JP2020508659A - プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ｐｃｓｋ９）関連障害の処置のための組成物および方法 - Google Patents

プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ｐｃｓｋ９）関連障害の処置のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本出願は、ｅｘ ｖｉｖｏであるかｉｎ ｖｉｖｏであるかにかかわらず、ＰＣＳＫ９と関連する１つまたは複数の状態を有する患者を処置するための材料および方法を提示する。加えて、本出願は、ゲノム編集によって、細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を編集および／または調節するための材料および方法を提示する。ゲノム編集によって、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失、または突然変異を導入し、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することによって、ゲノムへの恒久的な変化を創出するための、細胞のｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏ方法が本明細書に提示される。

Description

関連出願
本出願は、２０１７年２月２２日に出願された米国仮出願番号第６２／４６１，８５２号、および２０１７年６月２９日に出願された米国仮出願番号第６２／５２６，６４６号に基づく優先権および利益を主張しており、これら仮出願の各々の内容は、それらの全体が本明細書によって援用される。
配列表
本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。「ＣＲＩＳ−０１７＿００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の配列表のファイルは、２０１８年２月８日に作成されたものであり、サイズが１６．９ＭＢである。電子形式の配列表内の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
分野
本発明は、遺伝子編集の分野に関し、具体的には、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子の変更に関する。
背景
ゲノム操作とは、生物の遺伝子情報（ゲノム）の、ターゲティングされた特異的修飾のための戦略および技法を指す。ゲノム操作は、特に、ヒトの健康の領域における、可能な適用範囲の広さのため、極めて活発な研究領域である。例えば、ゲノム操作は、有害な突然変異を有する遺伝子を変更（例えば、矯正もしくはノックアウト）するため、または遺伝子の機能を探索するために、使用することができる。トランス遺伝子を生細胞へと挿入するために開発された初期の技術は、ゲノムへの新たな配列の挿入のランダムな性質により、制限されることが多かった。ゲノムへのランダムな挿入は、隣接する遺伝子の正常な制御の破壊を引き起こし、重度の望ましくない効果を生じる可能性がある。さらに、ランダムな組込み技術では、２つの異なる細胞において配列が同じ場所に挿入される保証がなかったため、再現性がほとんど得られない。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、およびＭｅｇａＴＡＬなど、近年のゲノム操作戦略では、ＤＮＡの特定の領域を修飾することが可能であり、それによって、初期の技術と比較して、変更の精度が高くなっている。これらの新しいプラットフォームは、より高い度合いの再現性を提供するが、依然として制限を有する。
遺伝的障害に対処しようと試みている世界中の研究者および医療従事者による努力にもかかわらず、またゲノム操作法の将来性にもかかわらず、ＰＣＳＫ９関連の兆候が関与する安全かつ有効な処置を開発する火急の必要性が依然として残っている。
１回の処置でＰＣＳＫ９関連の障害または状態に対処することができる、ゲノムへの恒久的な変化を創出するゲノム操作ツールを使用することによって、結果として得られる治療法は、ある特定のＰＣＳＫ９関連の兆候および／または疾患を完全に寛解させることができる。
要旨
ゲノム編集によって、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失、または突然変異を導入し、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することによって、ゲノムへの恒久的な変化を創出するための、細胞のｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏ方法が、本明細書に提示され、この方法は、ＰＣＳＫ９関連の状態または障害、例えば、脂質異常症を処置するために使用することができる。そのような方法を実施するための構成要素および組成物、ならびにベクターもまた、本明細書に提示される。
ゲノム編集によって、細胞内のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子を編集するための方法であって、細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除するステップを含む、方法が、本明細書に提示される。
ＰＣＳＫ９関連の状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、肝細胞を患者から単離するステップと、肝細胞のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集するステップと、ゲノム編集した肝細胞を患者へと植え込むステップとを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
一部の態様では、編集するステップは、肝細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む。
ＰＣＳＫ９関連の状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと、ｉＰＳＣのプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集するステップと、ゲノム編集したｉＰＳＣを肝細胞へと分化させるステップと、肝細胞を患者へと植え込むステップとを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
一部の態様では、編集するステップは、ｉＰＳＣへと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む。
ＰＣＳＫ９関連の状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、間葉幹細胞を患者から単離するステップと、間葉幹細胞のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集するステップと、ゲノム編集した間葉幹細胞を肝細胞へと分化させるステップと、肝細胞を患者へと植え込むステップとを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
一部の態様では、編集するステップは、間葉幹細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む。
ＰＣＳＫ９関連の障害を有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、患者の細胞内のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子を編集するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。一部の態様では、編集するステップは、細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む。一部の態様では、細胞は、肝細胞である。一部の態様では、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによって、肝細胞へと送達される。
細胞内のＰＣＳＫ９遺伝子の連続的なゲノム配列を変更する方法であって、細胞を、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと接触させて、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすことを含む、方法もまた、本明細書に提示される。一部の態様では、連続的なゲノム配列の変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子の１つまたは複数のエクソンに生じる。
一部の態様では、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、配列番号１〜６２０に列挙されるもののうちのいずれか、および配列番号１〜６２０に列挙されるもののうちのいずれかに対して少なくとも７０％の相同性を有する変異体から選択される。
一部の態様では、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドである。一部の態様では、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドである。一部の態様では、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の態様では、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）は、１つまたは複数の化学修飾されたＲＮＡである。一部の態様では、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）は、コーディング領域において化学修飾されている。一部の態様では、１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）は、コドン最適化されている。
一部の態様では、本方法は、細胞へと、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡを導入することをさらに含む。一部の態様では、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡは、ＰＣＳＫ９遺伝子のコーディング配列のセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む。一部の態様では、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡは、化学修飾されている。
一部の態様では、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとあらかじめ複合体化されている。一部の態様では、あらかじめ複合体化させることは、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡの、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼへの共有結合を含む。
一部の態様では、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に製剤化される。一部の態様では、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡも含むリポソームまたは脂質ナノ粒子中に製剤化される。
一部の態様では、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、ＡＡＶベクター粒子においてコードされ、ＡＡＶベクターの血清型は、表４および５に列挙されるものから選択される。一部の態様では、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡは、ＡＡＶベクター粒子においてコードされ、ＡＡＶベクターの血清型は、表４および５に列挙されるものから選択される。一部の態様では、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡもコードするＡＡＶベクター粒子においてコードされ、ＡＡＶベクターの血清型は、表４および５に列挙されるものから選択される。
配列番号５，３０５〜２８，６９６のうちのいずれかに対応するＲＮＡ配列であるスペーサー配列を少なくとも含む、単一分子ガイドポリヌクレオチドもまた、本明細書に提示される。一部の態様では、単一分子ガイドポリヌクレオチドは、スペーサー伸長領域をさらに含む。一部の態様では、単一分子ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長領域をさらに含む。一部の態様では、単一分子ガイドポリヌクレオチドは、化学修飾されている。
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドと、本明細書に記載される少なくとも１つの単一分子ガイドポリヌクレオチドとを含む、非天然のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系もまた、本明細書に提示される。一部の態様では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３ Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１、ならびにこれらの酵素に対して少なくとも７０％の相同性を有する変異体から選択される。一部の態様では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。一部の態様では、少なくとも１つのＮＬＳは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドのアミノ末端にあるかまたはアミノ末端から５０アミノ酸以内にある、および／または少なくとも１つのＮＬＳは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドのカルボキシ末端にあるかまたはカルボキシ末端から５０アミノ酸以内にある。一部の態様では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドは、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。
本明細書に記載される単一分子ガイドポリヌクレオチドをコードするＤＮＡもまた、本明細書に提示される。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするＤＮＡもまた、本明細書に提示される。
単一分子ガイドポリヌクレオチドをコードするＤＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む、ベクターもまた、本明細書に提示される。一部の態様では、ベクターは、プラスミドである。一部の態様では、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子であり、ここで、ＡＡＶベクターの血清型は、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に列挙されるものから選択される。
本明細書で開示し、説明する材料および方法の様々な態様は、付属の図面を参照して、より良く理解することができる。
図１Ａ〜Ｂは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。図１Ａは、ｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の図解である。図１Ｂは、ｓｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の別の図解である。
図２、３、および４は、ＰＣＳＫ９遺伝子をターゲティングする、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を伴うｇＲＮＡの切断効率を示す。
図２、３、および４は、ＰＣＳＫ９遺伝子をターゲティングする、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を伴うｇＲＮＡの切断効率を示す。
図２、３、および４は、ＰＣＳＫ９遺伝子をターゲティングする、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を伴うｇＲＮＡの切断効率を示す。
図５は、ＨｕＨ７細胞におけるＰＣＳＫ９をターゲティングするｇＲＮＡの切断効率を示す。
図６Ａおよび６Ｂは、ブタ、サル、およびヒトから単離したヒト初代肝細胞における、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｇＲＮＡの切断効率を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ブタ、サル、およびヒトから単離したヒト初代肝細胞における、ＰＣＳＫ９をターゲティングするｇＲＮＡの切断効率を示す。
図７Ａは、初代肝細胞におけるＰＣＳＫ９をターゲティングするｇＲＮＡの切断効率を示す。
図７Ｂは、初代肝細胞におけるＣ３をターゲティングするｇＲＮＡの切断効率を示す。
図７Ｃは、初代肝細胞におけるＰＣＳＫ９タンパク質の分泌に対する、ｇＲＮＡによる遺伝子編集の効果を示す。
配列表の簡単な説明
配列番号１〜６２０は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ配列である。
配列番号６２１〜６３１は、意図的にブランクである。
配列番号６３２〜４，７１５は、マイクロＲＮＡ配列である。
配列番号４，７１６〜４，７３３は、意図的にブランクである。
配列番号４，７３４〜５，３０２は、ＡＡＶ血清型配列である。
配列番号５，３０３は、ＰＣＳＫ９ヌクレオチド配列である。
配列番号５，３０４は、ＰＣＳＫ９遺伝子の上流および／または下流の１〜５キロ塩基対を含む、遺伝子配列である。
配列番号５，３０５〜５，３６５は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５，３６６〜５，５４５は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５，５４６〜６，５７９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号６，５８０〜７，２６９は、Ｎ．Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号７，２７０〜１８，７９１は、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号１８，７９２〜２８，６９６は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ Ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼにより、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２２ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号２８，６９７〜２８，７２６は、意図的にブランクである。
配列番号２８，７２７は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの試料のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
配列番号２８，７２８〜２８７３０は、試料のｓｇＲＮＡ配列を示す。
発明の詳細な説明
Ｉ．序説
ゲノム編集
本発明は、生物の遺伝子情報（ゲノム）のターゲティングされた特異的変更のための戦略および技法を提供する。本明細書において使用されるとき、「変更」または「遺伝子情報の変更」という用語は、細胞のゲノムにおける任意の変化を指す。遺伝的障害を処置する文脈で、変更には、挿入、欠失、および矯正が含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書において使用されるとき、「挿入」という用語は、ＤＮＡ配列における１つまたは複数のヌクレオチドの付加を指す。挿入は、数個のヌクレオチドの小規模な挿入から、大きなセグメント、例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子の挿入までの範囲に及び得る。「欠失」という用語は、ＤＮＡ配列における１つもしくは複数のヌクレオチドの喪失もしくは除去、または遺伝子の機能の喪失もしくは除去を指す。一部の事例では、欠失は、例えば、数個のヌクレオチド、エクソン、イントロン、遺伝子セグメント、または遺伝子の配列全体の喪失を含み得る。一部の事例では、遺伝子の欠失は、遺伝子またはその遺伝子産物の機能または発現の排除または低減を指す。これは、遺伝子内またはその近傍の配列の欠失だけでなく、その遺伝子の発現を破壊する他の事象（例えば、挿入、ナンセンス突然変異）によっても生じ得る。「矯正」という用語は、本明細書において使用されるとき、挿入によってか、欠失によってか、または置換によってかにかかわらず、細胞内のゲノムの１つまたは複数のヌクレオチドの変化を指す。そのような矯正は、構造か機能かにかかわらず、矯正されたゲノム部位に、より好ましい遺伝子型または表現型の結果をもたらし得る。「矯正」の１つの非限定的な例としては、遺伝子またはその遺伝子産物の構造または機能を回復させる、突然変異体または欠陥のある配列の野生型配列への矯正が挙げられる。突然変異の性質に応じて、矯正は、本明細書に開示される様々な戦略を介して達成することができる。１つの非限定的な例では、ミスセンス突然変異が、突然変異を含む領域を、その野生型対応物と置き換えることによって、矯正され得る。別の例として、遺伝子における重複突然変異（例えば、反復増殖）を、余分な配列を除去することによって、矯正することができる。
一部の態様では、変更には、遺伝子のノックイン、ノックアウト、またはノックダウンが含まれ得る。本明細書において使用されるとき、「ノックイン」という用語は、ゲノムへのＤＮＡ配列またはその断片の付加を指す。ノックインしようとするそのようなＤＮＡ配列としては、遺伝子全体または複数の遺伝子を挙げることができ、遺伝子と関連する制御配列、または前述のものの任意の部分もしくは断片を挙げることができる。例えば、野生型タンパク質をコードするｃＤＮＡを、突然変異体遺伝子を有する細胞のゲノムに挿入することができる。ノックイン戦略は、欠陥のある遺伝子を、全体的または部分的に置き換えることを必要とするものではない。一部の事例では、ノックイン戦略は、既存の配列と提供される配列との置換、例えば、突然変異体対立遺伝子と野生型コピーとの置換をさらに含んでもよい。対照的に、「ノックアウト」という用語は、遺伝子または遺伝子の発現の排除を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊を生じる、ヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによって、ノックアウトすることができる。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係な配列と置き換えることによって、ノックアウトすることができる。最後に、「ノックダウン」という用語は、本明細書において使用されるとき、遺伝子またはその遺伝子産物の発現の低減を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性もしくは機能が軽減され得るか、またはタンパク質のレベルが、低減もしくは排除され得る。
ゲノム編集とは一般に、ゲノムのヌクレオチド配列を、好ましくは、精密なまたは所定の方式で修飾する工程を指す。本明細書で記載されるゲノム編集法の例は、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、ゲノム内の正確な標的位置で切断し、これにより、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を、ゲノム内の特定の位置において創出する方法を含む。このような切断は、最近、Coxら、Nature Medicine、２１巻（２号）、１２１〜３１頁（２０１５年）において総説された通り、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）など、天然の内因性細胞過程により修復することが可能であり、規則的に修復されている。これらの２つの主要なＤＮＡ修復プロセスは、代替的な経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接接合させるが、場合によって、ヌクレオチド配列の喪失または付加であって、遺伝子発現を破壊する場合もあり、増強する場合もある、喪失または付加を伴う。ＨＤＲは、相同配列またはドナー配列を、規定されたＤＮＡ配列を切断点に挿入するための鋳型として利用する。相同配列は、姉妹染色分体など、内因性ゲノム内に存在しうる。代替的に、ドナーは、ヌクレアーゼにより切断されるローカスとの相同性が大きな領域を有するが、切断された標的ローカスへと組み込まれうる欠失を含む、さらなる配列または配列変化も含有しうる、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルスなどの外因性核酸でありうる。第３の修復機構は、「代替的ＮＨＥＪ」ともまた称する、マイクロ相同性媒介型末端結合（ＭＭＥＪ）であって、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じうるという点で、遺伝子結果がＮＨＥＪと同様である、ＭＭＥＪでありうる。ＭＭＥＪは、より好適な、ＤＮＡ末端の接合による修復結果を駆動するように、ＤＮＡ切断部位を挟む、少数の塩基対による相同配列を使用することができ、最近の報告は、この工程の分子機構についてさらに解明している（例えば、ChoおよびGreenberg、Nature、５１８巻、１７４〜７６頁（２０１５年）；Kentら、Nature Structural and Molecular Biology、Ａｄｖ．Ｏｎｌｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２９６１（２０１５年）；Mateos-Gomezら、Nature、５１８巻、２５４〜５７頁（２０１５年）；Ceccaldiら、Nature、５２８巻、２５８〜６２頁（２０１５年）を参照されたい）。一部の場合には、ＤＮＡ切断部位における潜在的なマイクロ相同性についての解析に基づき、可能性が高い修復結果を予測することが可能でありうる。
これらのゲノム編集機構の各々を使用して、所望のゲノムの変更を創出することができる。ゲノム編集工程内のステップは、意図される突然変異部位の近傍にまで近接した、標的ローカス内で、１つのＤＮＡ切断、または２つのＤＮＡ切断であって、二本鎖切断または２つの一本鎖切断としての２つのＤＮＡ切断を創出することでありうる。これは、本明細書で記載および例示される通り、部位特異的ポリペプチドの使用を介して達成することができる。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ系
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ゲノムローカスは、多くの原核生物（例えば、細菌および古細菌）のゲノム内で見出すことができる。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲローカスは、原核生物を、ウイルスおよびファージなど、外来の侵入者に対して防御する一助となる、ある種の免疫系として機能する産物をコードする。ＣＲＩＳＰＲローカスの機能の３つの段階：新たな配列の、ＣＲＩＳＰＲローカスへの組込み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、および外来の侵入者核酸のサイレンシングが存在する。５種類のＣＲＩＳＰＲ系（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、およびＶ型）が同定されている。
ＣＲＩＳＰＲローカスは、「リピート」と称する、いくつかの短い反復配列を含む。発現すると、リピートは、二次構造（例えば、ヘアピン）を形成する場合もあり、かつ／または非構造化一本鎖配列を構成する場合もある。リピートは通例、クラスターで生じ、種間で顕著に異なることが多い。リピートは、「スペーサー」と称する固有の介在配列で規則的に隔てられる結果として、リピート−スペーサー−リピートローカスアーキテクチャーをもたらす。スペーサーは、既知の外来インベーダー配列と同一であるか、またはこれと高度な相同性を有する。スペーサー−リピート単位は、スペーサー−リピート単位の成熟形態へとプロセシングされる、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする。ｃｒＲＮＡは、標的核酸のターゲティングに関与する、「シード」またはスペーサー配列（原核生物における天然に存在する形態では、スペーサー配列は、外来のインベーダー核酸をターゲティングする）を含む。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。
ＣＲＩＳＰＲローカスはまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列も含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物におけるｃｒＲＮＡ機能の生合成および干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。一部のＣａｓ遺伝子は、相同な二次および／または三次構造を含む。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系
天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系におけるｃｒＲＮＡの生合成は、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を必要とする。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の非限定的な例は、図１Ａおよび１Ｂに示される。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性ＲＮアーゼＩＩＩにより修飾され、次いで、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ内のｃｒＲＮＡリピートとハイブリダイズすることができる。内因性ＲＮアーゼＩＩＩを動員して、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを切断することができる。切断されたｃｒＲＮＡを、エクソリボヌクレアーゼによるトリミング（例えば、５’トリミング）にかけて、成熟ｃｒＲＮＡ形態をもたらすことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡを、さらに、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせたままにすることができ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、複合体を、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズしうる標的核酸へとガイドしうる。ｃｒＲＮＡの、標的核酸とのハイブリダイゼーションは、Ｃａｓ９を、ターゲティングされた核酸切断のために活性化させうる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系内の標的核酸を、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する。天然では、ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の、標的核酸への結合を容易とするのに不可欠である。ＩＩ型系（また、ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも称する）は、ＩＩ−Ａ型（ＣＡＳＳ４）およびＩＩ−Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）へとさらに細分することができる。Jinekら、Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁（２０１２年）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が、ＲＮＡによりプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号は、部位特異的遺伝子編集のための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の多数の例および適用を提示する。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型系との、いくつかの重要な差違を有する。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型系とは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く、単一のＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼである。実際、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらにトランス活性化させる要件なしに、成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされうる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、各成熟ｃｒＲＮＡが、１９ヌクレオチドのダイレクトリピートで始まり、２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列を後続させる、４２〜４４ヌクレオチドの長さの短い成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされうる。これに対し、ＩＩ型系における成熟ｃｒＲＮＡは、２０〜２４ヌクレオチドのスペーサー配列で始まり、約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートを後続させうる。また、Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体が、短いＴリッチＰＡＭを先行させる標的ＤＮＡを効率的に切断するように、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用するが、これは、ＩＩ型系についての標的ＤＮＡが、ＧリッチＰＡＭを後続させるのと対照的である。したがって、Ｖ型系が、ＰＡＭから遠い点で切断するのに対し、ＩＩ型系は、ＰＡＭと隣接する点で切断する。加えて、ＩＩ型系とは対照的に、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドの５’突出を伴う、ずれた位置でのＤＮＡの二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。ＩＩ型系は、平滑末端型二本鎖切断を介して切断する。ＩＩ型系と同様に、Ｃｐｆ１は、予測されるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠き、これは、ＩＩ型系と対照的である。
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチドおよびプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Fonfaraら、Nucleic Acids Research、４２巻：２５７７〜２５９０頁（２０１４年）において公開されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子を名乗る系は、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、広範にわたり書き換えられている。Fonfaraらはまた、多様な種に由来するＣａｓ９ポリペプチドのＰＡＭ配列を提示する（配列番号１〜６２０もまた参照のこと）。
ＩＩ．本発明の組成物および方法
ゲノム操作ツールを使用して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列を欠失または突然変異させることによって、ゲノムに恒久的な変化を創出するための、細胞の、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ方法が、本明細書に提示される。そのような方法は、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼを使用して、ＰＣＳＫ９遺伝子のゲノムローカスまたはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で恒久的に編集する。このようにして、本開示に記載される例は、単回の処置により（患者の寿命にわたり見込みのある治療を施すのではなく）ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を低減または排除するのを補助することができる。
部位特異的ポリペプチド（エンドヌクレアーゼ、酵素）
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するためにゲノム編集において使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドは、細胞または患者へと、１つまたは複数のポリペプチドとして投与することもでき、ポリペプチドをコードする１つまたは複数のｍＲＮＡとして投与することもできる。配列番号１〜６２０に列挙されているかまたは本明細書に開示されている酵素またはオルソログのうちのいずれかを、本明細書の方法において利用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の文脈では、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合することが可能であり、ガイドＲＮＡは、ポリペプチドが導かれる標的ＤＮＡ内の部位を指定する。本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系では、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼでありうる。
部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含みうる。２つまたはこれを超える核酸切断ドメインは、リンカーを介して、併せて連結することができる。例えば、リンカーは、可撓性リンカーを含みうる。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、またはこれを超えるアミノ酸の長さを含みうる。
天然に存在する野生型のＣａｓ９酵素は、２つのヌクレアーゼドメインである、ＨＮＨヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣドメインを含む。本明細書において、用語「Ｃａｓ９」とは、天然に存在するＣａｓ９および組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で想定されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、および／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含みうる。
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様フォールドを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つのアンチパラレルのβ鎖およびα螺旋を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様
ドメインは、金属結合性部位（例えば、二価カチオン結合性部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸（例えば、ｃｒＲＮＡによりターゲティングされる鎖の相補鎖）の１つの鎖を切断しうる。
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮアーゼＨまたはＲＮアーゼＨ様フォールドを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨドメインは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に対する作用を含む核酸ベースの機能の多様なセットに関与する。ＲＮアーゼＨドメインは、複数のα螺旋により取り囲まれた、５つのβ鎖を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、金属結合性部位（例えば、二価カチオン結合性部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、標的核酸（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）の１つの鎖を切断しうる。
部位特異的ポリペプチドは、二本鎖切断または一本鎖切断を、核酸内、例えば、ゲノムＤＮＡ内に導入しうる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存型修復（ＨＤＲ）あるいはＮＨＥＪまたは代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）もしくはマイクロ相同性媒介型末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激しうる。ＮＨＥＪは、相同鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復しうる。これは、場合によって、標的核酸内の切断部位において、小規模の欠失または挿入（インデル）をもたらす可能性があり、遺伝子発現の破壊または変更をもたらしうる。ＨＤＲは、相同な修復鋳型またはドナーが利用可能である場合に生じうる。相同なドナー鋳型は、標的核酸切断部位を挟む配列と相同である配列を含みうる。姉妹染色分体は、細胞により、修復鋳型として使用されうる。しかし、ゲノム編集の目的では、修復鋳型は、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはウイルス核酸などの外因性核酸として供給することができる。さらなるまたは変更された核酸配列もまた、標的ローカスへと組み込まれるように、外因性ドナー鋳型と共に、さらなる核酸配列（トランス遺伝子など）または修飾（単一または複数の塩基変化または欠失など）を、相同性のフランキング領域の間に導入することができる。ＭＭＥＪは、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じうるという点で、ＮＨＥＪと同様な遺伝子結果をもたらしうる。ＭＭＥＪは、好適な、末端接合によるＤＮＡ修復結果を駆動するように、切断部位を挟む、少数の塩基対による相同配列を使用しうる。一部の場合には、ヌクレアーゼ標的領域内の潜在的なマイクロ相同性についての解析に基づき、可能性が高い修復結果を予測することが可能でありうる。
したがって、場合によって、相同組換えを使用して、外因性ポリヌクレオチド配列を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。本明細書では、外因性ポリヌクレオチド配列を、「ドナーポリヌクレオチド」（またはドナーもしくはドナー配列）と称する。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位において、天然には存在しない配列でありうる。
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、突然変異、欠失、変更、組込み、遺伝子の矯正、遺伝子の置きかえ、遺伝子のタグ付け、トランス遺伝子の挿入、ヌクレオチドの欠失、遺伝子の破壊、転座、および／または遺伝子の突然変異をもたらしうる。ゲノムＤＮＡを欠失させ、非天然核酸を、ゲノムＤＮＡへと組み込む工程は、ゲノム編集の例である。
部位特異的ポリペプチドは、例示的な、野生型の部位特異的ポリペプチド［例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９；ＵＳ２０１４／００６８７９７における配列番号８；またはSapranauskasら、Nucleic Acids Res、３９巻（２１号）：９２７５〜９２８２頁（２０１１年）］、および多様な他の部位特異的ポリペプチドに対する、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態を含みうる。例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減する突然変異を含みうる。例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、例示的な野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）の核酸切断活性のうちの、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有しうる。部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、実質的な核酸切断活性を有さない場合がある。部位特異的ポリペプチドが、実質的な核酸切断活性を有さない修飾形態である場合、本明細書では、「酵素的に不活性」と称する。
部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、それが、標的核酸上の一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導しうる（例えば、二本鎖標的核酸の糖−リン酸骨格のうちの１つだけを切断することにより）ように、突然変異を含みうる。一部の態様では、突然変異は、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）の複数の核酸切断ドメインのうちの１または複数における核酸切断活性のうちの、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満をもたらしうる。一部の態様では、突然変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力は低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１または複数をもたらしうる。突然変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力は低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１または複数をもたらしうる。例えば、例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基、例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６を突然変異させて、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１または複数を不活化する。突然変異させるべき残基は、例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６（例えば、配列および／または構造アライメントにより決定される）に対応しうる。突然変異の非限定的な例は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａを含む。当業者は、アラニン置換以外の突然変異が適しうることを認識しうる。
一部の態様では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｈ８４０Ａ突然変異を、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５４Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５６Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドを、「ニッカーゼ」と称する。
ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体を使用して、ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるゲノム編集の特異性を増大させることができる。野生型のＣａｓ９は、標的配列（内因性のゲノムローカスなど）内の、指定された約２０ヌクレオチドの配列とハイブリダイズするようにデザインされた、単一のガイドＲＮＡによりガイドされることが典型的である。しかし、ガイドＲＮＡと標的ローカスとのいくつかのミスマッチが許容される可能性があり、標的部位内で要求される相同性の長さを、例えば、たった１３ｎｔの相同性まで効果的に低減し、これにより、標的ゲノム内の他の場所で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による、結合および二本鎖核酸切断（オフ標的切断としてもまた公知である）の潜在的可能性の上昇をもたらす。Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体は各々、１つの鎖だけを切断するため、二本鎖切断を創出するためには、１対のニッカーゼが、近接して、かつ、標的核酸の逆鎖上で結合し、これにより、二本鎖切断の同等物である、１対のニックを創出することが必要である。これは、２つの別個のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼにつき１つずつ）が、近接して、かつ、標的核酸の逆鎖上で結合しなければならないことを要求する。この要件は本質的に、二本鎖切断が生じるために必要とされる、最小の相同性の長さを二倍にし、これにより、２つのガイドＲＮＡ部位（存在する場合）が、二本鎖切断の形成を可能とするのに十分な程度に、互いと近接する可能性が低い場合に、二本鎖切断イベントが、ゲノム内の別の場所で生じる可能性を低減する。当技術分野で記載される通り、ニッカーゼはまた、ＨＤＲを、ＮＨＥＪと対比して促進するのにも使用することができる。ＨＤＲを使用して、所望の変化を効果的に媒介する特異的ドナー配列の使用を介して、選択された変化を、ゲノム内の標的部位へと導入することができる。遺伝子編集における使用のための、多様なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系についての記載は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号；およびNature Biotechnology、３２巻、３４７〜３５５頁（２０１４年）；ならびにこれらにおいて引用されて
いる参考文献において見出すことができる。
想定される突然変異は、置換、付加、および欠失、またはこれらの任意の組合せを含みうる。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、アラニンへと転換する。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、またはアルギニン）へと転換する。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）へと転換する。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、アミノ酸模倣体（例えば、リン酸化模倣体）へと転換する。突然変異は、保存的突然変異でありうる。例えば、突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、サイズ、形状、電荷、極性、コンフォメーションが相似するアミノ酸、および／または突然変異させるアミノ酸のロタマー（例えば、システイン／セリン突然変異、リシン／アスパラギン突然変異、ヒスチジン／フェニルアラニン突然変異）へと転換する。突然変異は、リーディングフレームのシフトおよび／または早期終止コドンの創出を引き起こしうる。突然変異は、遺伝子の調節的領域、または１もしくは複数の遺伝子の発現に影響を及ぼすローカスへの変化を引き起こしうる。
部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性の部位特異的ポリペプチド）は、核酸をターゲティングしうる。部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＤＮＡをターゲティングしうる。部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡをターゲティングしうる。
部位特異的ポリペプチドは、１または複数の非天然配列（例えば、部位特異的ポリペプチドは、融合タンパク質である）を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、核酸結合性ドメイン、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメインに対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、核酸切断ドメインの一方または両方は、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９に由来するヌクレアーゼドメインに対する、少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含む。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および部位特異的ポリペプチドを、非天然配列へと連結する、非天然配列（例えば、核局在化シグナル）またはリンカーに対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインの一方または両方における突然変異であって、ヌクレアーゼドメインの切断活性を、少なくとも５０％低減する突然変異を含む。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、ヌクレアーゼドメインのうちの１つは、アスパラギン酸１０の突然変異を含み、かつ／またはヌクレアーゼドメインのうちの１つは、ヒスチジン８４０の突然変異を含むことが可能であり、突然変異は、ヌクレアーゼドメインの切断活性を、少なくとも５０％低減する。
１または複数の部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的ローカスにおいて、１つの二本鎖切断を併せて生じさせる２つのニッカーゼ、またはゲノム内の特異的ローカスにおいて、２つの二本鎖切断を併せて生じさせるかまたは引き起こす４つのニッカーゼを含みうる。代替的に、１つの部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的ローカスにおいて、１つの二本鎖切断を生じさせうるかまたは引き起こしうる。
他の細菌株に由来するＣａｓ９オルソログの非限定的な例としては、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ ＭＢＩＣ１１０１７；Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ ＤＳＭ ５５０１；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ ＡＴＣＣ ２３２７０；Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＬＡＡ１；Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＤＳＭ ４４６；Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ ＤＳＭ １８０；Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ ＫＣ４；Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９４１３；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ ＣＳ−３２８；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｓｔｒ．Ｐａｒａｃａ；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＰＣＣ ８００５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ ＤＳＭ １２４４２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＭＬＳ１０；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿１＿４７；Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ ＤＳＭ ６７２５；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ ａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ ＭＰ１０４Ｃ；Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ＿１０８；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈａｇｅ ｃ−ｓｔ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ３ ｓｔｒ．Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂａ４ ｓｔｒ．６５７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＱＣＤ−６３ｑ４２；Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ ＷＨ ８５０１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＡＴＣＣ ５１１４２；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＣＣＹ０１１０；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７４２４；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７８２２；Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ ２５５−１５；Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ＡＴＣＣ ２９３２８；Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ ＤＳＭ ４４９６３；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＰＢ２００３／０４４−Ｔ３−４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ １１７４１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ；Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．ＰＣＣ ８１０６；Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＥＬＢ１７；Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ Ｚ−７３０３；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｐｈａｇｅ Ｍａ−ＬＭＭ０１；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＩＥＳ−８４３；Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ ＡＴＣＣ ２３１３４；Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ ＰＣＣ ７４２０；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ Ｎｃ４；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ＤＳＭ ４３１１１；Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ ＣＣＹ９４１４；Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０；Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．ＰＣＣ ６５０６；Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ＿ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ＿ＳＩ；Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ ＳＪ９５；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ ＣＪ２；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＪＳ６６６；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ ＴＡＣ１２５；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２５４８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２５４８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ４０７３６；Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＤＳＭ ４３０２１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７３３５；およびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＴＣＦ５２Ｂにおいて同定されるＣａｓタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない（Chylinskiら、RNA Biol.、２０１３年、１０巻（５号）：７２６〜７３７頁）。
Ｃａｓ９オルソログに加えて、他のＣａｓ９変異体、例えば、不活性ｄＣａｓ９および異なる機能を有するエフェクタードメインの融合タンパク質は、遺伝子調節のプラットフォームとしての機能を果たし得る。前述の酵素のうちのいずれも、本開示において有用であり得る。
本発明において利用され得るエンドヌクレアーゼのさらなる例を、配列番号１〜６２０に示す。これらのタンパク質は、使用前に修飾されてもよく、または核酸配列、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡにおいて、またはベクター構築物、例えば、本明細書において教示されるプラスミドもしくはＡＡＶベクター内にコードされてもよい。さらに、これらは、コドン最適化されていてもよい。
配列番号１〜６２０は、エンドヌクレアーゼ配列の非排他的なリストを開示する。
ゲノムターゲティング核酸
本開示は、会合させたポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を、標的核酸内の特異的標的配列へと導きうるゲノムターゲティング核酸を提示する。ゲノムターゲティング核酸は、ＲＮＡでありうる。本明細書では、ゲノムターゲティングＲＮＡを、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と称する。ガイドＲＮＡは、少なくとも目的の標的核酸配列とハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とを含みうる。ＩＩ型系では、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲリピート配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、互いとハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。いずれの系でも、ガイドＲＮＡと、部位特異的ポリペプチドとが、複合体を形成するように、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合しうる。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合により、複合体に、標的特異性をもたらしうる。したがって、ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を導きうる。
例示的なガイドＲＮＡは、１５〜２００塩基のスペーサー配列を含み、ここで、ゲノム位置は、ＧＲＣｈ３８ヒトゲノムアセンブリーに基づく。例示的なガイドＲＮＡは、配列番号５，３０５〜２８，６９６に提示されるＤＮＡ配列のＲＮＡバージョンに基づくスペーサー配列を含む。当業者には理解されるように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノムの標的配列と相補的なスペーサー配列を含むようにデザインすることができる。例えば、スペーサー配列のそれぞれ、例えば、配列番号５，３０５〜２８，６９６に提示されるＤＮＡ配列のＲＮＡバージョンは、単一のＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡ（対応するｔｒａｃｒＲＮＡとともに）へとまとめることができる。Jinekら、Science、３３７巻、８１６〜８２１頁（２０１２年）、およびDeltchevaら、Nature、４７１巻、６０２〜６０７頁（２０１１年）を参照されたい。
ゲノムターゲティング核酸は、二重分子ガイドＲＮＡでありうる。ゲノムターゲティング核酸は、単一分子ガイドＲＮＡでありうる。
二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２つの鎖を含みうる。第１の鎖は、５’〜３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、および最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含みうる。
ＩＩ型系内の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’〜３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含みうる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡの、さらなる機能性（例えば、安定性）に寄与するエレメントを含みうる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成しうる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１または複数のヘアピンを含みうる。
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２０ヌクレオチドを上回るスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１７〜３０ヌクレオチドで長さが可変のスペーサー配列を含み得る（表１を参照されたい）。
ｓｇＲＮＡは、表１の配列番号２８，７２９など、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まなくてもよい。ｓｇＲＮＡは、表１の配列番号２８，７３０など、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、１つまたは複数のウラシルを含んでもよい。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、１つのウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、２つのウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、３つのウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、４つのウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、５つのウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、６つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、７つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、８つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。
ｓｇＲＮＡは、修飾されていなくてもよく、または修飾されていてもよい。例えば、修飾されたｓｇＲＮＡは、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
Ｖ型系内の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’〜３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列およびスペーサー配列を含みうる。
例示を目的として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系において使用されるガイドＲＮＡ、または他のより低分子のＲＮＡは、下記で例示され、当技術分野で記載される通り、化学的手段によりたやすく合成することができる。化学合成手順が、持続的に拡大しつつある一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；ＰＡＧＥなど、ゲルの使用を回避する）などの手順による、このようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が、１００ほどのヌクレオチドを優に超えて増大するにつれて、難しくなる傾向がある。より長いＲＮＡを作出するために使用される１つの手法は、併せてライゲーションされる、２つまたはこれを超える分子を作製することである。Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなど、はるかに長いＲＮＡは、酵素により、よりたやすく作出される。多様な種類のＲＮＡ修飾、例えば、当技術分野で記載される、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を増強する修飾は、ＲＮＡの化学合成および／または酵素による作出中に導入することもでき、これらの後で導入することもできる。
スペーサー伸長配列
ゲノムターゲティング核酸についての一部の例では、スペーサー伸長配列は、活性を修飾することも可能であり、安定性をもたらすことも可能であり、かつ／またはゲノムターゲティング核酸を修飾するための位置をもたらすこともできる。スペーサー伸長配列は、オンまたはオフ標的活性または特異性を修飾しうる。一部の例では、スペーサー伸長配列を提供することができる。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドを超える長さを有しうる。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、またはこれを超えるヌクレオチド未満の長さを有しうる。スペーサー伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さでありうる。スペーサー伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチドの間の長さでありうる。スペーサー伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチドの間の長さでありうる。
スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含みうる。この部分は、核酸ターゲティング核酸の安定性を低下させる場合もあり、増大させる場合もある。この部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）でありうる。この部分は、真核細胞内で機能しうる。この部分は、原核細胞内で機能しうる。この部分は、真核細胞内および原核細胞内の両方で機能しうる。適切な部分の非限定的な例は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節ならびに／またはタンパク質およびタンパク質複合体のアクセシビリティの調節を可能とする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを、細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）へとターゲティングする配列、トラッキングをもたらす修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子への直接のコンジュゲーション、蛍光の検出を容易とする部分へのコンジュゲーション、蛍光の検出を可能とする配列など）、および／またはタンパク質の結合部位をもたらす修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）を含む。
スペーサー配列
スペーサー配列は、目的の標的核酸内の配列とハイブリダイズする。ゲノムターゲティング核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的に、標的核酸と相互作用しうる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動しうる。
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、スペーサー配列は、系内で使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’側に位置する標的核酸とハイブリダイズするようにデザインすることができる。スペーサーは、標的配列に完全にマッチする場合もあり、ミスマッチを有する場合もある。各Ｃａｓ９酵素は、それが標的ＤＮＡ内で認識する、特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、標的核酸内で、配列５’−ＮＲＧ−３’［配列中、Ｒは、ＡまたはＧを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によりターゲティングされる標的核酸配列のすぐ３’側にある］を含むＰＡＭを認識する。
標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、２０未満のヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、２０を上回るヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはこれを上回るヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、多くとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはこれを上回るヌクレオチドを含み得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基を含み得る。例えば、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ−３’（配列番号２８７２７）を含む配列では、標的核酸は、複数のＮに対応する配列（配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線を付したＮＲＧ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＰＡＭである）を含み得る。この標的核酸配列は、ＰＡＭ鎖と称されることが多く、相補的な核酸配列は、非ＰＡＭ鎖と称されることが多い。当業者であれば、スペーサー配列が、標的核酸の非ＰＡＭ鎖とハイブリダイズすることを認識するであろう（図１Ａおよび１Ｂ）。
標的核酸とハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有しうる。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔでありうる。一部の例では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含みうる。一部の例では、スペーサーは、１９ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは、１８ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは、２２ヌクレオチドを含み得る。
一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、最大で約３０％、最大で約４０％、最大で約５０％、最大で約６０％、最大で約６５％、最大で約７０％、最大で約７５％、最大で約８０％、最大で約８５％、最大で約９０％、最大で約９５％、最大で約９７％、最大で約９８％、最大で約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列のうちの、最も５’側の６つの連続ヌクレオチドにわたり、１００％である。スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、約２０連続ヌクレオチドにわたり、少なくとも６０％でありうる。スペーサー配列および標的核酸の長さは、１〜６ヌクレオチド異なる場合があるが、これは、１または複数のバルジ（ｂｕｌｇｅ）と考えることができる。
スペーサー配列は、コンピュータプログラムを使用して、デザインすることもでき、選び出すこともできる。コンピュータプログラムは、予測溶融温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一であるかまたは類似するが、ミスマッチ、挿入、または欠失の結果として、１または複数のスポットで変動する配列）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用しうる。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列
一部の態様では、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、基準ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列である。
一部の態様では、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズしうるヌクレオチドを含む。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、二重鎖、すなわち、塩基対合した二本鎖構造を形成しうる。一体となって、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに結合しうる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズしうる。一部の態様では、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含む。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対する、最大で約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含みうる。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。一部の態様では、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約９ヌクレオチドの長さである。一部の態様では、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約１２ヌクレオチドの長さである。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型ｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対して、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一でありうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列でありうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズするヌクレオチドを含みうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とは、二重鎖、すなわち、塩基対合した二本鎖構造を形成する。一体となって、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲリピートは、部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズしうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的でありうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔ長でありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約９ヌクレオチドの長さでありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１２ヌクレオチドでありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Jinekら、前出において記載されている、ｔｒａｃｒＲＮＡのｎｔ２３〜４８からなりうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型、ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一でありうる。
最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、二重螺旋を含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。
二重鎖は、ミスマッチを含みうる（すなわち、二重鎖の２つの鎖は、１００％相補的ではない）。二重鎖は、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超えるミスマッチを含みうる。二重鎖は、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超えるミスマッチを含みうる。二重鎖は、２つ以下のミスマッチを含みうる。
バルジ（ｂｕｌｇｅ）
場合によって、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖内には、「バルジ」が存在しうる。バルジとは、二重鎖内のヌクレオチドの非対合領域である。バルジは、二重鎖の、部位特異的ポリペプチドへの結合に寄与しうる。バルジは、二重鎖の一方の側に、非対合の５’−ＸＸＸＹ−３’（配列番号２８，７３１）［配列中、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、逆鎖上のヌクレオチドと、揺らぎ対を形成しうるヌクレオチドを含む］を含むことが可能であり、二重鎖の他の側に、非対合ヌクレオチド領域を含みうる。二重鎖の２つの側における非対合ヌクレオチドの数は、異なりうる。
一例では、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上に、非対合プリン（例えば、アデニン）を含みうる。一部の例では、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の非対合５’−ＡＡＧＹ−３’［配列中、Ｙは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上のヌクレオチドと、揺らぎ対合を形成しうる、ヌクレオチドを含む］を含みうる。
二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、最大で１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、１つの非対合ヌクレオチドを含みうる。
二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、第２の側のバルジ（例えば、二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）は、４つの非対合ヌクレオチドを含みうる。
バルジは、少なくとも１つの揺らぎ対合を含みうる。一部の例では、バルジは、最大で１つの揺らぎ対合を含みうる。バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含みうる。一部の例では、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含みうる。
ヘアピン
多様な例では、１または複数のヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡに対して３’側に位置しうる。
ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖内の、最後の対合ヌクレオチドの３’側の、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超えるヌクレオチドから始まりうる。ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖内の、最後の対合ヌクレオチドの３’側の、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドから始まりうる。
ヘアピンは、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超える連続ヌクレオチドを含みうる。ヘアピンは、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、またはこれを超える連続ヌクレオチドを含みうる。
ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続シトシンヌクレオチド）を含みうる。
ヘアピンは、二重鎖ヌクレオチド（例えば、ヘアピン内で一体にハイブリダイズしたヌクレオチド）を含みうる。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖内の、ＧＧジヌクレオチドへとハイブリダイズしたＣＣジヌクレオチドを含みうる。
ヘアピンのうちの１または複数は、部位特異的ポリペプチドの、ガイドＲＮＡと相互作用する領域と相互作用しうる。
ある例では、２つまたはこれを超えるヘアピンが存在し、他の例では、３つまたはこれを超えるヘアピンが存在する。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｔｒａｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列を含みうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有しうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１４ヌクレオチドの長さを有しうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なり（ｓｔｒｅｔｃｈ）にわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一でありうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つを超える二重鎖領域（例えば、ヘアピン領域、ハイブリダイズ領域）を含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖領域を含みうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。ステムループ構造は、機能的部分を含みうる。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含みうる。ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のヘアピンは、Ｐドメインを含みうる。一部の例では、Ｐドメインは、ヘアピン内の二本鎖領域を含みうる。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一分子ガイドの文脈にある場合であれ、二重分子ガイドの文脈にある場合であれ、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列をもたらすことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチドを超える長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０〜約５０００またはこれを超えるヌクレオチドの長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、またはこれを超えるヌクレオチド未満の長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有しうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを含みうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さでありうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチドの長さでありうる。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能的部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含みうる。機能的部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含みうる。機能的部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの全長を有しうる。機能的部分は、真核細胞内で機能しうる。機能的部分は、原核細胞内で機能しうる。機能的部分は、真核細胞内および原核細胞内の両方で機能しうる。
適切なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長の機能的部分の非限定的な例は、３’ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節ならびに／またはタンパク質およびタンパク質複合体によるアクセシビリティの調節を可能とする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）へとターゲティングする配列、トラッキングをもたらす修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子への直接のコンジュゲーション、蛍光の検出を容易とする部分へのコンジュゲーション、蛍光の検出を可能とする配列など）、および／またはタンパク質の結合性部位をもたらす修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合性部位または分子インデックス（例えば、バーコード配列）を含みうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１または複数のアフィニティータグを含みうる。
単一分子ガイドリンカー配列
単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。Jinekら、前出では、例えば、単純な４ヌクレオチドの「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）が使用された（Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁（２０１２年））。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有しうる。単一分子ガイド核酸のリンカーは、４〜４０ヌクレオチドの間でありうる。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドでありうる。リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドでありうる。
リンカーは、様々な配列のうちのいずれも含みうるが、一部の例では、リンカーは、ガイドＲＮＡの他の部分と相同的である広範な領域であって、ガイドの他の機能的な領域に干渉する可能性のある分子内結合を引き起こしうる領域を有する配列を含まない。Jinekら、前出では、単純な４ヌクレオチドの配列である、−ＧＡＡＡ−が使用された（Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁（２０１２年））が、より長い配列を含
む、多数の他の配列も同様に、使用することができる。
リンカー配列は、機能的部分を含みうる。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、タンパク質結合性部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含む、１または複数の特色を含みうる。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。一部の例では、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。
核酸の修飾（化学的および構造的修飾）
一部の態様では、細胞へと導入されたポリヌクレオチドは、例えば、活性、安定性、もしくは特異性を増強するか、送達を変更するか、宿主細胞内の自然免疫応答を低減するか、または本明細書でさらに記載され、当技術分野でも公知の他の増強のために、個別に、または組合せで使用されうる、１または複数の修飾を含みうる。
ある特定の例では、修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系で使用しうるが、この場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドまたは二重分子ガイド）、および／または細胞へと導入されるＣａｓ９もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、下記で記載および例示される通りに修飾することができる。このような修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系で使用して、任意の１または複数のゲノムローカスを編集することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系を、このような使用の非限定的例示を目的として使用して、単一分子ガイドの場合もあり、二重分子の場合もある、ガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を増強するのに、ガイドＲＮＡの修飾を使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、ゲノム編集複合体と、ゲノム内の標的配列との相互作用であって、例えば、オン標的活性を増強するのに使用されうる相互作用の開始、安定性、または反応速度を増強するのに使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、特異性、例えば、オン標的部位におけるゲノム編集の、他の（オフ標的）部位における効果と比較した相対速度を増強するのに使用することができる。
修飾はまた、または代替的に、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するその耐性を増大させ、これにより、細胞内のその半減期を延長することにより、ガイドＲＮＡの安定性を増大させるのに使用することができる。ガイドＲＮＡの半減期を延長する修飾は、エンドヌクレアーゼを発生させるために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞へと、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを導入する態様において、特に有用でありうる。エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入される、ガイドＲＮＡ半減期の延長を使用して、ガイドＲＮＡと、コードされるＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとが細胞内に共存する時間を延長しうるためである。
修飾はまた、または代替的に、細胞へと導入されたＲＮＡが、自然免疫応答を誘発する可能性または程度を減少させるのに使用することができる。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈では、十分に特徴付けられており、下記および当技術分野で記載されるこのような応答は、ＲＮＡの半減期の短縮および／またはサイトカインもしくは免疫応答と関連する他の因子の誘発と関連する傾向がある。
限定なしに述べると、ＲＮＡの安定性を増強する（細胞内に存在するＲＮアーゼによる分解に対するその耐性を増大させることなどにより）修飾、結果として得られる産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する修飾、および／または細胞へと導入されたＲＮＡが、自然免疫応答を誘発する可能性もしくは程度を減少させる修飾を含む、１種または複数種の修飾もまた、細胞へと導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡへと施すことができる。
前出および他のものなどの修飾の組合せも同様に、使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の場合、例えば、１種または複数種の修飾を、ガイドＲＮＡ（上記で例示したガイドＲＮＡを含む）へと施すこともでき、かつ／または１種または複数種の修飾を、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上記で例示したＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡを含む）へと施すこともできる。
例示を目的として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系で使用されるガイドＲＮＡ、または他の低分子ＲＮＡは、化学的手段によりたやすく合成することができ、下記で例示され、当技術分野で記載される通り、いくつかの修飾をたやすく組み込むことを可能とする。化学合成手順が、持続的に拡大しつつある一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；ＰＡＧＥなど、ゲルの使用を回避する）などの手順による、このようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が、１００ほどのヌクレオチドを優に超えて増大するにつれて、難しくなる傾向がある。より長い化学修飾ＲＮＡを作出するために使用しうる１つの手法は、併せてライゲーションされる、２つまたはこれを超える分子を作製することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなど、はるかに長いＲＮＡは、酵素により、よりたやすく作出される。酵素により作製されたＲＮＡにおける使用のために、少数種類の修飾が利用可能であるが、下記および当技術分野でさらに記載される通り、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を増強するのに使用しうる修飾がまだ存在し、新たな種類の修飾が、定期的に開発されている。
多様な種類の修飾、とりわけ、化学合成される低分子ＲＮＡと共に頻繁に使用される修飾についての例示を目的として述べると、修飾は、糖の２’位において修飾された、１または複数のヌクレオチド、一部の態様では、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロで修飾されたヌクレオチドを含みうる。一部の例では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース、非塩基性残基、またはＲＮＡの３’末端における逆塩基における、２’−フルオロ、２’−アミノ、または２’−Ｏ−メチル修飾を含む。このような修飾は、規定の方式で、オリゴヌクレオチドへと組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりＴｍが大きい（すなわち、標的への結合アフィニティーが大きい）ことが示されている。
いくつかのヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ消化に対して、天然のオリゴヌクレオチドより耐性とすることが示されており、これらの修飾オリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間にわたりインタクトのまま存続する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例は、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルによる糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環による糖間連結を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を伴うオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知である）、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２骨格、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格［式中、天然のホスホジエステル骨格を、Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨとして表す］；アミド骨格［De Mesmaekerら、Ace. Chem. Res.、２８巻：３６６〜３７４頁（１９９５年）を参照されたい］；モルホリノ骨格構造（SummertonおよびWeller、米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格を、ポリアミド骨格で置きかえ、ヌクレオチドを、ポリアミド骨格のアザ窒素原子へと、直接的または間接的に結合させる；Nielsenら、Science、１９９１年、２５４巻、１４９７頁を参照されたい）を伴うオリゴヌクレオチドである。リン含有連結は、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネートを含む、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートであって、通常の３’−５’連結を有するこれら、２’−５’連結されたこれらの類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が、５’−３’に対する３’−５’、または５’−２’に対する２’−５’で連結される逆極性を有するリン含有連結を含むがこれらに限定されない（米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号を参照されたい）。
モルホリノベースのオリゴマー性化合物については、BraaschおよびDavid Corey、Biochemistry、４１巻（１４号）：４５０３〜４５１０頁（２００２年）；Genesis、３０巻、３号（２００１年）；Heasman、Dev. Biol.、２４３巻：２０９〜２１４頁（２００２年）；Naseviciusら、Nat. Genet.、２６巻：２１６〜２２０頁（２０００年）；Lacerraら、Proc. Natl. Acad. Sci.、９７巻：９５９１〜９５９６頁（２０００年）；およ
び１９９１年７月２３日に公布された、米国特許第５，０３４，５０６号において記載されている。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体については、Wangら、J. Am. Chem. Soc.、１２２巻：８５９５〜８６０２頁（２０００年）において記載されている。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルによるヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルとの混合によるヌクレオシド間連結、または１もしくは複数の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環によるヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結を有する骨格（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の構成要素部分の混合を有する他の骨格（米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号を参照されたい）を含む。
１または複数の置換糖部分、例えば、２’位における以下：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ ＯＣＨ３、ＯＣＨ３ Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３［式中、ｎは、１〜約１０である］；Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基；および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つも含まれうる。一部の態様では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としてもまた公知の、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）修飾（Martinら、HeIv. Chim. Acta、１９９５年、７８巻、４８６頁）を含む。他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ ＣＨ２ＣＨ３）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾を、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても施すことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりに、シクロブチルなどの糖模倣体も有しうる。
一部の例では、糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格を、新規の基で置きかえることができる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持することができる。１つのこのようなオリゴマー性化合物であるオリゴヌクレオチド模倣体であって、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称する。ＰＮＡ化合物中では、オリゴヌクレオチドの糖骨格を、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置きかえることができる。ヌクレオ塩基は保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子へと、直接的または間接的に結合させることができる。ＰＮＡ化合物の調製について教示する、代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号を含むがこれらに限定されない。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Nielsenら、Science、２５４巻：１４９７〜１５００頁（１９９１年）において見出すことができる。
ガイドＲＮＡはまた、加えてまたは代替的に、ヌクレオ塩基（当技術分野では単に「塩基」と称することが多い）の修飾または置換も含みうる。本明細書で使用される場合、「非修飾」または「天然」ヌクレオ塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、天然の核酸内で、低頻度で、または一過性に見出されるに過ぎないヌクレオ塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（また、５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、当技術分野では、５−Ｍｅ−Ｃと称されることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成のヌクレオ塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾイルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン（2-(aminoalklyamino)adenine）または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリンを含む（Kornberg, A.、DNA Replication、W. H. Freeman & Co.、San Francisco、７５〜７７頁（１９８０年）；Gebeyehuら、Nucl. Acids Res.、１５巻：４５１３頁（１９９７年））。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンもまた、組み入れることができる。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６〜１．２℃だけ上昇させることが示されており（Sanghvi, Y. S.、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、１９９３年、２７６〜２７８頁）、塩基置換の態様である。
修飾ヌクレオ塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルアデニンおよび８−ヒドロキシルグアニンならびに他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、特に、５−ブロモウラシルおよび５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロメチルシトシン、ならびに他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニン（quanine）および７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなど、他の合成および天然ヌクレオ塩基を含みうる。
さらに、ヌクレオ塩基は、；米国特許第３，６８７，８０８号において開示されているヌクレオ塩基；「The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering」、８５８〜８５９頁、Kroschwitz, J.I.編、John Wiley & Sons、１９９０年において開示されているヌクレオ塩基；Englischら、「Angewandle Chemie, International Edition」、１９９１年、３０巻、６１３頁により開示されているヌクレオ塩基；およびSanghvi, Y. S.、１５章、「Antisense Research and Applications」、２８９〜３０２頁、Crooke, S.T.およびLebleu, B.編著、CRC Press、１９９３年により開示されているヌクレオ塩基を含みうる。これらのヌクレオ塩基のうちのいくつかは、本発明のオリゴマー性化合物の結合アフィニティーを増大させるために、特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、Ｎ−２、Ｎ−６、および０−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６〜１．２℃だけ上昇させることが示されており（Sanghvi, Y. S.、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、「Antisense Research and Applications」、CRC Press、Boca Raton、１９９３年、２７６〜２７８頁）、なおより特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、塩基置換の態様である。修飾ヌクレオ塩基については、米国特許第３，６８７，８０８号のほか、同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第５，７６３，５８８号；同第５，８３０，６５３号；同第６，００５，０９６号；および米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号において記載されている。
したがって、「修飾された」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼの両方へと組み込まれた、非天然の糖、リン酸、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチド内の全ての位置が、一様に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾のうちの１つを超える修飾は、単一のオリゴヌクレオチドに組み込むこともでき、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むこともできる。
ガイドＲＮＡおよび／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（またはＤＮＡ）は、活性、細胞の分布、またはオリゴヌクレオチドの細胞による取込みを増強する、１または複数の部分またはコンジュゲートへと化学的に連結することができる。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分［Letsingerら、Proc. Natl. Acad.、Sci. USA、８６巻：６５５３〜６５５６頁（１９８９年）］；コール酸［Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、４巻：１０５３〜１０６０頁（１９９４年）］；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Manoharanら、Ann. N. Y. Acad. Sci.、６６０巻：３０６〜３０９頁（１９９２年）；およびManoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、３巻：２７６５〜２７７０頁（１９９３年）］；チオコレステロール［Oberhauserら、Nucl. Acids Res.、２０巻：５３３〜５３８頁（１９９２年）］；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Kabanovら、FEBS Lett.、２５９巻：３２７〜３３０頁（１９９０年）；およびSvinarchukら、Biochimie、７５巻：４９〜５４頁（１９９３年）］；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［Manoharanら、Tetrahedron Lett.、３６巻：３６５１〜３６５４頁（１９９５年）；およびSheaら、Nucl. Acids Res.、１８巻：３７７７〜３７８３頁（１９９０年）］；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Mancharanら、Nucleosides & Nucleotides、１４巻：９６９〜９７３頁（１９９５年）］；アダマンタン酢酸［Manoharanら、Tetrahedron Lett.、３６巻：３６５１〜３６５４頁（１９９５年）］；パルミチル部分［（Mishraら、Biochim. Biophys. Acta、１２６４巻：２２９〜２３７頁（１９９５年）］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール（hexylamino-carbonyl-t oxycholesterol）部分［Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther.、２７７巻：９２３〜９３７頁（１９９６年）］を含むがこれらに限定されない。また、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同第５，６８８，９４１号も参照されたい。
糖および他の部分を使用して、タンパク質と、カチオン性のポリソームおよびリポソームなど、ヌクレオチドを含む複合体とを、特定の部位へとターゲティングすることができる。例えば、肝細胞指向移入は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を媒介しうる（例えば、Huら、Protein Pept Lett.、２１巻（１０号）：１０２５〜３０頁（２０１４年）を参照されたい）。当技術分野で公知であり、定期的に開発されている他の系は、本場合において使用される生体分子および／またはその複合体を、目的の、特定の標的細胞へとターゲティングするのに使用することができる。
これらのターゲティング部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基へと共有結合的に結合させたコンジュゲート基を含みうる。本発明のコンジュゲート基は、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含む。典型的なコンジュゲート基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含む。本開示の文脈における、薬力学特性を増強する基は、取込みを改善する基、分解に対する耐性を増強する基、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈における、薬物動態特性を増強する基は、本発明の化合物の、取込み、分布、代謝、または排出を改善する基を含む。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号（ＷＯ１９９３００７８８３として公開）、および米国特許第６，２８７，８６０号において開示されている。コンジュゲート部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むがこれらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
化学合成にあまり適さず、酵素的合成により作製することが典型的な、長型のポリヌクレオチドもまた、多様な手段により修飾することができる。このような修飾は、例えば、ある特定のヌクレオチド類似体の導入、特定の配列または他の部分の、分子の５’または３’末端における組込み、および他の修飾を含みうる。例示を目的として述べると、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、約４ｋｂの長さであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写により合成することができる。ｍＲＮＡへの修飾は、例えば、その翻訳または安定性を増大させる（細胞による分解に対するその耐性を増大させることなどによる）ように適用することもでき、ＲＮＡの、自然免疫応答を誘発する傾向であって、外因性ＲＮＡ、特に、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡなど、長いＲＮＡの導入後において、細胞内で観察されることが多い傾向を低減するように適用することもできる。
当技術分野では、ポリＡテール、５’キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾塩基（シュードＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）またはＮ６−メチル−ＡＴＰなど）の使用、または５’末端リン酸を除去する、ホスファターゼによる処理など、多数のこのような修飾について記載されている。当技術分野では、これらの修飾および他の修飾が公知であり、ＲＮＡの新たな修飾が、定期的に開発されている。
例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、および多くの他の供給元を含む、修飾ＲＮＡの多数の市販品の供給元が存在する。ＴｒｉＬｉｎｋにより記載されている通り、例えば、５−メチル−ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼの安定性の増大、翻訳の増大、または生得的免疫受容体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて転写されたＲＮＡとの相互作用の低減など、望ましい特徴を付与することができる。下記で言及される、KormannらおよびWarrenらによる刊行物において例示されている通り、５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、ならびにシュードＵＴＰおよび２−チオ−ＵＴＰはまた、培養物中およびｉｎ ｖｉｖｏにおける生得的免疫刺激を低減する一方で、翻訳を増強することも示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて送達される化学修飾ｍＲＮＡを使用して、治療効果の改善を達成しうることが示されている（例えば、Kormannら、Nature Biotechnology、２９巻、１５４〜１５７頁（２０１１年）を参照されたい）。このような修飾を使用して、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増大させ、かつ／またはその免疫原性を低減することができる。シュードＵ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ、および５−メチル−Ｃなどの化学修飾を使用して、ウリジンおよびシチジン残基のうちの４分の１だけを、それぞれ、２−チオ−Ｕおよび５−メチル−Ｃで置換する結果として、マウスにおける、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により媒介されるｍＲＮＡの認識の顕著な低下がもたらされることが見出された。生得的免疫系の活性化を低減することにより、これらの修飾を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡの安定性および寿命を効果的に増大させることができる（例えば、Kormannら、前出を参照されたい）。
また、生得的抗ウイルス応答を迂回するようにデザインされた修飾を組み込む、合成のメッセンジャーＲＮＡの反復投与は、分化ヒト細胞を、多能性へと再プログラム化できることも示されている。例えば、Warrenら、Cell Stem Cell、７巻（５号）：６１８〜３０頁（２０１０年）を参照されたい。一次再プログラム化タンパク質として作用する、このような修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラム化する、効率的な手段でありうる。このような細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称し、５−メチル−ＣＴＰ、シュードＵＴＰ、およびＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）を組み込む、酵素的に合成されたＲＮＡであれば、細胞の抗ウイルス応答を効果的に逃避するのに使用されうることが見出された（例えば、Warrenら、前出を参照されたい）。
当技術分野で記載されるポリヌクレオチドの他の修飾は、例えば、ポリＡテールの使用、５’キャップ類似体（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ）など）の付加、５’もしくは３’非翻訳領域ＵＴＲの修飾、または５’末端リン酸を除去する、ホスファターゼによる処理（そして、新たな手法が定期的に開発されている）を含む。
本明細書における使用のための修飾ＲＮＡを作出するのに適用可能な、いくつかの組成物および技法が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾との関連で開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉を介する、遺伝子サイレンシングに対するそれらの効果は一般に、一過性であり、これは、反復投与を要求しうるため、ｉｎ ｖｉｖｏでは、特定の課題を提示する。加えて、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、ウイルス感染の副産物であることが多い、ｄｓＲＮＡを検出および中和するように進化した免疫応答を有する。こうして、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介しうる、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｋｉｎａｓｅ）など、哺乳動物の酵素、および、潜在的に、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）のほか、このような分子に応答してサイトカインの誘導を惹起しうる、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８など）が存在する（例えば、Angartら、Pharmaceuticals（Basel）、６巻（４号）：４４０〜４６８頁（２０１３年）；Kanastyら、Molecular Therapy、２０巻（３号）：５１３〜５２４頁（２０１２年）；Burnettら、Biotechnol J.、６巻（９号）：１１３０〜４６頁（２０１１年）；JudgeおよびMacLachlan、Hum Gene Ther、１９巻（２号）：１１１〜２４頁（２００８年）による総説；ならびにこれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。
ＲＮＡの安定性を増強し、自然免疫応答を低減し、かつ／またはポリヌクレオチドの、ヒト細胞への導入であって、本明細書で記載される導入との関連で有用でありうる他の利益を達成するように、多種多様な修飾が、開発および適用されている（例えば、Whitehead KAら、Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering、２巻：７７〜９６頁（２０１１年）；GaglioneおよびMessere、Mini Rev Med Chem、１０巻（７号）：５７８〜９５頁（２０１０年）；Chernolovskayaら、Curr Opin Mol Ther.、１２巻（２号）：１５８〜６７頁（２０１０年）；Deleaveyら、Curr Protoc Nucleic Acid Chem、１６章：１６．３部（２００９年）；Behlke、Oligonucleotides、１８巻（４号）：３０５〜１９頁（２００８年）；Fuciniら、Nucleic Acid Ther、２２巻（３号）：２０５〜２１０頁（２０１２年）；Bremsenら、Front Genet、３巻：１５４
頁（２０１２年）による総説を参照されたい）。
上記で言及した通り、それらの多くが、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するようにデザインされた修飾に特化した、修飾ＲＮＡのいくつかの市販品の供給元が存在する。文献で報告されている多様な知見に基づき、様々な手法が提供されている。例えば、Dharmaconは、Kole、Nature Reviews Drug Discovery、１１巻：１２５〜１４０頁（２０１２年）により報告されている通り、非架橋酸素の、硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）による置きかえが、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するのに使用されていることについて言及している。リボースの２’位の修飾は、ヌクレオチド間のリン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善する一方で、二重鎖の安定性（Ｔｍ）を増大させ、これはまた、免疫活性化からの保護をもたらすことも示されていることが報告されている。Soutschekら、Nature、４３２巻：１７３〜１７８頁（２００４年）により報告されている通り、中程度のＰＳ骨格の修飾の、小型の、十分に忍容される２’−置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）との組合せは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける適用のための、高度に安定的なｓｉＲＮＡと関連しており、Volkov、Oligonucleotides、１９巻：１９１〜２０２頁（２００９年）により報告されている通り、２’−Ｏ−メチル修飾は、安定性の改善において有効であることが報告されている。自然免疫応答の誘導を減少させることとの関連で、特異的配列を、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロで修飾することは、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８の相互作用を低減する一方で、一般に、サイレンシング活性を保存することが報告されている（例えば、Judgeら、Mol. Ther.、１３巻：４９４〜５０５頁（２００６年）；およびCekaiteら、J. Mol. Biol.、３６５巻：９０〜１０８頁（２００７年）を参照されたい）。２−チオウラシル、シュードウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、およびＮ６−メチルアデノシンなどのさらなる修飾もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８により媒介される免疫作用を最小化することが示されている（例えば、Kariko, K.ら、Immunity、２３巻：１６５〜１７５頁（２００５年）を参照されたい）。
また、当技術分野で公知であり、市販されている、いくつかのコンジュゲートであって、例えば、コレステロール、トコフェロール、および葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、およびアプタマーを含み、それらの送達および／または細胞による取込みを増強しうるコンジュゲートを、本明細書での使用のための、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドへと適用することができる（例えば、Winkler、Ther. Deliv.、４巻：７９１〜８０９頁（２０１３年）による総説、およびこれにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。
コドンの最適化
部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で標準的な方法に従い、目的の標的ＤＮＡを含有する細胞内の発現のために、コドンを最適化することができる。例えば、意図された標的核酸が、ヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化したヒトポリヌクレオチドを、Ｃａｓ９ポリペプチドを産生するための使用に想定する。
ゲノムターゲティング核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体
ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９など、核酸にガイドされるヌクレアーゼ）と相互作用し、これにより、複合体を形成する。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドを、標的核酸へと導く。
リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）
部位特異的ポリペプチドおよびゲノムターゲティング核酸は各々、細胞または患者へと、個別に投与することができる。他方、部位特異的ポリペプチドは、１もしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１もしくは複数のｃｒＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。次いで、あらかじめ複合体化させた材料を、細胞または患者へと投与することができる。このようなあらかじめ複合体化させた材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。ＲＮＰにおける部位特異的ポリペプチドは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。部位特異的ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方において、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）が隣接し得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｎ末端に位置する１つのＮＬＳおよびＣ末端に位置する第２のＮＬＳの２つのＮＬＳが、隣接し得る。ＮＬＳは、当技術分野において公知の任意のＮＬＳ、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳであり得る。ＲＮＰにおける、ゲノムターゲティング核酸の部位特異的ポリペプチドに対する重量比は、１：１であり得る。例えば、ＲＮＰにおける、ｓｇＲＮＡのＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対する重量比は、１：１であり得る。
系の構成要素をコードする核酸
本開示は、本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提示する。
本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードする核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含みうる。
「ベクター」という用語は、それを連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は、さらなる核酸セグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなる核酸セグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、および哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。
一部の例では、ベクターは、それらが作動的に連結された核酸の発現を導くことが可能でありうる。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」、またはより簡単に、「発現ベクター」と称するが、これらは、同等の機能を果たす。
「作動可能に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とする形で、調節配列へと連結されていることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。当技術分野では、このような調節配列が周知であり、例えば、Goeddel、Gene Expression Technology、Methods in Enzymology、１８５巻、Academic Press、San Diego、CA（１９９０年）において記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞内のヌクレオチド配列の構成的発現を導く調節配列と、ある特定の宿主細胞内だけのヌクレオチド配列の発現を導く調節配列（例えば、組織特異的調節配列）とを含む。当業者は、発現ベクターのデザインが、標的細胞の選び出し、所望の発現レベルなどの因子に依存しうることを察知するであろう。
想定される発現ベクターは、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）、および他の組換えベクターに基づくウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。真核標的細胞のために想定される他のベクターは、ベクターである、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むがこれらに限定されない。宿主細胞と適合性である限りにおいて、他のベクターを使用することができる。
一部の例では、ベクターは、１または複数の転写および／または翻訳制御エレメントを含みうる。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導的プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写および翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクター内で使用することができる。ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構もしくは他のエレメントの構成要素を不活化させる、自己不活化ベクターでありうる。
適切な真核プロモーター（すなわち、真核細胞内で機能的なプロモーター）の非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスに由来するＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、ヒト伸長因子１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリベータ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）へと融合させたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１ローカスプロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネインＩに由来するプロモーターを含む。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼとの関連で使用されるガイドＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを発現するためには、例えば、Ｕ６およびＨ１を含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの多様なプロモーターが有利でありうる。当技術分野では、このようなプロモーターの使用を増強することについての記載、およびこのためのパラメータが公知であり、さらなる情報および手法が、定期的に記載されている（例えば、Ma, H.ら、Molecular Therapy - Nucleic Acids、３巻、ｅ１６１頁（２０１４年）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい）。
発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合性部位および転写ターミネーターも含有しうる。発現ベクターはまた、発現を増幅するのに適切な配列も含みうる。発現ベクターはまた、非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列であって、部位特異的ポリペプチドへと融合させ、したがって、融合タンパク質をもたらすヌクレオチド配列も含みうる。
プロモーターは、誘導的プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーターなど）でありうる。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）でありうる。場合によって、プロモーターは、空間限定型および／または時間限定型プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）でありうる。
本開示のゲノムターゲティング核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のための送達媒体内またはその表面上にパッケージングすることができる。想定される送達媒体は、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ハイドロゲル、およびミセルを含むがこれらに限定されない。当該分野において記載されている通り、様々なターゲティング部分を使用して、このような媒体の、所望される細胞型または場所との優先的な相互作用を増強することができる。
本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の、細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポソーム媒介型トランスフェクション、遺伝子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達などにより行うことができる。
治療アプローチ
脂質異常症を有する患者を処置するための方法が、本明細書に提示される。そのような方法の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞ベースの療法である。例えば、患者の肝臓の生検が、行われる。次いで、肝臓特異的始原細胞または初代肝細胞を、生検材料から単離する。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、これらの始原細胞または初代肝細胞の染色体ＤＮＡを矯正する。最後に、始原細胞または初代肝細胞を、患者へと植え込む。任意の源または種類の細胞を、始原細胞として使用することができる。
そのような方法の別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞ベースの療法である。例えば、患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、創出することができる。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、これらのｉＰＳ細胞の染色体ＤＮＡを、編集することができる。次いで、ゲノム編集したｉＰＳＣを、他の細胞へと分化させることができる。最後に、分化した細胞を、患者へと植え込む。
そのような方法のさらに別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞ベースの療法である。例えば、間葉幹細胞を、患者から単離してもよく、これは、患者の骨髄または末梢血から単離することができる。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、これらの間葉幹細胞の染色体ＤＮＡを、編集することができる。次いで、ゲノム編集した間葉幹細胞を、任意の種類の細胞、例えば、肝細胞へと分化させることができる。最後に、分化した細胞、例えば、肝細胞を、患者へと植え込む。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法アプローチの１つの利点は、投与の前に、治療剤についての包括的な解析を行う能力である。ヌクレアーゼベースの治療剤は、あるレベルのオフ標的作用を有し得る。遺伝子編集をｅｘ ｖｉｖｏにおいて実施することにより、植込みの前に、編集した細胞集団を特徴付けることが可能である。本開示は、編集した細胞の全ゲノムをシークエンシングして、オフ標的作用が存在する場合に、それが、確実に、患者に対する最小限の危険性と関連するゲノム位置に存在し得るようにすることを含む。さらに、クローン集団を含め、特定の細胞集団を、植込みの前に単離することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法の別の利点は、他の初代細胞供給源と比較した、ｉＰＳＣ内の遺伝子改変に関する。ｉＰＳＣは、多産であり、細胞ベースの療法に要求される多数の細胞を得ることを容易とする。さらに、ｉＰＳＣは、クローン単離を実施するために理想的な細胞型である。これにより、生存率を低下させる危険を冒さずに、正確なゲノム改変のためのスクリーニングが可能である。これに対し、他の初代細胞、例えば、肝細胞は、数回の継代にわたってのみ生存可能であり、クローン的に拡大することは困難である。このため、脂質異常症の処置のためのｉＰＳＣの操作は、はるかに容易であり得、所望される遺伝子改変を行うのに必要とされる時間の量を短縮することができる。
方法は、ｉｎ ｖｉｖｏベースの療法もまた含み得る。本明細書に記載される材料および方法を使用して、患者における細胞の染色体ＤＮＡを編集する。
ある特定の細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける処置および療法のための有望な標的を提示するが、送達の有効性を増加させることにより、そのような細胞へのｉｎ ｖｉｖｏでの直接的な送達が可能となり得る。ターゲティングおよび編集は、関連細胞を対象とすることが理想的であろう。他の細胞における切断はまた、ある特定の細胞およびまたは成長段階においてのみ活性であるプロモーターの使用によって、防止することができる。追加のプロモーターは、誘導性であり、したがって、ヌクレアーゼがプラスミドとして送達される場合には、一時的に制御され得る。送達されたＲＮＡおよびタンパク質が、細胞内に留まる時間の量はまた、半減期を変化させるために付加される処置またはドメインを使用して、調節することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの処置により、いくつかの処置ステップが排除されるが、送達率が低いため、より高い編集率が必要となり得る。ｉｎ ｖｉｖｏでの処置は、ｅｘ ｖｉｖｏでの処置および生着による問題および無駄を排除することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療の利点は、治療剤の作製および投与の容易さであり得る。同じ治療法および治療は、１人を上回る患者、例えば、同じかまたは類似の遺伝子型または対立遺伝子を共有する何人かの患者を処置するために使用される見込みを有するであろう。対照的に、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法は、典型的に、患者自身の細胞を使用する必要があり、この細胞は、同じ患者から単離、操作され、その患者に戻される。
ゲノム編集によって、細胞内のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための細胞内での方法もまた、本明細書に提示される。例えば、細胞を、患者または動物から単離することができる。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、細胞の染色体ＤＮＡを、編集することができる。
本明細書に提示される方法は、細胞内での方法か、ｅｘ ｖｉｖｏ方法か、ｉｎ ｖｉｖｏ方法かに関係なく、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍に、１つまたは複数の挿入、欠失、または突然変異を導入することによって、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を低減（ノックダウン）または排除（ノックアウト）することを含み得る。
例えば、ノックダウンまたはノックアウトの戦略は、不正確なＮＨＥＪ修復経路に起因して生じるランダムな挿入または欠失（インデル）を導入することによって、ＰＣＳＫ９遺伝子におけるリーディングフレームを破壊することを含み得る。これは、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび１つのｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ）を用いて、目的の遺伝子に１つの一本鎖切断もしくは二本鎖切断を、または２つもしくはそれよりも多いＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび２つもしくはそれよりも多いｓｇＲＮＡを用いて、目的の遺伝子に２つもしくはそれよりも多い一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導することによって、達成することができる。このアプローチは、ＰＣＳＫ９遺伝子のためのｓｇＲＮＡの開発および最適化を必要とし得る。
あるいは、ノックダウンまたはノックアウトの戦略はまた、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍における、１つまたは複数のセグメントの欠失を含み得る。この欠失戦略は、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍で２つの異なる部位に結合することができる、少なくとも１対のｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ）、ならびに１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを必要とする。２つのｇＲＮＡを有して構成されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、所望される位置に、２つの二本鎖切断を誘導する。切断後に、２つの末端が、平滑末端または突出であるかに関係なく、ＮＨＥＪによって接合されて、介在するセグメントの欠失がもたらされ得る。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部において、挿入、欠失、または突然変異をもたらし得る。
上述のゲノム編集戦略に加えて、別の戦略は、制御配列を編集することによって、ＰＣＳＫ９の発現、機能、または活性を調節することを伴う。
上記に列挙された編集の選択肢に加えて、Ｃａｓ９または同様のタンパク質を使用して、エフェクタードメインを、編集のために同定することができる同じ標的部位、またはエフェクタードメインの範囲内の追加の標的部位をターゲティングすることができる。広範なクロマチン修飾酵素、メチラーゼ、またはデメチラーゼを使用して、標的遺伝子の発現を変更することができる。１つの可能性は、突然変異が望ましくない活性を引き起こす場合に、ＰＣＳＫ９タンパク質の発現を低減することである。これらの種類の後成的な制御は、特に、可能性のあるオフ標的作用が限定されているため、いくつかの利点を有する。
コーディングおよびスプライシング配列内の突然変異に加えて、いくつかの種類のゲノム標的部位が存在しうる。
転写および翻訳の調節には、細胞内のタンパク質またはヌクレオチドと相互作用する、いくつかの異なるクラスの部位が関与する。転写因子または他のタンパク質のＤＮＡ結合性部位は、部位の役割について研究するのに突然変異または欠失のためにターゲティングされうることが多いが、それらはまた、遺伝子発現を変化させるのにターゲティングすることもできる。部位は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）による直接的ゲノム編集を介して付加されうる。ゲノムシークエンシング、ＲＮＡ発現、および転写因子の結合についてのゲノムワイドの研究の使用の増大は、部位が、どのようにして、発生的または一時的な遺伝子調節をもたらすのかを同定する能力を増大させている。これらの制御系は直接的なものでありうるか、または複数のエンハンサーに由来する活性の統合を要求しうる広範な協同的調節を伴いうる。転写因子は、６〜１２ｂｐ長の縮重ＤＮＡ配列に結合することが典型的である。個々の部位によりもたらされる低レベルの特異性は、結合および機能的な結果に、複雑な相互作用および規則が関与することを示唆する。縮重性が小さな結合性部位は、調節のより簡便手段をもたらしうる。ゲノム内で類似する配列が少なく、オフ標的切断の潜在的可能性が小さい、より長い配列を指定するように、人工転写因子をデザインすることができる。遺伝子の調節または発現の変化を可能とするように、これらの種類の結合性部位のうちのいずれかを、突然変異させるか、欠失させるか、または創出することさえできる（Canver, M.C.ら、Nature（２０１５年））。
これらの特色を有する、遺伝子調節的領域の別のクラスは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合性部位である。ｍｉＲＮＡとは、転写後遺伝子調節において鍵となる役割を果たすノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、全ての哺乳動物タンパク質コード遺伝子のうちの３０％の発現を調節しうる。さらなる低分子非コードＲＮＡを加えた、二本鎖ＲＮＡによる、特異的かつ強力な遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）が発見された（Canver, M.C.ら、Nature（２０１５年））。遺伝子サイレンシングに重要な非コードＲＮＡの最大のクラスは、ｍｉＲＮＡである。哺乳動物では、ｍｉＲＮＡはまず、個別の転写単位、タンパク質イントロンの一部、または他の転写物でありうる、長いＲＮＡ転写物として転写される。長い転写物は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、塩基対合の不完全なヘアピン構造を含む。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａを伴う、核内のタンパク質複合体である、Ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒにより、１または複数の短いｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡ）へと切断されうる。
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、移出される、２ヌクレオチドの３’突出を伴う約７０ヌクレオチドの長さの短いステムループであり、１９〜２５ヌクレオチドの成熟ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖になる。塩基対合安定性の小さなｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へとロードされうる。パッセンジャー鎖（＊でマークされる）は、機能的でありうるが、通例分解される。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを、標的ｍＲＮＡ内の部分的に相補的な配列モチーフであって、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に主に見出される相補的配列モチーフへとテザリングし、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Bartel, D.P.、Cell、１３６巻、２１５〜２３３頁（２００９年）；Saj, A.およびLai, E.C.、Curr Opin Genet Dev、２１巻、５０４〜５１０頁（２０１１年））。
ｍｉＲＮＡは、発生、分化、細胞周期、および増殖の制御、ならびに哺乳動物および他の多細胞の生物の事実上全ての生物学的経路において重要でありうる。ｍｉＲＮＡはまた、細胞周期の制御、アポトーシス、および幹細胞分化、造血、低酸素状態、筋発生、神経発生、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルスの複製、および免疫応答にも関与しうる。
単一のｍｉＲＮＡが、数百の異なるｍＲＮＡ転写物をターゲティングしうる一方で、個々のｍｉＲＮＡ転写物は、多くの異なるｍｉＲＮＡによりターゲティングされうる。最新版のｍｉＲＢａｓｅ（ｖ．２１）では、２８６４５を超えるマイクロＲＮＡが、注釈されている。一部のｍｉＲＮＡは、複数のローカスによりコードされる場合があり、それらの一部は、タンデムに共転写されたクラスターから発現しうる。特色は、複数の経路およびフィードバック制御を伴う、複雑な調節ネットワークを可能とする。ｍｉＲＮＡは、これらのフィードバックおよび調節回路の不可欠な部分である可能性があり、タンパク質の産生を限界内に保つことにより、遺伝子発現を調節する一助となりうる（Herranz, H.およびCohen, S.M.、Gene Dev、２４巻、１３３９〜１３４４頁（２０１０年）；Posadas, D.M.およびCarthew, R.W.、Curr Opin Genet Dev、２７巻、１〜６頁（２０１４年））。
ｍｉＲＮＡはまた、異常なｍｉＲＮＡ発現と関連する多数のヒト疾患においても重要でありうる。この関連は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を裏書きする。最近のｍｉＲＮＡ欠失研究は、ｍｉＲＮＡを、免疫応答の調節と連関させている（Stern-Ginossar, N.ら、Science、３１７巻、３７６〜３８１頁（２００７年））。
ｍｉＲＮＡはまた、がんとも強力な連関を有し、異なる種類のがんにおいて役割を果たしうる。ｍｉＲＮＡは、いくつかの腫瘍において、下方調節されることが見出されている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期の制御およびＤＮＡの損傷への応答など、鍵となるがん関連経路の調節において重要な場合があり、したがって、診断において使用することができ、臨床においてターゲティングすることができる。マイクロＲＮＡは、全てのマイクロＲＮＡを枯渇させる実験が、腫瘍血管新生を抑制するように、血管新生の平衡を精密に調節しうる（Chen, S.ら、Genes Dev、２８巻、１０５４〜１０６７頁（２０１４年））。
タンパク質コーディング遺伝子について示されている通り、ｍｉＲＮＡ遺伝子はまた、がんと共に生じる後成的（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）変化下にも置かれうる。多くのｍｉＲＮＡローカスは、ＤＮＡのメチル化によるそれらの調節の機会を増大させるＣｐＧアイランドと関連しうる（Weber, B.、Stresemann, C.、Brueckner, B.、およびLyko, F.、Cell Cycle、６巻、１００１〜１００５頁（２００７年））。研究の大半は、クロマチ
ンリモデリング薬による処理を使用して、ｍｉＲＮＡの後成的サイレンシングを明らかにしている。
ＲＮＡサイレンシングにおけるそれらの役割に加えて、ｍｉＲＮＡはまた、翻訳も活性化させうる（Posadas, D.M.およびCarthew, R.W.、Curr Opin Genet Dev、２７巻、１〜６頁（２０１４年））。ｍｉＲＮＡ部位のノックアウトが、標的遺伝子の発現の低下をもたらしうるのに対し、これらの部位の導入は、発現を増大させうる。
個々のｍｉＲＮＡは、結合特異性に重要でありうる、シード配列（２〜８塩基のマイクロＲＮＡ）を突然変異させることにより、最も効果的にノックアウトすることができる。この領域内の切断、続いてＮＨＥＪによる誤修復は、標的部位への結合を遮断することにより、ｍｉＲＮＡの機能を効果的に消失させうる。ｍｉＲＮＡはまた、回文配列に隣接する特殊なループ領域の特異的ターゲティングによっても阻害しうるであろう。触媒的に不活性なＣａｓ９はまた、ｓｈＲＮＡの発現を阻害するのにのにも使用することができる（Zhao, Y.ら、Sci Rep、４巻、３９４３頁（２０１４年））。ｍｉＲＮＡのターゲティングに加えて、結合部位もまた、ターゲティングされ、突然変異させて、ｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防止することができる。
本開示によると、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはそれらの結合部位のうちのいずれかを、本発明の組成物に組み込んでもよい。
組成物は、配列番号６３２〜４，７１５に列挙されるマイクロＲＮＡのうちのいずれかの配列、配列番号６３２〜４，７１５に列挙されるマイクロＲＮＡの逆相補体、または配列番号６３２〜４，７１５に列挙されるマイクロＲＮＡのうちのいずれかのマイクロＲＮＡアンチシード領域などであるがこれらに限定されない領域を有し得る。
本発明の組成物は、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡシードを含み得る。そのような配列は、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号および米国公開第ＵＳ２００５／００５９００５号に教示されるものなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。非限定的な実施形態として、公知のマイクロＲＮＡ、それらの配列、およびヒトゲノムにおけるそれらの結合部位の配列は、以下の配列番号６３２〜４，７１５に列挙されている。
マイクロＲＮＡ配列は、「シード」配列、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２位〜８位の領域にある配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完璧なワトソン−クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２位〜８位または２位〜７位を含み得る。一部の態様では、マイクロＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補性部位は、マイクロＲＮＡの１位に対向するアデニン（Ａ）が隣接している。一部の態様では、マイクロＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補性部位は、マイクロＲＮＡの１位に対向するアデニン（Ａ）が隣接している。例えば、Grimson A、Farh KK、Johnston WK、Garrett-Engele P、Lim LP、Bartel DP、Mol Cell.、２００７年７月６日、２７巻（１号）：９１〜１０５頁を参照されたい。マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列との完全な相補性を有する。
マイクロＲＮＡの同定、マイクロＲＮＡ標的領域、ならびにそれらの発現パターンおよび生物学における役割が、報告されている（Bonauerら、Curr Drug Targets、２０１０年、１１巻：９４３〜９４９頁；AnandおよびCheresh、Curr Opin Hematol、２０１１年、１８巻：１７１〜１７６頁；ContrerasおよびRao、Leukemia、２０１２年、２６巻：４０４〜４１３頁（２０１１年１２月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Bartel Cell、２００９年、１３６巻：２１５〜２３３頁；Landgrafら、Cell、２００７年、１２９巻：１４０１〜１４１４頁；GentnerおよびNaldini、Tissue Antigens.、２０１２年、８０巻：３９３〜４０３頁）。
例えば、組成物が、肝臓へと送達されるのを意図したものではないにもかかわらず、送達されてしまった場合、肝臓において豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２により、ｍｉＲ−１２２の１つまたは複数の標的部位が、その標的配列をコードするポリヌクレオチド内に操作されていれば、送達された配列の発現を阻害することができる。異なるマイクロＲＮＡの１つまたは複数の結合部位の導入は、生存性、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させるように操作することができ、したがって、さらに妥当性を重ねることができる。
本明細書において使用されるとき、「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡ標的部位もしくはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合または会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来的なワトソン−クリックハイブリダイゼーション則に従い得るか、またはマイクロＲＮＡと、マイクロＲＮＡ部位もしくはそれに隣接する標的配列との任意の安定な会合を反映し得ることを理解されたい。
対照的に、本発明の組成物の目的で、マイクロＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を増加させるために、それらが天然に存在する配列の外部で（すなわち、取り出して）操作されてもよい。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位は、肝臓におけるタンパク質発現を改善するために、取り出され得る。
具体的には、マイクロＲＮＡは、免疫細胞（造血系細胞とも称される）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて、差次的に発現されることが知られている。免疫細胞に特異的なマイクロＲＮＡは、免疫原性、自己免疫性、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療および組織／器官移植後の望ましくない免疫応答に関与する。免疫細胞に特異的なマイクロＲＮＡはまた、造血系細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化、およびアポトーシスの多数の側面を制御する。例えば、ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−１４６は、免疫細胞において排他的に発現され、特に、骨髄樹状細胞において豊富である。ｍｉＲ−１４２結合部位を、本発明のポリペプチドの３’−ＵＴＲへと導入することによって、ｍｉＲ−１４２により媒介されるｍＲＮＡの分解を通じて抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制し、プロフェッショナルＡＰＣ（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それによって、遺伝子送達後の抗原により媒介される免疫応答を防止することができる（例えば、Annoni Aら、blood、２００９年、１１４巻、５１５２〜５１６１頁を参照されたい）。
一実施形態では、免疫細胞、特に、抗原提示細胞において発現されることが知られているマイクロＲＮＡ結合部位を、ポリヌクレオチド内に操作して、マイクロＲＮＡにより媒介されるＲＮＡの分解を通じてＡＰＣにおけるポリヌクレオチドの発現を抑制し、抗原に媒介される免疫応答を緩和することができ、同時に、ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞に特異的なマイクロＲＮＡが発現されない非免疫細胞においては維持される。
様々ながん細胞／組織および他の疾患におけるマイクロＲＮＡの差次的発現をプロファイリングするために、多くのマイクロＲＮＡ発現に関する研究が行われており、当技術分野において説明されている。一部のマイクロＲＮＡは、ある特定のがん細胞において異常に過剰発現され、その他のものは、過少発現される。例えば、マイクロＲＮＡは、がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；がん幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵臓がんおよび疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）；喘息および炎症（ＵＳ８４１５０９６）；前立腺がん（ＵＳ２０１３／００５３２６４）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）；肺がん細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；結腸直腸がん細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；がん陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；上咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）；甲状腺がん（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣がん細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病およびリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３）において、差次的に発現される。
マイクロＲＮＡ配列ならびにターゲティングされる組織および／または細胞の非限定的な例は、配列番号６３２〜４，７１５に記載されている。
ゲノム操作戦略
一部の態様では、本開示の方法は、対立遺伝子のうちの一方または両方の編集を含み得る。遺伝子を編集して対立遺伝子を修飾することは、標的遺伝子または遺伝子産物を恒久的に変更する利点を有する。
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法のステップは、ゲノム操作を使用して、患者から単離した肝細胞を編集することを含み得る。あるいは、本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法のステップは、患者特異的なｉＰＳＣまたは間葉幹細胞を編集することを含み得る。同様に、本発明のｉｎ ｖｉｖｏ方法のステップは、ゲノム操作を使用して、脂質異常症患者における細胞を編集することを含む。同様に、本開示の細胞内での方法におけるステップは、ゲノム操作によって、ヒト細胞内のＰＣＳＫ９遺伝子を編集することを含み得る。
任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを、本開示の方法において使用することができ、それぞれのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、疾患特異的な場合もあり、疾患特異的でない場合もある、それ自体と関連するＰＡＭを有する。
例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現は、不正確なＮＨＥＪ修復経路に起因して生じる、ランダムな挿入または欠失（インデル）を導入することによって、破壊または排除することができる。標的領域は、ＰＣＳＫ９遺伝子のコーディング配列（すなわち、エクソン）であり得る。遺伝子のコーディング配列へのヌクレオチドの挿入および欠失は、正常な３文字コドンのパターンが乱れる、「フレームシフト」を引き起こし得る。このようにして、遺伝子発現およびしたがってタンパク質の産生が、低減または排除され得る。このアプローチはまた、ＰＣＳＫ９遺伝子の任意のイントロン、イントロン：エクソン接合部、または配列の変更によりＰＣＳＫ９遺伝子の発現が妨害され得るＰＣＳＫ９遺伝子の制御性ＤＮＡエレメントをターゲティングするために使用することができる。
別の例として、ＮＨＥＪはまた、遺伝子内またはその近傍のセグメントを、直接的にか、または複数の位置をターゲティングする１つのｇＲＮＡもしくは複数のｇＲＮＡによる切断を通じて、スプライスドナーもしくはアクセプター部位を変更することによってのいずれかで、欠失させるために使用することができる。これは、小規模なランダムインデルでは、標的遺伝子をノックアウトするのに不十分である場合に、有用であり得る。ガイド鎖の対が、この種類の欠失に使用されている。
ドナーが存在しない場合、接合部において塩基対合をほとんどまたは全く伴わずにＤＮＡ末端を接合させる、いくつかの非相同性修復経路を使用して、ＤＮＡ切断に由来する末端または異なる切断に由来する末端を接合させることができる。カノニカルのＮＨＥＪに加えて、ａｌｔ−ＮＨＥＪなど、同様の修復機構が存在する。２つの切断が存在する場合、介在するセグメントを、欠失させることもでき、反転させることもできる。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部において、挿入、欠失、または突然変異をもたらし得る。
ＮＨＥＪはまた、相同性非依存性標的組込みをもたらし得る。例えば、ドナープラスミドにおけるヌクレアーゼ標的部位の包含により、ドナーおよび染色体の両方のｉｎ ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ切断後に、染色体二本鎖切断へのトランス遺伝子の組込みが促進され得る（Cristea.、Biotechnol Bioeng.、２０１３年３月、１１０巻（３号）：８７１〜８０頁）。
ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼによる切断の後において、１５ｋｂの誘導的遺伝子発現カセットを、ヒト細胞株内の規定されたローカスへと挿入するのに使用した。（例えば、Maresca, M.、Lin, V.G.、Guo, N.、およびYang, Y.、Genome Res、２３巻、５３９〜５４６頁（２０１３年）；Cristeaら、Biotechnology and Bioengineering、２０１３年、８７１〜８０頁、１０．１００２／ｂｉｔ．２４７３３；Suzukiら、Nature、５４０巻、１４４〜１４９頁（２０１６年）を参照されたい）。組み込まれた配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子のリーディングフレームを破壊し得るか、または遺伝子の構造を変更し得る。
さらなる代替手段として、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）もまた、遺伝子をノックアウトするかまたは遺伝子機能を変更するために使用することができる。ＨＤＲは、本質的に、ＤＳＢ修復中に、供給された相同性ＤＮＡ配列を鋳型として使用する、エラーのない機序である。ＨＤＲ率は、突然変異と切断部位との距離の関数であるため、重複するかまたは最も近傍の標的部位を選ぶことが重要である。鋳型は、相同性領域が隣接する余剰配列を含み得るか、またはゲノム配列とは異なり、それによって配列編集が可能となる配列を含み得る。
例えば、ＨＤＲノックアウト戦略は、ＰＣＳＫ９遺伝子の構造または機能を、非機能性配列または無関係な配列を遺伝子挿入するか、または遺伝子の一部をそれで置き換えることによって、破壊することを含み得る。これは、ＨＤＲに対する細胞内ＤＳＢ応答を導くために外部から導入したドナーＤＮＡ鋳型の存在下において、１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび１つのｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ）を用いて目的の遺伝子に１つの一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導するか、または１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび２つもしくはそれよりも多くのｇＲＮＡを用いて目的の遺伝子に２つもしくはそれよりも多くの一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導することによって、達成することができる（ドナーＤＮＡ鋳型は、短い一本鎖オリゴヌクレオチド、短い二本鎖オリゴヌクレオチド、長い一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であり得る）。このアプローチは、ＰＣＳＫ９遺伝子のためのｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡ分子の開発および最適化を必要とし得る。
相同性により導かれる修復とは、ＤＳＢを修復するための細胞機構である。最も一般的な形態は、相同組換えである。ＨＤＲには、一本鎖アニーリングおよび代替的ＨＤＲを含む、さらなる経路が存在する。ゲノム操作ツールは、研究者が、ゲノムに対して、部位特異的修飾を創出するように、細胞の相同組換え経路を操作することを可能とする。細胞は、トランスに供給される合成のドナー分子を使用して、二本鎖切断を修復しうることが見出されている。特異的切断は、相同なドナー単独を供給される細胞１０６個中に１回の比率の１，０００倍を超えて、ＨＤＲ率を増大させる。特定のヌクレオチドにおける相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）率は、切断部位までの距離の関数であるので、重複するかまたは最近傍の標的部位を選び出すことが重要である。
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは、顕著に変動するが、小型または大型のフランキング相同性アームを伴う配列であって、ゲノムＤＮＡとのアニーリングを可能とする意図される配列を含有しうる。導入される遺伝子変化を挟む相同性領域は、３０ｂｐまたはこれより小型の場合もあり、マルチキロベースという大型のカセットの場合もあり、これらは、プロモーター、ｃＤＮＡなどを含有しうる。一本鎖オリゴヌクレオチドドナーおよび二本鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれも使用されている。これらのオリゴヌクレオチドは、１００ｎｔ未満〜多くのｋｂを超えるサイズの範囲であるが、より長いｓｓＤＮＡもまた、作出および使用しうる。ＰＣＲ単位複製配列、プラスミド、およびミニサークルを含む、二本鎖ドナーを使用することができる。一般に、ＡＡＶベクターは、ドナー鋳型の送達の極めて有効な手段でありうることが見出されているが、個々のドナーに対するパッケージング限界が＜５ｋｂである。ドナーの能動的転写が、ＨＤＲを３倍に増大させたことから、プロモーターを含むことが、転換を増大させうることが指し示される。逆に、ドナーのＣｐＧのメチル化は、遺伝子発現およびＨＤＲを減少させる。
Ｃａｓ９などの野生型エンドヌクレアーゼに加えて、一方のヌクレアーゼドメインまたは他方のヌクレアーゼドメインを不活化させる結果として、１つのＤＮＡ鎖だけの切断をもたらしうる、ニッカーゼ変異体が存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼにより導くこともでき、標的領域を挟むニッカーゼ対を使用して導くこともできる。ドナーは、一本鎖の場合もあり、ニック処理されている場合もあり、ｄｓＤＮＡの場合もある。
ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼと共に供給することもでき、様々な異なる方法、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、またはウイルスを介する形質導入により、独立に供給することもできる。ある範囲のテザリングの選択肢であって、ＨＤＲのためのドナーのアベイラビリティーを増大させる選択肢が提起されている。例は、ドナーの、ヌクレアーゼへの接合、近傍に結合するＤＮＡ結合性タンパク質への接合、またはＤＮＡ末端における結合もしくは修復に関与するタンパク質への接合を含む。
修復経路の選択は、細胞周期に影響を及ぼす培養条件など、いくつかの培養条件により導くこともでき、ＤＮＡ修復および関連タンパク質のターゲティングにより導くこともできる。例えば、ＨＤＲを増大させるために、ＫＵ７０、ＫＵ８０、またはＤＮＡリガーゼＩＶなど、鍵となるＮＨＥＪ分子を抑制することができる。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路およびＨＤＲの両方を使用する、部位特異的遺伝子挿入が、実施されている。
ＰＣＳＫ９遺伝子は、表３に示されるいくつかのエクソンを含む。これらのエクソンまたは近傍のイントロンのうちのいずれか１つまたは複数は、リーディングフレームを破壊し、最終的にＰＣＳＫ９タンパク質活性を排除する、１つまたは複数の挿入または欠失を創出するために、ターゲティングすることができる。
一部の実施形態では、本方法は、望ましくない配列に隣接する位置で遺伝子を２回切断することによって欠失を作製する、ｇＲＮＡ対を提供し得る。この配列には、１つまたは複数のエクソン、イントロン、イントロン：エクソン接合部、ＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列、またはこれらの組合せが含まれ得る。切断は、それぞれがゲノムにＤＳＢを作製する１対のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、または一緒になってゲノムにＤＳＢを作製する複数のニッカーゼによって、達成することができる。
あるいは、本方法は、コーディングまたはスプライシング配列内に１つの二本鎖切断を作製する１つのｇＲＮＡを提供し得る。二本鎖切断は、単一のＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは一緒になってゲノムにＤＳＢを作製する複数のニッカーゼによって、作製され得る。
スプライシングドナーおよびアクセプターは、一般に、隣接するイントロンの１００塩基対以内にある。一部の例では、本方法は、目的とされるそれぞれのエクソン／イントロン接合部に対して、±およそ１００〜３１００ｂｐで切断するｇＲＮＡを提供し得る。
ゲノム編集戦略のいずれについても、遺伝子編集は、シークエンシングまたはＰＣＲ分析によって確認することができる。
標的配列の選択
５’境界部および／または３’境界部の位置の、特定の基準ローカスと比べたシフトを使用して、本明細書でさらに記載および例示される、編集のために選択されるエンドヌクレアーゼ系に部分的に依存する、遺伝子編集の特定の適用を容易とするかまたは増強することができる。
このような標的配列選択の第１の非限定的な例では、多くのエンドヌクレアーゼ系は、切断のための潜在的な標的部位の初期の選択を導き得る規則または基準、例えば、ＰＡＭ配列モチーフの要件、特に、ＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの場合における、ＤＮＡ切断部位に隣接する位置を有する。
標的配列の選択または最適化についての別の非限定的例では、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組合せについての「オフ標的」活性の頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位で、ＤＳＢが生じる頻度）を、オン標的活性の頻度と比べて評価することができる。場合によって、所望のローカスにおいて適正に編集された細胞は、他の細胞と比べて、選択的利点を有しうる。選択的利点についての、例示的であるが非限定的な例は、複製速度の増強、存続性、ある特定の条件に対する耐性、患者への導入後のｉｎ ｖｉｖｏにおける、生着成功率または存続率の増強などの属性、およびこのような細胞の維持または数もしくは生存率の増大と関連する他の属性の獲得を含む。他の場合には、所望のローカスで適正に編集された細胞を、適正に編集された細胞を同定するか、分取するか、または他の形で選択するのに使用される、１または複数のスクリーニング法により、正に選択することができる。選択的利点および指向選択法のいずれも、変更と関連する表現型を利用しうる。場合によって、意図された細胞集団を選択または精製するのに使用される新たな表現型を創出する第２の修飾を創出するために、細胞を、２回またはこれを超える回数にわたり編集することができる。このような第２の修飾は、選択可能またはスクリーニング可能マーカーのための、第２のｇＲＮＡを付加することにより創出しうるであろう。場合によって、ｃＤＮＡを含有し、また、選択可能マーカーも含有するＤＮＡ断片を使用して、細胞を、所望のローカスにおいて、適正に編集することができる。
特定の場合に、いずれかの選択的利点が適用可能であるのであれ、いずれかの指向選択を適用するのであれ、適用の有効性を増強し、かつ／または所望の標的以外の部位における、所望されない変更の潜在的可能性を低減するために、標的配列の選択はまた、オフ標的頻度の考慮によっても導くことができる。本明細書および当技術分野で、さらに記載および例示される通り、オフ標的活性の発生は、標的部位と多様なオフ標的部位との間の類似性および相違性のほか、使用される特定のエンドヌクレアーゼも含む、いくつかの因子の影響を受ける可能性がある。オフ標的活性の予測の一助となる、バイオインフォマティクスツールが利用可能であり、このようなツールはまた、オフ標的活性の可能性が最も高い部位を同定し、次いで、これを、実験状況下で評価して、オフ標的の、オン標的活性に対する相対頻度について査定することができ、これにより、より高度な相対オン標的活性を有する配列の選択を可能とするのにも使用しうることが多い。本明細書では、このような技法の実例を提示するが、当技術分野では、他の例が公知である。
標的配列選択の別の態様は、相同組換えイベントに関する。相同性領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす、相同組換えイベントのための焦点として用いられうる。このような組換えイベントは、染色体および他のＤＮＡ配列の、通常の複製経過中に生じ、また、通常の細胞複製周期中に定期的に生じるが、多様なイベント（ＵＶ光およびＤＮＡ切断の他の誘導因子など）の発生により増強される場合もあり、ある特定の薬剤（多様な化学的誘導因子など）の存在により増強される場合もある、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合など、ＤＮＡ配列が合成される他の時点においても生じる。多くのこのような誘導因子は、ＤＳＢを、ゲノム内で、無差別的に生じさせ、ＤＳＢは、通常の細胞内で、定期的に誘導および修復されうる。修復中に、元の配列は、完全な忠実度で再構築されうるが、場合によって、小規模の挿入または欠失（「インデル」と称する）が、ＤＳＢ部位に導入される。
ＤＳＢはまた、本明細書で記載されるエンドヌクレアーゼ系の場合のように、特定の位置において、特異的に誘導することもできるが、これを使用して、選択された染色***置において、導かれたかまたは優先的な遺伝子修飾イベントを引き起こすことができる。相同な配列が、ＤＮＡ修復（ならびに複製）において組換えを起こす傾向は、いくつかの状況において利用することができ、相同性により導かれる修復を使用して、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を介して供給される目的の配列を、所望の染色***置へと挿入する、ＣＲＩＳＰＲなど、遺伝子編集系の１つの適用のための基盤である。
「マイクロ相同性」の小領域であって、１０塩基対またはこれ未満という少数の塩基対を含みうる小領域でありうる、特定の配列の間の相同性の領域もまた、所望の欠失をもたらすのに使用することができる。例えば、単一のＤＳＢを、近傍の配列とのマイクロ相同性を呈する部位に導入することができる。このようなＤＳＢの修復の通常の経過中に、高頻度で生じる結果は、ＤＳＢおよび共時的な細胞の修復工程により容易とされる組換えの結果としての、介在配列の欠失である。
しかし、一部の状況では、相同性の領域内で、標的配列を選択することはまた、遺伝子融合（欠失が、コーディング領域内にある場合）を含む、はるかに大型の欠失ももたらしうるが、これは、特定の状況下を考慮して、所望される場合もあり、所望されない場合もある。
本明細書に提示される例は、ＰＣＳＫ９タンパク質活性の低減または排除を生じる挿入、欠失、または突然変異を誘導するようにデザインされたＤＳＢを創出するための、多様な標的領域の選択、ならびにオン標的イベントと比べてオフ標的イベントを最小化するようにデザインされたそのような領域内の特定の標的配列の選択をさらに例示する。
ヒト細胞
本明細書に記載および例示されるように、脂質異常症またはＰＣＳＫ９と関連する任意の障害の改善に関して、遺伝子編集の主要な標的は、ヒト細胞である。例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ方法では、ヒト細胞は、体細胞であり得、体細胞は、記載される技法を使用して修飾された後に、分化した細胞、例えば、肝細胞または始原細胞を生じ得る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ方法では、ヒト細胞は、肝細胞、腎臓細胞、または他の罹患器官に由来する細胞であり得る。
それを必要とする患者に由来し、したがって、既に患者と完全にマッチしている自家細胞内で遺伝子編集を実施することにより、患者へと安全に再導入することが可能であり、患者の疾患と関連する、１または複数の臨床状態の改善において有効である細胞集団を効果的にもたらす細胞を作出することが可能である。
幹細胞は、増殖およびより多くの始原細胞をもたらすことのいずれもが可能であり、分化細胞または分化可能な娘細胞をもたらしうる、多数の母細胞を発生させる能力を有する。娘細胞自体が、増殖し、その後、１または複数の成熟細胞型へと分化する一方で、また、親の発生的潜在能を伴う１または複数の細胞も保持する後代をもたらすように、誘導することができる。次いで、「幹細胞」という用語は、特定の状況下では、より特化したまたは分化した表現型へと分化する能力または潜在的能力を伴い、ある特定の状況下では、実質的に分化せずに、増殖する能力を保持する細胞を指す。一態様では、始原細胞または幹細胞という用語は、それらの子孫細胞（後代）が分化により、例えば、胚細胞および組織の、進行する多様化においてそうであるように、完全に個別の性格を獲得することにより、しばしば、異なる方向に特化する汎用母細胞を指す。細胞の分化とは、典型的に、多くの細胞***を介して生じる、複雑な過程である。分化細胞は、複能性細胞に由来することが可能であり、複能性細胞はそれ自体、複能性細胞に由来するなどである。これらの複能性細胞の各々は、幹細胞であると考えられるが、各々がもたらしうる細胞型の範囲は、大幅に変動しうる。一部の分化細胞もまた、発生的潜在能が大きな細胞をもたらす能力を有する。このような能力は、天然の場合もあり、多様な因子による処理時に、人工的に誘導される場合もある。多くの生物学的事例では、幹細胞はまた、１つを超える別個の細胞型の後代をもたらしうるため、「複能性」でもありうるが、これは、「幹細胞性」であるために必要ではない。
自己再生は、幹細胞の別の重要な側面でありうる。理論的に、自己再生は、２つの主要な機構のうちのいずれかにより生じうる。幹細胞は、一方の娘細胞が、幹細胞状態を保持し、他方の娘細胞が、何らかの別個の他の特異的機能および表現型を発現して、非対称的に***する場合がある。代替的に、集団内の幹細胞の一部が、２つの幹細胞へと、対称的に***することが可能であり、これにより、全体としての集団内に一部の幹細胞を維持するのに対し、集団内の他の細胞は、分化した後代だけをもたらす。一般に、「始原細胞」は、より始原性である（すなわち、発生経路または進行に沿って、完全な分化細胞より早期の段階にある）、細胞の表現型を有する。始原細胞はまた、顕著な、または極めて高度な、増殖潜在能も有する。始原細胞は、細胞が発生および分化する、発生の経路および環境に応じて、複数の別個の分化細胞型をもたらす場合もあり、単一の分化細胞型をもたらす場合もある。
細胞の個体発生の文脈では、「分化した」または「〜を分化させること」という形容詞は、相対的な用語である。「分化細胞」とは、比較する細胞より、発生経路をさらに下に進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、分化系統限定前駆細胞（筋細胞の始原細胞など）へと分化することが可能であり、これは、経路をさらに下った、他の種類の前駆細胞（筋細胞の前駆細胞など）へと分化することが可能であり、次いで、筋細胞など、最終段階の分化細胞へと分化し、ある特定の組織型において、特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持する場合もあり、保持しない場合もある。
誘導多能性幹細胞
本明細書で記載される、遺伝子操作されたヒト細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）でありうる。ｉＰＳＣを使用する利点は、細胞を、始原細胞が投与される同じ対象から導出しうることである。すなわち、体細胞は、対象から得、誘導多能性幹細胞へと再プログラム化し、次いで、対象へと投与するように、始原細胞へと再分化させることができる（例えば、自家細胞）。始原細胞は、自家供給源から本質的に導出されるため、別の対象または対象群に由来する細胞の使用と比較して、生着拒絶またはアレルギー応答の危険性を低減することができる。加えて、ｉＰＳＣの使用は、胚供給源から得られた細胞に対する必要も無化する。したがって、一態様では、開示される方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
分化は、生理学的文脈では、一般に、不可逆的であるが、体細胞を、ｉＰＳＣへと再プログラム化するためのいくつかの方法が最近開発されている。当業者には、例示的な方法が公知であり、本明細書の下記で略述する。
「〜を再プログラム化すること」という用語は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変更するまたは逆行させ工程を指す。言い換えると、再プログラム化することとは、細胞の分化を、より未分化なまたはより始原的な細胞型へと戻すように駆動する工程を指す。多くの初代細胞を培養することは、完全な分化特徴の、何らかの喪失をもたらしうることに留意されたい。したがって、分化細胞という用語に含まれるこのような細胞を単に培養するだけで、これらの細胞が、非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞となるわけではない。分化細胞から多能性への移行は、培養物中で分化的性格の部分的な喪失をもたらす刺激を越えた、再プログラム化刺激を要求する。再プログラム化細胞はまた、培養物中では一般に、回数の限定された***能だけを有する初代親細胞と比べて、増殖可能性の喪失を伴わない、拡大継代能の特徴も有する。
再プログラム化されるべき細胞は、再プログラム化する前に、部分分化している場合もあり、最終分化している場合もある。再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、多能性状態または複能性状態への完全な逆行を包含しうる。再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全なまたは部分的な逆行を包含しうる。再プログラム化は、細胞による特定の遺伝子であって、その発現が、再プログラム化にさらに寄与する遺伝子の発現をもたらしうる。本明細書で記載されるある特定の例では、分化細胞（例えば、体細胞）の再プログラム化は、分化細胞に、未分化状態を取らせうる（例えば、分化細胞を、未分化細胞としうる）。結果として得られる細胞を、「再プログラム化細胞」または「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）」と称する。
再プログラム化は、細胞の分化の間に生じる遺伝パターンであって、核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、後成的変化、ゲノムインプリンティングなどの遺伝性パターンの少なくとも一部の変更、例えば、逆行を伴いうる。再プログラム化は、既に多能性である細胞の、既存の未分化状態を単に維持すること、または既に複能性細胞（例えば、筋原性幹細胞）である細胞の、既存の完全未満の分化状態を維持することとは別個である。再プログラム化はまた、既に多能性または複能性である細胞の自己再生または増殖の促進とも別個であるが、一部の例では、本明細書で記載される組成物および方法はまた、このような目的でも有用でありうる。
当技術分野では、体細胞から多能性幹細胞を作出するのに使用しうる多くの方法が公知である。体細胞を、多能性表現型へと再プログラム化する、任意のこのような方法が、本明細書で記載される方法における使用に適切であろう。
転写因子の規定された組合せを使用して、多能性細胞を作出するための再プログラム化法については記載されている。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの直接的な形質導入により、マウス体細胞を、発生の潜在能を拡大した、ＥＳ細胞様細胞へと転換することができる（例えば、TakahashiおよびYamanaka、Cell、１２６巻（４号）：６６３〜７６頁（２００６年）を参照されたい）。ｉＰＳＣは、多能性関連の転写回路およびエピジェネティックランドスケープの大半を修復するので、ＥＳ細胞に似ている。加えて、マウスｉＰＳＣは、多能性についての全ての標準的アッセイ：具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、三胚葉の細胞型への分化、奇形腫の形成、キメラへの寄与、生殖細胞系列伝達［例えば、MaheraliおよびHochedlinger、Cell Stem Cell、３巻（６号）：５９５〜６０５頁（２００８年）を参照されたい］、および四倍体補完法を満たす。
ヒトｉＰＳＣは、同様の形質導入法を使用して得ることができ、転写因子のトリオである、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧは、多能性を統御する転写因子のコアセットとして確立されている（例えば、BudniatzkyおよびGepstein、Stem Cell Transl Med.、３巻（４号）：４４８〜５７頁（２０１４年）；Barrettら、Stem Cell Trans Med、３巻：１〜６頁、ｓｃｔｍ．２０１４−０１２１（２０１４年）；Focosiら、Blood Cancer Journal、４巻：ｅ２１１頁（２０１４年）；ならびにこれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。ｉＰＳＣの作製は、従来通りにウイルスベクターを使用して、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸配列を、成体の体細胞へと導入することにより達成することができる。
ｉＰＳＣは、最終分化した体細胞から作出または導出しうるほか、成体幹細胞または体細胞性幹細胞から作出または導出することもできる。すなわち、非多能性始原細胞を、再プログラム化することにより、多能性または複能性とすることができる。このような場合、最終分化細胞を再プログラム化するのに要求されるほど多くの再プログラム化因子を含むことが必要ではない場合がある。さらに、再プログラム化は、再プログラム化因子の非ウイルス的導入により誘導することができ、例えば、タンパク質自体を導入することにより、または再プログラム化因子をコードする核酸を導入することにより、または翻訳時に再プログラム化因子をもたらすメッセンジャーＲＮＡを導入することにより誘導することができる（例えば、Warrenら、Cell Stem Cell、７巻（５号）：６１８〜３０頁（２０１０年）を参照されたい）。再プログラム化は、例えば、Ｏｃｔ−４（Ｏｃｔ−３／４またはＰｏｕｆ５１としてもまた公知）、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、およびＬＩＮ２８を含む幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組合せを導入することにより達成することができる。本明細書で記載される方法および組成物を使用する再プログラム化は、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘファミリーのメンバー、Ｋｌｆファミリーのメンバー、およびＭｙｃファミリーのメンバーのうちの１または複数を、体細胞へと導入することをさらに含みうる。本明細書で記載される方法および組成物は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ＭＹＣ、およびＫｌｆ４のそれぞれのうちの１もしくは複数を、再プログラム化のために導入することをさらに含みうる。上記で言及した通り、再プログラム化のために使用される正確な方法は、本明細書で記載される方法および組成物にとって、必ずしも不可欠なわけではない。しかし、再プログラム化細胞から分化させた細胞を、例えば、ヒト治療において使用するべき場合、一態様では、再プログラム化は、ゲノムを変更する方法により行うわけではない。したがって、このような例では、再プログラム化は、例えば、ウイルスまたはプラスミドベクターを使用せずに達成することができる。
出発細胞集団から導出される再プログラム化の効率（すなわち、再プログラム化細胞の数）は、Shiら、Cell-Stem Cell、２巻：５２５〜５２８頁（２００８年）；Huangfuら、Nature Biotechnology、２６巻（７号）：７９５〜７９７頁（２００８年）；およびMarsonら、Cell-Stem Cell、３巻：１３２〜１３５頁（２００８年）により示される通り、多様な薬剤、例えば、低分子の添加により増強することができる。したがって、誘導多能性幹細胞作製の効率または速度を増強する薬剤または薬剤の組合せを、患者特異的または疾患特異的ｉＰＳＣの作製において使用することができる。再プログラム化効率を増強する薬剤の一部の非限定的な例は、とりわけ、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ馴化培地、ＢＩＸ−０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５’−アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、およびトリコスタチン（ＴＳＡ）を含む。
再プログラム化増強剤の他の非限定的な例は、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えば、ＭＫ０６８３、ボリノスタット）および他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ−２１０、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ（例えば、（−）−Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ）、ＨＣトキシン、Ｎｕｌｌｓｃｒｉｐｔ（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ，３Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）、フェニルブチレート（例えば、フェニル酪酸ナトリウムおよびバルプロ酸（ＶＰＡ）および他の短鎖脂肪酸）、Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、酪酸ナトリウム、酪酸ピバロイルオキシメチル（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ−９）、Ｔｒａｐｏｘｉｎ Ｂ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としてもまた公知である）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ−９９４（例えば、Ｎ−アセチルジナリン）およびＭＳ−２７−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４、ＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、Ｔｕｂａｃｉｎ、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（例えば、６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１、およびＣＨＡＰ５０を含む。他の再プログラム化増強剤は、例えば、ＨＤＡＣのドミナントネガティブ形態（例えば、触媒不活性形態）、ｓｉＲＮＡによるＨＤＡＣ阻害剤、およびＨＤＡＣに特異的に結合する抗体を含む。このような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、およびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
本明細書で記載される方法による使用のための多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離されたクローンを、幹細胞マーカーの発現について調べることができる。体細胞から導出された細胞内のこのような発現により、細胞を、誘導多能性幹細胞として同定する。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔｌ、Ｅｓｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘｌ、Ｕｔｆｌ、およびＮａｔｌを含む非限定的な群から選択することができる。１つの場合には、例えば、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現しる細胞は、多能性であると同定される。このようなマーカーの発現を検出するための方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、およびウェスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析など、コードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法を含みうる。検出は、ＲＴ−ＰＣＲを伴いうるだけでなく、タンパク質マーカーの検出も含みうる。細胞内マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲ、または免疫細胞化学などのタンパク質検出法を介して、最もよく同定しうるが、細胞表面マーカーは、例えば、免疫細胞化学によりたやすく同定される。
単離された細胞の多能性幹細胞性は、ｉＰＳＣが、三胚葉の各々の細胞へと分化する能力について査定する試験により確認することができる。一例として述べると、ヌードマウスにおける奇形腫形成を使用して、単離されたクローンの多能性について査定することができる。細胞を、ヌードマウスへと導入し、細胞から生じる腫瘍に対して、組織学および／または免疫組織化学を実施することができる。三胚葉全てに由来する細胞を含む腫瘍の増殖は、例えば、細胞が多能性幹細胞であることをさらに指し示す。
肝細胞
一部の態様では、本明細書に記載される遺伝子操作されたヒト細胞は、肝細胞である。肝細胞は、肝臓の主要な実質組織の細胞である。肝細胞は、肝臓の質量の７０〜８５％を占めている。これらの細胞は、タンパク質の合成、タンパク質の貯蔵、炭水化物の形質転換、コレステロール、胆汁塩、およびリン脂質の合成、外因性および内因性物質の解毒、修飾、および***、ならびに胆汁の形成および分泌の開始に関与する。
患者特異的なｉＰＳＣの創出
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の１つのステップは、患者特異的な１つのｉＰＳ細胞、患者特異的な複数のｉＰＳ細胞、または患者特異的なｉＰＳ細胞株を創出することを含み得る。TakahashiおよびYamanaka、２００６年；Takahashi、Tanabeら、２００７年において記載されている通り、当技術分野では、患者特異的なｉＰＳ細胞を創出するための多くの方法が確立されている。例えば、創出するステップは、ａ）体細胞、例えば、皮膚細胞または線維芽細胞を、患者から単離すること、およびｂ）多能性幹細胞となるように細胞を誘導するために、多能性関連遺伝子のセットを、体細胞へと導入することを含み得る。多能性関連遺伝子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ−ＭＹＣ、ｎ−ＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ、およびＬＩＮ２８からなる群から選択される遺伝子のうちの１つまたは複数であり得る。
患者の肝臓または骨髄の生検または吸引の実施
生検または吸引物は、身体から採取される組織または体液の試料である。多数の異なる種類の生検または吸引物が存在する。それらのほぼすべてが、鋭利なツールを使用して、少量の組織を摘出することを含む。生検が、皮膚または他の感受性領域に行われる場合、麻痺させる薬を、最初に適用してもよい。生検または吸引は、当技術分野において公知の方法のうちのいずれかに従って実施され得る。例えば、生検の場合、針を、腹部の皮膚を通じて肝臓に注射し、肝臓組織が捕捉される。例えば、骨髄吸引の場合、大きな針を使用して、骨盤の骨に進入させ、骨髄を採取する。
肝臓特異的始原細胞または初代肝細胞の単離
肝臓特異的始原細胞および初代肝細胞は、当技術分野において公知の任意の方法に従って、単離することができる。例えば、ヒト肝細胞を、新しい外科手術標本から単離する。健常な肝臓組織を使用して、コラゲナーゼ消化によって肝細胞を単離する。得られた細胞懸濁液を、１００ｍｍのナイロンメッシュに通して濾過し、５０ｇで５分間の遠心分離によって沈殿させ、再懸濁させ、低温洗浄培地において２〜３回洗浄する。新しい肝臓調製物から得られた肝細胞を、ストリンジェントな条件下において培養することによって、ヒト肝臓幹細胞を得る。コラーゲンコーティングプレートに播種した肝細胞を、２週間培養する。２週間後に、生存している細胞を取り出し、幹細胞マーカーの発現に関して特徴付ける（Herreraら、STEM CELLS２００６年、２４巻：２８４０〜２８５０頁）。
間葉幹細胞の単離
間葉幹細胞は、当技術分野において公知の任意の方法に従って、患者の骨髄または末梢血などから単離することができる。例えば、骨髄吸引物を、ヘパリンを有するシリンジに採取してもよい。細胞を、洗浄し、Ｐｅｒｃｏｌｌにおいて遠心分離してもよい。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）において培養してもよい（Pittinger MF、Mackay AM、Beck SCら、Science、１９９９年、２８４巻：１４３〜１４７頁）。
遺伝子改変細胞
「遺伝子改変細胞」という用語は、ゲノム編集によって（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系を使用して）導入された少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞を指す。本明細書における一部のｅｘ ｖｉｖｏでの例では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変された始原細胞であり得る。本明細書における一部のｉｎ ｖｉｖｏでの例では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変された肝臓細胞であり得る。外因性ゲノムターゲティング核酸および／またはゲノムターゲティング核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝子改変細胞が、本明細書において想定される。
「対照で処置された集団」という用語は、ゲノム編集の構成要素の付加を除き、同一な培地、ウイルスによる誘導、核酸配列、温度、コンフルエンシー、フラスコサイズ、ｐＨなどで処置された細胞の集団について記載する。当技術分野において公知の任意の方法、例えば、ＰＣＳＫ９タンパク質のウエスタンブロット分析、またはＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡを定量化するためのリアルタイムＰＣＲを使用して、ＰＣＳＫ９遺伝子の転写またはタンパク質の発現もしくは活性を測定することができる。
「単離細胞」という用語は、それが元来見出される生物から取り出された細胞、またはこのような細胞の子孫を指す。任意選択で、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、規定された条件下、または他の細胞の存在下で培養することができる。任意選択で、細胞は、後に、第２の生物へと導入することもでき、それが単離された生物（またはそれを子孫とする細胞）へと再導入することもできる。
細胞の単離集団に関する「単離集団」という用語は、混合細胞集団または異質細胞集団から、取り出され、分離された細胞集団を指す。場合によって、単離集団は、細胞がそこから単離されるかまたは濃縮された異質集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団でありうる。場合によって、単離集団は、ヒト始原細胞の単離集団、例えば、ヒト始原細胞と、ヒト始原細胞がそこから導出された細胞とを含む異質細胞集団と比較して、実質的に純粋なヒト始原細胞の集団でありうる。
特定の細胞集団に関する、「実質的に増強された」という用語は、特定の種類の細胞の発生が、例えば、脂質異常症を改善するための、このような細胞の所望のレベルに応じて、既存のまたは基準レベルと比べて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍、またはこれを超える倍数だけ増大する細胞集団を指す。
特定の細胞集団に関する「実質的に濃縮された」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に照らして、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、またはこれを超える細胞集団を指す。
特定の細胞集団に関する「実質的に濃縮された」または「実質的に純粋」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に照らして、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。すなわち、始原細胞集団に関して、「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、本明細書の用語により規定される始原細胞ではない細胞であって、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満より少数の細胞を含有する細胞集団を指す。
ゲノム編集したｉＰＳＣの、他の細胞型への分化
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、ゲノム編集したｉＰＳＣを、肝細胞へと分化させることを含み得る。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。例えば、ｈｉＰＳＣを、アクチビンおよびＢ２７補充（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む、様々な処置を使用して、胚体内胚葉へと分化させる。胚体内胚葉を、さらに、肝細胞へと分化させるが、処置には、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、オンコスタチンＭ、デキサメタゾンなどが含まれる（Duanら、STEM CELLS、２０１０年；２８巻：６７４〜６８６頁、Maら、STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE、２０１３年、２巻：４０９〜４１９頁）。
ゲノム編集した間葉幹細胞の、肝細胞への分化
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、ゲノム編集した間葉幹細胞を、肝細胞へと分化させることを含み得る。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。例えば、ｈＭＳＣを、インスリン、トランスフェリン、ＦＧＦ４、ＨＧＦ、胆汁酸を含む、様々な因子およびホルモンで処置する（Sawitza Iら、Sci Rep.、２０１５年、５巻：１３３２０頁）。
細胞の、患者への植込み
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、肝細胞を、患者へと植え込むことを含み得る。この植え込むステップは、当技術分野で公知の任意の植込み方法を使用して、達成することができる。例えば、遺伝子改変細胞を、患者の血液に直接的に注射してもよく、またはそうでなければ、患者に投与してもよい。
本発明のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、始原細胞または初代肝細胞を、患者へと植え込むことを含む。この植え込むステップは、当技術分野で公知の任意の植込み方法を使用して、達成することができる。例えば、遺伝子改変細胞を、患者の肝臓に直接的に注射してもよく、またはそうでなければ、患者に投与してもよい。
ＩＩＩ．製剤化および送達
薬学的に許容される担体
本明細書で想定される、始原細胞を対象へと投与するｅｘ ｖｉｖｏ方法は、始原細胞を含む治療用組成物の使用を伴う。
治療用組成物は、細胞組成物と併せた、生理学的に忍容可能な担体と、任意選択で、本明細書で記載される、少なくとも１つのさらなる生体活性薬剤であって、その中に、有効成分として溶解または分散させた生体活性薬剤とを含有しうる。場合によって、治療用組成物は、治療目的で、哺乳動物またはヒト患者へと投与される場合、そうであることが所望されない限りにおいて、実質的に免疫原性ではない。
一般に、本明細書で記載される始原細胞は、薬学的に許容される担体を伴う懸濁液として投与することができる。当業者は、細胞組成物中で使用される、薬学的に許容される担体は、緩衝剤、化合物、低温保存剤、保存剤、または他の薬剤を、対象へと送達される細胞の生存率に実質的に干渉する量では含まないことを認識する。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性の維持を可能とする浸透圧緩衝剤と、任意選択で、細胞生存率を維持するか、または投与時における生着を増強する栄養物質とを含みうる。このような処方物および懸濁液は、当業者に公知であり、かつ／または規定の実験を使用して、本明細書で記載される始原細胞を伴う使用に適合させることができる。
細胞組成物はまた、乳化手順が、細胞の生存率に有害な影響を及ぼさないことを条件として、乳化することもでき、リポソーム組成物として提示することもできる。細胞および任意の他の有効成分は、薬学的に許容され、有効成分に対して適合性であり、本明細書で記載される治療法における使用に適する量の賦形剤と混合することができる。
細胞組成物中に含まれるさらなる薬剤は、その中の成分の薬学的に許容される塩を含みうる。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）を含む。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来しうる。
当技術分野では、生理学的に忍容可能な担体が周知である。例示的な液体担体は、有効成分および水に加えて、材料を含有しないか、または、生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理学的生理食塩液、またはリン酸緩衝生理食塩液など、これらの両方などの緩衝剤を含有する滅菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、１つを超える緩衝液塩のほか、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含有しうる。液体組成物はまた、水に加えた液相および水を除く液相も含有しうる。このようなさらなる液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水−油エマルジョンである。特定の障害または状態の処置において有効な細胞組成物中で使用される活性化合物の量は、障害または状態の性格に依存する場合があり、標準的な臨床法により決定することができる。
ガイドＲＮＡ製剤
本開示のガイドＲＮＡは、特定の投与方式および剤形に応じて、担体、溶媒、安定化剤、アジュバント、希釈剤など、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することができる。ガイドＲＮＡ組成物は、製剤および投与経路に応じて、生理学的に適合性のｐＨを達成し、約３のｐＨ〜約１１のｐＨ、ｐＨ約３〜ｐＨ約７の範囲となるように製剤化することができる。場合によって、ｐＨは、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約８の範囲に調整することができる。場合によって、組成物は、本明細書で記載される、治療有効量の少なくとも１つの化合物を、１または複数の薬学的に許容される賦形剤と併せて含みうる。任意選択で、組成物は、本明細書で記載される化合物の組合せを含む場合もあり、細菌の増殖の処理または防止において有用な、第２の有効成分（例えば、かつ、限定なしに述べると、抗菌剤または抗微生物剤）を含む場合もあり、本開示の試薬の組合せを含む場合もある。
適切な賦形剤は、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子など、大型で、ゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子を含む。他の例示的な賦形剤は、抗酸化剤（例えば、かつ、限定なしに述べると、アスコルビン酸）、キレート化剤（例えば、かつ、限定なしに述べると、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、かつ、限定なしに述べると、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、およびヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、かつ、限定なしに述べると、油、水、生理食塩液、グリセロール、およびエタノール）、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを含みうる。
送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）および／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、ウイルスにより送達することもでき、当技術分野で公知のウイルス性または非ウイルス性の送達媒体により送達することもできる。代替的に、エンドヌクレアーゼポリペプチドを、電気穿孔または脂質ナノ粒子など、当技術分野で公知の非ウイルス性送達媒体により送達することができる。さらに代替的な態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１または複数のポリペプチド単独として送達することもでき、１もしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた、１もしくは複数のｃｒＲＮＡとあらかじめ複合体化させた、１または複数のポリペプチドとして送達することもできる。
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボヌクレオタンパク質、正に帯電させたペプチド、低分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー−ＲＮＡキメラ、およびＲＮＡ−融合タンパク質複合体を含むがこれらに限定されない、非ウイルス性送達媒体により送達することができる。一部の例示的な非ウイルス性送達媒体については、PeerおよびLieberman、Gene Therapy、１８巻：１１２７〜１１３３頁（２０１１年）（これは、他のポリヌクレオチドの送達にもまた有用な、ｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達媒体に焦点を当てている）において記載されている。
本発明のポリヌクレオチドに関して、製剤化は、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号に教示されるもののうちのいずれかから選択され得る。
ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）により、細胞または患者へと送達することができる。
ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。代替的に、ナノ粒子は、１〜１０００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜２５０ｎｍ、２５〜２００ｎｍ、２５〜１００ｎｍ、３５〜７５ｎｍ、または２５〜６０ｎｍのサイズの範囲でありうる。
ＬＮＰは、カチオン性脂質から作製することもでき、アニオン性脂質から作製することもでき、中性脂質から作製することもできる。融合性リン脂質であるＤＯＰＥまたは膜成分であるコレステロールなどの中性脂質を、トランスフェクション活性およびナノ粒子安定性を増強する「ヘルパー脂質」として、ＬＮＰ中に組み入れることができる。カチオン性脂質の限界は、低い安定性および急速なクリアランスに起因する低い効能ならびに炎症性または抗炎症性応答の発生を含む。
ＬＮＰはまた、疎水性脂質から構成される場合もあり、親水性脂質から構成される場合もあり、疎水性脂質および親水性脂質の両方から構成される場合もある。
当技術分野で公知の、任意の脂質または脂質の組合せを使用して、ＬＮＰを作製することができる。ＬＮＰを作製するのに使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ−コレステロール、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ−ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ−ＤＯＰＥ−ＤＭＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭである。ＰＥＧで修飾された脂質の例は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０である。
脂質を、任意の数のモル比で組み合わせて、ＬＮＰを作製することができる。加えて、ポリヌクレオチドを、脂質と、広範にわたるモル比で組み合わせて、ＬＮＰを作製することができる。
既に言明した通り、部位特異的ポリペプチドおよびゲノムターゲティング核酸の各々を、細胞または患者へと、個別に投与することができる。他方、部位特異的ポリペプチドは、１もしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１もしくは複数のｃｒＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。次いで、あらかじめ複合体化させた材料を、細胞または患者へと投与することができる。このようなあらかじめ複合体化させた材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡとの特異的相互作用を形成することが可能である。この特性は、多くの生物学的工程で利用されているが、核酸に富む細胞内環境における、無差別的な相互作用の危険性とも隣り合わせである。この問題に対する１つの解決法は、ＲＮＡを、エンドヌクレアーゼと、あらかじめ複合体化させる、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成である。ＲＮＰの別の利益は、ＲＮＡの、分解からの保護である。
ＲＮＰ内のエンドヌクレアーゼは、修飾することもでき、非修飾とすることもできる。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、修飾することもでき、非修飾とすることもできる。当技術分野では、多数の修飾が公知であり、使用することができる。
エンドヌクレアーゼとｓｇＲＮＡとは一般に、１：１のモル比で組み合わせることができる。代替的に、エンドヌクレアーゼと、ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとは一般に、１：１：１のモル比で組み合わせることができる。しかし、広範にわたるモル比を使用して、ＲＮＰを作製することができる。
ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、送達のために使用することができる。当技術分野では、パッケージングされるＡＡＶゲノムであって、送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能を含むＡＡＶゲノムを、細胞へともたらすｒＡＡＶ粒子を作製する技法が標準的である。ｒＡＡＶの作製は典型的に、以下の構成要素：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個の（すなわち、ｒＡＡＶゲノム内には存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一の細胞（本明細書では、パッケージング細胞と描示する）内に存在することを要求する。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスを導出することができる、任意のＡＡＶ血清型に由来することが可能であり、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型であって、本明細書中に記載されるＡＡＶ血清型を含むがこれらに限定されないＡＡＶ血清型に由来しうる。偽型ｒＡＡＶの作製については、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０１／８３６９２号に開示されている。
ＡＡＶ血清型
本発明の組成物をコードするポリヌクレオチド、例えば、本発明のエンドヌクレアーゼ、ドナー配列、またはＲＮＡガイド分子をパッケージングするＡＡＶ粒子は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含み得るか、またはそれに由来し得る。本発明によると、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ１−７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１−８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２−１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２−３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２−４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２−５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ−２−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３−１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ３−９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−ａａ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ４−８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−８／ｒｈ．６４、ＡＡＶ４−９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５−２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ５−３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−８ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ−ｈ、ＡＡＶＨ−１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ−５／ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶＬＧ−１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１−８／ｒｈ．４３、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＢＡＡＶ、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、日本ＡＡＶ １０、真性型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶシャッフル１００−１、ＡＡＶシャッフル１００−２、ＡＡＶシャッフル１００−３、ＡＡＶシャッフル１００−７、ＡＡＶシャッフル１０−２、ＡＡＶシャッフル１０−６、ＡＡＶシャッフル１０−８、ＡＡＶ ＳＭ １００−１０、ＡＡＶ ＳＭ １００−３、ＡＡＶ ＳＭ １０−１、ＡＡＶ ＳＭ １０−２、および／またはＡＡＶ ＳＭ １０−８を含むがこれらに限定されない、以下の血清型のうちのいずれかおよびそれらの変異体から選択される血清型を利用し得るか、またはそれに基づき得る。
一部の態様では、ＡＡＶ血清型は、N Pulicherlaら（Molecular Therapy、１９巻（６号）：１０７０〜１０７８頁（２０１１年））によって説明されるように、ＡＡＶ９配列における突然変異、例えば、限定されないが、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４であり得るか、またはそれを有し得る。
一部の態様では、ＡＡＶ血清型は、米国特許第６１５６３０３号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＡＡＶ３Ｂ（ＵＳ６１５６３０３の配列番号１および１０）、ＡＡＶ６（ＵＳ６１５６３０３の配列番号２、７および１１）、ＡＡＶ２（ＵＳ６１５６３０３の配列番号３および８）、ＡＡＶ３Ａ（ＵＳ６１５６３０３の配列番号４および９）、またはこれらの誘導体であり得るか、またはそれを有し得る。
一部の態様では、血清型は、Grimmら（Journal of Virology、８２巻（１２号）：５８８７〜５９１１頁（２００８年）によって説明されるように、ＡＡＶＤＪまたはその変異体、例えば、ＡＡＶＤＪ８（またはＡＡＶ−ＤＪ８）であり得る。ＡＡＶＤＪ８のアミノ酸配列は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために、２つまたはそれよりも多くの突然変異を含み得る。非限定的な例として、米国特許第７，５８８，７７２号において配列番号１として記載されるＡＡＶ−ＤＪ配列は、２つの突然変異：（１）アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）へと変化する、Ｒ５８７Ｑ、および（２）アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）へと変化する、Ｒ５９０Ｔを含み得る。別の非限定的な例としては、３つの突然変異：（１）アミノ酸４０６におけるリシン（Ｋ、Ｌｙｓ）が、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）へと変化する、Ｋ４０６Ｒ、（２）アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）へと変化する、Ｒ５８７Ｑ、および（３）アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）へと変化する、Ｒ５９０Ｔを含み得る。
一部の実施形態では、ＡＡＶ血清型は、国際公開第ＷＯ２０１５１２１５０１号に記載される配列、例えば、限定されないが、真性型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号２）、「ＵＰｅｎｎ ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号８）、「日本ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号９）、またはこれらの変異体であり得るか、またはそれを有し得る。
本発明によると、ＡＡＶキャプシド血清型選択または使用は、様々な種に由来し得る。一実施形態では、ＡＡＶは、トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）であり得る。ＡＡＡＶ血清型は、米国特許第９２３８８００号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＡＡＡＶ（ＵＳ９，２３８，８００の配列番号１、２、４、６、８、１０、１２、および１４）、またはこれらの変異体であり得るか、またはそれを有し得る。
一実施形態では、ＡＡＶは、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）であり得る。ＢＡＡＶ血清型は、米国特許第９，１９３，７６９号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＢＡＡＶ（ＵＳ９１９３７６９の配列番号１および６）、またはこれらの変異体であり得るか、またはそれを有し得る。ＢＡＡＶ血清型は、米国特許第７４２７３９６号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＢＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号５および６）、またはこれらの変異体であり得るか、またはそれを有し得る。
一実施形態では、ＡＡＶは、ヤギＡＡＶであり得る。ヤギＡＡＶ血清型は、米国特許第７４２７３９６号に記載される配列、例えば、限定されないが、ヤギＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号３）、またはその変異体であり得るか、またはそれを有し得る。
他の実施形態では、ＡＡＶは、２つまたはそれよりも多くの親血清型に由来するハイブリッドＡＡＶとして操作してもよい。一実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９に由来する配列を含む、ＡＡＶ２Ｇ９であってもよい。ＡＡＶ２Ｇ９ ＡＡＶ血清型は、米国特許公開第ＵＳ２０１６００１７００５号に記載される配列であり得るか、またはそれを有し得る。
一実施形態では、ＡＡＶは、Pulicherlaら（Molecular Therapy、１９巻（６号）：１０７０〜１０７８頁（２０１１年）によって説明されるように、アミノ酸３９０〜６２７（ＶＰ１番号付け）における突然変異を有する、ＡＡＶ９キャプシドライブラリーによって生成された血清型であってもよい。血清型ならびに対応するヌクレオチドおよびアミノ酸の置換は、ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ、Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８ＡおよびＴ１４３６Ｘ、Ｖ４７３ＤおよびＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ；Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０ＣおよびＡ１６１７Ｔ；Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ；Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ；Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ；Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ；Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ；Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ；Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ；Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ；Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ；Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ；Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ；Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ；Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ；Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ；Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ；Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ；Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ；Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ；Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ；Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ；Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ；Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（Ｃ１５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ；Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ；Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ；Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ；Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ；Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ；Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ；Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ、；Ｇ４８１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ；Ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ）、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ；Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ；Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ；Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ；Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ；Ｍ５５９Ｌ）およびＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）であり得るが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、血清型であってもよい。非限定的な例として、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ８であり得る。
１つの例では、ＡＡＶは、変異体、例えば、Deverman、２０１６年、Nature Biotechnology.、３４巻（２号）：２０４〜２０９頁に記載されるＰＨＰ．ＡまたはＰＨＰ．Ｂであってもよい。
１つの例では、ＡＡＶは、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に見出されるもののうちのいずれかから選択される血清型であってもよい。
１つの例では、ＡＡＶは、配列番号，７３４〜５，３０２および表２に開示される配列、断片、または変異体によってコードされ得る。
ｒＡＡＶ作製の一般原理については、例えば、Carter、１９９２年、Current Opinions in Biotechnology、１５３３〜５３９頁；およびMuzyczka、１９９２年、Curr. Topics in Microbial. and Immunol.、１５８巻：９７〜１２９頁において総説されている。多様な手法については、Ratschinら、Mol. Cell. Biol.、４巻：２０７２頁（１９８４年）；Hermonatら、Proc. Natl. Acad.、Sci. USA、８１巻：６４６６頁（１９８４年）；Tratschinら、Mol. Cell. Biol.、５巻：３２５１頁（１９８５年）；McLaughlinら、J. Virol.、６２巻：１９６３頁（１９８８年）；およびLebkowskiら、１９８８年、Mol. Cell. Biol.、７巻：３４９頁（１９８８年）において記載されている。Samulskiら（１９８９年、J. Virol.、６３巻：３８２２〜３８２８頁）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Perrinら（１９９５年）、Vaccine、１３巻：１２４４〜１２５０頁；Paulら（１９９３年）、Human Gene Therapy、４巻：６０９〜６１５頁；Clarkら（１９９６年）、Gene Therapy、３巻：１１２４〜１１３２頁；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；および米国特許第６，２５８，５９５号。
ＡＡＶベクターの血清型は、標的細胞型とマッチさせることができる。例えば、以下の例示的な細胞型にはとりわけ、表示のＡＡＶ血清型を形質導入することができる。
アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを使用することができる。そのようなウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パポーバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の態様では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ＰＣＳＫ９遺伝子の１つまたは２つのローカスをターゲティングするｓｇＲＮＡ、およびドナーＤＮＡは、それぞれ、別個に脂質ナノ粒子へと製剤化され得るか、またはすべてが１つの脂質ナノ粒子へと共製剤化される。
一部の態様では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に製剤化され得るが、一方でｓｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクターで送達され得る。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として送達する選択肢が、利用可能である。ガイドＲＮＡは、同じＤＮＡから発現されてもよく、またはＲＮＡとして送達されてもよい。ＲＮＡは、その半減期を変更もしくは改善するか、または免疫応答の可能性もしくは程度を減少させるように、化学修飾されていてもよい。エンドヌクレアーゼタンパク質は、送達の前に、ｇＲＮＡと複合体化させてもよい。ウイルスベクターは、効率的な送達を可能にし、Ｃａｓ９の分割バージョンおよびＣａｓ９の小さいオルソログは、ＨＤＲのドナーで可能なように、ＡＡＶにパッケージングすることができる。これらの構成要素のそれぞれを送達することができる、広範な非ウイルス性送達方法もまた、存在し得るか、または非ウイルス的方法およびウイルス的方法を、タンデムで利用してもよい。例えば、ナノ粒子を使用して、タンパク質およびガイドＲＮＡを送達してもよく、一方で、ＡＡＶを使用して、ドナーＤＮＡを送達してもよい。
ＩＶ．投薬および投与
所望の効果をもたらすような、損傷または修復部位など、所望の部位における、導入された細胞の、少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、細胞、例えば、始原細胞の、対象への移入の文脈では、「〜を投与すること」、「〜を導入すること」、および「〜を植え込むこと」という用語は、互換的に使用される。細胞、例えば、始原細胞、またはそれらの分化した後代を、対象における所望の場所への送達をもたらす、任意の適切な経路により投与することができ、この場合、植え込まれた細胞または細胞の構成要素のうちの少なくとも一部は、依然として生存可能なままである。対象への投与後における細胞生存期間は、数時間、例えば、２４時間という短時間〜数日間〜数年間、またはさらに患者の生涯という長期間、すなわち、長期にわたる生着でありうる。例えば、本明細書で記載される一部の態様では、有効量の肝臓始原細胞を、腹腔内または静脈内経路などの全身投与経路を介して投与する。
本明細書では、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語が、互換的に使用され、診断、処置、または治療が所望される任意の対象を指す。一部の態様では、対象は、哺乳動物である。一部の態様では、対象は、ヒトである。
予防的に提供される場合、本明細書に記載される始原細胞は、脂質異常症の任意の症状に先立って、対象へと投与することができる。したがって、始原細胞集団の予防的投与は、脂質異常症を防止する機能を果たす。
本明細書に記載される方法に従って投与される始原細胞集団は、１つまたは複数のドナーから得られた、同種始原細胞を含み得る。そのような始原細胞は、例えば、肝臓、筋肉、心臓など、任意の細胞または組織起源のものであり得る。「同種」とは、同じ種の１つまたは複数の異なるドナーから得られた始原細胞、または始原細胞を含む生物学的試料を指し、ここで、１つまたは複数のローカスにおける遺伝子は、同一ではない。例えば、対象へと投与される肝臓始原細胞集団は、１つまたは複数の非類縁ドナー対象に由来する場合もあり、１つまたは複数の同一でない同胞種に由来する場合もある。一部の事例では、遺伝子的に同一な動物または一卵性双生児から得られた集団など、同系始原細胞集団を使用してもよい。始原細胞は、自家細胞であってもよい、すなわち、始原細胞を、対象から得るか、または単離し、同じ対象へと投与する、すなわち、ドナーとレシピエントとが同じである。
「有効量」という用語は、脂質異常症の、少なくとも１つまたは複数の徴候または症状を防止または緩和するのに必要とされる、始原細胞またはそれらの後代の集団の量を指し、所望の効果を生じる、例えば、脂質異常症を有する対象を処置するのに十分な、組成物の量に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象、例えば、脂質異常症を有するかまたはその危険性がある対象へと投与されると、特定の効果を促進するのに十分な、始原細胞または始原細胞を含む組成物の量を指す。有効量はまた、疾患の症状の発生を防止もしくは遅延させるか、疾患の症状の経過を変更する（例えば、疾患の症状の進行を緩徐化させることであるが、これに限定されない）か、または疾患の症状を逆行させるのに十分な量も含むであろう。任意の所与の事例について、適切な「有効量」とは、規定の実験を使用して、当業者により決定され得ることが理解される。
本明細書で記載される多様な態様における使用のために、有効量の始原細胞は、始原細胞少なくとも１０２個、始原細胞少なくとも５×１０２個、始原細胞少なくとも１０３個、始原細胞少なくとも５×１０３個、始原細胞少なくとも１０４個、始原細胞少なくとも５×１０４個、始原細胞少なくとも１０５個、始原細胞少なくとも２×１０５個、始原細胞少なくとも３×１０５個、始原細胞少なくとも４×１０５個、始原細胞少なくとも５×１０５個、始原細胞少なくとも６×１０５個、始原細胞少なくとも７×１０５個、始原細胞少なくとも８×１０５個、始原細胞少なくとも９×１０５個、始原細胞少なくとも１×１０６個、始原細胞少なくとも２×１０６個、始原細胞少なくとも３×１０６個、始原細胞少なくとも４×１０６個、始原細胞少なくとも５×１０６個、始原細胞少なくとも６×１０６個、始原細胞少なくとも７×１０６個、始原細胞少なくとも８×１０６個、始原細胞少なくとも９×１０６個、またはこれらの倍数個を含む。始原細胞は、１または複数のドナーから導出することもでき、自家供給源から得ることもできる。本明細書で記載される一部の例では、始原細胞は、それを必要とする対象への投与の前に、培養物中で拡大することができる。
ＰＣＳＫ９関連の障害を有する患者の細胞において発現されるＰＣＳＫ９のレベルにおけるわずかな減少および漸減は、疾患の１つもしくは複数の症状を軽減するため、長期にわたる生存を増加させるため、および／または他の処置に付随する副作用を低減するために、有益であり得る。そのような細胞をヒト患者へと投与したときに、減少したレベルのＰＣＳＫ９を生じる始原細胞の存在が、有益である。一部の事例では、対象の有効な処置により、処置される対象における総ＰＣＳＫ９と比べて、ＰＣＳＫ９レベルに少なくとも約３％、５％、または７％の低減が生じる。一部の例では、ＰＣＳＫ９の低減は、総ＰＣＳＫ９の少なくとも約１０％であろう。一部の例では、ＰＣＳＫ９の低減は、総ＰＣＳＫ９の少なくとも約２０％〜３０％であろう。同様に、一部の状況では、正常化された細胞は、罹患した細胞と比べて、選択的利点を有するため、ＰＣＳＫ９のレベルが有意に低減された細胞は、比較的限定的な亜集団の導入であっても、様々な患者において、有益であり得る。しかしながら、ＰＣＳＫ９のレベルが低減された始原細胞は、わずかなレベルであっても、患者における脂質異常症の１つまたは複数の側面を改善するのに有益であり得る。一部の例では、そのような細胞が投与された患者における肝臓始原細胞のうちの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くが、低減されたレベルのＰＣＳＫ９を産生している。
「投与された」とは、所望の部位において、細胞組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、始原細胞組成物の、対象への送達を指す。細胞組成物は、対象において有効な処置をもたらす、任意の適切な経路により、すなわち、対象における所望の位置への送達をもたらす投与であって、送達される組成物のうちの少なくとも一部、すなわち、細胞少なくとも１×１０４個を、所望の部位へと、ある期間にわたり送達する投与により投与することができる。
本方法の一態様では、医薬組成物は、腸内（腸に）、胃腸内、硬膜外（硬膜に）、経口（口から）、経皮、硬膜上、脳内（大脳に）、側脳室内（脳室内に）、皮膚上（皮膚の上への適用）、皮内（皮膚そのものに）、皮下（皮膚の下に）、鼻内投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈の中に）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈の中に）、筋肉内（筋肉の中に）、心臓内（心臓の中に）、骨内注入（骨髄の中に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（病理学的腔に）、腔内（陰茎の基底部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分配のための無傷な皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、経膣、吹送（吸飲）、舌下、***下、浣腸、点眼（結膜上）、点耳、耳介（耳にまたは耳への）、頬内（頬への）、結膜、皮膚、歯科的（歯に）、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内部）、尾内（馬尾内部）、脳槽内（小脳延髄槽大槽（cisterna magna cerebellomedularis）内部）、角膜内（角膜内部）、歯冠内、冠内（冠動脈内）、海綿体内（陰茎の陰核海綿体の膨張性空隙内）、椎間板内（椎間板内部）、導管内（腺導管内部）、十二指腸内（十二指腸内部）、硬膜内（硬膜内部またはその下に）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内部）、歯肉内（歯肉内部）、回腸内（小腸遠位部分内部）、病巣内（局在化した病変部の内部またはそこへの直接的な導入）、管腔内（管腔内部）、リンパ管内（リンパ内部）、髄内（骨髄腔内部）、髄膜内（髄膜内部）、心筋内（心筋内部）、眼内（眼内部）、卵巣内（卵巣内部）、心膜内（心膜内部）、胸膜内（胸膜内部）、前立腺内（前立腺腺内部）、肺内（肺またはその気管支内部）、副鼻腔内（鼻洞または眼窩周囲洞内部）、脊髄内（脊柱内部）、滑液嚢内（関節の滑液腔内部）、腱内（腱内部）、精巣内（精巣内部）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液内部）、胸郭内（胸郭内部）、小管内（器官の細管内部）、腫瘍内（腫瘍内部）、鼓室内（中耳内部）、血管内（血管内部）、脳室内（脳室内部）、イオン注入（可溶性塩イオンが身体の組織に移動する電流を用いて）、灌注（開放創傷部または体腔を浸漬するかまたは洗い流すため）、喉頭（喉頭に直接的に）、鼻腔胃（鼻を通じて胃内に）、閉塞的包帯技法（後で領域を閉鎖する包帯剤によって被覆する局所的投与経路）、眼部（外眼部に）、中咽頭（口および咽頭に直接的に）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所的または全身的な効果のための経口または経鼻吸入により気道内部へ）、眼球後（脳橋背後または眼球背後）、心筋内（心筋に入る）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤性（胎盤を通じてまたはそれを越えて）、経気管（気管壁を通じて）、経鼓膜（鼓室を越えてまたはそれを通じて）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス、ならびに脊髄などであるがこれらに限定されない経路を介して、投与され得る。
投与方式は、注射、注入、点滴、および／または内服を含む。「注射」は、限定せずに述べると、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、心室内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内注、脳脊髄内、ならびに胸骨内（intrasternal）注射および注入を含む。一部の例では、経路は静脈内である。細胞を送達するためには、注射または注入による投与を行うことができる。
細胞は、全身投与されうる。「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」、および「末梢投与された」という語句は、始原細胞の集団の、標的部位、組織、または臓器への直接投与以外の投与であって、代わりに、それが、対象の循環系に入り、したがって、代謝および他の同様の過程下に置かれるような投与を指す。
当業者は、脂質異常症を処置するための組成物を含む処置の効能を決定しうる。しかし、ごく一例として述べると、ＰＣＳＫ９のレベルの徴候または症状の任意の１つまたは全てが、有益な形で変更される（例えば、少なくとも１０％減少する）か、または疾患の、他の臨床的に許容される症状もしくはマーカーが、改善されるかまたは軽快する場合に、処置は、「有効な処置」と考えられる。効能はまた、入院または医療的介入の必要により評価される、個体の非悪化（例えば、疾患の進行が止まるか、もしくは少なくとも緩徐化する）により測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書で記載されている。処置は、個体または動物（一部の非限定的な例は、ヒトまたは哺乳動物を含む）における、疾患の任意の処置を含み、（１）疾患の阻害、例えば、症状の進行を止めるか、もしくは緩徐化させること；または（２）疾患を和らげること、例えば、症状の減退を引き起こすこと；および（３）症状の発症の可能性を防止または低減することを含む。
本開示に従った処置により、個体におけるＰＣＳＫ９の量を減少または変更することによって、脂質異常症と関連する１つまたは複数の症状を改善することができる。
Ｖ．プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子の特徴および特性
ＰＣＳＫ９は、無ベータリポタンパク質血症、腺腫、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、胆石症、冠動脈硬化症、冠動脈心疾患、非インスリン依存性真性糖尿病、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、高インスリン症、高脂血症、家族性複合型高脂血症、低ベータリポタンパク質血症、慢性腎不全、肝疾患、肝臓新生物、黒色腫、心筋梗塞、ナルコレプシー、新生物転移、腎芽細胞腫、肥満、腹膜炎、弾力線維性仮性黄色腫、脳血管発作、血管疾患、黄色腫症、末梢血管疾患、心筋虚血、脂質異常症、グルコース耐性障害、黄色腫、多遺伝子性高コレステロール血症、肝臓の続発性悪性新生物、認知症、過体重、Ｃ型肝炎、慢性頸動脈硬化症、ＩＩａ型高リポタンパク質血症、頭蓋内アテローム性動脈硬化症、虚血性脳卒中、急性冠動脈症候群、大動脈石灰化症、心血管罹患、ＩＩｂ型高リポタンパク質血症、末梢動脈疾患、家族性ＩＩ型高アルドステロン症、家族性低ベータリポタンパク質血症、常染色体劣性高コレステロール血症、常染色体優性高コレステロール血症３、冠動脈疾患、肝臓癌、虚血性脳血管発作、および動脈硬化性心臓血管疾患ＮＯＳなどであるがこれらに限定されない、疾患および障害と関連している。本明細書に記載される方法のうちのいずれかを使用したＰＣＳＫ９遺伝子の編集を使用して、本明細書に記載される疾患および障害の症状を処置、防止、および／または軽減することができる。
ＰＣＳＫ９の活性は、大部分が、主として肝臓に限定され、ＰＣＳＫ９は、脂質異常症、ＰＣＳＫ９関連の家族性高コレステロール血症、高コレステロール血症（家族性）、胃の乳頭状腺癌、ホモ接合型家族性高コレステロール血症、および上咽頭炎と関連している。ＰＣＳＫ９関連の家族性高コレステロール血症は、低密度リポタンパク質コレステロールの受容体の欠如に起因して、身体が、血中コレステロールレベルを危険なほどに高める、遺伝疾患（常染色体優性）である。ＰＣＳＫ９関連の家族性高コレステロール血症は、世界中で、ヘテロ接合性の人々では５００人に１人から、ホモ接合性の人々では１，０００，０００人に１人で生じ、アフリカ人、フランス系カナダ人、レバノン人、キリスト教徒、およびフィン人の集団においては、より一般的である。ＰＣＳＫ９関連の家族性高コレステロール血症の一般的な症状としては、低密度リポタンパク質単独かまたは超低密度リポタンパク質もかのいずれかで含まれる、循環コレステロールの上昇が挙げられる。ＰＣＳＫ９関連の家族性高コレステロール血症の現在の処置としては、スタチンを投与して、肝臓におけるヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）を阻害することが挙げられる。ＰＣＳＫ９関連の家族性高コレステロール血症の処置の別の選択肢は、腸内でのコレステロールの吸収を阻害するためのエゼチミブである。
脂質異常症は、詰まった動脈（アテローム性動脈硬化症）の発症に寄与する、血液中の脂質レベルの上昇を特徴とする遺伝的疾患である。これらの脂質としては、血漿コレステロール、トリグリセリド、または高密度リポタンパク質が挙げられる。脂質異常症は、心臓発作、卒中、または他の循環器系の問題の危険性を増加させる。現在の管理としては、生活スタイルの変化、例えば、運動および食生活の修正、ならびに脂質低下薬、例えば、スタチンの使用が挙げられる。スタチンではない脂質低下薬としては、胆汁酸封鎖剤（bile acid sequestrant）、コレステロール吸収阻害剤、ホモ接合性家族性高コレステロール血症の薬物、フィブレート薬、ニコチン酸、オメガ−３脂肪酸、および／または組合せ製品が挙げられる。処置の選択肢は、通常、具体的な脂質異常性に依存するが、異なる脂質異常性が同時に存在していることも多い。小児の処置は、食生活の変化は実装することが困難であり得、脂質低下治療薬では、有効性が実証されていないため、さらに困難である。
一実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法の標的組織は、肝臓組織である。
一実施形態では、遺伝子は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）であり、これは、サブチリシン／ケキシン様プロテアーゼＰＣ９とも称され得る。ＰＣＳＫ９は、細胞遺伝学的位置１ｐ３２．３を有し、ゲノム座標は、フォワード鎖の第１染色体の５５，０３９，５４８位〜５５，０６４，８５２位にある。ＰＣＳＫ９のヌクレオチド配列を、配列番号５，３０３として示す。ＢＳＮＤは、フォワード鎖においてＰＣＳＫ９の上流の遺伝子であり、ＲＰ１１−１０１Ｃ１１．１は、フォワード鎖においてＰＣＳＫ９の下流の遺伝子である。ＰＣＳＫ９は、ＮＣＢＩ遺伝子識別子が２５５７３８であり、Ｕｎｉｐｒｏｔ識別子がＱ８ＮＢＰ７であり、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子識別子がＥＮＳＧ０００００１６９１７４である。ＰＣＳＫ９は、２０４５個のＳＮＰ、１８個のイントロン、および２０個のエクソンを有する。Ｅｎｓｅｍｂｌからのエクソンの識別子、ならびにイントロンおよびエクソンの開始／終止部位を、表３に示す。
表４は、Ｅｎｓｅｍｂｌのデータベースに基づいてＰＣＳＫ９遺伝子の転写物のすべてに関する情報を提供する。Ｅｎｓｅｍｂｌからの転写物識別子および対応する転写物のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑの識別子、Ｅｎｓｅｍｂｌからの翻訳識別子および対応するタンパク質のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑの識別子、Ｅｎｓｅｍｂｌによって分類される転写物配列のバイオタイプ、ならびに表３の情報に基づいた、転写物におけるエクソンおよびイントロンを、表４に提示する。
ＰＣＳＫ９は、２０４５個のＳＮＰを有し、このＰＣＳＫ９遺伝子のＮＣＢＩ ｒｓ番号および／またはＵｎｉＰｒｏｔ ＶＡＲ番号は、ｒｓ１０４６５８３１、ｒｓ１０４６５８３２、ｒｓ１０５８５１１８、ｒｓ１０６７４５９８、ｒｓ１０８８８８９６、ｒｓ１０８８８８９７、ｒｓ１０８８８８９８、ｒｓ１１１３４２９１１、ｒｓ１１１４００６５９、ｒｓ１１１４２７０９９、ｒｓ１１１５６３７２４、ｒｓ１１１７０５９７１、ｒｓ１１１８３０９４９、ｒｓ１１１９７６２８３、ｒｓ１１２０６５１３、ｒｓ１１２０６５１４、ｒｓ１１２０６５１５、ｒｓ１１２０６５１６、ｒｓ１１２０６５１７、ｒｓ１１２０７１８５６、ｒｓ１１２０９６４６５、ｒｓ１１２０９９１４８、ｒｓ１１２１１２４９６、ｒｓ１１２３０６６５４、ｒｓ１１２６２８５９８、ｒｓ１１２６５００１５、ｒｓ１１２７１０３８６、ｒｓ１１３０２５３３、ｒｓ１１３１０６３０、ｒｓ１１３１３８５５２、ｒｓ１１３２４１０５９、ｒｓ１１３２６４７９６、ｒｓ１１３３３０４９２、ｒｓ１１３３６９５２７、ｒｓ１１３４４４０５９、ｒｓ１１３７２６１２５、ｒｓ１１３７４９９０８、ｒｓ１１４０６８５７８、ｒｓ１１４０８６６９８、ｒｓ１１４１６２３６６、ｒｓ１１４２５０７９４、ｒｓ１１４３６２３４、ｒｓ１１４５８７４７５、ｒｓ１１４６８９４２４、ｒｓ１１５２１９２４７、ｒｓ１１５３３３２７０、ｒｓ１１５４５１４０６、ｒｓ１１５５０５８１３、ｒｓ１１５５６３２２５、ｒｓ１１５８１１２４９、ｒｓ１１５８３６８０、ｒｓ１１５８３７２３、ｒｓ１１５８７０７１、ｒｓ１１５９１１４７、ｒｓ１１６２５１２１０、ｒｓ１１６３１２７８７、ｒｓ１１６５２８６、ｒｓ１１６５２８７、ｒｓ１１６７７５２１２、ｒｓ１１６８０６２０４、ｒｓ１１６８９１３２８、ｒｓ１１７００４０１４、ｒｓ１１７２４７１５２、ｒｓ１１７２５８３１２、ｒｓ１１７３８９８７９、ｒｓ１１８００２３１、ｒｓ１１８００２４３、ｒｓ１１８００２６５、ｒｓ１１８０４４２０、ｒｓ１１８０６６３８、ｒｓ１１８０８０５２、ｒｓ１２０２８７５２、ｒｓ１２０３２２６６、ｒｓ１２０６３９６２、ｒｓ１２０６６２６５、ｒｓ１２０６７５６９、ｒｓ１２０７４１２２、ｒｓ１２０７９４９５、ｒｓ１２０８２２４１、ｒｓ１２０８２５９１、ｒｓ１２０８４２１５、ｒｓ１２０９５２４９、ｒｓ１２０９６５５７、ｒｓ１２１３６６００、ｒｓ１３３７６０７１、ｒｓ１３７８５２９１２、ｒｓ１３７８７８１４６、ｒｓ１３７８８６４１１、ｒｓ１３７９１９１６０、ｒｓ１３８０３８２４６、ｒｓ１３８０６０５０９、ｒｓ１３８１７８４３７、ｒｓ１３８２３４０００、ｒｓ１３８３４１１７７、ｒｓ１３８４２４２７９、ｒｓ１３８８１７３５３、ｒｓ１３８８５０７０７、ｒｓ１３８８７６９５３、ｒｓ１３９４５７１１３、ｒｓ１３９４７９７６６、ｒｓ１３９５４３１１１、ｒｓ１３９５４９５９９、ｒｓ１３９６５８４９７、ｒｓ１３９６６９５６４、ｒｓ１３９６８３７１９、ｒｓ１３９７５４９４７、ｒｓ１３９８９４９７５、ｒｓ１４００７２０７２、ｒｓ１４０２８６２７９、ｒｓ１４０３１９５０９、ｒｓ１４０３５２２０６、ｒｓ１４０３６４６５７、ｒｓ１４０５２４６９８、ｒｓ１４０５８９５０９、ｒｓ１４０６４１４６２、ｒｓ１４０８３７９１０、ｒｓ１４０８３８５５１、ｒｓ１４０８６５７３０、ｒｓ１４０９１１９６９、ｒｓ１４１１３５０９９、ｒｓ１４１４０７７７９、ｒｓ１４１４３８０５９、ｒｓ１４１５０２００２、ｒｓ１４１５９３５１６、ｒｓ１４１８５５３６０、ｒｓ１４１８６７９７８、ｒｓ１４１９０１４８２、ｒｓ１４１９０７０４２、ｒｓ１４１９６３１７１、ｒｓ１４１９９５１９４、ｒｓ１４２１１８４１８、ｒｓ１４２１４９０５０、ｒｓ１４２２２９８３２、ｒｓ１４２３２５４１１、ｒｓ１４２５２４４６９、ｒｓ１４２５２５６７１、ｒｓ１４２６７６２１３、ｒｓ１４２８０２２７９、ｒｓ１４２８２４１７１、ｒｓ１４３１１７１２５、ｒｓ１４３２７５８５８、ｒｓ１４３２９１７３９、ｒｓ１４３３９４０３１、ｒｓ１４３４９９５６０、ｒｓ１４３６７９７０１、ｒｓ１４４１１０５１０、ｒｓ１４４２５４６９２、ｒｓ１４４３１７８８０、ｒｓ１４４５４６８４２、ｒｓ１４４６０６０６８、ｒｓ１４４７２１２３７、ｒｓ１４４８５０６６５、ｒｓ１４５０２２７７３、ｒｓ１４５０５５６７４、ｒｓ１４５１２８７６８、ｒｓ１４５２３３６２６、ｒｓ１４５２６４０２３、ｒｓ１４５２８４８１３、ｒｓ１４５３３０７３７、ｒｓ１４５３７３５７４、ｒｓ１４５４６８５７２、ｒｓ１４５７７０３９１、ｒｓ１４５８０６８８８、ｒｓ１４５８８６９０２、ｒｓ１４５９６３７９９、ｒｓ１４６０１６８２３、ｒｓ１４６０３５５８０、ｒｓ１４６４７１９６７、ｒｓ１４６４８４３２２、ｒｓ１４６５６３１５１、ｒｓ１４６７４１６３９、ｒｓ１４６８２６１０６、ｒｓ１４６９２４２４５、ｒｓ１４６９６００６０、ｒｓ１４７０１１３７３、ｒｓ１４７０９８８８３、ｒｓ１４７１８２０５４、ｒｓ１４７２８２４７５、ｒｓ１４７３８２９７１、ｒｓ１４７４７０９４４、ｒｓ１４７４７８１８８、ｒｓ１４７５９９４９６、ｒｓ１４７８６５０８７、ｒｓ１４７８７４２４０、ｒｓ１４８１４２６８５、ｒｓ１４８１９５４２４、ｒｓ１４８２２７１８０、ｒｓ１４８５６２７７７、ｒｓ１４８６１２２９６、ｒｓ１４８６８３６８７、ｒｓ１４８８２０５４９、ｒｓ１４８９４８５９７、ｒｓ１４９０９３９５７、ｒｓ１４９０９７２９７、ｒｓ１４９１３９４２８、ｒｓ１４９２５３５７９、ｒｓ１４９３１１９２６、ｒｓ１４９４８９３２５、ｒｓ１４９７４７７５２、ｒｓ１４９８３７０８３、ｒｓ１４９８６９４９２、ｒｓ１５０１１９７３９、ｒｓ１５０１６９５９８、ｒｓ１５０２７７２３１、ｒｓ１５０５０８７３１、ｒｓ１５０８９８４８５、ｒｓ１５１００３０１０、ｒｓ１５１０３９６８９、ｒｓ１５１０７２６６８、ｒｓ１５１０９５１４９、ｒｓ１５１１２５３６３、ｒｓ１５１１９３００９、ｒｓ１５７２０３３、ｒｓ１７１１１５０３、ｒｓ１７１１１５５５、ｒｓ１７１１１５５７、ｒｓ１８０８１０３４５、ｒｓ１８０８３７５６４、ｒｓ１８１２９６９４２、ｒｓ１８１３０１４８８、ｒｓ１８１４８２８５３、ｒｓ１８１６８９９４３、ｒｓ１８１７９０３０６、ｒｓ１８１９６８９５６、ｒｓ１８２１３８２０１、ｒｓ１８２１９５１５１、ｒｓ１８２２４６１３３、ｒｓ１８２３９３７１０、ｒｓ１８２３９３９８０、ｒｓ１８２４０９５４２、ｒｓ１８２６６２８７１、ｒｓ１８２６９０５１５、ｒｓ１８２７０３１８５、ｒｓ１８２７４３５６６、ｒｓ１８３１１８８７６、ｒｓ１８３２５６１６１、ｒｓ１８３３３２０１９、ｒｓ１８３４３１７６７、ｒｓ１８３５５３８１２、ｒｓ１８３６９２３５４、ｒｓ１８３８８２０５０、ｒｓ１８３９７７３３４、ｒｓ１８４２９７６０８、ｒｓ１８４３０３０２２、ｒｓ１８４５１８４８３、ｒｓ１８４５４８０７３、ｒｓ１８４５６３３６７、ｒｓ１８４５６８６３０、ｒｓ１８４８１６６３２、ｒｓ１８５００３８２１、ｒｓ１８５３６１７３０、ｒｓ１８５３６５１６７、ｒｓ１８５３９２２６７、ｒｓ１８５５８１６１７、ｒｓ１８５７１０３９７、ｒｓ１８５８４０１９３、ｒｓ１８５９０５８０５、ｒｓ１８５９２７３８５、ｒｓ１８６１１２０４０、ｒｓ１８６２５０８６９、ｒｓ１８６３２９９４１、ｒｓ１８６５４０４３３、ｒｓ１８６６５７５３０、ｒｓ１８６６６９８０５、ｒｓ１８６７９２３５９、ｒｓ１８６９６５３３５、ｒｓ１８６９６９６８１、ｒｓ１８７１５６５７８、ｒｓ１８７３３１２６７、ｒｓ１８７３６６７９２、ｒｓ１８７４０８９９４、ｒｓ１８７５０８０３７、ｒｓ１８７５２０５８９、ｒｓ１８７５９２０５３、ｒｓ１８７７４５５４４、ｒｓ１８７８４０２３４、ｒｓ１８７９２３９００、ｒｓ１８８２７４０５９、ｒｓ１８８４４５０８３、ｒｓ１８８４４９５３２、ｒｓ１８８５４５０３２、ｒｓ１８８５９８９１７、ｒｓ１８８６７２６９９、ｒｓ１８８７０６０１８、ｒｓ１８８９２４５４７、ｒｓ１８９０１４９２７、ｒｓ１８９１０１１５２、ｒｓ１８９２３６５６８、ｒｓ１８９２９３７８１、ｒｓ１８９６４８４１６、ｒｓ１８９６６５７５９、ｒｓ１８９６７９０６０、ｒｓ１８９６８３２２８、ｒｓ１８９８１６８０１、ｒｓ１８９８４２７５４、ｒｓ１９０３０４１９５、ｒｓ１９０３１９７５６、ｒｓ１９０４１４８２６、ｒｓ１９０５８９９１６、ｒｓ１９０９１２０６５、ｒｓ１９１１８１５７３、ｒｓ１９１２５９７９８、ｒｓ１９１３８７０５５、ｒｓ１９１７３２７３５、ｒｓ１９２０２７１４４、ｒｓ１９２０２９５６４、ｒｓ１９２１２２７６８、ｒｓ１９２１３６９９１、ｒｓ１９２２８０３５４、ｒｓ１９２２９５４８６、ｒｓ１９２５２３５０３、ｒｓ１９２５８７３９３、ｒｓ１９２６２４９５２、ｒｓ１９２８５４６６７、ｒｓ１９２８９７６３２、ｒｓ１９２９３２２２４、ｒｓ１９９５０７３１８、ｒｓ１９９８１５７８６、ｒｓ１９９９０４８４９、ｒｓ１９９９１６２１４、ｒｓ２０００１２６４４、ｒｓ２０００１５８８８、ｒｓ２０００２７６６２、ｒｓ２０００９１６５４、ｒｓ２００１０９４４２、ｒｓ２００１４６４４８、ｒｓ２００１５８３０１、ｒｓ２００５０５１８８、ｒｓ２００５２９７７４、ｒｓ２００５５１８４４、ｒｓ２００８５６４２１、ｒｓ２００９８２０００、ｒｓ２０１１２５９４３、ｒｓ２０１１６０９３１、ｒｓ２０１１８４１９５、ｒｓ２０１２８００５９、ｒｓ２０１３０１２２０、ｒｓ２０１３４９９８３、ｒｓ２０１３９５８０５、ｒｓ２０１４０５８５９、ｒｓ２０１５５７６０７、ｒｓ２０１７０８４２８、ｒｓ２０１７８９８４１、ｒｓ２０１８７２０５６、ｒｓ２３０８１６６、ｒｓ２４７９４０８、ｒｓ２４７９４０９、ｒｓ２４７９４１０、ｒｓ２４７９４１１、ｒｓ２４７９４１２、ｒｓ２４７９４１３、ｒｓ２４７９４１４、ｒｓ２４８３２０５、ｒｓ２４９５４７７、ｒｓ２４９５４７８、ｒｓ２４９５４７９、ｒｓ２４９５４８０、ｒｓ２４９５４８１、ｒｓ２４９５４８２、ｒｓ２４９５４８３、ｒｓ２６７５９８６６０、ｒｓ２６７５９８６６１、ｒｓ２８３６２１９５、ｒｓ２８３６２１９６、ｒｓ２８３６２１９７、ｒｓ２８３６２１９８、ｒｓ２８３６２１９９、ｒｓ２８３６２２００、ｒｓ２８３６２２０１、ｒｓ２８３６２２０２、ｒｓ２８３６２２０３、ｒｓ２８３６２２０４、ｒｓ２８３６２２０５、ｒｓ２８３６２２０６、ｒｓ２８３６２２０７、ｒｓ２８３６２２０８、ｒｓ２８３６２２０９、ｒｓ２８３６２２１０、ｒｓ２８３６２２１１、ｒｓ２８３６２２１２、ｒｓ２８３６２２１３、ｒｓ２８３６２２１４、ｒｓ２８３６２２１５、ｒｓ２８３６２２１６、ｒｓ２８３６２２１７、ｒｓ２８３６２２１８、ｒｓ２８３６２２１９、ｒｓ２８３６２２２０、ｒｓ２８３６２２２１、ｒｓ２８３６２２２２、ｒｓ２８３６２２２３、ｒｓ２８３６２２２４、ｒｓ２８３６２２２５、ｒｓ２８３６２２２６、ｒｓ２８３６２２２７、ｒｓ２８３６２２２８、ｒｓ２８３６２２２９、ｒｓ２８３６２２３０、ｒｓ２８３６２２３１、ｒｓ２８３６２２３２、ｒｓ２８３６２２３３、ｒｓ２８３６２２３４、ｒｓ２８３６２２３５、ｒｓ２８３６２２３６、ｒｓ２８３６２２３７、ｒｓ２８３６２２３８、ｒｓ２８３６２２３９、ｒｓ２８３６２２４０、ｒｓ２８３６２２４１、ｒｓ２８３６２２４２、ｒｓ２８３６２２４３、ｒｓ２８３６２２４４、ｒｓ２８３６２２４５、ｒｓ２８３６２２４６、ｒｓ２８３６２２４７、ｒｓ２８３６２２４８、ｒｓ２８３６２２４９、ｒｓ２８３６２２５０、ｒｓ２８３６２２５１、ｒｓ２８３６２２５２、ｒｓ２８３６２２５３、ｒｓ２８３６２２５４、ｒｓ２８３６２２５５、ｒｓ２８３６２２５６、ｒｓ２８３６２２５７、ｒｓ２８３６２２５８、ｒｓ２８３６２２５９、ｒｓ２８３６２２６０、ｒｓ２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４３０、ｒｓ７６８９９７５０９、ｒｓ７６９０００４０１、ｒｓ７６９０３４０２７、ｒｓ７６９０６０２０９、ｒｓ７６９０６５２７６、ｒｓ７６９１１２６４１、ｒｓ７６９１６３８９１、ｒｓ７６９２７８８６７、ｒｓ７６９２９８９５８、ｒｓ７６９３０５４８６、ｒｓ７６９４１１８９４、ｒｓ７６９４３５３４６、ｒｓ７６９４８７０３７、ｒｓ７６９５２１３１０、ｒｓ７６９５２２２３１、ｒｓ７６９５７３９９２、ｒｓ７６９６２８３２８、ｒｓ７６９６８１００１、ｒｓ７６９７８２４３５、ｒｓ７６９８１０２４８、ｒｓ７６９８１１６４１、ｒｓ７６９９７０５５６、ｒｓ７７００４３２３５、ｒｓ７７００８０５８３、ｒｓ７７０１１５０７４、ｒｓ７７０１３４８５、ｒｓ７７０１５７５４３、ｒｓ７７０２０６６６０、ｒｓ７７０２５６５５６、ｒｓ７７０２５６５６４、ｒｓ７７０２８２８５０、ｒｓ７７０２９０１４５、ｒｓ７７０４０６２３７、ｒｓ７７０４０６８６２、ｒｓ７７０４５９２１５、ｒｓ７７０５３９２５５、ｒｓ７７０５９２６０７、ｒｓ７７０６０４２４９、ｒｓ７７０６９９８６３、ｒｓ７７０７１６５８７、ｒｓ７７０７３６５１１、ｒｓ７７０７３８０９６、ｒｓ７７０７９９５３２、ｒｓ７７０８５７０６９、ｒｓ７７０８７３８５８、ｒｓ７７０８９１７１４、ｒｓ７７０９１６８６９、ｒｓ７７１０２５４７９、ｒｓ７７１０６９６２４、ｒｓ７７１０７０４１１、ｒｓ７７１１０８８６３、ｒｓ７７１１４３４０７、ｒｓ７７１１９２３８２、ｒｓ７７１２３８９８５、ｒｓ７７１２５７８４５、ｒｓ７７１２７４４７３、ｒｓ７７１３５９５２３、ｒｓ７７１４２１０７３、ｒｓ７７１４７９４２４、ｒｓ７７１５３２１８６、ｒｓ７７１５９４９２０、ｒｓ７７１６０１０５６、ｒｓ７７１６３１２４４、ｒｓ７７１６４１９３３、ｒｓ７７１６８２０４３、ｒｓ７７１７３５３６４、ｒｓ７７１８２９６８７、ｒｓ７７１８４１２６６、ｒｓ７７１９０８７９７、ｒｓ７７１９４９８７８、ｒｓ７７１９７８８４６、ｒｓ７７１９９３０８４、ｒｓ７７２０６１８８９、ｒｓ７７２０８１２４１、ｒｓ７７２１０２８２７、ｒｓ７７２１１４７９１、ｒｓ７７２１６５７９９、ｒｓ７７２２３０９６３、ｒｓ７７２３２１０４６、ｒｓ７７２３３１７１３、ｒｓ７７２３５５７０７、ｒｓ７７２３６７３２９、ｒｓ７７２４０８３１９、ｒｓ７７２４７６３７７、ｒｓ７７２５６００２２、ｒｓ７７２５６９０２０、ｒｓ７７２５８３３０４、ｒｓ７７２６１１５１３、ｒｓ７７２６２４１９８、ｒｓ７７２６７７３１２、ｒｓ７７２６９０９１９、ｒｓ７７２８８２３０９、ｒｓ７７３０４８８２１、ｒｓ７７３０６７８８７、ｒｓ７７３０７５４６１、ｒｓ７７３１２９８６１、ｒｓ７７３１４４４５８、ｒｓ７７３２４２５５８、ｒｓ７７３２８４８２４、ｒｓ７７３３６３９２３、ｒｓ７７３６０４５８４、ｒｓ７７３６３５２４８、ｒｓ７７３６６０３９８、ｒｓ７７３６９９１３４、ｒｓ７７３７４６０４９、ｒｓ７７３８１８４６９、ｒｓ７７３８２４０６７、ｒｓ７７３９２６２７６、ｒｓ７７３９３０６９９、ｒｓ７７３９８３５２８、ｒｓ７７４０５５１４６、ｒｓ７７４１０６８１６、ｒｓ７７４１３１６４１、ｒｓ７７４１７４８７７、ｒｓ７７４１９４６９７、ｒｓ７７４２４３１６１、ｒｓ７７４２７４６０６、ｒｓ７７４３２９０９３、ｒｓ７７４３４６９６１、ｒｓ７７４３７７０８８、ｒｓ７７４３８５７１６、ｒｓ７７４４５１６２６、ｒｓ７７４４７８８１９、ｒｓ７７４５０１３８１、ｒｓ７７４５０６２８７、ｒｓ７７４６４４２３６、ｒｓ７７４６５８６７５、ｒｓ７７４７９７５４１、ｒｓ７７４８５８４８７、ｒｓ７７５０５２４３３、ｒｓ７７５０７７０８０、ｒｓ７７５２６７９９６、ｒｓ７７５２７８１９８、ｒｓ７７５４２９３４０、ｒｓ７７５４４６８００、ｒｓ７７５５１８２５６、ｒｓ７７５５２１５７１、ｒｓ７７５５２２５４１、ｒｓ７７５５６０２２５、ｒｓ７７５５７５７６５、ｒｓ７７５７０４１１２、ｒｓ７７５７０７８６９、ｒｓ７７５７３０３６２、ｒｓ７７５８５８０１９、ｒｓ７７５９８８２１２、ｒｓ７７６０３１１５６、ｒｓ７７６０３３３５５、ｒｓ７７６０９５３０７、ｒｓ７７６１５０１２２、ｒｓ７７６２０８２９５、ｒｓ７７６２２８８３２、ｒｓ７７６２７６７１５、ｒｓ７７６３６７６２５、ｒｓ７７６４１３７０１、ｒｓ７７６４５６９３５、ｒｓ７７６４８４６２２、ｒｓ７７６５１０１２６、ｒｓ７７６６４９１８９、ｒｓ７７６６５８７５８、ｒｓ７７６６８２８４１、ｒｓ７７６６８３８１９、ｒｓ７７６７１１９３１、ｒｓ７７６７２６３２６、ｒｓ７７６７５２１１３、ｒｓ７７７１１１９３４、ｒｓ７７７１６０９１２、ｒｓ７７７１６５２５２、ｒｓ７７７１９０８７３、ｒｓ７７７２３２４８０、ｒｓ７７７３００８５２、ｒｓ７７７３７５８４９、ｒｓ７７７４２０５６６、ｒｓ７７７４３６７９８、ｒｓ７７７４６８２８５、ｒｓ７７７４７０８５６、ｒｓ７７７５５７９３４、ｒｓ７７７５８８８７７、ｒｓ７７７６４５９８１、ｒｓ７７７７０６４６３、ｒｓ７７７７３４３０７、ｒｓ７７７８０８４２９、ｒｓ７７７８４３５２６、ｒｓ７７７８６０８５９、ｒｓ７７７９３１４８９、ｒｓ７７７９８６５７３、ｒｓ７７８００３８３８、ｒｓ７７８０２２７８５、ｒｓ７７８０２３８７９、ｒｓ７７８０３３６３５、ｒｓ７７８０４３６９４、ｒｓ７７８０９１６４９、ｒｓ７７８１０４７８４、ｒｓ７７８１１７５２１、ｒｓ７７８１５７８８５、ｒｓ７７８１９６４２７、ｒｓ７７８２１８４６１、ｒｓ７７８２２２３１２、ｒｓ７７８３６５０９２、ｒｓ７７８３８２１３０、ｒｓ７７８４３５２２３、ｒｓ７７８４８６５４４、ｒｓ７７８５５５１１２、ｒｓ７７８５６２３４４、ｒｓ７７８５７８６９７、ｒｓ７７８５９５８７２、ｒｓ７７８６１７３７２、ｒｓ７７８６２４５３２、ｒｓ７７８６３９６０５、ｒｓ７７８７３８２９１、ｒｓ７７８７６９６５３、ｒｓ７７８７９６４０５、ｒｓ７７８８３７９２０、ｒｓ７７８８４９４４１、ｒｓ７７８８５６０６３、ｒｓ７７８８９４４０７、ｒｓ７７８９００６７１、ｒｓ７７８９５６６４６、ｒｓ７７９１１０５９１、ｒｓ７７９１４９４０７、ｒｓ７７９１６９１６９、ｒｓ７７９２３８４９６、ｒｓ７７９２４６１６６、ｒｓ７７９２６４２５８、ｒｓ７７９２８８７９５、ｒｓ７７９３８４４７０、ｒｓ７７９４２４４１８、ｒｓ７７９４６９７４２、ｒｓ７７９５２８７８７、ｒｓ７７９６３５４９３、ｒｓ７７９６４１０６２、ｒｓ７７９６５１６９２、ｒｓ７７９６８３１０８、ｒｓ７７９７５８６４１、ｒｓ７７９７９２８７０、ｒｓ７７９８２４３８９、ｒｓ７７９８２９９９４、ｒｓ７７９８９９５１１、ｒｓ７８００２１７１９、ｒｓ７８００６８２６２、ｒｓ７８０１９３５３３、ｒｓ７８０２１４８９３、ｒｓ７８０２４３７５３、ｒｓ７８０２７７１６０、ｒｓ７８０３７９８６３、ｒｓ７８０５０９３１９、ｒｓ７８０５６４４３３、ｒｓ７８０６４９８１４、ｒｓ７８０７４８５７９、ｒｓ７８０７７４４２３、ｒｓ７８０７８３０８４、ｒｓ７８０７８５２０２、ｒｓ７８０７８７５８５、ｒｓ７８０７９２７３９、ｒｓ７８０８３６６４８、ｒｓ７８０８７８１４５、ｒｓ７８０９４４２１２、ｒｓ７８０９４８８３５、ｒｓ７８１０６６３６２、ｒｓ７８１２６８３０９、ｒｓ７８１４１３７９６、ｒｓ７８１４３１６９４、ｒｓ７８１４６６７９３、ｒｓ７８１４９２７５０、ｒｓ７８１５１９２８３、ｒｓ７８１５９０５１３、ｒｓ７８１６４１３１２、ｒｓ７８１７４０４４３、ｒｓ７８３５６１４０、ｒｓ７８８２７４５５、ｒｓ７８９８４０００、ｒｓ７９４４８８００、ｒｓ７９５１２６４７、ｒｓ７９６７０５１２、ｒｓ７９７１０８８３、ｒｓ７９８０５６７８、ｒｓ７９８４４６１３、ｒｓ９３２６０３４、ＶＡＲ＿０２５４５１、ＶＡＲ＿０２５４５２、ＶＡＲ＿０２５４５４、ＶＡＲ＿０２５４５７、ＶＡＲ＿０２５４５８、ＶＡＲ＿０５８５２０、ＶＡＲ＿０５８５２２、ＶＡＲ＿０５８５２３、ＶＡＲ＿０５８５２４、ＶＡＲ＿０５８５２５、ＶＡＲ＿０５８５２６、ＶＡＲ＿０５８５２７、ＶＡＲ＿０５８５２８、ＶＡＲ＿０５８５２９、ＶＡＲ＿０５８５３０、ＶＡＲ＿０５８５３１、ＶＡＲ＿０５８５３２、ＶＡＲ＿０５８５３３、ＶＡＲ＿０５８５３４、ＶＡＲ＿０５８５３５、ＶＡＲ＿０５８５３６、ＶＡＲ＿０５８５３７、ＶＡＲ＿０６７２８２、ＶＡＲ＿０６７３５１およびＶＡＲ＿０７３６５７である。
１つの例において、本発明において使用されるガイドＲＮＡは、表５に列挙される２０ヌクレオチド（ｎｔ）の標的核酸配列を、少なくとも１つ含み得る。遺伝子の符号および遺伝子の配列識別子（遺伝子の配列番号）、標的遺伝子の１〜５キロ塩基対上流および／または下流を含む、遺伝子配列（拡大した遺伝子の配列番号）、ならびに２０ｎｔの標的核酸配列（２０ｎｔの標的配列の配列番号）を、表５に提示する。配列表には、それぞれの標的遺伝子、遺伝子をターゲティングするための鎖（配列表において（＋）鎖または（−）鎖により注記）、関連するＰＡＭタイプ、およびＰＡＭ配列が、２０ｎｔの標的核酸配列（配列番号５，３０５〜２８，６９６）のそれぞれについて、記載されている。スペーサー配列は、「Ｔ」が「Ｕ」である場合、表５に列挙される２０ｎｔの配列に対応するＲＮＡ配列であり得ることが、当技術分野において理解される。
一実施形態では、本発明において使用されるガイドＲＮＡは、「Ｔ」が「Ｕ」である場合に、例えば、配列番号５，３０５〜２８，６９６のうちのいずれかであるがこれらに限定されない、２０ヌクレオチド（ｎｔ）の標的配列に対応するＲＮＡ配列であり得る、少なくとも１つのスペーサー配列を含み得る。
一実施形態では、本発明において使用されるガイドＲＮＡは、「Ｔ」が「Ｕ」である場合に、例えば、配列番号５，３０５〜２８，６９６のうちのいずれかであるがこれらに限定されない、２０ｎｔの配列に対応するＲＮＡ配列である、少なくとも１つのスペーサー配列を含み得る。
一実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＮＡＡＡＡＣ、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＮＧＨＴＴ、ＮＲＧ、またはＹＴＮなどであるがこれらに限定されないＰＡＭタイプと関連する、２０ヌクレオチド（ｎｔ）の標的核酸配列を含み得る。非限定的な例として、特定の標的遺伝子および特定のＰＡＭタイプの２０ｎｔの標的核酸配列は、「Ｔ」が「Ｕ」である場合に、表６における２０ｎｔの核酸配列のうちのいずれか１つに対応するＲＮＡ配列であり得る。
一実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＹＴＮのＰＡＭタイプと関連する２２ヌクレオチド（ｎｔ）の標的核酸配列を含み得る。非限定的な例として、特定の標的遺伝子の２２ｎｔの標的核酸配列は、２０ｎｔのコア配列を含み得、ここで、２０ｎｔのコア配列は、「Ｔ」が「Ｕ」である場合に、配列番号１８，７９２〜２８，６９６に対応するＲＮＡ配列であり得る。別の非限定的な例として、特定の標的遺伝子の２２ｎｔの標的核酸配列はコア配列を含み得、ここで、コア配列は、「Ｔ」が「Ｕ」である場合に、配列番号１８，７９２〜２８，６９６のうちのいずれかに対応するＲＮＡ配列の断片、セグメント、または領域であり得る。
ＶＩ．他の治療法
遺伝子編集は、特異的配列をターゲティングするように操作されたヌクレアーゼを使用して行うことができる。現在のところ、ヌクレアーゼの４つ主要な種類：メガヌクレアーゼおよびそれらの誘導体、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系が存在する。特に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性が、タンパク質−ＤＮＡ間相互作用を介するのに対し、ＲＮＡ−ＤＮＡ間相互作用は、主にＣａｓ９をガイドするので、ヌクレアーゼプラットフォームは、デザインの難易度、ターゲティングの密度、および作用方式にばらつきがある。
本開示の方法では、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することができる。しかし、治療のための標的部位など、本明細書で記載される教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、またはＭｅｇａＴＡＬなど、エンドヌクレアーゼの他の形態へと適用することもでき、ヌクレアーゼの組合せの使用へと適用することもできる。しかし、本開示の教示を、このようなエンドヌクレアーゼへと適用するためには、とりわけ、特異的標的部位へと導かれるタンパク質を操作することが必要となろう。
さらなる結合性ドメインをＣａｓ９タンパク質へと融合させて、特異性を増大させることができる。これらの構築物の標的部位は、同定されたｇＲＮＡ指定部位へとマップされるが、亜鉛フィンガードメインなどのための、さらなる結合モチーフを要求するであろう。Ｍｅｇａ−ＴＡＬの場合は、メガヌクレアーゼを、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインへと融合させることができる。メガヌクレアーゼドメインは、特異性を増大させ、切断をもたらしうる。同様に、不活化Ｃａｓ９またはｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、切断ドメインへと融合させることができ、これは、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位と、融合させたＤＮＡ結合性ドメインのための隣接結合性部位とを要求する。これは、さらなる結合性部位がなければ、結合を減少させるように、触媒性の不活化に加えて、ｄＣａｓ９の何らかのタンパク質操作を要求する可能性が高い。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）とは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼであるＦｏｋＩの触媒性ドメインへと連結された、操作亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性ドメインから構成されるモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは、二量体としてだけ機能するため、１対のＺＦＮを、逆ＤＮＡ鎖上にあり、それらの間に正確な間隔を伴う、コグネイトの標的「半部位」配列に結合するように操作して、触媒的に活性のＦｏｋＩ二量体の形成を可能としなければならない。それ自体では配列特異性を有さないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ＺＦＮ半部位間で、ゲノム編集における開始ステップとして、ＤＮＡ二本鎖切断が作出される。
各ＺＦＮのＤＮＡ結合性ドメインは、夥多なＣｙｓ２−Ｈｉｓ２アーキテクチャーによる、３〜６つの亜鉛フィンガーであって、各フィンガーが、標的ＤＮＡ配列の１つの鎖のヌクレオチドのトリプレットを主に認識する亜鉛フィンガーから構成されることが典型的であるが、４番目のヌクレオチドとの交差相互作用もまた、重要でありうる。ＤＮＡとの鍵となる接触点を作る位置における、フィンガーのアミノ酸の変更は、所与のフィンガーの配列特異性を変更する。したがって、４フィンガーによる亜鉛フィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識するが、この場合、トリプレットの優先性は、可変的な程度で、隣接するフィンガーの影響を受けうるが、標的配列は、各フィンガーが寄与するトリプレット優先性の複合物である。ＺＦＮの重要な側面は、個々のフィンガーを修飾するだけで、ほぼ任意のゲノムアドレスへと、たやすく再ターゲティングしうるが、これを十分に行うには、かなりの熟練が要求されることである。ＺＦＮの大半の適用では、それぞれ、１２〜１８ｂｐずつを認識する、４〜６フィンガーのタンパク質が使用される。よって、１対のＺＦＮは、２４〜３６ｂｐの標的配列の組合せであって、半部位間の、典型的に５〜７ｂｐのスペーサーを含まない組合せを認識することが典型的であろう。結合性部位は、１５〜１７ｂｐを含む大型のスペーサーにより、さらに分離することができる。この長さの標的配列は、デザイン工程時に、リピートの配列または遺伝子の相同体を除外することを仮定すると、ヒトゲノム内で固有である可能性が高い。しかしながら、ＺＦＮタンパク質−ＤＮＡ間相互作用は、それらの特異性において絶対的ではないので、オフ標的結合および切断イベントが、２つのＺＦＮの間のヘテロ二量体、またはＺＦＮの一方もしくは他方によるホモ二量体として生じる。後者の可能性は、互いとだけ二量体化することが可能であり、それら自体では二量体化しえない、偏性ヘテロ二量体変異体としてもまた公知の、「プラス」および「マイナス」変異体を創出するように、ＦｏｋＩドメインの二量体化界面を操作することにより効果的に排されている。偏性ヘテロ二量体を強いることにより、ホモ二量体の形成が防止される。これは、ＺＦＮ、ならびにこれらのＦｏｋＩ変異体を採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性を大いに増強している。
当技術分野では、様々なＺＦＮベースの系が記載されており、それらの改変は、定期的に報告され、多数の参考文献が、ＺＦＮのデザインを導くのに使用される規則およびパラメータについて記載している（例えば、Segalら、Proc Natl Acad Sci USA、９６巻（６号）：２７５８〜６３頁（１９９９年）；Dreier Bら、J Mol Biol.、３０３巻（４号）：４８９〜５０２頁（２０００年）；Liu Qら、J Biol Chem.、２７７巻（６号）：３８５０〜６頁（２００２年）；Dreierら、J Biol Chem、２８０巻（４２号）：３５５８８〜９７頁（２００５年）；およびDreierら、J Biol Chem.、２７６巻（３１号）：２９４６６〜７８頁（２００１年）を参照されたい）。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮとは、モジュラーヌクレアーゼの別のフォーマットであって、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合性ドメインを、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインへと連結し、１対のＴＡＬＥＮが、タンデムに作動して、ターゲティングされたＤＮＡ切断を達成するフォーマットを表す。ＺＦＮとの主要な差違は、ＤＮＡ結合性ドメインおよび関連する標的ＤＮＡ配列認識特性の性格である。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメインは、元来、植物の細菌性病原体であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．において記載された、ＴＡＬＥタンパク質に由来する。ＴＡＬＥは、３３〜３５アミノ酸のリピートによるタンデムアレイであって、典型的には、最大で２０ｂｐの長さの標的ＤＮＡ配列であり、全標的配列の長さを最大で４０ｂｐとする、標的ＤＮＡ配列内の単一の塩基対を、各リピートが認識するタンデムアレイから構成される。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２および１３位における、２つのアミノ酸だけを含む、ＲＶＤ（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）により決定される。塩基である、グアニン、アデニン、シトシン、およびチミンは主に、４つのＲＶＤ：それぞれ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ、およびＡｓｎ−Ｇｌｙにより認識される。これは、亜鉛フィンガーの場合より、はるかに単純な認識コードを構成し、したがって、ヌクレアーゼデザインのために、後者を上回る利点を表す。しかしながら、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ間相互作用は、それらの特異性において絶対的ではなく、ＴＡＬＥＮもまた、オフ標的活性を低減するように、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用から利益を得ている。
それらの触媒機能を失活させた、ＦｏｋＩドメインのさらなる変異体も創出されている。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ対の片方が、不活性のＦｏｋＩドメインを含有する場合は、標的部位において、ＤＳＢではなく、一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）だけが生じるであろう。結果は、Ｃａｓ９切断ドメインのうちの一方を失活させた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の「ニッカーゼ」突然変異体の使用と同等である。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動しうるが、効率は、ＤＳＢによる場合より低下する。主要な利益は、オフ標的のニックは、ＮＨＥＪにより媒介される誤修復を受けやすいＤＳＢと異なり、迅速かつ正確に修復されることである。
当技術分野では、様々なＴＡＬＥＮベースの系が記載されており、それらの改変も、定期的に報告されている（例えば、Boch、Science、３２６巻（５９５９号）：１５０９〜１２頁（２００９年）；Makら、Science、３３５巻（６０６９号）：７１６〜９頁（２０１２年）；およびMoscouら、Science、３２６巻（５９５９号）：１５０１頁（２００９年）を参照されたい）。「Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ」プラットフォームまたはクローニングスキームに基づくＴＡＬＥＮの使用については、複数のグループにより記載されている（例えば、Cermakら、Nucleic Acids Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁（２０１１年）；Liら、Nucleic Acids Res.、３９巻（１４号）：６３１５〜２５頁（２０１１年）；Weberら、PLoS One.、６巻（２号）：ｅ１６７６５頁（２０１１年）；Wangら、J Genet Genomics、４１巻（６号）：３３９〜４７頁、Epub、２０１４年５月１７日（２０１４年）；およびCermak Tら、Methods Mol Biol.、１２３９巻：１３３〜５９頁（２０１５年）を参照されたい）。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）とは、長い認識配列（１４〜４４塩基対）を有し、ＤＮＡを、高特異性で切断する（ゲノム内の固有の部位であることが多い）、配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＨＥの、少なくとも６つの公知のファミリーであって、真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、およびファージを含む、広範囲にわたる宿主に由来する、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈｉｓ−Ｃｉｓボックス、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、およびＶｓｒ様を含む、それらの構造により分類されるファミリーが存在する。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集における最初のステップとして、標的ローカスにおけるＤＳＢを創出することができる。加えて、一部の天然および操作ＨＥは、ＤＮＡの単一の鎖だけを切断し、これにより、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大型の標的配列およびそれらがもたらす特異性のために、ＨＥは、部位特異的ＤＳＢを創出するのに魅力的な候補物質となっている。
当技術分野では、様々なＨＥベースの系が記載されており、それらの改変は、定期的に報告されている（例えば、Steentoftら、Glycobiology、２４巻（８号）：６６３〜８０頁（２０１４年）；BelfortおよびBonocora、Methods Mol Biol.、１１２３巻：１〜２６頁（２０１４年）；HafezおよびHausner、Genome、５５巻（８号）：５５３〜６９頁（２０１２年）による総説；ならびにこれらにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ−ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッド体のヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォームおよびＴｅｖ−ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインと、触媒的に活性のＨＥとの融合体を使用し、微調整可能なＤＮＡ結合およびＴＡＬＥの特異性の両方、ならびにＨＥの切断配列特異性を利用する（例えば、Boisselら、NAR、４２巻：２５９１〜２６０１頁（２０１４年）；Kleinstiverら、G3、４巻：１１５５〜６５頁（２０１４年）；ならびにBoisselおよびScharenberg、Methods Mol. Biol.、１２３９巻：１７１〜９６頁（２０１５年）を参照されたい）。
さらなる変化形では、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャーは、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）の、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインである、Ｉ−ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）との融合体である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質で、約３０ｂｐ離れて位置し、非適合性の粘着末端を伴う２つのＤＳＢを発生させる（例えば、Wolfsら、NAR、４２巻、８８１６〜２９頁（２０１４年）を参照されたい）。既存のヌクレアーゼベースの手法の他の組合せが進化し、本明細書で記載される、ターゲティングされたゲノム修飾の達成において有用となることが予期される。
ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１−Ｆｏｋ１および他のヌクレアーゼ
上記で記載したヌクレアーゼプラットフォームの構造的特性と機能的特性とを組み合わせることにより、ゲノム編集のためのさらなる手法であって、固有の欠点のうちの一部を潜在的に克服しうる手法を提供する。例として述べると、ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集系は、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、ＤＳＢを創出することが典型的である。ターゲティングの特異性は、標的ＤＮＡ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９の場合、隣接するＮＡＧまたはＮＧＧであるＰＡＭ配列内のさらなる２塩基を加えた）とのワトソン−クリック型塩基対合を経るガイドＲＮＡ内の、２０または２４ヌクレオチドの配列により駆動される。このような配列は、ヒトゲノム内では、固有となるのに十分に長いが、ＲＮＡ／ＤＮＡ間相互作用の特異性は絶対的ではなく、場合によって、顕著な無差別性が、特に、標的配列の５’側において許容され、特異性を駆動する塩基の数を有効に低減する。これに対する１つの解決法は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の触媒性機能を完全に失活させる（ＲＮＡにガイドされるＤＮＡ結合機能だけを保持しながら）代わりに、ＦｏｋＩドメインを、失活させたＣａｓ９へと融合させることであった（例えば、Tsaiら、Nature Biotech、３２巻：５６９〜７６頁（２０１４年）；およびGuilingerら、Nature Biotech.、３２巻：５７７〜８２頁（２０１４年）を参照されたい）。ＦｏｋＩは、触媒的に活性となるには、二量体化しなければならないため、２つのガイドＲＮＡは、２つのＦｏｋＩ融合体を、近接してテザリングして、二量体を形成し、ＤＮＡを切断することが要求される。これは本質的に、標的部位の組合せにおける塩基の数を二倍化し、これにより、ＣＲＩＳＰＲベースの系によるターゲティングの厳密性を増大させる。
さらなる例として述べると、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインの、Ｉ−ＴｅｖＩなど、触媒的に活性なＨＥへの融合は、オフ標的切断をさらに低減しうることを期待して、微調整可能なＤＮＡ結合およびＴＡＬＥの特異性の両方のほか、Ｉ−ＴｅｖＩの切断配列特異性も利用する。
ＶＩＩ．キット
本開示は、本明細書で記載される方法を実行するためのキットを提示する。キットは、ゲノムターゲティング核酸、ゲノムターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または本明細書で記載される方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子のうちの１または複数、あるいはこれらの任意の組合せを含みうる。
キットは、（１）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）部位特異的ポリペプチドまたは部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（３）ベクターおよび／またはポリペプチドを修復および／または希釈するための試薬とを含みうる。
キットは、（１）（ｉ）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）ベクターを修復および／または希釈するための試薬とを含みうる。
上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、単一分子ゲノムターゲティングガイド核酸を含みうる。上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、二重分子ゲノムターゲティング核酸を含みうる。上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、２つまたはこれを超える、二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを含みうる。キットは、核酸ターゲティング核酸をコー
ドするベクターを含みうる。
上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、所望の遺伝子改変を生じさせるように挿入されるポリヌクレオチドをさらに含みうる。
キットの構成要素は、別個の容器内の場合もあり、単一の容器内で組み合わせる場合もある。
上記の任意のキットは、１または複数のさらなる試薬をさらに含む場合があるが、この場合、このようなさらなる試薬は、緩衝液、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞へと導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける作製のための試薬、シークエンシングのためのアダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、修復緩衝液、希釈緩衝液などでありうる。キットはまた、オン標的への結合もしくはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断を容易とするかもしくは増強するか、またはターゲティングの特異性を改善するのに使用しうる、１または複数の構成要素も含みうる。
上記で言及した構成要素に加えて、キットは、キットの構成要素を使用して、方法を実施するための指示書をさらに含みうる。方法を実施するための指示書は、適切な記録媒体上に記録することができる。例えば、指示書は、紙またはプラスチックなどの基板上に印刷することができる。指示書は、キット内に、パッケージ添付文書として存在する場合もあり、キットまたはその構成要素の容器（すなわち、パッケージングまたは部分パッケージングと関連する）の表示中に存在する場合などもある。指示書は、適切なコンピュータ読取り用保存媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子保存データファイルとして存在しうる。一部の場合には、実際の指示書は、キット内に存在しないが、遠隔の供給源から、指示書を得る（例えば、インターネットを介して）ための手段を提供することができる。この場合の例は、指示書を閲覧することができ、かつ／または指示書をダウンロードしうるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を得るためのこの手段は、適切な基板上に記録することができる。
ＶＩＩＩ．本発明の具体的な方法および組成物
このように、本開示は、特に、以下の本発明による非限定的な方法に関する。第１の方法である、方法１では、本開示は、ゲノム編集によって、細胞内のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子を編集するための方法であって、細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法２では、本開示は、ＰＣＳＫ９関連の状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、肝細胞を患者から単離するステップと、肝細胞のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集するステップと、ゲノム編集した肝細胞を患者へと植え込むステップとを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法３では、本開示は、編集するステップが、肝細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む、方法２に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法４では、本開示は、ＰＣＳＫ９関連の状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと、ｉＰＳＣのプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集するステップと、ゲノム編集したｉＰＳＣを肝細胞へと分化させるステップと、肝細胞を患者へと植え込むステップとを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５では、本開示は、編集するステップが、ｉＰＳＣへと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む、方法４に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法６では、本開示は、ＰＣＳＫ９関連の状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、間葉幹細胞を患者から単離するステップと、間葉幹細胞のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集するステップと、ゲノム編集した間葉幹細胞を肝細胞へと分化させるステップと、肝細胞を患者へと植え込むステップとを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７では、本開示は、編集するステップが、間葉幹細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む、方法６に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法８では、本開示は、ＰＣＳＫ９関連の障害を有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、患者の細胞内のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法９では、本開示は、編集するステップが、細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む、方法８に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法１０では、本開示は、細胞が、肝細胞である、方法８〜９のいずれか１つに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法１１では、本開示は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによって、肝細胞へと送達される、方法１０に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法１２では、本開示は、細胞内のＰＣＳＫ９遺伝子の連続的なゲノム配列を変更する方法であって、細胞を、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと接触させて、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすことを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法１３では、本開示は、連続的なゲノム配列の変更が、ＰＣＳＫ９遺伝子の１つまたは複数のエクソンにおいて生じる、方法１２に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法１４では、本開示は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、配列番号１〜６２０に列挙されるもののうちのいずれか、および配列番号１〜６２０に列挙されるもののうちのいずれかに対して少なくとも７０％の相同性を有する変異体から選択される、方法１〜１３のうちのいずれか１つに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法１５では、本開示は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドである、方法１４に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法１６では、本開示は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドである、方法１４に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法１７では、本開示は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）である、方法１６に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法１８では、本開示は、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）が、１つまたは複数の化学修飾されたＲＮＡである、方法１７に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法１９では、本開示は、１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）が、コーディング領域において化学修飾されている、方法１８に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２０では、本開示は、１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）が、コドン最適化されている、方法１６〜１９のうちのうちのいずれか１つに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２１では、本開示は、細胞へと、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡを導入することをさらに含む、方法１〜２０のうちのいずれか１つに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２２では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、ＰＣＳＫ９遺伝子のコーディング配列のセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、方法２１に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２３では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、化学修飾されている、方法２１〜２２のうちのいずれかに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２４では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとあらかじめ複合体化されている、方法２１〜２３のうちのいずれか１つに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２５では、本開示は、あらかじめ複合体化させることが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡの、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼへの共有結合を含む、方法２４に記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２６では、本開示は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に製剤化される、方法１４〜２５のうちのいずれか１つに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２７では、本開示は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡも含むリポソームまたは脂質ナノ粒子中に製剤化される、方法２１〜２５のうちのいずれか１つに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２８では、本開示は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、ＡＡＶベクター粒子においてコードされ、ＡＡＶベクターの血清型が、表４および５に列挙されるものから選択される、方法１２または２１〜２２のうちのいずれか１つに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法２９では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、ＡＡＶベクター粒子においてコードされ、ＡＡＶベクターの血清型が、表４および５に列挙されるものから選択される、方法２１〜２２のうちのいずれかに記載の方法を提示する。
別の方法である、方法３０では、本開示は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡもコードするＡＡＶベクター粒子においてコードされ、ＡＡＶベクターの血清型が、表４および５に列挙されるものから選択される、方法２１〜２２のうちのいずれかに記載の方法を提示する。
本開示はまた、配列番号５，３０５〜２８，６９６のうちのいずれかに対応するＲＮＡ配列であるスペーサー配列を少なくとも含む、単一分子ガイドＲＮＡを含む組成物である、組成物１も提示する。
別の組成物である、組成物２では、本開示は、単一分子ガイドＲＮＡが、スペーサー伸長領域をさらに含む、組成物１に記載の単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物３では、本開示は、単一分子ガイドＲＮＡが、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長領域をさらに含む、組成物１に記載の単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物４では、本開示は、単一分子ガイドＲＮＡが、化学修飾されている、組成物１〜３に記載の単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物５では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドと、組成物１〜４に記載の少なくとも１つの単一分子ガイドＲＮＡとを含む、非天然のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提示する。
別の組成物である、組成物６では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３ Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１、ならびにこれらの酵素に対して少なくとも７０％の相同性を有する変異体から選択される、組成物５に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提示する。
別の組成物である、組成物７では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドが、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、組成物６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提示する。
別の組成物である、組成物８では、本開示は、少なくとも１つのＮＬＳが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドのアミノ末端にあるかまたはアミノ末端から５０アミノ酸以内にある、および／または少なくとも１つのＮＬＳが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドのカルボキシ末端にあるかまたはカルボキシ末端から５０アミノ酸以内にある、組成物７に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提示する。
別の組成物である、組成物９では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１酵素をコードするポリヌクレオチドが、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、組成物８に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提示する。
別の組成物である、組成物１０では、本開示は、組成物１〜３に記載の単一分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１１では、本開示は、組成物７〜９に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするＤＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１２では、本開示は、組成物１０または１１に記載のＤＮＡを含むベクターを提示する。
別の組成物である、組成物１３では、本開示は、ベクターがプラスミドである、組成物１２に記載のベクターを提示する。
別の組成物である、組成物１４では、本開示は、ベクターが、ＡＡＶベクター粒子であり、ＡＡＶベクターの血清型が、配列番号１〜６２０および表２に列挙されるものから選択される、組成物１２に記載のベクターを提示する。
ＩＸ．定義
「〜を含むこと」または「〜を含む」という用語は、本発明に不可欠であるが、不可欠なものであれ、可欠なものであれ、未指定の要素の包含に対しても開かれた、組成物、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素に言及して使用される。
「〜から本質的になる」という用語は、所与の態様に要求される要素を指す。用語は、本発明のその態様の、基本的かつ新規のまたは機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない、さらなる要素の存在を許容する。
「〜からなる」という用語は、態様についてのその記載において列挙されない任意の要素を除外して、本明細書で記載される組成物、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素を指す。
単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、文脈により、そうでないことが明確に指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。
本明細書において提示されるある特定の数値は、「約」という用語が先行する。「約」という用語は、列挙された数値の±１０％以内の数値を意味する。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が、以下に付随する説明において記載されている。本明細書において記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な材料および方法が、本明細書に記載されている。本発明の他の特性、目的、および利点は、説明から明らかであろう。本説明において、単数形は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、本説明が、優先される。
本明細書で列挙される任意の数値範囲は、数値精度が同じである（すなわち、指定された桁数と同じ桁数を有する）全ての部分範囲であって、列挙された範囲内に包含される部分範囲について記載する。例えば、「１．０〜１０．０」という列挙範囲は、本明細書の本文中で、「２．４〜７．６」という範囲が、明示的に列挙されていない場合であってもなお、例えば、「２．４〜７．６」など、列挙された最小値である１．０と、列挙された最大値である１０．０との間（およびこれらを含む）の、全ての部分範囲について記載する。したがって、本出願者は、本明細書で明示的に列挙される範囲内に包含される、同じ数値精度の、任意の部分範囲を、明示的に列挙するように、特許請求の範囲を含む本明細書を矯正する権利を留保する。任意のこのような部分範囲を明示的に列挙するように矯正することが、記載、記載の十分性、ならびに３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ａ）およびＥＰＣ １２３（２）条下の要件を含む、新規事項の要件に準拠するように、全てのこのような範囲は本明細書で固有に記載される。文脈により、明示的に指定またはそうでないことが要求されない限りにおいて、本明細書で記載される、全ての数値パラメータ（値、範囲、量、百分率などを表す数値パラメータ）はまた、「約」という語が、数の前に明示的に現れない場合であってもなお、「約」という語を前置しているかのように読むことができる。加えて、本明細書で記載される数値パラメータは、報告される有効桁数である、数値精度に照らして、通常の丸め法を適用することにより解釈されるものとする。また、本明細書で記載される数値パラメータは、必然的に、パラメータの数値を決定するのに使用される基礎的な測定法に特徴的な、固有のばらつきを有することも理解される。
本開示の１つまたは複数の態様の詳細が、以下に付随する説明において記載されている。本明細書において記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な材料および方法が、本明細書に記載されている。本開示の他の特性、目的、および利点は、説明から明らかであろう。本説明において、単数形は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、本説明が、優先される。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって、さらに例証される。
Ｘ．実施例
本発明は、本発明の例示的で非限定的な態様を提供する以下の実施例を参照して、より完全に理解される。
実施例では、ＰＣＳＫ９遺伝子の恒久的な欠失または突然変異をもたらし、ＰＣＳＫ９タンパク質活性を低減または排除する、本明細書において「ゲノム改変」と称されるＰＣＳＫ９遺伝子内の定義された治療的ゲノム欠失、挿入、または置き換えを創出するための例示的なゲノム編集技法としての、ＣＲＩＳＰＲ系の使用について説明する。定義された治療改変の導入は、本明細書において説明され、例示されるように、脂質異常症の潜在的な改善のための新規な治療戦略を代表する。
（実施例１）
ＰＣＳＫ９遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンする。それぞれの領域を、配列ＮＲＧを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンする。配列表の配列番号７，２７０〜１８，７９１に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列を、次いで、特定する。
（実施例２）
ＰＣＳＫ９遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンする。それぞれの領域を、配列ＮＮＧＲＲＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンする。配列表の配列番号５，５４６〜６，５７９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列を、次いで、特定する。
（実施例３）
ＰＣＳＫ９遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンする。それぞれの領域を、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンする。配列表の配列番号５，３６６〜５，５４５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列を、次いで、特定する。
（実施例４）
ＰＣＳＫ９遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンする。それぞれの領域を、配列ＮＡＡＡＡＣを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンする。配列表の配列番号５，３０５〜５，３６５に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列を、次いで、特定する。
（実施例５）
ＰＣＳＫ９遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンする。それぞれの領域を、配列ＮＮＮＮＧＡＴＴを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンする。配列表の配列番号６，５８０〜７，２６９に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２０ｂｐのスペーサー配列を、次いで、特定する。
（実施例６）
ＰＣＳＫ９遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＰＣＳＫ９遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンする。それぞれの領域を、配列ＴＴＮまたはＹＴＮを有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンする。配列表の配列番号１８，７９２〜２８，６９６に示されるように、ＰＡＭに対応するｇＲＮＡ ２２ｂｐのスペーサー配列を、次いで、特定する。
（実施例７）
ガイド鎖のバイオインフォマティクス解析
次いで、オンーゲット部位およびオフターゲット部位の両方において、理論的結合および実験的に査定した活性の両方を含む一段階プロセスまたは多段階プロセスで、候補ガイドをスクリーニングおよび選択する。例示として、意図される染色***置以外の染色***置での効果の可能性を査定するために、以下により詳細に説明および例示するように、オフターゲット結合を査定するために使用可能な様々なバイオインフォマティクスツールの１つまたは複数を使用して、隣接するＰＡＭを有する、ＰＣＳＫ９遺伝子内の部位などの、特定のオンターゲット部位に適合する配列を有する候補ガイドを、同様の配列を有するオフターゲット部位で切断するそれらの潜在的可能性について査定することができる。
その後、オフターゲット活性について比較的低い潜在的可能性を有することが予測される候補は、それらのオンターゲット活性、およびその後様々な部位でのオフターゲット活性を測定するために実験的に査定することができる。好ましいガイドは、選択した遺伝子座で所望の遺伝子編集レベルを達成するために十分に高いオンターゲット活性を有し、他の染色体遺伝子座では改変の可能性を低減させるために比較的低いオフターゲット活性を有する。オンターゲット対オフターゲット活性の比は多くの場合、ガイドの「特異性」と呼ばれる。
予測されるオフターゲット活性の最初のスクリーニングのために、最も可能性が高いオフターゲット部位を予測するために使用され得る、いくつかの公知かつ一般に利用可能なバイオインフォマティクスツールがあり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ系における標的部位への結合は相補的配列間のワトソン・クリック塩基対形成により駆動されるので、相違の程度（およびそれゆえオフターゲット結合の潜在的可能性の低減）は本質的に、標的部位に対する、潜在的可能性があるオフターゲット部位における、一次配列の差、ミスマッチおよびバルジ、すなわち、非相補的塩基に変えられた塩基、ならびに塩基の挿入または欠失に関連する。ＣＯＳＭＩＤ（ＣＲＩＳＰＲ Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ，Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（ウェブ上でｃｒｉｓｐｒ．ｂｍｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕにて使用可能）と呼ばれる例示的なバイオインフォマティクスツールは、かかる類似点を集計する。他のバイオインフォマティクスツールとして、ａｕｔｏＣＯＳＭＩＤ、およびＣＣＴｏｐが挙げられるが、これらに限定されない。
突然変異および染色体再編の有害効果を低減させるために、バイオインフォマティクスを使用して、オフターゲット切断を最小限にする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系についての研究は、特に、ＰＡＭ領域から遠位位置での、塩基対ミスマッチおよび／またはバルジを有するＤＮＡ配列へのガイド鎖の非特異的ハイブリダイゼーションに起因する高いオフターゲット活性の可能性を示唆した。それゆえ、塩基対ミスマッチに加えて、ＲＮＡガイド鎖とゲノム配列との間の挿入および／または欠失を有する、潜在的可能性があるオフターゲット部位を特定することができるバイオインフォマティクスツールを有することは、重要である。オフターゲット予測アルゴリズムＣＣＴｏｐに基づくバイオインフォマティクスツールを使用して、潜在的可能性があるＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位のゲノムを探索した（ＣＣＴｏｐは、crispr.cos.uni-heidelberg.de/においてウェブ上で利用可能である）。出力は、ミスマッチの数および位置に基づいて潜在的可能性があるオフターゲット部位のリストをランク付けし、標的部位のより情報に通じた選択を可能にし、より可能性があるオフターゲット切断を有する部位の使用を回避する。
ある領域におけるｇＲＮＡ標的化部位の見積もられたオンターゲット活性および／またはオフターゲット活性を比較検討する、追加のバイオインフォマティクスパイプラインを使用する。活性を予測するために使用することができる他の特徴として、問題の細胞種、ＤＮＡのアクセシビリティ、クロマチン状態、転写因子結合部位、転写因子結合データ、および他のＣＨＩＰ−ｓｅｑデータについての情報が挙げられる。ｇＲＮＡ対の相対的位置および方向、局所配列特徴、ならびにマイクロホモロジーなどの、編集効率を予測する追加の要素を比較検討する。
初期の評価およびガイドのデザインは、エクソン１〜３、およびイントロン１〜３についてはエクソン−イントロン接合部に４００〜５００ｂｐ近接する配列に、焦点を当てていた。初期のバイオインフォマティクス分析により、およそ６５０個のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列を特定した。
優先順位を付けたガイドのリストを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写に基づくガイドスクリーニングに関して、それらのオフターゲット部位の予測の数および位置を考慮して、生成した。このリストに、スクリーニングのために、Ｐｃｓｋ９配列内でのそれらの位置に基づいてｇＲＮＡのさらに優先順位付けを行ったが、５’エクソンをターゲティングするｇＲＮＡに、優先度を付与した。上述のプロセスに基づいて、１９２個のガイドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのガイドスクリーニングに選択した。
エクソン配列内のｇＲＮＡを使用して、タンパク質配列における変化および／またはタンパク質の短縮化を通じて、タンパク質の機能の喪失を生じるインデルを創出することができる。５’ＵＴＲ配列内のｇＲＮＡを、単独でかまたはエクソン内のｇＲＮＡと組み合わせてのいずれかで使用して、翻訳開始部位を除去し、タンパク質の合成を防止することができる。イントロン内のｇＲＮＡを、単独でかまたはエクソン内のｇＲＮＡと組み合わせて使用して、スプライスドナー部位およびアクセプター部位を除去し、短縮化されたタンパク質の産生およびその結果としての機能の喪失を生じることができる。エクソン１内のｇＲＮＡおよび上流の配列を使用して、転写および／または翻訳開始部位を除去することができる。
１９２個のガイド（表７）に、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写に基づくガイドシークエンシングプロトコールについて、それらのオフターゲット部位の予測の数および位置を考慮して、優先順位付けを行った。ｇＲＮＡもまた、スクリーニングのために、Ｐｃｓｋ９配列内でのそれらの位置に基づいて優先順位付けを行ったが、ＩＶＴスクリーニングのために５’エクソンをターゲティングするｇＲＮＡに、優先度を付与した。
エクソン配列内のｇＲＮＡを使用して、タンパク質配列における変化および／またはタンパク質の短縮化を通じて、タンパク質の機能の喪失を生じるインデルを創出することができる。イントロン１配列内のｇＲＮＡを、単独でかまたはエクソン内のｇＲＮＡと組み合わせてのいずれかで使用して、翻訳開始部位を除去し、タンパク質の合成を防止することができる。イントロン内のｇＲＮＡを、単独でかまたはエクソン内のｇＲＮＡと組み合わせて使用して、スプライスドナー部位およびアクセプター部位を除去し、短縮化されたタンパク質の産生およびその結果としての機能の喪失を生じることができる。
以下の検討事項を、ガイドの選択に使用した：１）エクソン１（２つのガイド）の欠失またはコーディング配列の５’末端におけるフレームシフトの創出を使用して、Ｐｃｓｋ９機能を破壊することができる。イントロン１において開始部位で注釈が付けられた重複するｌｎｃＲＮＡが存在する。イントロン１内の変異体２の開始部位を越えるいくつかのガイドを、選択したが、これらは、この転写物の妨害により、有害な作用が生じないことを確認するための対照としての機能を果たし得る。２）エクソン２および３は、ＵＣＳＣゲノムブラウザｈｇ３８アセンブリーに従ってＰｃｓｋ９ローカスから産生された非コーディング変異体ＲＮＡには存在しない。３）ナンセンス突然変異、スプライスアクセプター突然変異、およびスプライスドナー突然変異が、ヒトのエクソン３において特定されている（例えば、ＥｘＡＣデータベース−Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを参照されたい）。このエクソン内の多くのガイドが、スクリーニングに含まれた。４）５’ ＵＴＲ、エクソン１、イントロン１、エクソン２、およびイントロン２内のガイドを、セーフハーバー用途に使用することができる。
（実施例８）
オンターゲット活性についての、細胞における好ましいガイドの試験
コグネイトのＤＮＡ標的領域を編集することができる広範なｇＲＮＡ対を特定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを行った。関連するゲノム配列を、ｇＲＮＡデザインソフトウェアを使用して解析に供した。得られたｇＲＮＡのリストを、上述のように、配列の固有性（ゲノム内のどこにも完全なマッチを有しないｇＲＮＡのみをスクリーニングした）、および最小限の予測されるオフターゲットに基づいて、抜粋ｇＲＮＡリストに狭めた。このｇＲＮＡのセットを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅメッセンジャーＭＡＸを使用して、Ｃａｓ９を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に回収し、ゲノムＤＮＡを単離し、切断効率を、ＴＩＤＥ解析を使用して評価した。（図２〜４）。
有意な活性を有するｇＲＮＡを、ＰＣＳＫ９における遺伝子編集を測定するために、培養細胞においてフォローアップした。オフ標的イベントを、再度追跡してもよい。様々な細胞にトランスフェクトを行い、遺伝子矯正のレベルおよび可能性のあるオフ標的イベントを測定してもよい。これらの実験により、ヌクレアーゼおよびドナーのデザインおよび送達の送達が可能となる。
（実施例９）
オフターゲット活性についての、細胞における好ましいガイドの試験
上述の実施例においてＩＶＴスクリーニングによるオンターゲット活性が最も良かったｇＲＮＡを、他の方法に加えて、ハイブリッド捕捉アッセイ、ＧＵＩＤＥ Ｓｅｑ、および全ゲノムシークエンシングを使用して、オフターゲット活性について試験する。
（実施例１０）
ｇＲＮＡのスクリーニング
様々なエクソンをターゲィングするｇＲＮＡをデザインするためのＣＣＴｏｐプロトコール（Stemmer, M.、Thumberger, T.、del Sol Keyer, M.、Wittbrodt, J.、およびMateo, J.L.、CCTop: an intuitive, flexible and reliable CRISPR/Cas9 target prediction tool. PLOS ONE、（２０１５年）、doi:10.1371/journal.pone.0124633）を使用して、ＰＣＳＫ９領域（第１染色体：５５，０４０，２２２〜５５，０６４，８５３）を使用して、２０ｎｔの認識部位をデザインした。Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａおよびＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＰＣＳＫ９エクソンに高度に相同性のスペーサー（ｇＲＮＡ包含の基準：ＮＧＧ ＰＡＭの存在、スペーサー配列の最初の位置または２番目の位置における１つを上回らないミスマッチ）。ヒト、マカク、およびブタに交差反応性となるようにデザインされた２３個のｇＲＮＡを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した（Ａｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡ）。
ｇＲＮＡの活性を、Ｃａｓ９（レンチウイルスによる形質導入）を構成的に発現するＨｕＨ７細胞において試験した、図５。ウェル当たり１００００個の細胞（９６ウェルプレート）を播種し、播種後１６〜１８時間以内に、トランスフェクトし、簡単に述べると、ｇＲＮＡを、最終的なｇＲＮＡの量１３０ｎｇで製造業者のプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともにインキュベートした。細胞を、ｇＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体とともに、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭを含む完全培地において、４８時間インキュベートした。細胞を、ｐｒｅｐＧＥＭ（商標）（ＺｙＧｅｍ ＮＸ Ｌｔｄ）において、製造業者のプロトコールに従って、溶解させた。
ｇＲＮＡの効率は、Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ）分析（Brinkman EK、Chen T、Amendola M、van Steensel B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res.、２０１４年１２月１６日、４２巻（２２号）：ｅ１６８頁、doi:10.1093/nar/gku936）によって分析し、簡単に述べると、ゲノムＤＮＡを、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＰＣＲキットを使用したＰＣＲの鋳型として使用した。
ＰＣＲアンプリコンを、ＡｘｙＰｒｅｐ Ｍａｇ ＰＣＲクリーンアップキット（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して、精製した。アンプリコンをシークエンシングし、分解アルゴリズムを使用して分析した。ｇＲＮＡ活性を、Ｓ．ｐｙ．Ｃａｓ９の予測切断部位（すなわち、非標的鎖のＰＡＭ（ＮＧＧ）の上流のヌクレオチド−４と−３との間、および標的鎖のＰＡＭ相補性配列（ＣＣＮ）の下流のヌクレオチド３と４との間）に隣接する様々なインデル（１〜５０ｎｔの挿入または１〜５０ｎｔの欠失）を有する対立遺伝子の比として測定した。ｇＲＮＡの活性を、表８に列挙する。
この研究により、ＰＣＳＫ９エクソン１をターゲティングする１つのガイド、およびＰＣＳＫ９エクソン−１８をターゲティングする１つのガイドが、６０％よりも高いｉｎ ｖｉｔｒｏでのインデル効率を有したことが実証される。
（実施例１１）
初代肝細胞におけるＰＣＳＫ９をターゲィングするｇＲＮＡの交差反応活性
この実施例では、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションによるノックアウト後の、ブタ、カニクイザル、およびヒトドナーから単離した初代肝細胞におけるＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡの効率的な交差反応活性を実証する。
ブタ（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）、カニクイザル（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＡＤＭＥＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびヒト（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＡＤＭＥＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から単離した初代肝細胞を、２４ウェルのＩ型コラーゲンコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅｓ、カタログ番号３５６４０８）において、０．３５×１０６個の細胞／ウェルでコンフルエントな単層に播種し、３７℃で５％ ＣＯ２において、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｚ９９０００３）中でインキュベートした。播種の３〜５時間後に、肝細胞単層に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとの複合体で、Ｐ９−１ ｇＲＮＡまたはＰ９−１８ ｇＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。ｇＲＮＡのトランスフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅメッセンジャーＭａｘを製造業者のプロトコールに従って使用して、最終的なｇＲＮＡの量２００ｎｇで実施した。また、肝細胞に、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの複合体なしで、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅメッセンジャーＭａｘをトランスフェクトして、「疑似」試料を生成した。細胞には、トランスフェクションの１６時間後に新しいＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培養培地の培地交換を受容させ、ｇＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体とともに４８時間インキュベートし、４８時間の時点で、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧｅｍ）において、製造業者のプロトコールに従って溶解させた。
Ｃａｓ９およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡをトランスフェクトした肝細胞ならびに疑似トランスフェクタント（対照群）を、ＴＩＤＥによって分析した。ＴＩＤＥ分析により、ＰＣＳＫ９ガイドＲＮＡのＰ９−１およびＰＣＳＫ９ Ｐ９−１８の両方が、いずれも、ブタ、サル、およびヒトから単離した初代肝細胞において活性であったことが示された（図６Ａ〜６Ｂを参照されたい）。Ｐ９−１およびＰ９−１８は、ＨｕＨ７細胞において６０％を上回る切断効率を示すが、Ｐ９−１のみが、初代ヒト肝細胞において同様の切断効率（約６０％）を示した。加えて、Ｐ９−１は、Ｐ９−１８と比較して、良好な種間活性を示し、Ｐ９−１ ｇＲＮＡは、種間および種内で、より高いインデル頻度を示す。
（実施例１２）
遺伝子編集した初代ヒト肝細胞におけるＰＣＳＫ９タンパク質の分泌
この実施例では、初代ヒト肝細胞において、Ｐ９−１ ｇＲＮＡによる効率的な遺伝子編集と、ＰＣＳＫ９タンパク質の分泌の低減との間の相関性を実証する。
初代ヒト肝細胞（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＡＤＭＥＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、２４ウェルのＩ型コラーゲンコーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅｓ、カタログ番号３５６４０８）において、０．３５×１０６個の細胞／ウェルでコンフルエントな単層に播種し、３７℃で５％ ＣＯ２において、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｚ９９０００３）中でインキュベートした。播種の３〜５時間後に、肝細胞単層に、Ｐ９−１ ｇＲＮＡまたはｈＣ３ ｇＲＮＡ（ｈＣ３標的配列：ＴＧＧＧＡＣＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧ（配列番号２８，７３２）。ｈＣ３は、ヒトＣ３遺伝子を効率的にノックアウトするが、ＰＣＳＫ９遺伝子を編集しない、無関係のｇＲＮＡである）のいずれかを、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとの複合体でトランスフェクトした。ｇＲＮＡのトランスフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅメッセンジャーＭａｘを製造業者のプロトコールに従って使用して、最終的なｇＲＮＡの量２００ｎｇで実施した。また、肝細胞に、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの複合体なしで、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅメッセンジャーＭａｘをトランスフェクトして、「疑似」試料を生成した。細胞には、トランスフェクションの１６時間後に新しいＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ培養培地の培地交換を受容させた。試料を、ｇＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体とともに４８時間インキュベートし、４８時間の時点で、ＰＣＳＫ９タンパク質分析のために上清を採取し、細胞を、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧｅｍ）において、製造業者のプロトコールに従って溶解させた。
Ｃａｓ９およびＰ９−１ ｇＲＮＡまたはＣａｓ９およびｈＣ３ ｇＲＮＡをトランスフェクトした肝細胞ならびに疑似トランスフェクタント（対照群）を、ＴＩＤＥによって分析した。ＴＩＤＥ分析により、ＰＣＳＫ９が、予測した通り、Ｐ９−１ ｇＲＮＡによって編集されたが（インデル約６０％）、ｈＣ３ ｇＲＮＡによっては編集されなかったことが示された。同時に、ｈＣ３は、Ｃ３遺伝子を効率的に編集し、インデル頻度は、同じヒトドナーにおいて約６５％であった（それぞれ、図７Ａおよび７Ｂ）。
ヒトＰＣＳＫ９タンパク質のサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｌｅｇｅｎｄ ＭＡＸ（商標）Ｈｕｍａｎ ＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡキット、カタログ番号４４３１０７）を使用して、「疑似」試料および遺伝子編集試料から採取した上清におけるＰＣＳＫ９の濃度を検出した。この研究により、「疑似」試料におけるＰＣＳＫ９の平均レベルが約１１ｎｇ／ｍｌであることがわかり、ｈＣ３遺伝子編集肝細胞から採取した上清では約９ｎｇ／ｍＬと同様のレベルであった。対照的に、Ｐ９−１ ｇＲＮＡによる約６０％のＰＣＳＫ９遺伝子の編集を見せた初代肝細胞からの上清は、１ｎｇ／ｍＬよりも低いＰＣＳＫ９タンパク質を含有し、対照群と比較して、ＰＣＳＫ９タンパク質のレベルに有意な低減があった（図７Ｃ）。この研究により、ＰＣＳＫ９遺伝子の有効な編集が、初代肝細胞において分泌されるＰＣＳＫ９タンパク質の機能的な低減を生じることが実証される。
（実施例１３）
関連する動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの試験
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ガイドの組合せを評価した後、リード製剤を、動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで試験する。
リード選択に続いて、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９複合体を、送達のために、脂質ナノ粒子へと製剤化する。
ヘテロ接合性ＬＤＬＲ＋／−ブタを、血漿中コレステロール濃度の上昇、それに続く急速進行性アテローム性動脈硬化症を特徴とする状態である、高コレステロール血症のモデルとして選択する。ＰＣＳＫ９阻害のためのモノクローナル抗体療法は、家族性高コレステロール血症を有する患者においてＬＤＬコレステロールを低減することが示されており、この疾患は、ＬＤＬＲにおける機能喪失性突然変異を有する患者に顕著である。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＰ９−１ ｇＲＮＡと複合体化された脂質ナノ粒子を、ブタに注入し、投薬後１日目は１時間ごと、および７日間の期間にわたって３日後ごとに、全血試料を採取する。対照群には、生理食塩水を注入した動物が含まれる。投薬前に、ベースラインの全血採取も行う。
体重を、研究の間中モニタリングし、血漿および血清試料を、サイトカインおよび補体活性化（炎症性応答）ならびに臨床脂質パネル（全コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ−Ｃ、およびトリグリセリド）について、モニタリングする。７日間の終了時に、肝臓組織を採取し、ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子編集について評価する。
肝臓組織を、対照および投薬動物の両方からホモジナイズし、有効なＰＣＳＫ９遺伝子編集の根拠について、ＴＩＤＥ分析によって分析する。
この研究過程にわたるＴＩＤＥ分析および脂質化学組成の結果により、インデル頻度とコレステロールレベルにおける修飾との間の相関性が、ＬＤＬ−Ｃの低減を強調して、得られるであろう。
ＸＩ．均等物および範囲
当業者であれば、本明細書において記載される本発明による具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識するであろうし、または単に慣例的な実験を使用すれば確かめることができる。本発明の範囲は、上述の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
群内の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲および説明は、群メンバーのうちの１つ、１つよりも多く、またはすべてが、別途そうでないことが示されない限りまたは別途文脈から明らかでない限り、所与の産物またはプロセスに存在するか、それらに利用されるか、またはそれ以外ではそれらに関連していれば、条件を満たすと考えられる。本発明は、群内の厳密に１つのメンバーが、所与の産物またはプロセスに存在する、それらに利用される、またはそれ以外ではそれらに関連する、実施形態を含む。本発明は、１つよりも多くのまたはすべての群メンバーが、所与の産物またはプロセスに存在する、それらに利用される、またはそれ以外ではそれらに関連する、実施形態を含む。
加えて、先行技術の範囲内に入る本発明の任意の特定の実施形態が、特許請求の範囲のいずれか１つまたは複数から明示的に除外され得ることを、理解されたい。そのような実施形態は、当業者に公知であると考えられるため、それらは、除外について本明細書に明示的に記載されていない場合であっても、除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療剤もしくは有効成分、任意の産生の方法、任意の使用の方法など）は、先行技術の存在に関連するかしないかにかかわらず、任意の理由のために、任意の１つまたは複数の特許請求の範囲から除外される可能性がある。
使用されている単語は、制限というよりは説明の単語であること、本発明の広義の態様の本来の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で、変更がなされ得ることを、理解されたい。
本発明は、記載されるいくつかの実施形態に関して、詳細かつ具体的に記載されているが、本発明が、任意のそのような詳細もしくは実施形態または任意の特定の実施形態に制限されることを意図するものではなく、本発明は、先行技術を踏まえてそのような特許請求の範囲の可能な限り広義の解釈を提示し、したがって、本発明の意図される範囲内に効果的に包含されるように、添付の特許請求の範囲を参照して、解釈されるものとする。
例示的な例についての注釈
本開示は、本発明の様々な態様および／またはその潜在的可能性がある適用を例示する目的のために様々な特定の態様の説明を提供するが、変形および改変が当業者に想起されることが理解される。したがって、本明細書で説明する発明（単数）または発明（複数）は、少なくともそれらが請求されるのと同程度に広いものであり、本明細書で提供される特定の例示的な態様により、より狭く定義されるものではないと理解されるべきである。
本明細書で特定される任意の特許、刊行物、または他の開示材料は、別に示されない限り、組み込まれる材料が本明細書で明白に示される存在する説明、定義、記述、または他の開示材料と矛盾しない限り、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。そのため、および必要な限り、本明細書で示される明らかな開示は、参照により組み込まれる任意の矛盾する材料に取って代わる。本明細書に参照により組み込まれると述べられているが、本明細書で示される存在する定義、記述、または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその部分は、その組み込まれる材料と存在する開示材料との間で矛盾が生じない限りにおいてのみ組み込まれる。出願人らは、本明細書に参照により組み込まれる、任意の主題またはその部分を明白に列挙するために、本明細書を訂正する権利を有する。

Claims (41)

  1. ゲノム編集によって、細胞内のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子を編集するための方法であって、前記細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除するステップを含む、方法。
  2. ＰＣＳＫ９関連の状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
    （ａ）肝細胞を、患者から単離するステップと、
    （ｂ）前記肝細胞のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集するステップと、
    （ｃ）前記ゲノム編集した肝細胞を、前記患者へと植え込むステップと
    を含む、方法。
  3. 前記編集するステップが、前記肝細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む、請求項２に記載の方法。
  4. ＰＣＳＫ９関連の状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
    （ａ）患者特異的な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を創出するステップと、
    （ｂ）前記ｉＰＳＣのプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集するステップと、
    （ｃ）前記ゲノム編集したｉＰＳＣを、肝細胞へと分化させるステップと、
    （ｄ）前記肝細胞を、前記患者へと植え込むステップと
    を含む、方法。
  5. 前記編集するステップが、前記ｉＰＳＣへと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む、請求項４に記載の方法。
  6. ＰＣＳＫ９関連の状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
    （ａ）間葉幹細胞を、前記患者から単離するステップと、
    （ｂ）前記間葉幹細胞のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子またはＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集するステップと、
    （ｃ）前記ゲノム編集した間葉幹細胞を、肝細胞へと分化させるステップと、
    （ｄ）前記肝細胞を、前記患者へと植え込むステップと
    を含む、方法。
  7. 前記編集するステップが、前記間葉幹細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む、請求項６に記載の方法。
  8. ＰＣＳＫ９関連の障害を有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、前記患者の細胞内のプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子を編集するステップを含む、方法。
  9. 前記編集するステップが、前記細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＰＣＳＫ９調節エレメント内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、前記ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍に、少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的な挿入、欠失、または突然変異を生じるＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現または機能を低減または排除することを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記細胞が、肝細胞である、請求項８〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、局所注射、全身注入、またはこれらの組合せによって、前記肝細胞へと送達される、請求項１０に記載の方法。
  12. 細胞内のＰＣＳＫ９遺伝子の連続的なゲノム配列を変更する方法であって、前記細胞を、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと接触させて、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすことを含む、方法。
  13. 前記連続的なゲノム配列の前記変更が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子の１つまたは複数のエクソンにおいて生じる、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、配列番号１〜６２０に列挙されるもののうちのいずれか、および配列番号１〜６２０に列挙されるもののうちのいずれかに対して少なくとも７０％の相同性を有する変異体から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）が、１つまたは複数の化学修飾されたＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）が、コーディング領域において化学修飾されている、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）が、コドン最適化されている、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記方法が、前記細胞へと、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡを導入することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、前記ＰＣＳＫ９遺伝子内またはその近傍のＤＮＡ配列に相補的であるスペーサー配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、前記ＰＣＳＫ９遺伝子に隣接する配列または前記ＰＣＳＫ９遺伝子の調節エレメントをコードする他の配列に相補的であるスペーサー配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、化学修飾されている、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとあらかじめ複合体化されている、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記あらかじめ複合体化させることが、前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡの、前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼへの共有結合を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、リポソームまたは脂質ナノ粒子中に製剤化される、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡも含むリポソームまたは脂質ナノ粒子中に製剤化される、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、ＡＡＶベクター粒子においてコードされ、前記ＡＡＶベクターの血清型が、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に列挙されるもののうちのいずれかからなる群から選択される、請求項１２または請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、ＡＡＶベクター粒子においてコードされ、前記ＡＡＶベクターの血清型が、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に列挙されるもののうちのいずれかからなる群から選択される、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
  31. 前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡもコードするＡＡＶベクター粒子においてコードされ、前記ＡＡＶベクターの血清型が、配列番号４，７３４〜５，３０２および表２に列挙されるもののうちのいずれかからなる群から選択される、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
  32. 配列番号５，３０５〜２８，６９６のうちのいずれかに対応するＲＮＡ配列であるスペーサー配列を少なくとも含む、単一分子ガイドＲＮＡ。
  33. 単一分子ガイドポリヌクレオチドが、スペーサー伸長領域をさらに含む、請求項３２に記載の単一分子ガイドポリヌクレオチド。
  34. 単一分子ガイドポリヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長領域をさらに含む、請求項３２に記載の単一分子ガイドポリヌクレオチド。
  35. 前記単一分子ガイドポリヌクレオチドが、化学修飾されている、請求項３２〜３４に記載の単一分子ガイドポリヌクレオチド。
  36. ＤＮＡエンドヌクレアーゼとあらかじめ複合体化されている、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の単一分子ガイドＲＮＡ。
  37. 前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、請求項３６に記載の単一分子ガイドＲＮＡ。
  38. 前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３ Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１、およびＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１、ならびにこれらの酵素に対して少なくとも７０％の相同性を有する変異体からなる群から選択される、請求項３７に記載の単一分子ガイドＲＮＡ。
  39. 前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項３８に記載の単一分子ガイドＲＮＡ。
  40. 少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼのアミノ末端にあるかまたはアミノ末端から５０アミノ酸以内にある、および／または少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼのカルボキシ末端にあるかまたはカルボキシ末端から５０アミノ酸以内にある、請求項３９に記載の単一分子ガイドＲＮＡ。
  41. 請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の単一分子ガイドＲＮＡをコードする、ＤＮＡ。
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