JP6926238B2 - イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料の製造方法 - Google Patents

イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料の製造方法であって、
Ａ）スクロースからイソマルツロースおよびトレハルロースへの反応を触媒し得る酵素複合体を、スクロース含有溶液と接触させるステップと、
Ｂ）スクロースの少なくとも一部をイソマルツロースおよびトレハルロースへと異性化させるステップと、
Ｃ）前記酵素複合体を分離して、イソマルツロースとトレハルロースと水とを含有する溶液を得るステップと、
Ｄ）蒸発により水を部分的に除去して、全溶液に対して７５重量％〜９５重量％、好ましくは８０重量％〜９３重量％、特に好ましくは８６重量％〜９２重量％の固形分を有する濃縮溶液を得るステップと、
Ｅ）前記濃縮溶液を、３０℃〜６３℃、好ましくは４５℃〜６２℃、さらにより好ましくは５５℃〜６０℃の温度にし、次いで前記温度範囲でイソマルツロース結晶化を誘導し、次いで冷却することにより、イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料を得るステップと
を含む方法を提供する。
先行技術
イソマルツロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−１，６−フルクトース、Ｐａｌａｔｉｎｏｓｅ（登録商標）ともいう）は、スクロースから得られる砂糖代替品である。その製造はスクロースの異性化を介して進行し、これは一般に、イソマルツロースシンターゼ（スクロースグルコシルムターゼ、ＥＣ ５．４．９９．１１）を用いて酵素的に行われる。独国特許出願公開第１０４９８００号明細書（ＤＥ １０４９８００）、独国特許出願公開第２２１７６２８号明細書（ＤＥ ２２１７６２８）、欧州特許出願公開第２８９００号明細書（ＥＰ ２８９００）および欧州特許出願公開第９１０６３号明細書（ＥＰ ９１０６３）には、酵素によるスクロースからイソマルツロースへの転化のための固定化細菌細胞を用いた方法が記載されている。この目的のために、欧州特許出願公開第０６２５５７８号明細書（ＥＰ ０６２５５７８）では、プロタミノバクター・ラブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）（ＣＢＳ ５７４．７７）、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）（ＡＴＣＣ １５９２８）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（ＮＣＩＢ ８２８５）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）（ＮＲＲＬ−Ｂ ５１２ Ｆ （ＡＴＣＣ １０８３ ａ））およびエルウィニア・ラポンティシ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）（ＮＣＰＰＢ １５７８）の群からの細菌株が使用されている。欧州特許出願公開第０３９２５５６号明細書（ＥＰ ０３９２５５６）および欧州特許出願公開第１２５７６３８号明細書（ＥＰ １２５７６３８）には、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）ＪＣＭ １６８７、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）Ｎｏ． ８８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８３８）ならびにクレブシエラ・シンガポリエンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｉｎｇａｐｏｒｉｅｎｓｉｓ）ＬＸ３およびＬＸ２１の群からの細菌株の使用が記載されている。
これらの異性化法は、生細胞または死細胞のいずれかを用いて、固定化細胞または遊離細胞を用いて行われる。例えば、独国特許出願公開第３１３３１２３号明細書（ＤＥ ３１３３１２３）および欧州特許出願公開第０９１５９８６号明細書（ＥＰ ０９１５９８６）には、欧州特許出願公開第０００１０９９号明細書（ＥＰ ０００１０９９）と同様にアルギン酸カルシウムまたはイオン交換体を用いた酵素触媒の固定化方法、発酵の状況でイソマルツロースを産生し得る遊離生細胞を用いた方法が記載されている。スクロースの酵素反応では、副生成物として、トレハルロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−１，１−フルクトース）ならびにフルクトースおよびグルコースがしばしば形成される。
したがって、欧州特許出願公開第４８３７５５号明細書（ＥＰ ４８３７５５）にも、特定のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株のスクロースグルコシルムターゼを使用することによって実質的に上記の方法をトレハルロースの生成物収率に関して最適化したトレハルロースの製造方法が記載されている。独国特許出願公開第１０２０１２２１６９５５号明細書（ＤＥ １０２０１２２１６９５５）には、イソマルツロースの連続的な結晶化方法であって、Ａ）イソマルツロースと水とを含むフィード溶液を提供するステップと、Ｂ）蒸発によって水を部分的に除去して、イソマルツロース結晶の懸濁液を得るステップと、Ｃ）前記懸濁液を、イソマルツロース含有固体と母液とに分離するステップと、任意にＤ）前記イソマルツロース固体を洗浄するステップとを含む方法が開示されている。
欧州特許出願公開第２６７４５００号明細書（ＥＰ ２６７４５００）には、スクロースからイソマルツロースを生成する酵素をスクロース液に作用させることによって得られるイソマルツロース含有糖液から固体材料を製造する方法であって、前記糖液を加熱して前記糖液の固形分を７７〜９６重量％に調整するステップと、前記ステップで得られた混合物に剪断力をかけて結晶核を生成させ、これを、生成物の温度を６５〜１２０℃に保持しながら行うステップと、前記混合物を冷却して固体材料を得るステップとを含む方法が開示されている。
先行技術の欠点は、どちらかといえば純粋なイソマルツロース結晶が得られるため、含まれるトレハルロースが無駄になるという点、結晶質固体ではなく非晶質固体が得られるという点、および多量のエネルギーを必要とする高温域が作用するという点にある。
それ故、本発明の目的は、先行技術の方法の少なくとも１つの欠点を克服する方法を提供することであった。
発明の説明
驚くべきことに、請求項１記載の方法によって前記目的が達成可能であることが今や見出された。
したがって本発明は、イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料の製造方法であって、
Ａ）スクロースからイソマルツロースおよびトレハルロースへの反応を触媒し得る酵素複合体を、スクロース含有溶液と接触させるステップと、
Ｂ）スクロースの少なくとも一部をイソマルツロースおよびトレハルロースへと異性化させるステップと、
Ｃ）前記酵素複合体を分離して、イソマルツロースとトレハルロースと水とを含有する溶液を得るステップと、
Ｄ）蒸発により水を部分的に除去して、全溶液に対して７５重量％〜９５重量％、好ましくは８０重量％〜９３重量％、特に好ましくは８６重量％〜９２重量％の固形分を有する濃縮溶液を得るステップと、
Ｅ）前記濃縮溶液を、３０℃〜６３℃、好ましくは４５℃〜６２℃、さらにより好ましくは５５℃〜６０℃の温度にし、次いで前記温度範囲でイソマルツロース結晶化を誘導し、次いで冷却することにより、イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料を得るステップと
を含む方法を提供する。
本発明による方法の利点の１つは、生成物品質が一定である点にある。
本発明による方法のなおさらなる利点は、装置固有の空時収率の向上が達成される点にある。
本発明による方法のなおさらなる利点は、種結晶およびその複合体の成長が不要である点にある。
本発明による方法のさらなる利点は、該方法を低温で運転できるため、エネルギー節約が可能である点にある。
本発明による方法のなおさらなる利点は、純粋なイソマルツロースに焦点を合わせた単なる結晶化方法よりも多くの生成物が固化されるため、収率がより高い点にある。
本発明の他の利点は、得られた生成物をすぐに使用でき、また結晶形成の完了に長時間を要しないという点にある。
「イソマルツロース」なる用語は、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド−Ｄ−フルクトースを意味すると理解されるべきである。
「トレハルロース」なる用語は、１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド−Ｄ−フルクトースを意味すると理解されるべきである。
「酵素複合体」なる用語は、少なくとも１つの活性酵素を有する組成物または混合組成物を意味すると理解されるべきであり、それはまた、例えば生細胞のように本質的に複合体であってもよい。酵素複合体のさらなる例は、少なくとも１つの活性酵素が少なくとも１つのさらなるポリペプチドに結合している融合タンパク質であるが、精製酵素自体も本発明における酵素複合体であり得る。
本発明に関連して、「固定化酵素複合体」なる用語は、酵素複合体の水溶液中でのその自由拡散またはその自由運動が制限される、例えば遅くなるように、マトリックスに結合されるかまたはマトリックスによって囲まれる酵素複合体を意味すると理解されるべきである。
本発明に関連して、「イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料」なる用語は、全固体材料に対して少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、さらにより好ましくは少なくとも９０重量％の結晶質を含む固体材料を意味すると理解されるべきである。結晶含有量の測定に適した方法は、Ｘ線回折法である。
各物質の所与の重量値は、無水物質に関する。
特記しない限り、所与のパーセンテージ（％）は、いずれも重量パーセンテージである。
本発明による方法では、方法ステップＡ）のスクロース含有溶液中には、全スクロース含有溶液に対して２０〜８０重量％、特に３０〜５０重量％の濃度のスクロースが存在する。
本発明による好ましい方法は、イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料の製造であって、該固体材料が、乾燥固体材料の全重量に対して７０〜９０重量％、特に７２〜８９重量％、さらに特に７４〜８８重量％、さらに特に７５〜８５重量％の量のイソマルツロースを含む製造に特に適している。イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料は、乾燥固体材料の全重量に対して５〜２５重量％、特に６〜２０重量％の量のトレハルロースを含む。
イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料は、乾燥固体材料の全重量に対して０．１〜５重量％、特に０．２〜４重量％の量のグルコースを含み得る。
イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料は、乾燥固体材料の全重量に対して０．１〜５重量％、特に０．２〜４重量％の量のフルクトースを含み得る。
イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料は、乾燥固体材料の全重量に対して０．０５〜４重量％、特に０．１〜３重量％の量のスクロースを含み得る。
好ましくは、イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料は、上記の３つの糖をすべて含む。
酵素複合体中に存在する酵素は、好ましくは酵素クラスＥＣ ５．４．９９．１１の少なくとも１つのスクロースグルコシルムターゼである。プロタミノバクター・ラブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）、特にプロタミノバクター・ラブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ ５７４．７７株、プロタミノバクター・ルバー（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒ）Ｚ１２株、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、特にセラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）ＡＴＣＣ １５９２８株、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、特にセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）４Ｒｘ１３株、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、特にセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＮＣＩＢ ８２８５株、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、特にロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ １０８３ ａ株、エルウィニア・ラポンティシ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）、特にエルウィニア・ラポンティシ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）ＡＴＣＣ ２９２８３株、ＮＣＰＰＢ １５７８株、ＤＳＭ ４４８４株、ＮＸ−５株およびＷＡＣ２９２８株、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）、特にエルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）Ｄ１２株、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、特にアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＭＸ−２３２株、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）、特にクレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）ＪＣＭ １６８７株、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、特にクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−２８３８株、ＬＸ３株およびＮＫ３３−９８−８株、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、特にクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）３４２株、クレブシエラ・シンガポレンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ）、特にクレブシエラ・シンガポレンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ）ＬＸ２１株、シュードモナス・メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）、特にシュードモナス・メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）ＭＸ−４５株、パントエア・ディスペルサ（Ｐａｎｔｏｅａ ｄｉｓｐｅｒｓａ）、特にパントエア・ディスペルサ（Ｐａｎｔｏｅａ ｄｉｓｐｅｒｓａ）ＵＱ６８Ｊ株、クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、特にクレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）ＣＣＲＣ １９１１２株、ＭＸ１０株およびＵＱ１４Ｓ株、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、特にエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＦＭＢ−１（配列番号１６）株、ＳＺ６２株およびＥｊｐ６１７株、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）ＤＪからのスクロースグルコシルムターゼを本発明による方法において使用することが特に好ましく、その際、プロタミノバクター・ラブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ ５７４．７７およびプロタミノバクター・ルバー（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒ）Ｚ１２が特に好ましい。
酵素を、ポリペプチドとして精製された形態で使用することができる。精製を容易にするために、これらは融合タンパク質の形態であってもよく、その際、例えば精製を容易にするタグ、例えばＨｉｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＧＳＴタグまたはＭＢＰタグが、酵素に融合される。
本発明による方法では、酵素複合体が全細胞であることが好ましく、該全細胞は、好ましくは、プロタミノバクター・ラブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）、特にプロタミノバクター・ラブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ ５７４．７７株、プロタミノバクター・ルバー（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒ）Ｚ１２株、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、特にセラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）ＡＴＣＣ １５９２８株、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、特にセラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）４Ｒｘ１３株、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、特にセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＮＣＩＢ ８２８５株、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、特にロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ １０８３ ａ株、エルウィニア・ラポンティシ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）、特にエルウィニア・ラポンティシ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ）ＡＴＣＣ ２９２８３株、ＮＣＰＰＢ １５７８株、ＤＳＭ ４４８４株、ＮＸ−５株およびＷＡＣ２９２８株、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）、特にエルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）Ｄ１２株、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、特にアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＭＸ−２３２株、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）、特にクレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）ＪＣＭ １６８７株、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、特にクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）ＦＥＲＭ ＢＰ−２８３８株、ＬＸ３株およびＮＫ３３−９８−８株、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、特にクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）３４２株、クレブシエラ・シンガポレンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ）、特にクレブシエラ・シンガポレンシス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ）ＬＸ２１株、シュードモナス・メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）、特にシュードモナス・メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）ＭＸ−４５株、パントエア・ディスペルサ（Ｐａｎｔｏｅａ ｄｉｓｐｅｒｓａ）、特にパントエア・ディスペルサ（Ｐａｎｔｏｅａ ｄｉｓｐｅｒｓａ）ＵＱ６８Ｊ株、クレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、特にクレブシエラ・プランティコーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）ＣＣＲＣ １９１１２株、ＭＸ１０株およびＵＱ１４Ｓ株、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、特にエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＦＭＢ−１株、ＳＺ６２株およびＥｊｐ６１７株、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）ＤＪの群から選択され、その際、プロタミノバクター・ラブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ ５７４．７７およびプロタミノバクター・ルバー（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒ）Ｚ１２が特に好ましい。本発明による好ましい方法に含まれることが好ましい全細胞は、成長、休止、生存または死滅といったいかなる状態であってもよいが、休止細胞が特に好ましい。
酵素複合体の固定化は、例えばＣＬＥＡ（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ、不溶性架橋酵素凝集体）（Ｃａｏ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ： ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅ， Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ．， ２： １３６１−１２６４）の形態で行われてもよいし、天然または合成起源の固体支持体材料上で行われてもよい。天然材料は、多糖類、例えばアルギネート、アガロース、セファロース、セルロースおよびそれらの誘導体（例えば、ＤＥＡＥセルロースまたはＣＭセルロース）である。修飾セファロース、例えばエポキシ活性化セファロース、臭化シアン活性化セファロース、ＮＨＳ活性化セファロース、チオール活性化セファロースを使用することも可能である。これらのセファロースは、例えばＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＢｉｏＲａｄ社、Ｓｉｇｍａ社およびＰｉｅｒｃｅ社から市販されている。
使用可能な合成有機ポリマーは、ポリスチレン誘導体、ポリアクリレート、特にエポキシド活性化アクリル樹脂ビーズ（ユーパギット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ））、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ビニルおよびアリルポリマー、ポリエステルまたはポリアミドである。
好ましいポリ（メタ）アクリレートは、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキルアクリレートポリマー、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキルメタクリレートポリマーおよびＣ１〜Ｃ１０−アルキルアクリレート−Ｃ１〜Ｃ１０−アルキルメタクリレートコポリマーから選択される。封入方法およびさらに好ましく使用されるポリ（メタ）アクリレートポリマーは、欧州特許出願公開第３１１４２１８号明細書（ＥＰ ３１１４２１８）に記載されている。
使用可能な無機担体は、酸化ケイ素もしくは酸化アルミニウムまたはそれらの混合物をベースとする材料である。
酵素複合体の固定化は、高分子多孔質ゲル、例えばＲＳｉ（ＯＣＨ３）３の疎水性ゾル・ゲル材料、またはＲＳｉ（ＯＣＨ３）３とＳｉ（ＯＣＨ３）４との混合物への封入（Ｒｅｅｔｚ， Ｍ．Ｔ．； Ｚｏｎｔａ， Ａ．； Ｓｉｍｐｅｌｋａｍｐ， Ｊ．； Ｒｕｆｉｎｓｋａ， Ａ．； Ｔｅｓｃｈｅ， Ｂ． Ｊ． Ｓｏｌ−Ｇｅｌ Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １９９６， ７， ｐ． ３５−４３）、または多孔質高分子シリカゲルの混合物への封入（Ｅｌｇｒｅｎ， Ｔ．Ｍ．； Ｚａｄｖｏｒｎｙ， Ｏ．Ａ．； Ｂｒｅｃｈｔ， Ｅ．； Ｄｏｕｇｌａｓ， Ｔ．； Ｚｏｒｉｎ， Ｎ．Ａ．； Ｍａｒｏｎｅｙ， Ｍ． Ｊ． ＆ Ｐｅｔｅｒｓ， Ｊ． Ｗ．）によって行われてもよい。
さらに、固定化の他に、酵素膜反応器内での酵素の多用が考えられる。
本発明による方法で使用される酵素複合体、特に細胞を、多糖類、例えばアルギネート、ペクチン、カラギーナン、キトサン、もしくはポリビニルアルコール、例えばレンチカッツ（ｌｅｎｔｉｋａｔｓ）、またはそれらの混合物、特にアルギネートに固定化するのが好ましく、これに関して、例えばＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ５８におけるＳｈｉｍｉｚｕ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｕｓｅｆｕｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｎｅｗ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｓｃｈｅｐｅｒ， Ｔ．， ｅｄ．） ｐｐ． ４５−８８， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
本発明による方法において使用される酵素複合体の任意の形態に使用すべき特に好ましい固定化は、欧州特許出願公開第２０１１８６５号明細書（ＥＰ ２０１１８６５）に記載の方法である。該方法では、不活性支持体上に固定化された酵素複合体に、ヒドロシリル化によって得られたシリコーン被覆が備えられる。
本発明によれば、方法ステップＢ）において４〜９．５のｐＨが存在することが好ましい。このｐＨは、酸、特に無機酸、好ましくは硫酸、塩酸または酢酸の群の酸により有利に確立される。
本発明によれば、方法ステップＢ）において、スクロース含有溶液中で測定した場合に、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃の温度が存在することも好ましい。
方法ステップＣ）において、酵素複合体および最終的に含まれる固体不純物は、イソマルツロースから分離される。これは、例えばろ過、沈降、イオン交換クロマトグラフィーまたは遠心分離により行われる。酵素複合体の固定化特性ゆえ、この分離は、非固定化酵素を用いた場合よりも促進される。
方法の経済性の理由から、本発明によれば、固定化酵素複合体を、スクロース含有溶液が流れる固体層の形態で使用することが好ましい（Ｈ． Ｓｃｈｉｗｅｃｋ， Ｚｕｃｋｅｒｉｎｄ． （１９９０）， １１５ （７）， ５５５−５６５）。相応する固体層プロセスは、Ａ． Ｌｉｅｓｅ， ｅｔ． ａｌ． Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ａ． Ｌｉｅｓｅ， Ｋ． Ｓｅｅｌｂａｃｈ， Ｃ． Ｗａｎｄｒｅｙ （Ｅｄｓ．）， Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００６）， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍに記載されている。
最終的に含まれる固体不純物が、沈降によってイソマルツロースから分離される場合、それは有利であり得る。これを、好ましくは、２℃〜３０℃、好ましくは３℃〜２５℃、特に好ましくは４℃〜１２℃の温度での、２日間〜６０日間、好ましくは１０日間〜５０日間、より好ましくは２０日間〜４０日間の期間にわたる貯蔵によって達成することが好ましく、その間に、最終的に含まれる固体不純物が、イソマルツロースとトレハルロースと水とを含有する溶液の底部に沈む。
これによって、３０℃程度の低温であってもイソマルツロース結晶化の誘導を引き起こし得るという驚くべき技術的効果が奏される。したがって、本発明による他の好ましい方法は、方法ステップＣ）において、酵素複合体および最終的に含まれる固体不純物を、２日間〜６０日間の期間にわたる貯蔵によってイソマルツロースから分離し、好ましくはこれに、ステップＤ）において、蒸発により水を除去して全溶液に対して８６重量％〜９２重量％の固形分を有する濃縮溶液を得るという特徴と、ステップＥ）において、前記濃縮溶液を３０℃〜５０℃の温度にするという特徴とを伴うことを特徴とする。
蒸発の程度を変化させることによって様々な固形分を達成することができ、これを、例えば方法ステップＤ）における滞留時間によって制御することができる。
本発明による好ましい方法は、方法ステップＤ）が、５０℃〜８０℃、好ましくは６０℃〜７５℃、特に好ましくは６３℃〜６８℃の温度範囲で、かつ７０ｍｂａｒ〜２００ｍｂａｒ、好ましくは１００ｍｂａｒ〜１８０ｍｂａｒ、特に好ましくは１３０ｍｂａｒ〜１６０ｍｂａｒの圧力範囲で行われることを特徴とする。特に、これに関連して、本発明による方法において、方法ステップＤ）は、６３℃〜６８℃の温度範囲で、かつ１３０ｍｂａｒ〜１６０ｍｂａｒの圧力範囲で行われることが好ましい。
本発明による他の好ましい方法は、方法ステップＤ）が、５０℃〜８０℃、好ましくは６０℃〜７５℃、特に好ましくは６３℃〜６８℃の温度範囲で、かつ２５０ｍｂａｒ〜５００ｍｂａｒ、好ましくは２７５ｍｂａｒ〜４５０ｍｂａｒ、特に好ましくは３００ｍｂａｒ〜４００ｍｂａｒの圧力範囲で行われることを特徴とする。特に、これに関連して、本発明による方法において、方法ステップＤ）は、６３℃〜６８℃の温度範囲で、かつ３００ｍｂａｒ〜４００ｍｂａｒの圧力範囲で行われることが好ましい。
本発明によるなおもさらなる他の好ましい方法は、方法ステップＤ）が、９５℃〜１３０℃、好ましくは１０６℃〜１２１℃、特に好ましくは１０８℃〜１１８℃の温度範囲で、かつ２５０ｍｂａｒ〜５００ｍｂａｒ、好ましくは２７５ｍｂａｒ〜４５０ｍｂａｒ、特に好ましくは３００ｍｂａｒ〜４００ｍｂａｒの圧力範囲で行われることを特徴とする。特に、これに関連して、本発明による方法において、方法ステップＤ）は、１０８℃〜１１８℃の温度範囲で、かつ３００ｍｂａｒ〜４００ｍｂａｒの圧力範囲で行われることが好ましい。
蒸発の程度を変化させることによって、様々な固形分および／または収率を達成することができ、これを、例えば方法ステップＤ）における滞留時間、圧力および温度によって制御することができる。蒸発を、連続式蒸発器または回分式蒸発器で行うことができる。
本発明によれば、方法ステップＤ）において、３．５〜９．５のｐＨが存在することが好ましい。
方法ステップＥ）において、濃縮溶液を、３０℃〜６３℃、好ましくは４５℃〜６２℃、さらにより好ましくは５５℃〜６０℃の温度にし、これを好ましくは周囲圧力で行う。
本発明により、方法ステップＤ）において全溶液に対して８６重量％〜９２重量％の固形分を有する濃縮溶液を取得し、かつ方法ステップＥ）において該濃縮溶液を５５℃〜６０℃の温度にする場合、これは特に好ましい。
本発明による好ましい方法は、方法ステップＥ）において、濃縮溶液を３０℃〜６３℃、好ましくは４５℃〜６２℃、さらにより好ましくは５５℃〜６０℃の温度にし、次いで、イソマルツロース結晶化を、イソマルツロース種結晶の添加、剪断力、撹拌、摩擦、放射線および超音波からなる群のうちの少なくとも１つから選択される手段によって誘導することを特徴とし、その際、剪断力が特に好ましい。これに関連して、イソマルツロース結晶化を、選択された剪断力の手段により、ただしイソマルツロース種結晶を添加せずに誘導することが極めて好ましい。
本発明による好ましい方法は、方法ステップＥ）においてイソマルツロース種結晶を添加する場合、これらを、濃縮溶液中に含まれるイソマルツロースの全量に対して０．０１〜１０重量％、特に好ましくは０．１〜１重量％の量で添加することを特徴とする。
本発明による好ましい方法は、方法ステップＥ）において、剪断力付与装置によって、好ましくはイソマルツロース種結晶を添加せずに、剪断力によりイソマルツロース結晶を誘導することを特徴とする。
本発明において、「剪断力付与装置」とは、材料に剪断力を加える装置である。これは、例えば、高粘性材料を混練し得る装置、したがって材料を移動させる力が一方向および反対方向に加えられて該材料を粉砕、混練または混合する装置であり得る。これは特に、混練機としての機能を有する装置、より詳細には、材料を加熱することができ、そして加工済みの材料が装置の容器に残留、付着しないように該材料を掻き取ることができる装置であり得る。装置は、混練機、押出機、混練機、撹拌機および汎用混合撹拌機であってよく、押出機が好ましく用いられる。
これらの剪断力付与装置は、容積１００〜３００ｍｌの二重壁容器を備えた小型の実験室用混練機であってよい。この装置は、好ましくは１０〜４０ｒｐｍ、より好ましくは２０〜４０ｒｐｍの回転速度を有する。この装置は、２枚の同方向回転混練ブレードを備えた水平方向の混練槽を有していてもよく、該装置の最大トルクは４０Ｎｍまたは３０Ｎｍであってもよい。二重壁ジャケット内の熱流体により、生成物温度を調整することができる。例として、ＩＫＡ ＨＫＤ−Ｔ ０６が挙げられる。この装置内の生成物は円運動で動かされ、混練ブレード間で剪断される。この装置では、完全な結晶化および白色固体生成物の形成に要する時間（以下「加工時間」と呼ぶ）は、１〜４０分間、好ましくは３〜１５分間であり得る。加工時間中、混練および撹拌によってイソマルツロース混合物に連続的に剪断力が加えられる。混練装置は、回分式で運転される。加工時間の終了後、生成物は混練槽から取り出される。
連続式剪断力付与装置として、実験室用押出機、特に同方向回転二軸押出機、例えばＨａａｋｅ ＰｏｌｙＬａｂ ＯＳを使用することができる。スクリュの長さと直径との比（Ｌ／Ｄ）は、２５であり得る。スクリュは、搬送要素および混練要素を含むように構成され得る。材料は、供給口から押出機の排出端まで水平に搬送される。生成物は、スクリュ内で特に混練要素間で剪断される。装置の最大トルクは、１３０Ｎｍまたは１００Ｎｍであり得る。押出機は、押出機バレルの電気加熱部を有することができる。押出機の回転速度は、５〜１００ｒｐｍ、好ましくは１０〜５０ｒｐｍであり得る。押出機内での加工時間は、２０秒間〜５分間、好ましくは３０秒間〜２分間であり得る。
大型の剪断力付与装置としては、混練押出機、特に単一の回転送りスクリュを備えた混練機を使用することができる。スクリュは、搬送要素および混練要素を含み得る。材料は、供給口から押出機の排出端まで水平に搬送される。生成物は、スクリュ内で特に混練要素間で剪断される。
本発明による好ましい方法は、方法ステップＥ）において、超音波によるイソマルツロース結晶化の誘導が、２０Ｗ／ｃｍ２〜４００Ｗ／ｃｍ２、特に８０Ｗ／ｃｍ２〜３００Ｗ／ｃｍ２、特に１２０Ｗ／ｃｍ２〜１８０Ｗ／ｃｍ２の範囲の比表面出力密度の超音波処理によって達成されることを特徴とする。
本発明によれば、方法ステップＥ）において、３．５〜９．５のｐＨが存在することが好ましい。
以下に列挙される実施例は、本発明を例示的に説明するものであって、何ら本発明を実施例で規定される実施形態に限定することを意図したものではない。本発明の範囲は、本明細書全体および特許請求の範囲から生じるものである。
実施例：
実施例１：スクロース含有溶液の異性化
いずれの実験についても、以下のようにして異性化を行った。
プロタミノバクター・ラブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）（ＣＢＳ ５７４．７７）株の継代培養から得られた細胞を、５０ｇ／ｋｇのスクロース、１５ｇ／ｋｇのコーン膨潤水、７ｇ／ｋｇの硫酸アンモニウム、０．５ｇ／ｋｇの酵母抽出物、１ｇ／ｋｇの硫酸二水素カリウム、０．４１ｇ／ｋｇの塩化マグネシウム七水和物、０．００４ｇ／ｋｇの塩化マンガン四水和物、０．０４７ｇ／ｋｇのクエン酸鉄一水和物および９２６ｇ／ｋｇの水からなる滅菌栄養素培地１〜５ｍｌを適宜ｐＨ７．２に調整したもので水簸した。この懸濁液は、前培養のための接種材料としての役割を果たした。これは、１リットル振とうフラスコ内の上記栄養素溶液２００ｍｌを含む。
３０℃で２０時間培養した後、５０ｇ／ｋｇのスクロース、１５ｇ／ｋｇのコーン膨潤水、３ｇ／ｋｇの硫酸アンモニウム、４ｇ／ｋｇのリン酸水素アンモニウム、０．５ｇ／ｋｇの酵母抽出物、１ｇ／ｋｇの硫酸二水素カリウム、０．４１ｇ／ｋｇの塩化マグネシウム七水和物、０．００４ｇ／ｋｇの塩化マンガン四水和物、０．０４７ｇ／ｋｇのクエン酸鉄一水和物および９２６ｇ／ｋｇの水からなる無菌生成培地１リットルをｐＨ７．２に調整したものを入れた２リットル発酵槽に、初期光学密度（ＯＤ６００）が１となるように前培養物を接種した。
発酵を、３０℃、ｐＨ７（調節済み）およびｐＯ２ ３０％（カスケードスターラー、空気流）で実施した。発酵中にスクロースを供給した。１５〜２０時間後、発酵プロセスを完了させ、固定化のためにバイオマスを収穫することができた。
この目的のために、得られた懸濁液を、体積比１：１の水および４％濃度のアルギネート溶液と混合した。次いで、この懸濁液を２％濃度のＣａＣｌ２溶液に滴下することにより固定化した。得られたビーズを、ポリエチレンイミンおよびグルタルアルデヒドで後硬化した。得られた生体触媒は、４〜１０℃で数週間貯蔵可能である。
得られた固定化細胞を、加熱可能なカラム型反応器に導入し、２０〜３５℃に加熱し、そして全濃厚汁に対して４１重量％のスクロース含分を有するテンサイの濃厚汁の希釈物を、連続流で通す。
異性化後の組成を、表１に示す。
Figure 0006926238
実施例２：沈降
いくつかの実験では、最終的に含まれる固体不純物を、３０日間にわたる２０℃での貯蔵による沈降によってイソマルツロースから分離した。
実施例３：濃度
イソマルツロースとトレハルロースと水とを含有する溶液を、ロータリーエバポレーター内で、６５℃、１３０ｍｂａｒにて、所望の固形分８５〜９８％となるまで濃縮した。濃縮溶液の降下蒸気圧を補償するために、蒸発プロセス中に圧力を１１０ｍｂａｒに下げた。蒸発プロセスの終わりに、１５０ｍｂａｒで温度を９５℃に上げて、流し込み可能なシロップを得た。
以下のパーセントで示される所与の含水率値は、１００重量％−固形分重量％に等しい。
実施例４：結晶化
混練要素および搬送要素を備えたサーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）連続二軸スクリュ押出機（Ｈａａｋｅ ＰｏｌｙＬａｂ ＯＳ ＰＴＷ １６／２５）内で結晶化を誘導した。濃縮シロップを、押出機の加熱された（約１４０℃の）供給漏斗に移した。
これよりも高温で結晶化を誘導すると、取り扱いが容易でなく、かつより高いエネルギー量を必要とする生成物が生じる（Ｃ１およびＣ２）。過度に濃縮された溶液は、適切な結晶化が不可能である（Ｃ３）。本発明による温度で形成される非常に有用な結晶塊状物は、さらに非常に容易に加工可能であり、また外観が良好ですぐに使用可能な非常に均質な生成物を提供し得る。
Figure 0006926238

Claims (9)

  1. イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料の製造方法であって、
    Ａ）スクロースからイソマルツロースおよびトレハルロースへの反応を触媒し得る酵素複合体を、スクロース含有溶液と接触させるステップと、
    Ｂ）スクロースの少なくとも一部をイソマルツロースおよびトレハルロースへと異性化させるステップと、
    Ｃ）前記酵素複合体を分離して、イソマルツロースとトレハルロースと水とを含有する溶液を得るステップと、
    Ｄ）蒸発により水を部分的に除去して、全溶液に対して７５重量％〜９５重量％、好ましくは８０重量％〜９３重量％、特に好ましくは８６重量％〜９２重量％の固形分を有する濃縮溶液を得るステップと、
    Ｅ）前記濃縮溶液を、３０℃〜６３℃、好ましくは４５℃〜６２℃、さらにより好ましくは５５℃〜６０℃の温度にし、次いで前記温度範囲でイソマルツロース結晶化を誘導し、次いで冷却することにより、イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料を得るステップと
    を含む方法。
  2. 方法ステップＡ）の前記スクロース含有溶液中には、全スクロース含有溶液に対して２０〜８０重量％、特に３０〜５０重量％の濃度のスクロースが存在することを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 前記酵素複合体中に存在する酵素は、酵素クラスＥＣ ５．４．９９．１１の少なくとも１つのスクロースグルコシルムターゼであることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
  4. 方法ステップＢ）において、３．５〜９．５のｐＨが存在することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
  5. 方法ステップＣ）において、前記酵素複合体および最終的に含まれる固体不純物を、ろ過、沈降または遠心分離によりイソマルツロースから分離することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
  6. 方法ステップＤ）を、６３℃〜６８℃の温度範囲で、かつ１３０ｍｂａｒ〜１６０ｍｂａｒの圧力範囲で行うことを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. 方法ステップＤ）において全溶液に対して８６重量％〜９２重量％の固形分を有する濃縮溶液を取得し、かつ方法ステップＥ）において前記濃縮溶液を５５℃〜６０℃の温度にすることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. イソマルツロース結晶化を、イソマルツロース種結晶の添加、剪断力、撹拌、摩擦、放射線および超音波からなる群のうちの少なくとも１つから選択される手段によって誘導することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
  9. 前記イソマルツロース結晶とトレハルロースとを含む固体材料は、
    イソマルツロースを、乾燥固体材料の全重量に対して７０〜９０重量％、特に７２〜８９重量％、さらに特に７４〜８８重量％、さらに特に７５〜８５重量％の量で含み、
    トレハルロースを、乾燥固体材料の全重量に対して５〜２５重量％、特に６〜２０重量％の量で含み、
    グルコースを、乾燥固体材料の全重量に対して０．１〜５重量％、特に０．２〜４重量％の量で含み、
    フルクトースを、乾燥固体材料の全重量に対して０．１〜５重量％、特に０．２〜４重量％の量で含み、かつ
    スクロースを、乾燥固体材料の全重量に対して０．０５〜４重量％、特に０．１〜３重量％の量で含む
    ことを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
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