SU1011056A3 - Способ получени изомальтулозы - Google Patents

Description

О СП

o

№gff 4ff jy

ffff

/fanfye ayMr ftf ftuv/foi / % 2.Способ по п. 1, о т л и ч а щи и с   тем, что в качестве изомальтулъзуобразующего микроорганизма используют Erwlnia rhapontic штаммы NCPPB 1578, NCPPB 139, NCPPB 1739 или АТСС 2928i. 3.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что изомальтулозу образующий микроорганизм фиксируют в виде целых клеток. Изобретение-относитс  к микробиологическому синтезу веществ и может быть использовано Дл  ферментативного получени  изомальтулозы из сахарозы , котора  может найти применение в пищевой промышленности. Известен способ получени  изомаль тулозы из сахарозы микробиологическим способом при ферментации раствора , содержащего от 15 до Q% вес./ /вес. сахарозы. Образующуюс  изомальтулозу выдел ют фильтрованием и кристаллизуют fl J, Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемо му эффекту  вл етс  способ получени  изомальтулозы путем ферментативного превращени  растворов сахаро зы с использованием изомальтулозуобразующих микроорганизмов, например Protominobacter rubrum или Serratia plymuthica, и последующего выделени  и кристаллизации изомальтулозы. Дл  ферментации используют раствор с содержанием сухого вещества от 5 до 30%, предпочтительно от 20 до 27% причем сахароза составл ет от 90 до 98 сухих веществ. Кроме Protominobacter rubrum и Serratfa plymuthlса могут быть использованы Serratfa marscescens firwmia carotovora или Leuconostoc mesenterofdes в качестве изомальтулозуобразующего микроорганизма 2. Недостатками указанных способов  вл ютс  необходимость использовани  растворов сахарозы с концентрацией ниже tO i. предпочтительно около 25), недостаточно высока  продуктивность изомальтулозуобразующих микроорганизмов , а также протекание 10 Ю- 6 k. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что дл  фиксации используют растворимый экстракт целых. или дробленых клеток изомальтулозу образующего микроорганизма, 5. Способ по п. 1, о т л и чающийс  тем, что в качестве гел  используют альгинатный гель. побочных процессов при аэробной ферментации микроорганизмов, которые привод т к образованию веществ, загр зн ющих изомальтулозу. Цель изобретени  - повышение стабильности и продуктивности изомальтулозуобразующих микроорганизмов. Поставленна  цель достигаетс  согласно способу получени  изомальтулозы путем ферментативного преьращени   растворов сахарозы с использованием изомальтулозуобрёзующих микро .организмов и последующего выделени  и кристаллизации изомальтулозы, изомальтулозуобразующие микроорганизмы фиксируют путем включени  в гель и используют дл  получени  изомальтулозы из растворов, содержащих 40-55% вес/ /об. сахарозы. Кроме того, в качестве изомальТулозуобразующего микроорганизма используют Erwfnia rhaponticf штамма NCPpB 1578, NCPPB 139, NCPPB 1739 или АТСС 29284 Изомальтулозуобразующий микроорганизм фиксируют в виде целых клеток. Дл  фиксации используют растворимый экстракт целых или дробленых клеток изомальтулозуобразующего микроорганизма . В качестве гел  используют альгинатный гель. В предлагаемом способе используют иммобилизацию дл  закреплени  фермента или ферментов, образующих ферменативную систему, участвующую в превращении сахарозы в изомальтулозу. Можно использовать ферментативную истему, экстрагированную .из изомальулозуобразующего микроорганизма, на;пример или дробленые клетки мик роорганизма, при этом клетки служат носителем дл  ферментативной системы . Некоторое деление целых клеток может происходить после иммобилизации, но желательно, чтобы способ иммобилизации и другие параметры процесса были выбраны таким образом, чтобы деление отсутствовало или было минимальным . Дл  иммобилизации ферментной системы могут быть использованы различные способы, но наиболее удобным  вл етс  задержание в геле, поскольку этот способ пригоден дл  иммобилизации ферментативно -активного экстракта клеток, а также целых или дробленых клеток. Подход щие материалы ДЛЯ гел  включают альгинат полиакрил амид, агар, смесь ксантановой смолы (смолы лжеакации, каппа-частицы карагенана или смесь каппатчастиц карагенана ), смолы лжеакации, коллаген или ацетатцеллюлозу. Из этих материалов альгинатный гель, в частности гель альгината кальци , дает наилучшие результаты . Можно использовать другие альгинатные гели, например те, которые образуютс  с другими металлами Ц группы. Гель альгината кальци  характеризуетс  высокой скоростью проникающей диффузии сахарозы и низкой скоростью утечки наружу целых клеток и белка. . ,Дополнительным преимуществом  вл етс  исключительна  стабильность изомальтулозуобразующей активности у фик сированных целых клеток. Полупериод активности клеток, задержанных в геле альгината кальци , достигает 10000 ч, причем-8500 ч  вл етс  типич ной величиной, в то врем  как самый длительный полупериод в сравнимых услови х при других способах иммобилизации составл ет ниже 1000 ч. Кроме того, иммобилизаци  в альгантном геле не приводит -к существенной потере активности. Дл  иммобилизации ферментативной системы самой по себе, либо в целых или в дробленых клетках) в альгантном геле смешивают ферментативную систему с водным раствором растворимого альгината, например альгината натри . Оптимальной процедурой  вл етс  суспендирование целых клеток с растворимым альгинатом. Концентраци  клеток составл ет 1-90% влажного веса к объему, более оптимально 10-40%, еще лучше 20%. Наиболее приемлемые концентрации растворимого альгината дл  использовани  с целыми клетками или с другими видами ферментативной систему составл ют 1-10% (вес./об.), более п|редпочтительно 5% (. вес./об. Полученную, альгинатную смесь дозируют в раствор соли металла,- с которой растворимый альгинат образует гель о Если гелем  вл етс  альгинат кальци , то подход щие соли включают хлористый кальций концентрацией 0,011 ,0 М, предпочтительно 0,05-0,5 М или 0,1 М. Температура раствора соли металла при дозировании , предпочтительно около ,- раствор перемешивают. Стабильность фиксированной ферментативной системы увеличиваетс , если раствор соли мetaлла содержит также некоторое количество растворенной сахарозы, например (вес./об. сахарозы, предпочтительно 20%. При дозировании суспензии или другой альгинатной смеси в виде отдельных капель можно получить сферические гранулы гел , удерживащего ферментативную систему. Размер гранул может измен тьс , но дл  легкости обращени  и дл  обеспечени  высокой эффективности переноса массы при использовании, желательно использовать гранулы диаметром 3-5 мм. Однако размер и форма имеют мало значени . Можно фиксировать ферментативную систему в блоке гел  (который дл  использовани  навивак т на форму или нарезают на части), либо в микроволокнистых частицах (при использовании условий высокого градиента при дозировании альгинатной смеси). Используют и другие гели. Каппа-карагенан или смесь каппакарагенана сиолы лжеакации используют в таком же способе:, который использовали дл  альгината, за тем исключением , что раствор, в который экструдировали клеточную суспензию,представл ет собой смесь IM CaCI и 1 М КС1 при . Агар получают путем кип чени  5% (вес./об.) агара в деионизованйой воде, охлаждают полученный гель до добавл ют суспензию клеток и экструдируют полученную суспензию по капл м в лед ную воду. ,5 Смесь ксантана/смолы лжеакации полумают с noMoutbro методики, что и дл  агара, но смолу нагревают до , а гель перед добавлением клеток охлаждают до 60° С. Используют полиакриламид по способу Ч иба ты (Chibate et a1. (Method in Enzymology, , 1976, p. 739). Дл  иммобилизации целых или дроб леных клеток изомальтулозупродуциру ющего микроорганизма можно использо вать другие способы иммобилизации. Например, клетки можно физически ад сорбировать на инертном носителе;. ковалентно св зать их с инертным но сителем; агрегировать с помощью поперечно-сшивающего реагента, при этих способах, однако,сохранение ак тивности и стабильность активности ниже. Вместе с тем эти способы иммобилизации обладают другими преиму ществами. Так, при адсорбции клеток на целлюлозе жидкость, полученна  после превращени , кристально прозрачна , что свидетельствует о том, что все примеси адсорбированы ДЕАЁцеллюлозой . Иммобилизаци  дробленых клеток или растворенных экстрактов ферментативной системы позвол ет полность избежать клеточного делени , происход щего по врем  их использовани , благодар  чему устран етс  рас трескивание гранул и блокировка пор что иногда происходит при делении фиксированных целых клеток внутри гранул гел  альгината кальци . Более того, при фиксировании дробленых клеток или растворенных экстрактбз начальна  активность  вл етс  более высокой, что показывает отсутствие неповрежденных мембран стенок клетки, которые могут действовать как барьер, преп тствующий диффузии сахарозы или изомальтулозы . Дробление можно осуществить с помощью шаровой мельницы или другой обработкой целых клеток. Источником ферментативной системы , используемой дл  иммобилизации,  вл етс  изомальтулозупродуцирующий микроорганизм рода Erwinla. Мож но использовать бактерии других родов - Servatia plymuthlca или Ргоtaminobacter rubrum, но первый из названных возможно  вл етс  патогенным дл  человека, а последний склонен продуцировать нежелательный красный пигмент с малым моле566 кул рным весом. Можно использовать мутанты бактерий природного происхождени . Из штаммов, принадлежащих роду Erwinla, желательны штаммы E.phapontici , которые хран тс  в Британской Национальюй коллекции растительных патогенных бактерий по регистрационным номерам Л/ СРВ 1578, N СРРВ 139 и N СРРВ 1739. Щтамм«СРРВ 1578 хранитс  в Американской коллекции типов культур под регистрационными номерами АТСС 29283., . Штаммы N СРРВ 1578, 139 и 1739 ЯВЛЯЮТСЯ наиболее перспективными, поскольку обладают более высокой специфичностью продуцировани , большей первоначальной активностью и стабильностью по сравнению с другими штаммами Erwinla или с другими штаммами других родов. Способ провод т как непрерывный процесс путем загрузки зафиксированной ферментативной системы в колонну и пропускани  субстрата сахарозы в виде раствора через колонку или несколько колонок, установленных параллельно , например, на карусели. Размер колонки больше 20 мл. При обйчном превращении сахарозы в изомальтулозу образуетс  некоторое количество двуокиси углерода. При использовании зафиксированных целых клеток легче выводить этот углекислый газ, если жидкость пропускают через колонку вверх. Пропускание жидкости вверх способствует ожижению сло  -зафиксированной ферментативной системы и позвол ет избежать уплотнени , которое возможно при пропускании жидкости вниз. В качестве субстрата используют раствор сахарозы,содержащий не менее 301 предпочтительно не менее 40|и лучше всего не менее .об. сахарозы. Стабильность ( измер ема  в(эеменем полупериода жизни ферментативной системы синтеза изомальтулозы в зафиксированных клетках увеличиваетс  с увеличением концентрации сахарозы, аналогично увеличиваетс  концентраци  изомальтулозы в конвертированной жидкости. На фиг. 1 изображен график зависимости стабильности зафиксированных клеток от концентрации раствора сахарозы; на фиг. 2 - вли ние концентрации сахарозы на продуктивность зафиксированных клеток. Данные получены при использовании гранул альгината кальци  с зафиксированным штаммо  E.rhapontici NCPPB 1739. flpH увеличении концентрации сахарозы выше 30-ЛО стабильность и продуктивность существенно возрастают, что обусловлено главным образом свой ством зафиксированной изомальтулозуобразующей ферментативной системы, а не особенност ми способа фиксировани Способ иммобилизации с использование альгината кальци  в этом случае дает лучшую стабильность. Кроме того, высока  концентраци  сахарозы способствует ингибированию делени  зафиксированных клеток и пре отвращает микробное заражение, облегчает выделение продукта и уменьшает объем обрабатываемой жидкости. Верхний предел в зкости раствора заключен от 100 до 1000 сП, как правило около 500 сП. Дл  способа с использованием клеток , зафиксированных в гранулах гел  альгината кальци , концентраци  сахарозы в исходном материале состав л ет около 55 (вес./об.). Субстрат не об зательно должен быть раствором чистой сахарозы, вмес то последней можно включить в раствор до 15 (об./об.) мелассы или использовать материал, получаемый на. сахарном заводе, или родственный сироп, причем эт два типа примесей получают при обычном рафинировании сахара., Превращение сахарозы в изомальтулозу провод т при 15 АОС, более ,предпочтительно при 20-35 С, особенно приемлема температура около 30 С; рН раствора сахарозы наиболее предпочтительно около 7. Превращение в изомальтулозу обычно приводит к за кислению среды, но на практике обычно нет необходимости включать стадии дл  поддержани  значени  рН в пределах от 5 до 9. В любом случае образование кислоты обычно уменьшаетс  при увеличении концентрации субстрата . . Способ провод т так, чтобы осуществл лось в контролируемой степени превращение сахарозы в изомальтулозу и в сопровождающие продукты. При увеличении времени пребывани  сахарозы в контакте с зафиксированной ферментативной системой увеличиваетс  степень превращени  до практи ческого максимума от 85 до 100% сахарозы преврацаетс  в продукты . Однако максимальна  продуктивность необ зательно достигаетс  при самой высокой степени превращени ,потому что больша  пропускна  спсГсобность и более высока  активность, полученные благодар  меньшему времени пребывани , могут ксмпенсировать потери при работе не с максимальным превращением. Таким образом, максимальна  про- . дуктивность достигаетс  при работе . не с максимальным превращением, а обычно при превращении в продукты от 70 ДО 95. Дл  гранул альгината кальци  с зафиксированными клетками Erwinia обычно наблюдаетс  максимум продуктивности, если работают при превращении от 80 до 90. На фиг. 3 изображен график зависимости продуктивности зафиксированных клеток от исходного процента превращени  (т.е. процент превращени  проэкстрапрлирован назад к нулевому времени). Данные получены при использовании гранул альгината кальци  с зафиксированными клетками E.rhaponitici N СРРВ 1739. Имеетс  заметный максимум продуктивности вблизи значени  от 85 до 90% степени преварщени  сахарозы в изомальтулозу и в сопутствующие продукты . Степень превращени  сахарозы в i продукты значительно вли ет на стабильность изомальтулозуобразующей ферментативной системы зафиксированных клеток. Стабильность может экспоненциально возрастать при увеличении степени превращени  концентрированного раствора сахарозы. На фиг, А изображен график.зависимости полупериода жизни зафиксированных клеток от исходного процента превращени  ( при 55%-м превращении раствора сахарозы). Данные получены при использовании гранул альгината кальци  с зафиксированными клетками E.rhapontici N СРРВ 1739. Стабильность возрастает экспоненциально до значени  примерно 8500 ч при 90%-м превращении. После получени  изомальтулозы ее можно закристаллизовать либо очистить другим образом. Дл  пищевых и родственных продуктов можно использовать закристаллизованную изомальтулозу, котора  не об зательно должна быть чистой, в некоторых случа х можно использовать незакристаллизованный продукт, соде жащий примеси. Пример 1. Клетки из культу ры Erwinia rhapontici N СРРВ 1578, АТСС 29283) разбавл ют 10 мл фосфат ного буфера. 0,10 мл полученной сус пензии используют дл  посева на 200 питательной среды в стериллиэованны конических колбах с перегородками ем костью 500 мл. Состав среды указан в табл. 1. Таблица 1 Количество Компонент ( г/л дистиллированной воды) Сахароза Пептон ( переваренный казеин) М сной экстракт Колбы с посевами тр сут со скоро тью 120 колебаний в мин при 30 С в течение 70 ч, затем собирают биомас су. Клетки собирают в стационарной фазе роста, но можно собирать в логарифмической фазе роста или в фазе смерти. Клетки центрифугируют при 15000 10 мин при 30°С, по |учают примерно 1 г утрамбованных влажных клеток на 100 мл среды (если нужно обработать большие объемы инкулируемой среды, используют центрифужный ротор непрерывного действи , через который прокачивают среду со скоростью 100 мл/мин). Собранные утрамбованные клетки суспендируют в растворе альгината натри  5% (сухого вес./об,J в деионизированной воде с тем, чтобы получить 20% (влажн. вес./об. суспензию клеток ( вес клеток в граммах называют влажным весом (влажн. приблизительно перевести в сухой вес можно путем делени  на 5. Активности клеток выражены в расчете на грам влажных клеток). Клеточную суспензию .экструдируют по капл м с высоты 10 см в перемешиваемый раствор хлористого кальци  С 0,1 М) с температурой 30 С, содержащий 20 (вес./об. сахарозы, котора  служит дл  стабилизации изомальтулозуобразующей активности клеток. Полученные гранулы перемешивают 1 ч, затем помещают в колонку (30 см высоты, 5 см в диаметре ), снабженную рубашкой охлаждени . Затем готов т раствор сахарозы 55% (вес./об.) в деионизованной воде и довод т рН до 7,0 с помощью 1,0 М МаОН. Сахарный раствор прокачивают вверх через колонку при . При скорости потока сахарозы примерно 0,01 объемов пустой колонки/ч превращение сахарозы в изомальтулозу и другие продукты достигает равновеси . Равновесное состо ние достигаетс  через 24 ч, К этому времени активность зафиксированных клеток составл ет примерно 0,2 г продукта /г.влажн. клеток/ч. Стабильность клеток, выраженна  как полупериод , составл ет примерно 1 год. Когда скорость потока сахарозы увеличивают так, что превраидение снижаетс  до 80, активность составл ет примерно,0,325 г продукта/г влажн.клеток/ч. Собирают элюат колонки, выпаривают примерно до 70 ( вес./об.) , при , затем дают остыть, либо принудительно охлаждают при перемешивании, получа  при этом маленькие белые кристаллы . Кристаллы можно выделить быстрее путем затравки охлажденного раствора небольшим количеством сухой изомальтулозы . Кристаллы собирают фильтрованием или центрифугированием и высушивают при и 700 мм рт.ст. в вакуумной печи. Продукт подвергают анализу , а затем испытывают. Кристаллы содержат изомвльтулозы, при этом одна молекула кристаллизационной воды приходитс  на молекулу иэомальтулозы , остальное составл ют другие сахара. Трехкратна  перекристаллизаци  дает чистую изомальтулозу. Если субстрат на 80 превращают в изомальтулозу и сопутствующие продукты , получают 88 г кристаллического продукта на 100 г сахарозного субстрата, а продуктивность колонки составл ет 0,30 т сухого кристаллического продукта/объем колонки/ год. Во врем  рабочего использовани  количество жизнеспособных клеток из зафиксированных клеток быстро уменьшаетс : количество жизнеспособных клеток достигает нул  примерно че рез 500 ч рабочего использовани . После этого периода не остаетс  жизнеспособных клеток и не видно инволюциойных форм клеток. Несмотр  на

1110

сравнительно быструю потерю жизнеспособности , изомальтулЬзуобра зующа  активность зафиксированных клеток спадает не:зависино и намного медленнее с временем полураспада 35 дн .

Это показывает, что жизнеспрсобные клетки не нужны дл  образовани  изомальтулозы, и, что возможно имеетс  единственный стабильный фермент , который превращает сахарозу в изомальтулозу, дл  которого не требуетс  рециркулирование кофакторов или непрерывна  регенераци  источников энергии. Это подтвёрждаетс  опытом , когда в качестве субстрата используют в 55%-ной (вес./объем) сахарозе 0,1 г/л хлорамфеникола, который ингибирует синтез белка. Активность синтеза изомальтулозы не измен етс , но деление клеток прекращаетс , даже при добавлен|/1и питательных веществ.

Можно вызвать новый рост клеток Erwinia на месте посредством подачи питательных веществ в виде свежей стерильной среды даже при использовании их в колонке непрерывно в течение долгого времени; изомальтулозуобразующа  активность падает о небольшой доли от ее первоначального значени . 8 этих опытах среду прокачи вают вверх через колонку со скоростью 0,01 сзбъемов пустой колонки/ч. Значительные количества СП выдел ютс  при этом клетками, зафиксированными в гранулах, значение рН отработанной среды, вымываемой из колонки, падает до ,, наблюдаетс  увеличение числа жизнеспособных клеток, как в гранулах так и в отработанной среде, причем анализ азота, как отработанной среды, так и гранул клеток, показал, что происходит рост клеток. После возврата назад к сахарозе в качестве субстрата изональтулозуобразующа  активность гранул возрастает в некоторых случа х до уровней, превышающих первоначальную активность . Нет доказательств образовани  фермента в исходных клетках, но есть факт, что регенераци  вызвана исключительно ростом к-леток. Степень восстановлени  активности гранул пропорциональ на числу жизнеспособных клеток, оставшихс  непосредственно перед добавлением питательных веществ, и никакого восстановлени  активности не наблюдают в гранулах, которые использовали в течение столь длительных пе05612

риодов времени, что все зафиксированные клетки сделались жизнеспособными (500 ч/:

После рабочего использовани  регенерированных клеток в течение последующего периода активность колонки можно активировать аналогичным способом не менее 3-х раз. Возможность регенерации колонок с зафиксированными клетками обеспечивает теоретически бесконечную стабильность колонки и говорит о том, что возраст зафиксированных клеток не зависит от пропускной способности субстрата.

$ Вместо подачи питательных веществ непосредственно после использовани  гранул в течение некоторого периода времени питательную среду можно подать в колонку непосредственно после фиксировани . В этих опытах медленный рост клеток Erwinia происходит на месте. Когдафиксируют 1 ( влажн. вес,/об.) клеточный материал гранул, наблюдают 30-кратное увеличение числа жизнеспособных клеток, причем рост клеток происходит с временем удвоени  б ч до окоьчани  опыта, обусловленного сильным ослаблением струк- I туры альгинатного гел . Когда клетки

используют таким образом, при частом восстановлении активности посредством обеспечени  условий дл  роста клеток , внутренн   стабильность ферментативной системы меньша , чем в том случае, когда не происходит рост клеток. Таким образом, фермент  вл етс  намного стабильнее, когда клетка находитс  в псевдопокое или в состо НИИ сохранени , чем когда ей дают возможность делитьс .

Пример 2. Используют основную методику примера 1 с дополнительной стадией, в которой собранные клетки дроб т шаровой мельницей в течение 90 мин при перед фиксированием. Исходна  активность гранул така  же, как и при использовании целых клеток в примере 1, но полупериод жизни составл ет примерно 170 дней.

Пример Зо Способ осуществл ют по примеру 1, использу  другие штаммы изомальтулозуобразующих микроорганизмов , в частности Erwinia rhapontici (N СРРВ 1578, 139 и 1739 и АТСС 2928А), Erwinia caratovora var atroseptica N СРРВ 139, Erwinia dissolvens (N CPPB 1862 и 2209), Prota .minobacter rubrum (CBS 57, 77) Servatia masscescens (N CIB 8285)и

13И) 11056

Serratia plymuthica (АТСС 15928). Измер ют специфичность, активность и стабильность зафиксированных штаммов . Затем, принима  во внимание патогенность микроорганизмов и тенден- j цию продуцировать полимер или пигмент , исследуемые штаммы оценивают на пригодность их использовани  в способе по примеру 1.

В табл. 2 приведена пригодность Ю штаммов дл  получени  изомальтулозы. Таблица 2

I

При год-:

Штамм ность

E.rhaponticI NCPPB 1578

F..rhapontlc NCPPB 139 E.rhapontlci NCPPB 1739

E.rhapontlci ATCC 2928 +-Ы-+

E.carotovora var atroseptlca NCPPB 139

E.dissolvens NCPPB 1862 E.dissolvens NCPPB 2209 Serratia plymuthica

15928

ATCC

Serratia marscescens

NCIB8285 +

Protaminobacter rubrum CBS.57.77 +

Пример . Осуществл ют способ по примеру 1, использу  концентрацию сахарозы от 12,5 до 60( вес./ /об.). Активности и полупериоды жизни были измерены при исходном проценте превращени , равном %.

В табл. 3 приведено вли ние концентрации сахарозы на образований изомальтулозы.

Таблица 3

- И

Продолжение табл. 3

0 Изменение концентрации сахарозы вли ет на производительность фиксирующих колонок. Концентраци  сахарозы вли ет на активность зафиксированных клеток, причем концентрации

5 свыше примерно 0 ( вес./об. оказывает ингибируклцее действие. Стабильность (т.е. полупериод жизни) зафиксированных клеток существенно возрастает при увеличении концентрации сахарозы выше тех значений концентрации , которые использовали в предыдущих работах. Увеличение стабильности зафиксированных клеток при увеличении концентрации сахарозы перевешивает уменьшение активности , поэтому продуктивность колонки возрастает с увеличением концентрации сахарозы.

На равновесное отношение продуктов к сахарозе сильно вли ет концентраци  сахарозы в субстрате, причем наибольшее равновесное значение было получено при использовании (вес./об.) сахарозы. Таким образом, при использовании сахарозы равновесное отношение продуктов к сахарозе составл ет 13,2:1, что соotBeTCTByeT 93% превращени  в продукты .

Пример 5. Способ осуществл ют по примеру 1, использу  клетки Erwinla rhapontic N СРРВ 1578, зафиксированные другими способами иммобилизации.

В табл. показано вли ние способа фиксировани  активности изомальтулозуобразующих микроорганизмов на активность и полупериод жизни . 15101 Таблица k Альгинат кальци  0,325 8500 ЕАЕ-целлюлоза 0,583 «00 Полиакриламид 0,13 570 Клетки, агрегированные глутаровым альдегидом 0,153 О Каппа-каррагенан/смола лжеакации 0,2бЗ 37,5 Костный уголь 0,01 25 Агар 0,3 27 Ксантан/смола лжеакации 0,10 8 Пример 6. М-метил-М -нитро-N-нитрозогуанидин (, 100 мг/мл ) раствор ют в 25 мл 0,10 М цитратного буфера при рН 6,0 при инкубировании в вод ной бане при 37°С в течение 20 мин. Этот раствор затем добавл ют к 50 мл профильтрованного питательного бульона, содержащего примерно 1 г свежесобранных клеток Е. rhapontici N СРРВ 1578. Затем клетки инкубируют

0,441

52,4 0,389 54,4 0,354 56,6 10 S 15 20 25 JQ

Таблица 5

59,52 52,53 47,77 616 30 мин при в вод ной бане, потом их собирают и суспендируют в k% сахарозной среде табл. 1) в.течение ночи при С. Аликвоты (0,1 мл) помещают на 1,5% (вес.об.) агаровые чашки, содержащие сахарозу k% (вес./ /об.) , триптон 0,41 ( вес./об. и пептбн 1% ( вес./об., значение рН кото- , рых было доведено до 7,0, инкубирование провод т ч при . Отдельные колонии затем пересаживают в колбы дл  встр хивани  и провод т культивирование в течение 48 ч при при встр хивании при 120 об/мин, затем клетки собирают, подвергают Ticпытанию и анализу. Мутантные штаммы менее специфичны, чем первоначальные клетки, несмотр  на то, что они продуцируют изомальтулозу. Пример 7. Способ осуществл ют по примеру 1, использу  аль- , гинатный гель, содержащий зафиксированные клетки СРРВ 1578, который либо превращают в гель в блоке и нарезают на фрагменты, либо превращают в гель в виде непрерывного шнура и используют в намотанном на стержень виде или в виде нарезаных сегментов. При использовании в колонке эти зафиксированные клетки не про вл ют заметного различи  в активности или стабильности по сравнению с клетками, зафиксированными в сферических гранулах . Пример 8. Пример 3 показыает ,-что наиболее пригодными  вл тс  штаммы Е.rhapontici. Последуюее сравнение провод т в стандартизированных услови х, использу  каждый из трех штаммов Е.rhapontici, зафикированных в альгинате кальци . В табл. 5 приведена продуктивность разных штаммов Е.rhapontici. 17 Пример 9. Ферментативную систему, ответственную за превращение сахарозы в изомальтулозу, экстрагируют растворителем из клеток Erwlnia rhapontici N СРРВ 1578, использу  четыре разлиных способа, в частности встр хивание по Микле (Mickle), осмотический шок, ультразвуковую обработку или обработку де тергентом. Дл  встр хивани  по Микле 2 г навески свежесобранных клеток встр  хивают с 2 г сухого песка и с 2 мл дистиллированной воды 20 мин при комнатной температуре, использу  ус тановку дл  встр хивани  Микле. Дл  способа осмотического шока г навески клеток суспендируют в 10 мл деионизованной воды 30 мин при . Дл  ультразвуковой обработки 2 г навески клеток суспендируют в 15 мл деионизованной воды и обрабатывают

0,63 0,567 0,094

0,70 0, 0,038

0,63 05Т 0, 0,16 - 0, Из результатов, приведенных в табл. 6, Видно, что при встр хивании по Микле в поверхностный слой попадает примерно 5% активности клеток, а остальна  активность св зана с клеточными осколками„ Растворимый фе ментный экстракт, т.е. поверхностный слой, обладает активностью 0,09 г продукта/мл/ч, удельной активностью 0,0027,г продуктов/мг белка/ч и показывают двенадцёть различных белковых полос при анализе с помощью полиакриламидного гелевого электрофореза о Ферментативную систему можно более эффективно экстрагировать с по0 ,,60,0029

0,2533,00,08i«4

0,00561,990,0028

0,92 618 ультразвуком 30 мин, использу  генератор диаметром насадки 2,5 см. Дл  обработки детергентом исполь-, зуют 10 мл водного раствора Тритона Х-10П (0,15% o6./o6.J , чтобы обработать 0,5 г клеток. После каждой соответствующей обработки полученные суспензии подвергают центрифугированию при 17000 в течение 30 мин при Клетки или клеточные осколки и поверхностный слой жидкости затем по отдельности фиксируют на гранулах альгината кальци , использу  общий метод примера 1. Затем гранулы подвергают испытанию по отношению к 55% (вес./об.) сахарозе дл  определени  активности синтеза изомальтулозы. В табл. 6 Приведена активность изомальтулозуобразующих микроорганизмов при разных способах разрушени  клеток. Таблица 6 мощью осмотического шока клеток. С помощью этого способа экстрагируют примерно 9% клеточной активности, причем экстракт имеет активность 0,253 г продуктов/мл/ч и удельную активность 0, г продукта/мг белка/ч . Более того, электрофорез в пОлиакриламидном геле показывает только дес ть белковых полос. Сравнительно высока  чистота такого ферментативного экстракта веро тно обусловлена тем, что клетки не разрываютс  под действием осмотического шока . Ферментативна  система св зана с мембраной и/или заключена в клет1910 ке, причем более веро тным местом расположени   вл етс  периплазмическое пространство, особенно в силу того, что осмотический шок  вл етс  самым лучшим способом экстракции , а также потому, что такие св за ные с периплазмическим пространством ферменты, как кисла  фосфотаза, также были экстрагированы при обработке осмотическим шоком. Из данных табл. 6 следует, что дробленые клетки обладают наибольшей активностью. Это, веро тно, вызвано устранением преп тстви  дл  диффузионного переноса субстрата, создаваемого стенками и мембраной не поврежденной клетки. Однако нет существенного различи  активностей клеток, подвергнутых осмотическому шоку, нежизнеспособных клеток и свежих жизнеспособных клеток, что нагл дно показывает что здесь не действует активна  транспортна  система дл  притока сахарозы внутрь клетки , поскольку така  система была бы зависима о,т интегрального метаболизма целой клетки и она могла бы быть, по-видимому, утрачена при осмотическом шоке клеток. ; Дальнейшее исследование свободного от клеток ферментного экстракта, полученного осмотическим шоком, показало , что он имеет оптимальное зна чение рН,.равное 7,0, оптимальную тёмпературу и обладает макси ,1альной активностью дл  35% Свес./об раствора сахарозы. TOT фактJ что оптимальна  концентраци  субстрата дл  растворимой ферментативной сис6 ° . темы ниже, чем. дл  свободных клеток 55) или дл  зафиксированных -клеток , по-ёидимому, отражает изменение внутренних свойств ферментативной системы, завис щей от локализации. Когда ферментативную систему, экстрагированную- встр хиванием по Микле, используют на ( вес./об. сахарозе , зафиксированный фермент обладает исходной активностью 0,0067 г продукта/г гранул/ч и имеет полу11ериод жизни 620 ч, обеспечива  первоначальную степень превращени  81,5%. Таким образом, использование предлагаемого изобретени  позвол ет резко увеличить стабильность и продуктивность изомальтулозуобразующей сист-емы , как 3d счет ее иммобилизации в геле, так и благодар  использованию новых штаммов микроорганизмов рода Erwinia, применению более концентрированных растворов сахарозы и более полному превращению сахарозы в целевой продукт. Так, иммобилизаци  в геле альгината кальци  позвол ет увеличить врем  полужизни клеток от нескольких до 8500 ч, а использование 5 и 55%-х растворов сахарозы приводит к 1,510-кратному увеличению стабильности клеток по сравнению с опытами, в которых примен ют 35%-ые растворы, без существенного изменени  активности системы. Кроме того, изобретение позвол ет использовать изомальтулозуобразующую систему микроорганизмов без культивировани  и размножени  самих микроорганизмов.

fS

ej

I aj

аг

tff 4O s6 it т

vWtfPMMV Л$4М|ЛАМ19 . tfWIlJiAMi

AK

S

« I

It /

ll

i

§ t 15

4ff ffff dO т

/7/у уу АЛГ7 / /ff ffaffjv&

0fff.

Claims (5)

1. (577 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И30МАЛЬТУЛОЗЫ путем ферментативного превращения растворов сахарозы с исполь-зованием изомальтулозуобразующих микроорганизмов и последующего выделения и кристаллизации изомальтулозы, отличающийся, тем, что, с целью повышения стабильности и продуктивности изомальтулозуобразующих микроорганизмов, последние фиксируют путем включения в гель и используют для получения изомальту•лозы из растворов, содержащих 4055% (вес/об.) сахарозы.

   101
2. 2. Способ по п. 1, отличающи й с я тем, что в качестве изомальтулъзуобразующего микроорганизма используют Erwinia rhapontici штаммы NCPPB 1578, NCPPB 139, NCPPB 1739 или АТСС 29284.
3. 3. Способ по п. 1, о т ли ч а ющ и й с я тем, что изомальтулозуобразующий микроорганизм фиксируют в виде целых клеток.

   056
4. 4. Способ по π. 1, о т л и чающийся тем, что для фиксации используют растворимый экстракт целых. или дробленых клеток изомальтулозу образующего микроорганизма,
5. 5. Способ по п. 1, о т л ичающийся тем, что в качестве геля используют альгинатный гель.