KR20180118111A - 근위축성 측색 경화증 및/또는 전두측두엽 퇴행의 치료 물질 및 방법 - Google Patents

근위축성 측색 경화증 및/또는 전두측두엽 퇴행의 치료 물질 및 방법 Download PDF

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차드 알버트 코완
에이미 메다 카바디
안테 스벤 룬드버그
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Abstract

본원은, 생체외 및 생체내 양쪽, 근위축성 측색 경화증 (ALS) 및/또는 전두측두엽 퇴행 (FTLD)을 가진 환자의 치료 물질 및 방법을 제공한다. 게다가, 본원은 게놈 편집에 의해 세포에서 C9ORF72 유전자의 발현, 기능 또는 활성을 조절하기 위한 편집 물질 및 방법을 제공한다.

Description

근위축성 측삭 경화증 및/또는 전측두엽성 소엽성 변성의 치료를 위한 물질과 방법
관련 출원
본원은, 2015년 12월 23일 출원된, 미국 가출원 번호 62/387,424; 및 2016년 4월 18일 출원된 미국 가출원 번호 62/324,281의 권리를 주장하고; 이들 각각의 내용은 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입된다.
분야
본원은, 양쪽 생체외 및 생체내, 근위축성 측색 경화증 (ALS) 및/또는 전두측두엽 퇴행 (FTLD)을 가진 환자의 치료 물질 및 방법을 제공한다. 게다가, 본원은 게놈 편집에 의해 세포에서 C9ORF72 유전자의 발현, 기능 또는 활성을 조절하기 위한 편집 물질 및 방법을 제공한다.
서열 목록의 참고에 의한 편입
본원은, 본 명세서에서 참고로 그 전문이 편입되고 본 개시내용의 일부를 형성하는, 컴퓨터 판독가능한 형태로 (파일명: 50316A_SeqListing.txt; 14,785,573 바이트 - ASCII 텍스트 파일; 2016년 12월 21일 작성됨) 서열 목록을 함유한다.
배경
근위축성 측색 경화증 (ALS)는, 전형적으로 증상 개시의 2 내지 3년 내에, 호흡 부전부터 사망에 이르는 진행성 마비에 의해 임상적으로 특성규명된 치명적 신경퇴행성 질환이다 (Rowland and Shneider, N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700). ALS는 서방 세계에서 제3의 가장 흔한 신경퇴행성 질환이다 (Hirtz 등, Neurology, 2007, 68, 326-337). 사례의 대략 10%는 사실상 가족성이고, 반면에 상기 질환으로 진단된 환자의 대부분은, 이들이 모집단 내내 무작위로 발생하는 것처럼 보이기 때문에, 산발적으로서 분류된다 (Chio 등, Neurology, 2008, 70, 533-537). ALS 및 전두측두엽 치매가 질환의 중첩 연속체를 나타내는 임상, 유전적, 및 유행병 데이터에 기반하여, 중추 신경계 내내 TDP-43 양성 내포물의 존재를 병리적으로 특징으로 하는 인식이 성장하고 있다 (Lillo and Hodges, J. Clin. Neurosci, 2009, 16, 1131-1135; Neumann 등, Science, 2006, 314, 130-133).
현재까지, 수많은 유전자는 고전적 가족성 ALS, 예를 들어, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN, 및 VCP에 대하여 원인으로서 발견되어 왔다 (Johnson 등, Neuron, 2010, 68, 857-864; Kwiatkowski 등, Science, 2009, 323, 1205-1208; Maruyama 등, Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen 등, Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan 등, Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance 등, Brain, 2009, 129, 868-876). 과거 10 년 넘게, ALS, FTD, 및 ALS-FTD의 다중 사례를 포함하는 가계도의 연결 분석은, 현재 C9orf72로서 공지되는, 염색체 9의 짧은 아암에서 질환용 중요한 유전자좌를 확인하였다 (Boxer 등, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2011, 82, 196-203; Morita 등, Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson 등 J. Neurol., 2011, 258, 647-655; Vance 등, Brain, 2006, 129, 868-876).
전두측두엽 퇴행 (FTLD)는, 두정 및 후두엽을 아끼면서, 대뇌의 측두엽의 전측 부분 및 전두엽에서 회백질의 퇴행을 포함하는 신경퇴행성 질환의 한 유형이다. FTLD는 알츠하이머병후 치매의 제2의 가장 통상적인 형태이고, 따라서 노인에 있어서 신경학적 문제의 주요 원인이다. FTLD의 증후군은 전두측두 치매 (FTD)의 임상 하위그룹, 운동 뉴런 질환 (MND), 의미 치매 및 원발 진행 실어증을 동반한 FTD를 포함하고, 기억 및 지각을 비교적 보존하면서, 행동, 인격 및 언어에서 변화를 특징으로 한다.
병리적으로, FTLD와 관련된 2개의 주요 조직학적 프로파일이 있다. 이들 중 하나는, 뉴런에서, 그리고 가끔 신경교에서, 하이퍼인산화된 타우의 축적인, 타우병증이다. 그러나, 전체 사례의 절반을 충분히 넘게 차지하는, FTLD와 관련된 가장 흔한 신경병리학은 FTLD-U로서 공지되고, 여기에서 타우에 대한 것이 아닌, 유비퀴틴 (ub-ir)에 대하여 면역반응성인 뉴런의 세포질 내포물 및 신경돌기가 있다. 이러한 유형의 FTLD 병리학은 운동 뉴런 질환 (MND) 및 치매를 가진 환자에서 최초 기재되었지만, 후속적으로 운동 증상 없는 환자에서 FTLD의 통상 신경병리 피쳐로서 인식되어 왔다. 이러한 ub-ir 병리학은 특징적으로 해마의 덴테이트 근막의 과립 세포에서 그리고 전두 및 측두 신피질의 층 2의 뉴런에서 찾아진다.
현재, ALS의 치료용 시장에서 단 하나의 FDA 승인된 의약품, Rilutek (릴루졸)이 있다. 그러나, 작용 기전은 저조하게 이해된다. 약물은 뇌에서 글루타메이트의 수준 감소에 의해 일부 사람에 있어서 질환의 진행을 느리게 한다고 생각된다.
C9orf72 (염색체 9 열린 해독틀 72)는, 인간에 있어서, 유전자 C9ORF72에 의해 인코딩되는 단백질이다. 인간 C9ORF72 유전자는, 염기쌍 27,546,542부터 염기쌍 27,573,863까지, 염색체 9 열린 해독틀 72의 짧은 (p) 아암에서 위치한다. 그것의 세포유전적 위치는 9p21.2이다. 단백질은 뇌의 많은 영역에서, 뉴런의 세포질에서, 뿐만 아니라 시냅스전 말단에서 발견된다. 유전자에서 질환 유발 돌연변이는 2011년에 2개의 독립 연구 팀에 의해 최초 발견되었다 (DeJesus-Hernandez 등 (2011) Neuron 72 (2): 245-56; Renton 등 (2011). Neuron 72 (2): 257-68). C9ORF72에서 돌연변이는 FTLD와 ALS 사이 유전적 연결이 있는 것으로 확인된 최초 병원성 기전이기 때문에 유의미하다. 2012년 현재, 가족성 FTLD 및/또는 ALS와 관련되는 것이 확인된 가장 흔한 돌연변이이다.
C9ORF72의 돌연변이는 뉴클레오타이드 GGGGCC의 6개 문자 열의 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장이다. 건강한 개체에서, 이러한 헥사뉴클레오타이드의 소수 반복부, 전형적으로 30개가 있지만, 이환 표현형을 가진 사람에 있어서, 상기 반복부는 수백의 정도로 발생할 수 있다 (Fong 등 (2012) Alzheimers Res Ther 4 (4): 27). C9ORF72 유전자에서 헥사뉴클레오타이드 확장 이벤트는 가족성 ALS의 대략 40% 및 산발적 ALS 환자의 8-10%에서 존재한다. 헥사뉴클레오타이드 확장은 C9ORF72 유전자의 대안적으로 스플라이싱된 인트론 1에서 발생하고, 그대로 코딩 서열 또는 수득한 단백질을 변경시키지 않는다. C9ORF72의 3개의 대안적으로 스플라이싱된 변이체 (V1, V2 및 V3)은 정상적으로 생산된다. 확장된 뉴클레오타이드 반복부는 V1의 전사를 감소시키는 것으로 나타났지만, 생산된 단백질의 총량은 영향받지 않았다 (DeJesus-Hernandez 등 (2011), Neuron 72 (2): 245-56). 전반적으로, C9ORF72의 감소된 단백질 수준은 ALS/FTD의 원인으로서 단배수-결손을 시사하는 ALS 환자로부터 뇌 부검에서 관측되어 왔다 (Waite (2014) Neurobiol Aging, 35 1779 e1775-1779 e1713). 그러나, C9orf72 단백질의 생리적 기능은 저조하게 이해되고 뉴런 특이적 녹아웃 마우스는 단배수-결손이 질환 기전에 상당히 기여하는 것 같지 않은 병리학 (Koppers (2015), Ann Neurol, 78:426-438) 같은 질환을 발생하지 않는다.
단배수-결손에 더하여, C9ORF72 헥사뉴클레오타이드 확장이 FTD 및/또는 ALS를 야기하는 방식에 대하여 다른 이론이 있다. 또 다른 이론은 핵 및 세포질에서 GC 풍부 RNA의 축적이 독성이 되고, RNA 결합 단백질 격리가 발생한다는 것이다. 최근에 증가된 주목을 얻은, 비-코딩 반복부 확장 장애의 공통 피쳐는 이환된 세포의 핵 및/또는 세포질에서 RNA 응집체로서 반복된 뉴클레오타이드로 구성된 RNA 단편의 축적이다 (Todd and Paulson, 2010, Ann. Neurol. 67, 291-300). 몇 개의 장애에서, RNA 응집체는 RNA-결합 단백질을 격리시켜, 대안적인 mRNA 스플라이싱의 조절장애로 이어진다는 것으로 나타났다. 그와 같은 RNA 응집체의 특질은 중추 신경계 내내 TDP-43 양성 내포물이다 (Lillo and Hodges, J. Clin. Neurosci, 2009, 16, 1131-1135; Neumann 등, Science, 2006, 314, 130-133).
추가의 이론은 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부를 함유하는 C9ORF72 유전자로부터 전사된 RNA가 비-ATG 개시된 기전을 통해 번역되는 것이다. 이것은 돌연변이에서 다중 리보솜 해독틀에 상응하는 디펩타이드 반복부 단백질의 형성 및 축적을 구동시킨다. 반복부는 반복부-유도된 독성을 야기하는 디펩타이드 반복부 (DPR) 단백질로 번역된다. DPRs는 프로테아솜을 억제시키고 다른 단백질을 격리시킨다. C9ORF72에서 GGGGCC 반복부 확장은 몇 개의 가능한 기전을 통해 핵세포질 수송을 손상시킬 수 있다 (Edbauer, Current Opinion in Neurobiology 2016, 36:99-106).
종래에, ALS의 가족성 및 산발적 사례는 임상적으로 구별할 수 없었고, 이는 진단을 어렵게 하였다. 이러한 유전자의 확인은 따라서 가족성 ALS의 미래의 진단에서 도움이 될 것이다. 느린 진단은 또한 FTD에 공통이고, 이는 종종 또 다른 병태로 초기에 오진된 많은 환자에게 최대 1 년 걸릴 수 있다. 질환을 야기한다고 공지되는 특이적 유전자에 대한 시험은 더 빠른 진단으로 도움이 될 것이다. 가장 중요하게, 이러한 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장은 양쪽 가족성 FTD 및 가족성 ALS를 치료하기 위한 요법 개발에 대하여 극도로 유망한 미래의 표적이다.
게놈 공학기술은 살아있는 유기체의 유전적 정보 (게놈)의 표적화된, 특이적 변형에 대하여 전략 및 기술을 지칭한다. 게놈 공학기술은, 특히 인간 건강의 영역; 예를 들어, 유해한 돌연변이를 운반하는 유전자의 정정에서, 또는 유전자의 기능을 탐구하기 위해 광범위한 가능한 적용 때문에 연구 분야에서 매우 활발하다. 살아있는 세포 속에 이식유전자를 삽입하기 위해 개발된 초기 기술은 종종 게놈 속에 신규한 서열의 삽입의 랜덤성에 의해 제한되었다. 게놈 속에 랜덤 삽입은 중증의 원치않는 효과를 유발시키는 인접하는 유전자의 정상 조절의 파괴를 초래할 수 있다. 더욱이, 랜덤 통합 기술은, 서열이 2개의 상이한 세포내 동일한 장소에서 삽입될 보장이 없음에 따라, 거의 재현성을 제공하지 못한다. 최근 게놈 공학기술 전략, 예컨대 ZFNs, TALENs, HEs 및 MegaTALs는 DNA의 특정 영역을 변형되도록 하여, 이로써 초기 기술에 비교된 정정 또는 삽입의 정확성을 증가시킨다. 이들 새로운 플랫폼은 훨씬 더 큰 정도의 재현성을 제공한다.
ALS 및 FTLD를 다루기 위해 노력하는 전세계적인 연구자 및 의료 전문가로부터 노력에도 불구하고, 그리고 게놈 공학기술 접근법의 전망에도 불구하고, ALS 및 FTLD에 대하여 안전한 및 효과적인 치료 개발에 대하여 핵심 필요성이 여전히 남아있다.
현재, ALS 및 FTLD를 다루는 모든 요법은, 질환의 치유보다는, 질환의 진행을 느리게 하는데 목표한다. 그에 반해서, 본 발명은 질환의 유전적 기반을 정정하기 위한 접근법을 나타낸다. 단일 치료로 C9ORF72 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장을 회복할 수 있는 게놈에 영구 변화를 창출하기 위한 게놈 공학기술 도구를 이용함으로써, 수득한 요법은 질환 진행을 완전히 멈출 수 있다.
요약
근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 치료하기 위해 사용될 수 있는, 게놈 편집 및 C9orf72 단백질 활성 회복에 의해 세이프 하버 유전자좌 속에 C9ORF72 cDNA 또는 미니유전자의 녹-인 또는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 결실, 삽입 또는 정정에 의해 게놈에 영구 변화의 세포성, 생체외 및 생체내 창출 방법, 뿐만 아니라 그와 같은 방법 수행을 위한 성분, 키트 및 조성물, 그리고 그들에 의해 생산된 세포가 본 명세서에서 제공된다.
게놈 편집에 의해 인간 세포에서 C9ORF72 유전자의 편집 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 C9ORF72 유전자의 발현 또는 기능을 작용시키는 또는 상기 이내 또는 근처 1개 이상의 돌연변이 또는 엑손의 발현 또는 기능의 영구 삽입, 정정, 또는 조절의 적어도 하나를 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9ORF72 유전자의 영구 삽입을 초래하고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 인간 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입시키는 단계를 포함한다.
또한 게놈 편집에 의해 인간 세포에서 C9ORF72 유전자 삽입 방법이 본 명세서에서 제공되고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: C9ORF72 유전자 또는 미니유전자의 영구 삽입을 초래하는, 그리고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 인간 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 단계.
하나의 측면에서, C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 또는 C9ORF72 유전자 또는 미니유전자의 영구 삽입, 및 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함하는 게놈 편집에 의해 인간 세포에서 C9ORF72 유전자의 편집 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 하기의 단계를 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다: 환자 특이적 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 창출하는 단계; iPSC의 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 iPSC의 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 iPSC의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계; 게놈 편집된 iPSC를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키는 단계; 및 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 환자에 임플란팅하는 단계.
일부 구현예에서, 환자 특이적 유도 만능 줄기 세포를 창출하는 단계는 하기를 포함한다: 체세포를 환자로부터 단리시킴; 및 일련의 다능성-관련 유전자를 체세포에 도입시켜 세포를 만능 줄기 세포가 되도록 유도함. 일부 구현예에서, 체세포는 섬유아세포이다. 일부 구현예에서, 다능성-관련 유전자의 세트는 OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NANOG 및 cMYC로 구성되는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자이다.
C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손의 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자의 발현 또는 기능을 작용시키는 또는 상기 이내 또는 근처 1개 이상의 돌연변이 또는 엑손의 발현 또는 기능의 영구 삽입, 정정, 또는 조절을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 또는 C9ORF72 유전자의 영구 삽입을 초래하고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 iPSC 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2.
일부 구현예에서, iPSC의 C9ORF72 유전자를 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 iPSC 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 게놈 편집된 iPSC를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키는 단계는 1개 이상의 하기를 포함한다: 소분자의 조합으로 치료 또는 마스터 전사 인자의 전달.
일부 구현예에서, 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 환자에 임플란팅하는 단계는 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 하기의 단계를 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다: 백혈구를 환자로부터 단리시키는 단계; 백혈구의 C9ORF72 유전자를 편집하는 단계; 및 편집된 백혈구를 환자에 임플란팅하는 단계.
일부 구현예에서, 백혈구를 단리시키는 단계는 하기를 포함한다: 세포 분별 원심분리 및 세포 배양.
C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손의 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자의 발현 또는 기능을 작용시키는 또는 상기 이내 또는 근처 1개 이상의 돌연변이 또는 엑손의 발현 또는 기능의 영구 삽입, 정정, 또는 조절을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 또는 C9ORF72 유전자의 영구 삽입을 초래하고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 백혈구 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2.
일부 구현예에서, 신경 세포의 C9ORF72 유전자를 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 신경 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 백혈구를 환자에 임플란팅하는 단계는 백혈구를 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 하기의 단계를 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다: 임의로, 환자의 골수의 생검을 수행하는 단계; 간엽 줄기 세포를 단리시키는 단계; C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 줄기 세포의 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 C9ORF72 유전자의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계; 줄기 세포를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키는 단계; 및 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 환자에 임플란팅하는 단계.
일부 구현예에서, 간엽 줄기 세포를 단리시키는 단계는 하기를 포함한다: 골수의 흡인 및 Percoll™을 이용하는 밀도 원심분리에 의한 간엽 세포의 단리.
C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손의 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자의 발현 또는 기능을 작용시키는 또는 상기 이내 또는 근처 1개 이상의 돌연변이 또는 엑손의 발현 또는 기능의 영구 삽입, 정정, 또는 조절을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 또는 C9ORF72 유전자의 영구 삽입을 초래하고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 간엽 줄기 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2.
일부 구현예에서, 줄기 세포의 C9ORF72 유전자를 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 줄기 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 줄기 세포를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키는 단계는 게놈 편집된 줄기 세포를 신경 세포로 분화시키기 위해 1개 이상의 하기를 포함한다: 소분자의 조합으로 치료 또는 마스터 전사 인자의 전달.
일부 구현예에서, 세포를 환자에 임플란팅하는 단계는 세포를 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 하기의 단계를 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다: 임의로 환자를 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF)로 치료하는 단계; 조혈 전구 세포를 환자로부터 단리시키는 단계;C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 조혈 전구 세포의 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 조혈 전구 세포의 C9ORF72 유전자의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계; 및 세포를 환자에 임플란팅하는 단계.
일부 구현예에서, 환자를 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF)로 치료하는 단계는 Plerixaflor와 조합으로 수행된다.
일부 구현예에서, 조혈 전구 세포를 환자로부터 단리시키는 단계는 CD34+ 세포를 단리시키는 것을 포함한다.
C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손의 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자의 발현 또는 기능을 작용시키는 또는 상기 이내 또는 근처 1개 이상의 돌연변이 또는 엑손의 발현 또는 기능의 영구 삽입, 정정, 또는 조절을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 또는 C9ORF72 유전자의 영구 삽입을 초래하고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 조혈 전구 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2.
일부 구현예에서, 조혈 전구 세포의 C9ORF72 유전자를 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 줄기 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정 그리고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 C9ORF72 유전자의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포를 환자에 임플란팅하는 단계는 신경 세포를 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 환자의 세포에서 C9ORF72 유전자를 편집하는 단계를 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체내 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다.
C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계 또는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손의 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자의 발현 또는 기능을 작용시키는 또는 상기 이내 또는 근처 1개 이상의 돌연변이 또는 엑손의 발현 또는 기능의 영구 삽입, 정정, 또는 조절을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 또는 C9ORF72 유전자의 영구 삽입을 초래하고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR. 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2.
일부 구현예에서, 환자의 세포에서 C9ORF72 유전자를 편집하는 단계는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
일부 생체내 구현예에서, 세포는 신경 세포, 골수 세포, 조혈 전구 세포, 또는 CD34+ 세포이다.
일부 구현예에서, 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로서 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제; 또는 이의 동족체, 코돈-최적화된, 또는 변형된 버전이다.
일부 구현예에서, 방법은 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포 속으로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 1개 이상의 리보헥산 (RNAs)를 세포 속으로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 1개 이상의 RNAs는 1개 이상의 변형된 폴리뉴클레오타이드 또는 1개 이상의 변형된 RNAs이다.
일부 구현예에서, 방법은 세포 속으로 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 상기 DNA 엔도뉴클레아제는 단백질 또는 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, 방법은 세포 속으로 1개 이상의 가이드 리보헥산 (gRNAs)를 도입하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 1개 이상의 gRNAs는 단일-분자 가이드 RNA (sgRNAs)이다. 일부 구현예에서, 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs는 1개 이상의 변형된 gRNAs 또는 1개 이상의 변형된 sgRNAs이다.
일부 구현예에서, 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs와 사전-복합체화된다.
일부 구현예에서, 방법은 야생형 C9ORF72 유전자 또는 cDNA의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트를 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 C9ORF72 유전자 또는 cDNA의 일부는 전체 C9ORF72 유전자 또는 cDNA, 또는 천연 변이체 1, 변이체 2, 또는 변이체 3의 cDNA이다. 일부 구현예에서, 공여체 템플레이트는 어느 한쪽 단일 또는 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 공여체 템플레이트는 9p21.2 영역에 상동성 아암을 갖는다.
일부 구현예에서, 방법은 야생형 C9ORF72 유전자의 적어도 한 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트 및 1개 가이드 리보헥산 (gRNA)를 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 코돈-최적화된 또는 변형된 C9ORF72 유전자의 적어도 한 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트 및 1개 가이드 리보헥산 (gRNA)를 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 유전자좌 또는 세이프 하버 유전자좌에 C9ORF72 유전자 근위의 염색체 DNA의 일부의 영구 삽입 또는 정정, 그리고 여기서 상기 gRNA는 유전자좌 또는 세이프 하버 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함하고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 DSB 유전자좌에서 염색체 DNA 속으로 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트로부터 신규한 서열의 삽입을 용이하게 하는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 유전자좌에서 1개 단일-가닥 절단 (SSB) 또는 1개 이중-가닥 절단 (DSB)를 발효시키는 1개 이상의 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 근위는 DSB 유전자좌의 양쪽 업스트림 및 다운스트림 뉴클레오타이드를 의미한다.
일부 구현예에서, 방법은 야생형 C9ORF72 유전자의 적어도 한 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트 및 2개 가이드 리보헥산 (gRNAs)을 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는, C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 또는 C9ORF72 유전자의 조절요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 5' 유전자좌와 3' 유전자좌 사이 염색체 DNA의 영구 삽입 또는 정정을 초래하는 5' 유전자좌와 3' 유전자좌 사이 염색체 DNA 속으로 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트로부터 신규한 서열의 삽입을 용이하게 하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 또는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처, 적어도 2개 (예를 들면, 한 쌍)의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 한 쌍의 이중-가닥 절단 (DSBs), 5' 유전자좌에서 첫번째 및 3' 유전자좌에서 두번째를 발효 또는 창출시키는 2개 이상의 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이고, 여기서 상기 제1 가이드 RNA는 5' 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함하고 제2 가이드 RNA는 3' 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 1개 또는 2개 gRNAs는 1개 또는 2개 단일-분자 가이드 RNA (sgRNAs)이다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개 gRNAs 또는 1개 또는 2개 sgRNAs는 1개 또는 2개 변형된 gRNAs 또는 1개 또는 2개 변형된 sgRNAs이다.
일부 구현예에서, 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 또는 2개 gRNAs 또는 1개 또는 2개 sgRNAs와 사전-복합체화된다.
일부 구현예에서, 야생형 C9ORF72 유전자 또는 cDNA의 일부는 전체 C9ORF72 유전자 또는 cDNA; 천연 변이체 1, 변이체 2, 또는 변이체 3의 cDNA; 또는 약 30 헥사뉴클레오타이드 반복부이다.
일부 구현예에서, 공여체 템플레이트는 어느 한쪽 단일 또는 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 공여체 템플레이트는 9p21.2 영역에 상동성 아암을 갖는다.
일부 구현예에서, DSB, 또는 5' DSB 및 3' DSB는 C9ORF72 유전자의 제1 인트론에서이다.
공여체 템플레이트는 어느 한쪽 단일 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 공여체 템플레이트는 세이프 하버 유전자좌에 상동성 아암, 예컨대, 예를 들어, AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입 또는 정정은 상동 직접 수선 (HDR)에 의한 것이다.
일부 구현예에서, 방법은 세포 속으로 2개 가이드 리보헥산 (gRNAs)를 도입하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 5' DSB 유전자좌와 3' DSB 유전자좌 사이 염색체 DNA의 영구 결실을 초래하는 5' DSB 유전자좌와 3' DSB 유전자좌 사이 염색체 DNA의 결실을 야기하는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 한 쌍의 이중-가닥 절단 (DSBs), 5' DSB 유전자좌에서 첫번째 및 3' DSB 유전자좌에서 두번째를 발효시키는 2개 이상의 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이고, 여기서 상기 제1 가이드 RNA는 5' DSB 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함하고 제2 가이드 RNA는 3' DSB 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 2개 gRNAs는 2개 단일-분자 가이드 RNA (sgRNAs)이다. 일부 구현예에서, 2개 gRNAs 또는 2개 sgRNAs는 2개 변형된 gRNAs 또는 2개 변형된 sgRNAs이다.
일부 구현예에서, 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 또는 2개 gRNAs 또는 1개 또는 2개 sgRNAs와 사전-복합체화된다.
일부 구현예에서, 양쪽 5' DSB 및 3' DSB는 어느 한쪽 C9ORF72 유전자의 제1 엑손, 제1 인트론, 또는 제2 엑손 내 또는 근처이다.
일부 구현예에서, 결실은 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 결실이다.
일부 구현예에서, Cas9 또는 Cpf1 mRNA, gRNA, 및 공여체 템플레이트는 어느 한쪽 지질 나노입자로 별도로 각각 제형화되거나 지질 나노입자로 모두 공-제형화된다.
일부 구현예에서, Cas9 또는 Cpf1 mRNA, gRNA, 및 공여체 템플레이트는 별개의 엑소좀으로 제형화되거나 엑소좀으로 공-제형화된다.
일부 구현예에서, Cas9 또는 Cpf1 mRNA는 지질 나노입자로 제형화되고, 양쪽 gRNA 및 공여체 템플레이트는 바이러스 벡터에 의해 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV6 벡터이다.
Cas9 또는 Cpf1 mRNA는 지질 나노입자로 제형화될 수 있고, gRNA는 전기천공에 의해 세포에 전달될 수 있고 공여체 템플레이트는 바이러스 벡터에 의해 세포에 전달될 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터일 수 있다. AAV 벡터는 AAV6 벡터일 수 있다.
일부 구현예에서, C9ORF72 유전자는 하기에서 위치한다: 염색체 9: 27,546,542 - 27,573,863 (Genome Reference Consortium - GRCh38/hg38).
일부 구현예에서, C9orf72 단백질 활성의 회복은 야생형 또는 정상 C9orf72 단백질 활성에 비교된다.
또 다른 측면에서, 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자로부터 세포에서 C9ORF72 유전자 편집을 위하여 서열 식별 번호: 1-18807내 핵산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 스페이서 서열을 포함하는 1개 이상의 가이드 리보헥산 (gRNAs)이 본 명세서에서 제공된다. 일부 구현예에서, 1개 이상의 gRNAs는 1개 이상의 단일-분자 가이드 RNAs (sgRNAs)이다. 일부 구현예에서, 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs는 1개 이상의 변형된 gRNAs 또는 1개 이상의 변형된 sgRNAs이다.
근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자로부터 세포에서 세이프 하버 유전자좌 편집을 위하여 서열 식별 번호: 18810-73668내 핵산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 스페이서 서열을 포함하는 1개 이상의 가이드 리보헥산 (gRNAs)가 또한 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1개 이상의 gRNAs는 1개 이상의 단일-분자 가이드 RNAs (sgRNAs)이다. 일부 구현예에서, 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs는 1개 이상의 변형된 gRNAs 또는 1개 이상의 변형된 sgRNAs이다.
C9ORF72 유전자 이내 1개 이상의 돌연변이를 영구적으로 정정하기 위해, 그리고 C9orf72 단백질 활성을 회복하기 위해 이전의 방법에 의해 변형되고 있는 세포가 또한 본 명세서에서 제공된다. ALS 또는 FTLD 환자에 이전의 방법에 의해 변형되고 있는 세포의 투여에 의해 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)의 완화 방법이 추가로 본 명세서에서 제공된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 1개 이상의 변형된 가이드 리보헥산 (gRNAs)를 포함한다. 변형의 비-제한 예는 당의 2' 위치에서 변형된 1개 이상의 뉴클레오타이드, 일부 구현예에서 2'-O-알킬, 2'-O-알킬-O-알킬, 또는 2'-플루오로-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 변형은 피리미딘, 염기소실 잔기, 데스옥시 뉴클레오타이드, 또는 RNA의 3' 단부에서 역전된 염기의 리보오스에서 2'-플루오로, 2'-아미노 또는 2' O-메틸 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 1개 이상의 변형된 가이드 리보헥산 (gRNAs)는 변형된 gRNA를 원상태 올리고뉴클레오타이드보다 뉴클레아제 소화에 더욱 저항성으로 만드는 변형을 포함한다. 그와 같은 변형의 비-제한 예는 변형된 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로티오, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 당간 연결기 또는 단쇄 헤테로원자 또는 복소환형 당간 연결기를 포함하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 공여체로부터 환자에 골수 이식을 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다.
다양한 다른 측면은 본 명세서에서 기재되고 예시된다.
도 1은 분해 (TIDE) 분석에 의해 인델의 추적을 거치는 가이드 RNAs의 퍼센트 컷팅을 보여주는 그래프이다.
서열 목록의 간단한 설명
서열 식별 번호: 1-6148은 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 6149-6892는 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 7760-8097은 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 8098-8261은 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 6893-7759는 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 8262-18807은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 18810-20841은 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 20842-21012는 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 21013-21030은 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 21031-21039는 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 21040-21114는 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 21115-22290은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 22291-22458은 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Alb 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 22459-22486은 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Alb 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 22487-22504는 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Alb 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 22505-22509는 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 Alb 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 22510-22533은 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Alb 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 22534-22912는 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 Alb 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 22913-23257은 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Angpt13 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 23258-23293은 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Angpt13 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 23294-23316은 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Angpt13 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 23317-23329는 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 Angpt13 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 23330-23392는 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Angpt13 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 23393-24240은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 Angpt13 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 24241-24643은 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 ApoC3 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 24644-24668은 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 ApoC3 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 24669-24671은 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 ApoC3 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 24672-24673은 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 ApoC3 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 24674-24685는 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 ApoC3 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 24686-24917은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 ApoC3 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 24918-26685는 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 ASGR2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 26686-26891은 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 ASGR2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 26892-26915는 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 ASGR2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 26916-26927은 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 ASGR2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 26928-27010은 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 ASGR2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 27011-28450은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 ASGR2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 28451-28653은 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 CCR5 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 28654-28685는 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 CCR5 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 28686-28699는 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 CCR5 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 28700-28701은 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 CCR5 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 28702-28729는 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 CCR5 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 28730-29029는 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 CCR5 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 29030-30495는 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 F9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 30496-30658은 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 F9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 30659-30719는 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 F9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 30720-30744는 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 F9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 30745-30897은 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 F9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 30898-33038은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 F9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 33039-34054는 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 G6PC 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 34055-34171은 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 G6PC 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 34172-34195는 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 G6PC 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 34196-34204는 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 G6PC 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 34205-34294는 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 G6PC 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 34295-35389는 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 G6PC 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 35390-40882는 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Gys2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 40883-41558은 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Gys2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 41559-41836은 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Gys2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 41837-41950은 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 Gys2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 41951-42630은 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Gys2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 42631-51062는 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 Gys2 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 51063-52755는 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 HGD 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 52756-52969는 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 HGD 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 52970-53052는 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 HGD 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 53053-53071은 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 HGD 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 53072-53272는 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 HGD 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 53273-55597은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 HGD 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 55598-59392는 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Lp(a) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 59393-59802는 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Lp(a) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 59803-59938은 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Lp(a) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 59939-59973은 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 Lp(a) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 59974-60341은 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Lp(a) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 60342-64962는 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 Lp(a) 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 64963-66982는 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 PCSK9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 66983-67169는 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 PCSK9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 67170-67205는 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 PCSK9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 67206-67219는 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 PCSK9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 67220-67359는 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 PCSK9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 67360-69153은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 PCSK9 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 69154-70291은 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Serpina1 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 70292-70384는 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Serpina1 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 70385-70396은 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Serpina1 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 70397-70399는 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 Serpina1 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 70400-70450은 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 Serpina1 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 70451-71254는 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 Serpina1 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 71255-72086은 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 TF 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 72087-72172는 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 TF 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 72173-72184는 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 TF 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 72185-72191은 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 TF 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 72192-72235는 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 TF 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 72236-72871은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 TF 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 72872-73171은 S. 파이오제네스 Cas9 엔도뉴클레아제로 TTR 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 73172-73212는 S. 아우레스 Cas9 엔도뉴클레아제로 TTR 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 73213-73229는 S. 테모필러스 Cas9 엔도뉴클레아제로 TTR 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 73230-73231은 T. 덴티콜라 Cas9 엔도뉴클레아제로 TTR 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 73232-73266은 N. 메닝자이티데스 Cas9 엔도뉴클레아제로 TTR 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 20 bp 스페이서 서열이다.
서열 식별 번호: 73267-73668은 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다 Cpf1 엔도뉴클레아제로 TTR 유전자의 엑손 1-2를 표적화하기 위한 22 bp 스페이서 서열이다.
상세한 설명
C9ORF72
인간 C9ORF72 유전자는, 염기쌍 27,546,542부터 염기쌍 27,573,863까지, 염색체 9 열린 해독틀 72의 짧은 (p) 아암에서 위치한다. 그것의 세포유전적 위치는 9p21.2이다. C9ORF72의 돌연변이는 뉴클레오타이드 GGGGCC의 6 문자열의 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장이다. 건강한 개체에 있어서, 이러한 헥사뉴클레오타이드의 소수의 반복부, 전형적으로 30 이하가 있지만, 이환 표현형을 가진 사람에 있어서, 반복부는 수백의 정도로 발생할 수 있다. C9ORF72 유전자에서 헥사뉴클레오타이드 확장 이벤트는 가족성 ALS의 대략 40% 및 산발적 ALS의 8-10%에서 존재한다.
헥사뉴클레오타이드 확장은 C9ORF72 유전자의 대안적으로 스플라이싱된 인트론 1에서 발생하고, 그대로 코딩 서열 또는 수득한 단백질을 변경시키지 않는다. C9ORF72의 3개 대안적으로 스플라이싱된 변이체 (V1, V2 및 V3)은 정상적으로 생산된다. 확장된 뉴클레오타이드 반복부는 V1의 전사를 감소시키는 것으로 나타났지만, 생산된 단백질의 총량은 영향받지 않았다.
용어 "헥사뉴클레오타이드 반복부 확장"은 적어도 2회 반복된 일련의 6 염기 (예를 들어, GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG, 또는 GGGGGC)를 의미한다. 특정 구현예에서, 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장은 C9ORF72 핵산의 인트론 1에서 위치할 수 있다. 특정 구현예에서, 병원성 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장은 C9ORF72 핵산에서 GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG, 또는 GGGGGC의 적어도 30 반복부를 포함하고 질환과 관련된다. 다른 구현예에서, 병원성 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장은 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300 또는 초과 반복부를 포함한다. 특정 구현예에서, 반복부는 연속이다. 특정 구현예에서, 반복부는 1 이상 핵염기에 의해 차단된다. 특정 구현예에서, 야생형 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장은 C9ORF72 핵산에서 GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG, 또는 GGGGGC의 29 이하 반복부를 포함한다. 다른 구현예에서, 야생형 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장은 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 반복부를 포함한다. 특정 구현예에서, 전체 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장은 결실된다. 특정 구현예에서, 반복부는 연속이다. 특정 구현예에서, 반복부는 1 이상 핵염기에 의해 차단된다.
치료 접근법
하기에 의해 게놈에 영구 변화를 창출하기 위해 게놈 공학기술 도구의 세포성, 생체외 및 생체내 이용 방법이 본 명세서에서 제공된다: 1) C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 완전한 결실, 2) 야생형 또는 유사한 수의 헥사뉴클레오타이드 반복부로 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 정정/대체, 또는 3) 헥사뉴클레오타이드 반복부 영역의 결실 및 유전자 유전자좌 또는 세이프 하버 유전자좌 속으로 C9ORF72 cDNA 녹-인. 그와 같은 방법은, 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부 또는 이의 부분을 영구적으로 결실 또는 대체하기 위해 또는 C9ORF72 유전자의 게놈 유전자좌에서 삽입하기 위해, 엔도뉴클레아제, 예컨대 CRISPR관련된 (Cas9, Cpf1 및 기타 동종) 뉴클레아제를 이용한다. 이런 식으로, 본 발명은 (환자의 수명에 대하여 잠재적인 요법 전달 보다는) 단일 치료로 야생형 또는 유사한 C9ORF72 인트론 서열을 회복시키거나 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부를 결실시킨다.
근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 치료 방법이 본 명세서에서 제공된다. 그와 같은 방법의 구현예는 생체외 세포 기반 요법이다. 예를 들어, 환자 특이적 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)는 창출된다. 그 다음, 이들 iPS 세포의 염색체 DNA는 본 명세서에서 기재된 물질 및 방법을 이용하여 정정된다. 다음으로, 정정된 iPSCs는 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화된다. 마지막으로, 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포는 환자에 임플란팅된다.
C9ORF72 유전자좌에, 또는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌에 야생형 C9ORF72 cDNA를 삽입하기 위한 공여체 템플레이트와 함께, CRISPR-Cas9 또는 CRISPR-Cpf1을 이용하는 C9ORF72 유전자의 정확한 발현의 회복 방법이 본 명세서에서 제공된다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR. 일부 구현예에서, 그와 같은 방법은 녹-인될 수 있는 그리고 이환된 엑손을 함유하는 cDNA의 이용이다. 부분적인 cDNA 접근법에 더하여, 전장 cDNA는 번역 개시 부위에 녹-인될 수 있다. 어느 경우에나, 삽입된 cDNA의 발현은 C9ORF72 프로모터의 제어하에 있고, 이는 C9ORF72 단백질 수준의 정확한 조절을 제공한다.
하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌 속으로 C9ORF72 cDNA 삽입에 의해 C9ORF72 유전자의 정확한 발현의 회복 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2.
그와 같은 방법의 또 다른 구현예는 생체외 세포 기반 요법이다. 예를 들어, 백혈구는 환자로부터 단리된다. 다음으로, 이들 백혈구의 염색체 DNA는 본 명세서에서 기재된 물질 및 방법을 이용하여 정정된다. 마지막으로, 편집된 백혈구는 환자에 임플란팅된다.
그와 같은 방법의 더욱 또 다른 구현예는 생체외 세포 기반 요법이다. 예를 들어, 환자의 골수의 생검은 임의로 수행된다. 그 다음, 간엽 줄기 세포는 생검된 물질로부터 단리된다. 다음으로, 이들 줄기 세포의 염색체 DNA는 본 명세서에서 기재된 물질 및 방법을 이용하여 정정된다. 다음으로, 줄기 세포는 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화된다. 마지막으로, 이들 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포는 환자에 임플란팅된다.
그와 같은 방법의 추가 구현예는 생체외 세포 기반 요법이다. 예를 들어, 환자는 임의로 과립구 콜로니 자극 인자로 치료된다. 그 다음, 조혈 전구 세포는 환자로부터 단리된다. 다음으로, 이들 세포의 염색체 DNA는 본 명세서에서 기재된 물질 및 방법을 이용하여 정정된다. 마지막으로, 세포는 환자에 임플란팅된다.
생체외 세포 요법 접근법의 하나의 이점은 투여에 앞서 치료의 종합 분석을 수행하는 능력이다. 전체 뉴클레아제 기반 치료제는 부정확한 효과의 일부 수준을 갖는다. 생체외 유전자 정정 수행은 임플란팅하기에 앞서 정정된 세포 모집단을 완전히 특성규명하게 한다. 본 발명의 측면은 부정확한 컷트가, 있다면, 환자에 최소 위험과 관련된 게놈 위치에 있는 것을 보장하기 위해 정정된 세포의 전체 게놈의 서열분석을 포함한다. 더욱이, 클론 모집단을 포함하는, 특이적 세포의 모집단은 임플란팅하기에 앞서 단리될 수 있다.
생체외 세포 요법의 또 다른 이점은 다른 1차 세포 공급원에 비교된 iPSCs에서 유전적 정정에 관한 것이다. iPSCs는, 세포 기반 요법에 대하여 요구될 다수의 세포를 수득하는 것을 쉽게 하는, 번식성이다. 더욱이, iPSCs는 클론 단리 수행에 대하여 이상적 세포 유형이다. 이것은, 생존력에서 감소 위험 없이, 정확한 게놈 정정에 대하여 선별을 허용한다. 그에 반해서, 다른 1차 세포는 단지 몇몇의 통로에 대하여 생존가능하고 클론적으로 확장하기 어렵다. 따라서, ALS 또는 FTLD의 치료에 대하여 iPSCs의 은 훨씬 더 쉬울 것이고, 원하는 유전적 정정을 하기에 필요한 시간의 양을 줄일 것이다.
그와 같은 방법의 또 다른 구현예는 생체내 기반 요법이다. 이러한 방법에서, 환자에서 세포의 염색체 DNA는 본 명세서에서 기재된 물질 및 방법을 이용하여 정정된다. 바람직하게는, 세포는 신경 세포, 골수 세포, 조혈 전구 세포, 또는 CD34+ 세포이다.
생체내 유전자 요법의 이점은 치료제 생산 및 투여의 편의성이다. 동일한 치료 접근법 및 요법은 1 초과 환자, 예를 들어 동일한 또는 유사한 유전자형 또는 대립유전자를 공유하는 수많은 환자를 치료하는데 사용될 잠재력을 가질 수 있다. 그에 반해서, 생체외 세포 요법은 전형적으로, 단리되고, 조작되고 동일한 환자에 되돌아가는, 환자의 자신의 세포 이용을 요구한다.
게놈 편집에 의해 세포에서 C9ORF72 유전자의 세포 편집 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다. 예를 들어, 세포는 환자 또는 동물로부터 단리된다. 그 다음, 세포의 염색체 DNA는 본 명세서에서 기재된 물질 및 방법을 이용하여 정정된다.
본 발명의 방법은, 세포 또는 생체외 또는 생체내 방법과 무관하게, 하기의 하나 또는 조합을 포함한다: C9ORF72 유전자 내 또는 근처 전체 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부 또는 이의 부분의 결실, 야생형 수준 또는 유사한 수준으로 C9ORF72 유전자 내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 정정, 또는 유전자의 유전자좌 속으로 또는 게놈에서 이종성 위치 (예컨대 세이프 하버 부위, 예컨대 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR)에서 외인성 C9ORF72 DNA 또는 cDNA 서열 또는 이의 단편 도입. 양쪽 정정 및 녹-인 전략은 상동 직접 수선 (HDR)에서 공여체 DNA 템플레이트를 사용한다. 어느 한쪽 전략에서 HDR은 1개 이상의 엔도뉴클레아제 이용에 의해 게놈에서 특이적 부위에 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 작성함으로써 달성될 수 있다. cDNA의 제1 엑손 속으로의 HDR 매개된 녹-인의 효율의 평가는, 예를 들어 다음과 같은 영역 중 하나에 상동성 아암을 갖는 "세이프 하버" 부위 예컨대 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA에 cDNA 녹-인을 사용할 수 있다: ApoC3 (chr11:116,829,908-116,833,071), Angptl3 (chr1:62,597,487-62,606,305), Serpina1 (chr14:94,376,747-94,390,692), Lp(a) (chr6:160,531,483-160,664,259), Pcsk9 (chr1:55,039,475-55,064,852), FIX (chrX:139,530,736-139,563,458), ALB (chr4:73,404,254-73,421,411), TTR (chr18:31,591,766-31,599,023), TF (chr3:133,661,997-133,779,005), G6PC (17:42,900,796-42,914,432), Gys2 (chr12:21,536,188-21,604,857), AAVS1(PPP1R12C) (chr19:55,090,912-55,117,599), HGD (chr3:120,628,167-120,682,570), CCR5 (chr3:46,370,854-46,376,206), ASGR2 (chr17:7,101,322-7,114,310). 양쪽 정정 및 녹-인 전략은 상동 직접 수선 (HDR)에서 공여체 DNA 템플레이트를 사용한다. 어느 한쪽 전략에서 HDR은 1개 이상의 엔도뉴클레아제 이용에 의해 게놈에서 특이적 부위에 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)을 작성함으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, 정정 전략은, 상동 직접 수선에 세포 DSB 반응을 유도하기 위해 외인성으로 도입된 공여체 DNA 템플레이트의 존재하에, 1개 이상의 Cas9 및 sg RNA로 관심 유전자에서 1개 이중 가닥 절단, 또는 2개 이상의 적절한 sgRNAs를 이용하여 관심 유전자에서 2개 이상의 이중 가닥 절단을 유도함으로써 C9ORF72 유전자에서 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 정정을 포함한다 (공여체 DNA 템플레이트는 짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 짧은 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드, 긴 단일 또는 이중 가닥 DNA 분자일 수 있다). 이러한 접근법은 C9ORF72 유전자의 불균질 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장을 위하여 gRNAS 및 공여체 DNA 분자의 개발 및 최적화를 요구한다.
예를 들어, 녹-인 전략은 C9ORF72 유전자의 제1 또는 다른 엑손 및/또는 인트론의 또는 상기에서, 또는 세이프 하버 부위 (예컨대, 예를 들면, 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌의 엑손 1-2: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR))에서 sgRNA 또는 한 쌍의 sgRNAs 표적화 업스트림을 이용하여 유전자의 유전자좌 속으로 C9ORF72 cDNA 녹-인을 포함한다. 공여체 DNA는 9p21.2 영역에 상동성 아암을 갖는 단일 또는 이중 가닥 DNA일 것이다. 공여체 DNA는 상기 표적 세이프 하버 유전자좌에 상동성 아암을 갖는 단일 또는 이중 가닥 DNA일 수 있다. 공여체 템플레이트는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌에 상동성 아암을 갖는 단일 또는 이중 가닥 DNA일 수 있다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR.
예를 들어, 결실 전략은 1개 이상의 엔도뉴클레아제 및 2개 이상의 gRNAs 또는 sgRNAs를 이용하여 C9ORF72 유전자에서 1개 이상의, 및 바람직하게는 전체, 헥사뉴클레오타이드 반복부의 결실을 포함한다.
상기 전략 (정정 및 녹-인 및 결실)에 대한 이점은, 원칙적으로 양쪽 단기 및 장기 유익한 임상 및 실험실 효과를 포함하여, 유사하다. 녹-인 접근법은 정정 또는 결실 접근법 - 전체 환자 대 단지 환자의 서브셋을 치료하는 능력에 대해 1개의 이점을 제공한다. 이런 식으로 유전자 편집과 다른 사안은 HDR용 DNA 공여체에 대하여 필요성이다.
상기 게놈 편집 전략에 더하여, 또 다른 전략은 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부 영역이 아닌 유전자에서 편집에 의해 또는 조절 서열에서 편집에 의해 C9orf72의 발현, 기능, 또는 활성 조절을 포함한다.
CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제는 PAM이 트랜스에서 DNA 올리고 (PAMer)로서 나타나는 경우 단일-가닥 RNA 표적을 표적하는데 사용될 수 있다 (O'Connell, M.R. 등 Nature 516, 263-266 (2014)). 이러한 시스템의 조작은 게놈 유전자좌를 온전하게 이탈시키면서 전사된 RNA에서 절단을 구체적으로 유도하는데 이용될 수 있다. 이것은 세포에서 유해한 RNAs로부터 발현을 구체적으로 녹다운하기 위하여 유용한 전략이다. ALS 치료의 맥락에서, 하나의 접근법은 컷팅을 유도하기 위해 DNA PAMer와 함께 C9ORF72 사전-RNA에서 헥사뉴클레오타이드 반복부를 구체적으로 표적하는 gRNAs를 전달하는 것일 것이다. 이것은 유해한 C9ORF72 mRNA의 감소된 발현으로 이어질 것이다.
본 발명의 또 다른 방법은 공여체로부터 환자에 골수의 이식을 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 치료를 포함한다.
게놈 표적 부위의 수많은 유형은 코딩 및 스플라이싱 서열에서 돌연변이에 더하여 존재한다.
전사 및 번역의 조절은 세포 단백질 또는 뉴클레오타이드와 상호작용하는 부위의 수많은 상이한 부류를 연루시킨다. 종종 전사 인자 또는 다른 단백질의 DNA 결합 부위는, 이들이 또한 유전자 발현을 변화시키기 위해 표적화될 수 있어도, 그 부위의 역할을 연구하기 위해 돌연변이 또는 결실에 대하여 표적화될 수 있다. 부위는 상동 직접 수선 (HDR)에 의한 직접 게놈 편집 또는 비상동 말단 연결 (NHEJ)를 통해 부가될 수 있다. 게놈 서열분석의 증가된 사용, RNA 발현 및 전사 인자 결합의 게놈규모의 연구는 부위가 발달성 또는 일시적 유전자 조절로 이어지는 방식을 확인하기 위한 우리의 능력을 증가시켰다. 이들 제어 시스템은 다중 인핸서로부터 활성의 통합을 요구할 수 있는 광범위한 헙력 조절을 포함할 수 있거나 유도할 수 있다. 전사 인자는 전형적으로 6-12 bp-길이 축퇴 DNA 서열을 결합시킨다. 개별 부위에 의해 제공된 저수준의 특이성은 복잡한 상호작용 및 규칙이 결합 및 기능성 결과에 관여되는 것을 시사한다. 덜한 축퇴성을 가진 결합 부위는 조절의 더 단순한 수단을 제공할 수 있다. 인공 전사 인자는 게놈에서 덜 유사한 서열을 갖고 부정확한 절단에 대하여 더 낮은 잠재력을 갖는 더 긴 서열을 특정하기 위해 설계될 수 있다. 임의의 이들 유형의 결합 부위는 유전자 조절 또는 발현에서 변화를 가능하게 하기 위해 돌연변이, 결실 또는 심지어 창출될 수 있다 (Canver, M.C. 등, Nature (2015)).
이들 피쳐를 갖는 유전자 조절 영역의 또 다른 부류는 microRNA (miRNA) 결합 부위이다. miRNAs는 후-전사 유전자 조절에서 핵심 역할을 하는 비-코딩 RNAs이다. miRNA는 전체 포유동물 단백질-인코딩 유전자의 30%의 발현을 조절할 수 있다. 이중 가닥 RNA (RNAi)에 의한 특이적 및 강력한 유전자 침묵화는, 추가의 작은 비코딩 RNA와 함께, 발견되었다 (Canver, M.C. 등, Nature (2015)). 유전자 침묵화에 중요한 비코딩 RNAs의 최대 부류는 miRNAs이다. 포유동물에서, miRNAs는, 별개의 전사 유닛, 단백질 인트론의 일부, 또는 다른 전사체일 수 있는, 긴 RNA 전사체로서 최초 전사된다. 긴 전사체는 불완전하게 염기짝짓기된 헤어핀 구조를 포함하는 1차 miRNA (pri-miRNA)로 불린다. 이들 pri-miRNA는, Drosha를 연루하는, 핵에서 단백질 복합체인, 마이크로프로세서에 의해 1개 이상의 더 짧은 전구체 miRNAs (pre-miRNAs)로 절단된다.
pre-miRNAs는, 성숙한 19-25 뉴클레오타이드 miRNA:miRNA* 듀플렉스 속으로, 유출되는 2-뉴클레오타이드 3'-돌출부를 가진 짧은 줄기 루프 ~70 뉴클레오타이드 길이이다. 더 낮은 염기 짝짓기 안정성을 가진 miRNA 가닥 (가이드 가닥)은 RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC)상에 장입된다. (*로 마킹된) 패신저 가이드 가닥은 기능성일 수 있지만, 일반적으로 분해된다. 성숙한 miRNA는 RISC를 3' 미번역된 영역 (UTRs) 내에 우세하게 발견된 표적 mRNAs에서 부분적으로 상보적 서열 모티프에 속박시키고 후전사 유전자 침묵화를 유도한다 (Bartel, D.P. Cell 136, 215-233 (2009); Saj, A. & Lai, E.C. Curr Opin Genet Dev 21, 504-510 (2011)).
miRNAs는 포유동물 및 다른 다중세포 유기체에 있어서 개발, 분화, 세포 사이클 및 성장 조절에서, 그리고 사실상 전체 생물학적 경로에서 중요하다. miRNAs는 세포 사이클 제어, 세포자멸사 및 줄기 세포 분화, 조혈, 저산소증, 근육 발달, 신경발생, 인슐린 분비, 콜레스테롤 대사, 노화, 바이러스 복제 및 면역 반응에서 또한 관여된다.
단일 miRNA는 수백의 상이한 mRNA 전사체를 표적할 수 있고, 반면 개별 전사체는 많은 상이한 miRNAs에 의해 표적화될 수 있다. 28645 초과 microRNAs는 miRBase의 최근 발표 (v.21)에서 주석을 달아 왔다. 일부 miRNAs는 다중 유전자좌에 의해 인코딩되고, 이들 중 일부는 나란히 공-전사된 클러스터로부터 발현된다. 피쳐는 다중 경로 및 피드백 제어를 가진 복합 조절 네트워크를 허용한다. miRNAs는 이들 피드백 및 조절 회로의 일체부이고 제한 내에 단백질 생산 유지에 의해 유전자 발현 조절을 도울 수 있다 (Herranz, H. & 코헨, S.M. Genes Dev 24, 1339-1344 (2010); Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014)).
miRNA는 비정상 miRNA 발현과 관련되는 다수의 인간 질환에서 또한 중요하다. 이러한 관련은 miRNA 조절 경로의 중요성을 강조한다. 최근 miRNA 결실 연구는 면역 반응의 조절로 miRNA를 연결하였다 (Stern-Ginossar, N. 등, Science 317, 376-381 (2007)).
miRNA는 또한 암에 강한 링크를 갖고 암의 상이한 유형에서 역할을 할 수 있다. miRNAs는 수많은 종양에서 하향조절되는 것으로 밝혀졌다. miRNA는 핵심 암-관련된 경로의 조절, 예컨대 세포 사이클 제어 및 DNA 손상 반응에서 중요하고, 따라서 진단에서 사용되고 임상적으로 표적화되고 있다. MicroRNAs는 혈관신생의 밸런스를 정교하게 조절하여서, 전체 microRNAs를 고갈시키는 실험이 종양 혈관신생을 억제시킨다 (Chen, S. 등, Genes Dev 28, 1054-1067 (2014)).
단백질 코딩 유전자에 대하여 나타났던 바와 같이, miRNA 유전자는 또한 암으로 발생하는 후성유전적 변화를 거친다. 많은 miRNA 유전자좌는 DNA 메틸화에 의한 조절에 대하여 그것의 기회를 증가시키는 CpG 해도형과 관련된다 (Weber, B., Stresemann, C., Brueckner, B. & Lyko, F. Cell cycle 6, 1001-1005 (2007)). 다수의 연구는 후성유전적으로 침묵화된 miRNAs를 드러내기 위해 염색질 리모델링 약물로 치료를 사용하여 왔다.
RNA 침묵화에서 그것의 역할에 더하여, miRNA는 또한 번역을 활성화시킬 수 있다 (Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014)). 이들 부위의 녹아웃은 표적화된 유전자의 감소된 발현으로 이어질 수 있고, 반면 이들 부위의 도입은 발현을 증가시킬 수 있다.
개별 miRNA는, 결합 특이성에 중요한, 종자 서열 (microRNA의 염기 2-8) 돌연변이에 의해 가장 효과적으로 녹아웃될 수 있다. 상기 영역에서 절단은, NHEJ에 의한 수선오류에 이어서, 표적 부위에 결합 차단에 의해 miRNA 기능을 효과적으로 폐기시킬 수 있다. miRNA는 또한 회문 서열에 인접한 특별한 루프 영역의 특이적 표적화에 의해 억제될 수 있다. 촉매적으로 불활성 Cas9는 또한 shRNA 발현을 억제시키는데 사용될 수 있다 (Zhao, Y. 등, Sci Rep 4, 3943 (2014)). miRNA의 표적화에 더하여, 결합 부위는 또한 miRNA에 의한 침묵화를 예방하기 위해 표적화 및 돌연변이될 수 있다.
인간 세포
ALS 또는 FTLD 완화를 위하여, 본 명세서에서 기재된 및 설명된 바와 같이, 유전자 편집용 주요한 표적은 인간 세포이다. 예를 들어, 생체외 방법에서, 인간 세포는, 기재된 바와 같이 기술을 이용하여 변형된 후, 신경 세포 또는 전구 세포를 생기게 할 수 있는, 체세포이다. 예를 들어, 생체내 방법에서, 인간 세포는 신경 세포이다.
필요로 하는 환자로부터 유래되는 그리고 따라서 상기 환자와 이미 완전히 매칭되는 자가조직 세포에서 유전자 편집을 수행함으로써, 환자 속으로 안전하게 재-도입될 수 있는 세포를 생성하는 것이 가능하고, 환자의 질환과 관련된 1개 이상의 임상 병태의 완화에서 효과적일 세포의 모집단을 효과적으로 생기게 하는 것이 가능하다.
전구 세포 (또한 본 명세서에서 줄기 세포로 칭함) 는 더 많은 전구 세포의 증식 및 생기게 함 모두를 가능하게 하고, 이들은 차례로 분화된 또는 구분가능한 딸 세포를 차례로 생기게 할 수 있는 다수의 모 세포를 생성하는 능력을 갖는다. 딸 세포 자체는, 친계 발달성 잠재력을 가진 1개 이상의 세포를 또한 보유하면서, 1개 이상의 성숙한 세포 유형으로 후속적으로 분화하는 자손을 증식 및 생산하기 위해 유도될 수 있다. 용어 "줄기 세포"는 그 다음, 더욱 특화된 또는 분화된 표현형으로 분화하기 위해, 특정한 상황하에, 수용력 또는 잠재력을 가진 세포를 지칭하고, 이들은 특정 상황하에, 실질적으로 분화 없이 증식하기 위해 수용력을 보유한다. 하나의 구현예에서, 용어 전구 또는 줄기 세포는, 배아 세포 및 조직의 진행성 다양성에서 발생하는 바와 같이, 분화, 예를 들면, 완전히 개별 특성 획득에 의해, 종종 상이한 방향에서 후손 (자손)이 특정하는 일반화된 모 세포를 지칭한다. 세포 분화는 많은 세포 분할을 통해 전형적으로 발생하는 복합 공정이다. 분화된 세포는 자체가 다분화능 세포, 및 기타 등등으로부터 유래되는 다분화능 세포에서 유래할 수 있다. 각각의 이들 다분화능 세포가 줄기 세포로 고려될 수 있는 반면, 각각이 생기게 할 수 있는 세포 유형의 범위는 상당히 다양할 수 있다. 일부 분화된 세포는 또한 더 큰 발달성 잠재력의 세포를 생기게 하는 수용력을 갖는다. 그와 같은 수용력은 천연일 수 있거나 다양한 인자로 치료시 인공적으로 유도될 수 있다. 많은 생물학적 사례에서, 줄기 세포는 이들이 1 초과 구별되는 세포 유형의 자손을 생산할 수 있기 때문에 또한 "다분화능"이지만, 이것은 "줄기성"에 요구되지 않는다.
자기-재생은 줄기 세포의 또 다른 중요한 측면이다. 이론상, 자기-재생은 2개의 주요한 기전 중 어느 한쪽에 의해 발생할 수 있다. 줄기 세포는, 줄기 상태를 보유하는 하나의 딸 그리고 일부 구별되는 다른 특이적 기능 및 표현형을 발현시키는 다른 딸로, 비대칭으로 분할할 수 있다. 대안적으로, 모집단에서 줄기 세포의 일부는 대칭적으로 2개 줄기로 분할할 수 있고, 따라서 전체적으로 모집단에서 일부 줄기 세포를 유지하고, 반면 모집단에서 다른 세포는 분화된 자손만을 생기게 한다. 일반적으로, "전구 세포"는 더욱 원시적인 (즉, 완전히 분화된 세포인 것보다 발달성 경로 또는 진행을 따라 초기 단계에 있는) 세포 표현형을 갖는다. 종종, 전구 세포는 또한 상당한 또는 초고 증식성 잠재력을 갖는다. 전구 세포는, 세포가 발달하고 분화하는 환경 및 발달성 경로에 의존하여, 다수의 구별되는 분화된 세포 유형 또는 단일 분화된 세포 유형을 생기게 할 수 있다.
세포 개체 발생의 맥락에서, 형용사 "분화된", 또는 "분화하는"은 상대적인 용어이다. "분화된 세포"는 비교되는 세포보다 발달성 경로 더욱 아래로 진행시켰던 세포이다. 따라서, 줄기 세포는 계통-제한된 전구체 세포 (예컨대 근세포 전구 세포)로 분화할 수 있고, 이들은 차례로 경로 더욱 아래로 전구체 세포의 다른 유형 (예컨대 근세포 전구체)로, 및 그 다음, 특정 조직 유형에서 특징적인 역할을 하는, 말기 분화된 세포, 예컨대 근세포로 분화할 수 있고, 추가로 증식하기 위한 수용력을 보유할 수 있거나 아닐 수 있다.
용어 "조혈 전구 세포"는, 적혈구성 (적혈구 또는 적색 혈액 세포 (RBCs)), 골수성 (단핵구 및 대식세포, 중성구, 호염기구, 호산구, 거핵구 / 혈소판, 및 수지상 세포), 및 림프성 (T-세포, B-세포, NK-세포)를 포함하는, 전체 혈액 세포 유형을 생기게 하는 줄기 세포 계통의 세포를 지칭한다.
"적혈구성 계통의 세포"는 접촉된 세포가 적혈구생성을 경험하는 세포이어서, 최종 분화시 적혈구 또는 적색 혈액 세포를 형성하는 것을 나타낸다. 그와 같은 세포는 골수 조혈 전구 세포에서 기원한다. 조혈 미세환경의 다른 성분 및 특이적 성장 인자에 노출시, 조혈 전구 세포는, 일련의 중간 분화 세포 유형을 통해, 적혈구성 계통의 전체 중간체를, RBCs로 성숙시킬 수 있다. 따라서, "적혈구성 계통"의 세포는 조혈 전구 세포, 전적혈구모세포, 호염기적혈모구, 적혈구모세포, 메타적혈구모세포, 망상적혈구, 및 적혈구를 포함한다.
일부 구현예에서, 조혈 전구 세포는 조혈 전구 세포의 다음과 같은 세포 표면 마커 특징의 적어도 하나를 발현시킨다: CD34+, CD59+, Thyl/CD90+, CD381o/-, 및 C-키트/CDl 17+. 일부 구현예에서, 조혈 선조는 CD34+이다.
일부 구현예에서, 조혈 전구 세포는 환자가 (임의로 Plerixaflor와 조합으로) 1개 이상의 인자 예컨대 과립구 콜로니 자극 인자로 처리된 후 환자로부터 수득된 말초 혈액 줄기 세포이다. 설명적인 구현예에서, CD34+ 세포는 CliniMACS® Cell Selection System (Miltenyi Biotec)을 이용하여 농축된다. 일부 구현예에서, CD34+ 세포는 게놈 편집전 사이토카인 (예를 들면, SCF, rhTPO, rhFLT3)을 가진 무혈청 배지 (예를 들면, CellGrow SCGM 배지, CellGenix)에서 자극된다. 일부 구현예에서, SR1 및 dmPGE2 및/또는 다른 인자의 첨가는 장기간 생착을 개선하기 위해 고려된다.
일부 구현예에서, 적혈구성 계통의 조혈 전구 세포는 적혈구성 계통의 세포 표면 마커 특징: 예컨대 CD71 및 Terl 19를 갖는다.
ALS 및 FTLD 둘 모두는, 근육을 제어하기 위해 신경 섬유를 내보내는 척수의 큰 세포인, 운동 뉴런의 질환이다. 또한, 자발적인 운동을 지배하는 뇌의 일부에서 운동 뉴런은 ALS 및 FTLD에서 파괴된다. 이들 소위 상부 운동 뉴런은 뇌로부터 아래로 신경 섬유를 보내서 척수에서 하부 운동 뉴런을 제어한다. 생체내 방법은 운동 뉴런을 직접적으로 표적할 수 있다. 생체내 방법은 또한 신경교, 별아교세포 및 다른 지지 세포를 표적할 수 있다.
미공개된 데이터에서, 동종접합성 C9ORF72 돌연변이를 갖는 마우스가 생존가능한 것이 밝혀졌다. 그러나 이들 마우스는 감소된 기대 수명, 비장비대증, 호중구증가증, 혈소판감소증, 및 염증성 사이토카인의 상승된 수준을 특징으로 하여, ALS의 병리학에 대한 면역 성분일 수 있다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 골수 이식은 C9ORF72 동종접합성 돌연변이체 마우스에서 관측된 사이토카인의 치사성 및 수준을 지연시킬 수 있다. 이러한 작업에서 구축하여, CRISPR/Cas9/Cpf1 기술을 이용하는 면역 시스템의 세포내 C9orf72 유전자좌의 정정이 ALS의 치료에 대하여 신규한 접근법일 수 있다는 것이 가정된다.
유도 만능 줄기 세포
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 유전적으로 조작된 인간 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)이다. iPSCs 이용의 이점은 전구 세포가 투여되는 것과 동일한 대상체로부터 세포가 유래될 수 있다는 것이다. 즉, 체세포는 대상체로부터 수득될 수 있고, 유도 만능 줄기 세포에 리프로그래밍될 수 있고, 그 다음 대상체 (예를 들면, 자가조직 세포)에 투여되기 위해 전구 세포 속으로 재분화될 수 있다. 선조가 자가조직 공급원에서 본질적으로 유래되기 때문에, 생착 거부 또는 알러지성 반응의 위험은 또 다른 대상체 또는 대상체의 그룹으로부터 세포의 이용에 비교하여 감소된다. 게다가, iPSCs의 이용은 배아 공급원으로부터 수득된 세포에 대하여 필요성을 무효화시킨다. 따라서, 하나의 구현예에서, 개시된 방법에서 사용된 줄기 세포는 배아 줄기 세포가 아니다.
분화가 생리적 맥락하에 일반적으로 비가역적이어도, 몇 개의 방법은 iPSCs에 체세포를 리프로그래밍하기 위해 최근에 개발되어 왔다. 예시적인 방법은 당해 분야의 숙련가에 공지되고 아래 본 명세서에서 간단히 기재된다.
용어 "리프로그래밍"은 분화된 세포 (예를 들면, 체세포)의 분화 상태를 변경 또는 역전하는 공정을 지칭한다. 또 다른 방식으로 언급되면, 리프로그래밍은 세포의 더욱 미분화된 또는 더욱 원시 유형으로 세포의 분화를 역방향으로 구동시키는 공정을 지칭한다. 배양액내 많은 1차 세포 배치가 완전히 분화된 특징의 일부 손실로 이어질 수 있다는 것이 유의되어야 한다. 따라서, 용어 분화된 세포에서 포함된 그와 같은 세포의 단순히 배양은 이들 세포를 비-분화된 세포 (예를 들면, 미분화된 세포) 또는 만능 세포로 만들지 않는다. 분화된 세포의 만능분화능으로의 전이는 배양액에서 분화된 특성의 부분적인 손실로 이어지는 자극을 넘는 리프로그래밍 자극을 요구한다. 리프로그래밍된 세포는 또한, 배양액에서 단지 제한된 수의 분할에 대하여 수용력을 일반적으로 갖는, 1차 세포 부모에 비하여, 성장 잠재력의 손실 없이 연장된 통과의 수용력의 특징을 갖는다.
리프로그래밍되는 세포는 리프로그래밍에 앞서 어느 한쪽 부분적으로 또는 말단으로 분화될 수 있다. 일부 구현예에서, 리프로그래밍은 분화된 세포 (예를 들면, 체세포)의 분화 상태의 만능 상태 또는 다분화능 상태로의 완전한 복귀를 포함한다. 일부 구현예에서, 리프로그래밍은 분화된 세포 (예를 들면, 체세포)의 미분화된 세포 (예를 들면, 배아-유사 세포)로의 분화 상태의 완전한 또는 부분적인 복귀를 포함한다. 리프로그래밍은 세포에 의한 특정한 유전자의 발현을 초래할 수 있고, 이의 발현은 추가로 리프로그래밍에 기여한다. 본 명세서에서 기재된 특정 구현예에서, 분화된 세포 (예를 들면, 체세포)의 리프로그래밍은 미분화된 상태를 가정하기 위해 분화된 세포를 야기시킨다 (예를 들면, 미분화된 세포이다). 수득한 세포는 "리프로그래밍된 세포" 또는 "유도 만능 줄기 세포 (iPSCs 또는 iPS 세포)"로서 지칭된다.
리프로그래밍은 변경, 예를 들면, 세포 분화 동안 발생하는, 핵산 변형 (예를 들면, 메틸화), 염색질 응축, 후성유전적 변화, 게놈 임프린팅, 등의 유전 패턴의 적어도 일부의 역전을 포함할 수 있다. 리프로그래밍은 이미 만능인 세포의 현존하는 미분화된 상태의 단순히 유지 또는 이미 다분화능 세포 (예를 들면, 근육생성 줄기 세포)인 세포의 현존하는 미만 완전히 분화된 상태 유지와 구별된다. 본 명세서에서 기재된 조성물 및 방법이, 일부 구현예에서, 그와 같은 목적을 위하여 또한 사용될 수 있어도, 리프로그래밍은 이미 만능 또는 다분화능인 세포의 자기-재생 또는 증식과 또한 구별된다.
많은 방법은 체세포로부터 만능 줄기 세포를 생성하는데 사용될 수 있는 당해 기술에서 공지되어 있다. 체세포를 만능 표현형으로 리프로그래밍하는 임의의 그와 같은 방법은 본 명세서에서 기재된 방법에서 사용에 적절할 것이다.
전사 인자의 정의된 조합을 이용하는 만능 세포 생성용 리프로그래밍 방법론은 기재되어 있다. 마우스 체세포는 Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc의 직접 형질도입에 의해 확장된 발달성 잠재력을 가진 ES 세포-유사 세포로 전환될 수 있다; 참조, 예를 들면, Takahashi and Yamanaka, Cell 126(4): 663-76 (2006). iPSCs는, 이들이 다능성-관련 전사 회로 및 많은 후성유전적 풍경을 회복함에 따라, ES 세포를 닮는다. 게다가, 마우스 iPSCs는 만능분화능용 모든 표준 검정을 만족시킨다: 구체적으로, 3개 배엽층의 세포 유형으로 시험관내 분화, 기형종 형성, 키메라에 기여, 생식계열 전이 [참조, 예를 들면, Maherali and Hochedlinger, Cell Stem Cell. 3(6):595-605 (2008)], 및 4배체 상보성.
인간 iPSCs는 유사한 형질도입 방법을 이용하여 수득될 수 있고, 전사 인자 트리오, OCT4, SOX2, 및 NANOG는 만능분화능을 지배하는 전사 인자의 코어 세트로서 확립되어 왔다; 참조, 예를 들면, Budniatzky and Gepstein, Stem Cell Transl Med. 3(4):448-57 (2014); Barrett 등, Stem Cells Trans Med 3:1-6 sctm.2014-0121 (2014); Focosi 등, Blood Cancer Journal 4: e211 (2014); 및 본 명세서에서 인용된 참조문헌. iPSCs의 생산은, 역사적으로 바이러스 벡터를 이용하여, 성인, 체세포 속으로 줄기 세포-관련 유전자를 인코딩하는 핵산 서열의 도입에 의해 달성될 수 있다.
iPSCs는 말단으로 분화된 체세포로부터, 뿐만 아니라 성인 줄기 세포, 또는 체세포 줄기 세포로부터 생성 또는 유래될 수 있다. 즉, 비-만능 전구 세포는 리프로그래밍에 의해 만능 또는 다분화능하게 될 수 있다. 그와 같은 사례에서, 말단으로 분화된 세포를 리프로그래밍하기 위해 요구되는 만큼 많은 리프로그래밍 인자를 포함하는 것이 필요하지 않을 수 있다. 또한, 리프로그래밍은 리프로그래밍 인자의 비-바이러스 도입에 의해, 예를 들면, 단백질 자체의 도입에 의해, 또는 리프로그래밍 인자를 인코딩하는 핵산 도입에 의해, 또는 번역시 리프로그래밍 인자를 생산하는 메신저 RNAs 도입에 의해 유도될 수 있다 (참조 예를 들면, Warren 등, Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010). 리프로그래밍은, 예를 들어, Oct-4 (또한 Oct-3/4 또는 Pouf51로서 공지됨), Soxl, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, Klfl, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, 1-Myc, n-Myc, Rem2, Tert, 및 LIN28을 포함하는, 줄기 세포-관련 유전자를 인코딩하는 핵산의 조합 도입에 의해 달성될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 방법 및 조성물을 이용하는 리프로그래밍은 1개 이상의 Oct-3/4, Sox 계열의 구성원, Klf 계열의 구성원, 및 Myc 계열의 구성원의 체세포로의 도입을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 방법 및 조성물은 리프로그래밍을 위하여 1개 이상의 각각의 Oct-4, Sox2, Nanog, c-MYC 및 Klf4의 도입을 추가로 포함한다. 전술한 바와 같이, 리프로그래밍에 사용된 정확한 방법은 본 명세서에서 기재된 방법 및 조성물에 필연적으로 핵심이 아니다. 그러나, 리프로그래밍된 세포로부터 분화된 세포가, 예를 들면, 인간 요법에서 사용되는 경우, 하나의 구현예에서 리프로그래밍은 게놈을 변경시키는 방법에 의해 영향받지 않는다. 따라서, 그와 같은 구현예에서, 리프로그래밍은, 예를 들면, 바이러스 또는 플라스미드 벡터의 이용 없이, 달성된다.
출발 세포의 모집단에서 유래된 리프로그래밍의 효율 (즉, 리프로그래밍된 세포의 수)는, 하기에 의해 보여진 바와 같이, 다양한 제제, 예를 들면, 소분자의 첨가에 의해 향상될 수 있다: Shi 등, Cell-Stem Cell 2:525-528 (2008); Huangfu 등, Nature Biotechnology 26(7):795-797 (2008) and Marson 등, Cell-Stem Cell 3: 132-135 (2008). 따라서, 유도 만능 줄기 세포 생산의 효율 또는 비율을 향상시키는 제제 또는 제제들의 조합은 환자-특이적 또는 질환-특이적 iPSCs의 생산에서 사용될 수 있다. 리프로그래밍 효율을 향상시키는 제제의 일부 비-제한 예는 하기를 포함한다: 가용성 Wnt, Wnt 조건화된 배지, BIX-01294 (G9a 히스톤 메틸전달효소), PD0325901 (MEK 억제제), DNA 메틸전달효소 억제제, 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 억제제, 발프로산, 5'-아자시티딘, 덱사메타손, 수베로일아닐라이드, 하이드록삼산 (SAHA), 비타민 C, 및 트리코스타틴 (TSA), 그 중에서도.
리프로그래밍 향상제의 다른 비-제한 예는 하기를 포함한다: 수베로일아닐라이드 하이드록삼산 (SAHA (예를 들면, MK0683, 보리노스타트) 및 다른 하이드록삼산), BML-210, 데푸데신 (예를 들면, (-)-데푸데신), HC 독소, 눌스크립트 (4-(l,3-디옥소-lH,3H-벤조[de]이소퀴놀린-2-일)-N-하이드록시부탄아미드), 페닐부티레이트 (예를 들면, 나트륨 페닐부티레이트) 및 발프로산 ((VP A) 및 다른 단쇄 지방산), 스크립트에이드, 수라민 나트륨, 트리코스타틴 A (TSA), APHA 화합물 8, 아피시딘, 나트륨 부티레이트, 피발로일옥시메틸 부티레이트 (파이바넥스, AN-9), 트라폭신 B, 클라마이도신, 뎁시펩타이드 (또한 FR901228 또는 FK228로서 공지됨), 벤즈아미드 (예를 들면, CI-994 (예를 들면, N-아세틸 디날린) 및 MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (m-카복시신나민산 비스하이드록삼산), JNJ16241199, 투바신, A-161906, 프록사마이드, 옥삼플라틴, 3-Cl-UCHA (예를 들면, 6-(3-클로로페닐우레이도)카프로산 하이드록삼산), AOE (2-아미노-8-옥소-9, 10-에폭시데칸 산), CHAP31 및 CHAP 50. 다른 리프로그래밍 향상제는, 예를 들어, HDACs의 우세한 음성 형태 (예를 들면, 촉매적으로 불활성 형태), HDACs의 siRNA 억제제, 및 HDACs에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 그와 같은 억제제는, 예를 들면, 하기로부터 이용가능하다: BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Titan Pharmaceuticals, MethylGene, 및 Sigma Aldrich.
본 명세서에서 기재된 방법으로 사용하기 위한 만능 줄기 세포의 유도를 확인하기 위해, 단리된 클론은 줄기 세포 마커의 발현에 대하여 시험될 수 있다. 체세포에서 유래된 세포에서 그와 같은 발현은 세포를 유도 만능 줄기 세포로서 확인한다. 줄기 세포 마커는 SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbxl5, Ecatl, Esgl, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Daxl, Zpf296, Slc2a3, Rexl, Utfl, 및 Natl을 포함하는 비-제한 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, Oct4 또는 Nanog를 발현시키는 세포는 만능으로서 확인된다. 그와 같은 마커의 발현 검출 방법은, 예를 들어, 인코딩된 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 RT-PCR 및 면역학적 방법, 예컨대 웨스턴 블랏 또는 유세포측정 분석을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출은 RT-PCR을 포함하고, 뿐만 아니라 단백질 마커의 검출을 포함한다. 세포내 마커는 RT-PCR, 또는 단백질 검출 방법 예컨대 면역세포화학을 통해 최상으로 확인될 수 있고, 반면 세포 표면 마커는, 예를 들면, 면역세포화학에 의해 쉽게 확인된다.
단리된 세포의 만능 줄기 세포 특성은 각각 3개 배엽층의 세포로 분화하는 iPSCs의 능력을 평가하는 시험에 의해 확인될 수 있다. 일 예로서, 누드 마우스에서 기형종 형성은 단리된 클론의 만능 특성을 평가하는데 사용될 수 있다. 세포는 누드 마우스에 도입되고/되거나 조직학 및/또는 면역조직화학은 세포에서 일어나는 종양에서 수행된다. 전체 3개 배엽층으로부터 세포를 포함하는 종양의 성장은, 예를 들어, 세포가 만능 줄기 세포인 것을 추가로 나타낸다.
신경 세포
인간 신경계는 대략 3,600억 비-신경교 세포 및 900억 신경 세포를 갖는 것으로 추정된다. 형태학 단독에 기반된 뉴런의 수백의 상이한 유형이 있다. 종종, 유사해 보이는 뉴런은 현저하게 상이한 특성을 갖는다. 예를 들어, 이들은 상이한 신경전달물질을 이용하고 이들에 반응한다.
신경 줄기 세포 (NSCs)는 신경계의 주요 표현형을 생성하는 자기-갱신, 다분화능 세포이다. 줄기 세포는 그것의 환경으로부터 외인성 자극을 통해 다중 세포 유형으로 분화하는 그것의 능력을 특징으로 한다. 이들은, 하나의 비-특화된 및 하나의 특화된, 2개 딸 세포로 비대칭 세포 분할을 경험한다. NSCs는 주로 뉴런, 별아교세포, 및 희소돌기교세포로 분화한다.
전형적인 뉴런은 전기 신호를 하나의 세포에서 또 다른 것으로 전송한다. 뉴런은 세포 바디, 수지상조직, 축삭 둔덕, 축색, 신경 종말 및 신경근육 접합을 함유한다. 뉴런은 수지상 트리의 형상 또는 성질에 따라 명명될 수 있다.
중추 신경계의 대부분의 수많은 세포 구성요소는 뉴런 사이 공간을 차지하는 비-뉴런, 신경교 ("신경 글루") 세포이다. CNS에서 세포의 80-90%를 포함하는, 거의 3,600억 신경교 세포가 있다는 것이 추정되고 있다. 신경교는 이들이 시냅스를 형성하지 않고, 본질적으로 공정의 단 하나의 유형을 갖고, 분할하는 능력을 보유하고, 뉴런보다 덜 전기적으로 절제가능하다는 점에서 몇 개의 일반적인 방식으로 뉴런과 상이하다. 신경교는 그것의 핵(neucleus)의 크기 및 형상에 기반하여 분류되고 광학 현미경적 수준에서 뉴런과 식별된다. 신경교는 크기에 기반하여 2개의 주요한 카테고리, 대교세포 및 미세아교로 분할된다. 대교세포는 외배엽성 기원이고 별아교세포, 희소돌기교세포 및 뇌실막 세포로 구성된다. 미세아교 세포는 아마 중배엽 기원이다.
환자 특이적 iPSCs의 창출
본 발명의 생체외 방법의 하나의 단계는 환자 특이적 iPS 세포, 환자 특이적 iPS 세포, 또는 환자 특이적 iPS 세포주의 창출을 포함한다. 하기에서 기재된 바와 같이, 환자 특이적 iPS 세포를 창출하기 위하여 당해 분야에서 많은 확립된 방법이 있다: Takahashi and Yamanaka 2006; Takahashi, Tanabe 등 2007. 예를 들어, 창출 단계는 하기를 포함한다: a) 체세포, 예컨대 피부 세포 또는 섬유아세포를 환자로부터 단리시킴; 및 b) 세포를 만능 줄기 세포가 되도록 유도하기 위해 일련의 다능성-관련 유전자를 체세포 속으로 도입시킴. 일부 구현예에서, 다능성-관련 유전자의 세트는 OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NANOG, 및 cMYC로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자의 1개 이상이다.
환자의 골수의 생검 수행
생검은 바디로부터 취득된 조직 또는 유체의 샘플이다. 많은 상이한 종류의 생검이 있다. 그것 중 거의 모두는 소량의 조직을 제거하기 위해 날카로운 도구의 이용을 포함한다. 생검이 피부 또는 다른 감수성 영역에 있으면, 마비 의약이 먼저 적용된다. 생검은 당해 분야에서 임의의 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 골수 생검에서, 큰 바늘은 골수를 수집하기 위해 골반 뼈에 진입하는데 사용된다.
백혈구의 단리
백혈구는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 단리될 수 있다. 예를 들어, 백혈구는 액체 샘플로부터 원심분리에 의해 단리될 수 있다.
간엽 줄기 세포의 단리
간엽 줄기 세포는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 단리될 수 있다. 예를 들어, 골수 흡인물은 헤파린과 함께 주사기 속으로 수집된다. 세포는 세정되고 Percoll에서 원심분리된다. 세포는 10% 우태 혈청 (FBS)를 함유하는 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM) (저 글루코스) (Pittinger MF, Mackay AM, Beck SC 등, Science 1999; 284:143-147)에서 배양된다.
GCSF를 가진 환자의 치료
환자는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF)로 임의로 치료될 수 있다. 일부 구현예에서, GCSF는 Plerixaflor와 조합으로 투여된다.
환자로부터 조혈 전구 세포의 단리
조혈 전구 세포는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 환자로부터 단리될 수 있다. CD34+ 세포는 CliniMACS® Cell Selection System (Miltenyi Biotec)을 이용하여 농축된다. 일부 구현예에서, CD34+ 세포는 게놈 편집전 사이토카인 (예를 들면, SCF, rhTPO, rhFLT3)으로 무혈청 배지 (예를 들면, CellGrow SCGM 배지, CellGenix)에서 약하게 자극된다.
게놈 편집
게놈 편집은 일반적으로, 바람직하게는 정확한 또는 사전-결정된 방식으로 게놈의 뉴클레오타이드 서열 변형의 과정을 지칭한다. 본 명세서에서 기재된 게놈 편집 방법의 예는 게놈에서 정확한 표적 위치에 데옥시리보핵산 (DNA)를 컷팅하기 위해 부위 특이적 뉴클레아제를 이용하여, 이로써 게놈 이내 특정한 위치에 이중-가닥 또는 단일-가닥 DNa 절단을 창출하는 방법을 포함한다. 그와 같은 절단은, Cox 등, Nature Medicine 21(2), 121-31 (2015)에서 최근에 검토된 바와 같이, 천연, 내인성 세포 과정, 예컨대 상동 직접 수선 (HDR) 및 비상동 말단 연결 (NHEJ)에 의해 수선될 수 있고 규칙적으로 수선된다. NHEJ는 직접적으로, 유전자 발현을 파괴 또는 향상시킬 수 있는, 때때로 뉴클레오타이드 서열의 손실 또는 부가로, 이중-가닥 절단에서 비롯하는 DNA 단부를 연결시킨다. HDR은, 절단점에 정의된 DNA 서열 삽입용 템플레이트로서, 상동성 서열, 또는 공여체 서열을 사용한다. 상동성 서열은 내인성 게놈, 예컨대 자매 염색분체내 있을 수 있다. 대안적으로, 공여체는, 뉴클레아제-절단된 유전자좌와 높은 상동성의 영역을 갖지만, 또한 절단된 표적 유전자좌 속으로 편입될 수 있는 결실을 포함하는 추가의 서열 또는 서열 변화를 함유할 수 있는, 외인성 핵산, 예컨대 플라스미드, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드, 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드, 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드 또는 바이러스일 수 있다. 제3 수선 기전은, 또한 "대안적인 NHEJ"로서 지칭된, 미세상동성-매개된 말단 연결 (MMEJ)이고, 여기에서 유전적 결과는 작은 결실 및 삽입이 절단 부위에 발생할 수 있다는 점에서 NHEJ에 유사하다. MMEJ는 더욱 양호한 DNA 말단 연결 수선 결과를 구동시키기 위해 DNA 절단 부위를 측접하는 몇몇 염기쌍의 상동성 서열을 이용하고, 최근 보고는 이러한 과정의 분자 기전을 추가로 설명하고 있다; 참조, 예를 들면, Cho and Greenberg, Nature 518, 174-76 (2015); Kent 등, Nature Structural and Molecular Biology, Adv. Online doi:10.1038/nsmb.2961(2015); Mateos-Gomez 등, Nature 518, 254-57 (2015); Ceccaldi 등, Nature 528, 258-62 (2015). 일부 사례에서 DNA 절단의 부위에서 잠재적인 미세상동성의 분석에 기반하여 유사하게 수선 결과를 예측하는 것이 가능할 수 있다.
각각의 이들 게놈 편집 기전은 원하는 게놈 변경을 창출하는데 사용될 수 있다. 게놈 편집 과정에서 단계는, 의도된 돌연변이의 부위에 가능한 가까운, 상기 표적 유전자좌에서, 1개 또는 2개 DNA 절단, 이중-가닥 절단으로서 또는 2개 단일-가닥 절단으로서 후자를 창출하는 것이다. 이것은, 본 명세서에서 기재된 및 설명된 바와 같이, 부위 특이적 폴리펩타이드의 이용을 통해 달성될 수 있다.
부위 특이적 폴리펩타이드, 예컨대 DNA 엔도뉴클레아제는 핵산, 예를 들면, 게놈 DNA에서 이중-가닥 절단 또는 단일-가닥 절단을 도입할 수 있다. 이중-가닥 절단은 세포의 내인성 DNA-수선 경로 (예를 들면, 상동성-의존적 수선 또는 비상동 말단 연결 또는 대안적인 비상동 말단 연결 (A-NHEJ) 또는 미세상동성-매개된 말단 연결)을 자극시킬 수 있다. NHEJ는 상동성 템플레이트에 대하여 필요 없이 절단된 표적 핵산을 수선할 수 있다. 이것은 절단의 부위에 표적 핵산에서 작은 결실 또는 삽입 (인델)을 때때로 초래할 수 있고, 유전자 발현의 파괴 또는 변경으로 이어질 수 있다. HDR은 상동성 수선 템플레이트, 또는 공여체가 이용가능한 경우 발생할 수 있다. 상동성 공여체 템플레이트는 표적 핵산 절단 부위를 측접하는 서열에 상동성인 서열을 포함한다. 자매 염색분체는 수선 템플레이트로서 세포에 의해 일반적으로 사용된다. 그러나, 게놈 편집의 목적으로, 수선 템플레이트는 종종 외인성 핵산, 예컨대 플라스미드, 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드, 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드, 또는 바이러스성 핵산으로서 공급된다. 외인성 공여체 템플레이트로, 추가의 또는 변경된 핵산 서열이 또한 상기 표적 유전자좌 속으로 편입되도록 상동성의 측접하는 영역 사이 추가의 핵산 서열 (예컨대 이식유전자) 또는 변형 (예컨대 단일 또는 다중 염기 변화 또는 결실)을 도입하는 것이 흔하다. MMEJ는 작은 결실 및 삽입이 절단 부위에 발생할 수 있다는 점에서 NHEJ에 유사한 유전적 결과를 초래한다. MMEJ는 양호한 말단 연결 DNA 수선 결과를 구동시키기 위해 절단 부위를 측접하는 몇몇 염기쌍의 상동성 서열을 이용한다. 일부 사례에서 뉴클레아제 표적 영역에서 잠재적인 미세상동성의 분석에 기반하여 유사하게 수선 결과를 예측하는 것이 가능할 수 있다.
따라서, 일부 경우에, 상동성 재조합은 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 절단 부위 속으로 삽입하는데 사용된다. 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 공여체 폴리뉴클레오타이드 (또는 공여체 또는 공여체 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트)로 칭해진다. 일부 구현예에서, 공여체 폴리뉴클레오타이드, 공여체 폴리뉴클레오타이드의 부분, 공여체 폴리뉴클레오타이드의 카피, 또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 카피의 부분은 표적 핵산 절단 부위 속으로 삽입된다. 일부 구현예에서, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열, 즉, 표적 핵산 절단 부위에서 자연적으로 발생하지 않는 서열이다.
NHEJ 및/또는 HDR로 인해 표적 DNA의 변형은, 예를 들어, 돌연변이, 결실, 변경, 통합, 유전자 정정, 유전자 대체, 유전자 태깅, 이식유전자 삽입, 뉴클레오타이드 결실, 유전자 파괴, 전좌 및/또는 유전자 돌연변이로 이어질 수 있다. 게놈 DNA 결실 및 비-원상태 핵산의 게놈 DNA 속으로의 통합의 과정은 게놈 편집의 예이다.
CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템
CRISPR (클러스터링된 규칙적으로 배치된 짧은 회문 반복부) 게놈 유전자좌는 많은 원핵생물 (예를 들면, 박테리아 및 고세균)의 게놈에서 발견될 수 있다. 원핵생물에서, CRISPR 유전자좌는 외래 침입자, 예컨대 바이러스 및 파아지에 대해 원핵생물의 방어를 돕기 위한 면역 시스템의 한 유형으로서 기능하는 생성물을 인코딩한다. CRISPR 유전자좌 기능의 3개 단계가 있다: 신규한 서열의 유전자좌 속으로의 통합, CRISPR RNA (crRNA)의 생합성, 및 외래 침입자 핵산의 침묵화. CRISPR 시스템의 5개 유형 (예를 들면, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 U, 및 유형 V)는 확인되고 있다.
CRISPR 유전자좌는 "반복부"로서 지칭된 수많은 짧은 반복 서열을 포함한다. 반복부는 헤어핀 구조를 형성할 수 있고/있거나 체계 없는 단일-가닥 서열을 포함할 수 있다. 반복부는 일반적으로 클러스터내 발생하고 종 사이 빈번하게 분기한다. 반복부는 "스페이서"로서 지칭된 특유의 개입 서열로 규칙적으로 배치되어, 반복부-스페이서-반복부 유전자좌 구조를 초래한다. 스페이서는 공지된 외래 침입자 서열과 동일하거나 상기와 높은 상동성을 갖는다. 스페이서-반복부 유닛은, 스페이서-반복부 유닛의 성숙한 형태로 가공되는, crisprRNA (crRNA)를 인코딩한다. crRNA는 표적 핵산 표적화에 관여되는 "종자" 또는 스페이서 서열을 포함한다 (원핵생물내 자연 발생 형태에서, 스페이서 서열은 외래 침입자 핵산을 표적한다). 스페이서 서열은 crRNA의 5' 또는 3' 단부에 위치한다.
CRISPR 유전자좌는 또한 CRISPR 관련된 (Cas) 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. Cas 유전자는 원핵생물내 crRNA 기능의 생합성 및 간섭 단계에서 관여된 엔도뉴클레아제를 인코딩한다. 일부 Cas 유전자는 상동성 2차 및/또는 3차 구조를 포함한다.
유형 II CRISPR 시스템
사실상 유형 II CRISPR 시스템에서 crRNA 생합성은 트랜스-활성화 CRISPR RNA (tracrRNA)를 요구한다. tracrRNA는 내인성 RNaseIII에 의해 변형되고, 그 다음 사전-crRNA 어레이에서 crRNA 반복부에 하이브리드화한다. 내인성 RNaseIII은 사전-crRNA를 절단하는데 동원된다. 절단된 crRNAs는 성숙한 crRNA 형태를 생산하기 위해 엑소리보뉴클레아제 트리밍 (예를 들면, 5' 트리밍)을 거친다. tracrRNA는 crRNA에 하이브리드화되어 있고, tracrRNA 및 crRNA는 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, Cas9)와 회합한다. crRNA-tracrRNA-Cas9 복합체의 crRNA는 crRNA가 하이브리드화할 수 있는 표적 핵산에 복합체를 가이드한다. 표적 핵산에 crRNA의 하이브리드화는 표적화된 핵산 절단을 위하여 Cas9를 활성화시킨다. 유형 II CRISPR 시스템에서 표적 핵산은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)으로서 지칭된다. 사실상, PAM은 표적 핵산에 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, Cas9)의 결합을 용이하게 하는데 필수적이다. 유형 II 시스템 (또한 Nmeni 또는 CASS4로서 지칭됨) 은 유형 II-A (CASS4) 및 II-B (CASS4a)로 추가로 세분된다. Jinek 등, Science, 337(6096):816-821 (2012)는 CRISPR/Cas9 시스템이 RNA-프로그래밍가능한 게놈 편집에 유용하고, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2013/176772가 부위-특이적 유전자 편집용 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 시스템의 수많은 예 및 적용을 제공한다는 것을 보여주었다.
유형 V CRISPR 시스템
유형 V CRISPR 시스템은 유형 II 시스템에서 몇 개의 중요한 차이를 갖는다. 예를 들어, Cpf1은, 유형 II 시스템과 대조적으로, tracrRNA가 부족한 단일 RNA-유도된 엔도뉴클레아제이다. 사실상, Cpf1-관련 CRISPR 어레이는 추가의 트랜스-활성화 tracrRNA의 요건 없이 성숙한 crRNAS로 가공된다. 유형 V CRISPR 어레이는, 직접적인 반복부의 19 뉴클레오타이드로 시작하고 스페이서 서열의 23-25 뉴클레오타이드로 이어지는 각각의 성숙한 crRNA를 가진, 42-44 뉴클레오타이드 길이의 짧은 성숙한 crRNAs로 가공된다. 그에 반해서, 유형 II 시스템에서 성숙한 crRNAs는 스페이서 서열의 20-24 뉴클레오타이드로 시작하고 직접적인 반복부의 약 22 뉴클레오타이드로 이어진다. 또한, Cpf1은, 유형 II 시스템용 표적 DNA 이후 G-풍부 PAM에 대조적인, Cpf1-crRNA 복합체가 짧은 T-풍부 PAM에 의해 선행된 표적 DNA를 효율적으로 절단하도록 T-풍부 프로토스페이서-인접한 모티프를 사용한다. 따라서, 유형 V 시스템은 PAM에서 먼 지점에서 절단하고, 반면 유형 II 시스템은 PAM에 인접한 지점에서 절단한다. 게다가, 유형 II 시스템에 대조적으로, Cpf1은 4 또는 5 뉴클레오타이드 5' 돌출부를 가진 엇갈린 DNA 이중-가닥 절단을 통해 DNA를 절단한다. 유형 II 시스템은 뭉툭한 이중-가닥 절단을 통해 절단한다. 유형 II 시스템에 유사하게, Cpf1은 예상된 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유하지만, 유형 II 시스템에 대조적인, 제2 HNH 엔도뉴클레아제 도메인이 부족하다.
Cas 유전자/폴리펩타이드 및 프로토스페이서 인접 모티프
예시적인 CRISPR/Cas 폴리펩타이드는 하기의 도 1에서 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다: Fonfara 등, Nucleic Acids, 42: 2577-2590 (2014). CRISPR/Cas 유전자 명명 시스템은 Cas 유전자가 발견된 이래 광범위한 갱신을 경험하였다. Fonfara, 상동의 도 5는 다양한 종으로부터 Cas9 폴리펩타이드에 PAM 서열을 제공한다.
부위 특이적 폴리펩타이드
부위 특이적 폴리펩타이드는 DNA를 절단하기 위해 게놈 편집에서 사용된 뉴클레아제이다. 부위 특이적은 하기 어느 한쪽으로서 세포 또는 환자에 투여될 수 있다: 1개 이상의 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 1개 이상의 mRNAs.
CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템의 맥락에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는, 차례로, 폴리펩타이드가 유도되는 표적 DNA에서 부위를 특정하는 가이드 RNA에 결합할 수 있다. 본 명세서에서 CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템의 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 엔도뉴클레아제, 예컨대 DNA 엔도뉴클레아제이다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 복수의 핵산-절단 (즉, 뉴클레아제) 도메인을 포함한다. 2개 이상의 핵산-절단 도메인은 링커를 통해 함께 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 가요성 링커를 포함한다. 링커는 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 또는 초과 아미노산을 포함한다.
자연 발생 야생형 Cas9 효소는 2개 뉴클레아제 도메인, HNH 뉴클레아제 도메인 및 RuvC 도메인을 포함한다. 본 명세서에서, "Cas9"는 양쪽 자연 발생 및 재조합 Cas9s를 지칭한다. 본 명세서에서 고려된 Cas9 효소는 HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인, 및/또는 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다.
HNH 또는 HNH-유사 도메인은 McrA-유사 폴드를 포함한다. HNH 또는 HNH-유사 도메인은 2개의 역평행 β-가닥 및 α-나선을 포함한다. HNH 또는 HNH-유사 도메인은 금속 결합 부위 (예를 들면, 2가 양이온 결합 부위)를 포함한다. HNH 또는 HNH-유사 도메인은 표적 핵산의 1개 가닥 (예를 들면, crRNa 표적화된 가닥의 상보적 가닥)을 절단시킬 수 있다.
RuvC 또는 RuvC-유사 도메인은 RNaseH 또는 RNaseH-유사 폴드를 포함한다. RuvC/RNaseH 도메인은 양쪽 RNA 및 DNA에서 작용을 포함하는 핵산-기반 기능의 다양한 세트에서 관여된다. RNaseH 도메인은 복수의 α-나선에 의해 둘러싸인 5 β-가닥을 포함한다. RuvC/RNaseH 또는 RuvC/RNaseH-유사 도메인은 금속 결합 부위 (예를 들면, 2가 양이온 결합 부위)를 포함한다. RuvC/RNaseH 또는 RuvC/RNaseH-유사 도메인은 표적 핵산의 1개 가닥 (예를 들면, 이중-가닥 표적 DNA의 비-상보적 가닥)을 절단시킬 수 있다.
부위 특이적 폴리펩타이드는 핵산, 예를 들면, 게놈 DNA내 이중-가닥 절단 또는 단일-가닥 절단을 도입할 수 있다. 이중-가닥 절단은 세포의 내인성 DNA-수선 경로 (예를 들면, 상동성-의존적 수선 (HDR) 또는 비상동 말단 연결 (NHEJ) 또는 대안적인 비상동 말단 연결 (A-NHEJ) 또는 미세상동성-매개된 말단 연결 (MMEJ))를 자극시킬 수 있다. NHEJ는 상동성 템플레이트에 대하여 필요 없이 절단된 표적 핵산을 수선할 수 있다. 이것은 때때로 절단의 부위에 표적 핵산에서 작은 결실 또는 삽입 (인델)을 초래할 수 있고, 유전자 발현의 파괴 또는 변경으로 이어질 수 있다. HDR은 상동성 치유 템플레이트, 또는 공여체가 이용가능한 경우 발생할 수 있다. 상동성 공여체 템플레이트는 표적 핵산 절단 부위를 측접하는 서열에 상동성인 서열을 포함한다. 자매 염색분체는 일반적으로 수선 템플레이트로서 세포에 의해 사용된다. 그러나, 게놈 편집의 목적으로, 수선 템플레이트는 종종 외인성 핵산, 예컨대 플라스미드, 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 바이러스성 핵산으로서 공급된다. 외인성 공여체 템플레이트로, 추가의 또는 변경된 핵산 서열이 또한 상기 표적 유전자좌 속으로 편입되도록 상동성의 측접하는 영역 사이 추가의 핵산 서열 (예컨대 이식유전자) 또는 변형 (예컨대 단일 또는 다중 염기 변화 또는 결실)을 도입하는 것이 흔하다. MMEJ는 작은 결실 및 삽입이 절단 부위에서 발생할 수 있다는 점에서 NHEJ에 유사한 유전적 결과를 초래한다. MMEJ는 양호한 말단 연결 DNA 수선 결과를 구동시키기 위해 절단 부위를 측접하는 몇몇 염기쌍의 상동성 서열을 이용한다. 일부 사례에서 뉴클레아제 표적 영역에서 잠재적인 미세상동성의 분석에 기반하여 유사하게 수선 결과를 예측하는 것이 가능할 수 있다.
따라서, 일부 경우에, 상동성 재조합은 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 표적 핵산 절단 부위에 삽입하는데 사용된다. 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 공여체 폴리뉴클레오타이드 (또는 공여체 또는 공여체 서열)로 일컬어진다. 일부 구현예에서, 공여체 폴리뉴클레오타이드, 공여체 폴리뉴클레오타이드의 부분, 공여체 폴리뉴클레오타이드의 카피, 또는 공여체 폴리뉴클레오타이드의 카피의 부분은 표적 핵산 절단 부위에 삽입된다. 일부 구현예에서, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열, 즉, 표적 핵산 절단 부위에서 자연적으로 발생하지 않는 서열이다.
NHEJ 및/또는 HDR로 인해 표적 DNA의 변형은, 예를 들어, 돌연변이, 결실, 변경, 통합, 유전자 정정, 유전자 대체, 유전자 태깅, 이식유전자 삽입, 뉴클레오타이드 결실, 유전자 파괴, 전좌 및/또는 유전자 돌연변이로 이어질 수 있다. 게놈 DNA의 결실 및 비-원상태 핵산의 게놈 DNA 속으로의 통합의 과정은 게놈 편집의 예이다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 야생형 예시적인 부위 특이적 폴리펩타이드 [예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, US2014/0068797 서열 식별 번호 8 또는 Sapranauskas 등, Nucleic Acids Res, 39(21): 9275-9282 (2011)], 및 다양한 다른 부위 특이적 폴리펩타이드)에 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 야생형 예시적인 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, 상동)의 뉴클레아제 도메인에 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 10 인접 아미노산에 걸쳐서 야생형 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, 상동)에 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, 또는 100% 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 많아야 하기를 포함한다: 10 인접 아미노산에 걸쳐서 야생형 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, 상동)에 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, 또는 100% 동일성. 일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 적어도 하기를 포함한다: 부위 특이적 폴리펩타이드의 HNH 뉴클레아제 도메인에서 10 인접 아미노산에 걸쳐서 야생형 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, 상동)에 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, 또는 100% 동일성. 일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 많아야 하기를 포함한다: 부위 특이적 폴리펩타이드의 HNH 뉴클레아제 도메인에서 10 인접 아미노산에 걸쳐서 야생형 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, 상동)에 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, 또는 100% 동일성. 일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 적어도 하기를 포함한다: 부위 특이적 폴리펩타이드의 RuvC 뉴클레아제 도메인에서 10 인접 아미노산에 걸쳐서 야생형 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, 상동)에 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, 또는 100% 동일성. 일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 많아야 하기를 포함한다: 부위 특이적 폴리펩타이드의 RuvC 뉴클레아제 도메인에서 10 인접 아미노산에 걸쳐 야생형 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, 상동)에 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99, 또는 100% 동일성.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 야생형 예시적인 부위 특이적 폴리펩타이드의 변형된 형태를 포함한다. 야생형 예시적인 부위 특이적 폴리펩타이드의 변형된 형태는 부위 특이적 폴리펩타이드의 핵산-절단 활성을 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 예시적인 부위 특이적 폴리펩타이드의 변형된 형태는 야생형 예시적인 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, 상동)의 핵산-절단 활성의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만을 갖는다. 부위 특이적 폴리펩타이드의 변형된 형태는 실질적인 핵산-절단 활성을 갖지 않을 수 있다. 부위 특이적 폴리펩타이드가 실질적인 핵산-절단 활성을 갖지 않는 변형된 형태인 경우, 본 명세서에서 "효소적으로 불활성"으로서 지칭된다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드의 변형된 형태는 (예를 들면, 이중-가닥 표적 핵산의 당-포스페이트 골격의 단 하나의 컷팅에 의해) 표적 핵산에서 단일-가닥 절단 (SSB)를 유도할 수 있도록 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 야생형 부위 지향된 폴리펩타이드 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 Cas9, 상동)의 복수의 핵산-절단 도메인의 1개 이상에서 핵산-절단 활성의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만을 초래한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 표적 핵산의 상보적 가닥을 절단하는 능력을 보유하지만, 표적 핵산의 비-상보적 가닥을 절단하는 그것의 능력을 감소시키는 복수의 핵산-절단 도메인의 1개 이상을 초래한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 표적 핵산의 비-상보적 가닥을 절단하는 능력을 보유하지만, 표적 핵산의 상보적 가닥을 절단하는 그것의 능력을 감소시키는 복수의 핵산-절단 도메인의 1개 이상을 초래한다. 예를 들어, 야생형 예시적인 S. 파이오제네스 Cas9 폴리펩타이드에서 잔기, 예컨대 Asp10, His840, Asn854 및 Asn856은 복수의 핵산-절단 도메인 (예를 들면, 뉴클레아제 도메인)의 1개 이상을 비활성화시키기 위해 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 돌연변이되는 잔기는 (예를 들면, 서열 및/또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이) 야생형 예시적인 S. 파이오제네스 Cas9 폴리펩타이드에서 잔기 Asp10, His840, Asn854 및 Asn856에 상응한다. 돌연변이의 비-제한 예는 D10A, H840A, N854A 또는 N856A를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 알라닌 치환이 아닌 돌연변이가 적합하다는 것을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, D10A 돌연변이는 1개 이상의 H840A, N854A, 또는 N856A 돌연변이와 조합되어 실질적으로 DNA 절단 활성이 부족한 부위 특이적 폴리펩타이드를 생산한다. 일부 구현예에서, H840A 돌연변이는 1개 이상의 D10A, N854A, 또는 N856A 돌연변이와 조합되어 실질적으로 DNA 절단 활성이 부족한 부위 특이적 폴리펩타이드를 생산한다. 일부 구현예에서, N854A 돌연변이는 1개 이상의 H840A, D10A, 또는 N856A 돌연변이와 조합되어 실질적으로 DNA 절단 활성이 부족한 부위 특이적 폴리펩타이드를 생산한다. 일부 구현예에서, N856A 돌연변이는 1개 이상의 H840A, N854A, 또는 D10A 돌연변이와 조합되어 실질적으로 DNA 절단 활성이 부족한 부위 특이적 폴리펩타이드를 생산한다. 1개의 실질적으로 불활성 뉴클레아제 도메인을 포함하는 부위 특이적 폴리펩타이드는 "니카제"로서 지칭된다.
RNA-유도된 엔도뉴클레아제의 니카제 변이체, 예를 들어 Cas9는 CRISPR-매개된 게놈 편집의 특이성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 야생형 Cas9는 표적 서열에서 지정된 ~20 뉴클레오타이드 서열 (예컨대 내인성 게놈 유전자좌)로 하이브리드화하도록 설계된 단일 가이드 RNA에 의해 전형적으로 유도된다. 그러나, 몇 개의 미스매치는 가이드 RNA와 상기 표적 유전자좌 사이 용인되어, 예를 들어, 상동성의 13 nt만큼 적게, 표적 부위에서 요구된 상동성의 길이를 효과적으로 감소시킬 수 있고, 이로써 상기 표적 게놈에서 다른 곳에 CRISPR/Cas9 복합체에 의해 이중-가닥 핵산 절단 - 또한 부정확한 절단으로서 공지됨 및 결합에 대하여 상승된 잠재력을 초래할 수 있다. Cas9 각각의 니카제 변이체가 1개 가닥을 단지 컷팅하기 때문에, 이중-가닥 절단을 창출하기 위해 한 쌍의 니카제가 표적 핵산의 반대편 가닥상에 그리고 매우 근접해서 결합하여, 이로써 이중-가닥 절단의 등가물인, 한 쌍의 닉을 창출하는 것이 필요하다. 이것은 2개의 별개의 가이드 RNAs - 각각의 니카제를 위한 것 - 가 표적 핵산의 반대편 가닥상에 그리고 매우 근접에서 결합해야 하는 것을 요구한다. 이러한 요건은 본질적으로 이중-가닥 절단이 발생하는데 필요한 상동성의 최소 길이의 두배가 되어, 이로써, 2개 가이드 RNA 부위 - 이들이 존재한다면 - 가 이중-가닥 절단을 형성시키기 위해 서로에 충분히 가깝게 될 것 같지 않은, 이중-가닥 절단 이벤트가 게놈에서 다른 곳에 발생할 가능성을 감소시킨다. 당해 분야에서 기재된 바와 같이, 니카제는 HDR 대 NHEJ를 촉진시키는데 또한 사용될 수 있다. HDR은 원하는 변화를 효과적으로 매개하는 특이적 공여체 서열의 이용을 통해 게놈에서 표적 부위에 선택된 변화를 도입하는데 사용될 수 있다. 유전자 편집에서 사용하기 위한 다양한 CRISPR/Cas 시스템의 설명은, 예를 들면, 하기에서 발견될 수 있다: 국제 특허 출원 공개 번호 WO2013/176772, 및 Nature Biotechnology 32, 347-355 (2014), 및 본 명세서에서 인용된 참조문헌.
고려된 돌연변이는 치환, 첨가, 및 결실, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을 알라닌으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을 또 다른 아미노산 (예를 들면, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 또는 아르기닌)으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을 비-천연 아미노산 (예를 들면, 셀레노메티오닌)으로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을 아미노산 모방체 (예를 들면, 포스포모방체)로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 보존적 돌연변이이다. 예를 들어, 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을 크기, 형상, 전하, 극성, 형태를 닮은 아미노산, 및/또는 돌연변이된 아미노산 (예를 들면, 시스테인/세린 돌연변이, 라이신/아스파라긴 돌연변이, 히스티딘/페닐알라닌 돌연변이)의 회전이성질체로 전환시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 해독틀내 이동 및/또는 미성숙한 종결 코돈의 창출을 야기한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 1개 이상의 유전자의 발현에 영향을 주는 유전자 또는 유전자좌의 조절 영역에 변화를 야기한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, 변이체, 돌연변이된, 효소적으로 불활성 및/또는 조건적으로 효소적으로 불활성 부위 특이적 폴리펩타이드)는 핵산을 표적한다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, 변이체, 돌연변이된, 효소적으로 불활성 및/또는 조건적으로 효소적으로 불활성 엔도리보뉴클레아제)는 RNA를 표적한다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, 변이체, 돌연변이된, 효소적으로 불활성 및/또는 조건적으로 효소적으로 불활성 엔도리보뉴클레아제)는 DNA를 표적한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 1개 이상의 비-원상태 서열을 포함한다 (예를 들면, 부위 특이적 폴리펩타이드는 융합 단백질이다).
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 박테리아 (예를 들면, S. 파이오제네스)로부터 Cas9, 핵산 결합 도메인, 및 2개 핵산 절단 도메인 (즉, HNH 도메인 및 RuvC 도메인)에 적어도 15% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 박테리아 (예를 들면, S. 파이오제네스)로부터 Cas9, 및 2개 핵산 절단 도메인 (즉, HNH 도메인 및 RuvC 도메인)에 적어도 15% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 박테리아 (예를 들면, S. 파이오제네스)로부터 Cas9, 및 2개 핵산 절단 도메인에 적어도 15% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 핵산 절단 도메인의 한쪽 또는 양쪽은 박테리아 (예를 들면, S. 파이오제네스)로부터 Cas9에서 뉴클레아제 도메인에 적어도 50% 아미노산 동일성을 포함한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 박테리아 (예를 들면, S. 파이오제네스)로부터 Cas9, 2개 핵산 절단 도메인 (즉, HNH 도메인 및 RuvC 도메인)에 적어도 15% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열, 및 비-원상태 서열 (예를 들어, 핵 국재화 신호) 또는 비-원상태 서열에 부위 특이적 폴리펩타이드를 연결하는 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 박테리아 (예를 들면, S. 파이오제네스)로부터 Cas9, 2개 핵산 절단 도메인 (즉, HNH 도메인 및 RuvC 도메인)에 적어도 15% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 부위 특이적 폴리펩타이드는 뉴클레아제 도메인의 절단 활성을 적어도 50%만큼 감소시키는 핵산 절단 도메인의 한쪽 또는 양쪽에서 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드는 박테리아 (예를 들면, S. 파이오제네스)로부터 Cas9, 및 2개 핵산 절단 도메인 (즉, HNH 도메인 및 RuvC 도메인)에 적어도 15% 아미노산 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레아제 도메인의 한쪽은 아스파르트산 10의 돌연변이를 포함하고/하거나, 여기서 뉴클레아제 도메인의 한쪽은 히스티딘 840의 돌연변이를 포함하고, 여기서 상기 돌연변이는 뉴클레아제 도메인(들)의 절단 활성을 적어도 50%만큼 감소시킨다.
본 발명의 일부 구현예에서, 1개 이상의 부위 특이적 폴리펩타이드, 예를 들면 DNA 엔도뉴클레아제는 게놈에서 특이적 유전자좌에 1개의 이중-가닥 절단을 함께 발효시키는 2개 니카제, 또는 게놈에서 특이적 유전자좌에 2개의 이중-가닥 절단을 함께 발효시키는 4개 니카제를 포함한다. 대안적으로, 하나의 부위 특이적 폴리펩타이드, 예를 들면 DNA 엔도뉴클레아제는 게놈에서 특이적 유전자좌에 1개의 이중-가닥 절단을 발효시킨다.
게놈-표적 핵산
본 개시내용은 표적 핵산 이내 특이적 표적 서열에 관련된 폴리펩타이드 (예를 들면, 부위 특이적 폴리펩타이드)의 활성을 유도할 수 있는 게놈-표적 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 게놈-표적 핵산은 RNA이다. 게놈-표적 RNA는 본 명세서에서 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"로서 지칭된다. 가이드 RNA는 관심 표적 핵산 서열에 하이브리드화하는 스페이서 서열, 및 CRISPR 반복부 서열을 적어도 포함한다. 유형 II 시스템에서, gRNA는 또한 tracrRNA 서열을 포함한다. 유형 II 가이드 RNA에서, CRISPR 반복부 서열 및 tracrRNA 서열은 서로에 하이브리드화하여 듀플렉스를 형성한다. 유형 V 가이드 RNA에서, crRNA는 듀플렉스를 형성한다. 양쪽 시스템에서, 듀플렉스는 부위 특이적 폴리펩타이드를 결합시켜서, 가이드 RNA 및 부위 특이적 폴리펩타이드는 복합체를 형성한다. 게놈-표적 핵산은 부위 특이적 폴리펩타이드와 그것의 회합의 덕으로 복합체에 표적 특이성을 제공한다. 게놈-표적 핵산은 따라서 부위 특이적 폴리펩타이드의 활성을 유도한다.
예시적인 가이드 RNAs는, 그것의 표적 서열 및 관련된 Cas9 컷트 부위의 게놈 위치로 보여진, 서열 식별 번호: 1-18807에서 스페이서 서열을 포함하고, 여기서 상기 게놈 위치는 GRCh38/hg38 인간 게놈 어셈블리에 기반된다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 각각의 가이드 RNA는 그것의 게놈 표적 서열에 상보적인 스페이서 서열을 포함하도록 설계된다. 예를 들어, 서열 식별 번호: 1-18807에서 각각의 스페이서 서열은 (상응하는 tracrRNA와 함께) 단일 RNA 키메라 또는 crRNA에 들어갈 수 있다. 참조 Jinek 등, Science, 337, 816-821 (2012) 및 Deltcheva 등, Nature, 471, 602-607 (2011).
일부 구현예에서, 게놈-표적 핵산은 이중-분자 가이드 RNA이다. 일부 구현예에서, 게놈-표적 핵산은 단일-분자 가이드 RNA이다.
이중-분자 가이드 RNA는 RNA의 2개 가닥을 포함한다. 제1 가닥은, 5'에서 3' 방향으로, 선택적인 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열 및 최소 CRISPR 반복부 서열을 포함한다. 제2 가닥은 (최소 CRISPR 반복부 서열에 상보적인) 최소 tracrRNA 서열, 3' tracrRNA 서열 및 선택적인 tracrRNA 연장 서열을 포함한다.
유형 II 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA는, 5'에서 3' 방향으로, 선택적인 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 최소 CRISPR 반복부 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 서열, 3' tracrRNA 서열 및 선택적인 tracrRNA 연장 서열을 포함한다. 선택적인 tracrRNA 연장은 추가의 기능성 (예를 들면, 안정성)을 가이드 RNA에 기여하는 요소를 포함할 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 최소 CRISPR 반복부 및 최소 tracrRNA 서열을 연결시켜 헤어핀 구조를 형성한다. 선택적인 tracrRNA 연장은 1개 이상의 헤어핀을 포함한다.
유형 V 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA는, 5'에서 3' 방향으로, 최소 CRISPR 반복부 서열 및 스페이서 서열을 포함한다.
예시로서, CRISPR/Cas 시스템에서 사용된 가이드 RNAs, 또는 다른 더 작은 RNAs는, 아래 설명된 그리고 당해 분야에서 기재된 바와 같이, 화학적 수단에 의해 쉽게 합성될 수 있다. 화학 합성 절차가 계속해서 확장하는 동안, 절차 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 (겔 예컨대 PAGE의 이용을 피하는, HPLC)에 의한 그와 같은 RNAs의 정제는 폴리뉴클레오타이드 길이가 100을 넘어 상당히 증가하거나 뉴클레오타이드가 그렇게 함에 따라 더욱 도전적이게 되는 경향이 있다. 더 큰 길이의 RNAs 생성에 사용된 하나의 접근법은 함께 결찰되는 2개 이상의 분자를 생산하는 것이다. 훨씬 더 긴 RNAs, 예컨대 Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 것은 효소적으로 더욱 쉽게 생성된다. RNA 변형, 예를 들면, 당해 분야에서 기재된 바와 같이, 안정성을 향상시키는, 타고난 면역 반응의 가능성 또는 정도를 감소시키는, 및/또는 다른 속성을 향상시키는 변형의 다양한 유형은 RNAs의 화학 합성 및/또는 효소 생성 동안 또는 이후 도입될 수 있다.
스페이서 연장 서열
게놈-표적 핵산의 일부 구현예에서, 스페이서 연장 서열은 게놈-표적 핵산의 변형에 안정성 및/또는 위치를 제공할 수 있다. 스페이서 연장 서열은 정확한 또는 부정확한 활성 또는 특이성을 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 연장 서열은 제공된다. 스페이서 연장 서열은 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 또는 7000 또는 초과 뉴클레오타이드 초과의 길이를 가질 수 있다. 스페이서 연장 서열은 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000 또는 초과 뉴클레오타이드 미만의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서 연장 서열은 길이가 10 뉴클레오타이드 미만이다. 일부 구현예에서, 스페이서 연장 서열은 길이가 10-30 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 스페이서 연장 서열은 길이가 30-70 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 스페이서 연장 서열은 또 다른 모이어티 (예를 들면, 안정성 제어 서열, 엔도리보뉴클레아제 결합 서열, 리보자임)을 포함한다. 일부 구현예에서, 모이어티는 핵산을 표적하는 핵산의 안정성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 모이어티는 전사 종결자 세그먼트 (즉, 전사 종결 서열)이다. 일부 구현예에서, 모이어티는 진핵 세포에서 기능한다. 일부 구현예에서, 모이어티는 원핵 세포에서 기능한다. 일부 구현예에서, 모이어티는 양쪽 진핵 및 원핵 세포에서 기능한다. 적합한 모이어티의 비-제한 예는 하기를 포함한다: 5' 캡 (예를 들면, 7-메틸구아닐레이트 캡 (m7 G)), 리보스위치 서열 (예를 들면, 단백질 및 단백질 복합체에 의해 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 허용하기 위해), dsRNA 듀플렉스 (즉, 헤어핀)을 형성하는 서열, 세포하 위치 (예를 들면, 핵, 미토콘드리아, 엽록체, 및 기타 동종)에 RNA를 표적하는 서열, 추적에 제공하는 변형 또는 서열 (예를 들면, 형광 분자에 직접적인 콘주게이션, 형광 검출을 용이하게 하는 모이어티에 콘주게이션, 형광 검출을 허용하는 서열, 등), 및/또는 단백질 (예를 들면, 전사 활성제, 전사 억제인자, DNA 메틸전달효소, DNA 탈메틸효소, 히스톤 아세틸전달효소, 히스톤 탈아세틸화효소, 및 기타 동종을 포함하는, DNA에서 작용하는 단백질)에 결합 부위를 제공하는 변형 또는 서열.
스페이서 서열
스페이서 서열은 관심 표적 핵산내 서열에 하이브리드화한다. 게놈-표적 핵산의 스페이서는 하이브리드화 (즉, 염기 짝짓기)를 통해 서열-특이적 방식으로 표적 핵산과 상호작용한다. 스페이서의 뉴클레오타이드 서열은 따라서 관심 표적 핵산의 서열에 의존하여 다양하다.
본 명세서에서 CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서 서열은 시스템에서 사용된 Cas9 효소의 PAM의 5' 위치한 표적 핵산에 하이브리드화하도록 설계된다. 스페이서는 표적 서열을 완벽하게 매치할 수 있거나 미스매치를 가질 수 있다. 각각의 Cas9 효소는 표적 DNA에서 인식하는 특정한 PAM 서열을 갖는다. 예를 들어, S. 파이오제네스는 서열 5'-NRG-3'를 포함하는 PAM을 표적 핵산에서 인식하고, 여기에서 R은 어느 한쪽 A 또는 G를 포함하고, N은 임의의 뉴클레오타이드이고 N은 스페이서 서열에 의해 표적화된표적 핵산 서열의 바로 접해서 3'이다.
일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 20 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 20 초과 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 20 미만 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 적어도 하기를 포함한다: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 또는 초과 뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 많아야 하기를 포함한다: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 또는 초과 뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 PAM의 제1 뉴클레오타이드의 바로 접해서 5' 20 염기를 포함한다. 예를 들어, 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3' (서열 식별 번호: 18808)을 포함하는 서열에서, 표적 핵산은 Ns에 상응하는 서열을 포함하고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드이고, 밑줄친 NRG 서열은 S. 파이오제네스 PAM이다.
일부 구현예에서, 표적 핵산에 하이브리드화하는 스페이서 서열은 적어도 약 6 뉴클레오타이드 (nt)의 길이를 갖는다. 스페이서 서열은 하기일 수 있다: 적어도 약 6 nt, 적어도 약 10 nt, 적어도 약 15 nt, 적어도 약 18 nt, 적어도 약 19 nt, 적어도 약 20 nt, 적어도 약 25 nt, 적어도 약 30 nt, 적어도 약 35 nt 또는 적어도 약 40 nt, 약 6 nt 내지 약 80 nt, 약 6 nt 내지 약 50 nt, 약 6 nt 내지 약 45 nt, 약 6 nt 내지 약 40 nt, 약 6 nt 내지 약 35 nt, 약 6 nt 내지 약 30 nt, 약 6 nt 내지 약 25 nt, 약 6 nt 내지 약 20 nt, 약 6 nt 내지 약 19 nt, 약 10 nt 내지 약 50 nt, 약 10 nt 내지 약 45 nt, 약 10 nt 내지 약 40 nt, 약 10 nt 내지 약 35 nt, 약 10 nt 내지 약 30 nt, 약 10 nt 내지 약 25 nt, 약 10 nt 내지 약 20 nt, 약 10 nt 내지 약 19 nt, 약 19 nt 내지 약 25 nt, 약 19 nt 내지 약 30 nt, 약 19 nt 내지 약 35 nt, 약 19 nt 내지 약 40 nt, 약 19 nt 내지 약 45 nt, 약 19 nt 내지 약 50 nt, 약 19 nt 내지 약 60 nt, 약 20 nt 내지 약 25 nt, 약 20 nt 내지 약 30 nt, 약 20 nt 내지 약 35 nt, 약 20 nt 내지 약 40 nt, 약 20 nt 내지 약 45 nt, 약 20 nt 내지 약 50 nt, 또는 약 20 nt 내지 약 60 nt. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 20 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 19 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 스페이서 서열과 표적 핵산 사이 퍼센트 상보성은 하기이다: 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%. 일부 구현예에서, 스페이서 서열과 표적 핵산 사이 퍼센트 상보성은 하기이다: 많아야 약 30%, 많아야 약 40%, 많아야 약 50%, 많아야 약 60%, 많아야 약 65%, 많아야 약 70%, 많아야 약 75%, 많아야 약 80%, 많아야 약 85%, 많아야 약 90%, 많아야 약 95%, 많아야 약 97%, 많아야 약 98%, 많아야 약 99%, 또는 100%. 일부 구현예에서, 스페이서 서열과 표적 핵산 사이 퍼센트 상보성은 표적 핵산의 상보적 가닥의 표적 서열의 6개 인접 5'-최말단 뉴클레오타이드에 걸쳐 100%이다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열과 표적 핵산 사이 퍼센트 상보성은 약 20 인접 뉴클레오타이드에 걸쳐 적어도 60%이다. 스페이서 서열과 표적 핵산 사이 길이는, 벌지 또는 벌지들로서 생각될 수 있는, 1 내지 6 뉴클레오타이드만큼 상이할 수 있다.
일부 구현예에서, 스페이서 서열은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 설계 또는 선택된다. 컴퓨터 프로그램은 변수, 예컨대 예상된 용융 온도, 2차 구조 형성, 예상된 어닐링 온도, 서열 동일성, 게놈 맥락, 염색질 접근성, % GC, 게놈 발생의 (예를 들면, 동일하거나 유사하지만 미스매치, 삽입 또는 결실의 결과로서 1개 이상의 스팟에서 다양한 서열의) 빈도, 메틸화 상태, SNPs의 존재, 및 기타 동종을 이용할 수 있다.
최소 CRISPR 반복부 서열
일부 구현예에서, 최소 CRISPR 반복부 서열은 참조 CRISPR 반복부 서열 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 crRNA)에 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 서열 동일성을 가진 서열이다.
최소 CRISPR 반복부 서열은 세포에서 최소 tracrRNA 서열을 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드를 포함한다. 최소 CRISPR 반복부 서열 및 최소 tracrRNA 서열은 듀플렉스, 즉 염기-짝짓기된 이중-가닥 구조를 형성한다. 함께, 최소 CRISPR 반복부 서열 및 최소 tracrRNA 서열은 부위 특이적 폴리펩타이드에 결합한다. 최소 CRISPR 반복부 서열의 적어도 일부는 최소 tracrRNA 서열에 하이브리드화한다. 일부 구현예에서, 최소 CRISPR 반복부 서열의 적어도 일부는 최소 tracrRNA 서열에 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 상보성을 포함한다. 일부 구현예에서, 최소 CRISPR 반복부 서열의 적어도 일부는 최소 tracrRNA 서열에 많아야 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 상보성을 포함한다.
최소 CRISPR 반복부 서열은 길이 약 7 뉴클레오타이드 내지 약 100 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 최소 CRISPR 반복부 서열의 길이는 하기이다: 약 7 뉴클레오타이드 (nt) 내지 약 50 nt, 약 7 nt 내지 약 40 nt, 약 7 nt 내지 약 30 nt, 약 7 nt 내지 약 25 nt, 약 7 nt 내지 약 20 nt, 약 7 nt 내지 약 15 nt, 약 8 nt 내지 약 40 nt, 약 8 nt 내지 약 30 nt, 약 8 nt 내지 약 25 nt, 약 8 nt 내지 약 20 nt, 약 8 nt 내지 약 15 nt, 약 15 nt 내지 약 100 nt, 약 15 nt 내지 약 80 nt, 약 15 nt 내지 약 50 nt, 약 15 nt 내지 약 40 nt, 약 15 nt 내지 약 30 nt, 또는 약 15 nt 내지 약 25 nt. 일부 구현예에서, 최소 CRISPR 반복부 서열은 길이가 대략 9 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 최소 CRISPR 반복부 서열은 길이가 대략 12 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 최소 CRISPR 반복부 서열은 적어도 6, 7, 또는 8 인접 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 참조 최소 CRISPR 반복부 서열 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 야생형 crRNA)에 적어도 약 60% 동일하다. 예를 들어, 최소 CRISPR 반복부 서열은 적어도 6, 7, 또는 8 인접 뉴클레오타이드의 참조 최소 CRISPR 반복부 서열에 적어도 약 65% 동일, 적어도 약 70% 동일, 적어도 약 75% 동일, 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 85% 동일, 적어도 약 90% 동일, 적어도 약 95% 동일, 적어도 약 98% 동일, 적어도 약 99% 동일 또는 100% 동일하다.
최소 tracrRNA 서열
일부 구현예에서, 최소 tracrRNA 서열은 참조 tracrRNA 서열 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 야생형 tracrRNA)에 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 서열 동일성을 가진 서열이다.
최소 tracrRNA 서열은 세포에서 최소 CRISPR 반복부 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 최소 tracrRNA 서열 및 최소 CRISPR 반복부 서열은 듀플렉스, 즉 염기-짝짓기된 이중-가닥 구조를 형성한다. 함께, 최소 tracrRNA 서열 및 최소 CRISPR 반복부는 부위 특이적 폴리펩타이드에 결합한다. 최소 tracrRNA 서열의 적어도 일부는 최소 CRISPR 반복부 서열에 하이브리드화할 수 있다. 일부 구현예에서, 최소 tracrRNA 서열은 최소 CRISPR 반복부 서열에 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 상보성이다.
최소 tracrRNA 서열은 길이 약 7 뉴클레오타이드 내지 약 100 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 최소 tracrRNA 서열은 약 7 뉴클레오타이드 (nt) 내지 약 50 nt, 약 7 nt 내지 약 40 nt, 약 7 nt 내지 약 30 nt, 약 7 nt 내지 약 25 nt, 약 7 nt 내지 약 20 nt, 약 7 nt 내지 약 15 nt, 약 8 nt 내지 약 40 nt, 약 8 nt 내지 약 30 nt, 약 8 nt 내지 약 25 nt, 약 8 nt 내지 약 20 nt, 약 8 nt 내지 약 15 nt, 약 15 nt 내지 약 100 nt, 약 15 nt 내지 약 80 nt, 약 15 nt 내지 약 50 nt, 약 15 nt 내지 약 40 nt, 약 15 nt 내지 약 30 nt 또는 약 15 nt 내지 약 25 nt 길 수 있다. 일부 구현예에서, 최소 tracrRNA 서열은 길이가 대략 9 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 최소 tracrRNA 서열은 대략 12 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 최소 tracrRNA는 Jinek 등, 상동에서 기재된 tracrRNA nt 23-48로 구성된다.
일부 구현예에서, 최소 tracrRNA 서열은 적어도 6, 7, 또는 8 인접 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 참조 최소 tracrRNA (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 야생형 tracrRNA) 서열에 적어도 약 60% 동일하다. 예를 들어, 최소 tracrRNA 서열은 적어도 6, 7, 또는 8 인접 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 참조 최소 tracrRNA 서열에 적어도 약 65% 동일, 약 70% 동일, 약 75% 동일, 약 80% 동일, 약 85% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일, 약 99% 동일 또는 100% 동일하다.
일부 구현예에서, 최소 CRISPR RNA와 최소 tracrRNA 사이 듀플렉스는 이중 나선을 포함한다. 일부 구현예에서, 최소 CRISPR RNA와 최소 tracrRNA 사이 듀플렉스는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 또는 초과 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 최소 CRISPR RNA와 최소 tracrRNA 사이 듀플렉스는 많아야 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 또는 초과 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 듀플렉스는 미스매치를 포함한다 (즉, 듀플렉스의 2개 가닥은 100% 상보적이지 않다). 일부 구현예에서, 듀플렉스는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스는 많아야 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스는 2 이하 미스매치를 포함한다.
벌지
일부 구현예에서, 최소 CRISPR RNA와 최소 tracrRNA 사이 듀플렉스에서 "벌지"가 있다. 벌지는 듀플렉스 이내 뉴클레오타이드의 짝짓기되지 않은 영역이다. 일부 구현예에서, 벌지는 부위 특이적 폴리펩타이드에 듀플렉스의 결합에 기여한다. 벌지는, 듀플렉스의 한쪽에, 짝짓기되지 않은 5'-XXXY-3' (여기에서 X는 임의의 퓨린이고 Y는 반대편 가닥상에 뉴클레오타이드와 워블 쌍을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드를 포함한다), 및 듀플렉스의 다른 쪽에서 짝짓기되지 않은 뉴클레오타이드 영역을 포함한다. 듀플렉스의 2 쪽에서 짝짓기되지 않은 뉴클레오타이드의 수는 상이할 수 있다.
일 예에서, 벌지는 벌지의 최소 CRISPR 반복부 가닥상에 짝짓기되지 않은 퓨린 (예를 들면, 아데닌)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벌지는 벌지의 최소 tracrRNA 서열 가닥의 짝짓기되지 않은 5'-AAGY-3'를 포함하고, 여기에서 Y는 최소 CRISPR 반복부 가닥상에 뉴클레오타이드와 워블 짝짓기를 형성할 수 있는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 듀플렉스의 최소 CRISPR 반복부 측에서 벌지는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 초과 짝짓기되지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 최소 CRISPR 반복부 측에서 벌지는 많아야 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 초과 짝짓기되지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 최소 CRISPR 반복부 측에서 벌지는 1 짝짓기되지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 듀플렉스의 최소 tracrRNA 서열 측에서 벌지는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 또는 초과 짝짓기되지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 최소 tracrRNA 서열 측에서 벌지는 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 또는 초과 짝짓기되지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 듀플렉스의 제2 측 (예를 들면, 듀플렉스의 최소 tracrRNA 서열 측)에서 벌지는 4 짝짓기되지 않은 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 벌지는 적어도 하나의 워블 짝짓기를 포함한다. 일부 구현예에서, 벌지는 많아야 1개의 워블 짝짓기를 포함한다. 일부 구현예에서, 벌지는 적어도 하나의 퓨린 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 벌지는 적어도 3 퓨린 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 벌지 서열은 적어도 5 퓨린 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 벌지 서열은 적어도 하나의 구아닌 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 벌지 서열은 적어도 하나의 아데닌 뉴클레오타이드를 포함한다.
헤어핀
다양한 구현예에서, 1개 이상의 헤어핀은 3' tracrRNA 서열에서 최소 tracrRNA에 3' 위치한다.
일부 구현예에서, 헤어핀은 최소 CRISPR 반복부 및 최소 tracrRNA 서열 듀플렉스에서 마지막 짝짓기된 뉴클레오타이드로부터 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 또는 초과 뉴클레오타이드 3'를 시작한다. 일부 구현예에서, 헤어핀은 최소 CRISPR 반복부 및 최소 tracrRNA 서열 듀플렉스에서 마지막 짝짓기된 뉴클레오타이드의 많아야 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 초과 뉴클레오타이드 3'를 시작할 수 있다.
일부 구현예에서, 헤어핀은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 또는 초과 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 헤어핀은 많아야 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 초과 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 헤어핀은 CC 디뉴클레오타이드 (즉, 2 연속 시토신 뉴클레오타이드)를 포함한다.
일부 구현예에서, 헤어핀은 듀플렉스된 뉴클레오타이드 (예를 들면, 함께 하이브리드화된, 헤어핀에서 뉴클레오타이드)를 포함한다. 예를 들어, 헤어핀은 3' tracrRNA 서열의 헤어핀 듀플렉스에서 GG 디뉴클레오타이드에 하이브리드화되는 CC 디뉴클레오타이드를 포함한다.
헤어핀의 1개 이상은 부위 특이적 폴리펩타이드의 가이드 RNA-상호작용 영역과 상호작용할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 헤어핀이 있고, 일부 구현예에서 3개 이상의 헤어핀이 있다.
3' tracrRNA 서열
일부 구현예에서, 3' tracrRNA 서열은 참조 tracrRNA 서열 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 tracrRNA)에 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 100% 서열 동일성을 가진 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 3' tracrRNA 서열은 길이 약 6 뉴클레오타이드 내지 약 100 뉴클레오타이드를 갖는다. 예를 들어, 3' tracrRNA 서열은 하기를 가질 수 있다: 길이 약 6 뉴클레오타이드 (nt) 내지 약 50 nt, 약 6 nt 내지 약 40 nt, 약 6 nt 내지 약 30 nt, 약 6 nt 내지 약 25 nt, 약 6 nt 내지 약 20 nt, 약 6 nt 내지 약 15 nt, 약 8 nt 내지 약 40 nt, 약 8 nt 내지 약 30 nt, 약 8 nt 내지 약 25 nt, 약 8 nt 내지 약 20 nt, 약 8 nt 내지 약 15 nt, 약 15 nt 내지 약 100 nt, 약 15 nt 내지 약 80 nt, 약 15 nt 내지 약 50 nt, 약 15 nt 내지 약 40 nt, 약 15 nt 내지 약 30 nt, 또는 약 15 nt 내지 약 25 nt. 일부 구현예에서, 3' tracrRNA 서열은 대략 14 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 3' tracrRNA 서열은 적어도 6, 7, 또는 8 인접 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 참조 3' tracrRNA 서열 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 야생형 3' tracrRNA 서열)에 적어도 약 60% 동일하다. 예를 들어, 3' tracrRNA 서열은 적어도 6, 7, 또는 8 인접 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 참조 3' tracrRNA 서열 (예를 들면, S. 파이오제네스로부터 야생형 3' tracrRNA 서열)에 적어도 약 60% 동일, 약 65% 동일, 약 70% 동일, 약 75% 동일, 약 80% 동일, 약 85% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일, 약 99% 동일, 또는 100% 동일하다.
일부 구현예에서, 3' tracrRNA 서열은 1 초과 듀플렉스된 영역 (예를 들면, 헤어핀, 하이브리드화된 영역)을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' tracrRNA 서열은 2 듀플렉스된 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 3' tracrRNA 서열은 줄기 루프 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' tracrRNA에서 줄기 루프 구조는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20 또는 초과 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' tracrRNA에서 줄기 루프 구조는 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 초과 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기 루프 구조는 기능성 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 줄기 루프 구조는 압타머, 리보자임, 단백질-상호작용 헤어핀, CRISPR 어레이, 인트론, 또는 엑손을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 줄기 루프 구조는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 초과 기능성 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기 루프 구조는 많아야 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 초과 기능성 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 3' tracrRNA 서열에서 헤어핀은 P-도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, P-도메인은 헤어핀에서 이중-가닥 영역을 포함한다.
tracrRNA 연장 서열
tracrRNA가 단일-분자 가이드 또는 이중-분자 가이드의 문맥에 있든 아니든 tracrRNA 연장 서열은 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 길이 약 1 뉴클레오타이드 내지 약 400 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 또는 400 뉴클레오타이드 초과의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 길이 약 20 내지 약 5000 또는 초과 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 1000 초과 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 또는 초과 뉴클레오타이드 미만의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 1000 뉴클레오타이드 미만의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 길이가 10 미만 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 길이가 10-30 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 길이가 30-70 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 기능성 모이어티 (예를 들면, 안정성 제어 서열, 리보자임, 엔도리보뉴클레아제 결합 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능성 모이어티는 전사 종결자 세그먼트 (즉, 전사 종결 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 기능성 모이어티는 하기를 갖는다: 총 길이 약 10 뉴클레오타이드 (nt) 내지 약 100 뉴클레오타이드, 약 10 nt 내지 약 20 nt, 약 20 nt 내지 약 30 nt, 약 30 nt 내지 약 40 nt, 약 40 nt 내지 약 50 nt, 약 50 nt 내지 약 60 nt, 약 60 nt 내지 약 70 nt, 약 70 nt 내지 약 80 nt, 약 80 nt 내지 약 90 nt, 또는 약 90 nt 내지 약 100 nt, 약 15 nt 내지 약 80 nt, 약 15 nt 내지 약 50 nt, 약 15 nt 내지 약 40 nt, 약 15 nt 내지 약 30 nt, 또는 약 15 nt 내지 약 25 nt. 일부 구현예에서, 기능성 모이어티는 진핵 세포에서 기능한다. 일부 구현예에서, 기능성 모이어티는 원핵 세포에서 기능한다. 일부 구현예에서, 기능성 모이어티는 양쪽 진핵 및 원핵 세포에서 기능한다.
적합한 tracrRNA 연장 기능성 모이어티의 비-제한 예는 하기를 포함한다: 3' 폴리-아데닐화된 꼬리, 리보스위치 서열 (예를 들면, 단백질 및 단백질 복합체에 의해 조절된 안정성 및/또는 조절된 접근성을 허용하기 위해), dsRNA 듀플렉스 (즉, 헤어핀)을 형성하는 서열, 세포하 위치에 RNA (예를 들면, 핵, 미토콘드리아, 엽록체, 및 기타 동종)을 표적하는 서열, 추적에 제공하는 변형 또는 서열 (예를 들면, 형광 분자에 직접적인 콘주게이션, 형광 검출을 용이하게 하는 모이어티에 콘주게이션, 형광 검출을 허용하는 서열, 등), 및/또는 단백질 (예를 들면, 전사 활성제, 전사 억제인자, DNA 메틸전달효소, DNA 탈메틸효소, 히스톤 아세틸전달효소, 히스톤 탈아세틸화효소, 및 기타 동종을 포함하는, DNA에서 작용하는 단백질)에 결합 부위를 제공하는 변형 또는 서열. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 프라이머 결합 부위 또는 분자 지수 (예를 들면, 바코드 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, tracrRNA 연장 서열은 1개 이상의 친화성 태그를 포함한다.
단일-분자 가이드 링커 서열
일부 구현예에서, 단일-분자 가이드 핵산의 링커 서열은 길이 약 3 뉴클레오타이드 내지 약 100 뉴클레오타이드를 갖는다. Jinek 등, 상동에서, 예를 들어, 단순 4 뉴클레오타이드 "테트라루프" (-GAAA-)는 사용되었다, Science, 337(6096):816-821 (2012). 설명적인 링커는 하기를 갖는다: 길이 약 3 뉴클레오타이드 (nt) 내지 약 90 nt, 약 3 nt 내지 약 80 nt, 약 3 nt 내지 약 70 nt, 약 3 nt 내지 약 60 nt, 약 3 nt 내지 약 50 nt, 약 3 nt 내지 약 40 nt, 약 3 nt 내지 약 30 nt, 약 3 nt 내지 약 20 nt, 약 3 nt 내지 약 10 nt. 예를 들어, 링커는 하기를 가질 수 있다: 길이 약 3 nt 내지 약 5 nt, 약 5 nt 내지 약 10 nt, 약 10 nt 내지 약 15 nt, 약 15 nt 내지 약 20 nt, 약 20 nt 내지 약 25 nt, 약 25 nt 내지 약 30 nt, 약 30 nt 내지 약 35 nt, 약 35 nt 내지 약 40 nt, 약 40 nt 내지 약 50 nt, 약 50 nt 내지 약 60 nt, 약 60 nt 내지 약 70 nt, 약 70 nt 내지 약 80 nt, 약 80 nt 내지 약 90 nt, 또는 약 90 nt 내지 약 100 nt. 일부 구현예에서, 단일-분자 가이드 핵산의 링커는 4 내지 40 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 또는 7000 또는 초과 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 링커는 많아야 약 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 또는 7000 또는 초과 뉴클레오타이드이다.
바람직하게는 링커가, 가이드의 다른 기능성 영역으로 방해할 수 있는 분자내 결합을 야기시킬, 가이드 RNA의 다른 부분과 상동성의 광범위한 영역을 갖는 서열을 포함하지 않을 것이어도, 링커는 임의의 다양한 서열을 포함할 수 있다. Jinek 등, 상동에서, 단순 4 뉴클레오타이드 서열 -GAAA-가 사용되었지만, Science, 337(6096):816-821 (2012), 더 긴 서열을 포함하는, 수많은 다른 서열은 마찬가지로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커 서열은 기능성 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 링커 서열은, 압타머, 리보자임, 단백질-상호작용 헤어핀, CRISPR 어레이, 인트론, 또는 엑손을 포함하는, 1개 이상의 피쳐를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 초과 기능성 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 많아야 약 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 초과 기능성 모이어티를 포함한다.
C9ORF72 유전자에서 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 결실 또는 대체에 의해, 또는 상응하는 유전자 또는 세이프 하버 부위의 유전자좌 속으로 C9ORF72 cDNA의 녹-인에 의해 세포를 정정하는 게놈 공학기술 전략
본 발명의 생체외 방법의 단계는 게놈 공학기술을 이용하는 환자 특이적 iPS 세포의 편집/정정을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 생체외 방법의 단계는 백혈구, 간엽 줄기 세포, 또는 조혈 전구 세포의 편집/정정을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 생체내 방법의 단계는 게놈 공학기술을 이용하여 ALS 또는 FTLD 환자에서 세포의 편집/정정을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 세포 방법의 단계는 게놈 공학기술에 의해 인간 세포에서 C9ORF72 유전자의 편집/정정을 포함한다.
ALS 및/또는 FTLD 환자는 C9ORF72 유전자에서 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부를 나타낸다. 따라서, 상이한 환자는 일반적으로 유사한 정정 전략을 요구할 것이다. 임의의 CRISPR 엔도뉴클레아제는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있고, 질환 특이적일 수 있거나 아닐 수 있는, 각각의 CRISPR 엔도뉴클레아제는 그것의 자체 관련된 PAM을 갖는다. 예를 들어, S. 파이오제네스로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 서열 식별 번호: 1-6148에서 확인되고 있다. S. 아우레스로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 서열 식별 번호: 6149-6892에서 확인되고 있다. S. 테모필러스로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 서열 식별 번호: 7760-8097에서 확인되고 있다. T. 덴티콜라로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 서열 식별 번호: 8098-8261에서 확인되고 있다. N. 메닝자이티데스로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 서열 식별 번호: 6893-7759에서 확인되고 있다. 아시도미노콕쿠스 및 라크노스피라세아에로부터 CRISPR/Cpf1 엔도뉴클레아제를 가진 C9ORF72 유전자를 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 서열 식별 번호: 8262-18807에서 확인되고 있다. S. 파이오제네스로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR의 엑손 1-2를, 예를 들면, 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 실시예 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 및 91, 각각에서 확인되고 있다. S. 아우레스로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR의 엑손 1-2를, 예를 들면, 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 실시예 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 및 86, 각각에서 확인되고 있다. S. 테모필러스로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR의 엑손 1-2를, 예를 들면, 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 실시예 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57,63, 69, 75, 81, 및 87, 각각에서 확인되고 있다. T. 덴티콜라로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR의 엑손 1-2를, 예를 들면, 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 실시예 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 및 88, 각각에서 확인되고 있다. N. 메닝자이티데스로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR의 엑손 1-2를, 예를 들면, 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 실시예 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 및 89, 각각에서 확인되고 있다. 아시도미노콕쿠스, 라크노스피라세아에, 및 프란시셀라 노비시다로부터 CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 가진 AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR의 엑손 1-2를, 예를 들면, 표적화하기 위한 gRNA 스페이서 서열은 실시예 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 및 90, 각각에서 확인되고 있다.
예를 들어, 돌연변이는 부정확한 NHEJ 수선 경로 때문에 발생하는 삽입 또는 결실에 의해 정정될 수 있다. 환자의 C9ORF72 유전자가 염기를 삽입 또는 결실하였다면, 표적화된 절단은 프레임을 회복하는 NHEJ-매개된 삽입 또는 결실을 초래할 수 있다. 미스센스 돌연변이는 또한 1개 이상의 가이드 RNA를 이용하여 NHEJ-매개된 정정을 통해 정정될 수 있다. 돌연변이를 정정하기 위한 컷트(들)의 능력 또는 가능성은 국부 서열 및 미세-상동성에 기반하여 설계 또는 평가될 수 있다. NHEJ는 또한, 어느 한쪽 몇 개의 위치를 표적화하는 1개 gRNA, 또는 몇 개의 gRNAs에 의해 절단을 통해 스플라이스 공여체 또는 수용체 부위 변경에 의해 또는 직접적으로, 유전자의 세그먼트를 결실시키는데 사용될 수 있다. 아미노산, 도메인 또는 엑손이 돌연변이를 함유하고 제거 또는 역전될 수 있다면, 또는 결실이 달리 단백질에 기능을 회복하였다면 이것은 유용할 수 있다. 가이드 가닥의 쌍은 역전의 결실 및 정정에 사용되고 있다.
대안적으로, HDR에 의한 정정용 공여체는 어닐링을 허용하기 위해 작은 또는 큰 측접하는 상동 아암을 가진 정정된 서열을 함유한다. HDR은 본질적으로 DSB 수선 동안 템플레이트로서 공급된 상동성 DNA 서열을 이용하는 에러 없는 기전이다. 상동 직접 수선 (HDR)의 속도는 돌연변이와 컷트 부위 사이 거리의 함수이어서 중첩 또는 최근접한 표적 부위의 선택이 중요하다. 템플레이트는 상동성 영역에 의해 측접된 추가의 서열을 포함할 수 있거나 게놈 서열과 상이한 서열을 함유할 수 있고, 따라서 서열 편집을 허용한다.
NHEJ 또는 HDR에 의한 돌연변이 정정에 더하여, 다양한 다른 옵션이 가능하다. 작은 또는 큰 결실 또는 다중 돌연변이가 있다면, 이환된 엑손을 함유하는 cDNA는 녹-인될 수 있다. 전장 cDNA는 임의의 "세이프 하버"에 녹-인될 수 있지만, 공급된 또는 다른 프로모터를 사용해야 한다. 이러한 작제물이 정확한 위치에 녹-인된다면, 정상 유전자에 유사한, 생리적 제어를 가질 것이다. 공여체가 기능을 회복하기 위해 일반적으로 제공되어야 하여도, 뉴클레아제의 쌍은 돌연변이된 유전자 영역을 결실시키는데 사용될 수 있다. 이 경우에 2개 gRNA 및 1개 공여체 서열은 공급될 것이다.
일부 게놈 공학기술 전략은 C9ORF72 유전자 내 또는 근처 헥사뉴클레오타이드 반복부의 야생형 또는 유사한 수로 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 대체, 또는 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 결실 및, 상동성 재조합 (HR)로서 또한 공지되는, 상동 직접 수선 (HDR)에 의해 상응하는 유전자의 유전자좌 또는 세이프 하버 유전자좌 속으로 C9ORF72 cDNA 녹-인을 포함한다. 상동 직접 수선은 C9ORF72 유전자에서 확장된 헥사뉴클레오타이드를 갖는 환자의 치료용 하나의 전략이다. 이들 전략은 C9ORF72 유전자를 회복할 것이고 이환 상태를 완전히 역전시킬 것이다. 이러한 전략은 환자의 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 기간에 기반하여 더욱 통상 접근법을 유사하게 요구하지 않을 것이다. 돌연변이 정정용 공여체 뉴클레오타이드는 작다 (< 300 bp). HDR 효율성이 공여체 분자의 크기에 역으로 관련될 수 있음에 따라, 이것은 유리하다. 또한, 공여체 템플레이트가, 예를 들면, 비-제한 예로써, 공여체 템플레이트 전달의 효과적인 수단인 것으로 밝혀진, 크기-구속된 아데노-관련 바이러스 (AAV) 분자를 포함하는, 크기 구속된 바이러스 벡터 분자에 맞출 수 있다는 것이 기대된다. 또한, 공여체 템플레이트가, 비-제한 예로써, 혈소판 및/또는 엑소좀 또는 다른 미세소포를 포함하는, 다른 크기 구속된 분자를 맞출 수 있다는 것이 기대된다.
상동 직접 수선은 이중-가닥 절단 (DSBs) 수선용 세포 기전이다. 가장 통상적인 형태는 상동성 재조합이다. 단일-가닥 어닐링 및 대안적인-HDR을 포함하는, HDR용 추가의 경로가 있다. 게놈 공학기술 도구는 게놈에 부위-특이적 변형을 창출하기 위해 세포 상동성 재조합 경로를 연구자가 조작하게 한다. 세포가 트랜스로 제공된 합성 공여체 분자를 이용하여 이중-가닥 절단을 수선할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 특이적 돌연변이 근처 이중-가닥 절단의 도입 및 적합한 공여체의 제공에 의해, 표적화된 변화는 게놈에서 실시될 수 있다. 특이적 절단은 상동성 공여체 단독을 받는 106 세포 중 1의 속도를 넘어 1,000 배 초과 HDR의 속도를 증가시킨다. 특정한 뉴클레오타이드에서 상동 직접 수선 (HDR)의 속도는 컷트 부위에 대한 거리의 함수이어서, 중첩 또는 최근접한 표적 부위 선택은 중요하다. 원 위치에서 정정이 게놈의 나머지를 혼란되지 않게 함으로써, 유전자 편집은 유전자 첨가에 걸쳐 이점을 제공한다.
HDR에 의한 편집용 공급된 공여체는 현저하게 다양하지만 일반적으로 게놈 DNA에 어닐링을 허용하기 위해 작은 또는 큰 측접하는 상동 아암을 가진 의도된 서열을 함유한다. 도입된 유전적 변화를 측접하는 상동성 영역은 30 bp 이하일 수 있거나, 프로모터, cDNAs, 등을 함유할 수 있는 다중-킬로베이스 카셋트만큼 클 수 있다. 양쪽 단일-가닥 및 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드 공여체는 사용되고 있다. 더 긴 ssDNA가 또한 생성 및 사용될 수 있어도, 이들 올리고뉴클레오타이드는 크기가 100 nt 미만부터 많은 kb 초과 범위이다. PCR 앰플리콘, 플라스미드, 및 미니-모방체를 포함하는, 이중-가닥 공여체는 종종 사용된다. 일반적으로, 개별 공여체에 대하여 패키징 제한이 <5kb이어도, AAV 벡터가 공여체 템플레이트의 전달의 매우 효과적인 수단이라는 것이 밝혀졌다. 공여체의 활성 전사는 HDR을 3-배 증가시켰고, 프로모터의 봉입체가 전환을 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 반대로, 공여체의 CpG 메틸화는 유전자 발현 및 HDR을 감소시켰다.
야생형 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9에 더하여, 단 하나의 DNA 가닥의 컷팅을 초래하는 불활성화된 하나 또는 다른 뉴클레아제 도메인을 갖는 니카제 변이체는 실재한다. HDR은 표적체 부분을 측접하는 니카제의 쌍을 이용하여 또는 개별 Cas 니카제로부터 유도될 수 있다. 공여체는 단일-가닥, 닉, 또는 dsDNA일 수 있다.
공여체 DNA는 뉴클레아제와 또는 독립적으로 다양한 상이한 방법에 의해, 예를 들어 형질감염, 나노-입자, 마이크로-주사, 또는 바이러스성 형질도입에 의해 공급될 수 있다. 다양한 테더링 옵션은 HDR용 공여체의 이용가능성을 증가시키기 위해 제안되고 있다. 예는 뉴클레아제에 공여체의 부착, 근처에 결합하는 DNA 결합 단백질에 부착, 또는 DNA 단부 결합 또는 수선에 관여되는 단백질에 부착을 포함한다.
수선 경로 선택은 수많은 배양 조건, 예컨대 세포 사이클링에 영향을 주는 것에 의해, 또는 DNA 수선 및 관련된 단백질의 표적화에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, HDR을 증가시키기 위해, 핵심 NHEJ 분자, 예컨대 KU70, KU80 또는 DNA 리가제 IV는 억제될 수 있다.
존재한 공여체 없이, DNA 절단으로부터 단부 또는 상이한 절단으로부터 단부는 DNA 단부가 접합에서 거의 없는 염기-짝짓기로 연결되는 몇 개의 비상동성 수선 경로를 이용하여 연결될 수 있다. 표준적 NHEJ에 더하여, 유사한 치유 기전, 예컨대 alt-NHEJ가 있다. 2개 절단이 있다면, 개입 세그먼트는 결실 또는 역전될 수 있다. NHEJ 수선 경로는 연결부위에서 삽입, 결실 또는 돌연변이로 이어질 수 있다.
NHEJ는 뉴클레아제 절단후 인간 세포주에서 정의된 유전자좌에 15-kb 유도성 유전자 발현 카셋트를 삽입하는데 사용되었다. Maresca, M., Lin, V.G., Guo, N. & Yang, Y., Genome Res 23, 539-546 (2013).
NHEJ 또는 HDR에 의한 게놈 편집에 더하여, 양쪽 NHEJ 경로 및 HR을 이용하는 부위-특이적 유전자 삽입은 수행되고 있다. 조합 접근법은, 가능하게는 인트론/엑손 경계를 포함하는, 특정 설정에서 적용가능할 수 있다. NHEJ는 인트론에서 결찰에 대하여 효과적으로 증명할 수 있고, 반면 에러 없는 HDR은 코딩 영역에서 더욱 양호하게 적합화될 수 있다.
이전에 언급된 바와 같이, C9ORF72 유전자의 돌연변이는 뉴클레오타이드 GGGGCC의 6 문자열의 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장이다. 건강한 개체에서, 이러한 헥사뉴클레오타이드의 소수 반복부, 전형적으로 약 30 또는 그 미만이 있다. 질환 표현형을 가진 사람에서, 반복부는 수백의 정도로 발생할 수 있다. 1개 이상의 헥사뉴클레오타이드 반복부는 헥사뉴클레오타이드 반복부의 야생형 또는 유사한 수로 유전자를 회복시키기 위해 결실 또는 정정될 수 있다. 대안적으로, 모든 헥사뉴클레오타이드 반복부는 결실될 수 있다. 추가 대안으로서, C9ORF72 cDNA는 상응하는 유전자의 유전자좌에 녹-인될 수 있거나 세이프 하버 부위, 예컨대 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌에 녹-인될 수 있다: AAVS1(PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR. 일부 구현예에서, 방법은 1개 이상의 돌연변이를 대체하기 위해 또는 전체 C9ORF72 유전자 또는 cDNA를 녹-인하기 위해 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트로부터 신규한 서열의 편입을 용이하게 하는데 사용될 수 있는 1개의 gRNA 또는 한 쌍의 gRNAs를 제공한다.
방법의 일부 구현예는 유전자의 2회 컷팅, 1개 이상의 헥사뉴클레오타이드 반복부를 대체하기 위해 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트로부터 신규한 서열의 삽입 용이하게 하는 1개 이상의 헥사뉴클레오타이드 반복부의 5' 단부에서 1개의 gRNA 컷팅 및 1개 이상의 헥사뉴클레오타이드 반복부의 3' 말단에서 다른 gRNA 컷팅에 의해 결실을 만드는 gRNA 쌍을 제공한다. 컷팅은 게놈에서 DSB를 각각 만드는 한 쌍의 DNA 엔도뉴클레아제에 의해, 또는 게놈에서 DSB를 함께 만드는 다중 니카제에 의해 달성될 수 있다.
대안적으로, 방법의 일부 구현예는 1개 이상의 헥사뉴클레오타이드 반복부를 대체하기 위해 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트로부터 신규한 서열의 삽입을 용이하게 하는 1개 이상의 헥사뉴클레오타이드 반복부 주위 1개의 이중-가닥 컷트를 만드는 1개의 gRNA를 제공한다. 이중-가닥 컷트는 게놈에서 DSB를 함께 만드는 다중 니카제 또는 단일 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 만들어질 수 있다.
C9ORF72 유전자 이내 설명적인 변형은 상기 참조된 돌연변이 이내 또는 근위, 예컨대 특이적 돌연변이의 3 kb 미만, 2kb 미만, 1 kb 미만, 0.5 kb 미만 업스트림 또는 다운스트림의 영역 이내 대체를 포함한다. C9ORF72 유전자에서 헥사뉴클레오타이드 반복부의 상대적으로 넓은 변동이 제공되면, (비제한적으로 더 큰 뿐만 아니라 더 작은 결실을 포함하는) 상기 언급된 대체의 수많은 변동이 C9ORF72 유전자의 회복을 초래할 것으로 기대될 것이 인정될 것이다.
그와 같은 변이체는 문제의 특이적 돌연변이보다 5' 및/또는 3' 방향으로 더큰, 또는 어느 한쪽 방향으로 더 작은 대체를 포함한다. 따라서, 특이적 대체에 대하여 "근위"는, (또한 본 명세서에서 종점으로서 지칭된) 원하는 대체 경계와 관련된 DSB 유전자좌가 언급된 참조 유전자좌로부터 약 3 kb 미만인 영역 이내일 수 있다는 것이 의도된다. 일부 구현예에서, DSB 유전자좌는 더욱 근위이고 2 kb 이내, 1 kb 이내, 0.5 kb 이내, 또는 0.1 kb 이내이다. 작은 대체의 경우에서, 원하는 종점은 참조 유전자좌이거나 "상기에 인접"하고, 이에 의해 종점이 참조 유전자좌로부터 100 bp 이내, 50 bp 이내, 25 bp 이내, 또는 약 10 bp 미만 내지 5 bp인 것이 의도된다.
확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부가 야생형 수준으로 감소되는 한, 더 큰 또는 더 작은 대체를 포함하는 구현예는 동일한 이점을 제공하는 것이 기대된다. 따라서 본 명세서에서 기재된 및 설명된 대체의 많은 변동이 ALS 및/또는 FTLD 완화에 효과적일 것이 기대된다.
또 다른 게놈 공학기술 전략은 엑손 결실을 포함한다. 특이적 엑손의 표적화된 결실은 단일 치료 칵테일을 가진 환자의 큰 서브셋 치료용 매력적인 전략이다. 결실은 어느 한쪽 단일 헥사뉴클레오타이드 반복부 결실 또는 다중-헥사뉴클레오타이드 반복부 결실일 수 있다. 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 완전한 결실을 포함하는, 다중-반복부 결실이 다수의 환자에 닿을 수 있는 반면, 더 큰 결실을 위하여 결실의 효율은 증가된 크기와 함께 크게 감소한다. 따라서, 바람직한 결실은 크기가 40 내지 10,000 염기쌍 (bp) 범위이다. 예를 들어, 결실은 크기가 40-100; 100-300; 300-500; 500-1,000; 1,000-2,000; 2,000-3,000; 3,000-5,000; 또는 5,000-10,000 염기쌍의 범위일 수 있다.
사전-mRNA가 결실 이후 적절하게 가공되는 것을 보장하기 위해, 주위 스플라이싱 신호를 또한 결실시키는 것이 중요하다. 스플라이싱 공여체 및 수용체는 일반적으로 인접하는 인트론의 100 염기쌍 이내이다. 따라서, 일부 구현예에서, 방법은 각각의 관심 엑손/인트론 접합에 대하여 대략 +/- 100-3100 bp 컷팅하는 전체 gRNAs를 제공한다.
임의의 게놈 편집 전략에 대하여, 유전자 편집은 서열분석 또는 PCR 분석에 의해 확인될 수 있다.
표적 서열 선택
우선적으로, 특정한 참조 유전자좌에 대해 5' 경계 및/또는 3' 경계의 위치에서 이동은, 본 명세서에서 추가로 기재된 및 설명된 바와 같이, 편집을 위하여 선택된 엔도뉴클레아제 시스템에 부분적으로 의존하는, 유전자 편집의 특정한 적용을 향상시키는데 또는 용이하게 하는데 사용된다.
그와 같은 표적 서열 선택의 제1 측면에서, 많은 엔도뉴클레아제 시스템은 절단용 잠재적인 표적 부위의 초기 선택을 가이드하는 규칙 또는 기준, 예컨대 CRISPR 유형 II 또는 유형 V 엔도뉴클레아제의 경우에서 DNA 절단 부위에 인접한 특정한 위치에서 PAM 서열 모티프의 요건을 갖는다.
표적 서열 선택 또는 최적화의 또 다른 측면에서, 표적 서열 및 유전자 편집 엔도뉴클레아제의 특정한 조합용 "부정확한" 활성의 빈도 (즉 선택된 표적 서열이 아닌 부위에서 발생하는 DSBs의 빈도)가 정확한 활성의 빈도에 대해 평가된다. 일부 경우에, 원하는 유전자좌에서 정확하게 편집된 세포는 다른 세포에 대해 선택적 이점을 가질 수 있다. 선택적 이점의 설명적인, 그러나 비제한 예는 하기의 취득을 포함한다: 속성 예컨대 복제의 향상된 속도, 지속성, 특정 조건에 대한 저항성, 성공적인 생착의 향상된 속도 또는 환자에 도입 이후 생체내 지속성, 및 그와 같은 세포의 생존력 또는 유지 또는 증가된 수와 관련된 다른 속성. 다른 사례에서, 원하는 유전자좌에서 정확하게 편집된 세포는 정확하게 편집된 세포에 대하여 확인, 분류 또는 달리 선택하는데 사용된 1개 이상의 선별 방법에 의해 양성으로 선택될 수 있다. 양쪽 선택적 이점 및 유도된 선택 방법은 정정과 관련된 표현형을 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 세포의 의도된 모집단을 선택 또는 정제하는데 사용되는 신규한 표현형을 창출하는 제2 변형을 창출하기 위해 2회 이상 편집될 수 있다. 그와 같은 제2 변형은 선택가능한 또는 선별가능한 마커에 대하여 제2 gRNA 첨가에 의해 창출될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 cDNA 및 또한 선별 마커를 함유하는 DNA 단편을 이용하여 원하는 유전자좌에서 정확하게 편집될 수 있다.
임의의 선택적 이점이 적용가능하거나 임의의 유도된 선택이 특정한 경우에서 적용되든 아니든, 표적 서열 선택은 원하는 표적이 아닌 부위에서 원하지 않는 변경에 대하여 잠재력을 감소시키기 위해 및/또는 적용의 유효성을 향상시키기 위해 부정확한 빈도의 고려에 의해 또한 유도된다. 본 명세서에서 그리고 당해 분야에서 추가로 기재된 및 설명된 바와 같이, 부정확한 활성의 발생은 표적 부위와 다양한 오프 표적 부위 사이 유사성 및 비유사성, 뿐만 아니라 사용된 특정한 엔도뉴클레아제를 포함하는 수많은 인자에 의해 영향받는다. 많은 사례에서, 부정확한 활성의 예측을 돕는 생물정보학 도구는 이용가능하고, 빈번하게 그와 같은 도구는 또한 부정확한 내지 정확한 활성의 상대 빈도를 평가하기 위한 실험적 설정에서 그 다음 평가될 수 있는, 부정확한 활성의 가장 유사한 부위를 확인하는데 사용될 수 있고, 이로써 더 높은 상대 부정확한 활성을 갖는 서열의 선택을 허용한다. 그와 같은 기술의 예시는 본 명세서에서 제공되고, 기타는 당해 기술에서 공지되어 있다.
표적 서열 선택의 또 다른 측면은 상동성 재조합 이벤트에 관한 것이다. 상동성의 영역을 공유하는 서열이 개입 서열의 결실을 초래하는 상동성 재조합 이벤트용 초점으로서 작용할 수 있다는 것이 잘 알려진다. 그와 같은 재조합 이벤트는 염색체 및 다른 DNA 서열의 복제의 정상 과정 동안, 그리고 또한 DNA 서열이 합성되고 있는 다른 시간에서, 예컨대 이중-가닥 절단 (DSBs)의 수선의 경우에서 발생하고, 이는 정상 세포 복제 사이클 동안 규칙적 기준에서 발생하지만 다양한 이벤트 (예컨대 UV 광 및 DNA 파손의 다른 유발제)의 발생 또는 특정 제제 (예컨대 다양한 화학 유발제)의 존재에 의해 또한 향상될 수 있다. 많은 그와 같은 유발제는 DSBs를 게놈에서 무차별적으로 발생하게 하고, DSBs는 정상 세포에서 규칙적으로 유도 및 수선되고 있다. 수선 동안, 최초 서열은 완전한 충실도로 재작제될 수 있지만, 일부 경우에, 작은 삽입 또는 결실 ("인델"로서 지칭됨)은 DSB 부위에 도입된다.
선택된 염색체 위치에서 유도된 또는 우선적인 유전자 변형 이벤트를 야기하는데 사용될 수 있는, 본 명세서에서 기재된 엔도뉴클레아제 시스템의 경우에서와 같이, DSBs는 또한 특정한 위치에서 구체적으로 유도될 수 있다. DNA 수선 (뿐만 아니라 복제)의 맥락에서 재조합에 거치게 되는 상동성 서열용 경향은 수많은 상황에서 이용될 수 있고, 유전자 편집 시스템, 예컨대 CRISPR의 하나의 적용에 대한 기준이고, 여기에서 상동 직접 수선은, 원하는 염색체 위치 속으로, "공여체" 폴리뉴클레오타이드의 사용을 통해 제공된, 관심 서열을 삽입하는데 사용된다.
겨우 10 염기쌍 이하를 포함할 수 있는 "미세상동성"의 작은 영역일 수 있는, 특정한 서열 사이 상동성의 영역은 또한 원하는 결실을 초래하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 DSB는 인근 서열로 미세상동성을 나타내는 부위에서 도입된다. 그와 같은 DSB의 수선의 정상 과정 동안, 고주파수로 발생하는 결과는 DSB 및 수반되는 세포 수선 공정에 의해 용이하게 되는 재조합의 결과로서 개입 서열의 결실이다.
일부 상황에서, 그러나, 상동성의 영역 이내 표적 서열의 선택은, 원하는 주어진 특정한 상황일 수 있거나 아닐 수 있는, (결실이 코딩 영역에 있는 경우) 유전자 융합을 포함하여, 훨씬 더 큰 결실을 또한 생기게 할 수 있다.
본 명세서에서 제공된 예는 헥사뉴클레오타이드 반복부의 야생형 또는 유사한 수준의 회복을 초래하는 대체를 유도하도록 설계된 DSBs의 창출용 다양한 표적 영역의 선택, 뿐만 아니라 정확한 이벤트에 비해 부정확한 이벤트를 최소화하도록 설계되는 그와 같은 영역 이내 특이적 표적 서열의 선택을 추가로 설명한다.
핵산 변형
일부 구현예에서, 세포 속으로 도입된 폴리뉴클레오타이드는, 본 명세서에서 추가로 기재된 그리고 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 예를 들어, 활성, 안정성 또는 특이성을 향상시키는데, 전달을 변경시키는데, 숙주 세포에서 타고난 면역 반응을 감소시키는데, 또는 다른 향상을 위하여 사용될 수 있는 1개 이상의 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, 변형된 폴리뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템에서 사용되고, 이 경우에 세포 속으로 도입된 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 가이드 RNAs (어느 한쪽 단일-분자 가이드 또는 이중-분자 가이드) 및/또는 DNA 또는 RNA는, 아래 기재된 및 설명된 바와 같이, 변형될 수 있다. 그와 같은 변형된 폴리뉴클레오타이드는 임의의 1개 이상의 유전자 좌위를 편집하기 위해 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템에서 사용될 수 있다.
그와 같은 용도의 비제한 실례의 목적으로 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템을 이용하여, 가이드 RNAs의 변형은, 단일-분자 가이드 또는 이중-분자일 수 있는, 가이드 RNAs, 및 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 포함하는 CRISPR/Cas9/Cpf1 게놈 편집 복합체의 안정성 또는 형성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 가이드 RNAs의 변형은 또한 또는 대안적으로, 예를 들어, 정확한 활성을 향상시키는데 사용될 수 있는, 게놈에서 표적 서열을 가진 게놈 편집 복합체 사이 상호작용의 개시, 안정성 또는 동력학을 향상시키는데 사용될 수 있다. 가이드 RNAs의 변형은 또한 또는 대안적으로 특이성, 예를 들면, 다른 (부정확한) 부위에서 효과에 비교된 경우 정확한 부위에서 게놈 편집의 상대 속도를 향상시키는데 사용될 수 있다.
변형은 또한 또는 대안적으로, 예를 들면, 세포에서 존재하는 리보뉴클레아제 (RNases)에 의해 열화에 대한 그것의 저항 증가에 의해 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는데 사용될 수 있고, 이로써 세포에서 그것의 반감기를 증가되게 한다. 가이드 RNA 반감기를 향상시키는 변형은, 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 RNA와 동시에 도입된 가이드 RNAs의 반감기 증가가 가이드 RNAs 및 인코딩된 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제가 세포에서 공존하는 시간을 증가시키는데 사용될 수 있기 때문에, Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제가 엔도뉴클레아제를 생성하기 위해 번역될 필요가 있는 RNA를 통해 편집되도록 세포 속으로 도입되는 구현예에서 특히 유용할 수 있다.
변형은 또한 또는 대안적으로 세포 속으로 도입된 RNAs가 타고난 면역 반응을 유도하는 가능성 또는 정도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 아래 및 당해 분야에서 기재된 바와 같이, 작은-간섭 RNAs (siRNAs)를 포함하는, RNA 간섭 (RNAi)의 맥락에서 양호하게 특성규명된, 그와 같은 반응은 RNA의 감소된 반감기 및/또는 면역 반응과 관련된 다른 인자 또는 사이토카인의 유발과 관련되는 경향이 있다.
비제한적으로, (예컨대 세포에서 존재하는 RNAses에 의해 그것의 열화 증가에 의해) RNA의 안정성을 향상시키는 변형, 수득한 생성물 (즉 엔도뉴클레아제)의 번역을 향상시키는 변형, 및/또는 세포 속으로 도입된 RNAs가 타고난 면역 반응을 유도하는 가능성 또는 정도를 감소시키는 변형을 포함하여, 변형의 1개 이상의 유형은 또한 세포 속으로 도입되는 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 RNAs에 실시될 수 있다.
변형, 예컨대 전술한 것 및 기타의 조합은 마찬가지로 사용될 수 있다. CRISPR/Cas9/Cpf1의 경우에서, 예를 들어, 변형의 1개 이상의 유형은 (상기 예시된 것을 포함하여) 가이드 RNAs에 실시될 수 있고/있거나, 변형의 1개 이상의 유형은 (상기 예시된 것을 포함하여) Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 RNAs에 실시될 수 있다.
예시로서, CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템에서 사용된 가이드 RNAs, 또는 다른 더 작은 RNAs는, 아래 설명된 및 당해 분야에서 기재된 바와 같이, 수많은 변형이 쉽게 편입되도록 하는, 화학 수단에 의해 쉽게 합성될 수 있다. 화학 합성 절차가 계속해서 확장하는 반면, 절차 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 (겔 예컨대 PAGE의 사용을 피하는, HPLC)에 의한 그와 같은 RNAs의 정제는 폴리뉴클레오타이드 길이가 100 정도 뉴클레오타이드를 넘어 상당히 증가함에 따라 더욱 도전적이 되는 경향이 있다. 더 큰 길이의 화학적으로-변형된 RNAs 생성에 사용된 하나의 접근법은 함께 결찰되는 2개 이상의 분자를 생산하는 것이다. 훨씬 더 긴 RNAs, 예컨대 Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 것은 효소적으로 더욱 쉽게 생성된다. 변형의 더 적은 유형이 효소적으로 생산된 RNAs에서 사용을 위하여 일반적으로 이용가능한 반면, 아래 추가로 그리고 당해 분야에서 기재된 바와 같이, 예를 들면, 안정성을 향상시키는데, 타고난 면역 반응의 가능성 또는 정도를 감소시키는데, 및/또는 다른 속성을 향상시키는데 사용될 수 있는 변형이 여전히 있고; 변형의 신규한 유형은 규칙적으로 개발중이다.
변형의 다양한 유형, 특히 더 작은 화학적으로 합성된 RNAs로 빈번하게 사용된 것의 예시로서, 변형은 당의 2' 위치에서 변형된 1개 이상의 뉴클레오타이드, 일부 구현예에서 2'-O-알킬, 2'-O-알킬-O-알킬, 또는 2'-플루오로-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 변형은 RNA의 3' 단부에 피리미딘, 염기소실 잔기, 또는 역전된 염기의 리보오스상에 2'-플루오로, 2'-아미노 또는 2' O-메틸 변형을 포함한다. 그와 같은 변형은 올리고뉴클레오타이드에 일상적으로 편입되고 이들 올리고뉴클레오타이드는 주어진 표적에 대해 2'-데옥시올리고뉴클레오타이드보다 더 높은 Tm (즉, 더 높은 표적 결합 친화성)을 갖는 것으로 밝혀진다.
수많은 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 변형은 이들이 편입되는 올리고뉴클레오타이드를, 원상태 올리고뉴클레오타이드보다 뉴클레아제 소화에 더욱 저항성으로 만드는 것으로 밝혀지고; 이들 변형된 올리고는 비변형된 올리고뉴클레오타이드보다 더 긴 시간 동안 온전하게 생존한다. 변형된 올리고뉴클레오타이드의 특이적 예는 변형된 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 당간 연결기 또는 단쇄 헤테로원자 또는 복소환형 당간 연결기를 포함하는 것을 포함한다. 일부 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 골격을 가진 올리고뉴클레오타이드 및 하기를 가진 것이다: 헤테로원자 골격, 특히 CH2-NH-O-CH2, CH,~N(CH3)~O~CH2 (메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로서 공지됨), CH2 --O--N(CH3)-CH2, CH2-N (CH3)-N(CH3)-CH2 및 O-N(CH3)-CH2-CH2 골격, 여기서 상기 원상태 포스포디에스테르 골격은 O- P-- O- CH로서 표시됨); 아미드 골격 [참조 De Mesmaeker 등, Ace. Chem. Res., 28:366-374 (1995)]; 모폴리노 골격 구조 (참조 Summerton and Weller, 미국 특허 번호 5,034,506); 펩타이드 핵산 (PNA) 골격 (여기서 올리고뉴클레오타이드의 포스포디에스테르 골격은 폴리아미드 골격으로 재배치되고, 뉴클레오타이드는 폴리아미드 골격의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되고 있음, 참조 Nielsen 등, Science 1991, 254, 1497). 인-함유 연결기는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 연결기를 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 그리고 뉴클레오사이드의 인접한 쌍이 연결된 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2'인 역전된 극성을 갖는 것; 참조 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 및 5,625,050.
모폴리노-기반 올리고머성 화합물은 하기에서 기재된다: Braasch and David Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002); Genesis, Volume 30, Issue 3, (2001); Heasman, Dev. Biol., 243: 209-214 (2002); Nasevicius 등, Nat. Genet., 26:216-220 (2000); Lacerra 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9591-9596 (2000); 및 미국 특허 번호 5,034,506, 1991년 7월23일 발행.
사이클로헥세닐 핵산 올리고뉴클레오타이드 모방체는 하기에서 기재된다: Wang 등, J. Am. Chem. Soc., 122: 8595-8602 (2000).
그안에서 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드 골격은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 연결기, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 연결기, 또는 1개 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 복소환형 뉴클레오사이드간 연결기에 의해 형성되는 골격을 갖는다. 이들은 하기를 갖는 것을 포함한다: (뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성된) 모폴리노 연결기; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S, 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타; 참조 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439, 이들 각각은 본 명세서에서 참고로 편입됨.
1개 이상의 치환된 당 모이어티, 예를 들면, 2' 위치에서 하기 중 하나는 또한 포함될 수 있다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2, 또는 O(CH2)n CH3 (식 중 n은 1 내지 약 10이다); C1 내지 C10 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르알킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알크아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단 기; 리포터 기; 삽입제; 올리고뉴클레오타이드의 약력학적 특성 개선용 기; 또는 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 향상용 기 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환체. 일부 구현예에서, 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-0-CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸)로서 공지됨) (Martin 등, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486)을 포함한다. 다른 변형은 2'-메톡시 (2'-0-CH3), 2'-프로폭시 (2'-OCH2 CH2CH3) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 올리고뉴클레오타이드상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 실시될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 펜토푸라노실 기 대신에 당 모방체, 예컨대 사이클로부틸을 또한 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 단위의, 양쪽 당 및 뉴클레오사이드간 연결, 즉, 골격은 신규한 그룹으로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물로 하이브리드화를 위하여 유지된다. 탁월한 하이브리드화 특성을 갖는 것으로 나타났던 하나의 그와 같은 올리고머성 화합물, 올리고뉴클레오타이드 모방체는 펩타이드 핵산 (PNA)로서 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-골격은 아미드 함유 골격, 예를 들어, 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 핵염기는 유지되고 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 비제한적으로, 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262를 포함한다. PNA 화합물의 추가 교시는 Nielsen 등, Science, 254: 1497-1500 (1991)에서 발견될 수 있다.
가이드 RNAs는, 추가로 또는 대안적으로, (종종 당해 분야에서 단순히 "염기"로서 지칭된) 핵염기 변형 또는 치환을 또한 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비변형된" 또는 "천연" 핵염기는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)를 포함한다. 변형된 핵염기는 단지 드물게 또는 일시적으로 천연 핵산에서 발견된 핵염기, 예를 들면, 하이포잔틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신 (또한 5-메틸-2' 데옥시시토신으로 지칭되고 종종 당해 분야에서 5-Me-C로서 지칭됨), 5-하이드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC 및 젠토비오실 HMC, 뿐만 아니라 합성 핵염기, 예를 들면, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노alkly아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp75-77 (1980); Gebeyehu 등, Nucl. Acids Res. 15:4513 (1997). 당해 분야에서 공지된 "보편적인" 염기, 예를 들면, 이노신은 또한 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 0.6-1.2 ºC. 만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 밝혀지고 (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) 그리고 염기 치환의 구현예이다.
변형된 핵염기는 하기를 포함한다: 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸쿠아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌.
또한, 핵염기는 하기를 포함한다: 미국 특허 번호 3,687,808에서 개시된 것, 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990에서 개시된 것, Englisch 등, Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, page 613에 의해 개시된 것, 및 Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications', pages 289- 302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993에 의해 개시된 것. 특정한 이들 핵염기는 본 발명의 올리고머성 화합물의 결합 친화성 증가에 특히 유용하다. 이들은, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2ºC 만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 밝혀지고 (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds, 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 더욱더 상세하게는 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된 경우, 염기 치환의 구현예이다. 변형된 핵염기는 하기에서 기재된다: 미국 특허 번호 3,687,808, 뿐만 아니라 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 5,763,588; 5,830,653; 6,005,096; 및 미국 특허 출원 공개 2003/0158403.
따라서, 용어 "변형된"은 가이드 RNA, 엔도뉴클레아제, 또는 양쪽 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 속으로 편입되는 비-천연 당, 포스페이트, 또는 염기를 지칭한다. 주어진 올리고뉴클레오타이드에서 모든 위치가 균일하게 변형되는 것이 필요없고, 사실상 상기 언급된 변형의 1 초과는 단일 올리고뉴클레오타이드에서, 또는 심지어 올리고뉴클레오타이드 이내 단일 뉴클레오사이드에서 편입될 수 있다.
일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 가이드 RNAs 및/또는 mRNA (또는 DNA)는 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포, 또는 세포 흡수를 향상시키는 1개 이상의 모이어티 또는 콘주게이트에 화학적으로 연결된다. 그와 같은 모이어티는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 지질 모이어티 예컨대 콜레스테롤 모이어티 [Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556 (1989)]; 콜산 [Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Let., 4: 1053-1060 (1994)]; 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올 [Manoharan 등, Ann. N. Y. Acad. Sci., 660: 306-309 (1992) 및 Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Let., 3: 2765-2770 (1993)]; 티오콜레스테롤 [Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 20: 533-538 (1992)]; 지방족 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기 [Kabanov 등, FEBS Lett., 259: 327-330 (1990) 및 Svinarchuk 등, Biochimie, 75: 49- 54 (1993)]; 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 [Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995) 및 Shea 등, Nucl. Acids Res., 18: 3777-3783 (1990)]; 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 [Mancharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 14: 969-973 (1995)]; 아다만탄 아세트산 [Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 36: 3651-3654 (1995)]; 팔미틸 모이어티 [(Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1264: 229-237 (1995)]; 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-t 옥시콜레스테롤 모이어티 [Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 923-937 (1996)]. 참조 또한 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599, 928 및 5,688,941.
당류 및 다른 모이어티는 뉴클레오타이드, 예컨대 양이온성 폴리좀 및 리포좀을 포함하는 단백질 및 복합체를 특정한 부위에 표적하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 간 세포 유도된 전이는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPRs)를 통해 매개될 수 있다; 참조, 예를 들면, Hu, 등, Protein Pept Lett. 21(10):1025-30 (2014). 당해 분야에서 공지된 및 규칙적으로 개발된 다른 시스템은 본 경우에서 사용하는 생체분자 및/또는 이의 복합체를 특정한 관심 표적 세포에 표적하는데 사용될 수 있다.
이들 표적화 모이어티 또는 콘주게이트는 작용기, 예컨대 1차 또는 2차 하이드록실 기에 공유결합된 콘주게이트 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 콘주게이트 기는 삽입제, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학적 특성을 향상시키는 기, 및 올리고머의 약동학적 특성을 향상시키는 기를 포함한다. 전형적인 콘주게이트 기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴, 펜아진, 폴레이트, 펜안트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레신, 로다민, 쿠마린, 및 염료를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 약력학적 특성을 향상시키는 기는 흡수를 개선하는, 열화에 대한 저항성을 향상시키는, 및/또는 표적 핵산으로 서열-특이적 하이브리드화를 강화시키는 기를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 약동학적 특성을 향상시키는 기는 본 발명의 화합물의 흡수, 분포, 대사 또는 배출을 개선하는 기를 포함한다. 대표적인 콘주게이트 기는, 본 명세서에서 참고로 편입되는, 1992년 10월 23일 출원된, 국제 특허 출원 번호 PCT/US92/09196, 및 미국 특허 번호 6,287,860에서 개시된다. 콘주게이트 모이어티는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 지질 모이어티 예컨대 콜레스테롤 모이어티, 콜산, 티오에테르, 예를 들면, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시 콜레스테롤 모이어티. 참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941.
화학 합성에 덜 잘 받아들이고 효소 합성에 의해 전형적으로 생산되는 더 긴 폴리뉴클레오타이드는 또한 다양한 수단에 의해 변형될 수 있다. 그와 같은 변형은, 예를 들어, 특정 뉴클레오타이드 유사체의 도입, 분자의 5' 또는 3' 단부에서 특정한 서열 또는 다른 모이어티의 편입, 및 다른 변형을 포함할 수 있다. 예시로서, Cas9를 인코딩하는 mRNA는 길이가 대략 4 kb이고 시험관내 전사에 의해 합성될 수 있다. mRNA에 대한 변형은, 예를 들면, (예컨대 세포로 열화에 대한 그것의 저항 증가에 의해) 그것의 번역 또는 안정성을 증가시키는데, 또는 외인성 RNAs, 특히 더 긴 RNAs 예컨대 Cas9를 인코딩한 것의 도입 이후 세포에서 종종 관측되는 타고난 면역 반응을 유도하기 위해 RNA의 경향을 감소시키는데 적용될 수 있다.
수많은 그와 같은 변형, 예컨대 polyA 꼬리, 5' 캡 유사체 (예를 들면, 항 가역적 Cap 유사체 (ARCA) 또는 m7G(5')ppp(5')G (mCAP)), 변형된 5' 또는 3' 미번역된 영역 (UTRs), 변형된 염기 (예컨대 슈도-UTP, 2-티오-UTP, 5-메틸시티딘-5'-삼인산 (5-메틸-CTP) 또는 N6-메틸-ATP)의 사용, 또는 5' 말단 포스페이트를 제거하기 위해 포스파타제로 처리는 당해 분야에서 기재되어 있다. 이들 및 다른 변형은 당해 기술에서 공지되어 있고, RNAs의 신규한 변형은 규칙적으로 개발중이다.
예를 들어, TriLink Biotech, AxoLabs, Bio-Synthesis Inc., Dharmacon 및 많은 기타를 포함하는, 변형된 RNAs의 수많은 상업적 공급자가 있다. TriLink에 의해 기재된 바와 같이, 예를 들어, 5-메틸-CTP는 바람직한 특징, 예컨대 증가된 뉴클레아제 안정성, 증가된 번역 또는 타고난 면역 수용체의 시험관내 전사된 RNA와의 감소된 상호작용을 부여하는데 사용될 수 있다. 5-메틸시티딘-5'-삼인산 (5-메틸-CTP), N6-메틸-ATP, 뿐만 아니라 슈도-UTP 및 2-티오-UTP는 또한, 아래 참조된 Kormann 등 및 Warren 등에 의한 공보에서 설명된 바와 같이, 번역을 향상시키는 동안 배양액내 및 생체내 타고난 면역 자극을 감소시키는 것으로 나타났다.
생체내 전달된 화학적으로 변형된 mRNA가 개선된 치료 효과를 달성하는데 사용될 수 있다는 것이 나타났다; 참조, 예를 들면, Kormann 등, Nature Biotechnology 29, 154-157 (2011). 그와 같은 변형은, 예를 들어, RNA 분자의 안정성을 증가시키는데 및/또는 그것의 면역원성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 화학 변형 예컨대 슈도-U, N6-메틸-A, 2-티오-U 및 5-메틸-C를 이용하여, 2-티오-U 및 5-메틸-C 각각으로 우리딘 및 시티딘 잔기의 단지 4분의 1 치환이 마우스에서 mRNA의 톨-유사 수용체 (TLR) 매개된 인식에서 상당한 감소를 초래하였다는 것이 밝혀졌다. 타고난 면역 시스템의 활성화 감소에 의해, 이들 변형은 생체내 mRNA의 안정성 및 장수를 효과적으로 증가시키는데 사용될 수 있다; 참조, 예를 들면, Kormann 등, 상동.
타고난 항-바이러스성 반응을 우회하도록 설계된 변형을 편입시키는 합성 메신저 RNAs의 반복된 투여가 분화된 인간 세포를 만능분화능으로 리프로그래밍할 수 있다는 것이 또한 밝혀졌다. 참고, 예를 들면, Warren, 등, Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010). 1차 리프로그래밍 단백질로서 작용하는 그와 같은 변형된 mRNAs는 리프로그래밍 다중 인간 세포 유형의 효율적인 수단일 수 있다. 그와 같은 세포는 유도된 만능분화능 줄기 세포 (iPSCs)로서 지칭되고, 효소적으로 합성된 RNA 편입 5-메틸-CTP, 슈도-UTP 및 항 가역적 캡 유사체 (ARCA)가 세포의 항바이러스 반응을 효과적으로 모면하는데 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다; 참고, 예를 들면, Warren 등, 상동.
당해 분야에서 기재된 폴리뉴클레오타이드의 다른 변형은, 예를 들어, polyA 꼬리의 사용, 5' 캡 유사체 (예컨대 m7G(5')ppp(5')G (mCAP))의 첨가, 5' 또는 3' 미번역된 영역 (UTRs)의 변형, 또는 5' 말단 포스페이트를 제거하기 위해 포스파타제로 치료를 포함하고 - 신규한 접근법은 규칙적으로 개발중이다.
본 명세서에서 사용을 위하여 변형된 RNAs의 생성에 적용가능한 수많은 조성물 및 기술은, 작은-간섭 RNAs (siRNAs)를 포함하는, RNA 간섭 (RNAi)의 변형에 관련하여 개발되고 있다. siRNAs가 생체내 특정한 과제를 나타내는 것은 mRNA 간섭을 통해 유전자 침묵화에서 그것의 효과가 일반적으로 일시적이기 때문이고, 이는 반복부 투여를 요구할 수 있다. 게다가, siRNAs는 이중-가닥 RNAs (dsRNA)이고 포유동물 세포는, 종종 바이러스성 감염의 부산물인, dsRNA를 검출 및 중화시키도록 진화된 면역 반응을 갖는다. 따라서, 포유동물 효소 예컨대 PKR (dsRNA-반응성 키나제), 및 dsRNA에 세포 반응을 매개할 수 있는, 잠재적으로 레틴산-유도성 유전자 I (RIG-I), 뿐만 아니라 그와 같은 분자에 반응하여 사이토카인의 유도를 유발시킬 수 있는 톨-유사 수용체 (예컨대 TLR3, TLR7 및 TLR8)이 있다; 참조, 예를 들면, 하기에 의한 검토: Angart 등, Pharmaceuticals (Basel) 6(4): 440-468 (2013); Kanasty 등, Molecular Therapy 20(3): 513-524 (2012); Burnett 등, Biotechnol J. 6(9):1130-46 (2011); Judge and MacLachlan, Hum Gene Ther 19(2):111-24 (2008); 및 본 명세서에서 인용된 참조문헌.
아주 다양한 변형은, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, RNA 안정성을 향상시키기 위해, 타고난 면역 반응을 감소시키기 위해, 및/또는 인간 세포 속으로 폴리뉴클레오타이드의 도입과 관련하여 유용할 수 있는 다른 이점을 달성하기 위해 개발되고 있고 적용되고 있다; 참조, 예를 들면, 하기에 의한 검토: Whitehead KA 등, Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering, 2: 77-96 (2011); Gaglione and Messere, Mini Rev Med Chem, 10(7):578-95 (2010); Chernolovskaya 등, Curr Opin Mol Ther., 12(2):158-67 (2010); Deleavey 등, Curr Protoc Nucleic Acid Chem Chapter 16:Unit 16.3 (2009); Behlke, Oligonucleotides 18(4):305-19 (2008); Fucini 등, Nucleic Acid Ther 22(3): 205-210 (2012); Bremsen 등, Front Genet 3:154 (2012).
전술한 바와 같이, 변형된 RNAs의 수많은 상업적 공급자가 있고, 이들 중 다수는 siRNAs의 유효성을 개선하도록 설계된 변형에서 특화하였다. 다양한 접근법은 문헌에서 보고된 다양한 발견에 기반하여 제공된다. 예를 들어, Dharmacon은 황 (포스포로티오에이트, PS)로 비-브릿징 산소의 대체가, Kole, Nature Reviews Drug Discovery 11:125-140 (2012)에 의해 보고된 바와 같이, siRNAs의 뉴클레아제 저항성을 개선하는데 광범위하게 사용되고 있다는 것을 언급한다. 리보오스의 2'-위치의 변형은 듀플렉스 안정성 (Tm)을 증가시키면서 뉴클레오타이드간 포스페이트 결합의 뉴클레아제 저항성을 개선한다고 보고되었고, 이는 또한 면역 활성화로부터 보호를 제공하는 것으로 나타났다. 작은, 양호하게-용인된 2'-치환 (2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-하이드로)를 가진 중간 정도 PS 골격 변형의 조합은, Soutschek 등 Nature 432:173-178 (2004)에 의해 보고된 바와 같이, 생체내 적용을 위하여 고도로 안정적인 siRNAs와 관련되고 있고; 2'-O-메틸 변형은 Volkov, Oligonucleotides 19:191-202 (2009)에 의해 보고된 바와 같이 안정성 개선에 효과적인 것으로 보고되고 있다. 타고난 면역 반응의 유도 감소에 대하여, 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-하이드로로 특이적 서열의 변형은 침묵화 활성을 일반적으로 보존하면서 TLR7/TLR8 상호작용을 감소시키는 것으로 보고되고 있다; 참조, 예를 들면, Judge 등, Mol. Ther. 13:494-505 (2006); 및 Cekaite 등, J. Mol. Biol. 365:90-108 (2007). 추가의 변형, 예컨대 2-티오우라실, 슈도우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실, 및 N6-메틸아데노신은 또한 TLR3, TLR7, 및 TLR8에 의해 매개된 면역 효과를 최소화하는 것으로 밝혀졌다; 참조, 예를 들면, Kariko, K. 등, Immunity 23:165-175 (2005).
당해 분야에서 또한 공지된, 및 상업적으로 입수가능한 바와 같이, 수많은 콘주게이트는, 예를 들어, 콜레스테롤, 토코페롤 및 엽산, 지질, 펩타이드, 폴리머, 링커 및 압타머를 포함하여, 세포에 의한 흡수 및/또는 그것의 전달을 향상시킬 수 있는 본 명세서에서 사용을 위하여, 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 RNAs에 적용될 수 있다; 참조, 예를 들면, 하기에 의한 검토: Winkler, Ther. Deliv. 4:791-809 (2013), 및 본 명세서에서 인용된 참조문헌.
코돈-최적화
일부 구현예에서, 부위 특이적 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 관심의 표적 DNA를 함유하는 세포에서 발현을 위하여 당해 분야에서 방법 표준에 따라 코돈-최적화된다. 예를 들어, 의도된 표적 핵산이 인간 세포에 있으면, Cas9를 인코딩하는 인간 코돈-최적화된 폴리뉴클레오타이드는 Cas9 폴리펩타이드 생산용 용도로 고려된다.
게놈-표적 핵산 및 부위 특이적 폴리펩타이드의 복합체
게놈-표적 핵산은 부위 특이적 폴리펩타이드 (예를 들면, 핵산-유도된 뉴클레아제 예컨대 Cas9)와 상호작용하고, 이로써 복합체를 형성한다. 게놈-표적 핵산은 부위 특이적 폴리펩타이드를 표적 핵산에 가이드한다.
RNPs
이전에 언급된 바와 같이, 부위 특이적 폴리펩타이드 및 게놈-표적 핵산 각각은 별도로 세포 또는 환자에 투여될 수 있다. 다른 한편으로, 부위 특이적 폴리펩타이드는 tracrRNA와 함께 1개 이상의 가이드 RNAs, 또는 1개 이상의 crRNA와 사전-복합체화될 수 있다. 사전-복합체화된 물질은 그 다음 세포 또는 환자에 투여될 수 있다. 그와 같은 사전-복합체화된 물질은 리보핵단백질 입자 (RNP)로서 공지된다.
핵산 인코딩 시스템 성분
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 게놈-표적 핵산을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 본 개시내용의 부위 특이적 폴리펩타이드, 및/또는 본 개시내용의 방법의 구현예를 실시하기 위해 필요한 임의의 핵산 또는 단백질성 분자를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 게놈-표적 핵산을 인코딩하는 핵산, 본 개시내용의 부위 특이적 폴리펩타이드, 및/또는 본 개시내용의 방법의 구현예를 실시하기 위해 필요한 임의의 핵산 또는 단백질성 분자는 벡터 (예를 들면, 재조합 발현 벡터)를 포함한다.
용어 "벡터"는 연결되고 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 하나의 유형은, 추가의 핵산 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중-가닥 DNA 루프를 지칭하는, "플라스미드"이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 핵산 세그먼트는 바이러스성 게놈 속으로 결찰될 수 있다. 특정 벡터 (예를 들면, 복제의 박테리아 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적 복제를 할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 속으로 도입시 숙주 세포의 게놈 속으로 통합되고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다.
일부 구현예에서, 벡터는 이들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 그와 같은 벡터는, 동등한 기능을 담당하는, 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터", 또는 더욱 간단히 "발현 벡터"로서 지칭된다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되는 것을 의미한다. 용어 "조절 서열"은, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소 (예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 그와 같은 조절 서열은 당해 분야에서 잘 알려지고, 예를 들어, 하기에서 기재된다: Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). 조절 서열은 숙주 세포의 많은 유형에서 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 유도하는 것, 그리고 특정 숙주 세포 (예를 들면, 조직-특이적 조절 서열)에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하는 것을 포함한다. 발현 벡터의 설계가 상기 표적 세포의 선택, 원하는 발현의 수준, 및 기타 동종과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 것이다.
고려된 발현 벡터는, 비제한적으로, 하기를 포함하다: 백시니아 바이러스, 폴리오바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, SV40, 단순 포진 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 레트로바이러스에 기반된 바이러스 벡터 (예를 들면, 쥣과 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스 예컨대 루 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유선 종양 바이러스에서 유래된 벡터) 및 다른 재조합 벡터. 진핵 표적 세포에 대하여 고려된 다른 벡터는, 비제한적으로, 벡터 pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVLSV40 (Pharmacia)를 포함한다. 다른 벡터는 이들이 숙주 세포와 양립가능한 동안은 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 1개 이상의 전사 및/또는 번역 조절 요소를 포함한다. 이용된 숙주/벡터 시스템에 의존하여, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자, 등을 포함하는, 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 조절 요소는 발현 벡터에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 어느 한쪽으로 바이러스성 서열 또는 CRISPR 기계 또는 다른 요소의 성분을 비활성화시키는 자기-비활성화 벡터이다.
적합한 진핵 프로모터(즉, 진핵 세포에서 기능성인 프로모터)의 비-제한 예는 하기로부터의 것을 포함한다: 사이토메갈로바이러스 (CMV) 전초기, 단순 포진 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터 긴 말단 반복부 (LTRs), 인간 신장 인자-1 프로모터 (EF1), 닭 베타-액틴 프로모터 (CAG)에 융합된 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서를 포함하는 하이브리드 작제물, 쥣과 줄기 세포 바이러스 프로모터 (MSCV), 포스포글리세레이트 키나제-1 유전자좌 프로모터 (PGK), 및 마우스 메탈로티오네인-I.
Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제와 관련하여 사용된 가이드 RNAs를 포함하는, 작은 RNAs 발현을 위하여, 예를 들어 U6 및 H1을 포함하는, 다양한 프로모터 예컨대 RNA 폴리머라제 III 프로모터는 유리할 수 있다. 그와 같은 프로모터의 용도 향상을 위한 파라미터 및 상기의 설명은 종래 기술에서 공지되고, 추가의 정보 및 접근법은 규칙적으로 기재되고 있다; 참조, 예를 들면, Ma, H. 등, Molecular Therapy - Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12.
발현 벡터는 또한 번역 개시및 전사 종결자용 리보솜 결합 부위를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현 증폭용 적절한 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 부위 특이적 폴리펩타이드에 융합되는 비-원상태 태그 (예를 들면, 히스티딘 태그, 혈구응집소 태그, 녹색 형광 단백질, 등)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 따라서 융합 단백질을 초래한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터 (예를 들면, 열충격 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 에스트로겐 수용체-조절된 프로모터, 등)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터 (예를 들면, CMV 프로모터, UBC 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 공간적으로 제한된 및/또는 일시적으로 제한된 프로모터 (예를 들면, 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터, 등)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 게놈-표적 핵산을 인코딩하는 핵산 및/또는 부위 특이적 폴리펩타이드는 세포에 전달용 전달 비히클의 표면 속에 또는 표면상에 패키징된다. 고려된 전달 비히클은, 비제한적으로, 나노구형체, 리포좀, 양자점, 나노입자, 폴리에틸렌 글리콜 입자, 하이드로겔, 및 교질입자를 포함한다. 당해 분야에서 기재된 바와 같이, 다양한 표적화 모이어티는 원하는 세포 유형 또는 위치와 그와 같은 비히클의 우선적인 상호작용을 향상시키는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 복합체, 폴리펩타이드, 및 핵산의 세포 속으로의 도입은 바이러스성 또는 박테리오파아지 감염, 형질감염, 콘주게이션, 원형질 융합, 리포펙션, 전기천공, 뉴클레오펙션, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개된 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 리포좀-매개된 형질감염, 입자총 기술, 인산칼슘 침전, 직접적인 마이크로-주사, 나노입자-매개된 핵산 전달, 및 기타 동종에 의해 발생할 수 있다.
전달
가이드 RNA 폴리뉴클레오타이드 (RNA 또는 DNA) 및/또는 엔도뉴클레아제 폴리뉴클레오타이드(들) (RNA 또는 DNA)는 당해 분야에서 공지된 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 대안적으로, 엔도뉴클레아제 폴리펩타이드(들)은 당해 분야에서 공지된 비-바이러스 전달 비히클, 예컨대 전기천공 또는 지질 나노입자에 의해 전달될 수 있다. 추가 대안적인 구현예에서, DNA 엔도뉴클레아제는 어느 한쪽 단독으로, 1개 이상의 폴리펩타이드로서 전달될 수 있거나 tracrRNA와 함께 1개 이상의 crRNA 또는, 1개 이상의 가이드 RNAs와 사전-복합체화될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는, 비제한적으로, 나노입자, 리포좀, 리보핵단백질, 양으로 하전된 펩타이드, 소분자 RNA-콘주게이트, 압타머-RNA 키메라, 및 RNA-융합 단백질 복합체를 포함하는 비-바이러스 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 일부 예시적인 비-바이러스 전달 비히클은 하기에서 기재된다: Peer and Lieberman, Gene Therapy, 18: 1127-1133 (2011) (다른 폴리뉴클레오타이드의 전달에 또한 유용한 siRNA용 비-바이러스 전달 비히클에 집중함).
엔도뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 가이드 RNA, sgRNA, 및 mRNA는 지질 나노입자 (LNP)에 의해 세포 또는 환자에 전달될 수 있다.
LNP는 1000 nm, 500 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 또는 25 nm 미만의 직경을 갖는 임의의 입자를 지칭한다. 대안적으로, 나노입자는 크기가 1-1000 nm, 1-500 nm, 1-250 nm, 25-200 nm, 25-100 nm, 35-75 nm, 또는 25-60 nm의 범위일 수 있다.
LNPs는 양이온성, 음이온성, 또는 중성 지질로부터 제조될 수 있다. 중성 지질, 예컨대 융합유도 인지질 DOPE 또는 막 성분 콜레스테롤은 형질감염 활성 및 나노입자 안정성을 향상시키기 위해 '헬퍼 지질'로서 LNPs에서 포함될 수 있다. 양이온성 지질의 제한은 좋지 못한 안정성 및 급속 청소능으로 인한 낮은 효능, 뿐만 아니라 염증성 또는 항-염증성 반응의 생성을 포함한다.
LNPs는 또한 소수성 지질, 친수성 지질, 또는 양쪽 소수성 및 친수성 지질로 구성될 수 있다.
당해 기술에서 공지되어 있는 임의의 지질 또는 지질의 조합은 LNP를 생산하는데 사용될 수 있다. LNPs를 생산하는데 사용된 지질의 예는 하기이다: DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-콜레스테롤, DOTAP-콜레스테롤, GAP-DMORIE-DPyPE, 및 GL67A-DOPE-DMPE-폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 양이온성 지질의 예는 하기이다: 98N12-5, C12-200, DLin-KC2-DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1, 및 7C1. 중성 지질의 예는 하기이다: DPSC, DPPC, POPC, DOPE, 및 SM. PEG-변형된 지질의 예는 하기이다: PEG-DMG, PEG-CerC14, 및 PEG-CerC20.
지질은 LNP를 생산하기 위해 임의의 수의 몰비로 조합될 수 있다. 게다가, 폴리뉴클레오타이드(들)은 LNP를 생산하기 위해 광범위한 몰비로 지질(들)과 조합될 수 있다.
이전에 언급된 바와 같이, 부위 특이적 폴리펩타이드 및 게놈-표적 핵산 각각은 별도로 세포 또는 환자에 투여될 수 있다. 다른 한편으로, 부위 특이적 폴리펩타이드는 tracrRNA와 함께 1개 이상의 crRNA 또는, 1개 이상의 가이드 RNAs와 사전-복합체화될 수 있다. 사전-복합체화된 물질은 그 다음 세포 또는 환자에 투여될 수 있다. 그와 같은 사전-복합체화된 물질은 리보핵단백질 입자 (RNP)로서 공지된다.
RNA는 RNA 또는 DNA와 특이적 상호작용을 형성할 수 있다. 이러한 특성이 많은 생물학적 과정에서 개척되는 동안, 또한 핵산-풍부 세포 환경에서 부정확한 상호작용의 위험과 함께 온다. 이러한 문제에 대한 하나의 해결책은 리보핵단백질 입자 (RNPs)의 형성이고, 여기에서 RNA는 엔도뉴클레아제와 사전-복합체화된다. RNP의 또 다른 이점은 열화로부터 RNA의 보호이다.
RNP에서 엔도뉴클레아제는 변형 또는 비변형될 수 있다. 마찬가지로, gRNA, crRNA, tracrRNA, 또는 sgRNA는 변형 또는 비변형될 수 있다. 수많은 변형은 당해 기술에서 공지되어 있고 사용될 수 있다.
엔도뉴클레아제 및 sgRNA는 1:1 몰비로 일반적으로 조합될 수 있다. 대안적으로, 엔도뉴클레아제, crRNA 및 tracrRNA는 1:1:1 몰비로 일반적으로 조합될 수 있다. 그러나, 광범위한 몰비는 RNP를 생산하는데 사용될 수 있다.
바이러스 벡터, 예컨대 아데노 바이러스, HPV, HSV, 렌티 바이러스, 또는 다른 바이러스 벡터는 전달용으로 사용될 수 있다.
재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터는 전달용으로 사용될 수 있다. 전달되는 폴리뉴클레오타이드, rep 및 cap 유전자, 그리고 헬퍼 바이러스 기능을 포함하는 패키징되는 AAV 게놈이 세포에 제공되는, rAAV 입자를 생산하는 기술은 당해 분야에서 표준이다. rAAV의 생산은 다음과 같은 성분이 (패키징 세포로서 본 명세서에서 언급된) 단일 세포: rAAV 게놈, rAAV 게놈에서 분리된 (즉, 게놈이 아닌) AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 기능 이내 존재하는 것을 요구한다. AAV rep 및 cap 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형 출신일 수 있고, 비제한적으로, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 및 AAV rh.74를 포함하는, rAAV 게놈 ITRs보다 상이한 AAV 혈청형 출신일 수 있다. 위형 rAAV의 생산은, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/83692에서 개시된다. 참조 표 1.
표 1
Figure pct00001
패키징 세포의 생성 방법은 AAV 입자 생산용 모든 필요한 성분을 안정적으로 발현시키는 세포주의 창출을 포함한다. 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자가 부족한 rAAV 게놈, rAAV 게놈에서 분리된 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선별 마커, 예컨대 네오마이신 저항 유전자를 포함하는 플라스미드 (또는 다중 플라스미드)는 세포의 게놈 속으로 통합된다. AAV 게놈은 박테리아 플라스미드 속으로 절차 예컨대 GC 테일링 (Samulski 등, 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 첨가 (Laughlin 등, 1983, Gene, 23:65-73) 또는 직접, 블런트-말단 결찰 (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)에 의해 도입되고 있다. 패키징 세포주는 그 다음 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스로 감염된다. 이러한 방법의 이점은 세포가 선택가능하고 rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는, 패키징 세포 속으로 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 도입하기 위해, 플라스미드 보다는, 아데노바이러스 또는 배큘로바이러스를 사용한다.
rAAV 생산의 일반 원리는, 예를 들어, 하기에서 검토된다: Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; 및 Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). 다양한 접근법은 하기에서 기재된다: Ratschin 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin 등, Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin 등, J. Virol., 62:1963 (1988); 및 Lebkowski 등, 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski 등 (1989, J. Virol., 63:3822-3828); 미국 특허 번호 5,173,414; WO 95/13365 및 상응하는 미국 특허 번호 5,658.776 ; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin 등 (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul 등 (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark 등 (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; 미국 특허 번호 5,786,211; 미국 특허 번호. 5,871,982; 및 미국 특허 번호 6,258,595.
AAV 벡터 혈청형은 표적 세포 유형에 매칭될 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 예시적인 세포 유형은 그 중에서도 지시된 AAV 혈청형에 의해 형질도입될 수 있다. 참조 표 2.
표 2
Figure pct00002
Figure pct00003
아데노-관련 바이러스 벡터에 더하여, 다른 바이러스 벡터는 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 그와 같은 바이러스 벡터는, 비제한적으로, 렌티바이러스, 알파바이러스, 에테로바이러스, 페스티바이러스, 배큘로바이러스, 헤르페스바이러스, 엡슈타인 바르 바이러스, 파포바바이러스, 폭스바이러스, 백시니아 바이러스, 및 단순 포진 바이러스를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas9 mRNA, C9ORF72 유전자에서 1개 또는 2개 유전자좌를 표적하는 sgRNA, 및 공여체 DNA는 지질 나노입자로 각각 별도로 제형화되거나, 1개의 지질 나노입자로 모두 공-제형화되거나, 2개 이상의 지질 나노입자로 공-제형화된다.
일부 구현예에서, Cas9 mRNA는 지질 나노입자에서 제형화되고, 반면 sgRNA 및 공여체 DNA는 AAV 벡터에서 전달된다. 일부 구현예에서, Cas9 mRNA 및 sgRNA는 지질 나노입자에서 공-제형화되고, 반면 공여체 DNA는 AAV 벡터에서 전달된다.
옵션은 DNA 플라스미드로서, mRNA로서 또는 단백질로서 Cas9 뉴클레아제를 전달하는데 이용가능하다. 가이드 RNA는 동일한 DNA로부터 발현될 수 있거나, RNA로서 또한 전달될 수 있다. RNA는 그것의 반감기를 변경 또는 개선하기 위해, 또는 면역 반응의 가능성 또는 정도를 감소시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 엔도뉴클레아제 단백질은 전달에 앞서 gRNA와 복합체화될 수 있다. 바이러스 벡터는 효율적인 전달을 허용하고; Cas9의 분할 버전 및 Cas9의 더 작은 오쏘로그는, HDR용 공여체가 할 수 있듯이, AAV에서 패키징될 수 있다. 각각의 이들 성분을 전달할 수 있는 비-바이러스 전달 방법의 범위는 또한 실재하거나, 비-바이러스 및 바이러스 방법은 나란히 이용될 수 있다. 예를 들어, 나노-입자는 단백질 및 가이드 RNA를 전달하는데 사용될 수 있고, 반면 AAV는 공여체 DNA를 전달하는데 사용될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포
용어 "유전적으로 변형된 세포"는 (예를 들면, CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템을 이용하는) 게놈 편집에 의해 도입된 적어도 하나의 유전적 변형을 포함하는 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 일부 생체외 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 전구 세포이다. 본 명세서에서 일부 생체내 구현예에서, 유전적으로 변형된 세포는 유전적으로 변형된 신경 세포이다. 외인성 게놈-표적 핵산 및/또는 게놈-표적 핵산을 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 세포는 본 명세서에서 고려된다.
용어 "대조군 처리된 모집단"은, 게놈 편집 성분의 첨가를 예외로, 동일한 배지, 바이러스성 유도, 핵산 서열, 온도, 밀집도, 플라스크 크기, pH, 등으로 처리된 세포의 모집단을 기재한다. 당해 분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들어 의 노던 블랏 분석 또는 C9ORF72 mRNA 정량화는 C9ORF72 유전자에서 헥사뉴클레오타이드 반복부의 길이를 측정하는데 사용될 수 있다.
용어 "단리된 세포"는 본래 발견되었던 유기체로부터 제거된 세포, 또는 그와 같은 세포의 후손을 지칭한다. 임의로, 세포는 시험관내, 예를 들면, 정의된 조건하에 또는 다른 세포의 존재하에 배양되고 있다. 임의로, 세포는 제2 유기체 속으로 나중에 도입되거나 또는 단리되었던 것 (또는 전해지는 세포) 유기체 속으로 재도입된다.
세포의 단리된 모집단에 대한 용어 "단리된 모집단"은 세포의 혼합된 또는 불균질 모집단으로부터 제거 및 분리된 세포의 모집단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 단리된 모집단은, 세포가 단리 또는 농축된 것으로부터 불균질 모집단에 비교된 경우, 세포의 실질적으로 순수한 모집단이다. 일부 구현예에서, 단리된 모집단은, 인간 전구 세포가 유래된 것으로부터 세포 및 인간 전구 세포를 포함하는 세포의 불균질 모집단에 비교된 경우, 인간 전구 세포의 단리된 모집단, 예를 들면, 인간 전구 세포의 실질적으로 순수한 모집단이다.
특정한 세포 모집단에 대한, 용어 "실질적으로 향상된"은 세포의 특정한 유형의 발생이, 예를 들면, ALS 및/또는 FTLD 완화를 위한 그와 같은 세포의 원하는 수준에 의존하여 적어도 2-배, 적어도 3-, 적어도 4-, 적어도 5-, 적어도 6-, 적어도 7-, 적어도 8-, 적어도 9, 적어도 10-, 적어도 20-, 적어도 50-, 적어도 100-, 적어도 400-, 적어도 1000-, 적어도 5000-, 적어도 20000-, 적어도 100000- 또는 초과 배만큼, 기존의 또는 참조 수준에 비해 증가되는 세포의 모집단을 지칭한다.
특정한 세포 모집단에 대한 용어 "실질적으로 풍부한"은 총 세포 모집단을 구성하는 세포에 대하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70% 또는 초과인 세포의 모집단을 지칭한다.
특정한 세포 모집단에 대한 용어 "실질적으로 풍부한" 또는 "실질적으로 순수한"은 총 세포 모집단을 구성하는 세포에 대하여 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 순수한 세포의 모집단을 지칭한다. 즉, 전구 세포의 모집단에 대하여, 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "본질적으로 정제된"은 본 명세서에서 용어에 의해 정의된 바와 같이 전구 세포가 아닌 세포의 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 또는 1% 미만보다 적게 함유하는 세포의 모집단을 지칭한다.
조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포 속으로 게놈 편집된 iPSCs의 분화
본 발명의 생체외 방법의 또 다른 단계는 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포 속으로 게놈 편집된 iPSCs의 분화를 포함한다. 분화 단계는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, iPSCs는 소분자의 조합을 이용하여 또는 마스터 전사 인자 예컨대, 비제한적으로, Brn2, ASCL1, MYT1L, Sox2 및 Foxa2,Hes1,　Hes3,　Klf4,　Myc, Notch1, (NICD),　PLAGL1, 및 Rfx4의 전달에 의해 뉴런으로 분화된다. iPSCs는, βIII-튜불린, 티로신 하이드록실라제, AADC, DAT, ChAT, LMX1B, 및 MAP2를 발현시키는, 뉴런으로 분화될 수 있다. 카테콜아민-관련 효소의 존재는, hESCs처럼, iPSCs가 도파민작용성 뉴런으로 분화가능성일 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.
게놈 편집된 간엽 줄기 세포의 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포 속으로의 분화
본 발명의 생체외 방법의 또 다른 단계는 게놈 편집된 간엽 줄기 세포의 신경 세포로의 분화를 포함한다. 분화 단계는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 간엽 줄기 세포는 소분자의 조합을 이용하여 또는 마스터 전사 인자 예컨대, 비제한적으로, Brn2, ASCL1, MYT1L, Sox2 및 Foxa2, Hes1, Hes3, Klf4, Myc, Notch1, (NICD), PLAGL1, 및 Rfx4의 전달에 의해 뉴런으로 분화된다. 간엽 줄기 세포는, βIII-튜불린, 티로신 하이드록실라제, AADC, DAT, ChAT, LMX1B, 및 MAP2를 발현시키는, 뉴런으로 분화될 수 있다. 카테콜아민-관련 효소의 존재는, hESCs처럼, 간엽 줄기 세포가 도파민작용성 뉴런으로 분화가능성일 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.
세포의 환자로의 임플란팅
본 발명의 생체외 방법의 또 다른 단계는 세포의 환자로의 임플란팅을 포함한다. 이러한 임플란팅 단계는 당해 분야에서 공지된 임의의 임플란팅하기 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는 환자의 중추 신경계에서 직접적으로 주사될 수 있거나 또는 달리 환자에 투여될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 선택된 마커를 이용하여 생체외 정제될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 캐리어
본 명세서에서 고려된 대상체에 전구 세포의 생체외 투여 방법은 전구 세포를 포함하는 치료 조성물의 사용을 포함한다.
치료 조성물은, 활성 성분으로서 거기에서 용해된 또는 분산된, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 세포 조성물과 함께 생리적으로 내성있는 캐리어, 및 임의로 적어도 하나의 추가의 생체활성제를 함유한다. 일부 구현예에서, 치료 조성물은, 그렇게 원하지 않는 한, 치료 목적으로 포유동물 또는 인간 환자에 투여된 경우 실질적으로 면역원성이 아니다.
일반적으로, 본 명세서에서 기재된 전구 세포는 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 가진 현탁액으로서 투여된다. 당해 분야의 숙련가는 세포 조성물에서 사용되는 약제학적으로 허용가능한 캐리어가 상기 대상체에게 전달된 세포의 생존력을 실질적으로 방해하지 않는 양으로 완충액, 화합물, 동결보존 제제, 보존제, 또는 다른 제제를 포함하지 않을 것을 인식할 것이다. 세포를 포함하는 제형은 예를 들면, 세포 막 완전성을 유지되도록 하는 삼투 완충액, 및 임의로, 세포 생존력을 유지시키기 위한 또는 투여시 생착을 향상시키기 위한 영양소를 포함할 수 있다. 그와 같은 제형 및 현탁액은 당해 분야의 숙련가에 공지되고/되거나, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 일상적인 실험과정을 이용하여, 전구 세포와 사용에 적합할 수 있다.
세포 조성물은 또한 리포좀 조성물로서 나타날 수 있거나 에멀젼화될 수 있고, 단, 에멀젼화 절차는 세포 생존력에 부정적으로 영향을 주지 않는다. 세포 및 임의의 다른 활성 성분은 약제학적으로 허용가능하고 활성 성분과 양립가능한 부형제와, 그리고 본 명세서에서 기재된 치료 방법에서 사용에 적합한 양으로 혼합될 수 있다.
세포 조성물에서 포함된 추가 제제는 거기에서 성분의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 무기 산, 예컨대, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산 및 기타 동종과 같은 유기 산으로 형성되는 (폴리펩타이드의 자유 아미노 기로 형성된) 산 부가 염을 포함한다. 자유 카복실 기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제이철 하이드록사이드, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 및 기타 동종과 같은 유기 염기에서 유래될 수 있다.
생리적으로 내성있는 캐리어는 당해 기술에서 공지되어 있다. 예시적인 액체 캐리어는 활성 성분 및 물에 더하여 물질을 함유하지 않는, 또는 생리적 pH 값에서 완충액 예컨대 인산나트륨, 생리적 염수 또는 모두, 예컨대 포스페이트-완충 식염수를 함유하는 멸균된 수용액이다. 한층 더, 수성 캐리어는 1 초과 완충액 염, 뿐만 아니라 염 예컨대 나트륨 및 칼륨 클로라이드, 덱스트로오스, 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 용질을 함유할 수 있다. 액체 조성물은 또한 물에 더해 그리고 물을 제외하고 액상을 함유할 수 있다. 그와 같은 추가의 액상의 예시는 글리세린, 식물성 오일 예컨대 목화씨 오일, 및 수-오일 에멀젼이다. 특정한 장애 또는 병태의 치료에서 효과적인 세포 조성물에서 사용된 활성 화합물의 양은 장애 또는 병태의 성질에 의존할 것이고, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.
투여 & 효능
용어 "투여", "도입" 및 "이식"은, 원하는 효과(들)이 생산되도록, 원하는 부위, 예컨대 손상 또는 수선의 부위에서 도입된 세포의 적어도 부분적인 국재화를 초래하는 방법 또는 경로에 의해, 대상체에, 세포, 예를 들면, 전구 세포의 배치의 맥락에서 상호교환적으로 사용된다. 세포 예를 들면, 전구 세포, 또는 그것의 분화된 자손은 임플란팅된 세포의 적어도 한 부분 또는 세포의 성분이 생존가능하게 남아있는 상기 대상체에서 원하는 위치에 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에 투여후 세포의 생존력의 기간은 몇 시간, 예를 들면, 24 시간만큼 짧은 내지 며칠, 몇 년만큼 길게, 또는 심지어 환자의 수명, 즉, 장기간 생착까지일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 일부 구현예에서, 근육생성 전구 세포의 유효량은 전신 투여 경로, 예컨대 복강내 또는 정맥내 경로를 통해 투여된다.
용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 진단, 치료 또는 요법이 요구되는 임의의 대상체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
예방적으로 제공된 경우, 본 명세서에서 기재된 전구 세포는 ALS 및/또는 FTLD의 임의의 증상보다 먼저, 예를 들면, 치매, 보행 곤란, 다리의 약화, 손 약화, 서투름, 언어 차질, 삼키기 어려움, 근경련, 팔 또는 어깨 또는 혀의 단수축, 머리 떠받치기 또는 양호한 자세 유지 어려움의 발생에 앞서 대상체에 투여될 수 있다. 따라서, 신경 전구 세포 모집단의 예방적 투여는 ALS 및/또는 FTLD를 예방하기 위해 제공한다.
치료적으로 제공된 경우, 신경 전구 세포는 ALS 및/또는 FTLD의 증상 또는 징후의 개시에서 (또는 후), 예를 들면, 질환의 개시시 제공된다.
본 명세서에서 기재된 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 방법에 따라 투여되는 신경 전구 세포 모집단은 1개 이상의 공여체로부터 수득된 동종이계 신경 전구 세포를 포함한다. "동종이계"는, 1개 이상의 유전자좌에서 유전자가 동일하지 않은, 동일한 종의 1개 이상의 상이한 공여체로부터 수득된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 전구 세포 또는 생물학적 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 대상체에 투여되는 신경 전구 세포 모집단은 1 초과 관련없는 공여체 대상체에서, 또는 1 이상의 비-동일한 형제자매에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 동계의 신경 전구 세포 모집단, 예컨대 유전적으로 동일한 동물로부터, 또는 동일한 쌍둥이로부터 수득된 것은 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 신경 전구 세포는 자가조직 세포이다; 즉, 신경 전구 세포는 대상체로부터 수득 또는 단리되고 동일한 대상체에 투여된다, 즉, 공여체 및 수령체가 동일하다.
하나의 구현예에서, 용어 "유효량"은 ALS 및/또는 FTLD의 적어도 1개 이상의 징후 또는 증상을 예방 또는 경감시키는데 필요한 전구 세포 또는 그것의 자손의 모집단의 양을 지칭하고, 원하는 효과를 제공하기 위한, 예를 들면, ALS 및/또는 FTLD를 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물의 충분한 양에 관한 것이다. 용어 "치료적 유효량"은 따라서 전형적인 대상체, 예컨대 ALS 및/또는 FTLD에 대하여 위험에 처하거나 상기 위험을 갖는 대상체에 투여된 경우 특정한 효과를 촉진시키는데 충분한 전구 세포를 포함하는 조성물 또는 전구 세포의 양을 지칭한다. 유효량은 또한 질환의 증상의 발생을 예방 또는 지연시키는데, 질환의 증상의 과정을 변경시키는데 (예를 들어 비제한적으로, 질환의 증상의 진행을 느리게 하는데), 또는 질환의 증상을 반전시키는데 충분한 양을 포함할 것이다. 임의의 주어진 경우에 대하여, 적절한 "유효량"이 일상적인 실험과정을 이용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다는 것이 이해된다.
본 명세서에서 기재된 다양한 구현예에서 사용을 위하여, 전구 세포의 유효량은 하기를 포함한다: 적어도 102 전구 세포, 적어도 5 X 102 전구 세포, 적어도 103 전구 세포, 적어도 5 X 103 전구 세포, 적어도 104 전구 세포, 적어도 5 X 104 전구 세포, 적어도 105 전구 세포, 적어도 2 X 105 전구 세포, 적어도 3 X 105 전구 세포, 적어도 4 X 105 전구 세포, 적어도 5 X 105 전구 세포, 적어도 6 X 105 전구 세포, 적어도 7 X 105 전구 세포, 적어도 8 X 105 전구 세포, 적어도 9 X 105 전구 세포, 적어도 1 X 106 전구 세포, 적어도 2 X 106 전구 세포, 적어도 3 X 106 전구 세포, 적어도 4 X 106 전구 세포, 적어도 5 X 106 전구 세포, 적어도 6 X 106 전구 세포, 적어도 7 X 106 전구 세포, 적어도 8 X 106 전구 세포, 적어도 9 X 106 전구 세포, 또는 이의 다수. 전구 세포는 1개 이상의 공여체에서 유래되거나, 자가조직 공급원으로부터 수득된다. 본 명세서에서 기재된 일부 구현예에서, 전구 세포는 필요로 하는 대상체에 투여에 앞서 배양액에서 확장된다.
ALS 및/또는 FTLD를 갖는 환자의 세포내 C9ORF72 유전자에서 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 감소는 질환의 1개 이상의 증상의 완화에, 장기간 생존의 증가에, 및/또는 다른 치료와 관련된 부작용의 감소에 유익할 수 있다. 인간 환자에 그와 같은 세포의 투여시, 헥사뉴클레오타이드 반복부의 야생형 또는 유사한 수준을 갖는 신경 선조의 존재는 유익하다. 일부 구현예에서, 대상체의 효과적인 치료는 치료된 대상체에서 총 헥사뉴클레오타이드 반복부에 비해 적어도 약 3%, 5% 또는 7% 야생형 또는 유사한 수준을 생기게 한다. 일부 구현예에서, 야생형 또는 유사한 수준은 총 헥사뉴클레오타이드 반복부의 적어도 약 10%일 것이다. 일부 구현예에서, 야생형 또는 유사한 수준은 총 헥사뉴클레오타이드 반복부의 적어도 약 20% 내지 30%일 것이다. 유사하게, 헥사뉴클레오타이드 반복부의 야생형 수준을 갖는 세포의 심지어 상대적으로 제한된 하위모집단의 도입은 일부 상황에서 정규화된 세포가 이환 세포에 비해 선택적 이점을 가질 것이기 때문에 다양한 환자에서 유익할 수 있다. 그러나, 헥사뉴클레오타이드 반복부의 야생형 또는 유사한 수준을 가진 신경 선조의 심지어 보통의 수준은 환자에서 ALS 및/또는 FTLD의 1개 이상의 측면의 완화에 유익할 수 있다. 일부 구현예에서, 그와 같은 세포가 투여되는 환자에서 신경 선조의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 초과는 헥사뉴클레오타이드 반복부의 야생형 또는 유사한 수준을 생산중이다.
"투여된"은 원하는 부위에서 세포 조성물의 적어도 부분적인 국재화를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 대상체 속으로 전구 세포 조성물의 전달을 지칭한다. 세포 조성물은 대상체에서 효과적인 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다, 즉 투여는 전달된 조성물의 적어도 한 부분, 즉 적어도 1 x 104 세포가 일정한 기간 동안 원하는 부위에 전달되는 대상체에서 원하는 위치에 전달을 초래한다. 투여 방식은 주사, 주입, 점적주입, 또는 섭취를 포함한다. "주사"는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 관절내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 뇌내 척추, 및 흉골내 주사 및 주입. 일부 구현예에서, 경로는 정맥내이다. 세포의 전달을 위하여, 주사 또는 주입으로 투여는 일반적으로 바람직하다.
하나의 구현예에서, 세포는 전신으로 투여된다. 어구 "전신 투여", "전신으로 투여된", "말초 투여" 및 "말초에 투여된"은 직접적으로 표적 부위, 조직, 또는 장기에가 아닌 전구 세포의 모집단의 투여를 지칭하여, 대신에, 대상체의 순환 시스템에 진입하고, 따라서, 대사 및 다른 유사 공정을 거친다.
ALS 및/또는 FTLD의 치료용 조성물을 포함하하는 치료의 효능은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 헥사뉴클레오타이드 반복부의, 임의의 하나 또는 모든 징후 또는 증상, 단지 하나의 예로서, 상기의 수준이 유익한 방식으로 변경되면 (예를 들면, 적어도 10%만큼 증가되면), 또는 질환의 다른 임상적으로 허용된 증상 또는 마커가 개선 또는 완화되면, 치료는 "효과적인 치료"로 간주된다. 효능은 또한 의료 개입용 필요성 또는 입원에 의해 평가된 경우 악화하는 개체의 실패에 의해 측정될 수 있다 (예를 들면, 만성적 폐쇄성 폐 질환, 또는 상기 질환의 진행은 중단되거나 적어도 느려진다). 이들 지표의 측정 방법은 당해 분야의 숙련가에 공지되고/되거나 본 명세서에서 기재된다. 치료는 개체 또는 동물에서 질환의 임의의 치료를 포함하고 (일부 비-제한 예는 인간, 또는 포유동물을 포함한다) 그리고 하기를 포함한다: (1) 질환의 억제, 예를 들면, 증상의 진행의 저지, 또는 느려짐; 또는 (2) 질환의 완화, 예를 들면, 증상의 퇴행 야기; 및 (3) 증상의 발생의 가능성 예방 또는 감소.
본 발명에 따른 치료는 개체에서 헥사뉴클레오타이드 반복부의 양을 감소시킴으로써 ALS 및/또는 FTLD와 관련된 1개 이상의 증상을 완화시킨다. ALS 및/또는 FTLD와 전형적으로 관련된 초기 징후는 예를 들어, 치매, 보행 곤란, 다리의 약화, 손 약화, 서투름, 언어 차질, 삼키기 어려움, 근경련, 팔 또는 어깨 또는 혀의 단수축, 머리 떠받치기 또는 양호한 자세 유지 어려움을 포함한다.
키트
본 개시내용은 본 발명의 방법 실시용 키트를 제공한다. 키트는 게놈-표적 핵산, 게놈-표적 핵산을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 부위 특이적 폴리펩타이드, 부위 특이적 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및/또는 본 발명의 방법의 구현예를 실시하는데 필요한 임의의 핵산 또는 단백질성 분자, 또는 이들의 임의의 조합의 1개 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 하기를 포함한다: (1) 게놈-표적 핵산을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 및 (2) 부위 특이적 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 부위 특이적 폴리펩타이드를 포함하는 벡터 및 (3) 벡터(들) 및 또는 폴리펩타이드의 재구성 및/또는 희석용 시약.
일부 구현예에서, 키트는 하기를 포함한다: (1) (i) 게놈-표적 핵산을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 및 (ii) 부위 특이적 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 및 (2) 벡터의 재구성 및/또는 희석용 시약.
임의의 상기 키트의 일부 구현예에서, 본 키트는 단일-분자 가이드 게놈-표적 핵산을 포함한다. 임의의 상기 키트의 일부 구현예에서, 본 키트는 이중-분자 게놈-표적 핵산을 포함한다. 임의의 상기 키트의 일부 구현예에서, 본 키트는 2개 이상의 이중-분자 가이드 또는 단일-분자 가이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 키트는 핵산을 표적하는 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함한다.
임의의 상기 키트의 일부 구현예에서, 본 키트는 원하는 유전적 변형을 발효시키기 위해 삽입되는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다.
키트의 성분은 별개의 용기내에 있을 수 있거나, 단일 컨테이너에서 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 키트는 1개 이상의 추가의 시약을 추가로 포함하고, 여기에서 그와 같은 추가의 시약은 완충액, 세포 속으로 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 도입용 완충액, 세정 완충액, 대조군 시약, 대조군 벡터, 대조군 RNA 폴리뉴클레오타이드, DNA로부터 폴리펩타이드의 시험관내 생산용 시약, 서열분석용 어댑터 및 기타 동종으로부터 선택된다. 완충액은 안정화 완충액, 재구성 완충액, 희석 완충액, 또는 기타 동종일 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 또한 엔도뉴클레아제에 의해 DNA의 정확한 결합 또는 절단을 용이하게 하는데 또는 향상시키는데, 또는 표적의 특이성을 개선하는데 사용될 수 있는 1개 이상의 성분을 포함할 수 있다.
상기-언급된 성분에 더하여, 키트는 방법을 실시하기 위한 키트의 성분 사용을 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 방법 실시용 지침은 적합한 기록 매체상에 일반적으로 기록된다. 예를 들어, 지침은 기재, 예컨대 종이 또는 플라스틱, 등 위에 인쇄될 수 있다. 지침은 키트에서 포장 삽입물로서, 키트 또는 이의 성분의 컨테이너의 (즉, 패키징 또는 서브패키징과 관련된) 라벨링, 등으로 존재할 수 있다. 지침은 적합한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체, 예를 들면 CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브, 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재할 수 있다. 일부 사례에서, 실제 지침은 키트에서 존재하지 않지만, 원격 공급원으로부터 (예를 들면 인터넷을 통해) 지침의 수득 수단은 제공될 수 있다. 이러한 구현예의 예는 지침이 보일 수 있는 및/또는 지침이 다운로드될 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 지침과 같이, 지침 수득을 위한 이러한 수단은 적합한 기재상에 기록될 수 있다.
가이드 RNA 제형
본 발명의 가이드 RNAs는, 특정한 투여 방식 및 투약 형태에 의존하여, 약제학적으로 허용가능한 부형제 예컨대 캐리어, 용매, 안정화제, 아쥬반트, 희석제, 등으로 제형화된다. 가이드 RNA 조성물은 생리적으로 양립가능한 pH를 달성하기 위해 일반적으로 제형화되고, 제형 및 투여 경로에 의존하여, 약 3의 pH 내지 약 11의 pH, 약 pH 3 내지 약 pH 7 범위이다. 대안적인 구현예에서, pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 8 범위이도록 조정된다. 일부 구현예에서, 조성물은, 1개 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량을 포함한다. 임의로, 조성물은 본 명세서에서 기재된 화합물의 조합을 포함하거나, 박테리아 성장의 치료 또는 예방에서 유용한 제2 활성 성분 (예를 들어 및 비제한적으로, 항균 또는 항-미생물제)를 포함할 수 있거나, 본 발명의 시약의 조합을 포함할 수 있다.
적합한 부형제는, 예를 들어, 큰, 느리게 대사작용된 거대분자를 포함하는 캐리어 분자 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머, 및 불활성 바이러스 입자를 포함한다. 다른 예시적인 부형제는 산화방지제 (예를 들어 및 비제한적으로, 아스코르브산), 킬레이트제 (예를 들어 및 비제한적으로, EDTA), 탄수화물 (예를 들어 및 비제한적으로, 덱스트린, 하이드록시알킬셀룰로오스, 및 하이드록시알킬메틸셀룰로오스), 스테아르산, 액체 (예를 들어 및 비제한적으로, 오일, 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올), 습윤 또는 유화제, pH 완충 물질, 및 기타 등등을 포함한다.
다른 가능한 치료 접근법
유전자 편집은 특이적 서열을 표적하기 위해 조작된 뉴클레아제를 이용하여 수행될 수 있다. 현재까지 뉴클레아제의 4개의 주요 유형이 있다: 메가뉴클레아제 및 그것의 유도체, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs), 전사 활성제 유사 효과기 뉴클레아제 (TALENs), 및 CRISPR-Cas9 뉴클레아제 시스템. 특히 ZFNs 및 TALENs의 특이성이 단백질-DNA 상호작용을 통함에 따라, 뉴클레아제 플랫폼은 설계의 어려움, 표적 밀도 및 작용 방식에서 다양하고, 반면 RNA-DNA는 주로 가이드 Cas9를 상호작용시킨다. Cas9 절단은 또한 상이한 CRISPR 시스템 사이 상이한, PAM인, 인접한 모티프를 요구한다. 연쇄상구균 파이오제네스로부터 Cas9는 NRG PAM을 이용하여 절단하고, 나이세리아 메닌기티디스로부터 CRISPR은 NNNNGATT, NNNNNGTTT 및 NNNNGCTT를 포함하는 PAMs를 가진 부위에서 절단할 수 있다. 수많은 다른 Cas9 오쏘로그는 대안적인 PAMs에 인접한 프로토스페이서를 표적한다.
본 발명의 방법에서, CRISPR 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 명세서에서 기재된 교시, 예컨대 치료 표적 부위는 다른 형태의 엔도뉴클레아제, 예컨대 ZFNs, TALENs, HEs, 또는 MegaTALs, 또는 뉴클레아제의 조합 이용에 적용될 수 있다. 그러나, 상기 엔도뉴클레아제에 본 발명의 교시를 적용하기 위해, 다른 것들 중에서, 특이적 표적 부위에 유도된 단백질을 조작하는 것을 필요로 할 것이다.
추가의 결합 도메인은 특이성을 증가시키기 위해 Cas9 단백질에 융합될 수 있다. 이들 작제물의 표적 부위는 확인된 gRNA 지정된 부위에 맵핑할 것이지만, 예컨대 아연 핑거 도메인을 위하여, 추가의 결합 모티프를 요구할 것이다. 메가-TAL의 경우에서, 메가뉴클레아제는 TALE DNA-결합 도메인에 융합될 수 있다. 메가뉴클레아제 도메인은 특이성을 증가시킬 수 있고 절단을 제공할 수 있다. 유사하게, 불활성화된 또는 사망한 Cas9 (dCas9)는 절단 도메인에 융합될 수 있고 융합된 DNA-결합 도메인에 대하여 sgRNA/Cas9 표적 부위 및 인접한 결합 부위를 요구할 수 있다. 이것은 유사하게, 촉매적 불활성화에 더하여, 추가의 결합 부위 없이 결합을 감소시키기 위해, dCas9의 일부 단백질 공학기술을 요구할 것이다.
아연 핑거 뉴클레아제
아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs)는 유형 II 엔도뉴클레아제 FokI의 촉매적 도메인에 연결된 조작된 아연 핑거 DNA 결합 도메인으로 구성된 모듈러 단백질이다. FokI이 이량체로서만 기능하기 때문에, 한 쌍의 ZFNs는 촉매적으로 활성 FokI 이량체를 형성하도록 하기 위해 이들 사이 정확한 간격으로 그리고 반대편 DNA 가닥에서 동족 표적 "절반-부위" 서열에 결합시키기 위해 조작되어야 한다. 자신이 그 자체로는 서열 특이성을 갖지 않는, FokI 도메인의 이량체화시, DNA 이중-가닥 절단은 게놈 편집의 개시 단계로서 ZFN 절반-부위 사이 생성된다.
각각의 ZFN의 DNA 결합 도메인은 전형적으로, 제4 뉴클레오타이드와 교차-가닥 상호작용이 또한 중요할 수 있어도, 표적 DNA 서열의 하나의 가닥에서 뉴클레오타이드의 삼중항을 주로 인식하는 각각의 핑거와, 풍부한 Cys2-His2 구조의 3-6 아연 핑거로 구성된다. DNA와 핵심 접촉하는 위치에서 핑거의 아미노산의 변경은 주어진 핑거의 서열 특이성을 변경시킨다. 따라서, 4-핑거 아연 핑거 단백질은 12 bp 표적 서열을 선택적으로 인식할 것이고, 여기에서 상기 표적 서열은, 삼중항 선호가 인접하는 핑거에 의해 다양한 정도로 영향받을 수 있어도, 각각의 핑거에 의해 기여된 삼중항 선호의 복합체이다. ZFNs의 중요한 측면은, 상당한 전문지식이 이것을 잘 하기 위해 요구되어도, 이들이 개별 핑거를 단순히 변형시킴으로써 거의 임의의 게놈 주소로 쉽게 재표적화될 수 있다는 것이다. ZFNs의 대부분의 적용에서, 4-6 핑거의 단백질은 사용되어, 12-18 bp 각각을 인식한다. 그러므로, 한 쌍의 ZFNs는 전형적으로, 절반-부위 사이 5-7 bp 스페이서를 포함하지 않는, 24-36 bp의 조합된 표적 서열을 인식할 것이다. 결합 부위는, 15-17 bp를 포함하는, 더 큰 스페이서로 추가 분리될 수 있다. 이러한 길이의 표적 서열은 인간 게놈에서 특유일 것 같아서, 반복적인 서열 또는 유전자 동족체가 설계 과정 동안 제외되는 것을 가정한다. 그럼에도 불구하고, ZFN 단백질-DNA 상호작용은 그것의 특이성에서 절대적이지 않아서 부정확한 결합 및 절단 이벤트가, 2 ZFNs 사이 이종이량체로서, 또는 ZFNs의 한쪽 또는 다른쪽의 호모다이머로서 발생한다. 후자 가능성은, 자체로가 아니고, 서로 단지 이량체화할 수 있는, 절대적 이종이량체 변이체로서도 공지된, "플러스" 및 "마이너스" 변이체를 창출하기 위해 FokI 도메인의 이량체화 계면 조작에 의해 효과적으로 제거되었다. 절대적 이종이량체 강제는 호모다이머의 형성을 예방한다. 이것은 ZFNs, 뿐만 아니라 이들 FokI 변이체를 채택하는 임의의 다른 뉴클레아제의 특이성을 크게 향상시켰다.
다양한 ZFN-기반 시스템은 당해 분야에서 기재되어 있고, 이의 변형은 규칙적으로 보고되고, 수많은 참조문헌은 ZFNs의 설계를 가이드하는데 사용되는 규칙 및 파라미터를 기재한다; 참조, 예를 들면, Segal 등, Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758-63 (1999); Dreier B 등, J Mol Biol. 303(4):489-502 (2000); Liu Q 등, J Biol Chem. 277(6):3850-6 (2002); Dreier 등, J Biol Chem 280(42):35588-97 (2005); 및 Dreier 등, J Biol Chem. 276(31):29466-78 (2001).
전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 (TALENs)
TALENs는 모듈러 뉴클레아제의 또 다른 포멧을 나타내어 이로써, ZFNs와 같이, 조작된 DNA 결합 도메인은 FokI 뉴클레아제 도메인에 연결되고, 한 쌍의 TALENs는 표적화된 DNA 절단을 달성하기 위해 나란히 작동한다. ZFNs로부터 주요 차이는 DNA 결합 도메인의 성질 및 관련된 표적 DNA 서열 인식 특성이다. TALEN DNA 결합 도메인은, 식물 박테리아 병원체 크산토모나스 sp.에서 본래 기재된, TALE 단백질에서 유래한다. TALEs는, 최대 40 bp의 총 표적 서열 길이를 제공하는, 길이가 전형적으로 최대 20 bp인 표적 DNA 서열에서 단일 염기쌍을 인식하는 각각의 반복부로, 33-35 아미노산 반복부의 탠덤 어레이로 구성된다. 각각의 반복부의 뉴클레오타이드 특이성은, 위치 12 및 13에서 단지 2개 아미노산을 포함하는, 반복 가변성 2잔기 (RVD)에 의해 결정된다. 염기 구아닌, 아데닌, 시토신 및 티민은 하기 4개 RVDs에 의해 우세하게 인식된다: Asn-Asn, Asn-Ile, His-Asp 및 Asn-Gly, 각각. 이것은 아연 핑거에 대하여 훨씬 더 단순한 인식 코드를 구성하고, 따라서 뉴클레아제 설계에 대하여 후자보다 이점을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, ZFNs와 같이, TALENs의 단백질-DNA 상호작용은 그것의 특이성에서 절대적이지 않고, TALENs는 부정확한 활성을 감소시키기 위해 FokI 도메인의 절대적 이종이량체 변이체의 사용으로부터 또한 이익이 되고 있다.
그것의 촉매적 기능에서 탈활성화되는 FokI 도메인의 추가의 변이체는 창출되었다. 어느 한쪽 TALEN 또는 ZFN 쌍의 이분의 일이 불활성 FokI 도메인을 함유하면, 단지 단일-가닥 DNA 절단 (니킹)이, DSB보다는, 표적 부위에서 발생할 것이다. 결과는 Cas9 절단 도메인 중 하나가 탈활성화된 CRISPR/Cas9/Cpf1 "니카제" 돌연변이체의 사용에 비교할만하다. DNA 닉은 HDR에 의해, 그러나 DSB로 보다 더 낮은 효율로 게놈 편집을 구동하는데 사용될 수 있다. 주요 이점은, NHEJ-매개된 수선오류되기 쉬운, DSB와 달리, 부정확한 닉이 빠르고 정확하게 수선되는 것이다.
다양한 TALEN-기반 시스템은 당해 분야에서 기재되고 있고, 이의 변형은 규칙적으로 보고된다; 참조, 예를 들면, Boch, Science 326(5959):1509-12 (2009); Mak 등, Science 335(6069):716-9 (2012); 및 Moscou 등, Science 326(5959):1501 (2009). "골든 게이트" 플랫폼에 기반된 TALENs의 사용은 다중 그룹에 의해 기재되고 있다; 참조, 예를 들면, Cermak 등, Nucleic Acids Res. 39(12):e82 (2011); Li 등, Nucleic Acids Res. 39(14):6315-25(2011); Weber 등, PLoS One. 6(2):e16765 (2011); Wang 등, J Genet Genomics 41(6):339-47, Epub 2014 May 17 (2014); 및 Cermak T 등, Methods Mol Biol. 1239:133-59 (2015).
귀소 엔도뉴클레아제
귀소 엔도뉴클레아제 (HEs)는 긴 인식 서열 (14-44 염기쌍)을 갖는 그리고 높은 특이성으로 - 종종 게놈에서 특유의 부위에서 DNA를 절단하는 서열-특이적 엔도뉴클레아제이다. LAGLIDADG (서열 식별 번호: 18809), GIY-YIG, His-Cis 박스, H-N-H, PD-(D/E)xK, 및 진핵생물, 원생생물, 박테리아, 고세균, 시아노박테리아 및 파아지를 포함하는, 넓은 범위의 호스트로부터 유래되는 Vsr-유사를 포함하여, 그것의 구조에 의해 분류된 경우 HEs의 적어도 6개 공지된 계열이 있다. ZFNs 및 TALENs와 같이, HEs는 게놈 편집에서 초기 단계로서 표적 유전자좌에서 DSB를 창출하는데 사용될 수 있다. 게다가, 일부 천연 및 조작된 HEs는 DNA의 단일 가닥만을 컷팅하고, 이로써 부위-특이적 니카제를 기능화한다. HEs의 큰 표적 서열 및 이들이 제공하는 특이성은 부위-특이적 DSBs를 창출하기 위해 이들을 매력적인 후보로 만들었다.
다양한 HE-기반 시스템은 당해 분야에서 기재되어 있고, 이의 변형은 규칙적으로 보고된다; 참조, 예를 들면, 하기에 의한 검토: Steentoft 등, Glycobiology 24(8):663-80 (2014); Belfort and Bonocora, Methods Mol Biol. 1123:1-26 (2014); Hafez and Hausner, Genome 55(8):553-69 (2012); 및 본 명세서에서 인용된 참조문헌.
MegaTAL / Tev-mTALEN / MegaTev
하이브리드 뉴클레아제의 추가 예로서, MegaTAL 플랫폼 및 Tev-mTALEN 플랫폼은, 양쪽 조절가능 DNA 결합 및 TALE의 특이성, 뿐만 아니라 HE의 절단 서열 특이성을 이용하여, TALE DNA 결합 도메인 및 촉매적으로 활성 HEs의 융합을 이용한다; 참조, 예를 들면, Boissel 등, NAR 42: 2591-2601 (2014); Kleinstiver 등, G3 4:1155-65 (2014); 및 Boissel and Scharenberg, Methods Mol. Biol. 1239: 171-96 (2015).
추가 변동에서, MegaTev 구조는 GIY-YIG 귀소 엔도뉴클레아제 I-TevI (Tev)에서 유래된 뉴클레아제 도메인과 메가뉴클레아제 (Mega)의 융합이다. 2개 활성 부위는 DNA 기질에서 ∼30 bp 떨어져 배치되고 비-양립가능한 응집성 단부를 가진 2개 DSBs를 생성한다; 참조, 예를 들면, Wolfs 등, NAR 42, 8816-29 (2014). 현존하는 뉴클레아제-기반 접근법의 다른 조합이 본 명세서에서 기재된 표적화된 게놈 변형 달성에서 유용할 것이고 상기 달성을 발전시킬 것이 기대된다.
dCas9-FokI 또는 dCpf1-Fok1 및 다른 뉴클레아제
상기 기재된 뉴클레아제 플랫폼의 구조적 및 기능적 특성의 조합은 고유한 결핍의 일부를 잠재적으로 극복할 수 있는 게놈 편집에 추가 접근법을 제공한다. 예로서, CRISPR 게놈 편집 시스템은 전형적으로 DSB를 창출하기 위해 단일 Cas9 엔도뉴클레아제를 이용한다. 표적화의 특이성은 표적 DNA (S. 파이오제네스로부터 Cas9의 경우에서 NGG PAM 서열 또는 인접한 NAG에서 추가의 2 염기 플러스)와 왓슨-크릭 염기-짝짓기를 경험한 가이드 RNA에서 20 또는 24 뉴클레오타이드 서열만큼 유도된다. 그와 같은 서열은 인간 게놈에서 특유이도록 충분히 길지만, RNA/DNA 상호작용의 특이성은 절대적이지 않고, 상당한 난잡이, 특히 표적 서열의 5' 절반에서 때때로 용인되어, 특이성을 구동시키는 염기의 수를 효과적으로 감소시킨다. 이것에 대한 하나의 해결책은 Cas9 또는 Cpf1 촉매적 기능을 완전히 탈활성화 - RNA-유도된 DNA 결합 기능만을 보유 - 그리고 탈활성화된 Cas9에 FokI 도메인 융합 대신 하는 것이었다; 참조, 예를 들면, Tsai 등, Nature Biotech 32: 569-76 (2014); 및 Guilinger 등, Nature Biotech. 32: 577-82 (2014). FokI가 촉매적으로 활성이 되기 위해 이량체화해야 하기 때문에, 2개의 가이드 RNAs는 이량체를 형성하기 위해 그리고 DNA를 절단하기 위해 가깝게 근접하여 2개 FokI 융합을 연결하도록 요구된다. 이것은 본질적으로 조합된 표적 부위에서 염기의 수를 배가시키고, 이로써 CRISPR-기반 시스템에 의한 표적화에 의해 엄격성을 증가시킨다.
추가 예로서, 촉매적으로 활성 HE, 예컨대 I-TevI에 TALE DNA 결합 도메인의 융합은, 부정확한 절단이 추가로 감소될 수 있다는 기대로, 양쪽 조절가능 DNA 결합 및 TALE의 특이성, 뿐만 아니라 I-TevI의 절단 서열 특이성을 이용한다.
본 발명의 방법 및 조성물
따라서, 본 개시내용은 특히 다음과 같은 비-제한 발명에 관한 것이다: 제1 방법, 방법 1에서, 본 개시내용은 게놈 편집에 의해 인간 세포에서 C9ORF72 유전자의 편집 방법을 제공하고, 상기 방법은 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제의 도입을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 2에서, 본 개시내용은 게놈 편집에 의해 인간 세포에서 C9ORF72 유전자의 삽입 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: C9ORF72 유전자 또는 미니유전자의 영구 삽입을 초래하고, C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 인간 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 단계.
또 다른 방법, 방법 3에서, 본 개시내용은 하기의 단계를 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법을 제공한다: i) 환자 특이적 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 창출하는 단계; ii) iPSC의 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 iPSC의 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계, 또는 iPSC의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계; iii) 게놈 편집된 iPSC를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키는 단계; 및 iv) 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 환자에 임플란팅하는 단계.
또 다른 방법, 방법 4에서, 본 개시내용은 방법 3의 방법을 제공하고, 여기서 상기 창출 단계는 하기를 포함한다: a) 체세포를 환자로부터 단리시킴; 및 b) 일련의 다능성-관련 유전자를 체세포에 도입시켜 세포를 만능 줄기 세포가 되도록 유도함.
또 다른 방법, 방법 5에서, 본 개시내용은 방법 4의 방법을 제공하고, 여기서 체세포는 섬유아세포이다.
또 다른 방법, 방법 6에서, 본 개시내용은 방법 4의 방법을 제공하고, 여기서 다능성-관련 유전자의 세트는 OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NANOG 및 cMYC로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자의 1개 이상이다.
또 다른 방법, 방법 7에서, 본 개시내용은 방법 3 내지 6 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 편집 단계는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 상기 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9ORF72 유전자 또는 미니유전자의 영구 삽입 및 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 iPSC 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 8에서, 본 개시내용은 방법 7의 방법을 제공하고, 여기서 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌이다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR.
또 다른 방법, 방법 9에서, 본 개시내용은 방법 3 내지 8 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 분화 단계는 게놈 편집된 iPSC를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키기 위해 1개 이상의 하기를 포함한다: 소분자의 조합으로 치료 또는 마스터 전사 인자의 전달.
또 다른 방법, 방법 10에서, 본 개시내용은 방법 3 내지 9 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 임플란팅 단계는 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 11에서, 본 개시내용은 하기의 단계를 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법을 제공한다: i) 백혈구를 환자로부터 단리시키는 단계; ii) 백혈구의 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계, 또는 백혈구의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계; 및 iii) 편집된 백혈구를 환자에 임플란팅하는 단계.
또 다른 방법, 방법 12에서, 본 개시내용은 방법 11의 방법을 제공하고, 여기서 단리 단계는 하기를 포함한다: 세포 분별 원심분리, 세포 배양, 또는 이들의 조합.
또 다른 방법, 방법 13에서, 본 개시내용은 방법 11 내지 12 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 편집 단계는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 신경 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 14에서, 본 개시내용은 방법 13의 방법을 제공하고, 여기서 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌이다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR.
또 다른 방법, 방법 15에서, 본 개시내용은 방법 11 내지 14 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 임플란팅 단계는 편집된 백혈구를 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 16에서, 본 개시내용은 하기의 단계를 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법을 제공한다: i) 임의로, 환자의 골수의 생검을 수행하는 단계; ii) 간엽 줄기 세포를 단리시키는 단계; iii) 줄기 세포의 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 줄기 세포의 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계, 또는 줄기 세포의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계; iv) 줄기 세포를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키는 단계; 및 v) 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 환자에 임플란팅하는 단계.
또 다른 방법, 방법 17에서, 본 개시내용은 방법 16의 방법을 제공하고, 여기서 단리 단계는 하기를 포함한다: 골수의 흡인 및 Percoll™을 이용하는 밀도 원심분리에 의한 간엽 세포의 단리.
또 다른 방법, 방법 18에서, 본 개시내용은 방법 16 내지 17 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 편집 단계는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 줄기 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 19에서, 본 개시내용은 방법 18의 방법을 제공하고, 여기서 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌이다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR.
또 다른 방법, 방법 20에서, 본 개시내용은 방법 16 내지 19 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 분화 단계는 게놈 편집된 줄기 세포를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키기 위해 1개 이상의 하기를 포함하는, 방법: 소분자의 조합으로 치료 또는 마스터 전사 인자의 전달.
또 다른 방법, 방법 21에서, 본 개시내용은 방법 16 내지 20 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 임플란팅 단계는 세포를 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 22에서, 본 개시내용은 하기의 단계를 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법을 제공한다: i) 임의로, 환자를 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF)로 치료하는 단계; ii) 조혈 전구 세포를 환자로부터 단리시키는 단계; iii) 조혈 전구 세포의 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 조혈 전구 세포의 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는 단계, 또는 조혈 전구 세포의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계; 및 iv) 세포를 환자에 임플란팅하는 단계.
또 다른 방법, 방법 23에서, 본 개시내용은 방법 22의 방법을 제공하고, 여기서 치료 단계는 Plerixaflor와 조합으로 수행된다.
또 다른 방법, 방법 24에서, 본 개시내용은 방법 22 내지 23 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 단리 단계는 CD34+ 세포를 단리시키는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 25에서, 본 개시내용은 방법 22 내지 24 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 편집 단계는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 줄기 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 26에서, 본 개시내용은 방법 25의 방법을 제공하고, 여기서 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌이다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR.
또 다른 방법, 방법 27에서, 본 개시내용은 방법 22 내지 26 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 임플란팅 단계는 신경 세포를 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 28에서, 본 개시내용은 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 환자의 세포에서 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는, 또는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계를 포함하는, 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체내 치료 방법을 제공한다.
또 다른 방법, 방법 29에서, 본 개시내용은 방법 28의 방법을 제공하고, 여기서 편집 단계는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 정정을 초래하는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 30에서, 본 개시내용은 방법 29의 방법을 제공하고, 여기서 세이프 하버 유전자좌는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌이다: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR.
또 다른 방법, 방법 31에서, 본 개시내용은 방법 28 내지 30 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 세포 신경 세포, 골수 세포, 조혈 전구 세포, 또는 CD34+ 세포.
또 다른 방법, 방법 32에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 하기이다: Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로서 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제; 또는 이의 동족체, 자연 발생 분자의 재조합, 이의 코돈-최적화된, 또는 변형된 버전, 및 이들의 조합.
또 다른 방법, 방법 33에서, 본 개시내용은 방법 32의 방법을 제공하고, 여기서 방법은 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포 속으로 도입하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 34에서, 본 개시내용은 방법 32의 방법을 제공하고, 여기서 방법은 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 1개 이상의 리보헥산 (RNAs)를 세포 속으로 도입하는 것을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 35에서, 본 개시내용은 방법 33 또는 34 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 1개 이상의 RNAs는 1개 이상의 변형된 폴리뉴클레오타이드 또는 1개 이상의 변형된 RNAs이다.
또 다른 방법, 방법 36에서, 본 개시내용은 방법 32의 방법을 제공하고, 여기서 DNA 엔도뉴클레아제는 단백질 또는 폴리펩타이드이다.
또 다른 방법, 방법 37에서, 본 개시내용은 이전의 방법 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 방법은 세포 속으로 1개 이상의 가이드 리보헥산 (gRNAs)를 도입하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 방법, 방법 38에서, 본 개시내용은 방법 37의 방법을 제공하고, 여기서 1개 이상의 gRNAs는 단일-분자 가이드 RNA (sgRNAs)이다.
또 다른 방법, 방법 39에서, 본 개시내용은 방법 37 내지 38 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs는 1개 이상의 변형된 gRNAs 또는 1개 이상의 변형된 sgRNAs이다.
또 다른 방법, 방법 40에서, 본 개시내용은 방법 37 내지 39 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs와 사전-복합체화된다.
또 다른 방법, 방법 41에서, 본 개시내용은 이전의 방법 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 방법은 야생형 C9ORF72 유전자 또는 미니유전자 또는 cDNA의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트를 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 방법, 방법 42에서, 본 개시내용은 방법 41의 방법을 제공하고, 여기서 야생형 C9ORF72 유전자 또는 cDNA의 일부는 전체 C9ORF72 유전자 또는 cDNA, 또는 천연 변이체 1, 변이체 2, 또는 변이체 3의 cDNA이다.
또 다른 방법, 방법 43에서, 본 개시내용은 방법 41 내지 42 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 공여체 템플레이트는 어느 한쪽 단일 또는 이중 가닥이다.
또 다른 방법, 방법 44에서, 본 개시내용은 방법 41 내지 43 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 공여체 템플레이트는 9p21.2 영역에 상동성 아암을 갖는다.
또 다른 방법, 방법 45에서, 본 개시내용은 방법 41 내지 43 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 공여체 템플레이트는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌에 상동성 아암을 갖는다: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2.
또 다른 방법, 방법 46에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 방법은 야생형 C9ORF72 유전자의 적어도 한 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트 및 1개의 가이드 리보헥산 (gRNA)를 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 DSB 유전자좌에서, 또는 유전자좌에서 염색체 DNA 속으로 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트로부터 신규한 서열의 삽입을 용이하게 하는 세이프 하버 유전자좌 또는 유전자좌 또는 세이프 하버 유전자좌에 C9ORF72 유전자 근위의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자의 염색체 DNA의 일부의 영구 삽입 또는 정정 그리고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 이내 또는 근처 1개의 단일-가닥 절단 (SSB) 또는 이중-가닥 절단 (DSB)를 발효시키는 1개 이상의 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이고, 여기서 gRNA는 유전자좌의 세그먼트 또는 유전자좌에 상보적인 스페이서 서열을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 47에서, 본 개시내용은 방법 46의 방법을 제공하고, 여기서 근위는 유전자좌 또는 유전자좌의 양쪽 업스트림 및 다운스트림 뉴클레오타이드를 의미한다.
또 다른 방법, 방법 48에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 방법은 야생형 C9ORF72 유전자의 적어도 한 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트 및 2개의 가이드 리보헥산 (gRNAs)를 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는, C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9ORF72 유전자 또는 세이프 하버 유전자좌의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 5' 유전자좌와 3' 유전자좌 사이 염색체 DNA의 영구 삽입 또는 정정 그리고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 5' 유전자좌와 3' 유전자좌 사이 염색체 DNA 속으로 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트로부터 신규한 서열의 삽입을 용이하게 하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처, 한 쌍의 단일-가닥 절단 (SSB) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs), 5' 유전자좌에서 첫번째 및 3' 유전자좌에서 두번째를 발효시키는 2개 이상의 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이고, 여기서 제1 가이드 RNA는 5' 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함하고 제2 가이드 RNA는 3' 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 49에서, 본 개시내용은 방법 46 내지 48 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 1개 또는 2개 gRNAs는 1개 또는 2개 단일-분자 가이드 RNA (sgRNAs)이다.
또 다른 방법, 방법 50에서, 본 개시내용은 방법 46 내지 49 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 1개 또는 2개 gRNAs 또는 1개 또는 2개 sgRNAs는 1개 또는 2개 변형된 gRNAs 또는 1개 또는 2개 변형된 sgRNAs이다.
또 다른 방법, 방법 51에서, 본 개시내용은 방법 46 내지 50 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 또는 2개 gRNAs 또는 1개 또는 2개 sgRNAs와 사전-복합체화된다.
또 다른 방법, 방법 52에서, 본 개시내용은 방법 46 내지 51 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 야생형 C9ORF72 유전자 또는 cDNA의 일부는 전체 C9ORF72 유전자 또는 cDNA; 천연 변이체 1, 변이체 2, 변이체 3의 cDNA; 또는 약 30 헥사뉴클레오타이드 반복부이다.
또 다른 방법, 방법 53에서, 본 개시내용은 방법 46 내지 52 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 공여체 템플레이트는 어느 한쪽 단일 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이다.
또 다른 방법, 방법 54에서, 본 개시내용은 방법 46 내지 53 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 공여체 템플레이트는 9p21.2 영역에 상동성 아암을 갖는다.
또 다른 방법, 방법 55에서, 본 개시내용은 방법 46 내지 44 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 공여체 템플레이트는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌에 상동성 아암을 갖는다: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2.
또 다른 방법, 방법 56에서, 본 개시내용은 방법 44의 방법을 제공하고, 상기 DSB, 또는 5' DSB 및 3' DSB는 C9ORF72 유전자의 제1 인트론에 있다.
또 다른 방법, 방법 57에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 56 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 삽입 또는 정정은 상동 직접 수선 (HDR)에 의한 것이다.
또 다른 방법, 방법 58에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 방법은 세포 속으로 2개 가이드 리보헥산 (gRNAs)를 도입하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는, C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 5' DSB 유전자좌와 3' DSB 유전자좌 사이 염색체 DNA의 영구 결실을 초래하는 5' DSB 유전자좌와 3' DSB 유전자좌 사이 염색체 DNA의 결실을 야기하는 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 한 쌍의 이중-가닥 절단 (DSBs), 5' DSB 유전자좌에서 첫번째 및 3' DSB 유전자좌에서 두번째를 발효시키는 2개 이상의 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이고, 여기서 제1 가이드 RNA는 5' DSB 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함하고 제2 가이드 RNA는 3' DSB 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함한다.
또 다른 방법, 방법 59에서, 본 개시내용은 방법 58의 방법을 제공하고, 여기서 2개 gRNAs는 2개 단일-분자 가이드 RNA (sgRNAs)이다.
또 다른 방법, 방법 60에서, 본 개시내용은 방법 58 내지 59 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 2개 gRNAs 또는 2개 sgRNAs는 2개 변형된 gRNAs 또는 2개 변형된 sgRNAs이다.
또 다른 방법, 방법 61에서, 본 개시내용은 방법 58 내지 60 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제는 1개 또는 2개 gRNAs 또는 1개 또는 2개 sgRNAs와 사전-복합체화된다.
또 다른 방법, 방법 62에서, 본 개시내용은 방법 58 내지 61 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 양쪽 5' DSB 및 3' DSB는 C9ORF72 유전자의 어느 한쪽 제1 엑손, 제1 인트론, 또는 제2 엑손 내 또는 근처이다.
또 다른 방법, 방법 63에서, 본 개시내용은 방법 58 내지 62 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 결실은 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 결실이다.
또 다른 방법, 방법 64에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 63 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 Cas9 또는 Cpf1 mRNA, gRNA, 및 공여체 템플레이트는 어느 한쪽 지질 나노입자로 별도로 각각 제형화되거나 지질 나노입자로 모두 공-제형화된다.
또 다른 방법, 방법 65에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 63 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 Cas9 또는 Cpf1 mRNA는 지질 나노입자로 제형화되고, 양쪽 gRNA 및 공여체 템플레이트는 바이러스 벡터에 의해 전달된다.
또 다른 방법, 방법 66에서, 본 개시내용은 방법 65의 방법을 제공하고, 여기서 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터이다.
또 다른 방법, 방법 67에서, 본 개시내용은 방법 66의 방법을 제공하고, 여기서 AAV 벡터는 AAV6 벡터이다.
또 다른 방법, 방법 68에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 63 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 Cas9 또는 Cpf1 mRNA, gRNA, 및 공여체 템플레이트는 어느 한쪽 별개의 엑소좀으로 각각 제형화되거나 엑소좀으로 모두 공-제형화된다.
또 다른 방법, 방법 69에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 63 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 Cas9 또는 Cpf1 mRNA는 지질 나노입자로 제형화되고, gRNA는 세포에 전기천공에 의해 전달되고 공여체 템플레이트는 세포에 바이러스 벡터에 의해 전달된다.
또 다른 방법, 방법 70에서, 본 개시내용은 방법 69의 방법을 제공하고, 여기서 gRNA는 세포에 전기천공에 의해 전달되고 공여체 템플레이트는 세포에 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터에 의해 전달된다.
또 다른 방법, 방법 71에서, 본 개시내용은 방법 70의 방법을 제공하고, 여기서 AAV 벡터는 AAV6 벡터이다.
또 다른 방법, 방법 72에서, 본 개시내용은 이전의 방법들 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 C9ORF72 유전자는 하기상에 위치한다: 염색체 9: 27,546,542 - 27,573,863 (Genome Reference Consortium - GRCh38/hg38).
또 다른 방법, 방법 73에서, 본 개시내용은 방법 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 하나의 방법을 제공하고, 여기서 C9orf72 단백질 활성의 회복이 야생형 또는 정상 C9orf72 단백질 활성에 비교된다.
또 다른 방법, 방법 74에서, 본 개시내용은 공여체로부터 골수를 환자에 이식하는 것을 포함하는 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자로부터 세포에서 C9ORF72 유전자 편집을 위하여 서열 식별 번호: 1-18807내 핵산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 스페이서 서열을 포함하는, 1개 이상의 가이드 리보헥산 (gRNAs)의 조성물, 조성물 1을 제공한다.
또 다른 조성물, 조성물 2에서, 본 개시내용은 조성물 1의 조성물을 제공하고, 여기서 1개 이상의 gRNAs는 1개 이상의 단일-분자 가이드 RNAs (sgRNAs)이다.
또 다른 조성물, 조성물 3에서, 본 개시내용은 조성물 1 또는 조성물 2의 조성물을 제공하고, 여기서 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs는 1개 이상의 변형된 gRNAs 또는 1개 이상의 변형된 sgRNAs이다.
본 개시내용은 또한 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자로부터 세포에서 C9ORF72 유전자 편집을 위하여 서열 식별 번호: 18810-73668내 핵산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 스페이서 서열을 포함하는 1개 이상의 가이드 리보헥산 (gRNAs)의 조성물, 조성물 4를 제공한다.
또 다른 조성물, 조성물 5에서, 본 개시내용은 조성물 4의 조성물을 제공하고, 여기서 1개 이상의 gRNAs는 1개 이상의 단일-분자 가이드 RNAs (sgRNAs)이다.
또 다른 조성물, 조성물 6에서, 본 개시내용은 조성물 4 또는 조성물 5의 조성물을 제공하고, 여기서 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs는 1개 이상의 변형된 gRNAs 또는 1개 이상의 변형된 sgRNAs이다.
정의
용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는, 본 발명에 필수적인, 그렇지만 필수적이든 아니든, 불특정된 요소의 포함에 개방적인 조성물, 방법, 및 이의 각각의 성분(들)에 관련하여 사용된다.
용어 "으로 본질적으로 구성되는"은 주어진 구현예에 대하여 요구된 그들 요소를 지칭한다. 상기 용어는 본 발명의 구현예의 기본적이고 신규한 또는 기능성 특징(들)에 물질적으로 영향을 주지 않는 추가의 요소의 존재를 허용한다.
용어 "으로 구성되는"은, 구현예의 그 기재에서 인용되지 않은 임의의 요소가 제외되는, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 조성물, 방법, 및 이의 각각의 성분을 지칭한다.
단수 형태 "한", "하나" 및 "그"는, 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한, 복수의 참조를 포함한다.
본 명세서에서 나타난 특정 수치는 용어 "약"이 선행한다. 용어 "약"은 용어 "약"이 선행하는 수치, 뿐만 아니라 대략 수치인, 나타나는 문맥에서, 구체적으로 인용된 수치의 실질적인 등가인 수일 수 있는 근사하는 미인용된 수치인 수치에 문자 그대로의 지원을 제공하는데 사용된다. 용어 "약"은 인용된 수치의 + 10% 이내 수치를 의미한다.
수치의 범위가 본 명세서에서 나타나는 경우, 그 범위의 하한과 상한 사이 각각의 개입 값, 그 범위의 상한 및 하한, 그리고 그 범위를 가진 모든 언급된 값이 본 개시내용 이내 포괄되는 것이 고려된다. 그 범위의 하한 및 상한 이내 모든 가능한 하위-범위는 본 개시내용에 의해 또한 고려된다.
실시예
본 발명은, 본 발명의 설명적인 비-제한 구현예를 제공하는, 다음과 같은 실시예를 참고로 더욱 완전히 이해될 것이다.
실시예는, 게놈 유전자좌에서 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 정정, 또는 헥사뉴클레오타이드 반복부의 야생형 또는 유사한 수준을 회복하는, 이종성 유전자좌에서 발현으로 이어지는 C9ORF72 유전자에서, 본 명세서에서 일명 "게놈 변형"인, 정의된 치료 게놈 대체를 창출하기 위해 설명적인 게놈 편집 기술로서 CRISPR 시스템의 용도를 기재한다. 정의된 치료 변형의 도입은, 본 명세서에서 기재된 및 설명된 바와 같이, ALS 및/또는 FTLD의 잠재적인 완화를 위하여 신규한 치료 전략을 나타낸다.
실시예 1 - C9ORF72 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
C9ORF72 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호: 1-6148에서 제공된 바와 같이, 확인되었다.
실시예 2 - C9ORF72 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
C9ORF72 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호: 6149-6892에서 제공된 바와 같이, 확인되었다.
실시예 3 - C9ORF72 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
C9ORF72 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 24 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호: 7760-8097에서 제공된 바와 같이, 확인되었다.
실시예 4 - C9ORF72 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
C9ORF72 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 24 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호: 8098-8261에서 제공된 바와 같이, 확인되었다.
실시예 5 - C9ORF72 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
C9ORF72 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 24 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호: 6893-7759에서 제공된 바와 같이, 확인되었다.
실시예 6 - C9ORF72 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
C9ORF72 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 24 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호: 8262-18807에서 제공된 바와 같이, 확인되었다.
실시예 7 - AAVS1 (PPP1R12C) 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　18810-20841에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 8 - AAVS1 (PPP1R12C) 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　20842-21012에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 9 - AAVS1 (PPP1R12C) 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　21013-21030에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 10 - AAVS1 (PPP1R12C) 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　21031-21039에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 11 - AAVS1 (PPP1R12C) 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　21040-21114에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 12 - AAVS1 (PPP1R12C) 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
AAVS1 (PPP1R12C) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　21115-22290에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 13 - ALB 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
ALB 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　22291-22458에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 14 - ALB 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
ALB 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　22459-22486에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 15 - ALB 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
ALB 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　22487-22504에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 16 - ALB 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
ALB 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　22505-22509에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 17 - ALB 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
ALB 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　22510-22533에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 18 - ALB 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
ALB 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　22534-22912에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 19 - Angptl3 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
Angptl3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　22913-23257에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 20 - Angptl3 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
Angptl3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　23258-23293에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 21 - Angptl3 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
Angptl3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　23294-23316에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 22 - Angptl3 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
Angptl3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　23317-23329에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 23 - Angptl3 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
Angptl3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　23330-23392에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 24 - Angptl3 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
Angptl3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　23393-24240에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 25 - ApoC3 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
ApoC3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　24241-24643에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 26 - ApoC3 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
ApoC3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　24644-24668에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 27 - ApoC3 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
ApoC3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　24669-24671에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 28 - ApoC3 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
ApoC3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　24672-24673에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 29 - ApoC3 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
ApoC3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　24674-24685에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 30 - ApoC3 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
ApoC3 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　24686-24917에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 31 - ASGR2 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
ASGR2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　24918-26685에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 32 - ASGR2 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
ASGR2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　26686-26891에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 33 - ASGR2 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
ASGR2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　26892-26915에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 34 - ASGR2 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
ASGR2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　26916-26927에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 35 - ASGR2 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
ASGR2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　26928-27010에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 36 - ASGR2 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
ASGR2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　27011-28450에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 37 - CCR5 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
CCR5 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　28451-28653에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 38 - CCR5 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
CCR5 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　28654-28685에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 39 - CCR5 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
CCR5 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　28686-28699에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 40 - CCR5 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
CCR5 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　28700-28701에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 41 - CRISPR/NmCas9 표적 부위 for the CCR5 유전자
CCR5 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　28702-28729에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 42 - CCR5 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
CCR5 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　28730-29029에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 43 - FIX (F9) 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
FIX (F9) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　29030-30495에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 44 - FIX (F9) 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
FIX (F9) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　30496-30658에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 45 - FIX (F9) 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
FIX (F9) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　30659-30719에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 46 - FIX (F9) 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
FIX (F9) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　30720-30744에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 47 - FIX (F9) 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
FIX (F9) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　30745-30897에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 48 - FIX (F9) 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
FIX (F9) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　30898-33038에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 49 - G6PC 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
G6PC 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　33039-34054에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 50 - G6PC 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
G6PC 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　34055-34171에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 51 - G6PC 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
G6PC 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　34172-34195에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 52 - G6PC 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
G6PC 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　34196-34204에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 53 - G6PC 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
G6PC 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　34205-34294에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 54 - G6PC 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
G6PC 유전자의 영역은 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　34295-35389에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 55 - Gys2 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
Gys2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　35390-40882에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 56 - Gys2 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
Gys2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　40883-41558에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 57 - Gys2 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
Gys2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　41559-41836에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 58 - Gys2 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
Gys2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　41837-41950에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 59 - Gys2 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
Gys2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　41951-42630에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 60 - Gys2 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
Gys2 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　42631-51062에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 61 - HGD 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
HGD 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　51063-52755에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 62 - HGD 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
HGD 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　52756-52969에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 63 - HGD 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
HGD 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　52970-53052에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 64 - HGD 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
HGD 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　53053-53071에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 65 - HGD 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
HGD 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　53072-53272에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 66 - HGD 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
HGD 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　53273-55597에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 67 - Lp(a) 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
Lp(a) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　55598-59392에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 68 - Lp(a) 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
Lp(a) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　59393-59802에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 69 - Lp(a) 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
Lp(a) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　59803-59938에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 70 - Lp(a) 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
Lp(a) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　59939-59973에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 71 - Lp(a) 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
Lp(a) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　59974-60341에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 72 - Lp(a) 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
Lp(a) 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　60342-64962에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 73 - PCSK9 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
PCSK9 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　64963-66982에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 74 - PCSK9 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
PCSK9 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　66983-67169에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 75 - PCSK9 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
PCSK9 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　67170-67205에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 76 - PCSK9 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
PCSK9 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　67206-67219에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 77 - PCSK9 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
PCSK9 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　67220-67359에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 78 - PCSK9 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
PCSK9 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　67360-69153에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 79 - Serpina1 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
Serpina1 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　69154-70291에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 80 - Serpina1 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
Serpina1 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　70292-70384에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 81 - Serpina1 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
Serpina1 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　70385-70396에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 82 - Serpina1 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
Serpina1 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　70397-70399에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 83 - Serpina1 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
Serpina1 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　70400-70450에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 84 - Serpina1 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
Serpina1 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　70451-71254에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 85 - TF 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
TF 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　71255-72086에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 86 - TF 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
TF 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　72087-72172에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 87 - TF 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
TF 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　72173-72184에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 88 - TF 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
TF 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　72185-72191에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 89 - TF 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
TF 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　72192-72235에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 90 - TF 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
TF 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　72236-72871에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 91 - TTR 유전자용 CRISPR/SpCas9 표적 부위
TTR 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NRG를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　72872-73171에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 92 - TTR 유전자용 CRISPR/SaCas9 표적 부위
TTR 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNGRRT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　73172-73212에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 93 - TTR 유전자용 CRISPR/StCas9 표적 부위
TTR 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNAGAAW를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　73213-73229에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 94 - TTR 유전자용 CRISPR/TdCas9 표적 부위
TTR 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NAAAAC를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　73230-73231에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 95 - TTR 유전자용 CRISPR/NmCas9 표적 부위
TTR 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 NNNNGHTT를 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 20 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　73232-73266에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 96 - TTR 유전자용 CRISPR/Cpf1 표적 부위
TTR 유전자의 엑손 1-2는 표적 부위에 대하여 스캐닝되었다. 각각의 면적은 서열 YTN을 갖는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 대하여 스캐닝되었다. PAM에 상응하는 gRNA 22 bp 스페이서 서열은, 서열 식별 번호:　73267-73668에서 나타낸 바와 같이, 확인되었다.
실시예 97 - 가이드 가닥의 생물정보학 분석
후보 가이드는 양쪽 이론적 결합 및 실험적으로 평가된 활성을 포함하는 다중-단계 공정에서 선별 및 선택될 것이다. 예시로서, 특정한 정확한 부위, 예컨대 C9ORF72 유전자 이내 부위를, 인접한 PAM과 매칭시키는 서열을 갖는 후보 가이드는, 의도된 것이 아닌 염색체 위치에서 효과의 가능성을 평가하기 위해, 아래에 더 상세히 기재된 및 설명된 바와 같이, 부정확한 결합 평가를 위하여 이용가능한 1개 이상의 다양한 생물정보학 도구를 이용하여, 유사한 서열을 갖는 부정확한 부위를 절단시키는 그것의 잠재력에 대하여 평가될 수 있다. 부정확한 활성에 대하여 상대적으로 더 낮은 잠재력을 갖는 것으로 예상된 후보는 그 다음 그것의 정확한 활성, 및 그 다음 다양한 부위에서 부정확한 활성을 측정하기 위해 실험적으로 평가될 수 있다. 바람직한 가이드는 선택된 유전자좌에서 원하는 수준의 유전자 편집을 달성하기 위해 충분히 높은 정확한 활성, 그리고 다른 염색체 유전자좌에서 변경의 가능성을 감소시키기 위해 상대적으로 더 낮은 부정확한 활성을 갖는다. 정확한 대 부정확한 활성의 비는 종종 가이드의 "특이성"으로서 지칭된다.
예상된 부정확한 활성의 초기 선별을 위하여, 아마도 부정확한 부위를 예측하는데 사용될 수 있는 공공연하게 이용가능한 그리고 공지된 수많은 생물정보학 도구가 있고; CRISPR/Cas9/Cpf1 뉴클레아제 시스템에서 표적 부위에 결합이 상보적 서열 사이 왓슨-크릭 염기 짝짓기에 의해 유도되기 때문에, 비유사성 (및 따라서 부정확한 결합에 대하여 감소된 잠재력)의 정도는 1차 서열 차이: 미스매치 및 벌지, 즉 비-상보적 염기로 변화되는 염기, 및 표적 부위에 비해 잠재적인 부정확한 부위에서 염기의 삽입 또는 결실에 본질적으로 관련된다. (crispr.bme.gatech.edu에서 웹상으로 이용가능한) COSMID (CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions)로 불리는 예시적인 생물정보학 도구는 그와 같은 유사성을 수집한다. 다른 생물정보학 도구는, 비제한적으로, GUIDO, autoCOSMID, 및 CCtop를 포함한다.
생물정보학은 돌연변이 및 염색체 재배열의 해로운 효과를 감소시키기 위해 부정확한 절단을 최소화하는데 사용되었다. CRISPR /Cas9 시스템에서 연구는, 특히 PAM 영역으로부터 원위 위치에서 염기쌍 미스매치 및/또는 벌지를 가진 DNA 서열에 가이드 가닥의 비특이적 하이브리드화로 인해 높은 부정확한 활성의 가능성을 제안하였다. (참조 예를 들면, Hsu, P.D. 등 DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol 31, 827-832 (2013); Fu, Y. 등 High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol (2013); Cradick, T.J., Fine, E.J., Antico, C.J. & Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Research 41, 9584-9592 (2013); Lin, Y. 등 CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Res 42, 7473-7485 (2014)). 따라서, 염기쌍 미스매치에 더하여, RNA 가이드 가닥과 게놈 서열 사이 삽입 및/또는 결실을 갖는 잠재적인 부정확한 부위를 확인할 수 있는 생물정보학 도구를 갖는 것이 중요하다. 생물정보학-기반 도구, COSMID (CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions)은 따라서 (http_crispr_bme_gatech_edu에서 웹상으로 이용가능한) 잠재적인 CRISPR 부정확한 부위에 대하여 게놈을 검색하는데 사용되었다. COSMID 산출은 미스매치의 수 및 위치에 기반하여 잠재적인 부정확한 부위의 목록을 등급화하였고, 표적 부위의 더욱 박식한 선택을 허용하였고, 더욱 유사하게 부정확한 절단으로 부위의 사용을 피하였다.
한 영역에서 gRNa 표적화 부위의 추정된 정확한 및/또는 부정확한 활성을 평가하는 추가의 생물정보학 입수경로는 이용되었다. 활성을 예측하는데 사용될 수 있는 다른 피쳐는 문제의 세포 유형, DNA 접근성, 염색질 상태, 전사 인자 결합 부위, 전사 인자 결합 데이터, 및 다른 CHIP-seq 데이터에 대하여 정보를 포함한다. 편집 효율 예컨대 gRNAs의 쌍의 상대 위치 및 방향, 국부 서열 피쳐 및 미세-상동성을 예측하는 추가의 인자는 평가된다. (참조 예를 들면, Naito, Y., Hino, K., Bono, H. & Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics 31, 1120-1123 (2015); Cradick, T.J., Qui, P., Lee, C.M., Fine, E.J. & Bao, G. COSMID: A Web-based Tool for Identifying and Validating CRISPR/Cas Off-target Sites. Molecular Therapy-Nucleic Acids, e214 (2014); Guell, M., Yang, L. & Church, G.M. Genome editing assessment using CRISPR Genome Analyzer (CRISPR-GA). Bioinformatics 30, 2968-2970 (2014); Prykhozhij, S.V., Rajan, V., Gaston, D. & Berman, J.N. CRISPR multitargeter: a web tool to find common and unique CRISPR single guide RNA targets in a set of similar sequences. PLoS One 10, e0119372 (2015); Montague, T.G., Cruz, J.M., Gagnon, J.A., Church, G.M. & Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res 42, W401-407 (2014); Bae, S., Kweon, J., Kim, H.S. & Kim, J.S. Microhomology-based choice of Cas9 nuclease target sites. Nat Methods 11, 705-706 (2014); Bae, S., Park, J. & Kim, J.S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014); Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J. & Mateo, J.L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. PLoS One 10, e0124633 (2015)).
실시예 98 - 정확한 활성에 대하여 세포내 바람직한 가이드의 시험
최저 부정확한 활성을 갖는 것으로 예측된 gRNAs는 그 다음 모델 세포주, 예컨대 HEK293T 또는 K562에서 정확한 활성에 대하여 시험될 것이고, TIDE 또는 차세대 서열분석을 이용하여 인델 빈도에 대하여 평가될 것이다. TIDE는 가이드 RNA (sgRNA)에 의해 결정된 표적 유전자좌의 CRISPR-Cas9에 의해 게놈 편집을 빠르게 평가하기 위한 웹 도구이다. 2개의 표준 모세관 서열분석 반응으로부터 정량적 서열 미량 데이터에 기반하여, TIDE 소프트웨어는 편집 효능을 정량화하고 표적화된 세포 풀의 DNA에서 삽입 및 결실 (인델)의 우세한 유형을 확인한다. 상세한 설명 및 실시예에 대하여 Brinkman 등, Nucl. Acids Res. (2014) 참조. 고-처리량 서열분석으로서도 공지된, 차세대 서열분석 (NGS)는 하기를 포함하는 수많은 상이한 현대 서열분석 기술을 기재하는데 사용된 포괄적인 용어이다: Illumina (Solexa) 서열분석, Roche 454 서열분석, Ion torrent: 양성자/PGM 서열분석, 및 고체 서열분석. 이들 최근 기술은 이전에 사용된 Sanger 서열분석보다 훨씬 더 빠르게 그리고 저렴하게 DNA 및 RNA를 서열화시키고, 그와 같이 유전체학 및 분자 생물학의 연구를 혁신시켰다.
조직 배양 세포의 형질감염은 활성 및 특이성의 강력한 수단 그리고 상이한 작제물의 선별을 허용한다.(Cradick, T.J., Qui, P., Lee, C.M., Fine, E.J. & Bao, G. COSMID: A Web-based Tool for Identifying and Validating CRISPR/Cas Off-target Sites. Molecular Therapy-Nucleic Acids, e214 (2014)). 조직 배양 세포주, 예컨대 K-562 또는 HEK293T는 쉽게 형질감염되고 고 활성을 초래한다. 이들 또는 다른 세포주는 CD34+와 매칭하는 그리고 최상의 대리를 제공하는 세포주를 결정하기 위해 평가될 것이다. 이들 세포는 그 다음 많은 초기 단계 시험을 위하여 사용될 것이다. 예를 들어, S. 파이오제네스 Cas9용 개별 gRNAs는, 인간 세포에서 발현에 적합한, 플라스미드를 이용하여 세포 속으로 형질감염될 것이다. 며칠 후 게놈 DNA는 수확되고 표적 부위는 PCR에 의해 증폭된다. 컷팅 활성은 자유 DNA 단부의 NHEJ 수선에 의해 도입된 삽입, 결실 및 돌연변이의 속도에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법이 미절단된 DNA로부터 정확하게 수선된 서열을 이러한 방법으로 분화시킬 수 없어도, 컷팅의 수준은 수선오류의 양에 의해 추산될 수 있다. 부정확한 활성은 확인된 추정 부정확한 부위의 증폭 그리고 절단을 검출하기 위한 유사한 방법의 이용에 의해 관측될 수 있다. 전좌는 또한, 특이적 컷팅 및 및 전좌가 발생하는지를 결정하기 위해, 프라이머 측접 컷트 부위를 이용하여 분석될 수 있다. 비-유도된 검정은 가이드-seq를 포함하는 부정확한 절단의 상보적 시험을 허용하여 개발되었다. (Kim, D. 등 Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells. Nat Methods 12, 237-243, 231 p following 243 (2015); Frock, R.L. 등 Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases. Nat Biotechnol 33, 179-186 (2015); Wang, X. 등 Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nat Biotechnol 33, 175-178 (2015); Tsai, S.Q. 등 GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol (2014); Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J. & Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol 32, 677-683 (2014)). 상당한 활성을 가진 gRNA 또는 gRNA의 쌍은 그 다음 C9ORF72 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 배양된 세포에서 후속 조치될 수 있다. 부정확한 이벤트는 재차 뒤따를 수 있다. 유사하게 CD34+ 세포는 형질감염될 수 있고 유전자 정정 및 가능한 부정확한 이벤트의 수준은 측정될 수 있다. 이들 실험은 뉴클레아제 및 공여체 설계 및 전달의 최적화를 허용한다.
실시예 99 - 부정확한 활성에 대하여 세포내 바람직한 가이드의 시험
상기 실시예에서 TIDE 및 차세대 서열분석 연구로부터 최상의 정확한 활성을 갖는 gRNAs는 그 다음 전체의 게놈 서열분석을 이용하여 부정확한 활성에 대하여 시험될 것이다. 후보 gRNAs는 CD34+ 세포 또는 iPSCs에서 더욱 완전히 평가될 것이다.
실시예 100 - HDR 유전자 편집용 상이한 접근법 시험
양쪽 정확한 활성 및 부정확한 활성을 위하여 gRNAs 시험후, 돌연변이 정정 및 녹-인 전략은 HDR 유전자 편집을 위하여 시험될 것이다.
돌연변이 정정 접근법을 위하여, 공여체 DNA 템플레이트는 짧은 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드, 짧은 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드 (온전한 PAM 서열/돌연변이된 PAM 서열), 긴 단일-가닥 DNA 분자 (온전한 PAM 서열/돌연변이된 PAM 서열) 또는 긴 이중-가닥 DNA 분자 (온전한 PAM 서열/돌연변이된 PAM 서열)로서 제공될 것이다. 게다가, 공여체 DNA 템플레이트는 AAV에 의해 전달될 것이다.
cDNA 녹-인 접근법의 일부 구현예를 위하여, 세이프 하버 유전자좌 (예를 들면, AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR), 18q11.2 영역, 14q24.3 영역, 또는 11p15.4 영역에 상동성 아암을 갖는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손 (제1 코딩 엑손) C9ORF72 유전자의 완전한 CDS 및 C9ORF72 유전자의 3'UTR의 40 nt 초과 및 다음과 같은 인트론의 적어도 40 nt를 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌 (예를 들면, AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR), 18q11.2 영역, 14q24.3 영역, 또는 11p15.4 영역에 상동성 아암을 갖는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손, C9ORF72 유전자의 완전한 CDS 및 C9ORF72 유전자의 3'UTR의 80 nt 초과, 및 다음과 같은 인트론의 적어도 80 nt를 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌 (예를 들면, AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR), 18q11.2 영역, 14q24.3 영역, 또는 11p15.4 영역에 상동성 아암을 갖는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손, C9ORF72 유전자의 완전한 CDS 및 C9ORF72 유전자의 3'UTR의 100 nt 초과, 및 다음과 같은 인트론의 적어도 100 nt를 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌 (예를 들면, AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR), 18q11.2 영역, 14q24.3 영역, 또는 11p15.4 영역에 상동성 아암을 갖는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손, C9ORF72 유전자의 완전한 CDS 및 C9ORF72 유전자의 3'UTR의 150 nt 초과, 및 다음과 같은 인트론의 적어도 150 nt를 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌 (예를 들면, AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR), 18q11.2 영역, 14q24.3 영역, 또는 11p15.4 영역에 상동성 아암을 갖는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손, C9ORF72 유전자의 완전한 CDS 및 C9ORF72 유전자의 3'UTR의 300 nt 초과, 및 다음과 같은 인트론의 적어도 300 nt를 포함할 수 있다. 세이프 하버 유전자좌 (예를 들면, AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR), 18q11.2 영역, 14q24.3 영역, 또는 11p15.4 영역에 상동성 아암을 갖는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA는 C9ORF72 유전자의 제1 엑손, C9ORF72 유전자의 완전한 CDS 및 C9ORF72 유전자의 3'UTR의 400 nt 초과, 및 다음과 같은 인트론의 적어도 400 nt를 포함할 수 있다. 게다가, DNA 템플레이트는 AAV에 의해 전달될 것이다.
cDNA 또는 미니유전자 녹-인 접근법을 위하여, 9p21.2에 상동성 아암을 갖는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA는, C9ORF72 유전자의 제1 엑손 (제1 코딩 엑손) C9ORF72 유전자의 완전한 CDS 및 C9ORF72 유전자의 3'UTR의 80 nt 초과, 및 다음과 같은 인트론의 적어도 80 nt를 포함할 수 있다. 게다가, DNA 템플레이트는 AAV에 의해 전달될 것이다.
실시예 101 - 선도 Crispr-Cas9/DNA 공여체 조합의 재평가
HDR 유전자 편집에 대하여 상이한 전략 시험후, 선도 CRISPR-Cas9/DNA 공여체 조합은 결실, 재조합, 및 부정확한 특이성의 효율에 대하여 1차 인간 뉴런에서 재평가될 것이다. Cas9 mRNA는 전달용 지질 나노입자로 제형화될 것이고, sgRNAs는 나노입자로 제형화될 것이거나 AAV로서 전달될 것이고, 공여체 DNA는 나노입자로 제형화될 것이거나 AAV로서 전달될 것이다.
실시예 102 - 관련된 마우스 모델에서 생체내 시험
최근에 어느 한쪽 정상 헥사뉴클레오타이드 반복부 보체 또는 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부를 가진 인간 C9ORF72 유전자를 함유하는 마우스 모델은 생성되었다. Tg(C9orf72_3) 라인 112 마우스 (Jackson Laboratory, Stock No. 023099)는 인간 C9orf72_3 이식유전자의 몇 개의 탠덤 카피를 갖고, 각각의 카피는 100-1000 반복부 ([GGGGCC]100-1000)을 갖는다. 대조군으로서, Tg(C9orf72_2) 라인 8 마우스 (Jackson Laboratory, Stock No. 023088)은 15 헥사뉴클레오타이드 반복부 ([GGGGCC]15)를 가진 C9orf72_2 이식유전자를 갖는다. Tg(C9orf72_3) 라인 112 및 Tg(C9orf72_2) 라인 8로부터 반접합 마우스는 생존가능하고, 멸균되고, 멘델 비로 태어나고 16 월령까지 임의의 보행성 또는 인지 표현형을 발생하지 않는다.
3월령까지, 그러나, 반접합 Tg(C9orf72_3) 라인 112 동물은 뇌의 대부분의 뉴런의 모집단에서 (반복부 확장의 비-ATG 개시된 번역에서 비롯한) 폴리(GP) 디펩타이드 및 (헥사뉴클레오타이드-반복부 확장-함유 인간 C9ORF72 RNAs에 의해 형성된) RNA 병소를 나타낸다. RNA 병소 또는 폴리(GP) 디펩타이드 표현형은 반접합 Tg(C9orf72_2) 라인 8에 대하여 관측되지 않는다. (O'Rourke (2015) Neuron Volume 88, Issue 5, p892-901, 2 December 2015 "C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD").
gRNA들은 C9ORF72에서 헥사뉴클레오타이드 반복부 확장을 변경시키는 그리고 표현형 변화, 예컨대 RNA 병소 및 반복부 관련된 비-ATG (RAN) 번역된 디펩타이드의 억제 또는 완화, 그리고 반접합 Tg(C9orf72_3) 라인 112 동물에서 나타났던 핵소체 기능이상 및 수득한 변경된 뉴클레올린 분포의 억제 또는 완화를 생산하는 그것의 능력을 평가하기 위해 동물에서 시험될 것이다.
실시예 103 - C9ORF72의 시험관내 전사
C9ORF72 DNA 표적 영역을 편집할 수 있는 gRNAs의 쌍의 광범위를 확인하기 위해, 시험관내 전사된 (IVT) gRNA 선별은 수행되었다. C9ORF72 게놈 서열은 gRNA 설계 소프트웨어를 이용하는 분석용으로 제출되었다. gRNAs의 수득한 목록은 서열의 특유성에 기반된 약 200 gRNAs (참조 표 3) (게놈의 다른 어느 곳에서 완벽한 매치 없는 gRNAs만이 선별되었다) 및 최소 예상된 부정확물의 목록으로 좁혀졌다.
표 3. gRNAs
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
표 3에서 gRNAs는 시험관내 전사되었고, Cas9를 구성적으로 발현시키는 HEK293T 세포에 메신저 Max를 이용하여 형질감염되었다. 세포는 형질감염후 48 시간에 수확되었고, 게놈 DNA는 단리되었고, 컷팅 효율은 TIDE 분석을 이용하여 평가되었다. (도 1). 시험된 gRNAs의 약 25%가 컷팅 효율성을 80% 넘게 유도하였다는 것이 밝혀졌다.
설명적인 구현예에 관한 주석
본 개시내용이 본 발명 및/또는 그것의 잠재적인 적용의 다양한 측면 예시의 목적으로 다양한 특이적 측면의 설명을 제공하는 동안, 변동 및 변형이 당해 분야의 숙련가에 발생할 것이 이해된다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 본 발명 또는 발명들은 이들이 청구되는 한 적어도 넓게 이해되어야 하고, 본 명세서에서 제공된 특정한 설명적인 측면에 의해 더욱 협소하게 정의되지 않아야 한다.
본 명세서에서 확인된 임의의 특허, 공보, 또는 다른 개시 물질은, 그 전문이 달리 나타내지 않는 한, 그러나 편입된 물질이 본 명세서에서 명확히 제시된 현존하는 설명, 정의, 서술, 또는 다른 개시 물질과 상충하지 않는 정도로만 본 명세서 참고로 편입된다. 이와 같이, 그리고 필요한 정도로, 본 명세서에서 제시된 바와 같은 분명한 설명은 참고로 편입된 임의의 상충 물질을 교체한다. 본 명세서에 참고로 편입되도록 언급되는, 그러나 본 명세서에서 제시된 현존하는 정의, 서술, 또는 다른 개시 물질과 상충하는 임의의 물질, 또는 이의 부분은 그 편입된 물질과 현존하는 개시 물질 사이 상충이 일어나지 않는 정도로 단지 편입된다. 출원인은 본 명세서에서 참고로 편입된, 임의의 요지, 또는 이의 부분을 명확히 인용하기 위해 본 명세서를 수정할 권리를 갖는다.

Claims (80)

  1. 게놈 편집에 의한 인간 세포에서 상기 C9ORF72 유전자의 편집 방법으로서, 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 교정을 초래하고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 상기 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제의 도입을 포함하는, 방법.
  2. 게놈 편집에 의한 인간 세포에서 C9ORF72 유전자의 삽입 방법으로서: 상기 C9ORF72 유전자 또는 미니유전자의 영구 삽입을 초래하고, 상기 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 상기 인간 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법으로서:
    i) 환자 특이적 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 창출하는 단계;
    ii) 상기 iPSC의 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 iPSC의 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집 단계, 또는 상기 iPSC의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집 단계;
    iii) 상기 게놈 편집된 iPSC를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키는 단계; 및
    iv) 상기 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 상기 환자에 임플란팅하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 창출 단계는:
    a) 체세포를 상기 환자로부터 단리시키는 단계; 및
    b) 일련의 다능성-관련 유전자를 상기 체세포에 도입시켜 상기 세포를 만능 줄기 세포가 되도록 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 체세포가 섬유아세포인, 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 다능성-관련 유전자의 상기 세트가 OCT4, SOX2, KLF4, Lin28, NANOG 및 cMYC로 구성되는 군으로부터 선택되는 상기 유전자의 하나 이상인, 방법.
  7. 청구항 3 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 단계가 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 상기 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 교정을 초래하는 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 상기 C9ORF72 유전자 또는 미니유전자의 영구 삽입 및 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 상기 iPSC 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 세이프 하버 유전자좌가: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌인, 방법.
  9. 청구항 3 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분화 단계가 상기 게놈 편집된 iPSC를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키기 위해 1개 이상의 하기: 소분자의 조합으로 치료 또는 마스터 전사 인자의 전달을 포함하는, 방법.
  10. 청구항 3 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임플란팅 단계가 상기 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 상기 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법으로서:
    i) 백혈구를 상기 환자로부터 단리시키는 단계;
    ii) 상기 백혈구의 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집 단계, 또는 상기 백혈구의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집 단계; 및
    iii) 상기 편집된 백혈구를 상기 환자에 임플란팅하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 단리 단계가: 세포 분별 원심분리, 세포 배양, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  13. 청구항 11 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 단계가 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 상기 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 교정을 초래하는 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 상기 신경 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 세이프 하버 유전자좌가: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌인, 방법.
  15. 청구항 11 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임플란팅 단계가 상기 편집된 백혈구를 상기 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법으로서:
    i) 임의로, 상기 환자의 골수의 생검을 수행하는 단계;
    ii) 간엽 줄기 세포를 단리시키는 단계;
    iii) 상기 줄기 세포의 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 줄기 세포의 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집 단계, 또는 상기 줄기 세포의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집 단계;
    iv) 상기 줄기 세포를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키는 단계; 및
    v) 상기 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포를 상기 환자에 임플란팅하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 단리 단계가: 골수의 흡인 및 Percoll을 이용하는 밀도 원심분리에 의한 간엽 세포의 단리를 포함하는, 방법.
  18. 청구항 16 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 단계가 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 상기 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 교정을 초래하는 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 상기 줄기 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 세이프 하버 유전자좌가: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌인, 방법.
  20. 청구항 16 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분화 단계가 상기 게놈 편집된 줄기 세포를 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, 또는 신경 세포로 분화시키기 위해 1개 이상의: 소분자의 조합으로 치료 또는 마스터 전사 인자의 전달을 포함하는, 방법.
  21. 청구항 16 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임플란팅 단계가 상기 세포를 상기 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함하는, 방법.
  22. 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체외 치료 방법으로서:
    i) 임의로, 상기 환자를 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF)로 치료하는 단계;
    ii) 조혈 전구 세포를 상기 환자로부터 단리시키는 단계;
    iii) 상기 조혈 전구 세포의 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 조혈 전구 세포의 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집 단계, 또는 상기 조혈 전구 세포의 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집 단계; 및
    iv) 상기 세포를 상기 환자에 임플란팅하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 치료 단계가 Plerixaflor와 조합으로 수행되는, 방법.
  24. 청구항 22 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리 단계가 CD34+ 세포를 단리시키는 것을 포함하는, 방법.
  25. 청구항 22 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 단계가 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 상기 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 교정을 초래하는 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 상기 줄기 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 세이프 하버 유전자좌가: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌인, 방법.
  27. 청구항 22 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임플란팅 단계가 상기 신경 세포를 상기 환자에 이식, 국소 주사, 전신 주입, 또는 이들의 조합에 의해 임플란팅하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 생체내 치료 방법으로서, C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 환자의 세포에서 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 편집하는, 또는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 편집하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 편집 단계가 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 상기 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 영구 결실, 삽입, 또는 교정을 초래하는 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처 1개 이상의 단일-가닥 절단 (SSBs) 또는 1개 이상의 이중-가닥 절단 (DSBs)를 발효시키기 위해 상기 세포 속으로 1개 이상의 데옥시리보핵산 (DNA) 엔도뉴클레아제를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 세이프 하버 유전자좌가: AAVS1 (PPP1R12C), ALB, Angptl3, ApoC3, ASGR2, CCR5, FIX (F9), G6PC, Gys2, HGD, Lp(a), Pcsk9, Serpina1, TF, 및 TTR로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌인, 방법.
  31. 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 신경 세포, 골수 세포, 조혈 전구 세포, 또는 CD34+ 세포, 방법.
  32. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제가: Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로서 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제; 또는 이의 동족체, 상기 자연 발생 분자의 재조합, 이의 코돈-최적화된, 또는 변형된 버전, 및 이들의 조합인, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 방법이 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 속으로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  34. 청구항 32에 있어서, 상기 방법이 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 1개 이상의 리보헥산 (RNAs)를 상기 세포 속으로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  35. 청구항 33 또는 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 1개 이상의 RNAs가 1개 이상의 변형된 폴리뉴클레오타이드 또는 1개 이상의 변형된 RNAs인, 방법.
  36. 청구항 32에 있어서, 상기 DNA 엔도뉴클레아제가 단백질 또는 폴리펩타이드인, 방법.
  37. 청구항 1 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 세포 속으로 1개 이상의 가이드 리보헥산 (gRNAs)을 도입하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 1개 이상의 gRNAs가 단일-분자 가이드 RNA (sgRNAs)인, 방법.
  39. 청구항 37 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs가 1개 이상의 변형된 gRNAs 또는 1개 이상의 변형된 sgRNAs인, 방법.
  40. 청구항 37 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제가 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs와 사전-복합체화되는, 방법.
  41. 청구항 1 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 야생형 C9ORF72 유전자 또는 미니유전자 또는 cDNA의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트를 상기 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 야생형 C9ORF72 유전자 또는 cDNA의 상기 일부가 상기 전체 C9ORF72 유전자 또는 cDNA, 또는 천연 변이체 1, 변이체 2, 또는 변이체 3인, 방법.
  43. 청구항 41 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여체 템플레이트가 한쪽 단일 또는 이중 가닥인, 방법.
  44. 청구항 41 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여체 템플레이트가 상기 9p21.2 영역에 상동성 아암을 갖는, 방법.
  45. 청구항 41 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여체 템플레이트가: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌에 상동성 아암을 갖는, 방법.
  46. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 야생형 C9ORF72 유전자의 적어도 한 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트 및 1개의 가이드 리보헥산 (gRNA)를 상기 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함하고, 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제가 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 DSB 유전자좌에서, 또는 상기 유전자좌에서 상기 염색체 DNA 속으로 상기 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트로부터 신규한 서열의 삽입을 용이하게 하는 세이프 하버 유전자좌 또는 상기 유전자좌 또는 세이프 하버 유전자좌에 상기 C9ORF72 유전자 근위의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자의 상기 염색체 DNA의 일부의 영구 삽입 또는 교정 그리고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 세이프 하버 이내 또는 근처 1개의 단일-가닥 절단 (SSB) 또는 이중-가닥 절단 (DSB)를 발효시키는 1개 이상의 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이고, 상기 gRNA가 상기 유전자좌의 세그먼트 또는 유전자좌에 상보적인 스페이서 서열을 포함하는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 근위가 상기 유전자좌 또는 유전자좌의 상류 및 하류 양쪽의 뉴클레오타이드를 의미하는, 방법.
  48. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 야생형 C9ORF72 유전자의 적어도 한 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트 및 2개의 가이드 리보헥산 (gRNAs)를 상기 세포 속으로 도입하는 것을 추가로 포함하고, 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제가, 상기 C9ORF72 유전자의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 또는 상기 C9ORF72 유전자 또는 세이프 하버 유전자좌의 조절 요소를 인코딩하는 다른 DNA 서열 또는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 상기 5' 유전자좌와 상기 3' 유전자좌 사이 상기 염색체 DNA의 영구 삽입 또는 교정 그리고 C9orf72 단백질 활성의 회복을 초래하는 상기 5' 유전자좌와 상기 3' 유전자좌 사이 상기 염색체 DNA 속으로 상기 폴리뉴클레오타이드 공여체 템플레이트로부터 신규한 서열의 삽입을 용이하게 하는 세이프 하버 유전자좌 이내 또는 근처, 한 쌍의 단일-가닥 절단 (SSB) 또는 이중-가닥 절단 (DSBs), 5' 유전자좌에서 첫번째 및 3' 유전자좌에서 두번째를 발효시키는 2개 이상의 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이고, 상기 제1 가이드 RNA가 상기 5' 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA가 상기 3' 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함하는, 방법.
  49. 청구항 46 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 또는 2개 gRNAs가 1개 또는 2개 단일-분자 가이드 RNA (sgRNAs)인, 방법.
  50. 청구항 46 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 또는 2개 gRNAs 또는 1개 또는 2개 sgRNAs가 1개 또는 2개 변형된 gRNAs 또는 1개 또는 2개 변형된 sgRNAs인, 방법.
  51. 청구항 46 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제가 1개 또는 2개 gRNAs 또는 1개 또는 2개 sgRNAs와 사전-복합체화되는, 방법.
  52. 청구항 46 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 C9ORF72 유전자 또는 cDNA의 상기 일부가 상기 전체 C9ORF72 유전자 또는 cDNA; 천연 변이체 1, 변이체 2, 변이체 3의 상기 cDNA; 또는 약 30 헥사뉴클레오타이드 반복부인, 방법.
  53. 청구항 46 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여체 템플레이트가 한쪽 단일 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드인, 방법.
  54. 청구항 46 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여체 템플레이트가 상기 9p21.2 영역에 상동성 아암을 갖는, 방법.
  55. 청구항 46 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여체 템플레이트가: AAVS1 (PPP1R12C)의 엑손 1-2, ALB의 엑손 1-2, Angptl3의 엑손 1-2, ApoC3의 엑손 1-2, ASGR2의 엑손 1-2, CCR5의 엑손 1-2, FIX (F9)의 엑손 1-2, G6PC의 엑손 1-2, Gys2의 엑손 1-2, HGD의 엑손 1-2, Lp(a)의 엑손 1-2, Pcsk9의 엑손 1-2, Serpina1의 엑손 1-2, TF의 엑손 1-2, 및 TTR의 엑손 1-2로 구성되는 군으로부터 선택되는 세이프 하버 유전자좌에 상동성 아암을 갖는, 방법.
  56. 청구항 44에 있어서, 상기 DSB, 또는 5' DSB 및 3' DSB가 상기 C9ORF72 유전자의 제1 인트론에 있는, 방법.
  57. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삽입 또는 교정이 상동 직접 수선 (HDR)에 의한 것인, 방법.
  58. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 세포 속으로 2개 가이드 리보헥산 (gRNAs)를 도입하는 것을 추가로 포함하고, 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제가, 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처 상기 5' DSB 유전자좌와 상기 3' DSB 유전자좌 사이 상기 염색체 DNA의 영구 결실을 초래하는 상기 5' DSB 유전자좌와 상기 3' DSB 유전자좌 사이 상기 염색체 DNA의 결실을 야기하는 상기 C9ORF72 유전자 이내 또는 근처, 한 쌍의 이중-가닥 절단 (DSBs), 5' DSB 유전자좌에서 첫번째 및 3' DSB 유전자좌에서 두번째를 발효시키는 2개 이상의 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제이고, 상기 제1 가이드 RNA가 상기 5' DSB 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함하고 상기 제2 가이드 RNA가 상기 3' DSB 유전자좌의 세그먼트에 상보적인 스페이서 서열을 포함하는, 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 2개 gRNAs가 2개 단일-분자 가이드 RNA (sgRNAs)인, 방법.
  60. 청구항 58 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 gRNAs 또는 2개 sgRNAs가 2개 변형된 gRNAs 또는 2개 변형된 sgRNAs인, 방법.
  61. 청구항 58 내지 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 DNA 엔도뉴클레아제가 1개 또는 2개 gRNAs 또는 1개 또는 2개 sgRNAs와 사전-복합체화되는, 방법.
  62. 청구항 58 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 양쪽 상기 5' DSB 및 3' DSB가 상기 C9ORF72 유전자의 어느 한쪽 상기 제1 엑손, 제1 인트론, 또는 제2 엑손 내 또는 근처인, 방법.
  63. 청구항 58 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결실이 상기 확장된 헥사뉴클레오타이드 반복부의 결실인, 방법.
  64. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9 또는 Cpf1 mRNA, gRNA, 및 공여체 템플레이트가 어느 한쪽 지질 나노입자로 별도로 각각 제형화되거나 지질 나노입자로 모두 공-제형화되는, 방법.
  65. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9 또는 Cpf1 mRNA가 지질 나노입자로 제형화되고, 양쪽 상기 gRNA 및 공여체 템플레이트가 바이러스 벡터에 의해 전달되는, 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터인, 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 상기 AAV 벡터가 AAV6 벡터인, 방법.
  68. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9 또는 Cpf1 mRNA, gRNA, 및 공여체 템플레이트가 어느 한쪽 별개의 엑소좀으로 각각 제형화되거나 엑소좀으로 모두 공-제형화되는, 방법.
  69. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9 또는 Cpf1 mRNA가 지질 나노입자로 제형화되고, 상기 gRNA가 상기 세포에 전기천공에 의해 전달되고 공여체 템플레이트가 상기 세포에 바이러스 벡터에 의해 전달되는, 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 gRNA가 상기 세포에 전기천공에 의해 전달되고 공여체 템플레이트가 상기 세포에 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터에 의해 전달되는, 방법.
  71. 청구항 70에 있어서, 상기 AAV 벡터가 AAV6 벡터인, 방법.
  72. 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C9ORF72 유전자가: 염색체 9: 27,546,542 - 27,573,863 (Genome Reference Consortium - GRCh38/hg38)에 위치하는, 방법.
  73. 청구항 1, 7, 13, 18, 25 또는 29 중 어느 한 항에 있어서, C9orf72 단백질 활성의 상기 회복이 야생형 또는 정상 C9orf72 단백질 활성에 비교되는, 방법.
  74. 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 세포에서 C9ORF72 유전자 편집을 위하여 서열 식별 번호: 1-18807의 핵산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 스페이서 서열을 포함하는, 1개 이상의 가이드 리보헥산 (gRNAs).
  75. 청구항 74에 있어서, 상기 1개 이상의 gRNAs가 1개 이상의 단일-분자 가이드 RNAs (sgRNAs)인, 1개 이상의 gRNAs.
  76. 청구항 74 또는 75에 있어서, 상기 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs가 1개 이상의 변형된 gRNAs 또는 1개 이상의 변형된 sgRNAs인, 1개 이상의 gRNAs 또는 sgRNAs.
  77. 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 치료 방법으로서, 공여체로부터 골수를 상기 환자에 이식하는 것을 포함하는, 방법.
  78. 근위축성 측색 경화증 (ALS) 또는 전두측두엽 치매 (FTLD)를 가진 환자의 세포에서 C9ORF72 유전자 편집을 위하여 서열 식별 번호: 18810-73668의 핵산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 스페이서 서열을 포함하는, 1개 이상의 가이드 리보헥산 (gRNAs).
  79. 청구항 78에 있어서, 상기 1개 이상의 gRNAs가 1개 이상의 단일-분자 가이드 RNAs (sgRNAs)인, 1개 이상의 gRNAs.
  80. 청구항 78 또는 79에 있어서, 상기 1개 이상의 gRNAs 또는 1개 이상의 sgRNAs가 1개 이상의 변형된 gRNAs 또는 1개 이상의 변형된 sgRNAs인, 1개 이상의 gRNAs 또는 sgRNAs.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
US10280418B2 (en) 2014-03-18 2019-05-07 Univeristy Of Massachusetts RAAV-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
ES2784360T3 (es) 2015-05-29 2020-09-24 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72
EP4269577A3 (en) 2015-10-23 2024-01-17 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US20200123570A1 (en) * 2016-06-29 2020-04-23 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of apolipoprotein c3 (apociii)-related disorders
WO2018007871A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
MX2019003745A (es) * 2016-09-30 2019-12-11 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen una expansion de repeticiones de hexanucleotidos en un locus c9orf72.
CN110214180A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器的aav递送
GB201619876D0 (en) 2016-11-24 2017-01-11 Cambridge Entpr Ltd Controllable transcription
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11920148B2 (en) 2017-02-22 2024-03-05 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
CN110914426A (zh) 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
EP3622073A4 (en) * 2017-05-09 2021-01-06 University of Massachusetts METHOD FOR TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
EP3684937A4 (en) 2017-09-22 2021-06-02 University of Massachusetts DUAL EXPRESSION VECTORS OF SOD1 AND THEIR USES
TWI833708B (zh) * 2017-09-29 2024-03-01 美商英特利亞醫療公司 調配物
JP2021500036A (ja) 2017-10-16 2021-01-07 ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. アデノシン塩基編集因子の使用
KR20200077529A (ko) * 2017-10-24 2020-06-30 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 희귀 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물
WO2019094694A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 University Of Massachusetts Compositions and methods for the treatment of expanded repeat-associated disorders
CA3116918A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for transgene expression from an albumin locus
MX2021007400A (es) * 2018-12-20 2021-07-15 Regeneron Pharma Expansion de repeticiones mediada por nucleasas.
CN109852587B (zh) * 2019-03-07 2021-04-27 中国科学院动物研究所 一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法
BR112021018607A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Massachusetts Inst Technology Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos
WO2020205605A2 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 University Of Massachusetts OLIGONUCLEOTIDE-BASED MODULATION OF C9orf72
AU2020267775A1 (en) * 2019-05-09 2021-12-02 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
EP3796776A1 (en) 2019-06-07 2021-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
US20230040053A1 (en) * 2019-12-23 2023-02-09 Tsinghua University DEVELOPMENT OF DUAL-gRNA APPROACH WITH UNDETECTABLE OFF-TARGET EFFECT TO CORRECT C9ORF72 REPEAT EXPANSION AND C9ORF72 PATHOLOGY
WO2021159008A2 (en) 2020-02-07 2021-08-12 Maze Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
KR20230010625A (ko) 2020-03-11 2023-01-19 비트 바이오 리미티드 간 세포 생성 방법
WO2021188729A1 (en) * 2020-03-18 2021-09-23 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of c9orf72
WO2021216457A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Spinalcyte, Llc Treatment of frontotemporal dementia using fibroblasts and products thereof
CN116096873A (zh) 2020-05-08 2023-05-09 布罗德研究所股份有限公司 同时编辑靶标双链核苷酸序列的两条链的方法和组合物
WO2022058295A1 (en) * 2020-09-15 2022-03-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for diagnosing diseases induced by repeat expansion using optical mapping
US20230392134A1 (en) 2020-09-30 2023-12-07 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
IL307305A (en) 2021-04-06 2023-11-01 Maze Therapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of TDP-43 proteinopathy
GB202105455D0 (en) * 2021-04-16 2021-06-02 Ucl Business Ltd Composition
EP4130263A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-08 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Compound and method for a specific targeting of the hax1 gene
WO2023086389A1 (en) * 2021-11-09 2023-05-19 Prime Medicine, Inc. Genome editing compositions and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2023164482A2 (en) * 2022-02-23 2023-08-31 The Johns Hopkins University Treatment for nucleotide repeat expansion disease
WO2023220740A2 (en) * 2022-05-12 2023-11-16 The Regents Of The University Of California Therapeutic crispr/cas9 gene editing approaches to the c9orf72 repeat expansion mutation in ipscs
WO2023235726A2 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2024077109A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Maze Therapeutics, Inc. Unc13a antisense oligonucleotides and uses thereof

Family Cites Families (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
WO1988010264A1 (en) 1987-06-24 1988-12-29 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
WO1992002258A1 (en) 1990-07-27 1992-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
KR100211552B1 (ko) 1990-08-03 1999-08-02 디. 꼬쉬 유전자 발현 억제용 화합물 및 방법
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
US5596086A (en) 1990-09-20 1997-01-21 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages having one nitrogen and two carbon atoms
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ATE198598T1 (de) 1990-11-08 2001-01-15 Hybridon Inc Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5837484A (en) 1993-11-09 1998-11-17 Medical College Of Ohio Stable cell lines capable of expressing the adeno-associated virus replication gene
CA2176117C (en) 1993-11-09 2006-01-03 Terence R. Flotte Generation of high titers of recombinant aav vectors
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
WO1996001064A1 (fr) 1994-07-01 1996-01-18 Tornare Francois Canne multi-longueurs
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
US6143548A (en) 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
EP0850313B8 (en) 1995-09-08 2009-07-29 Genzyme Corporation Improved aav vectors for gene therapy
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
DK1009808T3 (da) 1997-09-05 2013-01-21 Genzyme Corp Fremgangsmåder til generering af hjælper-frie præparater af rekombinante aav-vektorer med høj titer
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
WO2001083692A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20110023144A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in amyotrophyic lateral sclerosis disease
US9209196B2 (en) 2011-11-30 2015-12-08 Sharp Kabushiki Kaisha Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device
MX362866B (es) 2012-05-25 2019-02-20 Univ California Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn.
EP3434776A1 (en) * 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US10508289B2 (en) * 2013-10-25 2019-12-17 Cellectis Rare-cutting endonucleases for efficient and specific targeting DNA sequences comprising highly repetitive motives
MX2016007325A (es) * 2013-12-12 2017-07-19 Broad Inst Inc Composiciones y metodos de uso de sistemas crispr-cas en desordenes debidos a repeticion de nucleotidos.
JP6202701B2 (ja) 2014-03-21 2017-09-27 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及びプログラム
WO2015153760A2 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a nervous system disorder
US11254933B2 (en) * 2014-07-14 2022-02-22 The Regents Of The University Of California CRISPR/Cas transcriptional modulation
ES2784360T3 (es) * 2015-05-29 2020-09-24 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen una interrupción en un locus C9ORF72
WO2016210372A2 (en) * 2015-06-25 2016-12-29 University Of Southern California Methods to treat neurological diseases
MX2019003745A (es) * 2016-09-30 2019-12-11 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen una expansion de repeticiones de hexanucleotidos en un locus c9orf72.

Also Published As

Publication number Publication date
CN109312339B (zh) 2022-01-28
WO2017109757A1 (en) 2017-06-29
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JP2018538002A (ja) 2018-12-27
CN109312339A (zh) 2019-02-05
BR112018012894A2 (pt) 2018-12-04
EP3394260B1 (en) 2021-02-17
JP6947729B2 (ja) 2021-10-13
MX2018007840A (es) 2019-05-02
EP3394260A1 (en) 2018-10-31
CA3009308A1 (en) 2017-06-29

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