JP2018538002A - 筋萎縮性側索硬化症及び/または前頭側頭葉変性症の治療のための材料及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年12月23日に出願された米国仮特許出願第62/387,424号、及び2016年4月18日に出願された米国仮特許出願第62/324,281号の利益を主張し、これらのそれぞれの内容物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、コンピュータ可読形態の配列表(ファイル名:50316A_SeqListing.txt;14,785,573バイト−ASCIIテキストファイル、2016年12月21日に作成)を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本開示の一部を形成する。
現在、ALS及びFTLDに対処するための全ての療法は、疾患を治癒することよりはむしろ、疾患の進行を遅延させることを目的とする。対照的に、本発明は、疾患の遺伝子的基礎を修正するためのアプローチを提示する。単一治療によりC9ORF72ヘキサヌクレオチド反復拡大を復元し得るゲノムへの永久変化を作成するためのゲノム操作ツールによって、得られた療法は、疾患進行を完全に停止させるべきである。
配列番号1〜6148は、S.pyogenes Cas9エンドヌクレアーゼを有するC9ORF72遺伝子を標的化するための20bpのスペーサー配列である。
(配列番号18808)を含む配列では、標的核酸は、Nが任意のヌクレオチドであるNに対応する配列を含み、下線を引いたNRG配列は、S.pyogenes PAMである。
C9ORF72遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号1〜6148に提供されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
C9ORF72遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号6149〜6892に提供されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
C9ORF72遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号7760〜8097に提供されるように、PAMに対応するgRNA 24bpのスペーサー配列が、特定された。
C9ORF72遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号8098〜8261に提供されるように、PAMに対応するgRNA 24bpのスペーサー配列が、特定された。
C9ORF72遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号6893〜7759に提供されるように、PAMに対応するgRNA 24bpのスペーサー配列が、特定された。
C9ORF72遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号8262〜18807に提供されるように、PAMに対応するgRNA 24bpのスペーサー配列が、特定された。
AAVS1(PPP1R12C)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号18810〜20841に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
AAVS1(PPP1R12C)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号20842〜21012に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
AAVS1(PPP1R12C)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号21013〜21030に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
AAVS1(PPP1R12C)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号21031〜21039に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
AAVS1(PPP1R12C)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号21040〜21114に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
AAVS1(PPP1R12C)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号21115〜22290に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
ALB遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号22291〜22458に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ALB遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号22459〜22486に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ALB遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号22487〜22504に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ALB遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号22505〜22509に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ALB遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号22510〜22533に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ALB遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号22534〜22912に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
Angptl3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号22913〜23257に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Angptl3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号23258〜23293に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Angptl3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号23294〜23316に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Angptl3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号23317〜23329に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Angptl3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号23330〜23392に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Angptl3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号23393〜24240に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
ApoC3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号24241〜24643に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ApoC3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号24644〜24668に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ApoC3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号24669〜24671に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ApoC3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号24672〜24673に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ApoC3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号24674〜24685に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ApoC3遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号24686〜24917に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
ASGR2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号24918〜26685に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ASGR2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号26686〜26891に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ASGR2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号26892〜26915に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ASGR2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号26916〜26927に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ASGR2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号26928〜27010に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
ASGR2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号27011〜28450に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
CCR5遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号28451〜28653に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
CCR5遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号28654〜28685に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
CCR5遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号28686〜28699に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
CCR5遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号28700〜28701に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
CCR5遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号28702〜28729に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
CCR5遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号28730〜29029に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
FIX(F9)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号29030〜30495に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
FIX(F9)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号30496〜30658に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
FIX(F9)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号30659〜30719に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
FIX(F9)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号30720〜30744に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
FIX(F9)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号30745〜30897に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
FIX(F9)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号30898〜33038に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
G6PC遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号33039〜34054に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
G6PC遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号34055〜34171に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
G6PC遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号34172〜34195に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
G6PC遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号34196〜34204に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
G6PC遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号34205〜34294に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
G6PC遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号34295〜35389に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
Gys2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号35390〜40882に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Gys2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号40883〜41558に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Gys2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号41559〜41836に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Gys2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号41837〜41950に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Gys2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号41951〜42630に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Gys2遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号42631〜51062に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
HGD遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号51063〜52755に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
HGD遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号52756〜52969に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
HGD遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号52970〜53052に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
HGD遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号53053〜53071に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
HGD遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号53072〜53272に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
HGD遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号53273〜55597に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
Lp(a)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号55598〜59392に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Lp(a)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号59393〜59802に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Lp(a)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号59803〜59938に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Lp(a)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号59939〜59973に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Lp(a)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号59974〜60341に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Lp(a)遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号60342〜64962に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
PCSK9遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号64963〜66982に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
PCSK9遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号66983〜67169に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
PCSK9遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号67170〜67205に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
PCSK9遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号67206〜67219に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
PCSK9遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号67220〜67359に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
PCSK9遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号67360〜69153に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
Serpina1遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号69154〜70291に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Serpina1遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号70292〜70384に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Serpina1遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号70385〜70396に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Serpina1遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号70397〜70399に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Serpina1遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号70400〜70450に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
Serpina1遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号70451〜71254に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
TF遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号71255〜72086に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TF遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号72087〜72172に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TF遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号72173〜72184に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TF遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号72185〜72191に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TF遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号72192〜72235に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TF遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号72236〜72871に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
TTR遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NRGを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号72872〜73171に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TTR遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNGRRTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号73172〜73212に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TTR遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNAGAAWを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号73213〜73229に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TTR遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NAAAACを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号73230〜73231に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TTR遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列NNNNGHTTを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号73232〜73266に示されるように、PAMに対応するgRNA 20bpのスペーサー配列が、特定された。
TTR遺伝子のエクソン1〜2を、標的部位についてスキャンした。各エリアを、配列YTNを有するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)についてスキャンした。配列番号73267〜73668に示されるように、PAMに対応するgRNA 22bpのスペーサー配列が、特定された。
候補ガイドは、理論性結合及び実験的に評価された活性の両方を含む、複数のステッププロセスにおいてスクリーニングされ、選択されるであろう。例示のために、C9ORF72遺伝子内の部位等の特定のオフターゲット部位を、隣接したPAMと一致させる配列を有する候補ガイドは、意図されるもの以外の染色体上の位置での効果の可能性を評価するために、以下にさらに詳述され、例示されるように、オフターゲット結合を評価するために利用可能な様々なバイオインフォマティクスツールのうちの1つ以上を用いて、同様の配列を有するオフターゲット部位を切断するそれらの可能性について評価され得る。次いで、オフターゲット活性に対して比較的低い可能性を有することが予測される候補は、それらのオンターゲット活性を測定し、次いで様々な部位でオフターゲット活性を測定するために実験的に評価され得る。好ましいガイドは、選択された遺伝子座で所望のレベルの遺伝子編集を達成するために十分に高いオンターゲット活性と、他の染色体遺伝子座で改変の可能性を低減するために比較的低いオフターゲット活性と、を有する。オンターゲット対オフターゲット活性の比は、しばしば、ガイドの「特異性」と称される。
次いで、最低オフターゲット活性を有することが予測されるgRNAは、HEK293TまたはK562等のモデル細胞株中のオフターゲット活性に対して試験され、TIDEまたは次世代シークエンシングを用いて、インデル頻度に対して評価されるであろう。TIDEは、ガイドRNA(sgRNA)によって決定される標的遺伝子座のCRISPR−Cas9によってゲノム編集を迅速に評価するためのウェブツールである。2つの標準的なキャピラリーシークエンシング反応からの定量的配列追跡データに基づいて、TIDEソフトウェアは、編集の有効性を定量化し、標的化した細胞プールのDNA中の主要な種類の挿入及び欠失(インデル)を特定する。詳細な説明及び例のために、Brinkman et al,Nucl.Acids Res.(2014)を参照のこと。ハイスループットシークエンシングとしても既知である、次世代シークエンシング(NGS)は、Illumina(Solexa)シークエンシング、Roche 454シークエンシング、Ion torrent:Proton/PGMシークエンシング、及びSOLiDシークエンシングを含む、多くの異なる近代的シークエンシング技術を記載するために使用されるあらゆる状況に対応できる用語である。これらの最新技術は、これまでに使用されたSangerシークエンシングよりもはるかに迅速かつ安価にDNA及びRNAの配列を決定することができ、したがって、ゲノミクス及び分子生物学の研究に革命を起こす。
次いで、上記の実施例におけるTIDE及び次世代シークエンシング研究からの最良のオンターゲット活性を有するgRNAは、全ゲノムシークエンシングを用いてオフターゲット活性について試験されるであろう。候補gRNAは、CD34+細胞またはiPSCにおいてより完全に評価されるであろう。
オンターゲット活性及びオフターゲット活性の両方のgRNAを試験した後、変異修正及びノックイン戦略は、HDR遺伝子編集について試験されよう。
HDR遺伝子編集のための異なる戦略を試験した後、主なCRISPR−Cas9/DNAドナーの組み合わせは、欠失、組換え、及びオフターゲット特異性の有効性のために初代ヒト神経細胞中で再評価されよう。Cas9 mRNAは、送達のために脂質ナノ粒子に製剤化され、sgRNAは、ナノ粒子に製剤化またはAAVとして送達され、ドナーDNAは、ナノ粒子に製剤化またはAAVとして送達されよう。
最近、正常なヘキサヌクレオチド反復補体または拡大したヘキサヌクレオチド反復のいずれかとともに、ヒトC9ORF72遺伝子を含有するマウスモデルが、生成された。Tg(C9orf72_3)株112マウス(Jackson Laboratory、ストック番号023099)は、ヒトC9orf72_3トランス遺伝子のいくつかのタンデムコピーを有し、各コピーが、100〜1000反復([GGGGCC]100〜1000)を有する。対照として、Tg(C9orf72_2)株8マウス(Jackson Laboratory、ストック番号023088)は、15のヘキサヌクレオチド反復([GGGGCC]15)を有するC9orf72_2トランス遺伝子を有する。Tg(C9orf72_3)株112及びTg(C9orf72_2)株8からの半接合体マウスは、生存可能であり、増殖に適し、メンデル比で生まれ、16月齢でいかなる運動または認識の表現型も発現しない。
C9ORF72 DNA標的領域を編集することができる大きなスペクトルの一対のgRNAを特定するために、インビトロ転写(IVT)のgRNAスクリーニングを行った。C9ORF72ゲノム配列は、a gRNA設定ソフトウェアを用いて分析のために提示された。結果として得られたgRNAの表は、配列の特異性(ゲノム中で他にスクリーニングされた完全一致しないgRNAのみ)に基づいて約200 gRNAの一覧表(表3を参照のこと)に狭め、最小限にオフターゲットを予測した。
Claims (80)
- ゲノム編集によってヒト細胞におけるC9ORF72遺伝子を編集するための方法であって、前記C9ORF72遺伝子内もしくはその近傍の拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらし、C9orf72タンパク質活性の復元をもたらす、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍の1つ以上の一本鎖切断(SSB)または二本鎖切断(DSB)を引き起こすために、前記細胞に、1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼを導入することを含む、方法。
- ゲノム編集によってヒト細胞におけるC9ORF72遺伝子を挿入するための方法であって、前記C9ORF72遺伝子またはミニ遺伝子の永久挿入をもたらし、かつ前記C9orf72タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の1つ以上の一本鎖切断(SSB)または二本鎖切断(DSB)を引き起こすために、前記ヒト細胞に、1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼを導入するステップを含む、方法。
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭葉変性症(FTLD)患者を治療するためのエクスビボ方法であって、
i)患者特異的誘導多能性幹細胞(iPSC)を作成するステップと、
ii)前記iPSCの前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記iPSCの前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍で編集するステップ、または前記iPSCのセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、
iii)前記ゲノム編集されたiPSCを、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化させるステップと、
iv)前記造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を、前記患者に移植するステップと、を含む、方法。 - 前記作成するステップが、
a)体細胞を前記患者から単離することと、
b)前記体細胞に、一連の多分化能関連遺伝子を導入し、前記細胞を誘導して、多能性幹細胞にすることと、を含む、請求項3に記載の方法。 - 前記体細胞が、線維芽細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記一連の多分化能関連遺伝子が、OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG、及びcMYCからなる群から選択される前記遺伝子のうちの1つ以上である、請求項4に記載の方法。
- 前記編集するステップが、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍の前記拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍、または前記C9ORF72遺伝子もしくはミニ遺伝子の永久挿入及びC9orf72タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、1つ以上の一本鎖切断(SSB)または二本鎖切断(DSB)を引き起こすために、前記iPSCに、1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼを導入することを含む、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セーフハーバー遺伝子座が、AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、及びTTRからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である、請求項7に記載の方法。
- 前記分化させるステップが、前記ゲノム編集されたiPSCを、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化させるために、小分子の組み合わせによる処理またはマスター転写因子の送達のうちの1つ以上を含む、請求項3〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植するステップが、前記造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、前記患者に移植することを含む、請求項3〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭葉変性症(FTLD)患者を治療するためのエクスビボ方法であって、
i)白血球を前記患者から単離するステップと、
ii)前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記白血球の前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍で編集するステップ、または前記白血球のセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、
iii)前記編集された白血球を前記患者に移植するステップと、を含む、方法。 - 前記単離するステップが、細胞分画遠心分離、細胞培養、またはこれらの組み合わせを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記編集するステップが、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍の前記拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍、または前記C9orf72タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、1つ以上の一本鎖切断(SSB)または1つ以上の二本鎖切断(DSB)を引き起こすために、前記神経系細胞に、1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼを導入することを含む、請求項11または12に記載の方法。
- 前記セーフハーバー遺伝子座が、AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、及びTTRからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である、請求項13に記載の方法。
- 前記移植するステップが、前記編集された白血球を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、前記患者に移植することを含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭葉変性症(FTLD)患者を治療するためのエクスビボ方法であって、
i)任意に、前記患者の骨髄の生検を実行するステップと、
ii)間葉幹細胞を単離するステップと、
iii)前記幹細胞の前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記幹細胞の前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍で編集するステップ、または前記幹細胞のセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、
iv)前記幹細胞を、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化させるステップと、
v)前記造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞を、前記患者に移植するステップと、を含む、方法。 - 前記単離するステップが、パーコール法を用いた密度遠心分離による、骨髄の吸引及び間葉細胞の単離を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記編集するステップが、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍の前記拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍、またはC9orf72タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、1つ以上の一本鎖切断(SSB)または1つ以上の二本鎖切断(DSB)を引き起こすために、前記幹細胞に、1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼを導入することを含む、請求項16または17に記載の方法。
- 前記セーフハーバー遺伝子座が、AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、及びTTRからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である、請求項18に記載の方法。
- 前記分化させるステップが、前記ゲノム編集された幹細胞を、造血前駆細胞、神経前駆細胞、または神経系細胞に分化させるために、小分子の組み合わせによる処理またはマスター転写因子の送達のうちの1つ以上を含む、請求項16〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移植するステップが、前記細胞を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、前記患者に移植することを含む、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭葉変性症(FTLD)患者を治療するためのエクスビボ方法であって、
i)任意に、前記患者を、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)で治療するステップと、
ii)造血前駆細胞を、前記患者から単離するステップと、
iii)前記造血前駆細胞の前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記造血前駆細胞の前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍で編集するステップ、または前記造血前駆細胞のセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップと、
iv)前記細胞を、前記患者に移植するステップと、を含む、方法。 - 前記治療ステップが、Plerixaflorと組み合わせて行われる、請求項22に記載の方法。
- 前記単離するステップが、CD34+細胞を単離することを含む、請求項22または23に記載の方法。
- 前記編集するステップが、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍の前記拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍、またはC9orf72タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、1つ以上の一本鎖切断(SSB)または1つ以上の二本鎖切断(DSB)を引き起こすために、前記幹細胞に、1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼを導入することを含む、請求項22〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セーフハーバー遺伝子座が、AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、及びTTRからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である、請求項25に記載の方法。
- 前記移植するステップが、前記神経系細胞を、移植術、局所注射、全身注入、またはこれらの組み合わせによって、前記患者に移植することを含む、請求項22〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭葉変性症(FTLD)患者を治療するためのインビボ方法であって、前記患者の細胞中の前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍で編集するステップ、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍で編集するステップを含む、方法。
- 前記編集するステップが、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍の前記拡大したヘキサヌクレオチド反復の永久欠失、挿入、または修正をもたらす、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍、またはC9orf72タンパク質活性の復元をもたらす、セーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、1つ以上の一本鎖切断(SSB)または1つ以上の二本鎖切断(DSB)を引き起こすために、前記細胞に、1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼを導入することを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記セーフハーバー遺伝子座が、AAVS1(PPP1R12C)、ALB、Angptl3、ApoC3、ASGR2、CCR5、FIX(F9)、G6PC、Gys2、HGD、Lp(a)、Pcsk9、Serpina1、TF、及びTTRからなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である、請求項29に記載の方法。
- 前記細胞が、神経系細胞、骨髄細胞、造血前駆細胞、またはCD34+細胞である、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のDNAエンドヌクレアーゼが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1及びCsx12としても既知である)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、もしくはCpf1エンドヌクレアーゼ;またはこれらのホモログ、天然に存在する分子の組み換え、コドン最適化、またはこれらの修飾した変形、及びこれらの組み合わせである、請求項1、7、13、18、25、または29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞に、前記1つ以上のDNAエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項32に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞に、前記1つ以上のDNAエンドヌクレアーゼをコードする1つ以上のリボ核酸(RNA)を導入することを含む、請求項32に記載の方法。
- 前記1つ以上のポリヌクレオチドまたは1つ以上のRNAが、1つ以上の修飾ポリヌクレオチドまたは1つ以上の修飾RNAである、請求項33または34に記載の方法。
- 前記DNAエンドヌクレアーゼが、タンパク質またはポリペプチドである、請求項32に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞に、1つ以上のガイドリボ核酸(gRNA)を導入することをさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のgRNAが、単一分子ガイドRNA(sgRNA)である、請求項37に記載の方法。
- 前記1つ以上のgRNAまたは1つ以上のsgRNAが、1つ以上の修飾gRNAまたは1つ以上の修飾sgRNAである、請求項37または38に記載の方法。
- 前記1つ以上のDNAエンドヌクレアーゼが、1つ以上のgRNAまたは1つ以上のsgRNAと事前に複合体形成される、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞に、野生型C9ORF72遺伝子またはミニ遺伝子またはcDNAの一部を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含む、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記野生型C9ORF72遺伝子またはcDNAの一部が、全C9ORF72遺伝子もしくはcDNA、または天然変異体1、変異体2、もしくは変異体3のcDNAである、請求項41に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖のいずれかである、請求項41または42に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型が、9p21.2領域に対して相同アームを有する、請求項41〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型が、AAVS1(PPP1R12C)のエクソン1〜2、ALBのエクソン1〜2、Angptl3のエクソン1〜2、ApoC3のエクソン1〜2、ASGR2のエクソン1〜2、CCR5のエクソン1〜2、FIX(F9)のエクソン1〜2、G6PCのエクソン1〜2、Gys2のエクソン1〜2、HGDのエクソン1〜2、Lp(a)のエクソン1〜2、Pcsk9のエクソン1〜2、Serpina1のエクソン1〜2、TFのエクソン1〜2、及びTTRのエクソン1〜2からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に対して相同アームを有する、請求項41〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞に、1つのガイドリボ核酸(gRNA)及び前記野生型C9ORF72遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含み、前記1つ以上のDNAエンドヌクレアーゼが、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍のDSB遺伝子座で、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、1つの一本鎖切断(SSB)または二本鎖切断(DSB)を引き起こす、1つ以上のCas9またはCpf1エンドヌクレアーゼであり、前記遺伝子座またはセーフハーバーで、前記ポリヌクレオチドドナー鋳型から染色体DNAへの新しい配列の挿入を容易にし、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の近位にある前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列の前記染色体DNAの一部の永久挿入または修正をもたらし、かつC9orf72タンパク質活性の復元をもたらし、前記gRNAが、前記遺伝子座の断片または遺伝子座に相補的であるスペーサー配列を含む、請求項1、7、13、18、25、または29のいずれか一項に記載の方法。
- 近位が、前記遺伝子座の上流及び下流の両方または遺伝子座のヌクレオチドを意味する、請求項46に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞に、2つのガイドリボ核酸(gRNA)、及び前記野生型C9ORF72遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含み、前記1つ以上のDNAエンドヌクレアーゼが、第1が5’遺伝子座及び第2が3’遺伝子座であり、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍の、またはセーフハーバー遺伝子座内もしくはその近傍の、一対の一本鎖切断(SSB)または二本鎖切断(DSB)を引き起こす2つ以上のCas9またはCpf1エンドヌクレアーゼであり、前記5’遺伝子座と前記3’遺伝子座との間で、前記ポリヌクレオチドドナー鋳型から前記染色体DNAへの新しい配列の挿入を容易にし、前記C9ORF72遺伝子、もしくは前記C9ORF72遺伝子またはセーフハーバー遺伝子座の調節要素をコードする他のDNA配列内もしくはその近傍の、前記5’遺伝子座と前記3’遺伝子座との間の前記染色体DNAの永久挿入または修正をもたらし、かつC9orf72タンパク質活性の復元をもたらし、第1のガイドRNAが、前記5’遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含み、第2のガイドRNAが、前記3’遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含む、請求項1、7、13、18、25、または29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは2つのgRNAが、1つまたは2つの単一分子ガイドRNA(sgRNA)である、請求項46〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つもしくは2つのgRNAまたは1つもしくは2つのsgRNAが、1つもしくは2つの修飾gRNAまたは1つもしくは2つの修飾sgRNAである、請求項46〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のDNAエンドヌクレアーゼが、1つもしくは2つのgRNAまたは1つもしくは2つのsgRNAと事前に複合体形成される、請求項46〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記野生型C9ORF72遺伝子またはcDNAの一部が、前記全C9ORF72遺伝子またはcDNA;天然変異体1、変異体2、変異体3のcDNA;または約30のヘキサヌクレオチド反復である、請求項46〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型が、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、請求項46〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型が、9p21.2領域に対して相同アームを有する、請求項46〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型が、AAVS1(PPP1R12C)のエクソン1〜2、ALBのエクソン1〜2、Angptl3のエクソン1〜2、ApoC3のエクソン1〜2、ASGR2のエクソン1〜2、CCR5のエクソン1〜2、FIX(F9)のエクソン1〜2、G6PCのエクソン1〜2、Gys2のエクソン1〜2、HGDのエクソン1〜2、Lp(a)のエクソン1〜2、Pcsk9のエクソン1〜2、Serpina1のエクソン1〜2、TFのエクソン1〜2、及びTTRのエクソン1〜2からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に対して相同アームを有する、請求項46〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DSB、または5’DSB及び3’DSBが、前記C9ORF72遺伝子の第1イントロン内にある、請求項44に記載の方法。
- 前記挿入または修正が、相同配向型修復(HDR)によるものである、請求項1、7、13、18、25、または29〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞に、2つのガイドリボ核酸(gRNA)を導入することをさらに含み、前記1つ以上のDNAエンドヌクレアーゼが、前記C9ORF72遺伝子内もしくはその近傍の、第1が5’DSB遺伝子座及び第2が3’DSB遺伝子座であり、一対の二本鎖切断(DSB)を引き起こす、2つ以上のCas9またはCpf1エンドヌクレアーゼであり、前記5’DSB遺伝子座と前記3’DSB遺伝子座との間で前記染色体DNAの欠失をもたらし、前記C9ORF72遺伝子内もしくはその近傍の、前記5’DSB遺伝子座と前記3’DSB遺伝子座との間で前記染色体DNAの永久欠失をもたらし、第1のガイドRNAが、前記5’DSB遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含み、第2のガイドRNAが、前記3’DSB遺伝子座の断片に相補的であるスペーサー配列を含む、請求項1、7、13、18、25、または29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記2つのgRNAが、2つの単一分子ガイドRNA(sgRNA)である、請求項58に記載の方法。
- 前記2つのgRNAまたは2つのsgRNAが、2つの修飾gRNAまたは2つの修飾sgRNAである、請求項58または59に記載の方法。
- 前記1つ以上のDNAエンドヌクレアーゼが、1つもしくは2つのgRNAまたは1つもしくは2つのsgRNAと事前に複合体形成される、請求項58〜60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記5’DSB及び3’DSBがともに、前記C9ORF72遺伝子の第1エクソン、第1イントロン、または第2エクソンのいずれかの中にあるか、またはその近傍にある、請求項58〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記欠失が、前記拡大したヘキサヌクレオチド反復の欠失である、請求項58〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Cas9またはCpf1 mRNA、gRNA、及びドナー鋳型はいずれも、それぞれ、脂質ナノ粒子に別々に製剤化されるか、または全てが脂質ナノ粒子に同時に製剤化される、請求項1、7、13、18、25、または29〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Cas9またはCpf1 mRNAが、脂質ナノ粒子に製剤化され、前記gRNA及びドナー鋳型がともに、ウイルスベクターによって送達される、請求項1、7、13、18、25、または29〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項65に記載の方法。
- 前記AAVベクターが、AAV6ベクターである、請求項66に記載の方法。
- 前記Cas9またはCpf1 mRNA、gRNA、及びドナー鋳型はいずれも、それぞれ、別々のエクソソームに製剤化されるか、または全てがエクソソームに同時に製剤化される、請求項1、7、13、18、25、または29〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Cas9またはCpf1 mRNAが、脂質ナノ粒子に製剤化され、前記gRNAが、電気穿孔法によって前記細胞に送達され、ドナー鋳型が、ウイルスベクターによって前記細胞に送達される、請求項1、7、13、18、25、または29〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記gRNAが、電気穿孔法によって前記細胞に送達され、ドナー鋳型が、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによって前記細胞に送達される、請求項69に記載の方法。
- 前記AAVベクターが、AAV6ベクターである、請求項70に記載の方法。
- 前記C9ORF72遺伝子が、染色体9:27,546,542〜27,573,863(ゲノム参照コンソーシアム−GRCh38/hg38)上に位置する、請求項1〜71のいずれか一項に記載の方法。
- C9orf72タンパク質活性の復元が、野生型または正常C9orf72タンパク質活性と比較される、請求項1、7、13、18、25、または29のいずれか一項に記載の方法。
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭葉変性症(FTLD)患者からの細胞中の前記C9ORF72遺伝子を編集するために、配列番号1〜18807の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、1つ以上のガイドリボ核酸(gRNA)。
- 前記1つ以上のgRNAが、1つ以上の単一分子ガイドRNA(sgRNA)である、請求項74に記載の1つ以上のgRNA。
- 前記1つ以上のgRNAまたは1つ以上のsgRNAが、1つ以上の修飾gRNAまたは1つ以上の修飾sgRNAである、請求項74または75に記載の1つ以上のgRNAまたはsgRNA。
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭葉変性症(FTLD)患者を治療するための方法であって、ドナーからの骨髄を前記患者に移植することを含む、方法。
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭葉変性症(FTLD)患者からの細胞中の前記C9ORF72遺伝子を編集するために、配列番号18810〜73668の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、1つ以上のガイドリボ核酸(gRNA)。
- 前記1つ以上のgRNAが、1つ以上の単一分子ガイドRNA(sgRNA)である、請求項78に記載の1つ以上のgRNA。
- 前記1つ以上のgRNAまたは1つ以上のsgRNAが、1つ以上の修飾gRNAまたは1つ以上の修飾sgRNAである、請求項78または79に記載の1つ以上のgRNAまたはsgRNA。
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