FI104563B - Menetelmä ja kantaja isomaltuloosin tuottamiseksi immobilisoitujen mikro-organismien avulla - Google Patents
Menetelmä ja kantaja isomaltuloosin tuottamiseksi immobilisoitujen mikro-organismien avulla Download PDFInfo
- Publication number
- FI104563B FI104563B FI962095A FI962095A FI104563B FI 104563 B FI104563 B FI 104563B FI 962095 A FI962095 A FI 962095A FI 962095 A FI962095 A FI 962095A FI 104563 B FI104563 B FI 104563B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- carrier
- isomaltulose
- sucrose
- immobilized
- microorganisms
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
- C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
v j 104563
Menetelmä ja kantaja isomaltuloosin tuottamiseksi immobilisoitujen mikro-organismien avulla
Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä sakkaroosin isomeroimiseksi isomaltuloo-siksi elävien, immobilisoitujen, isomaltuloosia muodostavien mikro-organismien avulla. Keksintö kohdistuu myös kantajamateriaaliin, joka käsittää anioninvaihtomateriaalia, ja johon on immobilisoitu eläviä, isomaltuloosia muodostavia mikro-organismeja. Keksinnön kohteena on edelleen isomaltin valmistus sakkaroosista isomaltuloosin kautta.
Isomaltuloosi (eli palatinoosi) on pelkistävä disakkaridi, jonka systemaattinen nimi on 6-O-a-D-glukopyranosyyIi-D-fruktofuranoosi. Isomaltuloosia on ehdotettu käytettäväksi makeutusaineena elintarviketeollisuudessa ja se toimii raaka-aineena valmistettaessa iso-maitia (eli palatiniittia) hydraamalla. Isomalti on pääosin a-D-glukopyranosyyli-(l,6)-sor-bitolin ja a-D-glukopyranosyyli-(l,6-)-mannitolin ekvimolaarinen seos. Isomalti on kariesta aiheuttamaton erikoismakeutusaine, jolla on kuvattu olevan pehmeän makea maku.
Alalla on kuvattu monia erilaisia menetelmiä, joilla sakkaroosi voidaan isomeroida isomal-tuloosiksi. Isomeroitumisen oletetaan tapahtuvan α-glukosyylitransferaasi- eli sakkaroosi-mutaasientsyymin vaikutuksesta, jota entsyymiä on todettu esiintyvän sellaisissa mikro-organismeissa kuin Protaminobacter rubrum. Serratica plvmuthica. Envinia rhapontici ja muissa vastaavissa. Näistä tunnetuista isomerointitekniikoista voidaan mainita isomerointi elävillä tai kuolleilla mikro-organismin soluilla tai eristetyllä entsyymillä. Alalla on myös esitetty lukuisia tekniikoita entsyymisysteemin immobilisoimiseksi.
Niinpä esimerkiksi patenttijulkaisussa EP-B1-0 028 900 (Tate 8c Lyle Public Limited Company) ehdotetaan erilaisten isomeroivien mikro-organismien, edullisesti R rhapontici:n entsyymisysteemin immobilisointia. Edullisessa immobilisointitekniikassa kuolleita mikrobisoluja sidotaan kalsiumalginaaattipelletteihin. Julkaisussa kuvataan myös immobilisointi dietyyliaminoetyyliselluloosan (DEAE-selluloosan) paksuun vesilietteeseen, mutta tämän tekniikan esitetään johtavan huonompiin tuloksiin.
Patenttijulkaisussa US 4 386 158 (Mitsui Sugar) kuvataan a-glukosyylitransferaasin immobilisoimiseksi käytettyjen kalsiumalginaattigeelien fysikaalisen lujuuden parantaminen käsittelemällä niitä polyetyleeni-imiinillä ja glutaraldehydillä.
: Patenttijulkaisussa US 4 640 894 (Siiddeutsche Zucker-Aktiengesellschaft) kuvataan iso- 104563 2 maltuloosin valmistus reaktorilla, joka sisältää immobilisoituja kuolleita P. rubrum-soluja. Julkaisussa esitetään erilaisia immobilisointitekniikoita kuten sulkeminen geelien sisään ja flokkulointi flokkuloivilla aineilla. Glutaraldehydin avulla toteutettua silloitusta tarvitaan soluvuodon estämiseksi.
Patenttijulkaisussa EP-B-0 077 971 (Miles Laboratories, Inc.) kuvataan elävien P. rubrum-solujen immobilisointi flokkuloimalla tanniinin ja polyetyleeniamiinin avulla, toteuttamalla reaktio epihalogeenihydriini/polyamiini-sekapolymeerin ja glutaraldehydin välisen additio-tuotteen kanssa ja kuivaamalla 55 °C:ssa.
Patenttijulkaisussa EP-B-0 049 801 (Bayer AG) kuvataan P. rubrum:ista eristetyn, sakkaroosia konvertoivan entsyymin immobilisointi erilaisten kantajamateriaalien kuten ontto-kuitujen tai kationinvaihtomateriaalien pinnalle. Glutaraldehydiä käytetään edullisesti vahvemman sitoutumisen aikaansaamiseksi silloittumisen avulla.
Patenttijulkaisussa EP-B-0 200 069 (Siidzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt) on kuvattu eristetyn sakkaroosimutaasientsyymin selektiivinen immobilisointi anionisoitu-vaan kantajamateriaaliin, erityisesti sulfonihappomuodossa olevaan kationinvaihtomatrii- siin.
Patenttijulkaisussa EP-A-0 160 253 (Bayer AG) kuvataan P. rubrum-soluien immobilisointi sitomalla polymeerisysteemiin polymeroinnin aikana, jolloin saadaan aikaan biokatalyyt-tejä sakkaroosin konvertoimiseksi isomaltuloosiksi.
Tekniikan nykytason mukaiset menetelmät sakkaroosin konvertoimiseksi isomaltuloosiksi eivät ole täysin tyydyttäviä. Kantajamateriaali tuotetaan yleensä käyttöpaikalla. Immobili-sointiprosessit ovat monimutkaisia ja on pidettävä huolta siitä, ettei herkkää entsyymisys-teemiä vahingoiteta. Sitominen alginaatti- tai karrageenigeelien sisään edellyttää useiden erillisten prosessivaiheiden toteuttamista, ja lopuksi silloitus glutaraldehydin avulla on usein välttämätöntä. Liuoksessa tapahtuva saostaminen flokkuloivalla aineella on työlästä ja myös siinä tarvitaan useita peräkkäisiä tuotantovaiheita, joissa entsyymisysteemi on mukana, ja joista voidaan mainita kuivaus, ekstruusio ja rakeistus. Entsyymisysteemin sitominen polymeerin sisään polymeroinnin aikana saattaa johtaa fysikaalisesti lujaan tuotteeseen, mutta myös tämä prosessi on monimutkainen ja se saattaa vaikuttaa herkän entsyy-j misysteemin aktiivisuuteen.
: Tekniikan nykytason mukaisiin menetelmiin, joiden avulla eläviä tai kuolleita mikro-orga- 104563 3 nismeja sisällytetään kantajaan itse kantajamatriisin valmistuksen aikana, liittyy edelleen se haitta, että tuotteen menetettyä aktiivisuutensa koko kantaja on hylättävä.
Esillä olevan keksinnön tavoitteena on päästä eroon tekniikan nykytason mukaisten, isomal-tuloosia muodostavien mikrobien immobilisoimiseksi käytettyjen tekniikoiden haitoista sekä saada aikaan teknisesti helppo menetelmä isomaltuloosin ja/tai isomaltin tuottamiseksi sakkaroosista.
Esillä olevan keksinnön tavoitteena on myös saada aikaan menetelmä sakkaroosin konvertoimiseksi isomaltuloosiksi immobilisoiduilla elävillä mikro-organismeilla alistamatta mikrobeja sellaisille reaktioille, jotka ovat välttämättömiä kiinteän kantajan valmistamiseksi.
Esillä olevan keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan menetelmä, jossa elävien, isomaltuloosia muodostavien mikroorganismisolujen immobilisointi kantajamateriaaliin ei ole teknisesti monimutkaista.
Esillä olevan keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan jatkuva menetelmä sakkaroosin konvertoimiseksi isomaltuloosiksi pakatussa kolonnissa, jossa immobilisoidut solut voidaan helposti virkistää tai aktivoida uudelleen tuotannon aikana.
Esillä olevan keksinnön tavoitteena on samoin saada aikaan menetelmä isomaltuloosin tuottamiseksi pakatussa kolonnissa, jonka sisältämän kantajan fysikaalinen lujuus on hyvä, ja jossa kolonnissa syntyy vain pieni painehäviö sakkaroosiliuoksen virratessa sen läpi.
Keksinnön erityisenä tavoitteena on saada aikaan menetelmä, jossa käytetään isomaltuloosia muodostavia, eläviä mikro-organismeja käsittävää kantajajäijestelmää, ja jossa kantaja voidaan elvyttää käytön jälkeen.
Yllättäen on todettu, että teknisesti yksinkertainen menetelmä sakkaroosin konvertoimiseksi isomaltuloosiksi immobilisoitujen elävien mikro-organismien avulla voidaan saada m aikaan käyttämällä kantajana kiinteätä huokoista materiaalia, jolla on heikosti emäksisiä anioninvaihto-ominaisuuuksia.
V
Esillä oleva keksintö on määritelty liitteenä olevissa patenttivaatimuksissa.
Näin ollen, keksinnön kohteena on menetelmä sakkaroosin isomeroimiseksi isomaltuloosik-' si anioninvaihtomateriaaliin immobilisoitujen elävien, isomaltuloosia muodostavien mikro- 104563 4 organismien avulla. Tässä menetelmässä sakkaroosia sisältävä liuos saatetaan kosketukseen huokoiseen rakeiseen kantajamateriaaliin immobilisoitujen, isomaltuloosia muodostavien mikro-organismien kanssa, joka kantajamateriaali käsittää heikosti emäksistä anioninvaihto-materiaalia inertin ja olennaisesti kokoonpuristumattoman kiinteän matriisin muodossa, minkä jälkeen isomerointituote otetaan talteen.
Keksinnön mukainen menetelmä voidaan toteuttaa joko panoksittain tai jatkuvana prosessina. Jatkuva prosessi toteutetaan edullisesti kantajalla täytetyssä kolonnissa.
Elävät mikro-organismit immobilisoidaan edullisesti huokoiseen kantajaan kantajamatriisin muodostamisen jälkeen. Kantajaa voidaan virkistää joko jatkuvasti tai keskeytyvästä esimerkiksi syöttämällä ravinteita ja/tai kasvualustaa kolonnin läpi.
Erään erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan kantajamateriaali voidaan elvyttää käytön jälkeen poistamalla kaikki mikrobisolut, pesemällä kantaja ja lataamalla se uudelleen elävillä soluilla.
Keksinnön kohteena on myös menetelmä isomaltin valmistamiseksi sakkaroosista, tämän menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa sakkaroosia sisältävä liuos saatetaan kosketukseen huokoiseen rakeiseen kantajamateriaaliin immobilisoitujen, elävien isomaltuloosia muodostavien mikro-organismien kanssa, joka kantajamateriaali käsittää heikosti emäksistä ani-oninvaihtomateriaalia inertin ja olennaisesti kokoonpuristumattoman kiinteän matriisin muodossa; isomaltuloosi hydrataan isomaltiksi; ja isomalti otetaan talteen.
Esillä olevassa keksinnössä saadaan myös aikaan kantajamateriaali, jota voidaan käyttää menetelmässä isomaltuloosin ja/tai isomaltin tuottamiseksi sakkaroosista, joka kantajamateriaali on huokoista rakeista materiaalia ja se käsittää heikosti emäksistä anioninvaihtomate-riaalia inertin ja olennaisesti kokoonpuristumattoman kiinteän matriisin muodossa, ja johon on immobilisoitu eläviä, isomaltuloosia muodostavia mikro-organismeja.
Esillä olevassa selityksessä ja patenttivaatimuksissa käytetyllä käsitteellä "isomaltuloosia j , muodostavat mikro-organismit" tarkoitetaan mitä tahansa sellaista mikro-organismia, joka kykenee konvertoimaan sakkaroosin isomaltuloosiksi, ja joka voidaan immobilisoida heikosti emäksiseen anioninvaihtokantajamateriaaliin. Esimerkkeinä näistä mikro-organismeista voidaan mainita edellä mainituissa, tekniikan nykytasoa kuvaavissa patenttijulkai-; ^ suissa mainitut mikro-organismit, näihin kuitenkaan rajoittumatta. Erityisen edullinen mikro-organismi on Protaminobacter rubrum (CBS 574.77), koska se on hyvin tehokas ja 5 104563 sitä voidaan käyttää turvallisesti elintarvikkeiden aineosien valmistamiseksi. Hyviä tuloksia on myös saatu esimerkiksi mikro-organismeilla Serratia plvmuthica ja Envinia rhapontici. mutta näillä mikrobeilla on patogeenisiä ominaisuuksia ja näin ollen niiden käyttö on vähemmän turvallista. Muita sopivia, isomaltuloosia muodostavia mikro-organismeja voidaan myös eristää sokerijuurikkaista ja muista samankaltaisista lähteistä, mikä on ilmeistä alan asiantuntijalle.
Anioninvaihtomateriaalin, jota voidaan käyttää kantajana esillä olevassa keksinnössä, anioninvaihtokyvyn tulisi olla sellainen, että se soveltuu elävien mikrobisolujen sitomiseen absorption avulla. Edullisia ovat heikosti emäksiset anioninvaihtomateriaalit eli anionin-vaihtajat.
Heikosti emäksisissä anioninvaihtajissa on primäärejä ja/tai sekundäärisiä ja/tai tertiäärisiä aminoryhmiä. Ne dissosioituvat ja ne kykenevät ioninvaihtoon happamissa liuoksissa. Tertiäärisiä aminoryhmiä käsittävillä anioninvaihtajilla on melko emäksiset ominaisuudet, ja niitä kutsutaan myös puolivahvoiksi emäksisiksi anioninvaihtajiksi.
Kantajan tulisi olla inerttiä siinä mielessä, ettei se vaikuta sakkaroosin konversioon isomal-tuloosiksi. Kantajan tulisi kuitenkin edullisesti sitoa mikrobisoluja pinnalleen.
Keksinnön mukaisen kantajan yhteydessä käytetyllä käsitteellä "huokoinen" tarkoitetaan sitä, että kiinteässä kantajassa on lukuisia onttoja kohtia ja huokosia, joiden avulla aikaan saatava pinta-ala on hyvin suuri verrattuna esimerkiksi saman säteisen pallon pinta-alaan.
Selityksessä ja patenttivaatimuksissa käytetyllä käsitteellä "olennaisesti kokoonpuristuma-ton" tarkoitetaan sitä, ettei kiinteän kantajan muoto muutu olennaisesti konversioprosessis-sa vallitsevassa paineessa. Tässä on selvä ero tekniikan nykytason mukaisissa menetelmissä käytettäviin alginaattigeelipelletteihin, joilla tapahtuu muodonmuutosta.
> Keksinnön mukaisessa kantajamateriaalissa tulisi olla kiinteä huokoinen matriisi, joka kykenee vastustamaan muodonmuutosta, ja joka sallii sakkaroosiliuoksen virtauksen kolonnin läpi aiheuttamatta suurta painehäviötä.
«
Kantajamateriaalit, joita voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisesti, ovat heikosti emäksisiä anioninvaihtajia, jotka ovat kiinteinä rakeina tai hiukkasina. Esimerkkejä tämän tyyppisistä, kaupallisesti saatavista kantajista ovat ne, joita on käytetty esillä olevan selityk-sen suoritusesimerkeissä. Kantajamateriaalirakeet ovat edullisesti yleisesti pallomaisia, 6 104563 jolloin niistä johtuva virtausvastus on pieni. Kantajamateriaalilla tulisi edullisesti olla myös makrohuokoinen luonne suuren pinta-alan aikaansaamiseksi.
Esillä olevan keksinnön mukainen edullinen kantajamateriaali käsittää dietyyliaminoetyyli-modifioidun selluloosan (DEAE-selluloosan) muodossa olevaa, heikosti emäksistä anionin-vaihtajaa, joka käsittää polystyreenin kanssa agglomeroituneita mikrokuituja tai mikrohiukkasia kuten on kuvattu patenttijulkaisussa US 4,355,117, jonka julkaisun sisältö liitetään oheen tällä viittauksella.
Etu, joka saavutetaan käyttämällä huokoisen kantajamateriaalin, jolla on suuri pinta-ala, muodossa olevaa, heikosti emäksistä anioninvaihtajaa on se, että mikrobit immobilisoitu-vat kantajan pinnalle, eivätkä ne pidäty kantajamateriaalin sisään, kuten alginaattigeelien ja in situ-muodostettuien polymeerien tapauksessa. Sakkaroosiliuoksen ei tarvitse tunkeutua itse kantajan sisään, ja näin ollen konversionopeus paranee verrattuna järjestelmiin, joissa mikrobit on pidätetty kantajan sisään.
Elävät mikro-organismisolut yleensä immobilisoidaan kantajamateriaaliin käyttöpaikalla. Mikrobisolut voidaan kuitenkin myös ladata kantajamateriaaliin etukäteen ja tällaista kantajaa voidaan varastoida tai se voidaan kuljettaa jossain muualla tapahtuvaa käyttöä varten. Esillä olevan keksinnön piirteenä on itse asiassa huokoinen kiinteä kantajamateriaali, joka sisältää eläviä, isomaltuloosia muodostavia mikro-organismeja.
Keksinnön kolmantena piirteenä on isomaltin valmistus hydraamalla isomaltuloosia, jota on tuotettu sakkaroosista konversioprosessilla immobilisoitujen elävien mikro-organismien avulla.
Panoksena tai kolonnissa toteutetun reaktion jälkeen isomaltuloosi voidaan puhdistaa ja ottaa talteen reaktioliuoksesta. Isomaltuloosi voidaan puhdistaa esimerkiksi ioninvaihdolla epäpuhtauksien ja sivutuotteiden poistamiseksi ja kiteyttää jäähdytyskiteytyksellä. Isomal-tia voidaan valmistaa isomaltuloosista hydraamalla. Tämä hydraus voidaan toteuttaa esimerkiksi katalyyttisenä hydrauksena liuoksessa (30-50 % p/p) käyttäen katalyyttinä Raney-nikkeliä. Lämpötila asetetaan yleensä noin alueelle 100-130 °C, vedyn paineen ollessa noin 40-100 kg/cm^ ja prosessin kestäessä noin 3-10 tuntia.
! Hydrauksen päättymisen jälkeen katalyytti erotetaan reaktioliuoksesta. Liuos suodatetaan ja tuotteeksi saatu isomalti voidaan haluttaessa puhdistaa jälleen ioninvaihdolla. Isomalti * voidaan käyttää nestemäisenä tai se voidaan ottaa talteen liuoksesta alan asiantuntijan 104563 7 hyvin tuntemilla tavoilla. Vaihtoehtoisesti, isomaltuloosi voidaan hydrata isomaltiksi ilman edeltävää kiteytystä ja puhdistusta.
Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä sakkaroosin konvertoimiseksi isomaltuloosik-si voidaan toteuttaa panosprosessina reaktiosäiliössä, joka sisältää rakeiseen kantajaan immobilisoituja eläviä mikrobeja. Riittävän pitkän reaktioajan jälkeen, jolloin konversio on 80% tai suurempi, kiinteä kantaja voidaan poistaa liuoksesta suodattamalla. Reaktion jälkeen liuos sisältää pääasiallisena reaktiotuotteena isomaltuloosia, vähän trehaluloosia, fruktoosia ja glukoosia sekä mahdollisesti reagoimatta jäänyttä sakkaroosia.
Edullisessa tapauksessa menetelmä toteutetaan jatkuvana prosessina kantajalla täytetyssä kolonnissa. Tässä yhteydessä voidaan käyttää useita kolonneja, jotka on voitu liittää peräkkäin ja/tai rinnakkain, jotta esimerkiksi yhtä kolonnia voidaan elvyttää samalla kun toiset ovat toiminnassa. Sakkaroosiliuosta voidaan myös kierrättää yhden tai useamman kolonnin läpi konversion parantamiseksi.
Kantaja sisältää eläviä, glukosyylitransferaasientsyymiä sisältäviä mikro-organismeja (isomaltuloosia muodostavia mikro-organismeja), immobilisoituina kantajan pinnalle. Mikrobien immobilisointi kantajan pinnalle voidaan toteuttaa joko - kolonniin lataamalla syöttämällä solususpensiota kantajalla täytetyn kolonnin läpi; tai - lisäämällä kantajaa ravistelupullossa tai muussa vastaavassa säiliössä olevaan viljelyalus-taan mikro-organismien lisääntymisen aikana.
Kummankin menetelmän tapauksessa on edullista parantaa edelleen kolonnin latausta syöttämällä tuoretta ravintoalustaa pakatun kolonnin läpi.
"Kolonniin lataaminen" mahdollistaa kolonnin pakkaamisen uudella kantajamateriaalilla ennen immobilisointia. Mikrobeilla lataaminen on helppoa, eikä immobilisoitumisen jälkeen tarvita mitään lisäreaktiovaiheita. Niinpä mikrobeja ei altisteta millekään ankarille käsittelyolosuhteille.
Reaktio toteutetaan edullisesti pakatussa vaipallisessa kolonnissa, alueella 25-35 °C, edul-lisesti noin 30 °C olevassa optimilämpötilassa. Alueella 35-45 °C olevat lämpötilat ovat osoittautuneet osittain inaktivoiviksi. Yli 55 °C olevat lämpötilat inaktivoivat täydellisesti P. rubrum-kolonnin 24 tunnissa.
Puhdistettua sakkaroosia tai melassia sisältävää liuosta johdetaan pakatun kolonnin läpi, v 104563 8 edullisesti alhaalta ylös C02:n poistamisen helpottamiseksi, jolloin CO2 poistuu yhdessä mahdollisen ilmastusilman kanssa kolonnin yläpäästä.
Liuoksen sakkaroosipitoisuus tulisi pitää edullisesti noin alueella 20-40 %, edullisemmin alueella 25-35 %. 55 % olevien sakkaroosipitoisuuksien on todettu pienentävän merkittävällä tavalla konversiota lyhyillä viipymäajoilla. Sakkaroosiliuoksen pH tulisi pitää edullisesti noin alueella 4-8, edullisemmin alueella 5,5-7.
Vaikka sakkaroosiliuoksen virtausnopeus voikin olla hyvin pieni, jolloin päästään sakkaroosin hyvin suureen konversioon isomaltuloosiksi, niin kuitenkin kaupallinen prosessi toteutetaan edullisesti optimaalista pienemmällä konversiolla reaktorin tilavuuden säästämiseksi. Useimmissa sovellutuksissa jopa noin 80 % oleva konversioaste on sopiva. Konversiota - voidaan jatkaa niin kauan, kunnes isomaltuloosin saanto pienenee. Saattaa olla edullista tai välttämätöntä virkistää mikrobiaktiivisuutta ajoittain syöttämällä kolonniin ravinteita. Jatkuvaa vähäravinteista syöttöä voidaan myös käyttää.
Esillä olevan keksinnön mukaisen prosessin edullisessa suoritusmuodossa isomerointi toteutetaan jatkuvana prosessina pakatussa kolonnireaktorissa, jonka sisältämät immobilisoidut mikrobit on sidottu olennaisesti kokoonpuristumattomaan kantajaan, jolla on heikosti emäksisiä anioninvaihto-ominaisuuksia. Kantaja koostuu edullisesti jatkuvasta huokoisesta j petistä, tai vaihtoehtoisesti kuoppaisista tai verkkomaisista huokoisista rakeista. Matriisi tai rakeet koostuvat vuorostaan yksittäisistä mikropartikkeleista tai mikrokuiduista. Tällä kan-tajarakenteella saadaan aikaan hyvin suuri pinta-ala mikrobisolujen immobilisoimiseksi.
Edullisen kantajan rakeinen tai matriisimainen luonne muodostuu, kun mikrokuidut, mikro-rakeet, mikropalloset, mikrohelmet tms. yksittäiset mikropartikkelit sitoutuvat, tiivistyvät, kutoutuvat, liimautuvat tai agglomeroituvat löysästi yhteen. Sitoutuminen toteutetaan muodostamalla kemiallisia, adheesisia tai mekaanisia sidoksia joihinkin yksittäisten mikro-partikkelien välisiin kosketuskohtiin. Kemiallinen sitoutuminen toteutetaan aiheuttamalla näissä kohdissa kemiallinen ristisidosreaktio. Adhesiivinen sitoutuminen toteutetaan agglo-7 meroimalla tai liimaamalla mikropartikkelit yhteen käyttämällä jotakin lisäainetta kuten termoplastista muovia. Mekaaninen sitoutuminen toteutetaan antamalla kuitujen sekoittua toisiinsa tai muodostamalla solmuja kosketuskohtiin tai liittämällä hiukkaset toisiinsa hammastamalla niiden pinnat yhteen. Viimeksi mainitussa tapauksessa matriisi käsittää 5 koko reaktorin läpi ulottuvan yhtenäisen rakenteen, joka muistuttaa puuvillafluffia tai jj , putkeen pakattua suodatuspaperia. Myös tässä tapauksessa rakeet ovat lopullisessa muodos- “ ' saan erillisiä ja yksittäisiä, '-fi 104563 9 , Nämä mikropartikkelit koostuvat heikosti emäksisestä anioninvaihtoaineesta, josta voidaan muodostaa haluttuja, pinnaltaan karkeita rakeita. Näistä aineista mainittakoon natiivi tai regeneroitu selluloosa tai raion, josta on muodostettu johdannainen anioninvaihtokyvyn aikaansaamiseksi; synteettiset anioninvaihtomateriaalit kuten fenoliformaldehydi materiaalit, akryyliketjumateriaalit sekä polystyreenimatriisimateriaalit sekä agaroosiin tai dekstriiniin perustuvat anioninvaihtomateriaalit. Edullinen kantaja on huokoinen, rakeinen anionin-vaihtaja, joka on saatu anioninvaihtokyvyn aikaansaamiseksi kemiallisesti modifioidusta selluloosasta tai raionista. Erityisen edullisten suoritusmuotojen tapauksesa kysymyksessä ovat dietyyliaminoetyylisubstituoitua selluloosaa olevat mikrokuidut tai mikrohiukkaset, jotka on sidottu toisiinsa adhesiivisesti agglomeroimalla ne poly styreenillä.
Oletetaan, että positiivisesti varautuneen anioninvaihtomateriaalin ja negatiivisesti varautuneiden mikrobisolujen välille syntyvät sähköiset voimat ovat pääasiassa syynä mikrobien sitoutumisesta materiaalin pinnoille. Tämä sitoutuminen vähentää olennaisesti mikrobien ulosvuotoa, sallien kuitenkin mikrobien ja sakkaroosiliuoksen välisen esteettömän kosketuksen.
Edellä kuvattua tyyppiä olevat, heikosti emäksiset anioninvaihtajat ovat osoittautuneet erityisen edullisiksi haluttaessa pysyvää ja aktiivista kantajamateriaalia sakkaroosin konvertoimiseksi isomaltuloosiksi. Nämä kantajat ovat kiinteitä ja muodoltaan pysyviä, minkä johdosta päästään pitkään käyttöikään ja pieneen virtausvastukseen. Niillä on suuri pinta-ala, minkä ansiosta konversiota varten voidaan saavuttaa suuri mikrobipopulaatio tilavuus-yksikköä kohden.
«
Esillä olevan keksinnön mukaisen kantajajäijestelmän erityinen etu on se, että konversion pienentyessä usean virkistysjakson jälkeen kantajasysteemi voidaan elvyttää, ladata uudestaan ja ottaa uudelleen käyttöön. Tämä pätee erityisesti esillä olevan keksinnön mukaiseen edulliseen kantajaan, eli kiinteän polystyreenimatriisin käsittävään, DEAE-modifioituun „ selluloosaan.
Keksintöä havainnollistetaan nyt seuraavilla, keksintöä rajoittamattomilla esimerkeillä. Esimerkki 1
Kantajan (DEAEI valmistus immobilisointia varten
Rakeinen selluloosajohdannainen valmistettiin US-patenttijulkaisussa 4 355 117 esitetyllä 104563 10 tavalla seuraavasti.
25 osaan kuitumaista selluloosaa sekoitettiin 25 osaa titaanidioksidia ja tähän seokseen seostettiin 50 osaa elintarvikelaatuista iskunkestävää polystyreeniä kaksiruuvi-ekstruuderil-la. Puriste jäähdytettiin vedessä ja se seulottiin hiukkaskokoon 0,35-0,85 mm.
Näistä seulotuista rakeisista agglomeroituneista selluloosahiukkasista muodostettiin DEAE-selluloosa-johdannainen edellä mainitussa US-patenttijulkaisussa kuvatulla tavalla.
20 g näin valmistettua rakeista DEAE-selluloosaa hydratoitiin upottamalla se tislattuun veteen 5 tunniksi. Tämä hydratoitu DEAE-selluloosakantaja steriloitiin upottamalla etanoliin (75 %) yhdeksi tunniksi ja se huuhdottiin steriilillä vedellä ennen sen siirtämistä steriiliin lasikolonniin (korkeus 60 cm, halkaisija 1,5 cm).
Solususpension valmistus Protaminobacter rubrum:ista (CBS 574.77)
Protaminobacter rubrum-kannan (CBS 574.77) viljelmästä otetut solut laimennettiin 10 ml:lla suolaliuosta. Saadusta suspensiosta otettuja 0,1 ml.n annoksia siirrostettiin 1000 ml:n steriloituihin ravistelupulloihin, joissa oli 300 ml kasvualustaa. Alusta oli seuraava: sakkaroosi 40 g/1, peptoni 10 g/1, hiivauute 5 g/1, lihauute 3 g/1, Na2HPC>4 2 g/1, pH 7. Näitä siirrostettuja pulloja, 3 x 300 ml, ravisteltiin nopeudella 230 kierr./min 30 °C:ssa 20 tuntia, jonka jälkeen solupitoisuus ylitti 5 x 10^ solua/ml.
Bakteereiden immobilisointi DEAE-selluloosakantaiaan | 750 ml tätä solususpensiota pumpattiin kolonnissa olevan kantajapetin läpi virtausnopeudel- • la 35 ml/h (= 0,5 petin tilavuutta/h) 25 °C:ssa, suunnassa ylhäältä alaspäin. Immobili- soituneiden mikrobien määrää kolonnissa lisättiin syöttämällä kolonniin 750 ml uutta kasvualustaa solususpension jälkeen. Kolonnissa oleva kantaja oli nyt valmis tuotantovaiheeseen.
Isomaltuloosin valmistus kolonnissa DEAE-selluloosakantajaan immobilisoitua P. rubrum-oreanismia sisältävän kolonnin alaosaan syötettiin jatkuvasti 25 % sakkaroosiliuosta (pH 7,5) 30 °C:ssa ja liuosta poistettiin kolonnin yläosasta peristalttisella pumpulla. Tämä järjestelmä salli C(>2:n vapautumisen ja ” poistumisen kolonnin yläosasta. Tällä tavalla päästiin erilaisiin konversioihin virtausnopeu- - desta tai sakkaroosin pitoisuudesta riippuen (katso seuraava taulukko).
m π 104563
Taulukko 1
Sakkaroosin pitoisuus 25 %
Virtausnopeus, petin tilavuutta/h_0J>_QJ_OJi_0.08 isomaltuloosi 12 22 35 61 trehaluloosi 1 2 2,5 4,5 fruktoosi 1 2 2 2,5 glukoosi 1 1,5 1,5 2 sakkaroosi 85 73 60 30
Virtausnopeus 0,08 petin tilavuutta/h
Sakkaroosin pitoisuus _ 25 %_35 %_55 % isomaltuloosi 61 43 12 trehaluloosi 4,5 2 1 fruktoosi 3 3 1 glukoosi 2 2,5 0,6 sakkaroosi 30 50 86 DEAE-selluloosakantajaan immobilisoituja P. rubrum-soluia sisältävää kolonnia pidettiin toiminnassa kaksi viikkoa. Konversio pieneni ajan kuluessa. Immobilisoidut solut virkistettiin kahden viikon kuluttua syöttämällä kolonniin uutta steriiliä viljelyalustaa (10 petin tilavuutta). Tämän virkistysjakson jälkeen sakkaroosiliuoksen (25 %, 30 °C) virtausnopeus asetettiin arvoon 0,08 petin tilavuutta/h, jolloin sakkaroosi konvertoitui seuraaviksi tuotteiksi (analysoitu HPLC-menetelmällä; Pb+ +-muodossa oleva ioninvaihtomateriaali): ' isomaltuloosi 79 %, trehaluloosi 0,9 %, fruktoosi 0,4 %, glukoosi 0,6 %, sakkaroosi 18,5 %.
Tästä immobilisoitua P. rubrum-mikrobia sisältävästä kolonnista saatu isomaltuloosiliuos haihdutettiin 70-85 °C:n lämpötilassa 70 %:n pitoisuuteen ja kiteytettiin jäähdyttämällä lineaarisesti 65 °C:n lämpötilasta 25 °C:n lämpötilaan. Isomaltuloosikiteet otettiin talteen linkoamalla, kiteet pestiin lingolla ja ne kuivattiin 50 eC:ssa. Linkouksen saanto oli 70 % (isomaltuloosia isomaltuloosista) ja näiden kiteiden isomaltuloosipitoisuus oli 95-100 %.
Isomaltuloosiliuos (50 % p/p) hydrattiin isomaltiksi käyttäen katalyyttinä Raney-nikkeliä (pH 9, lämpötila 100 °C, vedyn paine 40 kg/cm^, 3 tuntia). Hydrauksen päätyttyä Raney-nikkeli erotettiin reaktioliuoksesta. Liuosta haihdutettiin ja isomalti kiteytettiin tavanomai-• sella tavalla.
12 104563
Sen jälkeen, kun DEAE-selluloosakolonnia oli käytetty yhden kuukauden ajan, kantaja elvytettiin kolonnissa huuhtomalla immobilisoituja P. rubrum-soluia 1 M NaOH-liuoksella (60 °C), kunnes kantajan alkuperäinen väri oli saavutettu, huuhtelemalla vedellä, puskuroimalla pH-arvoon 5 ja pesemällä steriilillä vedellä. Tämän jälkeen kantaja oli valmis uudelleenlataamista ja uutta tuotantojaksoa varten.
Esimerkki 2
Solususpension valmistus Erwinia rhapontici:sta (ATCC 29284)
Erwinia rhapontici-kannan (ATCC 29284) viljelmästä otetut solut laimennettiin 10 ml:Ila suolaliuosta. Tuloksena saadusta suspensiosta otettuja 0,1 ml:n annoksia siirrostettiin 1000 ml:n steriloituihin ravistelupulloihin, joissa oli 300 ml kasvualustaa. Alusta oli seuraava: sakkaroosi 40 g/1, peptoni 10 g/1, lihauute 6 g/1, KH2PO4 0,01 M, pH 7. Näitä siirrostet-tuja pulloja, 3 x 300 ml, ravisteltiin nopeudella 230 kierr./min 30 °C:ssa 24 tuntia, jonka jälkeen solupitoisuus ylitti 2 x 109 solua/ml.
Solususpension valmistus Serratia plvmuthica:sta (ATCC 15928)
Serratia plvmuthica-kannan (ATCC 15982) viljelmästä otetut solut laimennettiin 10 mlrlla suolaliuosta. Saadusta suspensiosta otettuja 0,1 ml:n annoksia siirrostettiin 1000 ml:n steriloituihin ravistelupulloihin, joissa oli 300 ml kasvualustaa. Alusta oli seuraava: sakkaroosi 40 g/1, peptoni 10 g/1, lihauute 6 g/1, KH2PO4 0,01 M, pH 7. Näitä siirrostettuja pulloja, 3 x 300 ml, ravisteltiin nopeudella 230 kierr./min 30 °C:ssa 24 tuntia, jonka jälkeen solu-pitoisuus ylitti 2-5 x 109 solua/ml.
• ·
Isomaltuloosin tuottaminen kolonnissa immobilisoidun Serratia plvmuthica:n (ATCC 15928) ia Erwinia rhapontici:n (ATCC 29284) avulla : Mikro-organismien Serratia plvmuthica ja Erwinia rhaoontici immobilisointi DEAE-kanta- j jaan toteutettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. 25-prosenttista sakkaroosiliuosta (pH 7,5) pumpattiin 30 °C:ssa jatkuvasti immobilisoituja soluja sisältävän kolonnin läpi. Virtausnopeus asetettiin siten, että isomaltuloosin pitoisuus ulosvirtauksessa saatiin mahdollisim-: man suureksi. Sakkaroosi konvertoitui seuraaviksi tuotteiksi (analysoitu HPLC-menetelmäl- lä; Pb+ +-muodossa oleva ioninvaihto materiaali): 104563 13 S. plvmuthica E. rhapontici
Virtausnopeus 0,12 petin til. 0,02 petin til.
' isomaltuloosi 80 % 79 % trehaluloosi 7,5 % 15 % fruktoosi 5,5 % 0,5 % glukoosi 3 % 0,5 % sakkaroosi
Kumpaakin kolonnia immobilisoituine mikrobisoluineen pidettiin toiminnassa pari viikkoa. Tuotanto pieneni ajan kuluessa. Mikrobeja virkistettiin ajoittain syöttämällä kolonniin uutta steriiliä viljely alustaa (10 petin tilavuutta).
Elvvtvs
Usean virkistysjakson (kuukauden pituisen käytön jälkeen) Spezyme GDC-kantaja elvytettiin kolonnissa huuhtomalla immobilisoituja P. rubrum-soluia 1 M NaOH-liuoksella (60 °C), kunnes kantajan alkuperäinen väri oli saavutettu, huuhtelemalla vedellä ja puskuroimalla pH-arvoon 5 ja pesemällä steriilillä vedellä. Tämän jälkeen kantaja oli valmis uudelleenlataamista ja uutta tuotantojaksoa varten.
Esimerkki 3
Anionin- ia kationinvaihtomateriaalien testaaminen
Protaminobacter rubrum:ia (CBS 574.77) viljeltiin samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1. Viiden tunnin pituisen viljelyn jälkeen 3 grammaa kutakin testattavaa ioninvaihtomateri-;· aalia lisättiin 75 ml:aan viljelyalustaa. Viljelyä jatkettiin ravistelupulloissa 13 tuntia ionin- vaihtomateriaalin lataamiseksi P. rubrum-soluilla. Ioninvaihtomateriaalit erotettiin vilje-lyalustasta suodattamalla ja ne pestiin vedellä.
Toinen kahdesta Spezyme GDC-kantajanäytteestä käsiteltiin glutaraldehydillä silloittumi-sen aikaansaamiseksi. Kolmeen grammaan immobilisoitua P. rubrum:ia sisältävää ’ Spezyme GDC-näytettä sekoitettiin 15 ml 0,3 % glutaraldehydiä. Puoli tuntia kestäneen hitaan sekoittamisen jälkeen Spezyme GDC pestiin 150 ml: 11a tislattua vettä.
Immobilisoitujen P. rubrum-soluien määrä kussakin ioninvaihtomateriaalissa, glutaraldehydillä käsitelty Spezyme GDC mukaan lukien, määritettiin glukosyylitransferaasiaktiivi-suutena. Ioninvaihtomateriaalin testauksesta saadut tulokset on esitetty taulukossa 2. Kanta-.· jamateriaalien ominaisuudet on esitetty taulukossa 3.
14 104563.
Taulukko 2
Eri kantajiin immobilisoitujen P. rubrum-soluien aktiivisuus
Glukosyyli-
Kiinteä transferaasi-
Ioninvaihtaia_matriisi_Kauppanimi_aktiivisuus. U/g
Heikosti emäksiset anioninvaihtajat: DEAE-selluloosa polystyreeni Spezyme GDC* 1,0 DEAE-selluloosa polystyreeni Spezyme GDC + glutaraldehydi 0,8 tertiäärinen fenoliform- Duolite A 5682 1,3 amiini aldehydi tertiäärinen styreeni-di- Amberlite 0,6 amiini vinyylibent- IRA 932 seeni tertiäärinen polystyreeni Macronet MN-1002 0,3 amiini
Heikosti happamat kationinvaihtajat: karboksyyli polyakryyli Duolite C 4642 0
Vahvasti emäksiset anioninvaihtajat: kvatemäärinen polystyreeni Macronet MN-4002 0 ammonium kvatemäärinen styreeni-di- Amberlite 0 ammonium vinyylibent- IRA 9002 seeni
Vahvasti happamat kationin vaihtaj at: sulfoni polystyreeni Residion EXC* 0 sulfoni styreeni-di- Amberlite 0 vinyylibent- IRA 2002 seeni
Ioninvaihtajat hankittu yhtiöistä: 1 Cultor Ltd.
2 Rohm et Haas Ltd.
2 Purolite Ltd.
4 Mitsubishi Chemicals Co 104563 15
Taulukko 3
Kantamateriaalien ominaisuudet
Kapasiteetti Pinta-ala Huokoset
meq/ml m^/g A
Heikosti emäksiset anioninvaihtajat:
Spezyme GDC-carrier 0,2-0,25
Duolite A 568 1,2 l(ml/g) 150-250
Amberlite IRA 93 0,85 25 300-1000
Mac ro net MN-100 0,15 800-1000 850-950
Heikosti hapan kationinvaihtaja:
Duolite C 464 2,7
Vahvasti happamat anioninvaihtajat:
Macronet MN 400 0,3 800-1000 850-950
Amberlite IRA 900 1,0 18 100-1000
Vahvasti happamat kationinvaihtaj at:
Residion EXC 1,1 200
Amberlite IRC 200 1,75 45 100-500 • ·
Glukosvvlitransferaasiaktiivisuuden määritys
Inkubointikoe: 5 ml:aan 10-prosenttista sakkaroosiliuosta, joka oli tehty 0,05 M KH2P04-puskuriin, pH 7, sekoitettiin koeputkessa 1 g immobilisaattia 5 ml:ssa vettä. Seosta inkuboitiin 30 eC:ssa 60 minuuttia varovasti ravistellen. Entsyymireaktio pysäytettiin kuumentamalla koeputkia vesihauteessa 100 °C:ssa 2 minuuttia. Vertailunäyte valmis-„ tettiin samalla tavalla, mutta entsyymireaktio pysäytettiin heti entsyyminäytteen lisäämisen jälkeen. Reaktiossa muodostunut isomaltuloosi määritettiin pelkistävänä sokerina (DNS-e menetelmä). U/g = (μΜοΙ/ml x 5 ml) / (60 min. x näytteen määrä grammoina).
Esillä oleva keksintö on kuvattu ohessa eräiden erityisten esimerkkien avulla. Nämä esimerkit ovat luonteeltaan havainnollistavia ja alan asiantuntijalle on ilmeistä, että keksintöä voidaan muunnella monella eri tavalla liitteenä olevien patenttivaatimusten piiristä kuitenkaan poikkeamatta.
Claims (13)
1. Menetelmä sakkaroosin isomeroimiseksi isomaltuloosiksi elävien, immobilisoitujen, isomaltuloosia muodostavien mikro-organismien avulla, tunnettu siitä, että - sakkaroosia sisältävä liuos saatetaan kosketukseen kantajan pinnalle immobilisoitujen, elävien, isomaltuloosia muodostavien mikro-organismien kanssa, kantajan koostuessa olennaisesti kokoonpuristumattomasta huokoisesta rakeisesta kiinteästä materiaalista, joka on heikosti emäksinen anioninvaihtaja, ja - isomerointituote otetaan talteen.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä on jatkuva konversioprosessi, joka toteutetaan yhdessä tai useammassa kantajalla täytetyssä kolonnissa.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismit on immobilisoitu kantajan pinnalle syöttämällä mikrobiliuosta kolonniin.
4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikrobi-tiheyttä kantajan pinnalla lisätään ravitsemalla immobilisoituja mikro-organismeja ravinto- liuoksella.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisoitujen mikro-organismien mikrobiologista aktiivisuutta virkistetään syöttämällä ajoittain ravinne-liuosta kantajaan. • « *
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantaja elvytetään poistamalla mikro-organismit, pesemällä kantaja ja lataamalla siihen tuoreita eläviä mikro-organismeja.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakkaroosia sisältävän liuoksen sakkaroosipitoisuus on 20-40 %, edullisesti 25-35 %. * 1 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantajan kiinteä * materiaali sisältää polymeerimatriisiin sitoutunutta ainetta, jolla on heikosti emäksiset anioninvaihto-ominaisuudet. 7. i >a 'ra 104563
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantaja on anionin-vaihtaja, joka sisältää dietyyliaminoetyylimodifioitua (DEAE) selluloosaa olevia mikrokui-tuja tai mikropartikkeleita, jotka on sidottu adhesiivisesti agglomeroimalla polystyreenillä.
10. Kantaja, joka soveltuu käytettäväksi mikrobeja käyttävässä menetelmässä sakkaroosin isomeroimiseksi isomaltuloosiksi, tunnettu siitä, että kantaja koostuu olennaisesti ko-koonpuristumattomasta huokoisesta rakeisesta kiinteästä materiaalista, joka on heikosti emäksinen anioninvaihtaja ja jonka pinnalle on immobilisoitu eläviä, isomaltuloosia muodostavia mikro-organismeja.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen kantaja, tunnettu siitä, että kantaja sisältää polymeerimatriisiin sitoutunutta ainetta, jolla on anioninvaihto-ominaisuudet.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen kantaja, tunnettu siitä, että kantaja on anioninvaihtaja, joka sisältää dietyyliaminoetyylimodifioitua (DEAE) selluloosaa olevia mikrokuituja tai mikropartikkeleita, jotka on sidottu adhesiivisesti agglomeroimalla polystyreenillä.
13. Menetelmä isomaltin valmistamiseksi sakkaroosista, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, joissa - sakkaroosia sisältävä liuos saatetaan kosketukseen kantajan pinnalle immobilisoitujen, elävien, isomaltuloosia muodostavien mikro-organismien kanssa kantajan koostuessa olennaisesti kokoonpuristumattomasta huokoisesta rakeisesta kiinteästä materiaalista, joka on heikosti emäksinen anioninvaihtaja, ja - tuloksena oleva isomaltuloosi hydrataan isomaltiksi; ja • • - isomalti otetaan talteen.
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI962095A FI104563B (fi) | 1996-05-17 | 1996-05-17 | Menetelmä ja kantaja isomaltuloosin tuottamiseksi immobilisoitujen mikro-organismien avulla |
| CA002254956A CA2254956A1 (en) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Process and carrier for the production of isomaltulose by immobilized micro-organisms |
| IL12701397A IL127013A (en) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Process and carrier for the production of isomaltulose by immobilized micro-organisms |
| DE69712206T DE69712206T2 (de) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Verfahren und trägermaterial für die herstellung von isomaltulose mittels immobilisierter mikroorganismen. |
| JP09541660A JP2000513570A (ja) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | 固定化された微生物によるイソマルツロースの製造方法およびそのための担体 |
| US08/857,808 US5939294A (en) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Immobilization of microogranisms on weakly basic anion exchange substance for producing isomaltulose |
| AU27770/97A AU2777097A (en) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Process and carrier for the production of isomaltulose by immobilized micro-organisms |
| PCT/FI1997/000288 WO1997044478A1 (en) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Process and carrier for the production of isomaltulose by immobilized micro-organisms |
| BR9709100-6A BR9709100A (pt) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Processos para a isomerização de sacarose em isomaltulose e para a produção de isomalte a partir de sacarose, e, veìculo adaptado para uso em um processo microbiano para a isomerização de sacarose em isomaltulose. |
| EP97921861A EP0915986B1 (en) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Process and carrier for the production of isomaltulose by immobilized micro-organisms |
| KR1019980709264A KR20000011105A (ko) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | 고정된 미생물에 의한 이소말툴로즈의 제조방법 및 제조용 담체 |
| AT97921861T ATE216726T1 (de) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Verfahren und trägermaterial für die herstellung von isomaltulose mittels immobilisierter mikroorganismen. |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI962095A FI104563B (fi) | 1996-05-17 | 1996-05-17 | Menetelmä ja kantaja isomaltuloosin tuottamiseksi immobilisoitujen mikro-organismien avulla |
| FI962095 | 1996-05-17 | ||
| US08/857,808 US5939294A (en) | 1996-05-17 | 1997-05-16 | Immobilization of microogranisms on weakly basic anion exchange substance for producing isomaltulose |
| US85780897 | 1997-05-16 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI962095A0 FI962095A0 (fi) | 1996-05-17 |
| FI962095A FI962095A (fi) | 1997-11-18 |
| FI104563B true FI104563B (fi) | 2000-02-29 |
Family
ID=26160159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI962095A FI104563B (fi) | 1996-05-17 | 1996-05-17 | Menetelmä ja kantaja isomaltuloosin tuottamiseksi immobilisoitujen mikro-organismien avulla |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5939294A (fi) |
| EP (1) | EP0915986B1 (fi) |
| AU (1) | AU2777097A (fi) |
| FI (1) | FI104563B (fi) |
| WO (1) | WO1997044478A1 (fi) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI105048B (fi) * | 1997-05-22 | 2000-05-31 | Xyrofin Oy | Menetelmä isomaltuloosin ja muiden tuotteiden valmistamiseksi |
| US6421223B2 (en) * | 1999-03-01 | 2002-07-16 | Micron Technology, Inc. | Thin film structure that may be used with an adhesion layer |
| US7166451B1 (en) * | 2003-02-24 | 2007-01-23 | The Ohio State University | Immobilization of enzyme on a fibrous matrix |
| ES2343741T3 (es) * | 2006-03-15 | 2010-08-09 | Explora Laboratories Sa | Un proceso para la inmovilizacion de celulas en una resina. |
| US9139856B2 (en) * | 2008-03-12 | 2015-09-22 | Tata Chemicals Ltd. | Process for production of galactooligosaccharides (GOS) |
| US20120315366A1 (en) | 2009-12-23 | 2012-12-13 | Evonik Degussa Gmbh | Sweetener and method of production thereof |
| DE102011100772A1 (de) | 2011-05-05 | 2012-11-08 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Isomaltulose aus Pflanzensäften |
| DE102011083030A1 (de) | 2011-09-20 | 2013-03-21 | Evonik Degussa Gmbh | Mischungszusammensetzung und deren Verwendung als Süßungsmittel |
| US20140170727A1 (en) * | 2012-12-19 | 2014-06-19 | Nanomr, Inc. | Affinity medium using fixed whole cells |
| DE102013011977A1 (de) * | 2013-07-18 | 2015-01-22 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Optimiertes Verfahren zur Herstellung einer Isomaltulose-haltigen Zusammensetzung |
| DE102014203964A1 (de) | 2014-03-05 | 2015-09-10 | Evonik Degussa Gmbh | Granulat enthaltend Isomaltulose Synthase |
| MY193606A (en) * | 2015-11-12 | 2022-10-20 | Petiva Private Ltd | Process for preparing non-cariogenic, sustained energy release juice |
| EP3363909A1 (en) | 2017-02-15 | 2018-08-22 | Evonik Degussa GmbH | Process for production of a solid material containing isomaltulose crystals and trehalulose |
| EP3653708A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-20 | Evonik Operations GmbH | Isomaltulose production |
| EP3892730A1 (en) | 2020-04-07 | 2021-10-13 | Evonik Operations GmbH | In situ production of isomaltulose |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3066516D1 (en) * | 1979-11-07 | 1984-03-15 | Tate & Lyle Plc | Production of isomaltulose |
| JPS5836959B2 (ja) * | 1980-08-21 | 1983-08-12 | 三井製糖株式会社 | 固定化α−グルコシルトランスフエラ−ゼによるパラチノ−スの製造法 |
| US4355117A (en) * | 1980-10-08 | 1982-10-19 | Nabisco Brands, Inc. | Process for preparing agglomerated fibrous cellulose |
| DE3038219A1 (de) * | 1980-10-09 | 1982-04-15 | Süddeutsche Zucker AG, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung von isomaltulose (6-o-(alpha)-d-glucopyranosido-d-fructose) mit hilfe von immobilisierten bakterienzellen |
| DE3038218A1 (de) * | 1980-10-09 | 1982-05-06 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Saccharose-mutase, immobilisierte saccharose-mutase und verwendung von dieser immobilisierten saccharose-mutase zu herstellung von isomaltulose (6-o- a -d-glucopyranosido-d-fructose) |
| US4337313A (en) * | 1980-12-08 | 1982-06-29 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of biocatalysts |
| JPS57189692A (en) * | 1981-05-18 | 1982-11-22 | Nippon Oil Co Ltd | Immobilizing method of microorganism |
| US4390627A (en) * | 1981-10-26 | 1983-06-28 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of the sucrose mutase in whole cells of protaminobacter rubrum |
| EP0160253A3 (de) * | 1984-05-02 | 1986-10-08 | Bayer Ag | Immobilisierung von Protaminobacter rubrum und Verwendung des immobilisierten Präparates zur Umwandlung von Sucrose zu Isomaltulose |
| DE3528752A1 (de) * | 1985-04-27 | 1986-10-30 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Kontinuierliches verfahren zur enzymatischen herstellung von isomaltulose |
-
1996
- 1996-05-17 FI FI962095A patent/FI104563B/fi active
-
1997
- 1997-05-16 WO PCT/FI1997/000288 patent/WO1997044478A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-05-16 EP EP97921861A patent/EP0915986B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-16 AU AU27770/97A patent/AU2777097A/en not_active Abandoned
- 1997-05-16 US US08/857,808 patent/US5939294A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI962095A (fi) | 1997-11-18 |
| AU2777097A (en) | 1997-12-09 |
| EP0915986B1 (en) | 2002-04-24 |
| EP0915986A1 (en) | 1999-05-19 |
| US5939294A (en) | 1999-08-17 |
| FI962095A0 (fi) | 1996-05-17 |
| WO1997044478A1 (en) | 1997-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI104563B (fi) | Menetelmä ja kantaja isomaltuloosin tuottamiseksi immobilisoitujen mikro-organismien avulla | |
| KR101411073B1 (ko) | 폴리비닐 알코올 겔 내에 고정화된 효소 또는 미생물 형태의 생체촉매의 산업적 생산 방법, 이의 사용 방법, 및 이의 생산 장치 | |
| GB2082591A (en) | Method of producing an immobilized-glucosyl transferase useful in the production of palatinose from sucrose | |
| AU2012251903A1 (en) | Process for the production of isomaltulose from plant juices | |
| JPS6321474B2 (fi) | ||
| US4390627A (en) | Immobilization of the sucrose mutase in whole cells of protaminobacter rubrum | |
| WO2016123745A1 (zh) | 固定化细胞及其制备方法 | |
| US3960663A (en) | Process for the continuous isomerization of dextrose | |
| US3847740A (en) | Process for the production of levulose-bearing syrups | |
| CN1747659A (zh) | 具有延长链和低血糖指数的异麦芽糖寡糖的制备方法 | |
| US4578354A (en) | Immobilization of catalytically active microorganisms in agar gel fibers | |
| US6602691B1 (en) | Process for the production of mannitol by immobilized micro-organisms | |
| KR20000011105A (ko) | 고정된 미생물에 의한 이소말툴로즈의 제조방법 및 제조용 담체 | |
| Chibata et al. | Immobilized cells: Historical background | |
| US3847741A (en) | Temperature-programmed process for the production of levulose-bearing syrups | |
| CN113249371B (zh) | 一种用于塔格糖生产的固定化细胞的制备方法及其应用 | |
| CN1059759A (zh) | 复合固定化酶的制备方法 | |
| US4113566A (en) | Process for preparing 6-aminopenicillanic acid | |
| Chibata | Production of useful chemicals using cells immobilized with polyacrylamide and carrageenan | |
| JPS59159781A (ja) | 固定化酵素の製造方法およびその用途 | |
| Burnett | Immobilized Enzymes | |
| JPS60156358A (ja) | 調味液の製造法 | |
| JP3632242B2 (ja) | パラチノースおよびトレハルロースの製造方法 | |
| SU883175A1 (ru) | Способ получени иммобилизованной глюкозоизомеразы | |
| Chibata et al. | Immobilized cells |