある。例えば、作成するステップは、ａ）皮膚細胞または線維芽細胞等の体細胞を患者から単離することと、ｂ）体細胞に、一連の多分化能関連遺伝子を導入し、細胞を誘導して、多能性幹細胞にすることと、を含む。いくつかの実施形態では、一連の多分化能関連遺伝子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、及びｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上である。
患者の骨髄の生検を実行すること
生検は、身体から取られた組織または流体の試料である。多くの異なる種類の生検が存在する。それらのほぼ全ては、少量の組織を除去するための鋭利なツールを使用することを伴う。生検が、皮膚または他の敏感な部位にある場合、麻痺させる薬物を最初に適用する。生検は、当該技術分野で既知の方法のうちのいずれかに従って行われ得る。例えば、骨髄生検において、太い注射針が、骨髄を収集するために、骨髄骨に入れるために使用される。
白血球を単離すること
白血球は、当該技術分野で既知の任意の方法に従って単離され得る。例えば、白血球は、遠心分離によって液体試料から単離され得る。
間葉幹細胞を単離すること
間葉幹細胞は、当該技術分野で既知の任意の方法に従って単離され得る。例えば、骨髄穿刺は、ヘパリン入りの注射器に回収される。細胞を、洗浄し、Ｐｅｒｃｏｌｌ上で遠心分離する。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）中で培養する（Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ ＭＦ，Ｍａｃｋａｙ ＡＭ，Ｂｅｃｋ ＳＣ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８４：１４３−１４７）。
ＧＣＳＦで患者を治療すること
患者は、任意に、当該技術分野で既知の任意の方法に従って顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）で治療され得る。いくつかの実施形態では、ＧＣＳＦは、Ｐｌｅｒｉｘａｆｌｏｒと組み合わせて投与される。
造血前駆細胞を患者から単離すること
造血前駆細胞は、当該技術分野で既知の任意の方法によって患者から単離され得る。ＣＤ３４＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて濃縮される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ゲノム編集前に、サイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＦＬＴ３）で、無血清培地（例えば、ＣｅｌｌＧｒｏｗ ＳＣＧＭ培地、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）中で弱く刺激される。
ゲノム編集
ゲノム編集は、概して、好ましくは、正確なまたは事前決定された様式でゲノムのヌクレオチドを修飾するプロセスを指す。本明細書に記載されるゲノム編集の方法の例は、ゲノム中の正確な標的位置でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断するための部位特異的ヌクレアーゼを使用し、それによってゲノム内の特定の位置で二本鎖または一本鎖ＤＮＡ切断を作成する方法を含む。そのような切断は、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１（２），１２１−３１（２０１５）において最近概説されているように、相同配向型修復（ＨＤＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等の天然の内因性細胞プロセスであり得、定期的にそれらによって修復される。ＮＨＥＪは、時には、ヌクレオチド配列の欠失または付加によって、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端に直接結合し、遺伝子発現を崩壊または増強することができる。ＨＤＲは、切断点で、定義されたＤＮＡ配列を挿入するための鋳型として、相同配列、またはドナー配列を使用する。相同配列は、姉妹染色分体等の内因性ゲノム中に存在し得る。あるいは、ドナーは、ヌクレアーゼで切断された遺伝子座を含む高度な相同性の領域を有するが、切断された標的遺伝子座に組み込まれ得る欠失を含む、さらなる配列または配列変化も含み得る、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス等の外因性核酸であり得る。第３の修復機構は、マイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ）であり、「代替ＮＨＥＪ」とも称され、小欠失及び挿入が切断部位で生じ得るという点において、遺伝的な結果は、ＮＨＥＪと類似している。ＭＭＥＪは、より好ましいＤＮＡ末端結合修復結果を後押しするようにＤＮＡ切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を使用し、最近の報告は、このプロセスの分子機構をさらに解明している；例えば、Ｃｈｏ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ５１８，１７４−７６（２０１５）、Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｄｖ．Ｏｎｌｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２９６１（２０１５）、Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１８，２５４−５７（２０１５）、Ｃｅｃｃａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２８，２５８−６２（２０１５）を参照のこと。場合によっては、ＤＮＡ切断の部位で潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、修復結果を予測することは恐らく可能であり得る。
これらのゲノム編集機構の各々は、所望のゲノム改変を作成するために使用することができる。ゲノム編集プロセスにおけるステップは、意図された変異の部位に可能な限り近く、標的遺伝子座において、後者は、二本鎖切断として、または２つの一本鎖切断として、１つまたは２つのＤＮＡ切断を作成することである。これは、本明細書に記載され、例示されるように、部位特異的ポリペプチドの使用によって達成され得る。
ＤＮＡエンドヌクレアーゼ等の部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ中に二本鎖切断または一本鎖切断を導入し得る。二本鎖切断は、細胞の内因性のＤＮＡ修復経路（例えば、相同依存性修復または非相同末端結合または代替の非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介性末端結合）を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同な鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復し得る。これは、時には、切断の部位で標的核酸中の小欠失または挿入（インデル）をもたらし得、遺伝子発現の崩壊または改変につながり得る。ＨＤＲは、相同修復鋳型またはドナーが利用可能である場合に生じ得る。相同ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に対して相同である配列を含む。姉妹染色分体は、概して、修復鋳型として細胞によって使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的のために、修復鋳型は、しばしば、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸等の外因性核酸として供給される。外因性ドナー鋳型を用いて、ホモロジーの隣接領域間にさらなる核酸配列（トランス遺伝子等）または修飾（単一または複数の塩基変化または欠失）を導入することは一般的であり、そのため、追加のまたは改変された核酸配列もまた、標的遺伝子座に組み込まれる。ＭＭＥＪは、小欠失及び挿入が切断部位で生じ得るという点において、ＮＨＥＪと類似している、遺伝的な結果をもたらす。ＭＭＥＪは、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を後押しするように切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を使用する。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域で潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、修復結果を予測することは恐らく可能であり得る。
それ故に、場合によっては、相同組み合わせは、標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列を挿入するために使用される。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書において、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーまたはドナー配列またはポリヌクレオチドドナー鋳型）と称される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的核酸切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位で天然に存在しない配列である。
ＮＨＥＪ及び／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修正は、例えば、変異、欠失、改変、組み込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ化、トランス遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破損、転座、及び／または遺伝子変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡを削除し、非天然核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の例である。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスタ化規則的スペース間短パリンドローム反復）ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌及び古細菌）のゲノムにおいて見出され得る。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ウイルス及びファージ等の外来侵入物に対して原核生物が防御するのに役立つ免疫系の種類として機能する生成物をコードする。遺伝子座への新たな配列の組み込み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の生物発生、及び外来侵入物である核酸のサイレンシングの３つの段階のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座機能が存在する。５種類のＣＲＩＳＰＲ系（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、及びＶ型）が、特定されている。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、「反復」と称される多くの短い反復配列を含む。反復は、ヘアピン構造を形成することができ、及び／または非構造化一本鎖配列を含むことができる。反復は、通常、クラスタ中に生じ、種の間で高頻度に分岐する。反復は、「スペーサー」と称される固有の介在性配列で規則的に空間を空けられており、それによって反復−スペーサー−反復遺伝子座の構造が生じる。スペーサーは、既知の外来の侵入物配列と同一であるか、または高い相同性を有する。スペーサー−反復単位は、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードし、スペーサー−反復単位の成熟型に処理される。ｃｒＲＮＡは、標的核酸を標的とすることを含む「シード」またはスペーサー配列を含む（原核生物中の天然に存在する形態で、スペーサー配列は、外来侵入物である核酸を標的とする）。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列も含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物において、ｃｒＲＮＡ機能の生物発生及び干渉段階に関与する。いくつかのＣａｓ遺伝子は、相同な二次及び／または三次的構造を含む。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中のｃｒＲＮＡの生物発生は、実際は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性のＲＮａｓｅＩＩＩによって修飾され、次いで、プレ−ｃｒＲＮＡアレイ中のｃｒＲＮＡ反復に対してハイブリダイズする。内因性のＲＮａｓｅＩＩＩは、プレ−ｃｒＲＮＡを切断するために補充される。切断されたｃｒＲＮＡは、エクソリボヌクレアーゼトリミングに供されて、成熟ｃｒＲＮＡ形態（例えば、５’トリミング）を生じる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズされたまま残存し、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、複合体を、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズすることができる標的核酸に誘導する。標的核酸に対するｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーションは、標的核酸切断に関してＣａｓ９を活性化する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中の標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される。実際には、ＰＡＭは、標的核酸に対する部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の結合を容易にするために必須である。ＩＩ型システム（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも称される）は、ＩＩ型−Ａ（ＣＡＳＳ４）及びＩＩ型−Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）にさらに小分割される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ＲＮＡ−プログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号は、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの多数の例及び用途を提供する。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステム
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型システムとはいくつかの重要な差異を有する。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型システムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠いている、単一のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。実際に、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、さらなるトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることなく、成熟ｃｒＲＮＡＳに処理される。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、４２〜４４ヌクレオチド長の短い成熟ｃｒＲＮＡに処理され、それぞれ、成熟ｃｒＲＮＡは、直接反復の１９ヌクレオチドで始まり、続いて、スペーサー配列の２３〜２５ヌクレオチドが続く。対照的に、ＩＩ型システム中の成熟ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列の２０〜２４ヌクレオチドで始まり、続いて、直接反復の約２２ヌクレオチドが続く。また、Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体が短いＴリッチなＰＡＭが先行する標的ＤＮＡを有効に切断し、ＧリッチなＰＡＭとは対照的に、ＩＩ型システムに対する標的ＤＮＡが続くように、Ｔリッチなプロトスペーサー−隣接モチーフを利用する。それ故に、Ｖ型システムは、ＰＡＭから離れている点で切断し、一方、ＩＩ型システムは、ＰＡＭに隣接する点で切断する。加えて、ＩＩ型システムとは対照的に、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する交互のＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。ＩＩ型システムは、鈍的二本鎖破断を介して切断する。ＩＩ型システムと同様に、Ｃｐｆ１は、予測されたＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠いており、このことは、ＩＩ型システムとは対照的である。
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチド及びプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２：２５７７−２５９０（２０１４）の図１中のＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されたため、広範な書換を行った。Ｆｏｎｆａｒａの図５（上記を参照）は、様々な種からＣａｓ９ポリペプチドに対するＰＡＭ配列を提供する。
部位特異的ポリペプチド
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するためにゲノム編集で使用される部位特異的ポリペプチドである。部位特異的は、１つ以上のポリペプチド、またはポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡのいずれかとして、細胞または患者に投与され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの文脈において、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合することができ、次いで、ポリペプチドが配向される標的ＤＮＡ中の部位を特定する。本明細書においてＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ等のエンドヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含む。２つ以上の核酸切断ドメインは、リンカーを介して一緒に連結され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、可撓性リンカーを含む。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上のアミノ酸長を含み得る。
天然に存在する野生型Ｃａｓ９酵素は、２つのヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨヌクレアーゼドメイン、及びＲｕｖＣドメイン）を含む。本明細書において、「Ｃａｓ９」は、天然に存在するＣａｓ９及び組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で企図されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、及び／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様フォールディングを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行のβ−鎖及びα−らせんを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価陽イオン結合部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の相補的な鎖）を切断し得る。
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮａｓｅＨまたはＲＮａｓｅＨ様フォールディングを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方に作用することを含む核酸ベースの機能の多様なセットに関与する。ＲＮａｓｅＨドメインは、複数のα−らせんによって囲まれる５つのβ−鎖を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価陽イオン結合部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補的な鎖）を切断し得る。
部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ中に二本鎖切断または一本鎖切断を導入し得る。二本鎖切断は、細胞の内因性のＤＮＡ修復経路（例えば、相同依存性修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または代替の非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介性末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同な鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復し得る。これは、時には、切断の部位で標的核酸中の小欠失または挿入（インデル）をもたらし得、遺伝子発現の崩壊または改変につながり得る。ＨＤＲは、相同修復鋳型またはドナーが利用可能である場合に生じ得る。相同ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に対して相同である配列を含む。姉妹染色分体は、概して、修復鋳型として細胞によって使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的のために、修復鋳型は、しばしば、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸等の外因性核酸として供給される。外因性ドナー鋳型を用いて、ホモロジーの隣接領域間にさらなる核酸配列（トランス遺伝子等）または修飾（単一または複数の塩基変化または欠失）を導入することは一般的であり、そのため、追加のまたは改変された核酸配列もまた、標的遺伝子座に組み込まれる。ＭＭＥＪは、小欠失及び挿入が切断部位で生じ得るという点において、ＮＨＥＪと類似している、遺伝的な結果をもたらす。ＭＭＥＪは、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を後押しするように切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を使用する。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域で潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づいて、修復結果を予測することは恐らく可能であり得る。
それ故に、場合によっては、相同組み合わせは、標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列を挿入するために使用される。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書において、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーまたはドナー配列）と称される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的核酸切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位で天然に存在しない配列である。
ＮＨＥＪ及び／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修正は、例えば、変異、欠失、改変、組み込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ化、トランス遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破損、転座、及び／または遺伝子変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡを削除し、非天然核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の例である。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的部位特異的ポリペプチド［例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、ＵＳ２０１４／００６８７９７の配列番号８、またはＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３９（２１）：９２７５−９２８２（２０１１）］、及び様々な他の部位特異的ポリペプチド）に対して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、上記を参照）のヌクレアーゼドメインに対して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、１０の連続するアミノ酸において、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、上記を参照）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、１０の連続するアミノ酸において、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、上記を参照）に対して多くても７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０の連続するアミノ酸において、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、上記を参照）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン中の１０の連続するアミノ酸において、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、上記を参照）に対して多くても７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０の連続するアミノ酸において、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、上記を参照）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン中の１０の連続するアミノ酸において、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、上記を参照）に対して多くても７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態を含む。野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減する変異を含む。いくつかの実施形態では、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、上記を参照）の核酸切断活性を９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満有する。部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、実質的な核酸切断活性を有し得ない。部位特異的ポリペプチドが実質的な核酸切断活性を有しない修飾形態である場合、それは、本明細書で「酵素的に不活性である」と称される。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、変異を含み、そのため、それは、標的核酸上の一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導し得る（例えば、二本鎖標的核酸の糖−リン酸塩骨格のうちの１つのみを切断することによって）。いくつかの実施形態では、変異は、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、上記を参照）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の核酸切断活性をもたらす。いくつかの実施形態では、変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらす。いくつかの実施形態では、変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の相補鎖を切断する能力を低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらす。例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、及びＡｓｎ８５６等の野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドの残基は、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つ以上を不活性化するために変異される。いくつかの実施形態では、変異される残基は、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド中の残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、及びＡｓｎ８５６に対応する（例えば、配列及び／または構造的アラインメントによって決定される）。変異の非限定的な例は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａを含む。当業者は、アラニン置換以外の変異が適切であることを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、Ｄ１０Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせられて、実質的にＤＮＡ切断活性を欠失している部位特異的ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、Ｈ８４０Ａ変異は、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせられて、実質的にＤＮＡ切断活性を欠失している部位特異的ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、Ｎ８５４Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせられて、実質的にＤＮＡ切断活性を欠失している部位特異的ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、Ｎ８５６Ａ変異は、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１つ以上と組み合わせられて、実質的にＤＮＡ切断活性を欠失している部位特異的ポリペプチドを生成する。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と称される。
ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼのニッカーゼ変異体、例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム編集の特異性を増加させるために使用することができる。野生型Ｃａｓ９は、典型的には、標的配列（内因性ゲノム遺伝子座等）内の特定された約２０ヌクレオチド配列でハイブリダイズするように設計される単一のガイドＲＮＡによって誘導される。しかしながら、いくつかのミスマッチは、ガイドＲＮＡと標的遺伝子座との間に許容され得、標的部位における必要とされるホモロジーの長さを効果的に低減することと、例えば、１３ｎｔのホモロジーとして、それによってオフターゲット切断としても既知である、標的ゲノム内で他の場所にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合及び二本鎖核酸切断の高い潜在性をもたらす。Ｃａｓ９のニッカーゼ変異型は、それぞれ、二本鎖切断を作製するために、１つの鎖のみを切断するため、標的核酸に近接近して、その反対の鎖上で結合し、それにより、二本鎖切断と同等である一対のニックを作製することが、一対のニッカーゼに必要である。これには、２つの別々のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼに対して１つ）が、標的核酸に近接近して、その反対の鎖上で結合すべきであることが必要である。この必要条件は、本質的に、生じるために二本鎖切断に対して必要とされる最小長さの相同性を２倍にし、それによって、二本鎖切断事象がゲノム中の他の場所で生じるであろう可能性を軽減し、２つのガイドＲＮＡ部位は、存在する場合、二本鎖切断が形成することを可能にするために互いに十分近い可能性は低い。当該技術分野で記載されるように、ニッカーゼはまた、ＮＨＥＪに対してＨＤＲを促進するために使用することもできる。ＨＤＲは、所望の変化を効果的に媒介する特定のドナー配列の使用を通してゲノム中の標的部位への選択された変化を導入するために使用することができる。ゲノム編集で用いられる様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの説明は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号、及びＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，３４７−３５５（２０１４）、及びそこに言及される参照文献に見出され得る。
企図される変異は、置換、付加、及び欠失、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、変異は、変異アミノ酸をアラニンに変換する。いくつかの実施形態では、変異は、変異アミノ酸を、別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニン）に変換する。いくつかの実施形態では、変異は、変異アミノ酸を、非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換する。いくつかの実施形態では、変異は、変異アミノ酸を、アミノ酸模倣体（例えば、リン酸模倣体）に変換する。いくつかの実施形態では、変異は、保存的変異である。例えば、変異は、変異アミノ酸を、変異アミノ酸のサイズ、形状、変化、極性、構造、及び／または回転異性体と似ているアミノ酸に変換することができる（例えば、システイン／セリン変異、リジン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。いくつかの実施形態では、変異は、リーディングフレームのシフト及び／または未成熟停止コドンの生成をもたらす。いくつかの実施形態では、変異は、１つ以上の遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子または遺伝子座の調節領域への変化をもたらす。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異、変異した、酵素的に不活性な及び／または条件付きで酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、核酸を標的にする。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異、変異した、酵素的に不活性な及び／または条件付きで酵素的に不活性なエンドニボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡを標的にする。いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異、変異した、酵素的に不活性な及び／または条件付きで酵素的に不活性なエンドニボヌクレアーゼ）は、ＤＮＡを標的にする。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上の非天然配列を含む（例えば、部位特異的ポリペプチドは、融合タンパク質である）。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、バクテリウム（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、及び２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、バクテリウム（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、バクテリウム（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメインを含み、核酸切断ドメインのうちの１つまたはその両方が、バクテリウム（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９からのヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、バクテリウム（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）、及び非天然配列（例えば、核局在シグナル）、または非天然配列に対して部位特異的ポリペプチドを連結するリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、バクテリウム（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み、部位特異的ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％まで低下する核酸切断ドメインのうちの１つまたはその両方に突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドは、バクテリウム（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み、ヌクレアーゼドメインのうちの１つは、アスパラギン酸１０の変異を含み、及び／またはヌクレアーゼドメインのうちの１つは、ヒスチジン８４０の変異を含み、変異は、ヌクレアーゼドメイン（複数可）の切断活性を少なくとも５０％まで低下する。
本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム中の特定の遺伝子座において１つの二本鎖切断をともに影響を及ぼす２つのニッカーゼ、またはゲノム中の特定の遺伝子座において２つの二本鎖切断をともに影響を及ぼす４つのニッカーゼを含む。あるいは、１つの部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム中の特定の遺伝子座において１つの二本鎖切断に影響を及ぼす。
ゲノム標的核酸
本開示は、標的核酸内の特定の標的配列に対して、関連したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を指向し得るゲノム標的核酸を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的核酸は、ＲＮＡである。ゲノム標的ＲＮＡは、本明細書において「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、対象となる標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列、及びＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。両方のシステムでは、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドを結合し、そのため、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。ゲノム標的核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその関連のおかげで標的特異性を提供する。したがって、ゲノム標的核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を指向する。
例示的なガイドＲＮＡは、それらの標的配列のゲノム位置及び関連したＣａｓ９切断部位で示される配列番号１〜１８８０７中にスペーサー配列を含み、ゲノム位置は、ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ヒトゲノムアセンビリに基づいている。当業者によって理解されるように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に対して相補的であるスペーサー配列を含むように設計される。例えば、配列番号１〜１８８０７中のスペーサー配列の各々は、単一ＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡ（対応するｔｒａｃｒＲＮＡとともに）に入れることができる。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２−６０７（２０１１）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ゲノム標的核酸は、二重分子のガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的核酸は、単一分子ガイドＲＮＡである。
二重分子のガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２つの鎖を含む。第１の鎖は、５’から３’方向に、任意にスペーサー伸長配列、スペーサー配列、及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して相補的である）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意にｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含む。
ＩＩ型システム中の単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’方向に、任意にスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子のガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含む。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部は、ガイドＲＮＡに対するさらなる機能性（例えば、安定性）に寄与する要素を含んでもよい。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結させて、ヘアピン構造を形成する。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部は、１つ以上のヘアピンを含む。
Ｖ型システム中の単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、及びスペーサー配列を含む。
例示のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム中に使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さいＲＮＡは、以下に例示され、当該技術分野で記載されるように、化学的手段によって容易に合成され得る。化学合成手順は、継続的に拡大しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥ等のゲルの使用を避ける）等の手順によるこのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長がほぼ１００のヌクレオチドを超えて著しく増加するため、さらに困難である傾向がある。より大きい長さのＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、一緒にライゲーションされる２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするもの等のはるかに長いＲＮＡは、酵素的にさらに容易に生成される。様々な種類のＲＮＡ修飾、例えば、当該技術分野で記載されるように、安定性を増強する、先天性免疫応答の可能性または程度を低減する、及び／または他の特質を増強する、修飾は、ＲＮＡの化学合成及び／または酵素生成中またはその後に導入され得る。
スペーサー伸長配列
ゲノム標的核酸のいくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、安定性を提供し、かつ／またはゲノム標的核酸の修飾のための位置を提供することができる。スペーサー伸長配列は、オンまたはオフターゲット活性または特異性を修正することができる。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列が、提供される。スペーサー伸長配列は、１より多い、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７０００もしくはそれ以上の長さを有し得る。スペーサー伸長配列は、１より少ない、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７０００もしくはそれ以上の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、１０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含む。いくつかの実施形態では、部分は、核酸標的核酸の安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、部分は、転写終止セグメント（すなわち、転写終止配列）である。いくつかの実施形態では、部分は、真核生物細胞中で機能する。いくつかの実施形態では、部分は、原核生物細胞中で機能する。いくつかの実施形態では、部分は、真核生物細胞及び原核生物細胞の両方の中で機能する。好適な部分の非限定的な例は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７ Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体によって調節された安定性及び／または調節された接近性を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラスト等）に標的とする配列、トラッキングを提供する修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子に対する直接のコンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分に対するコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列、等）、及び／またはタンパク質（例えば、転写活性化因子、転写レプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ等を含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に結合部位を提供する修飾もしくは配列を含む。
スペーサー配列
スペーサー配列は、対象となる標的核酸中の配列にハイブリダイズする。ゲノム標的核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して標的核酸と、配列特異的な方式で相互作用する。したがって、スペーサーのヌクレオチド配列は、対象となる標的核酸の配列に応じて異なる。
本明細書においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、システムにおいて使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’側に位置する標的核酸に対してハイブリダイズするように設計される。スペーサーは、標的配列を完全に一致し得るか、またはミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡ中で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、標的核酸中で、配列５’−ＮＲＧ−３’を含むＰＡＭを認識し、式中、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によって標的とされる標的核酸配列のすぐ３’側である。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０超のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、多くても５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基を含む。例えば、
Figure 0006947729
（配列番号１８８０８）を含む配列では、標的核酸は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＮに対応する配列を含み、下線を引いたＮＲＧ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＰＡＭである。
いくつかの実施形態では、標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６のヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有する。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔであり得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１９ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、多くても約３０％、多くても約４０％、多くても約５０％、多くても約６０％、多くても約６５％、多くても約７０％、多くても約７５％、多くても約８０％、多くても約８５％、多くても約９０％、多くても約９５％、多くても約９７％、多くても約９８％、多くても約９９％、または１００％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、標的核酸の相補性鎖の標的配列の６つの連続する最も５’側のヌクレオチドにおいて１００％である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、約２０の連続するヌクレオチドを少なくとも６０％上回る。スペーサー配列及び標的核酸の長さは、１〜６ヌクレオチドによって異なり得、バルジ（複数可）であると考えられ得る。
いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、コンピュータプログラムを用いて設計または選択される。コンピュータプログラムは、予測融点、二次構造形成、及び予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテクスト、クロマチン接近性、ＧＣ％、ゲノム出現（例えば、同一であるかまたは同様であるが、ミスマッチ、挿入、または欠失の結果として１つ以上のスポットにおいて異なる配列）の頻度、メチル化状況、ＳＮＰの存在等のような変数を用い得る。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、参照ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列である。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、細胞中の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチドを含む。最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、二重鎖、すなわち、塩基対の二本鎖構造を形成する。まとめると、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに結合する。少なくとも最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、少なくとも最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、多くても約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含む。
最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、およそ１２ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６つ、７つ、または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、少なくとも６つ、７つ、または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列である。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞中の最小ＣＲＩＳＰＲ配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含む。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、二重鎖、すなわち塩基対の二本鎖構造を形成する。まとめると、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、部位特異的ポリペプチドに結合する。少なくとも最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の一部は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含む。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さであり得る。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｊｉｎｅｋら（上記を参照）に記載される、２３〜４８ｎｔのｔｒａｃｒＲＮＡからなる。
いくつかの実施形態では、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６つ、７つ、または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６つ、７つ、または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一である。
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、二重らせんを含む。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれ以上のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、二重鎖は、ミスマッチを含む（すなわち、二重鎖の２つの鎖は、１００％相補的ではない）。いくつかの実施形態では、二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、または５もしくはミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖は、多くても約１、２、３、４、または５もしくはミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖は、２つ以下のミスマッチを含む。
バルジ
いくつかの実施形態では、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖中に「バルジ」がある。バルジは、二重鎖内のヌクレオチドの不対の領域である。いくつかの実施形態では、バルジは、部位特異的ポリペプチドへの二重鎖の結合に寄与する。バルジは、二重鎖の片側に、不対の５’−ＸＸＸＹ−３’を含み、式中、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、反対の鎖の上のヌクレオチドと不安定な対を形成し得るヌクレオチド、及び二重鎖の他の側の上の不対のヌクレオチド領域を含む。二重鎖の２つの側上に不対のヌクレオチドの数は、異なり得る。
一例では、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上に不対のプリン（例えば、アデニン）を含む。いくつかの実施形態では、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の不対の５’−ＡＡＧＹ−３’を含み、式中、Ｙは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復鎖上のヌクレオチドと不安定な対を形成し得るヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側上のバルジは、少なくとも１、２、３、４、または５もしくはそれ以上の不対のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側上のバルジは、多くても１、２、３、４、または５もしくはそれ以上の不対のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲ反復側上のバルジは、１つの不対のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側上のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれ以上の不対のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側上のバルジは、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれ以上の不対のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖の第２の側（例えば、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）の上のバルジは、４つの不対のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つの不安定な対合を含む。いくつかの実施形態では、バルジは、多くても１つの不安定な対合を含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含む。
ヘアピン
様々な実施形態では、１つ以上のヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡの３’側に位置する。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の二重鎖中の最後の対のヌクレオチドの少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０もしくはそれ以上のヌクレオチド３’で開始する。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の二重鎖中の最後の対のヌクレオチドの多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれ以上のヌクレオチド３’で開始し得る。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０もしくはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続したシトシンヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピンは、二重鎖のヌクレオチド（例えば、一緒にハイブリダイズした、ヘアピンのヌクレオチド）を含む。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖中のＧＧジヌクレオチドにハイブリダイズするＣＣジヌクレオチドを含む。
ヘアピンのうちの１つ以上は、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と相互作用し得る。
いくつかの実施形態では、２つ以上のヘアピンが存在し、いくつかの実施形態では、３つ以上のヘアピンが存在する。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６つ、７つ、または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して少なくとも約６０％同一である。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６つ、７つ、または８つの連続するヌクレオチドのストレッチにおいて、参照の３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一である。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つを超える二重鎖の領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズした領域）を含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖の領域を含む。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ中のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０もしくはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ中のステムループ構造は、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、機能的な部分を含む。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質−相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、及びエクソンを含み得る。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、５またはそれ以上の機能的な部分を含む。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、多くても約１、２、３、４、５またはそれ以上の機能的な部分を含む。
いくつかの実施形態では、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のヘアピンは、Ｐ−ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｐ−ドメインは、ヘアピン中に二本鎖の領域を含む。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡが単一分子ガイドまたは二重分子ガイドという状況であるかどうかが提供され得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００、を超えるヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０〜約５０００またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００を超えるヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００もしくはそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド長未満を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能的な部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含む。いくつかの実施形態では、機能的な部分は、転写終止セグメント（すなわち、転写終止配列）を含む。いくつかの実施形態では、機能的な部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの総長を有する。いくつかの実施形態では、機能的な部分は、真核生物細胞中で機能する。いくつかの実施形態では、機能的な部分は、原核細胞細胞中で機能する。いくつかの実施形態では、機能的な部分は、真核生物細胞及び原核生物細胞の両方の中で機能する。
好適なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長機能的な部分の非限定的な例には、３’ポリ−アデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体により調節された安定性及び／もしくは調節された接近性を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラスト等）に標的とする配列、トラッキング（蛍光分子に対する直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列等）を提供する修正もしくは配列、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写レプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ等を含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に関する結合部位を提供する修飾もしくは配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合部位、または分子指標（例えば、バーコード配列）を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１つ以上の親和性タグを含む。
単一分子ガイドリンカー配列
いくつかの実施形態では、単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有する。Ｊｉｎｅｋら（上記を参照）では、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）の単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）を、使用した。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、単一分子のガイド核酸のリンカーは、４〜４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００もしくはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは、多くても約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００もしくはそれ以上のヌクレオチドである。
リンカーは、様々な配列のうちのいずれかを含み得るが、好ましくはリンカーがガイドＲＮＡの他の部分との相同性の広範な領域を有する配列を含まず、ガイドの他の機能的領域と干渉し得ない分子内結合を引き起こし得る。Ｊｉｎｅｋら（上記を参照）では、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）の単純な４ヌクレオチド配列−ＧＡＡＡ−を、使用したが、より長い配列を含む多くの他の配列を、同様に使用することができる。
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、機能的部分を含む。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質−相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、及びエクソンを含む、１つ以上の特性を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、または５もしくはそれ以上の機能的な部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、多くても約１、２、３、４、または５もしくはそれ以上の機能的な部分を含む。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内の拡大したヘキサヌクレオチド反復の欠失または置換によって、または対応する遺伝子またはセーフハーバー部位の遺伝子座にＣ９ＯＲＦ７２ ｃＤＮＡをノックインすることによって細胞を修正するためのゲノム操作戦略
本発明のエクスビボ方法のステップは、ゲノム操作を用いて、患者特異的ｉＰＳ細胞を編集すること／修正することを含む。あるいは、本発明のエクスビボ方法のステップは、白血球、間葉幹細胞、または造血前駆細胞を編集すること／修正することを含む。同様に、本発明のインビボ方法のステップは、ゲノム操作を用いて、ＡＬＳまたはＦＴＬＤ患者における細胞を編集すること／修正することを含む。同様に、本発明の細胞内方法のステップは、ゲノム操作によって、ヒト細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集すること／修正することを含む。
ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤ患者は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内の拡大したヘキサヌクレオチド反復を示す。したがって、異なる患者は、概して、同様の修正戦略を必要とするであろう。任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、本発明の方法において使用され得、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、それ自体の関連したＰＡＭを有し、疾患特異的であってもなくてもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号１〜６１４８で特定されている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号６１４９〜６８９２で特定されている。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号７７６０〜８０９７で特定されている。Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号８０９８〜８２６１で特定されている。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号６８９３〜７７５９で特定されている。Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを有するＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号８２６２〜１８８０７で特定されている。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲのエクソン１〜２を標的化するためのを標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、それぞれ、実施例７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、及び９１で特定されている。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲのエクソン１〜２を標的化するためのを標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、それぞれ、実施例８、１４、２０、２６、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、及び８６で特定されている。例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲのエクソン１〜２を標的化するためのを標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、それぞれ、実施例９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、及び８７で特定されている。例えば、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲのエクソン１〜２を標的化するためのを標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、それぞれ、実施例１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、及び８８で特定されている。例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲのエクソン１〜２を標的化するためのを標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、それぞれ、実施例１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、及び８９で特定されている。例えば、Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａからのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを有するＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲのエクソン１〜２を標的化するためのを標的化するためのｇＲＮＡスペーサー配列は、それぞれ、実施例１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、及び９０で特定されている。
例えば、変異は、不明確なＮＨＥＪ修復経路が原因で起こる挿入または欠失によって修正され得る。患者のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子が、挿入または欠失した塩基を有する場合、標的切断は、フレームを復元するＮＨＥＪ媒介性挿入または欠失をもたらし得る。ミスセンス変異はまた、１つ以上のガイドＲＮＡを用いてＮＨＥＪ媒介性修正を通して修正され得る。変異を修正する切断（複数可）の能力または可能性は、局所的配列及びマイクロホモロジーに基づいて設計または評価され得る。ＮＨＥＪはまた、いくつかの位置を標的化する１つのｇＲＮＡ、またはいくつかのｇＲＮＡによる切断を通してスプライスドナーまたはアクセプター部位を、直接または変化させることによって、遺伝子のセグメントを欠失するために使用することもできる。これは、アミノ酸、ドメイン、またはエクソンが変異を含み、除去または挿入され得る場合か、またはそうでなければタンパク質への機能を復元する場合に有用であり得る。ガイド鎖の対は、欠失または反転の修正のために使用されている。
あるいは、ＨＤＲによる修正のためのドナーは、アニーリングを可能にするために、小さいまたは大きい隣接相同アームを有する修正された配列を含む。ＨＤＲは、本質的には、ＤＳＢ修復中の鋳型として供給された相同ＤＮＡ配列を使用するエラーフリー機構である。相同配向型修復（ＨＤＲ）の速度は、重複または最も近い標的部位を選択することは重要であるため、変異と切断部位との間の距離の関数である。鋳型は、相同領域によって隣接された余分の配列を含むことができるか、またはゲノム配列とは異なる配列を含むことができ、そのため、配列編集を可能にする。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによって変異を修正することに加えて、他の選択肢の範囲が可能である。小さいまたは大きい欠失または複数の変異が存在する場合、影響を受けたエクソンを含有する、ｃＤＮＡが、ノックインされ得る。完全長ｃＤＮＡは、任意の「セーフハーバー」にノックインされ得るが、供給されたまたは他のプロモーターを使用しなければならない。この構築体が、正しい場所にノックインされる場合、それは、正常遺伝子と同様に、生理学的制御を有するであろう。ヌクレアーゼの対は、変異した遺伝子領域を欠失するために使用されることができるが、ドナーは、通常、機能を複製するために提供されなければならないであろう。この場合、２つのｇＲＮＡが供給され得、１つのドナーが配列を決定する。
いくつかのゲノム操作戦略は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の野生型または同様の数のヘキサヌクレオチド反復による、拡大したヘキサヌクレオチド反復の置換、または拡大したヘキサヌクレオチド反復を欠失すること、及びＣ９ＯＲＦ７２ ｃＤＮＡを、相同組換え（ＨＲ）としても既知である相同配向型修復（ＨＤＲ）によって対応する遺伝子の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座にノックインすることを含む。相同配向型修復は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子において拡大したヘキサヌクレオチドを有する患者を治療するためのある戦略である。これらの戦略は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子を復元し、疾患状態を完全に逆転させるであろう。この戦略は、患者の拡大したヘキサヌクレオチド反復の長さに基づいたさらにカスタムアプローチを必要としない可能性が高いであろう。変異を修正するためのドナーヌクレオチドは、小さい（３００ｂｐ未満）。これは、ＨＤＲ効率がドナー分子のサイズに逆相関し得るため、有利である。また、ドナー鋳型が、例えば、非限定的な例として、ドナー鋳型送達の有効な手段であることが示されている、サイズ制限したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）分子を含む、サイズ制限したウイルスベクター分子に適合することができることが予想されている。また、ドナー鋳型が、非限定的な例として、血小板、及び／またはエクソソームまたは他の微小胞胞を含む、他のサイズ制限した分子に適合することができることも予想されている。
相同配向型修復は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞機構である。最も一般的な形態は、相同組換えである。一本鎖アニーリング及び代替のＨＤＲを含む、ＨＤＲのためのさらなる経路が存在する。ゲノム操作ツールは、研究者が、ゲノムに部位特異的修飾を行うために細胞相同組換え経路を操作することができる。細胞が、トランスに提供される合成ドナー分子を用いて二本鎖切断を修復することができることが見出されている。したがって、特異的変異の近傍に二本鎖切断を導入し、好適なドナーを提供することによって、ゲノム中で標的化された変化を行うことができる。特異的切断は、相同ドナーを単独で受容する１０６細胞中の１の速度を上回る１，０００倍よりもＨＤＲの速度を増加させる。特定のヌクレオチドで相同配向型修復（ＨＤＲ）の速度は、重複または最も近い標的部位を選択することは重要であるため、切断部位に対する距離の関数である。遺伝子編集は、原位置の修正が、ゲノムの残りが摂動されないままであるため、遺伝子付加を上回る利点を提供する。
編集のために供給されたドナーは、ＨＤＲによって大きく異なるが、一般に、ゲノムＤＮＡにアニーリングすることができる小さいまたは大きい隣接相同アームを有する目的とする配列を含有する。導入した遺伝子変化に隣接する相同領域は、３０ｂｐ以下であり得るか、またはｃＤＮＡ等のプロモーターを含有し得るマルチキロベースカセットと同じ大きさであり得る。一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチドドナーの両方が使用されている。より長いｓｓＤＮＡがまた、生成及び使用され得るが、これらのオリゴヌクレオチドは、１００ｎｔ未満から多くのｋｂを超えるサイズの範囲である。ＰＣＲ単位複製配列、プラスミド、及びミニサークルを含む、二本鎖ドナーが、しばしば、使用される。全般に、ＡＡＶベクターが、個々のドナーのための包装制限が５ｋｂ未満であるが、ドナー鋳型の送達の非常に効果的な手段であることが見出された。ドナーの活性転写は、プロモーターの封入が変換を増加し得ることを示す、ＨＤＲを３倍増加した。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は、遺伝子発現及びＨＤＲを減少させた。
Ｃａｓ９等の野生型エンドヌクレアーゼに加えて、１つのＤＮＡ鎖のみの切断をもたらす不活性化された１つまたは他のヌクレアーゼドメインを有する、ニッカーゼ変異体が、存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから指向され得るか、標的領域を隣接するニッカーゼの対を使用し得る。ドナーは、一本鎖、ニック、またはｄｓＤＮＡであり得る。
ドナーＤＮＡは、様々な異なる方法によって、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロ注入、またはウイルス形質転換によって、ヌクレアーゼとともにまたは独立して供給され得る。様々な範囲のテザリング選択肢は、ＨＤＲのためのドナーの可能性を増加させることが提案されている。例には、ドナーをヌクレアーゼに連結させること、その近隣に結合するＤＮＡ結合タンパク質に連結させること、またはＤＮＡ末端結合もしくは修復に関与するタンパク質に連結させることが含まれる。
修復経路の選択は、細胞サイクリングに影響を及ぼすもののような多くの培養条件によって、またはＤＮＡ修復及び関連タンパク質の標的化によって誘導され得る。例えば、ＨＤＲを増加させるために、ＫＵ７０、ＫＵ８０、またはＤＮＡリガーゼＩＶ等の主なＮＨＥＪ分子は、抑制され得る。
ドナーが存在することなく、ＤＮＡ切断からの末端または異なる切断からの末端は、ＤＮＡ末端が接合部でほとんどまたは全く塩基対合することなく、接合される、いくつかの非相同修復経路を用いて接合され得る。標準的ＮＨＥＪに加えて、ａｌｔ−ＮＨＥＪ等の同様の修復機構が存在する。２つの切断がある場合、介在するセグメントは、欠失または反転され得る。ＮＨＥＪ修復経路は、接合で挿入、欠失、または変異をもたらし得る。
ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼ切断後にヒト細胞株において定義された遺伝子座に、１５ｋｂの誘導遺伝子発現カセットを挿入するために使用された。Ｍａｒｅｓｃａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｖ．Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｎ．＆ Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２３，５３９−５４６（２０１３）。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路及びＨＲの両方を使用する、部位特異的挿入が、行われている。組み合わせアプローチは、ある特定の状況において適用可能であり、イントロン／エクソン境界を含む可能性が高い。ＮＨＥＪは、イントロン内のライゲーションに対して有効であることが証明され得るが、エラーフリーＨＤＲは、コード領域により良好に適し得る。
前述のように、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の変異は、６つの文字列のヌクレオチドＧＧＧＧＣＣのヘキサヌクレオチド反復拡大である。健常な個人において、典型的には、約３０以下のこのヘキサヌクレオチドの反復がほとんどない。疾患表現型を有する人々において、この反復は、数百程度で生じ得る。１つ以上のヘキサヌクレオチド反復は、遺伝子を、野生型または同様の数のヘキサヌクレオチド反復に復元するために欠失または修正され得る。あるいは、ヘキサヌクレオチド反復の全てが欠失していてもよい。さらなる代替として、Ｃ９ＯＲＦ７２ ｃＤＮＡは、対応する遺伝子の遺伝子座にノックインされ得るか、またはＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座等のセーフハーバー部位にノックインされ得る。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の変異を置き換えるために、または全Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子もしくはｃＤＮＡをノックインするために、ポリヌクレオチドドナー鋳型から新しい配列の組み込みを促進するために使用することができる、１つのｇＲＮＡまたは一対のｇＲＮＡを提供する。
本方法のいくつかの実施形態は、１つ以上のヘキサヌクレオチド反復を置き換えるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型からの新しい配列の挿入を促進する、一方のｇＲＮＡを、１つ以上のヘキサヌクレオチド反復の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡを、１つ以上のヘキサヌクレオチド反復の３’末端で切断する、遺伝子を２回切断することによって欠失するｇＲＮＡ対を提供する。切断は、それぞれ、ゲノム中のＤＳＢを作製する一対のＤＮＡエンドヌクレアーゼによって、またはゲノム中のＤＳＢを一緒に作製する複数のニッカーゼによって達成され得る。
あるいは、本方法のいくつかの実施形態は、１つ以上のヘキサヌクレオチド反復を置き換えるために、ポリヌクレオチドドナー鋳型からの新しい配列の挿入を促進する、１つ以上のヘキサヌクレオチド反復周辺で１つの二本鎖切断を行うために１つのｇＲＮＡを提供する。二本鎖切断は、単一のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、またはゲノム中のＤＳＢを一緒に作製する複数のニッカーゼによって作製され得る。
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内の例示的な修飾には、上に称される変異内もしくはその近傍の、例えば、特異的変異の３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満の上流または下流の領域内の置換が含まれる。Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子における比較的幅広い変動のヘキサヌクレオチド反復を考慮すると、（より大きいならびにより小さい欠失が含まれるが、これらに限定されることなく）上で言及される置換の多くの変動が、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の復元をもたらすことが予想され得ると理解されよう。
このような変異体は、問題になっている特異的変異よりも５’及び／または３’方向でより大きい、またはいずれかの方向でより小さい置換を含む。したがって、特定の置換に対する「近位」によって、所望の置換境界と関連するＤＳＢ遺伝子座（本明細書において終点とも称される）が、記載される参照遺伝子座から約３ｋｂ未満である領域内であり得ることが意図されている。いくつかの実施形態では、ＤＳＢ遺伝子座は、より近位であり、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内である。小さい置換の場合、所望の終点は、参照遺伝子座でまたはそれに「隣接」しており、これによって、終点が、参照遺伝子座から１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、または約１０ｂｐ〜５ｂｐであることが意図されている。
より大きいまたはより小さい置換を含む実施形態は、拡大したヘキサヌクレオチド反復が野生型レベルまで低減される限り、同じ利益を提供することが予想される。それ故に、本明細書で説明及び図示される置換の多くの変形例が、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤを改善するために有効であろうと予測される。
別のゲノム操作戦略は、エクソン欠失を伴う。特定のエクソンの標的欠失は、単一の治療カクテルを有する、大きなサブセットの患者を治療するための魅力的な戦略である。欠失は、単一のヘキサヌクレオチド反復欠失またはマルチ−ヘキサヌクレオチド反復欠失のいずれかであり得る。拡大したヘキサヌクレオチド反復の完全欠失を含む、マルチ−反復欠失は、より大きい欠失のためにより多数の患者に達し得るが、欠失の有効性が、増加したサイズで大幅に減少する。したがって、好ましい欠失は、サイズで４０〜１０，０００の塩基対（ｂｐ）の範囲である。例えば、欠失は、サイズで４０〜１００、１００〜３００、３００〜５００、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜３，０００、３，０００〜５，０００、または５，０００〜１０，０００の塩基対の範囲であり得る。
プレ−ｍＲＮＡが欠失後に適切に処理されることを確実にするために、周囲のスプライシングシグナルを欠失することも重要である。スプライシングドナー及びアクセプターは、概して、隣接するイントロンの１００塩基対内である。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、それぞれ、対象となるエクソン／イントロン接合部に対しておよそ＋／−１００〜３１００ｂｐを切断する、全てのｇＲＮＡを提供する。
ゲノム編集戦略のうちのいずれかのために、ゲノム編集は、配列決定またはＰＣＲ分析によって確認され得る。
標的配列選択
好ましくは、特定の参照遺伝子座と比較して５’境界及び／または３’境界の位置のシフトは、本明細書にさらに記載され、例示されるように、ゲノム編集の特定の用途を促進または増強するために使用され、これは、一部分において、編集のために選択されたエンドヌクレアーゼシステムに応じて異なる。
このような標的配列選択の第１の態様では、多くのエンドヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型またはＶ型エンドヌクレアーゼの場合、ＤＮＡ切断部位に隣接する特定の場所でＰＡＭ配列モチーフの必要条件等の切断のために潜在的な標的部位の初期選択を誘導する規則または基準を有する。
標的配列選択または最適化の別の態様では、標的配列及びゲノム編集エンドヌクレアーゼの特定の組み合わせの「オフターゲット」活性の頻度（すなわち、選択された配列以外の部位で生じるＤＳＢの頻度）は、オンターゲット活性の頻度と比較して評価される。場合によっては、所望の遺伝子座で正しく編集されている細胞は、他の細胞と比較して選択的優位性を有し得る。例示的であるが、非限定的である、選択的優位性の例は、特質、例えば、複製の増強速度、持続性、ある特定の条件への耐性、生着の成功の増強速度、または患者への導入後のインビボでの持続性、及びこのような細胞の維持または数もしくは生存率の増加と関連する、他の特質の習得を含む。別の場合では、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、正しく編集された細胞を特定、分類、またはそうでなければ選択するために使用される１つ以上のスクリーニング方法によって積極的に選択され得る。選択的優位性及び配向性選択方法はともに、修正と関連する表現型を利用し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、意図された細胞集団を選択または精製するために使用される新しい表現型を作製する第２の修飾を作製するために２回以上編集され得る。このような第２の修飾は、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーのために第２のｇＲＮＡを添加することによって作製され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ｃＤＮＡ及び選択可能なマーカーをも含有するＤＮＡ断片を用いて所望の遺伝子座で正しく編集され得る。
任意の選択的優位性が適用可能であるか、または任意の配向された選択が特定の状況で適用されるべきであるかどうか、標的配列選択はまた、適用の有効性を増強する、及び／または所望の標的以外の部位で望ましくない変更の可能性を低減させるために、オフターゲットの考慮により導かれる。本明細書及び当該技術分野においてさらに説明され、例示されるように、オフターゲット活性の発生は、標的部位と様々なオフターゲット部位との間の類似点及び相違点を含む、多くの要因、ならびに使用される特定のエンドヌクレアーゼによって影響される。多くの場合、バイオインフォマティクスツールは、オフターゲット活性の予測を支援するのに利用でき、しばしば、このようなツールはまた、オフターゲット活性の最も可能性の高い部位を特定するために使用することができ、オンターゲット活性に対するオフターゲット活性の相対度数を評価するために実験的設定で評価することができ、それによって、より高い相対的オフターゲット活性を有する配列の選択を可能にする。このような技術の例示的な例は、本明細書に提供され、その他は、当該技術分野で既知である。
標的配列選択の別の態様は、相同的組換え事象に関する。相同性領域を共有する配列が、介在配列の欠失をもたらす相同的組換え事象に対する焦点として機能し得ることが公知である。このような組換え事象は、染色体及び他のＤＮＡ配列の通常の複製の経過中に生じ、普段は、ＤＮＡ配列が合成される場合、例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合、通常の細胞複製サイクル中に生じるが、様々な事象（例えば、紫外線及びＤＮＡ切断の他の誘導物質）の発生またはある特定の事象（例えば、様々な化学誘導物質）の存在によっても増強され得る。多くのこのような誘導物質は、ＤＳＢがゲノム中に無差別に生じさせ、ＤＳＢは、定期的に、正常細胞に誘導され、修復される。修復時、元の配列は、完全な忠実度で再構築され得るが、場合によっては、小さい挿入または欠失（「インデル」と称される）は、ＤＳＢ部位で導入される。
ＤＳＢはまた、特定の位置で特異的に誘導され得、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼ系の場合は、選択された染色***置で配向されたまたは優先的な遺伝子組換え事象を引き起こすために使用することができる。ＤＮＡ修復（及び複製）の文脈において組換えの影響を受けやすい相同配列の傾向は、多くの状況においてうまく生かされ得、ＣＲＩＳＰＲ等の遺伝子編集システムの１つの適用への基盤となり、相同配向型修復が対象となる配列を挿入するために使用されるが、但し、所望の染色***置への「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を通じるものとする。
わずか１０塩基対以下を含み得る「マイクロホモロジー」の小領域であり得る、特定の配列間の相同性領域はまた、所望の欠失をもたらすために使用され得る。例えば、単一のＤＳＢは、近隣配列でマイクロホモロジーを示す部位で導入される。このようなＤＳＢの通常の修復経過中、高頻度で生じる結果は、ＤＳＢ及び同時細胞修復プロセスによって促進される組換えの結果として介在配列の欠失である。
しかしながら、いくつかの状況では、相同性領域内の標的配列を選択することはまた、遺伝子融合（欠失がコード領域内である場合）を含む、さらに大きい欠失をもたらすこともでき、特定の状況を考えると、所望であっても所望でなくてもよい。
本明細書に提供される例は、野生型または同様のレベルのヘキサヌクレオチド反復の復元をもたらす置換を誘導するように設計されるＤＳＢの作製のための様々な標的領域の選択、ならびにオンターゲット事象と比較してオフターゲット事象を最小限に抑えるように設計されるような領域内に特定の標的配列の選択をさらに例証する。
核酸修飾
いくつかの実施形態では、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、本明細書にさらに記載され、当該技術分野で既知であるように、例えば、活性、安定性、もしくは特異性を増強し、送達を変化させ、宿主細胞における先天性免疫応答を低減させるために、または他の増強のために使用することができる、１つ以上の修飾を含む。
ある特定の実施形態では、修飾ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用され、この場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドもしくは二分子ガイドのいずれか）及び／または細胞に導入されるＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、以下に記載され、例示されるように、修飾され得る。このような修飾ポリヌクレオチドは、任意の１つ以上のゲノム遺伝子座を編集するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムで使用することができる。
このような使用の非限定的な例示の目的のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを用いて、ガイドＲＮＡの修飾は、単一分子ガイドまたは二分子、及びＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る、ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を増強するために使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、ゲノム中の標的配列とのゲノム編集複合体間の相互作用の開始、安定性、または動力学を増強するために使用することができ、これは、例えば、オンターゲット活性を増強するために使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、特異性、例えば、他の（オフターゲット）部位における効果と比較して、オンターゲット部位におけるゲノム編集の相対速度を増強するために使用することができる。
修飾はまた、または代替的に、例えば、細胞中に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対するその耐性を増加させ、それによって、増加させた細胞中のその半減期を引き起こすことによって、ガイドＲＮＡの安全性を増加させるために使用することができる。ガイドＲＮＡ半減期を増強する修飾は、特に、エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期を増加させることは、ガイドＲＮＡ及びコードしたＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが細胞中で共存する時間を増加させるために使用することができるため、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞に導入される、実施形態で有用であり得る。
修飾はまた、または代替的に、細胞に導入されたＲＮＡは、先天性免疫応答を引き起こす可能性または程度を減少させるために使用することができる。以下に、及び当該技術分野で記載されるように、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈において十分に特徴付けられた、このような応答は、ＲＮＡの半減期の減少及び／またはサイトカインもしくは免疫応答と関連する他の因子の誘導と関連する傾向がある。
１つ以上の種類の修飾はまた、ＲＮＡの安定性を増強させる修飾（例えば、細胞中に存在するＲＮＡｅｓによるその分解を増大させることによって）、得られた生成物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強させる修飾、及び／または細胞に導入されるＲＮＡが先天性免疫応答を誘導する可能性または程度を減少させる修飾が含まれるが、これらに限定されない、細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに行われ得る。
前述及びその他のような修飾の組み合わせは、同様に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、例えば、１つ以上の種類の修飾は、ガイドＲＮＡ（上記に例示されるものを含む）を行われ得るか、及び／または１つ以上の種類の修飾は、ＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上記に例示されるものを含む）を行われ得る。
例示のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システム中に使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さいＲＮＡは、以下に例示され、当該技術分野で記載されるように、化学的手段によって容易に合成され得、多くの修飾が容易に組み込まれることを可能にする。化学合成手順は、継続的に拡大しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥ等のゲルの使用を避ける）等の手順によるこのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長がおよそ１００ヌクレオチドを著しく超えて増加するためより困難である傾向がある。より大きい長さの化学修飾されたＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、一緒にライゲーションされる２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするもの等のはるかに長いＲＮＡは、酵素的にさらに容易に生成される。少数の種類の修飾は、概して、酵素的に生成されたＲＮＡで用いるために利用可能であるが、依然として、例えば、以下に、及び当該技術分野でさらに記載されるように、安定性を増強する、先天性免疫応答の可能性または程度を低減する、及び／または他の特質を増強する、修飾があり、新しい種類の修飾は、定期的に開発されている。
様々な種類の修飾、特に、より小さい化学的に合成されたＲＮＡで高い頻度で使用されるものの例示のために、修飾は、糖の２’位で修飾された１つ以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジン、脱塩基残基、またはＲＮＡの３’末端で反転塩基のリボース上の２’−フルオロ、２’−アミノ、または２’Ｏ−メチル修飾を含む。このような修飾は、通常通りにオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して、２’ −デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
いくつかのヌクレオチド修飾及びヌクレオシド修飾は、これらが組み込まれているオリゴヌクレオチドを、天然オリゴデオキシヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に対してより耐性にすることが示されており、これらの修飾オリゴ体（ｏｌｉｇｏ）は、無修飾オリゴヌクレオチドより長い時間にわたって無傷で残存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例としては、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間連結を含むものが含まれる。いくつかのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、及びヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として既知である）、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、及びＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格であり、天然ホスホジエステル骨格は、Ｏ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨ，として表される）；アミド骨格［Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２８：３６６−３７４（１９９５）を参照］；モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置き換えられており、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５４，１４９７を参照）を有するものである。リン含有連結としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’ −アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’ −５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’ −５’連結類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣り合う対が３’ −５’から５’ −３’または２’ −５’から５’ −２’に連結されている逆極性を有するものが挙げられるが、これらに限定されず、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、及び同第５，６２５，０５０号を参照のこと。
モルホリノ系オリゴマー化合物は、Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３−４５１０（２００２）、Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ３，（２００１）、Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９−２１４（２００２）、Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：２１６−２２０（２０００）、Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９５９１−９５９６（２０００）、及び１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号において記載されている。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５−８６０２（２０００）に記載されている。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキル短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結の混合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成部分を有するその他を有するものを含む；米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、及び同第５，６７７，４３９号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
１つ以上の置換糖部分はまた、例えば、２’位で以下のもののうちの１つが含まれ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ ＯＣＨ３、ＯＣＨ３ Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３（式中、ｎは、１〜約１０である）、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリル、またはアラルキル、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基及び同様の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−０−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても既知である）を含む（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）。他の修飾は、２’−メトキシ（２’−０−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ ＣＨ２ＣＨ３）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチル等の糖模倣体も有することができる。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間連結の両方は、すなわち、骨格が、新規の基で置き換えられている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。１つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）に見出され得る。
ガイドＲＮＡはまた、さらにまたは代替的に、核酸塩基（単に「塩基」と当該技術分野で称されることが多い）修飾または置換も含むことができる。本明細書で使用される場合、「未修飾」または「天然」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、５−Ｍｅ−Ｃと当該技術分野で称されることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、及びゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ（ａｍｉｎｏａｌｋｌｙａｍｉｎｏ））アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、及び２，６−ジアミノプリンのような、天然核酸中に稀に、または一過性にのみ見出される核酸塩基が含まれる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５−７７（１９８０）、Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当該技術分野で既知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンも含めることができる。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換の実施形態である。
修飾核酸塩基は、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、及びチミン、５−ウラシル（疑似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン、及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンのような、他の合成及び天然核酸塩基を含む。
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、「Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ’，１９９１，３０、６１３頁に開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅａ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものを含む。ある特定のこれらの核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、及び０−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ，「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，２７６〜２７８頁）、さらにより具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合、塩基置換の実施形態である。修飾された核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、同第５，７５０，６９２号、同第５，７６３，５８８号、同第５，８３０，６５３号、同第６，００５，０９６号、及び米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号において記載されている。
それ故に、「修飾された」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼの両方に組み込まれる、非天然糖、リン酸塩、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチド中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、前述の修飾の１つを超える修飾を、単一オリゴヌクレオチド内に、またはさらにはオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシド内に組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼをコードする、ガイドＲＮＡ及び／またはｍＲＮＡ（もしくはＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する１つ以上の部分またはコンジュゲートに化学的に結合されている。このような部分には、コレステロール部分等の脂質部分［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６（１９８９）］；コール酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３−１０６０（１９９４）］；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６−３０９（１９９２）及びＭａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５−２７７０（１９９３）］；チオコレステロール［Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３−５３８（１９９２）］；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７−３３０（１９９０）及びＳｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９−５４（１９９３）］；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール、またはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）及びＳｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７−３７８３（１９９０）］；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Ｍａｎｃｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９−９７３（１９９５）］；アダマンタン酢酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）］；パルミチル部分［（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９−２３７（１９９５）］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−トキシコレステロール部分［Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３−９３７（１９９６）］が含まれるが、これらに限定されない。米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、及び同第５，６８８，９４１号を参照のこと。
糖及び他の部分は、特定の部位に、カチオン性ポリソーム及びリポソーム等のヌクレオチドを含む、タンパク質及び複合体を標的化するために使用することができる。例えば、肝細胞配向型転移は、アシアロ糖タンパク受容体（ＡＳＧＰＲ）を介して媒介され得る；例えば、Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２１（１０）：１０２５−３０（２０１４）を参照のこと。当該技術分野で既知であり、定期的に開発されている他のシステムは、対象となる特定の標的細胞に、本発明の症例及び／またはそれらの複合体における使用の生体分子を標的とするために、使用することができる。
これらの標的化部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基等の官能基に共有結合的に結合したコンジュゲート基を含むことができる。本発明のコンジュゲート基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基を含む。一般的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が含まれる。本発明の文脈において、薬物動態学的特性を増強する基には、取込みを改善し、分解に対する耐性を増強し、及び／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明の文脈において、薬物動態学的特性を増強する基には、本発明の化合物の取込み、分布、代謝、または排出を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基には、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号及び米国特許第６，２８７，８６０号に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。コンジュゲート基には、コレステロール部分等の脂肪部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン、またはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、同第５，６８８，９４１号を参照のこと。
化学合成にあまり影響を受けず、一般的には酵素合成によって生成される、より長いポリヌクレオチドはまた、様々な手段によって修飾され得る。このような修飾は、例えば、ある特定のヌクレオチド類似体の導入、特定の配列または分子の５’または３’末端で他の部分の組み込み、及び他の修飾を含み得る。例示のために、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、およそ４ｋｂの長さであり、インビトロ転写によって合成され得る。ｍＲＮＡへの修飾は、例えば、その翻訳または安定性を増大させる（例えば、細胞による分解に対してその耐性を増加させることによって）、または外因性ＲＮＡ、特に、Ｃａｓ９をコードするもの等のより長いＲＮＡの導入後に、しばしば細胞中に観察される先天性免疫応答を誘導するためにＲＮＡの傾向を低減するために適用され得る。
多数のこのような修飾は、例えば、ポリＡ尾部、５’キャップ類似体（例えば、反逆方向キャップ類似体（ＡＲＣＡ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾塩基（例えば、偽−ＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−三リン酸塩（５−メチル−ＣＴＰ）またはＮ６−メチル−ＡＴＰ）の使用、または５’末端リン酸塩を除去するためのホスファターゼによる治療のような、当該技術分野で記載されている。これらの及び他の修飾は、当該技術分野で既知であり、ＲＮＡの新しい修飾は、定期的に開発されている。
例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＡｘｏＬａｂｓ，Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ及び多くの他のものを含む、修飾ＲＮＡの多くの商業的供給業者が存在する。ＴｒｉＬｉｎｋによって記載されるように、例えば、５−メチル−ＣＴＰは、ヌクレアーゼ安定性の増大、またはインビトロ転写ＲＮＡによる先天性免疫受容体の相互作用の低減等の所望の特性を与えるために使用することができる。５−メチルシチジン−５’−三リン酸塩（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、ならびに疑似−ＵＴＰ及び２−チオ−ＵＴＰはまた、以下で言及される、Ｋｏｒｍａｎｎら及びＷａｒｒｅｎらによって刊行物中に例示されるように、培養中及びインビボで先天性免疫刺激を低減することも示されているが、翻訳を増強させる。
インビボで送達される化学修飾されたｍＲＮＡが、改善された治療効果を達成するために使用することができることが示されており、例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１５４−１５７（２０１１）を参照のこと。このような修飾は、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増加させ、及び／またはその免疫原性を低減させるために使用することができる。疑似−Ｕ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ、及び５−メチル−Ｃ等の化学修飾を用いて、２−チオ−Ｕ及び５−メチル−Ｃによる、ウリジン及びシチジンのわずか４分の１の置換が、それぞれ、マウスにおけるｍＲＮＡのトール様受容体（ＴＬＲ）の媒介性認識において有意な減少をもたらしたことが見出された。先天性免疫系の活性化を低減することによって、これらの修飾を、インビボでｍＲＮＡの安定性及び寿命を効果的に増加させるために使用することができる；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎらの上記を参照のこと。
先天性抗ウイルス応答を迂回するように設計されている修飾を組み込む合成メッセンジャーＲＮＡは、多能性能に対して分化されたヒト細胞を再プログラミングすることができることも示されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０）を参照のこと。一次再プログラミングタンパク質としての役割を果たすこのような修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラミングする有効な手段であり得る。このような細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称され、５−メチル−ＣＴＰ、疑似−ＵＴＰ、及び反逆方向キャップ類似体（ＡＲＣＡ）を組み込む酵素的に合成されたＲＮＡが、細胞の抗ウイルス応答を効果的に回避するために使用され得ることが見出された；例えば、Ｗａｒｒｅｎらの上記を参照のこと。
当該技術分野に記載されるポリヌクレオチドの他の修飾は、例えば、ポリＡ尾部の使用、５’キャップ類似体（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ）等）の添加、５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の修飾、または５’末端ホスフェートを除去するためにホスファターゼによる治療を含み、新しいアプローチは、定期的に開発されている。
本明細書での使用のための修飾ＲＮＡの生成に適用可能ないくつかの組成物及び技法は、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾に関連して開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉を介して遺伝子サイレンシングにおけるそれらの効果が、概して、一過性であり、反復投与を必要とすることができるため、インビボで特定の課題を示す。さらに、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、しばしば、ウイルス感染の副生成物である、ｄｓＲＮＡを検出及び中和するように発生する免疫応答を有する。したがって、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）等の哺乳動物酵素、及びｄｓＲＮＡへの細胞応答を媒介し得る、潜在的にレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、ならびにこのような分子に応答してサイトカインの誘導を引き起し得るトール様受容体（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８）が存在する；例えば、Ａｎｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）６（４）：４４０−４６８（２０１３）、Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０（３）：５１３−５２４（２０１２）、Ｂｕｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．６（９）：１１３０−４６（２０１１）、Ｊｕｄｇｅ ａｎｄ ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１１１−２４（２００８）による概説、及びそこに言及された参照文献を参照のこと。
多種多様の修飾は、ＲＮＡの安定性を増強する、先天性免疫応答を低減する、及び／または本明細書に記載されるヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入に関連して有用であり得る他の利益を達成するために開発され、適用されている；例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＫＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７−９６（２０１１）、Ｇａｇｌｉｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｒｅ，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１０（７）：５７８−９５（２０１０）、Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１２（２）：１５８−６７（２０１０）、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｕｎｉｔ １６．３（２００９）、Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８（４）：３０５−１９（２００８）、Ｆｕｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２２（３）：２０５−２１０（２０１２）、Ｂｒｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ ３：１５４（２０１２）による概説を参照のこと。
上述のように、修飾ＲＮＡの多くの商業的供給業者が存在し、これらの多くは、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計される修正を特殊化する。様々なアプローチは、文献において報告される様々な所見に基づいて提供される。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋｏｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １１：１２５−１４０（２０１２）によって報告されるように、硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）による非架橋酸素の置換が、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために広範囲に使用されていることに留意する。リボーゼの２’位の修飾は、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善するが、二重鎖の安定性（Ｔｍ）を増加させることが報告されており、これはまた、免疫活性化からの保護を提供することも示されている。中程度のＰＳ骨格修飾と小さい、良好な耐容性を示す２’−置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）との組み合わせは、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８（２００４）によって報告されるように、インビボでの適用のために高度に安定したｓｉＲＮＡと関連しており、２’−Ｏ−メチル修飾は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９：１９１−２０２（２００９）によって報告されるように、安定性を改善するのに有効であることが報告されている。先天性免疫応答の誘導を低減させることに対して、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロを有する特定の配列の修飾は、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８の相互作用を低減させるが、概して、サイレンシング活性を維持することが報告されており、例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４−５０５（２００６）及びＣｅｋａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０−１０８（２００７）を参照のこと。２−チオウラシル、疑似ウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、及びＮ６−メチルアデノシン等のさらなる修飾はまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８によって媒介される免疫効果を最小限に抑えることも示されている；例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５−１７５（２００５）を参照のこと。
また、当該技術分野でも既知であり、商業的に利用可能であるように、いくつかのコンジュゲートは、例えば、コレステロール、トコフェロール、及び葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、及びアプタマーを含む、それらの送達を増強、及び／または細胞による取り込むことができる、本明細書で使用するために、ＲＮＡ等のポリヌクレオチドに適用することができる；例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１−８０９（２０１３）、及びそこに言及される参照文献を参照のこと。
コドン最適化
いくつかの実施形態では、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、対象となる標的ＤＮＡを含有する細胞中の発現のために当該技術分野で標準的な方法に従ってコドン最適化される。例えば、意図された標的核酸がヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドを生成するための使用に企図される。
ゲノム標的核酸及び部位特異的ポリペプチドの複合体
ゲノム標的核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９等の核酸誘導ヌクレアーゼ）と相互作用し、それによって、複合体を形成する。ゲノム標的核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導する。
ＲＮＰ
上述のように、部位特異的ポリペプチド及びゲノム標的核酸は、それぞれ、細胞または患者に別々に投与され得る。一方、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つ以上のｃｒＲＮＡと事前に複合体形成され得る。次いで、事前に複合体形成された材料は、細胞または患者に投与され得る。このような事前に複合体形成された材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として既知である。
核酸コードシステム構成成分
別の態様では、本開示は、本開示のゲノムを標的化する核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク性分子を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示のゲノムを標的化する核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク性分子は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含む。
「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなる核酸セグメントをライゲーションすることができる円形二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、さらなる核酸セグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。ある特定のベクターは、導入された宿主細胞中での自己複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞へ導入して宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主ゲノムとともに複製される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、作動可能に連結される核酸の発現を指向することができる。このようなベクターは、同等機能に役立つ、「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と本明細書で称される。
「作動可能に連結される」という用語は、対象となるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列（複数可）に連結されていることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）において記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞中のヌクレオチド配列の構造的発現を配向するもの、及びある特定の宿主細胞中のヌクレオチド配列のみの発現を配向するもの（例えば、組織特異的配列）を含む。発現ベクターの設計が、標的細胞の選択、所望の発現のレベル等としてこのような因子に応じて異なり得ることが、当業者には理解されよう。
企図される発現ベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルスに基づいたウイルスベクター、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルス等に由来するベクター）に基づいたウイルスベクター、ならびに他の組換えベクターが挙げられるが、これらに限定されない。真核生物標的細胞について企図される他のベクターとしては、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。他のベクターは、それらが宿主細胞に適合する限り、使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の転写及び／または翻訳制御要素を含む。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネータ等を含む、多くの好適な転写及び翻訳制御要素のうちのいずれかは、発現ベクターに使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構の構成成分または他の要素のいずれかを不活性化する自己不活性化ベクターである。
好適な真核生物プロモーター（すなわち、真核生物細胞中で機能的なプロモーター）には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスからの長末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子−１プロモーター（ＥＦ１）からのもの、ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、及びマウスメタロチオネイン−Ｉと融合されるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッド構築体が含まれる。
ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼに関連して使用されるガイドＲＮＡを含む、小ＲＮＡを発現するために、例えば、Ｕ６及びＨ１を含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター等の様々なプロモーターは、有利であり得る。このようなプロモーターの使い方をより向上させるための説明及びパラメーターは、当該技術分野で既知であり、さらなる情報及びアプローチは、定期的に説明されている；例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照のこと。
発現ベクターはまた、翻訳開始及び転写ターミネータのためのリボソーム結合部位も含有し得る。発現ベクターはまた、発現を増幅するために適切な配列を含み得る。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドと融合し、そのため、融合タンパク質をもたらす、非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーター等）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、空間的に限定された及び／または時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）である。
いくつかの実施形態では、本開示のゲノム標的核酸及び／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のための送達ビヒクルの中または表面上にパッケージ化される。企図される送達ビヒクルとしては、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野で説明されるように、様々な標的部分は、所望の細胞型または場所とのこのようなビヒクルの優先的相互作用を増強するために使用することができる。
細胞への本開示の複合体、ポリペプチド、及び核酸の導入は、ウイルスもしくはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェシン、リン酸カルシウム沈澱、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロ注入、ナノ粒子媒介性核酸送達等により起こり得る。
送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）及び／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）は、当該技術分野で既知であるウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクルによって送達され得る。あるいは、エンドヌクレアーゼポリペプチド（複数可）は、電気穿孔法または脂質ナノ粒子等の当該技術分野で既知の非ウイルス送達ビヒクルによって送達され得る。さらなる代替の実施形態では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のポリペプチドと送達され、単独で、または１つ以上のガイドＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つ以上のｃｒＲＮＡと事前に複合体形成され得る。
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボヌクレオタンパク質、正電荷ペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー−ＲＮＡキメラ、及びＲＮＡ融合タンパク質複合体が挙げられるが、これらに限定されない、非ウイルス送達ビヒクルによって送達され得る。いくつかの例示的な非ウイルス送達ビヒクルは、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：１１２７−１１３３（２０１１）（他のポリヌクレオチドの送達にも有用なｓｉＲＮＡのための非ウイルス送達ビヒクルに焦点を当てている）において説明されている。
ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって、細胞または患者に送達され得る。
ＬＮＰとは、１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍの直径を有する任意の粒子を指す。あるいは、ナノ粒子は、１〜１０００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜２５０ｎｍ、２５〜２００ｎｍ、２５〜１００ｎｍ、３５〜７５ｎｍ、または２５〜６０ｎｍのサイズの範囲であり得る。
ＬＮＰは、陽イオン性、陰イオン性、または中性脂質から作製され得る。融合リン脂質ＤＯＰＥまたは膜構成成分コレステロール等の中性脂質は、トランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を増強するための「ヘルパー脂質」としてＬＮＰ中に含まれ得る。陽イオン性脂質の制限には、低い安定性及び迅速なクリアランス、ならびに炎症性または抗炎症応答の生成による低い有効性が含まれる。
ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性脂質及び親水性脂質の両方からなり得る。
当該技術分野で既知である脂質の任意の脂質またはその組み合わせは、ＬＮＰを生成するために使用され得る。ＬＮＰを生成するために使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ−コレステロール、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ−ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ−ＤＯＰＥ−ＤＭＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。陽イオン性脂質の例は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０である。
脂質は、ＬＮＰを生成するために、任意の数のモル比で組み合わされてもよい。加えて、ポリヌクレオチド（複数可）は、ＬＮＰを生成するために、広範囲のモル比で脂質（複数可）と組み合わせてもよい。
上述のように、部位特異的ポリペプチド及びゲノム標的核酸は、それぞれ、細胞または患者に別々に投与され得る。一方、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つ以上のｃｒＲＮＡと事前に複合体形成され得る。次いで、事前に複合体形成された材料は、細胞または患者に投与され得る。このような事前に複合体形成された材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として既知である。
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡとの特異的相互作用を形成することができる。この特性が、多くの生物学的プロセスにおいて利用されているが、核酸リッチな細胞環境における乱雑な相互作用の危険性も伴う。この問題に対する１つの解決策は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成であり、ＲＮＡは、エンドヌクレアーゼと事前に複合体形成される。ＲＮＰの別の利点は、分解からのＲＮＡの保護である。
ＲＮＰ中のエンドヌクレアーゼは、修飾または未修飾であり得る。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、修飾または未修飾であり得る。多くの修飾は、当該技術分野で既知であり、使用され得る。
エンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡは、概して、１：１のモル比で組み合わせられ得る。あるいは、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、概して、１：１：１のモル比で組み合わせられ得る。しかしながら、広範囲のモル比は、ＲＮＰを生成するために使用され得る。
ウイルスベクターは、アデノウイルス、ＨＰＶ、ＨＳＶ、レンチウイルス、または他のウイルスベクター等の送達のために使用され得る。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、送達のために使用され得る。ｒＡＡＶ粒子を生成するための技術、ｒｅｐ及びキャップ遺伝子を送達されるポリヌクレオチドを含むパッケージ化されたＡＡＶゲノム、ならびにヘルパーウイルス機能は、当該技術分野で標準である細胞に提供される。ｒＡＡＶの生成は、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離する（すなわち、その中にはない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びキャップ遺伝子の構成成分、及びヘルパーウイルス機能が単一細胞（本明細書においてパッケージング細胞として示される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ及びキャップ遺伝子は、任意のＡＡＶ血清型からのものであり得、組換えウイルスは、誘導され得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、及びＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からのものであり得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際特許出願第ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。表１を参照のこと。
Figure 0006947729
パッケージング細胞を作製する方法は、ＡＡＶ粒子生成のために必要な構成成分の全てを安定的に発現する細胞株を生成することを含む。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びキャップ遺伝子を欠いているｒＡＡＶゲノムを含むプラスミド（または複数のプラスミド）、ｒＡＡＶゲノムから分離されるＡＡＶ ｒｅｐ及びキャップ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーは、細胞のゲノムに統合される。ＡＡＶゲノムは、例えば、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの添加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）によるような手法によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株は、アデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染する。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模生産に好適であることである。好適な方法の他の例は、パッケージング細胞に、ｒＡＡＶゲノム及び／またはｒｅｐ及びキャップ遺伝子を導入するために、プラスミドよりもアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
ｒＡＡＶ生成の一般原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４−１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９−６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４−１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号において説明されている。
ＡＡＶベクター血清型は、細胞型を標的するように一致させ得る。例えば、以下の例示的な細胞型は、とりわけ、示されたＡＡＶ血清型によって形質導入され得る。表２を参照のこと。
Figure 0006947729
アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターは、本発明の実践において使用され得る。このようなウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、パポーウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子中の１つまたは２つの遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡは、それぞれ、脂質ナノ粒子に別々に製剤化されるか、またはこれらは全て、１つの脂質ナノ粒子中に共製剤化されるか、または２つ以上の脂質ナノ粒子中に共製剤化される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に製剤化されるが、ｓｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクターに送達される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に共製剤化されるが、ドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクターに送達される。
選択肢は、ＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを送達するために利用可能である。ガイドＲＮＡは、同じＤＮＡから発現され得るか、またはＲＮＡとしてまた送達され得る。ＲＮＡは、その半減期を改変または改善する、または免疫応答の可能性もしくは程度を低減するように化学的に修飾され得る。エンドヌクレアーゼタンパク質は、送達前にｇＲＮＡと複合体形成され得る。ウイルスベクターは、効率的な送達を可能にし、Ｃａｓ９のスプリットバージョン及びＣａｓ９のより小さいオルソログは、ＨＤＲにおいてドナーがパッケージ化され得るように、ＡＡＶにおいてパッケージ化され得る。これらの構成成分のそれぞれが送達することができる、様々な範囲の非ウイルス送達方法が存在するか、または非ウイルス及びウイルス方法が、タンデムで用いられ得る。例えば、ナノ粒子は、タンパク質及びガイドＲＮＡを送達するために使用することができるが、ＡＡＶは、ドナーＤＮＡを送達するために使用することができる。
遺伝的に修飾された細胞
「遺伝的に修飾された細胞」という用語は、ゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系を用いて）によって導入される少なくとも１つの遺伝的修飾を含む細胞を指す。本明細書のいくつかのエクスビボ実施形態では、遺伝的に修飾された細胞は、遺伝的に修飾された前駆細胞である。本明細書のいくつかのインビボ実施形態では、遺伝的に修飾された細胞は、遺伝的に修飾された神経系細胞である。外因性ゲノム標的核酸及び／またはゲノム標的核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝的に修飾された細胞が、本明細書において企図される。
「対照処理集団」という用語は、ゲノム編集の構成成分の添加を除いて、同一の培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、密集度、フラスコのサイズ、ｐＨ等で処理された細胞の集団を説明している。例えば、ノーザンブロット分析、またはＣ９ＯＲＦ７２ ｍＲＮＡを定量化するための、当該技術分野で既知である任意の方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子中のヘキサヌクレオチド反復の長さを測定するために使用することができる。
「単離細胞」という用語は、最初に見出された生物、またはこのような細胞の子孫から除去された細胞を指す。任意に、細胞は、例えば、定義された条件下、または他の細胞の存在下で、インビトロで培養されている。任意に、細胞は、後で、第２の生物に導入されるか、またはそれ（または子孫である細胞）を単離した生物に再導入される。
細胞の単離集団に対して「単離集団」という用語は、細胞の混合または異種集団から除去及び分離された細胞集団を指す。いくつかの実施形態では、単離集団は、細胞が単離または濃縮された異種集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団である。いくつかの実施形態では、単離集団は、ヒト前駆細胞、及びヒト前駆細胞を由来した細胞を含む異種細胞集団と比較して、ヒト前駆細胞の単離集団、例えば、実質的に純粋なヒト前駆細胞の集団である。
特定の細胞集団に対して「実質的に増強された」という用語は、特定の細胞型の発生が、事前または参照レベルと比較して、例えば、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤを改善するためにこのような細胞の所望のレベルに応じて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍もしくはそれ以上増加する、細胞集団を指す。
特定の細胞集団に対して「実質的に濃縮された」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に対して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％またはそれ以上である細胞集団を指す。
特定の細胞集団に対して「実質的に濃縮された」または「実質的に純粋な」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。つまり、前駆細胞集団に対して「実質的に純粋な」または「実質的に精製された」という用語は、本明細書において用語によって定義されるように、前駆細胞ではない細胞の約２０％未満、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満含有する細胞集団を指す。
造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞への、ゲノム編集したｉＰＳＣの分化
本発明のエクスビボ方法の別のステップは、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に、ゲノム編集されたｉＰＳＣを分化させることを含む。分化させるステップは、当該技術分野で既知の任意の方法に従って実施され得る。例えば、ｉＰＳＣは、小分子の組み合わせを用いて、またはＢｒｎ２、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、Ｓｏｘ２、及びＦｏｘａ２、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ３、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｎｏｔｃｈ１、（ＮＩＣＤ）、ＰＬＡＧＬ１、及びＲｆｘ４等であるが、これらに限定されない、マスター転写因子の送達によってニューロンに分化させる。ｉＰＳＣは、βＩＩＩ−チューブリン、チロシン、ヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１Ｂ、及びＭＡＰ２を発現する、ニューロンに分化させ得る。カテコールアミン関連酵素の存在は、ｉＰＳＣが、ｈＥＳＣのように、ドーパミンニューロンに分化させ得ることを示し得る。
造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞への、ゲノム編集された間葉幹細胞の分化
本発明のエクスビボ方法の別のステップは、神経系細胞に、ゲノム編集された間葉幹細胞を分化させることを含む。分化させるステップは、当該技術分野で既知の任意の方法に従って実施され得る。例えば、間葉幹細胞は、小分子の組み合わせを用いて、またはＢｒｎ２、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、Ｓｏｘ２、及びＦｏｘａ２、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ３、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｎｏｔｃｈ１、（ＮＩＣＤ）、ＰＬＡＧＬ１、及びＲｆｘ４等であるが、これらに限定されない、マスター転写因子の送達によってニューロンに分化させる。間葉幹細胞は、βＩＩＩ−チューブリン、チロシン、ヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１Ｂ、及びＭＡＰ２を発現する、ニューロンに分化させ得る。カテコールアミン関連酵素の存在は、間葉幹細胞が、ｈＥＳＣのように、ドーパミンニューロンに分化させ得ることを示し得る。
細胞を、患者に移植すること
本発明のエクスビボ方法の別のステップは、細胞を、患者に移植することを含む。この移植するステップは、当該技術分野で既知の任意の移植方法を用いて達成され得る。例えば、遺伝的に修飾された細胞は、患者の中枢神経系に直接注射され得るか、またはそうでなければ患者に投与され得る。遺伝的に修飾された細胞は、選択されたマーカーを用いてエクスビボで精製され得る。
薬学的に許容される担体
本明細書で企図される対象への前駆細胞を投与するエクスビボ方法は、前駆細胞を含む治療組成物の使用を含む。
治療組成物は、細胞組成物、及び任意に本明細書に記載される少なくとも１つのさらなる生物活性剤と一緒に生理学的に許容される担体を含有し、活性成分としてそこに分解または分散される。いくつかの実施形態では、治療組成物は、所望でない限り、治療目的のために哺乳動物またはヒト患者に投与される場合に、実質的に免疫原性ではない。
概して、本明細書に記載される前駆細胞は、懸濁液として薬学的に許容される担体とともに投与される。当業者は、細胞組成物で使用される薬学的に許容される担体が、対象に送達される細胞の生存率と実質的に干渉する量で、緩衝液、化合物、低温保存剤、保存剤、または他の薬剤を含まないことを認識するであろう。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性を維持することができる浸透緩衝液、及び任意に細胞の生存を維持するか、または投与時に生着を増強するための栄養物を含み得る。このような製剤及び懸濁液は、当業者に既知であり、及び／または日常の実験を用いて、本明細書に記載される前駆細胞とともに用いるために適合され得る。
細胞組成物はまた、リポソーム組成物として乳化または提示され得るが、但し、乳化手順が細胞生存に悪影響を及ぼさないものとする。細胞及び任意の他の活性成分は、本明細書に記載される治療方法で用いるのに好適な量で、薬学的に許容される賦形剤と混合し、活性成分と適合し得る。
細胞組成物中に含まれるさらなる薬剤は、その中に構成成分の薬学的に許容される塩を含み得る。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）を含む。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、エタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来し得る。
生理学的に許容される担体は、当該技術分野で公知である。例示的な液体担体は、活性成分及び水以外のいかなる材料も含有しないか、または緩衝液、例えば、生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理食塩水またはその両方、例えば、リン酸緩衝生理食塩水を含有する滅菌水溶液である。さらになお、水性担体は、１つを超える緩衝塩、ならびに塩、例えば、塩化ナトリウム及び塩化カリウム、デキストロース、ポリエチレングリコール、及び他の溶質を含有し得る。液体組成物はまた、水に加えて及び水を除いて液相を含有し得る。このようなさらなる液体相の例は、グリセリン、植物油、例えば、綿実油、及び水−油エマルジョンである。特定の疾患または病態の治療に有効である細胞組成物で使用される活性化合物の量は、疾患または病態の性質に応じて異なり、標準的な臨床技法によって決定され得る。
投与及び有効性
「投与すること」、「導入すること」、及び「移植すること」という用語は、所望の効果（複数可）が生成されるように、所望の部位、例えば、損傷または修復の部位で導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、対象への、細胞、例えば、前駆細胞の置換の文脈において同義に使用される。細胞、例えば、前駆細胞、またはそれらの分化した子孫は、移植された細胞または細胞の構成成分の少なくとも一部が生存する対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、短くて数時間、例えば、２４時間から数日、長くて数年、またはさらには患者の一生涯、すなわち長期にわたる生着であり得る。例えば、本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、有効量の筋原性前駆細胞は、投与の全身経路、例えば、腹腔内または静脈内経路を介して投与される。
「個人」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書において同義に使用され、診断、治療、または療法が所望である任意の対象を指す。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
予防的に提供される場合、本明細書に記載される前駆細胞は、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤの任意の症状より前、例えば、認知症の発症、歩行困難、脚の衰弱、手の衰弱、不器用、不明瞭な発語、嚥下困難、筋けいれん、脚もしくは肩もしくは舌の単収縮、頭を持ち上げるまたは良い姿勢を保つことが困難になる前に、対象に投与され得る。したがって、神経前駆細胞集団の予防的投与は、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤを予防するのに役立つ。
治療的に提供される場合、神経前駆細胞は、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤの症状または兆候の発症時（または後）に、例えば、疾患の発症時に提供される。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って投与される神経前駆細胞集団は、１つ以上のドナーから得られた同種神経前駆細胞を含む。「同種」とは、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合に、同じ種の１つ以上の異なるドナーから得られた神経前駆細胞を含む神経前駆細胞または生物学的試料を指す。例えば、対象に投与される神経前駆細胞集団は、１つ以上の別個のドナー対象、または１つ以上の非同一の同胞種に由来し得る。いくつかの実施形態では、遺伝学的に同一の動物、または一卵性双生児から得られたもの等の同系神経前駆細胞集団が、使用することができる。他の実施形態では、神経前駆細胞は、自己細胞である；つまり、神経前駆細胞は、対象から得られるかまたは単離され、同じ対象（すなわち、ドナー及び受容者が同じである）に投与される。
一実施形態では、「有効量」という用語は、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤの少なくとも１つ以上の兆候または症状を予防または軽減するために必要とされる前駆細胞またはそれらの子孫の集団の量を指し、例えば、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤを有する対象を治療するために、所望の効果を提供するための十分な量の組成物に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤを有するまたはその危険性がある者等の典型的な対象に投与される場合に、特定の効果を促進するのに十分である、前駆細胞、または前駆細胞を含む組成物の量を指す。有効量はまた、疾患の症状の発症を防止または遅延させる、疾患の症状の経過を変化させる（例えば、疾患の症状の進行を遅らせることであるが、これに限定されない）、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含み得る。任意の所与の場合において、適切な「有効量」は、日常の実験を用いて当業者によって決定され得ることが理解されよう。
本明細書に記載される様々な実施形態で用いるための、前駆細胞の有効量は、少なくとも１０２個の前駆細胞、少なくとも５×１０２個の前駆細胞、少なくとも１０３個の前駆細胞、少なくとも５×１０３個の前駆細胞、少なくとも１０４個の前駆細胞、少なくとも５×１０４個の前駆細胞、少なくとも１０５個の前駆細胞、少なくとも２×１０５個の前駆細胞、少なくとも３×１０５個の前駆細胞、少なくとも４×１０５個の前駆細胞、少なくとも５×１０５個の前駆細胞、少なくとも６×１０５個の前駆細胞、少なくとも７×１０５個の前駆細胞、少なくとも８×１０５個の前駆細胞、少なくとも９×１０５個の前駆細胞、少なくとも１×１０６個の前駆細胞、少なくとも２×１０６個の前駆細胞、少なくとも３×１０６個の前駆細胞、少なくとも４×１０６個の前駆細胞、少なくとも５×１０６個の前駆細胞、少なくとも６×１０６個の前駆細胞、少なくとも７×１０６個の前駆細胞、少なくとも８×１０６個の前駆細胞、少なくとも９×１０６個の前駆細胞、またはこれらの倍数を含む。前駆細胞は、１つ以上のドナーから得られるか、または自家源から得られる。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、前駆細胞は、それを必要とする対象への投与前に、培地中で拡大させる。
ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤを有する患者の細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子における拡大したヘキサヌクレオチド反復の低減は、疾患の１つ以上の症状を改善するため、長期生存を増加させるため、及び／または他の治療に関連する副作用を低減するために有益であり得る。ヒト患者へのこのような細胞の投与時に、野生型または同様のレベルのヘキサヌクレオチド反復を有する神経前駆細胞の存在は有益である。いくつかの実施形態では、対象の効果的な治療は、治療を受けた対象における全ヘキサヌクレオチド反復と比較して、少なくとも約３％、５％、または７％の野生型または同様のレベルを引き起こす。いくつかの実施形態では、野生型または同様のレベルは、全ヘキサヌクレオチド反復の少なくとも約１０％であろう。いくつかの実施形態では、野生型または同様のレベルは、全ヘキサヌクレオチド反復の少なくとも約２０％〜３０％であろう。同様に、野生型レベルのヘキサヌクレオチド反復を有する、より比較的に制限された細胞の導入は、場合によっては、正規化細胞が、罹患細胞と比較して選択的優位性を有するため、様々な患者において有益であり得る。しかしながら、野生型または同様のレベルのヘキサヌクレオチド反復を有する、さらに適度なレベルの神経前駆細胞は、患者におけるＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤの１つ以上の態様を改善するために有益であり得る。いくつかの実施形態では、このような細胞が投与される患者における、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％もしくはそれ以上の神経前駆細胞は、野生型または同様のレベルのヘキサヌクレオチド反復を生成している。
「投与された」とは、所望の部位で細胞組成物の少なくとも部分的局在化をもたらす方法または経路によって、対象への前駆細胞組成物の送達を指す。細胞組成物は、対象における効果的な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与され得、すなわち、組成物の少なくとも一部が送達される、すなわち、少なくとも１×１０４個の細胞が、一定期間中所望の部位に送達される場合に、投与は、対象における所望の場所への送達をもたらす。投与モードは、注射、注入、点滴注入、または摂取を含む。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、及び胸骨下注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この経路は、静脈内である。細胞の送達のために、注射または注入による投与が、一般的に好ましい。
一実施形態では、細胞は、全身投与される。「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、及び「末梢に投与される」という語句は、標的部位、組織、または器官への直接的投与以外の、前駆細胞の集団がその代わりに対象の循環系に入り、それにより、代謝及び他の同様のプロセスに供されるように、前駆細胞の集団の投与を指す。
ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤの治療のための組成物を含む治療の有効性は、当業者によって決定され得る。しかしながら、治療は、ヘキサヌクレオチド反復の兆候または症状のうちの任意の１つまたはその全て、一例としてそのレベルが、有益な様式で改変される（例えば、少なくとも１０％増加する）、または疾患の他の臨床的に認められた症状またはマーカーが、改善または緩和される場合、「効果的な治療」と見なされている。有効性はまた、個人が、入院または医学的介入（例えば、慢性閉鎖性肺疾患、または疾患の進行が、停止されるか、または少なくとも遅延させる）の必要性によって評価されるように悪化させないことによって測定され得る。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ／または本明細書に記載されている。治療は、個体または動物（いくつかの非限定的な例には、ヒトまたは哺乳動物が含まれる）における疾患の任意の治療を含み、（１）疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を停止するまたは遅延させること、または（２）疾患を緩和させること、例えば、症状の退縮を生じること、及び（３）症状の発症を防ぐこと、またはその可能性を低減させることを含む。
本発明に従って治療は、個体におけるヘキサヌクレオチド反復の量を低減させることによって、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤと関連する１つ以上の症状を緩和する。典型的には、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤと関連する初期兆候は、例えば、認知症、歩行困難、脚の衰弱、手の衰弱、不器用、不明瞭な発語、嚥下困難、筋けいれん、脚もしくは肩もしくは舌の単収縮、頭を持ち上げるまたは良い姿勢を保つことが困難になることを含む。
キット
本開示は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。キットは、ゲノム標的核酸、ゲノム標的核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／または本発明の方法の実施形態、またはこれらの任意の組み合わせを実行するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子のうちの１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、（１）ゲノム標的核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、（２）部位特異的ポリペプチドもしくは部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、ならびに（３）ベクター（複数可）及びもしくはポリペプチドの再構成及び／もしくは希釈のための試薬を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、（１）（ｉ）ゲノム標的核酸をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、を含むベクター、ならびに（２）ベクターの再構成及び／もしくは希釈のための試薬を含む。
上記のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、単一分子ガイドゲノム標的核酸を含む。上記のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、二重分子ゲノム標的核酸を含む。上記のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、２つ以上の二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、核酸標識核酸をコードするベクターを含む。
上記のキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、所望の遺伝的修飾に影響を及ぼすように挿入されるポリヌクレオチドをさらに含み得る。
キットの構成成分は、別個の容器であり得るか、または単一の容器内に組み合わせられ得る。
いくつかの実施形態では、上述のキットは、１つ以上のさらなる試薬をさらに含み、このようなさらなる試薬は、緩衝液、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞に導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのインビトロでの生成のために試薬、配列決定のためのアダプター等から選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構成緩衝液、希釈緩衝液等であり得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、エンドヌクレアーゼによってオンターゲット結合またはＤＮＡの切断を促進するもしくは増強する、または標的化の特異性を改善させるために使用され得る１つ以上の構成成分も含むことができる。
上述の構成成分に加えて、キットは、方法を実行するためにキットの構成要素を使用するための指示をさらに含むことができる。方法を実行するための指示は、概して、好適な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙またはプラスチック等の基材上に印刷され得る。指示は、包装挿入物としてキットの中に、キットの容器もしくはその構成要素のラベル等の中に（すなわち、包装または分包に伴って）存在し得る。指示は、好適なコンピュータ読み取り可能な記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等に存在する電子記憶データファイルとして存在することができる。いくつかの場合において、実際の指示は、キット中に存在しないが、遠隔供給源から（例えば、インターネットを介して）指示を得るための手段が提供され得る。この実施態様の例は、指示が見られ得る、及び／またはそこから指示がダウンロードされ得るウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を得るためのこの手段は、好適な基材に記録可能である。
ガイドＲＮＡ製剤
本発明のガイドＲＮＡは、特定の投与モード及び剤形に応じて、薬学的に許容される賦形剤、例えば、担体、溶媒、安定化剤、アジュバント、希釈剤等で製剤化される。ガイドＲＮＡ組成物は、概して、生理学的に適合するｐＨを達成するように製剤化され、投与の製剤及び経路に応じて、約３のｐＨ〜約１１のｐＨ、約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲である。代替の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調整される。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに、治療上有効量の本明細書に記載される少なくとも１つの化合物を含む。任意に、組成物は、本明細書に記載される化合物の組み合わせを含むか、または細菌増殖の治療または予防に有用な第２の活性成分（例えば、抗バクテリア剤または抗菌剤であるが、これらに限定されない）を含み得るか、または本発明の試薬の組み合わせを含み得る。
好適な賦形剤には、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子等の大きくて遅く代謝する巨大分子を含む、担体分子が含まれる。他の例示的な賦形剤には、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸であるが、これに限定されない）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡであるが、これに限定されない）、炭水化物（例えば、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルメチルセルロースであるが、これらに限定されない）、ステアリン酸、液体（例えば、油、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールであるが、これらに限定されない）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等が含まれる。
他の可能性のある治療的アプローチ
ゲノム編集は、特定の配列を標的化するように操作されたヌクレアーゼを用いて行われ得る。今まで、４つの主な種類のヌクレアーゼ：メガヌクレアーゼ及びそれらの誘導体、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系がある。ヌクレアーゼプラットフォームは、特に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの特異性がタンパク質−ＤＮＡの相互作用によるものであるが、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用は、主に、Ｃａｓ９を誘導するため、設計の難しさ、標的化密度、及び作用モードに応じて異なる。Ｃａｓ９切断はまた、隣接モチーフ、異なるＣＲＩＳＰＲ系で異なる、ＰＡＭも必要とする。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９は、ＮＲＧ ＰＡＭを用いて切断し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからのＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴ、及びＮＮＮＮＧＣＴＴを含む、ＰＡＭを有する部位で切断することができる。多くの他のＣａｓ９オルソログは、代替のＰＡＭに隣接してプロトスペーサーを標的化する。
本発明の方法において、Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することが、好ましい。しかしながら、治療標的部位等の本明細書に記載される教示は、エンドヌクレアーゼの他の形態、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、またはＭｅｇａＴＡＬに、またはヌクレアーゼの組み合わせを用いて適用され得る。しかしながら、このようなエンドヌクレアーゼへの本発明の教示を適用するために、とりわけ、特異的標的部位に向けられるタンパク質を操作することが必要とされ得る。
さらなる結合ドメインは、特異性を増加させるために、Ｃａｓ９タンパク質に融合され得る。これらの構築体の標的部位は、特定されたｇＲＮＡ特異的部位にマッピングされ得るが、例えば、亜鉛フィンガードメインに対してさらなる結合モチーフを必要とし得る。Ｍｅｇａ−ＴＡＬの場合は、メガヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに融合され得る。メガヌクレアーゼドメインは、特異性を増加し、切断を提供し得る。同様に、不活性化または死滅Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、切断ドメインに融合され、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位及び融合されたＤＮＡ結合ドメインに対する隣接結合部位を必要とし得る。これは、さらなる結合部位のない結合を減少させるために、触媒不活性化に加えて、ｄＣａｓ９のいくつかのタンパク質操作を必要とし得る可能性が高い。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結された操作された亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる分子タンパク質である。ＦｏｋＩが二量体としてのみ機能するため、一対のＺＦＮは、反対のＤＮＡ鎖上の、触媒的に活性なＦｏｋＩ二量体を形成することができるようにそれらの間で正確な間隔を有する、同種の標的「半減期」配列に結合するために操作されなければならない。それ自体が本来配列特異性を有しない、ＦｏｋＩドメインの二量化時に、ＤＮＡ二本鎖切断が、ゲノム編集における開始ステップとしてＺＦＮハーフ部位間で生成される。
第４のヌクレオチドとの交差鎖相互作用も重要であり得るが、各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、十分なＣｙｓ２−Ｈｉｓ２アーキテクチャの３〜６の亜鉛フィンガーからなり、各フィンガーは、主に、標的ＤＮＡ配列の１つの鎖上で三重のヌクレオチドを認識する。ＤＮＡと主な接触を行う位置におけるフィンガーのアミノ酸の改変は、所与のフィンガーの配列特異性を改変させる。それ故に、三重選択が、隣接したフィンガーによる異なる度合いに影響され得るが、標的配列が、各フィンガーによって寄与される三重選択の複合物である場合に、４つのフィンガーの亜鉛フィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識するであろう。ＺＦＮの重要な態様は、かなりの専門的技術がうまく行うために必要とされるが、個々のフィンガーを単に改変することによってほぼあらゆるゲノムアドレスにも容易に再標的化し得ることである。ＺＦＮのほとんどの用途では、４〜６つのフィンガーのタンパク質が使用され、それぞれ、１２〜１８ｂｐを認識する。それ故に、一対のＺＦＮは、典型的には、ハーフ部位間の５〜７ｂｐのスペーサーを含まない、２４〜３６ｂｐの組み合わせられた標的配列を認識するであろう。結合部位は、１５〜１７ｂｐを含む、より大きいスペーサーでさらに分離され得る。この長さの標的配列は、反復配列または遺伝子ホモログが設計プロセス中に含まれないと仮定すれば、ヒトゲノムで固有である可能性がある。それでもなお、ＺＦＮタンパク質−ＤＮＡの相互作用は、それらの特異性で絶対ではない、そのため、オフターゲット結合及び切断事象が、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体として、またはＺＦＮの一方もしくはもう一方のホモ二量体として生じる。後者の可能性は、互いに二量化し得るが、それら自体で二量化し得ない、偏性ヘテロ二量体変異体としても既知である、「プラス」及び「マイナス」変異を作製するために、ＦｏｋＩドメインの二量化相互作用を操作することによって効果的に排除される。偏性ヘテロ二量体の強化は、ホモ二量体の形成を防ぐ。これは、ＺＦＮ、ならびにこれらのＦｏｋＩ変異体を採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性を大いに強化する。
様々なＺＦＮに基づいた系は、当該技術分野で説明されており、それらの修正が定期的に報告され、多数の参照文献は、ＺＦＮの設計を誘導するために使用される規則及びパラメーターを説明している；例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６（６）：２７５８−６３（１９９９）、Ｄｒｅｉｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３０３（４）：４８９−５０２（２０００）、Ｌｉｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（６）：３８５０−６（２００２）、Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（４２）：３５５８８−９７（２００５）、及びＤｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（３１）：２９４６６−７８（２００１）を参照のこと。
転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、モジュールヌクレアーゼの別の形式を表し、操作されたＤＮＡ結合ドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、一対のＴＡＬＥＮは、標的ＤＮＡ切断を達成するためにタンデムに操作される。ＺＦＮからの主な違いは、ＤＮＡ結合ドメイン及び関連する標的ＤＮＡ配列認識特性の性質である。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインは、最初に植物細菌病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐに記載されたＴＡＬＥタンパク質に由来する。ＴＡＬＥは、３３〜３５のアミノ酸反復のタンデムアレイからなり、各反復が最大２０ｂｐ長さである標的ＤＮＡ配列中の単一対合を認識し、最大４０ｂｐの総標的配列長を得る。各反復のヌクレオチド特異性は、反復可変性二残基（ＲＶＤ）によって決定され、１２位及び１３位でわずか２つのアミノ酸を含む。塩基グアニン、アデニン、シトシン、及びチミンは、それぞれ、４つのＲＶＤ：Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ、及びＡｓｎ−Ｇｌｙによって主に認識される。これは、亜鉛フィンガーよりもはるかに単純な認識コードを構成し、したがって、ヌクレアーゼ設計において後者を上回る利点を表す。それにもかかわらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ相互作用は、それらの特異性において絶対的ではなく、ＴＡＬＥＮはまた、オフターゲット活性を低減するために、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用からも有益である。
ＦｏｋＩドメインのさらなる変異体が作製されており、それらの触媒機能において不活性化される。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ対のうちのいずれかの半分が不活性なＦｏｋＩドメインを含有する場合、一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）のみが、ＤＳＢというよりもむしろ標的部位で生じるであろう。結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１「ニッカーゼ」変異体の使用に相当し、Ｃａｓ９切断ドメインのうちの１つが不活性化されている。ＤＮＡニックは、ＤＳＢを用いるよりもさらに低い効率で、ＨＤＲによってゲノム編集を推進するために使用され得る。主な利益は、ＮＨＥＪ媒介性ミス修復の傾向がある、ＤＳＢとは異なり、オフターゲットニックが、迅速かつ正確に修復されることである。
様々なＴＡＬＥＮに基づいたシステムは、当該技術分野で説明されており、それらの修正が定期的に報告されている；例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９−１２（２００９）、Ｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３５（６０６９）：７１６−９（２０１２）、及びＭｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０１（２００９）を参照のこと。「ゴールデンゲート」プラットホームに基づいたＴＡＬＥＮの使用は、複数の基によって説明されている；例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１２）：ｅ８２（２０１１）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１４）：６３１５−２５（２０１１）、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．６（２）：ｅ１６７６５（２０１１）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４１（６）：３３９−４７，Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｍａｙ １７（２０１４）、及びＣｅｒｍａｋ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２３９：１３３−５９（２０１５）を参照のこと。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４〜４４塩基対）を有し、しばしば、ゲノムにおいて固有の部位で高度の特異性でＤＮＡを切断する、配列特異的エンドヌクレアーゼである。真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、及びファージを含む、広範囲の宿主に由来する、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１８８０９）、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈｉｓ−Ｃｉｓ ｂｏｘ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、及びＶｓｒ−様を含む、それらに構造によって分類されるように、少なくとも６つの既知のＨＥのファミリーが存在する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥは、ゲノム編集の初期ステップとして標的遺伝子座でＤＳＢを作製するために使用され得る。加えて、いくつかの天然及び操作されたＨＥは、ＤＮＡの一本鎖のみ切断し、それによって、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥ及びそれらが提供される特異性の大きな標的配列は、部位特異的ＤＳＢを作製するために魅力的な候補である。
様々なＨＥに基づいたシステムは、当該技術分野で説明されており、それらの修正が定期的に報告されている；例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４（８）：６６３−８０（２０１４）、Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１１２３：１−２６（２０１４）、Ｈａｆｅｚ ａｎｄ Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ ５５（８）：５５３−６９（２０１２）、及びその中に言及された参照文献による概説を参照のこと。
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ−ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットホーム及びＴｅｖ−ｍＴＡＬＥＮプラットホームは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び触媒活性ＨＥの融合を使用し、調節可能なＤＮＡ結合及びＴＡＬＥの特異性、ならびにＨＥの切断配列特異性の両方を活用する；例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ４２：２５９１−２６０１（２０１４）、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３ ４：１１５５−６５（２０１４）、及びＢｏｉｓｓｅｌ ａｎｄ Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３９：１７１−９６（２０１５）を参照のこと。
さらなる変形において、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャは、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）に由来するヌクレアーゼドメインによるメガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）の融合である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基板上で約３０ｂｐ離れて位置付けられ、非適合性の付着末端を有する２つのＤＳＢを生成する；例えば、Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ４２，８８１６−２９（２０１４）を参照のこと。既知のヌクレアーゼに基づいたアプローチの他の組み合わせが進化し、本明細書に記載される標的ゲノム修飾を達成するのに有用であろうことが予想される。
ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１−Ｆｏｋ１及び他のヌクレアーゼ
上述のヌクレアーゼプラットフォームの構造及び機能的特性を組み合わせることは、固有の欠点のうちのいくつかを潜在的に克服することができるゲノム編集へのさらなるアプローチを提供する。一例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは、典型的には、ＤＳＢを作製するために単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用する。標的化の特異性は、標的ＤＮＡ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９の場合、隣接するＮＡＧまたはＮＧＧ ＰＡＭ配列中のさらなる２つ塩基に加えて）でＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を受けるガイドＲＮＡ内の２０または２４のヌクレオチド配列によって推進される。このような配列は、ヒトゲノムにおいて固有であるのに十分な長さであるが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性が、絶対的ではなく、著しく乱雑性を許容する場合があり、特に、標的配列の５’半分において、特異性を推進する塩基の数を効果的に低減する。これに対する１つの解決策は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１触媒機能を完全に不活性化することであり、ＲＮＡ−ガイドＤＮＡ結合機能のみ保持し、その代わりに不活性化したＣａｓ９にＦｏｋＩドメインを誘導する；例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２：５６９−７６（２０１４）及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５７７−８２（２０１４）を参照のこと。ＦｏｋＩは、触媒活性であるために二量化しなければならないため、２つのガイドＲＮＡは、二量体を形成し、ＤＮＡを切断するように近接近して、２つのＦｏｋＩ融合でつなぐことが必要である。これは、本質的には、組み合わせた標的部位において塩基の数を倍にし、それによってＣＲＩＳＰＲに基づいたシステムによって標的化のストリンジェンシーを増加させる。
さらなる例として、Ｉ−ＴｅｖＩ等の触媒活性のＨＥへのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの融合は、オフターゲット切断がさらに低減され得るという見込みで、調節可能なＤＮＡ結合及びＴＡＬＥの特異性、ならびにＩ−ＴｅｖＩの切断配列特異性の両方を活用する。
本発明の方法及び組成物
したがって、本開示は、特に、以下の非限定例に関し、第１の方法である方法１では、本開示は、ゲノム編集によってヒト細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するための方法を提供し、本方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
別の方法である方法２では、本開示は、ゲノム編集によってヒト細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を挿入するための方法を提供し、本方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子またはミニ遺伝子の永久挿入をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、ヒト細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入するステップを含む。
別の方法である方法３では、本開示は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのエクスビボ方法を提供し、本方法は、ｉ）患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作成するステップと、ｉｉ）ｉＰＳＣのＣ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、またはｉＰＳＣのセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、ｉｉｉ）ゲノム編集されたｉＰＳＣを、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を分化させるステップと、ｉｖ）造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を患者に移植するステップと、を含む。
別の方法である方法４では、本開示は、方法３の方法を提供し、作成するステップは、ａ）体細胞を患者から単離するステップと、ｂ）体細胞に、一連の多分化能関連遺伝子を導入し、細胞を誘導して、多能性幹細胞にするステップと、を含む。
別の方法である方法５では、本開示は、方法４の方法を提供し、体細胞は、線維芽細胞である。
別の方法である方法６では、本開示は、方法４の方法を提供し、一連の多分化能関連遺伝子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、及びｃＭＹＣからなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上である。
別の方法である方法７では、本開示は、方法３〜６のうちのいずれか１つの方法を提供し、編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子もしくはミニ遺伝子の永久挿入及びＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、ｉＰＳＣに、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
別の方法である方法８では、本開示は、方法７の方法を提供し、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である。
別の方法である方法９では、本開示は、方法３〜８のうちのいずれか１つの方法を提供し、分化させるステップは、ゲノム編集されたｉＰＳＣを、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化させるために、小分子の組み合わせによる処理またはマスター転写因子の送達のうちの１つ以上を含む。
別の方法である方法１０では、本開示は、方法３〜９のうちのいずれか１つの方法を提供し、移植するステップは、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、患者に移植することを含む。
別の方法である方法１１では、本開示は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのエクスビボ方法を提供し、本方法は、ｉ）白血球を患者から単離するステップと、ｉｉ）Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくは白血球のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、または白血球のセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、ｉｉｉ）編集された白血球を患者に移植するステップと、を含む。
別の方法である方法１２では、本開示は、方法１１の方法を提供し、単離するステップが、細胞分画遠心分離、細胞培養、またはこれらの組み合わせを含む。
別の方法である方法１３では、本開示は、方法１１または１２のいずれかの方法を提供し、編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、神経系細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
別の方法である方法１４では、本開示は、方法１３の方法を提供し、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である。
別の方法である方法１５では、本開示は、方法１１〜１４のうちのいずれか１つの方法を提供し、移植するステップは、編集された白血球を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、患者に移植することを含む。
別の方法である方法１６では、本開示は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのエクスビボ方法を提供し、本方法は、ｉ）任意に、患者の骨髄の生検を実行するステップと、ｉｉ）間葉幹細胞を単離するステップと、ｉｉｉ）幹細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくは幹細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、または幹細胞のセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、Ｉｖ）幹細胞を、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化させるステップと、ｖ）造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を患者に移植するステップと、を含む。
別の方法である方法１７では、本開示は、方法１６の方法を提供し、単離するステップは、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）を用いた密度遠心分離による、骨髄の吸引及び間葉細胞の単離を含む。
別の方法である方法１８では、本開示は、方法１６または１７の方法を提供し、編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、幹細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
別の方法である方法１９では、本開示は、方法１８の方法を提供し、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である。
別の方法である方法２０では、本開示は、方法１６〜１９のうちのいずれか１つの方法を提供し、分化させるステップは、ゲノム編集された幹細胞を、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化させるために、小分子の組み合わせによる処理またはマスター転写因子の送達のうちの１つ以上を含む。
別の方法である方法２１では、本開示は、方法１６〜２０のうちのいずれか１つの方法を提供し、移植するステップは、細胞を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、患者に移植することを含む。
別の方法である方法２２では、本開示は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのエクスビボ方法を提供し、本方法は、ｉ）任意に、患者を、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）で治療するステップと、ｉｉ）造血前駆細胞を、患者から単離するステップと、ｉｉｉ）造血前駆細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくは造血前駆細胞のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、または造血前駆細胞のセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、ｉｖ）細胞を、患者に移植するステップと、を含む。
別の方法である方法２３では、本開示は、方法２２の方法を提供し、治療するステップは、Ｐｌｅｒｉｘａｆｌｏｒと組み合わせて行われる。
別の方法である方法２４では、本開示は、方法２２または２３のいずれかの方法を提供し、単離するステップは、ＣＤ３４＋細胞を単離することを含む。
別の方法である方法２５では、本開示は、方法２２〜２４のいずれか１つの方法を提供し、編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、幹細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
別の方法である方法２６では、本開示は、方法２５の方法を提供し、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である。
別の方法である方法２７では、本開示は、方法２２〜２６のうちのいずれか１つの方法を提供し、移植するステップは、神経系細胞を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、患者に移植することを含む。
別の方法である方法２８では、本開示は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するためのインビボ方法を提供し、本方法は、患者の細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で編集するステップ、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、を含む。
別の方法である方法２９では、本開示は、方法２８の方法を提供し、編集するステップは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらすＣ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍、またはＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または１つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすために、細胞に、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入することを含む。
別の方法である方法３０では、本開示は、方法２９の方法を提供し、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である。
別の方法である方法３１では、本開示は、方法２８〜３０のうちのいずれか１つの方法を提供し、この細胞、神経系細胞、骨髄細胞、造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞。
別の方法である方法３２では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９のうちのいずれか１つの方法を提供し、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても既知である）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；またはこれらのホモログ、天然に存在する分子の組み換え、コドン最適化、またはこれらの修飾した変形、及びこれらの組み合わせである。
別の方法である方法３３では、本開示は、方法３２の方法を提供し、本方法は、細胞に、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む。
別の方法である方法３４では、本開示は、方法３２の方法を提供し、本方法は、細胞に、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入することを含む。
別の方法である方法３５では、本開示は、方法３３または３４のいずれかの方法を提供し、１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のＲＮＡは、１つ以上の修飾ポリヌクレオチドまたは１つ以上の修飾ＲＮＡである。
別の方法である方法３６では、本開示は、方法３２の方法を提供し、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、タンパク質またはポリペプチドである。
別の方法である方法３７では、本開示は、前述の方法のうちの１つの方法を提供し、本方法は、細胞に、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含む。
別の方法である方法３８では、本開示は、方法３７の方法を提供し、１つ以上のｇＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。
別の方法である方法３９では、本開示は、方法３７または３８の方法を提供し、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の修飾ｇＲＮＡまたは１つ以上の修飾ｓｇＲＮＡである。
別の方法である方法４０では、本開示は、方法３７〜３９のうちのいずれか１つの方法を提供し、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡと事前に複合体形成される。
別の方法である方法４１では、本開示は、前述の方法のうちの１つの方法を提供し、本方法は、細胞に、野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子またはミニ遺伝子またはｃＤＮＡの一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含む。
別の方法である方法４２では、本開示は、方法４１の方法を提供し、野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子またはｃＤＮＡの一部は、全Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子もしくはｃＤＮＡ、または天然変異体１、変異体２、もしくは変異体３のｃＤＮＡである。
別の方法である方法４３では、本開示は、方法４１または４２のいずれかの方法を提供し、ドナー鋳型は、一本鎖または二本鎖のいずれかである。
別の方法である方法４４では、本開示は、方法４１〜４３のうちのいずれか１つの方法を提供し、ドナー鋳型は、９ｐ２１．２領域に対して相同アームを有する。
別の方法である方法４５では、本開示は、方法４１〜４３のうちのいずれか１つの方法を提供し、ドナー鋳型は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１〜２、ＡＬＢのエクソン１〜２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１〜２、ＡｐｏＣ３のエクソン１〜２、ＡＳＧＲ２のエクソン１〜２、ＣＣＲ５のエクソン１〜２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１〜２、Ｇ６ＰＣのエクソン１〜２、Ｇｙｓ２のエクソン１〜２、ＨＧＤのエクソン１〜２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１〜２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１〜２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１〜２、ＴＦのエクソン１〜２、及びＴＴＲのエクソン１〜２からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に対して相同アームを有する。
別の方法である方法４６では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９のうちのいずれか１つの方法を提供し、本方法は、細胞に、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）及び野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含み、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍のＤＳＢ遺伝子座で、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす、１つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、遺伝子座またはセーフハーバーで、ポリヌクレオチドドナー鋳型から染色体ＤＮＡへの新しい配列の挿入を容易にし、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくは遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の近位にあるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列の染色体ＤＮＡの一部の永久挿入または修正をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらし、ｇＲＮＡが、遺伝子座の断片または遺伝子座に相補的であるスペーサー配列を含む。
別の方法である方法４７では、本開示は、方法４６の方法を提供し、近位は、遺伝子座の上流及び下流の両方または遺伝子座のヌクレオチドを意味する。
別の方法である方法４８では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９のうちのいずれか１つの方法を提供し、本方法は、細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）、及び野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含み、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、第１が５’遺伝子座及び第２が３’遺伝子座であり、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、一対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす２つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、５’遺伝子座と３’遺伝子座との間で、ポリヌクレオチドドナー鋳型から染色体ＤＮＡへの新しい配列の挿入を容易にし、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子、もしくはＣ９ＯＲＦ７２遺伝子またはセーフハーバー遺伝子座の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍の、５’遺伝子座と３’遺伝子座との間の染色体ＤＮＡの永久挿入または修正をもたらし、かつＣ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらし、第１のガイドＲＮＡが、５’遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが、３’遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含む。
別の方法である方法４９では、本開示は、方法４６〜４８のうちのいずれか１つの方法を提供し、１つまたは２つのｇＲＮＡは、１つまたは２つの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。
別の方法である方法５０では、本開示は、方法４６〜４９のうちのいずれか１つの方法を提供し、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡは、１つもしくは２つの修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは２つの修飾ｓｇＲＮＡである。
別の方法である方法５１では、本開示は、方法４６〜５０のうちのいずれか１つの方法を提供し、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと事前に複合体形成される。
別の方法である方法５２では、本開示は、方法４６〜５１のうちのいずれか１つの方法を提供し、野生型Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子またはｃＤＮＡの一部は、全Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子もしくはｃＤＮＡ；天然変異体１、変異体２、もしくは変異体３のｃＤＮＡ；または約３０のヘキサヌクレオチド反復である。
別の方法である方法５３では、本開示は、方法４６〜５２のうちのいずれか１つの方法を提供し、ドナー鋳型は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである。
別の方法である方法５４では、本開示は、方法４６〜５３のうちのいずれか１つの方法を提供し、ドナー鋳型は、９ｐ２１．２領域に対して相同アームを有する。
別の方法である方法５５では、本開示は、方法４６〜４４のうちのいずれか１つの方法を提供し、ドナー鋳型は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）のエクソン１〜２、ＡＬＢのエクソン１〜２、Ａｎｇｐｔｌ３のエクソン１〜２、ＡｐｏＣ３のエクソン１〜２、ＡＳＧＲ２のエクソン１〜２、ＣＣＲ５のエクソン１〜２、ＦＩＸ（Ｆ９）のエクソン１〜２、Ｇ６ＰＣのエクソン１〜２、Ｇｙｓ２のエクソン１〜２、ＨＧＤのエクソン１〜２、Ｌｐ（ａ）のエクソン１〜２、Ｐｃｓｋ９のエクソン１〜２、Ｓｅｒｐｉｎａ１のエクソン１〜２、ＴＦのエクソン１〜２、及びＴＴＲのエクソン１〜２からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に対して相同アームを有する。
別の方法である方法５６では、本開示は、方法４４の方法を提供し、ＤＳＢ、または５’ＤＳＢ及び３’ＤＳＢは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１イントロン内にある。
別の方法である方法５７では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９〜５６のうちのいずれか１つの方法を提供し、挿入または修正は、相同配向型修復（ＨＤＲ）によるものである。
別の方法である方法５８では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９のうちのいずれか１つの方法を提供し、本方法は、細胞に、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入することをさらに含み、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座との間で染色体ＤＮＡの永久欠失をもたらす、５’ＤＳＢ遺伝子座と３’ＤＳＢ遺伝子座との間で染色体ＤＮＡの欠失をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の、第１が５’ＤＳＢ遺伝子座及び第２が３’ＤＳＢ遺伝子座である、一対の二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす、２つ以上のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、第１のガイドＲＮＡが、５’ＤＳＢ遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが、３’ＤＳＢ遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含む。
別の方法である方法５９では、本開示は、２つのｇＲＮＡは、２つの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である方法５８の方法を提供する。
別の方法である方法６０では、本開示は、方法５８または５９のいずれかの方法を提供し、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡは、２つの修飾ｇＲＮＡまたは２つの修飾ｓｇＲＮＡである。
別の方法である方法６１では、本開示は、方法５８〜６０のうちのいずれか１つの方法を提供し、１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼは、１つもしくは２つのｇＲＮＡまたは１つもしくは２つのｓｇＲＮＡと事前に複合体形成される。
別の方法である方法６２では、本開示は、方法５８〜６１のうちのいずれか１つの方法を提供し、５’ＤＳＢ及び３’ＤＳＢの両方が、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の第１エクソン、第１イントロン、または第２エクソンのいずれかの中にあるか、またはその近傍にある。
別の方法である方法６３では、本開示は、方法５８〜６２のうちのいずれか１つの方法を提供し、欠失は、拡大したヘキサヌクレオチド反復の欠失である。
別の方法である方法６４では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９〜６３のうちのいずれか１つの方法を提供し、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びドナー鋳型はいずれも、それぞれ、脂質ナノ粒子に別々に製剤化されるか、または全てが脂質ナノ粒子に同時に製剤化される。
別の方法である方法６５では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９〜６３のうちのいずれか１つの方法を提供し、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に製剤化され、ｇＲＮＡ及びドナー鋳型はともに、ウイルスベクターによって送達される。
別の方法である方法６６では、本開示は、方法６５の方法を提供し、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
別の方法である方法６７では、本開示は、方法６６の方法を提供し、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６ベクターである。
別の方法である方法６８では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９〜６３のうちのいずれか１つの方法を提供し、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びドナー鋳型はいずれも、それぞれ、エクソソームに別々に製剤化されるか、または全てがエクソソームに同時に製剤化される。
別の方法である方法６９では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９〜６３のうちのいずれか１つの方法を提供し、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に製剤化され、ｇＲＮＡは、電気穿孔法によって細胞に送達され、ドナー鋳型は、ウイルスベクターによって細胞に送達される。
別の方法である方法７０では、本開示は、方法６９の方法を提供し、ｇＲＮＡは、電気穿孔法によって細胞に送達され、ドナー鋳型は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって細胞に送達される。
別の方法である方法７１では、本開示は、方法７０の方法を提供し、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６ベクターである。
別の方法である方法７２では、本開示は、前述の方法のうちのいずれか１つの方法を提供し、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子は、染色体９：２７，５４６，５４２〜２７，５７３，８６３（ゲノム参照コンソーシアム−ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）上に位置する。
別の方法である方法７３では、本開示は、方法１、７、１３、１８、２５、または２９のうちのいずれか１つの方法を提供し、Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元は、野生型または正常Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質活性と比較される。
別の方法である方法７４では、本開示は、ドナーからの骨髄を患者に移植することを含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者を治療するための方法を提供する。
本開示はまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者から細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するために、配列番号１〜１８８０７中の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）の組成物である組成物１も提供する。
別の組成物である組成物２では、本開示は、組成物１の組成物を提供し、１つ以上のｇＲＮＡは、１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。
別の組成物である組成物３では、本開示は、組成物１または組成物２の組成物を提供し、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の修飾ｇＲＮＡまたは１つ以上の修飾ｓｇＲＮＡである。
本開示はまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）患者から細胞中のＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するために、配列番号１８８１０〜７３６６８中の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つ以上のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）の組成物である組成物４も提供する。
別の組成物である組成物５では、本開示は、組成物４の組成物を提供し、１つ以上のｇＲＮＡは、１つ以上の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。
別の組成物である組成物６では、本開示は、組成物４または組成物５の組成物を提供し、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡは、１つ以上の修飾ｇＲＮＡまたは１つ以上の修飾ｓｇＲＮＡである。
定義
「含むこと」または「含む」という用語は、本発明に必須である、組成物、方法、及びこれらのそれぞれの構成成分（複数可）に関して使用され、必須であるかどうかにかかわらず、不特定の要素の包含の余地がある。
「本質的にからなる」という用語は、所定の実施形態のために必要とされる要素を指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的及び新規のまたは機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない、さらなる要素の存在を許容する。
「からなる」という用語は、実施形態のその記載において記載されていないいかなる要素も除外する、本明細書に記載される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成成分を指す。
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段文脈が明らかに指図しない限り、複数の言及を含む。
本明細書に提示されるある特定の数値は、「約」という用語により始まる。「約」という用語は、「約」という用語が先行する数値、ならびに数値に近い数値に対して文字通りの支援を提供するために使用され、近似している言及されない数値は、それが提示される文脈において、特に言及される数値の実質的な同等物である、数であり得る。「約」という用語は、言及された数値の＋１０％内の数値を意味する。
数値の範囲が本明細書に提示される場合、それぞれ、範囲の下限と上限との間に介入し、範囲の上限及び下限である範囲、及びこの範囲を有する全ての記述された値は、本開示内に包含されることが企図される。範囲の下限及び上限内の全ての可能な部分的な範囲もまた、本開示によって企図される。
本発明は、本発明の例示的な非限定的な実施形態を提供する、以下の実施例への言及によってさらに完全に理解されよう。
本実施例は、ゲノム遺伝子座における拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久修正、または野生型もしくは同様のレベルのヘキサヌクレオチド反復を復元する異種遺伝子座の発現をもたらす、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子において、本明細書では「ゲノム修飾」と称される、定義された治療的ゲノム置換を作製するための例示的なゲノム編集技術としてＣＲＩＳＰＲシステムの使用を説明している。定義された治療的修飾の導入は、本明細書に記載され、例示される、ＡＬＳ及び／またはＦＴＬＤの改善の可能性に対する新規の治療戦略を表す。
実施例１−Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号１〜６１４８に提供されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２−Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６１４９〜６８９２に提供されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３−Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７７６０〜８０９７に提供されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２４ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４−Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号８０９８〜８２６１に提供されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２４ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５−Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６８９３〜７７５９に提供されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２４ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６−Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号８２６２〜１８８０７に提供されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２４ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７−ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号１８８１０〜２０８４１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８−ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２０８４２〜２１０１２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例９−ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２１０１３〜２１０３０に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１０−ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２１０３１〜２１０３９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１１−ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２１０４０〜２１１１４に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１２−ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２１１１５〜２２２９０に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１３−ＡＬＢ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＡＬＢ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２２２９１〜２２４５８に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１４−ＡＬＢ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＡＬＢ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２２４５９〜２２４８６に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１５−ＡＬＢ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＡＬＢ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２２４８７〜２２５０４に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１６−ＡＬＢ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＡＬＢ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２２５０５〜２２５０９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１７−ＡＬＢ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＡＬＢ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２２５１０〜２２５３３に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１８−ＡＬＢ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＡＬＢ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２２５３４〜２２９１２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例１９−Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２２９１３〜２３２５７に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２０−Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２３２５８〜２３２９３に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２１−Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２３２９４〜２３３１６に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２２−Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２３３１７〜２３３２９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２３−Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２３３３０〜２３３９２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２４−Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２３３９３〜２４２４０に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２５−ＡｐｏＣ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２４２４１〜２４６４３に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２６−ＡｐｏＣ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２４６４４〜２４６６８に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２７−ＡｐｏＣ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２４６６９〜２４６７１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２８−ＡｐｏＣ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２４６７２〜２４６７３に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例２９−ＡｐｏＣ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２４６７４〜２４６８５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３０−ＡｐｏＣ３遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＡｐｏＣ３遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２４６８６〜２４９１７に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３１−ＡＳＧＲ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２４９１８〜２６６８５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３２−ＡＳＧＲ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２６６８６〜２６８９１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３３−ＡＳＧＲ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２６８９２〜２６９１５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３４−ＡＳＧＲ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２６９１６〜２６９２７に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３５−ＡＳＧＲ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２６９２８〜２７０１０に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３６−ＡＳＧＲ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＡＳＧＲ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２７０１１〜２８４５０に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３７−ＣＣＲ５遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２８４５１〜２８６５３に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３８−ＣＣＲ５遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２８６５４〜２８６８５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例３９−ＣＣＲ５遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２８６８６〜２８６９９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４０−ＣＣＲ５遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２８７００〜２８７０１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４１−ＣＣＲ５遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２８７０２〜２８７２９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４２−ＣＣＲ５遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＣＣＲ５遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２８７３０〜２９０２９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４３−ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号２９０３０〜３０４９５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４４−ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３０４９６〜３０６５８に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４５−ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３０６５９〜３０７１９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４６−ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３０７２０〜３０７４４に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４７−ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３０７４５〜３０８９７に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４８−ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３０８９８〜３３０３８に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例４９−Ｇ６ＰＣ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
Ｇ６ＰＣ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３３０３９〜３４０５４に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５０−Ｇ６ＰＣ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
Ｇ６ＰＣ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３４０５５〜３４１７１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５１−Ｇ６ＰＣ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
Ｇ６ＰＣ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３４１７２〜３４１９５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５２−Ｇ６ＰＣ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
Ｇ６ＰＣ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３４１９６〜３４２０４に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５３−Ｇ６ＰＣ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
Ｇ６ＰＣ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３４２０５〜３４２９４に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５４−Ｇ６ＰＣ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
Ｇ６ＰＣ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３４２９５〜３５３８９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５５−Ｇｙｓ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
Ｇｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号３５３９０〜４０８８２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５６−Ｇｙｓ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
Ｇｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号４０８８３〜４１５５８に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５７−Ｇｙｓ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
Ｇｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号４１５５９〜４１８３６に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５８−Ｇｙｓ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
Ｇｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号４１８３７〜４１９５０に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例５９−Ｇｙｓ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
Ｇｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号４１９５１〜４２６３０に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６０−Ｇｙｓ２遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
Ｇｙｓ２遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号４２６３１〜５１０６２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６１−ＨＧＤ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５１０６３〜５２７５５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６２−ＨＧＤ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５２７５６〜５２９６９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６３−ＨＧＤ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５２９７０〜５３０５２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６４−ＨＧＤ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５３０５３〜５３０７１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６５−ＨＧＤ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５３０７２〜５３２７２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６６−ＨＧＤ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＨＧＤ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５３２７３〜５５５９７に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６７−Ｌｐ（ａ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
Ｌｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５５５９８〜５９３９２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６８−Ｌｐ（ａ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
Ｌｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５９３９３〜５９８０２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例６９−Ｌｐ（ａ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
Ｌｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５９８０３〜５９９３８に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７０−Ｌｐ（ａ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
Ｌｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５９９３９〜５９９７３に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７１−Ｌｐ（ａ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
Ｌｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号５９９７４〜６０３４１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７２−Ｌｐ（ａ）遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
Ｌｐ（ａ）遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６０３４２〜６４９６２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７３−ＰＣＳＫ９遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６４９６３〜６６９８２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７４−ＰＣＳＫ９遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６６９８３〜６７１６９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７５−ＰＣＳＫ９遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６７１７０〜６７２０５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７６−ＰＣＳＫ９遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６７２０６〜６７２１９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７７−ＰＣＳＫ９遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６７２２０〜６７３５９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７８−ＰＣＳＫ９遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６７３６０〜６９１５３に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例７９−Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号６９１５４〜７０２９１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８０−Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７０２９２〜７０３８４に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８１−Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７０３８５〜７０３９６に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８２−Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７０３９７〜７０３９９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８３−Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７０４００〜７０４５０に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８４−Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７０４５１〜７１２５４に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８５−ＴＦ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７１２５５〜７２０８６に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８６−ＴＦ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７２０８７〜７２１７２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８７−ＴＦ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７２１７３〜７２１８４に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８８−ＴＦ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７２１８５〜７２１９１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例８９−ＴＦ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７２１９２〜７２２３５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例９０−ＴＦ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＴＦ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７２２３６〜７２８７１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例９１−ＴＴＲ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７２８７２〜７３１７１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例９２−ＴＴＲ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７３１７２〜７３２１２に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例９３−ＴＴＲ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７３２１３〜７３２２９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例９４−ＴＴＲ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７３２３０〜７３２３１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例９５−ＴＴＲ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７３２３２〜７３２６６に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例９６−ＴＴＲ遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＴＴＲ遺伝子のエクソン１〜２を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列ＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列番号７３２６７〜７３６６８に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列が、特定された。
実施例９７−ガイド鎖のバイオインフォマティクス分析
候補ガイドは、理論性結合及び実験的に評価された活性の両方を含む、複数のステッププロセスにおいてスクリーニングされ、選択されるであろう。例示のために、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内の部位等の特定のオフターゲット部位を、隣接したＰＡＭと一致させる配列を有する候補ガイドは、意図されるもの以外の染色体上の位置での効果の可能性を評価するために、以下にさらに詳述され、例示されるように、オフターゲット結合を評価するために利用可能な様々なバイオインフォマティクスツールのうちの１つ以上を用いて、同様の配列を有するオフターゲット部位を切断するそれらの可能性について評価され得る。次いで、オフターゲット活性に対して比較的低い可能性を有することが予測される候補は、それらのオンターゲット活性を測定し、次いで様々な部位でオフターゲット活性を測定するために実験的に評価され得る。好ましいガイドは、選択された遺伝子座で所望のレベルの遺伝子編集を達成するために十分に高いオンターゲット活性と、他の染色体遺伝子座で改変の可能性を低減するために比較的低いオフターゲット活性と、を有する。オンターゲット対オフターゲット活性の比は、しばしば、ガイドの「特異性」と称される。
予測されたオフターゲット活性の初期スクリーニングのために、最も可能性が高いオフターゲット部位を予測するために使用することができる、既知であり、公的に入手可能であるいくつかのバイオインフォマティクスツールがあり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ系における標的部位への結合が、相補配列間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合によって動かされるため、相違度（したがって、オフターゲット結合の可能性が低い）は、本質的に一次配列差、ミスマッチ及びバルジ、すなわち、非相補的塩基に変化する塩基、及び標的部位と比較して、潜在的なオフターゲット部位において塩基の挿入または欠失に関連している。ＣＯＳＭＩＤと称される例示的なバイオインフォマティクスツール（ミスマッチ、挿入、及び欠失を有するＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位）（ｃｒｉｓｐｒ．ｂｍｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕのウェブ上で入手可能）は、このような類似性をコンパイルする。他のバイオインフォマティクスツールとしては、ＧＵＩＤＯ、ａｕｔｏＣＯＳＭＩＤ、及びＣＣｔｏｐが挙げられるが、これらに限定されない。
バイオインフォマティクスは、変異及び染色体再配置の有害効果を低減するために、オフターゲット切断を最小限に抑えるために使用された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系における研究は、特に、ＰＡＭ領域からの遠位で塩基対のミスマッチ及び／またはバルジを有するＤＮＡ配列に対してガイド鎖の非特異的ハイブリダイゼーションにより、高いオフターゲット活性を示唆した。（例えば、Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，８２７−８３２（２０１３）、Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３）、Ｃｒａｄｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．Ｊ．，Ａｎｔｉｃｏ，Ｃ．Ｊ．＆ Ｂａｏ，Ｇ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ β−ｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ ＣＣＲ５ ｇｅｎｅｓ ｈａｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１，９５８４−９５９２（２０１３）、Ｌｉｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍｓ ｈａｖｅ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，７４７３−７４８５（２０１４）を参照のこと）。したがって、塩基対ミスマッチに加えて、ＲＮＡガイド鎖とゲノム配列との間の挿入及び／または欠失を有する潜在的なオフターゲット部位を特定し得ることができるバイオインフォマティクスツールを有することは重要である。したがって、バイオインフォマティクスツール、ＣＯＳＭＩＤ（ミスマッチ、挿入、及び欠失を有するＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位）は、潜在的なＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位（ｈｔｔｐ＿ｃｒｉｓｐｒ＿ｂｍｅ＿ｇａｔｅｃｈ＿ｅｄｕのウェブ上で入手可能）に対するゲノムを検索するために使用された。ＣＯＳＭＩＤ出力は、ミスマッチの数及び位置に基づいて潜在的なオフターゲット部位の一覧を順位化し、標的部位のさらに情報を持つ選択を可能にし、オフターゲット切断の可能性が高い部位の使用を避けた。
領域内のｇＲＮＡ標的部位の推定されるオンターゲット及び／またはオフターゲット活性を較量する、さらなるバイオインフォマティクスパイプラインが、用いられた。活性を予測するために使用され得る他の特性は、問題になっている細胞型についての情報、ＤＮＡ接近性、クロマチン状態、転写因子結合部位、転写因子結合データ、及び他のＣＨＩＰ−ｓｅｑデータを含む。編集の有効性、例えば、ｇＲＮＡの対の相対位置及び方向、局所的配列特性、及びマイクロホモロジーを予測する、さらなる要因が、較量される。（例えば、Ｎａｉｔｏ，Ｙ．，Ｈｉｎｏ，Ｋ．，Ｂｏｎｏ，Ｈ．＆ Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｋ．ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ：ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３１，１１２０−１１２３（２０１５）、Ｃｒａｄｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．，Ｑｕｉ，Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．Ｊ．＆ Ｂａｏ，Ｇ．ＣＯＳＭＩＤ：Ａ Ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ｅ２１４（２０１４）、Ｇｕｅｌｌ，Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．＆ Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＲＩＳＰＲ−ＧＡ）．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０，２９６８−２９７０（２０１４）、Ｐｒｙｋｈｏｚｈｉｊ，Ｓ．Ｖ．，Ｒａｊａｎ，Ｖ．，Ｇａｓｔｏｎ，Ｄ．＆ Ｂｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｎ．ＣＲＩＳＰＲ ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔｅｒ：ａ ｗｅｂ ｔｏｏｌ ｔｏ ｆｉｎｄ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ａ ｓｅｔ ｏｆ ｓｉｍｉｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０，ｅ０１１９３７２（２０１５）、Ｍｏｎｔａｇｕｅ，Ｔ．Ｇ．，Ｃｒｕｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｇａｇｎｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．＆ Ｖａｌｅｎ，Ｅ．ＣＨＯＰＣＨＯＰ：ａ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａｎｄ ＴＡＬＥＮ ｗｅｂ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２，Ｗ４０１−４０７（２０１４）、Ｂａｅ，Ｓ．，Ｋｗｅｏｎ，Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．＆ Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｂａｓｅｄ ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，７０５−７０６（２０１４）、Ｂａｅ，Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．＆ Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ：ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｈａｔ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｃａｓ９ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０，１４７３−１４７５（２０１４）、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｍ．，Ｔｈｕｍｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．，Ｄｅｌ Ｓｏｌ Ｋｅｙｅｒ，Ｍ．，Ｗｉｔｔｂｒｏｄｔ，Ｊ．＆ Ｍａｔｅｏ，Ｊ．Ｌ．ＣＣＴｏｐ：Ａｎ Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ，Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｎｄ Ｒｅｌｉａｂｌｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０，ｅ０１２４６３３（２０１５）を参照のこと）。
実施例９８−オフターゲット活性のための細胞中の好ましいガイドの試験
次いで、最低オフターゲット活性を有することが予測されるｇＲＮＡは、ＨＥＫ２９３ＴまたはＫ５６２等のモデル細胞株中のオフターゲット活性に対して試験され、ＴＩＤＥまたは次世代シークエンシングを用いて、インデル頻度に対して評価されるであろう。ＴＩＤＥは、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によって決定される標的遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によってゲノム編集を迅速に評価するためのウェブツールである。２つの標準的なキャピラリーシークエンシング反応からの定量的配列追跡データに基づいて、ＴＩＤＥソフトウェアは、編集の有効性を定量化し、標的化した細胞プールのＤＮＡ中の主要な種類の挿入及び欠失（インデル）を特定する。詳細な説明及び例のために、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１４）を参照のこと。ハイスループットシークエンシングとしても既知である、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、Ｒｏｃｈｅ ４５４シークエンシング、Ｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭシークエンシング、及びＳＯＬｉＤシークエンシングを含む、多くの異なる近代的シークエンシング技術を記載するために使用されるあらゆる状況に対応できる用語である。これらの最新技術は、これまでに使用されたＳａｎｇｅｒシークエンシングよりもはるかに迅速かつ安価にＤＮＡ及びＲＮＡの配列を決定することができ、したがって、ゲノミクス及び分子生物学の研究に革命を起こす。
組織培養細胞のトランスフェクションは、異なる構築物をスクリーニングし、活性及び特異性を試験するロバストな手段を可能にする（Ｃｒａｄｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．，Ｑｕｉ，Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．Ｊ．＆ Ｂａｏ，Ｇ．ＣＯＳＭＩＤ：Ａ Ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ｅ２１４（２０１４））。Ｋ−５６２またはＨＥＫ２９３Ｔ等の組織培養細胞株は、容易にトランスフェクトされ、高い活性をもたらす。これらのまたは他の細胞株は、ＣＤ３４＋と一致する細胞株を決定し、最良の代理物を提供するために評価されよう。次いで、これらの細胞は、多くの初期段階試験のために使用されよう。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のための個々のｇＲＮＡは、ヒト細胞における発現に好適である、プラスミドを用いて細胞にトランスフェクトされるであろう。数日後、ゲノムＤＮＡを採取し、標的部位をＰＣＲによって増幅する。切断活性は、遊離ＤＮＡ末端のＮＨＥＪ修復によって導入される挿入、欠失、及び変異の速度によって測定され得る。この方法は、この方法で切断されていないＤＮＡから正しく修復された配列を分化させることができないが、切断のレベルは、ミス修復によって評価され得る。オフターゲット活性は、特定された推定上のオフターゲット部位を増幅し、切断を検出するために同様の方法を用いることによって観察され得る。転座はまた、特異的切断及び転座が起こるかどうかを決定するために、切断部位に隣接するプライマーを用いてアッセイされ得る。ｇｕｉｄｅ−ｓｅｑを含むオフターゲット切断の相補的試験を可能にする、無誘導アッセイが、開発されている（Ｋｉｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，２３７−２４３，２３１ｐ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ２４３（２０１５）、Ｆｒｏｃｋ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１７９−１８６（２０１５）、Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｕｎｂｉａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ａｎｄ ＴＡＬＥＮｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３，１７５−１７８（２０１５）、Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１４）、Ｋｕｓｃｕ，Ｃ．，Ａｒｓｌａｎ，Ｓ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．，Ｔｈｏｒｐｅ，Ｊ．＆ Ａｄｌｉ，Ｍ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｂｏｕｎｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，６７７−６８３（２０１４））。次いで、有意な活性を有するｇＲＮＡまたはｇＲＮＡの対は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の発現レベルを測定するために、培養細胞中で追跡調査され得る。オフターゲット事象は、再度続き得る。同様に、ＣＤ３４＋細胞は、トランスフェクトされ、遺伝子修正のレベル及び可能なオフターゲット事象が測定され得る。これらの実験は、ヌクレアーゼ及びドナー設計及び送達の最適化を可能にする。
実施例９９−オフターゲット活性のための細胞中の好ましいガイドの試験
次いで、上記の実施例におけるＴＩＤＥ及び次世代シークエンシング研究からの最良のオンターゲット活性を有するｇＲＮＡは、全ゲノムシークエンシングを用いてオフターゲット活性について試験されるであろう。候補ｇＲＮＡは、ＣＤ３４＋細胞またはｉＰＳＣにおいてより完全に評価されるであろう。
実施例１００−ＨＤＲ遺伝子編集のための異なるアプローチの試験
オンターゲット活性及びオフターゲット活性の両方のｇＲＮＡを試験した後、変異修正及びノックイン戦略は、ＨＤＲ遺伝子編集について試験されよう。
変異修正アプローチのために、ドナーＤＮＡ鋳型は、短い一本鎖オリゴヌクレオチド、短い二本鎖オリゴヌクレオチド（無傷のＰＡＭ配列／変異したＰＡＭ配列）、長い一本鎖ＤＮＡ分子（無傷のＰＡＭ配列／変異したＰＡＭ配列）、または長い二本鎖ＤＮＡ分子（無傷のＰＡＭ配列／変異したＰＡＭ配列）として提供されるであろう。加えて、ドナーＤＮＡ鋳型は、ＡＡＶによって送達されよう。
ｃＤＮＡノックインアプローチのいくつかの実施形態のために、セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲ）、１８ｑ１１．２領域、１４ｑ２４．３領域、または１１ｐ１５．４領域に対して相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の４０ｎｔ超の第１のエクソン（第１のコーディングエクソン）、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の完全ＣＤＳ、及びＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の３’ＵＴＲ、及び少なくとも４０ｎｔの以下のイントロンを含み得る。セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲ）、１８ｑ１１．２領域、１４ｑ２４．３領域、または１１ｐ１５．４領域に対して相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の８０ｎｔ超の第１のエクソン、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の完全ＣＤＳ、及びＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の３’ＵＴＲ、及び少なくとも８０ｎｔの以下のイントロンを含み得る。セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲ）、１８ｑ１１．２領域、１４ｑ２４．３領域、または１１ｐ１５．４領域に対して相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の１００ｎｔ超の第１のエクソン、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の完全ＣＤＳ、及びＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の３’ＵＴＲ、及び少なくとも１００ｎｔの以下のイントロンを含み得る。セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲ）、１８ｑ１１．２領域、１４ｑ２４．３領域、または１１ｐ１５．４領域に対して相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の１５０ｎｔ超の第１のエクソン、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の完全ＣＤＳ、及びＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の３’ＵＴＲ、及び少なくとも１５０ｎｔの以下のイントロンを含み得る。セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲ）、１８ｑ１１．２領域、１４ｑ２４．３領域、または１１ｐ１５．４領域に対して相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の３００ｎｔ超の第１のエクソン、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の完全ＣＤＳ、及びＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の３’ＵＴＲ、及び少なくとも３００ｎｔの以下のイントロンを含み得る。セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）、ＡＬＢ、Ａｎｇｐｔｌ３、ＡｐｏＣ３、ＡＳＧＲ２、ＣＣＲ５、ＦＩＸ（Ｆ９）、Ｇ６ＰＣ、Ｇｙｓ２、ＨＧＤ、Ｌｐ（ａ）、Ｐｃｓｋ９、Ｓｅｒｐｉｎａ１、ＴＦ、及びＴＴＲ）、１８ｑ１１．２領域、１４ｑ２４．３領域、または１１ｐ１５．４領域に対して相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の４００ｎｔ超の第１のエクソン、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の完全ＣＤＳ、及びＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の３’ＵＴＲ、及び少なくとも４００ｎｔの以下のイントロンを含み得る。加えて、ＤＮＡ鋳型は、ＡＡＶによって送達されよう。
ｃＤＮＡまたはミニ遺伝子ノックインアプローチのために、９ｐ２１．２に対して相同アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の８０ｎｔ超の第１のエクソン（第１のコーディングエクソン）、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の完全ＣＤＳ、及びＣ９ＯＲＦ７２遺伝子の３’ＵＴＲ、及び少なくとも８０ｎｔの以下のイントロンを含む。加えて、ＤＮＡ鋳型は、ＡＡＶによって送達されよう。
実施例１０１−主なＣｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組み合わせの再評価
ＨＤＲ遺伝子編集のための異なる戦略を試験した後、主なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組み合わせは、欠失、組換え、及びオフターゲット特異性の有効性のために初代ヒト神経細胞中で再評価されよう。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、送達のために脂質ナノ粒子に製剤化され、ｓｇＲＮＡは、ナノ粒子に製剤化またはＡＡＶとして送達され、ドナーＤＮＡは、ナノ粒子に製剤化またはＡＡＶとして送達されよう。
実施例１０２−関連マウスモデルにおけるインビボ試験
最近、正常なヘキサヌクレオチド反復補体または拡大したヘキサヌクレオチド反復のいずれかとともに、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を含有するマウスモデルが、生成された。Ｔｇ（Ｃ９ｏｒｆ７２＿３）株１１２マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号０２３０９９）は、ヒトＣ９ｏｒｆ７２＿３トランス遺伝子のいくつかのタンデムコピーを有し、各コピーが、１００〜１０００反復（［ＧＧＧＧＣＣ］１００〜１０００）を有する。対照として、Ｔｇ（Ｃ９ｏｒｆ７２＿２）株８マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号０２３０８８）は、１５のヘキサヌクレオチド反復（［ＧＧＧＧＣＣ］１５）を有するＣ９ｏｒｆ７２＿２トランス遺伝子を有する。Ｔｇ（Ｃ９ｏｒｆ７２＿３）株１１２及びＴｇ（Ｃ９ｏｒｆ７２＿２）株８からの半接合体マウスは、生存可能であり、増殖に適し、メンデル比で生まれ、１６月齢でいかなる運動または認識の表現型も発現しない。
しかしながら、３月齢までに、半接合体Ｔｇ（Ｃ９ｏｒｆ７２＿３）株１１２動物は、脳の最も神経集団におけるＲＮＡ病巣（ヘキサヌクレオチド反復拡大を含有するヒトＣ９ＯＲＦ７２ ＲＮＡによって形成される）及びポリ（ＧＰ）ジペプチド（反復拡大の非ＡＴＧ開始翻訳に起因する）を示す。Ｎｏ ＲＮＡ病巣またはポリ（ＧＰ）ジペプチド表現型は、半接合体Ｔｇ（Ｃ９ｏｒｆ７２＿２）株８に対して観察される。（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ（２０１５） Ｎｅｕｒｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ ８８，Ｉｓｓｕｅ ５，ｐ８９２−９０１，２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１５ 「Ｃ９ｏｒｆ７２ ＢＡＣ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｙｐｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ＡＬＳ／ＦＴＤ」）。
ｇＲＮＡは、Ｃ９ＯＲＦ７２においてヘキサヌクレオチド反復拡大を改変し、表現型の変化、例えば、ＲＮＡ病巣及び反復関連の非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳ジペプチドの抑制または緩和、ならびに半接合体Ｔｇ（Ｃ９ｏｒｆ７２＿３）株１１２動物において示される結果として生じた改変されたヌクレオリン分布及び核機能不全の抑制または緩和を行う、それらの能力を評価するために、動物において試験されよう。
実施例１０３−Ｃ９ＯＲＦ７２のインビトロ転写
Ｃ９ＯＲＦ７２ ＤＮＡ標的領域を編集することができる大きなスペクトルの一対のｇＲＮＡを特定するために、インビトロ転写（ＩＶＴ）のｇＲＮＡスクリーニングを行った。Ｃ９ＯＲＦ７２ゲノム配列は、ａ ｇＲＮＡ設定ソフトウェアを用いて分析のために提示された。結果として得られたｇＲＮＡの表は、配列の特異性（ゲノム中で他にスクリーニングされた完全一致しないｇＲＮＡのみ）に基づいて約２００ ｇＲＮＡの一覧表（表３を参照のこと）に狭め、最小限にオフターゲットを予測した。
Figure 0006947729
Figure 0006947729
Figure 0006947729
Figure 0006947729
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表３中のｇＲＮＡは、インビトロ転写され、Ｃａｓ９を構造的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にメッセンジャーＭａｘを用いてトランスフェクトされた。細胞を、トランスフェクトから４８時間後に採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断効率は、ＴＩＤＥ分析を用いて評価された。（図１）。約２５％の試験したｇＲＮＡが８０％を超える切断効率を誘導したことが見出された。
例示的な実施形態に関する注記
本開示は、本発明の様々な態様及び／またはその潜在的用途を示す目的のために様々な特定の態様の説明を提供するが、変形及び修飾が当業者に生じるであろうことが理解されよう。したがって、本明細書に記載される本発明（複数可）は、少なくともそれらが特許請求されるものと同じく広範で、本明細書に提供される特定の例示的な態様によってより狭く定義されないことが理解されるべきである。
本明細書に特定されるあらゆる特許、刊行物、または他の開示材料は、特に記載のない限り、組み込まれた材料が、本明細書に明示的に記載される既存の説明、定義、声明、または他の開示材料と矛盾しない程度にまで、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、必要な程度まで、本明細書に記載される本開示は、参照により組み込まれた任意の矛盾した材料に優先する。参照により組み込まれると言われているが、本明細書に記載される既存の定義、声明、または他の開示材料と矛盾する、任意の材料、またはこれらの一部は、組み込まれた材料と既存の開示材料との間に生じる矛盾がない程度までのみ組み込まれる。出願者らは、本明細書において参照により組み込まれる任意の主題またはその一部を明示的に列挙するために本明細書を修正する権利を留保する。

Claims (12)

  1. ゲノム編集によってヒト細胞におけるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を編集するためのex vivo方法であって、前記細胞に、１又は複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、及び１又は複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入して、前記Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍で、或いは前記Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列内もしくはその近傍で１又は複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こし、これが前記Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらし、そして前記Ｃ９ＯＲＦ７２タンパク質活性の復元をもたらし、
    ここで前記１又は複数のｇＲＮＡが、配列番号２６６９、２６７３、２６８１、２６８７、２６８９、２６９４、２６９７、２６９８、２７０１、２７５５、２７５８、２７６３、２７８５、２８０５、３３４１、３３４４、３４０３、３４０４、３４０５、３４１０、３４２１、３４２２、３４３０、３４３２、３４３５、３４３７、３４６４、３４７２、３４７５、３４７９、３４８５、３４９６、３５０３、３５１９、３５２３、３５２４、３５３１、３５３４、３５４２、３５４９、３５５６、３５５８、及び３５９２からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、前記方法。
  2. ゲノム編集によってヒト細胞におけるＣ９ＯＲＦ７２遺伝子を挿入するためのex vivo方法であって、以下の工程：
    前記ヒト細胞に、１又は複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ及び１又は複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入して、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で１又は複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こし、これが前記Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子またはミニ遺伝子の永久挿入をもたらし、そして前記Ｃ９ｏｒｆ７２タンパク質活性の復元をもたらし、
    ここで、前記１又は複数のｇＲＮＡが、配列番号２６６９、２６７３、２６８１、２６８７、２６８９、２６９４、２６９７、２６９８、２７０１、２７５５、２７５８、２７６３、２７８５、２８０５、３３４１、３３４４、３４０３、３４０４、３４０５、３４１０、３４２１、３４２２、３４３０、３４３２、３４３５、３４３７、３４６４、３４７２、３４７５、３４７９、３４８５、３４９６、３５０３、３５１９、３５２３、３５２４、３５３１、３５３４、３５４２、３５４９、３５５６、３５５８、及び３５９２からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、前記方法。
  3. 前記１又は複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、１又は複数のポリヌクレオチドにコードされる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記１又は複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、１又は複数のリボ核酸（ＲＮＡ）にコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記１又は複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、タンパク質又はポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記１又は複数のｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記１又は複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ及び１又は複数のｇＲＮＡが、どちらも各々別々に脂質ナノ粒子に剤形されるか、又はすべてが脂質ナノ粒子に一緒に剤形される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記１又は複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、脂質ナノ粒子に剤形され、そして前記１又は複数のｇＲＮＡが、ウイルスベクターによりデリバリーされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ６ベクターである、請求項９に記載の方法。
  11. 配列番号２６６９、２６７３、２６８１、２６８９、２６９７、２６９８、２７５５、２７５８、２７６３、２７８５、２８０５、３３４１、３３４４、３４０３、３４０４、３４０５、３４１０、３４２１、３４２２、３４３０、３４３２、３４３５、３４３７、３４６４、３４７２、３４７５、３４７９、３４８５、３４９６、３５０３、３５１９、３５２３、３５２４、３５３１、３５３４、３５４２、３５４９、３５５６、３５５８、及び３５９２から選ばれるスペーサー配列を含む、１又は複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）。
  12. 前記１又は複数のｇＲＮＡが、１又は複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１１に記載の１又は複数のｇＲＮＡ。
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