JP4070611B2 - 電気穿孔法用の緩衝溶液およびその使用を含む方法 - Google Patents
電気穿孔法用の緩衝溶液およびその使用を含む方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、動物またはヒトの細胞を懸濁し、生体活性分子を電流によって前記細胞に導入するために前記生体活性分子を溶解するための緩衝溶液、および緩衝溶液の使用を含む、生体活性分子を電流によって動物またはヒトの細胞に導入するための方法に関する。
生体活性分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の生細胞への導入は、これら分子の生体機能を研究するための重要な手段である。外来分子を細胞へ導入するための好ましい方法は電気穿孔法であり、これは他の方法とは異なって、導入試薬によってターゲット細胞の生体構造および機能に持続的変化を及ぼすことはほとんどない。電気穿孔法では、水溶液からの外来分子を短時間の電流によって細胞に導入するが、この場合、短い電気パルスの影響によって細胞膜が外来分子に対して浸透性となる。生体活性分子は、一時的に発生する細胞膜の「細孔」によってまず細胞質に達し、ここで、必要である場合は、すでにその研究されるべき機能を発揮しうる。しかし、真核細胞へＤＮＡを導入する場合は、遺伝情報の発現を可能にするために、ＤＮＡは細胞核へ達する必要がある。これは細胞***中の***活性細胞において起こりうるが、ここでＤＮＡは、核膜の一時的な溶解後に受動的に細胞核に達する。しかし、休止期にある細胞または***活性の弱い細胞、例えば動物の初代細胞の研究に際しては、ＤＮＡはこのようにして細胞核に達することはなく、そのためこの場合はこの方法が利用不可能か、または、少なくともきわめて時間がかかる。さらに、特にＤＮＡの動物細胞への導入、いわゆるトランスフェクションの場合には、細胞の生存率が重要なパラメーターとしてトランスフェクション効率に影響を及ぼすため、細胞の不安定性により、さらに頻繁に電気穿孔法における特有の問題が生じる。
電気穿孔法中に動物細胞およびＤＮＡ分子を受容するために、過去においては頻繁に細胞培養液（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら（１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．、２２、ｐ．２０７）あるいはリン酸またはＨＥＰＥＳ緩衝食塩液（ポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）ら（１９８４年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、ｐ．７１６１；フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら（１９８５年）、Ｎａｔｕｒｅ ３１９、ｐ．７９１）が使用された。しかし、非緩衝もしくは弱緩衝マニトール溶液またはショ糖溶液も動物細胞の電気穿孔法において使用された（清水（Ｓｈｉｍｉｚｕ）ら（１９８６年）、Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１、ｐ．１０５；リッグス（Ｒｉｇｇｓ）ら（１９８６年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３、ｐ．５６０２）。しかし、このような非緩衝もしくは弱緩衝溶液には、その使用によって細胞死亡率の上昇およびトランスフェクション効率の明らかな低下が生じるという欠点がある（ヤン（Ｙａｎ）ら（１９９８年）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４、ｐ．５９０）。
したがって、ヤン（Ｙａｎ）ら（１９９８年）は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、および６ｍＭデキストロースからなる電気穿孔法用の緩衝溶液を使用した。この緩衝液では、ヒト大動脈の平滑筋細胞に有効にトランスフェクトすることはできたが、この場合のトランスフェクション効率は１５％でしかなく、生存率はわずか１０〜２０％であった。さらに、ヤンらによって使用された緩衝液は５００Ｖまでの電圧パルスに対してのみ最適化され、そのためこの緩衝液が、例えば細胞核への直接トランスフェクションするために必要であるような高い電圧パルスでも使用できるかどうかについての所見は得られない。しかしいずれの場合でも、この緩衝液で得られるトランスフェクション効率は低すぎ、高い要求に応じられない。
伝導率が高い緩衝溶液の使用に際して、特に長い高圧パルスをかける場合に確認された高い電流によって細胞におこる障害を回避するために、イオン強度が低く、伝導率も低い緩衝液がしばしば使用された。
フリードリヒ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ）ら（１９９８年）（Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．、４７、ｐ．１０３）は、電気穿孔法における電流が、水の電気分解によって電極の近くのｐＨ値を変化させることを示した。ｐＨ値のこの変化は、キュベットのアルミニウム電極からの細胞毒性Ａｌ３＋イオンの放出を引き起こし、それによって細胞死亡率の上昇を引き起こす。同著者らは、ここでトランスフェクション効率の上昇のためにパルス持続時間の短縮を提案している。使用された緩衝液の変化には言及されていない。
例えば、Ｍｇ２＋など二価イオンも電気穿孔法用緩衝液に添加される場合が多い。マグネシウムイオンは細胞表面へのＤＮＡの結合を容易にし、それによってトランスフェクション効率の上昇をひき起こす。ただし、これは、濃度が高い場合、例えば、ＤＮＡ分子の電荷の中和による電気泳動の減少または伝導率の上昇による緩衝液の加熱などの悪影響が上回るため、１０ｍＭまでのＭｇ２＋濃度に対してのみ有効であるとみられる（クシー（Ｘｉｅ）とツォング（Ｔｓｏｎｇ）（１９９３年）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、６５、ｐ．１６８４）；ノイマン（Ｎｅｕｍａｎｎ）ら（１９８２年）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１、ｐ．８４１；クレンチン（Ｋｌｅｎｃｈｉｎ）ら（１９９１年）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、６０、ｐ．８０４）。
さらに、細胞の生存率を上昇させるために、緩衝液の組成を細胞内の状態に適合させることが提案された。したがって、電気穿孔法中に細胞膜の細孔を介した物質変化の結果細胞内Ｎａ＋／Ｋ＋比が崩壊するのを防ぐために、細胞質に対応した高いカリウム濃度と低いナトリウム濃度を有する緩衝液を使用しなければならなかった（バン・デン・ホフ（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｆｆ）ら（１９９５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８、第１５章、ｐ．１８５〜１９７）。しかし、この場合、トランスフェクション効率の減少が１３００Ｖ／ｃｍ以上の高い電界強度のパルスで確認された。
しかし、これまで記載されたすべての緩衝溶液には、その使用によって得られるトランスフェクション効率が比較的低く、かつ／または緩衝液が休止期にある細胞もしくは***活性の弱い細胞の電気穿孔法における利用には適していないという欠点がある。
したがって、本発明の課題は、低い細胞死亡率でより高いトランスフェクション効率を達成しうる電気穿孔法用の緩衝溶液を提供し、その方法を開発することである。
この課題は、本発明による緩衝溶液が、ｐＨ値ｐＨ７からｐＨ８の変化で、温度が２５℃において、少なくとも２０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能、および少なくとも２００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示し、２〜６ｍｍｏｌ×ｌ -1 Ｋ + 濃度のカリウムイオン（Ｋ + ）および１００〜１５０ｍｍｏｌ×ｌ -1 Ｎａ + 濃度のナトリウムイオン（Ｎａ + ）を含有することによって解決される。このような緩衝溶液によって、電気穿孔法を用いた生体活性分子の動物またはヒトの細胞への導入が、９３％までのトランスフェクション効率と同時に低い細胞死亡率で可能である。この緩衝液では、種々の細胞型、特に休止期にある細胞および***活性の弱い細胞をも有効にトランスフェクトしうる。さらに、緩衝溶液の使用によって、電界強度が少なくとも２０００Ｖ／ｃｍの高圧パルスの使用が可能であり、これが動物およびヒトの初代細胞へのＤＮＡ分子の直接のトランスフェクションを可能にする。この場合、本発明による緩衝液の有利な特徴の決め手となるのが、高い緩衝能と高いイオン強度との結合である。緩衝能βは、緩衝溶液のｐＨ値を１ｐＨ単位変化させるのに必要なタンパク質分解量を示す（β＝ｄｃ×ｄｐＨ-1であり、ｄｃ＝酸または塩基の添加量およびｄｐＨ＝ｐＨ値の変化である）。溶液のイオン強度Ｉは、式Ｉ＝０．５Σｃi×ｚi 2（ｃi＝イオン濃度（ｍｏｌ／ｌ）、ｚi＝イオン荷電）によって計算される。本願に記載された緩衝物質のイオン強度を計算するために、プログラム「ジャバ・バッファー・カルキュレータ（Java Buffer Calculator）」（トゥイガー（Twigger）とベイノン（Beynon）、１９９８年）を使用した。この枠内で、緩衝液を種々の細胞型および要件に適した組成で最適化することができる。
好ましい実施形態においては、緩衝溶液に２２〜８０ｍｍｏｌ×ｌ−１×ｐＨ−１、好ましくは４０〜７０ｍｍｏｌ×ｌ−１×ｐＨ−１の緩衝能があることである。イオン強度に関しては、２００〜５００ｍｍｏｌ×ｌ−１、好ましくは２５０〜４００ｍｍｏｌ×ｌ−１の範囲が特に有利であることが明らかにされた。通常、細胞型および他の実験条件によって緩衝能およびイオン強度に関する最適条件があり、ここでこれら２つのパラメータ間には相互作用が存在する。
別の好ましい実施形態においては、緩衝溶液が少なくとも１０ｍｍｏｌ×ｌ−１マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、好ましくは１５〜２０ｍｍｏｌ×ｌ−１マグネシウムイオンを含有することである。従来の知見に反して、驚くべきことに、本発明による緩衝液におけるＭｇ２＋イオンは、高濃度のときでさえも、トランスフェクション効率を、同時におこるイオン強度のわずかな上昇によって説明されうるよりもはるかに上昇させることが明らかにされた。この場合、緩衝液は塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）を含有しうる。
本発明による緩衝液は、細胞内Ｎａ+／Ｋ+比に適合しておらず、これに関してはむしろ「細胞外」の比が示されている。しかし、これは意外にも細胞に対する悪影響を示さず、トランスフェクション効率および細胞生存率の明らかな上昇を来たす。
本発明による緩衝液は緩衝物質としてＨＥＰＥＳおよび／またはＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４を含有することが有利である。しかし、例えば、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたはＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４も緩衝物質として使用することができる。さらに、追加の成分、例えば、塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、マニトール、グルコース、ラクトビオン酸ナトリウム、および／またはペプチドも緩衝液に含有しうる。
本発明による緩衝溶液の特に有利な組成の例として、それぞれ種々の細胞系に最適化されている６つの群の緩衝系が以下に挙げられる。しかし、本発明の範囲内で別の組成も可能であり、したがって、これらの例を限定として理解すべきではない。
１）４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１２０〜１６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）
２）４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１２０〜１６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）
３）４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０〜１６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウム、または５〜１００ｍＭマニトール、または５〜１００ｍＭコハク酸ナトリウム、または５〜１００ｍＭ塩化ナトリウム
４）４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、 ５０〜１６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウム、または５〜１００ｍＭマニトール、または５〜１００ ｍＭコハク酸ナトリウム、または５〜１００ｍＭ塩化ナトリウム
５）４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、８０〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、８〜１２ｍＭグルコース、０．３〜０．５ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、２０〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および５０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、または３０〜５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）
６）０．１〜３．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０〜２００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）、および／または１〜５０ｍＭマニトール、および／または１〜５０ｍＭコハク酸ナトリウム
課題はさらに、電流によって動物またはヒトの細胞へ生体活性分子を導入する方法によって解決されるが、この方法は、ｐＨ値ｐＨ７からｐＨ８の変化で、温度が２５℃において、少なくとも２０ｍｍｏｌ×ｌ−１×ｐＨ−１の緩衝能、および少なくとも２００ｍｍｏｌ×ｌ−１のイオン強度を示す緩衝溶液中に細胞を懸濁し、生体活性分子を溶解するステップと、懸濁液に電圧をかけるステップとを含む。この方法によって、電気穿孔法による生体活性分子の動物およびヒトの細胞への導入が、９３％までのトランスフェクション効率と同時に低い細胞死亡率で可能である。この場合、種々の細胞型、特に休止期にある細胞および***活性の弱い細胞をも有効にトランスフェクトすることができる。
緩衝溶液の組成に関する本発明による方法の別の有利な実施形態は、従属請求項および前述の説明において開示されている。
本発明による緩衝溶液は、２〜１０ｋＶ×ｃｍ−１の電界強度および１０〜２００μｓの持続時間ならびに少なくとも２Ａ×ｃｍ−２の電流密度の電圧パルスによって生体活性分子の細胞への導入を達成する電気穿孔法を実施するために特に適している。この場合、高圧パルスによって、動物およびヒトの細胞の細胞核へのＤＮＡの直接のトランスフェクションが可能となり、ここでパルスが短いことによって不可逆性の膜障害が回避される。これとともに高圧パルスが短いことにより、緩衝液の高いイオン強度または伝導性が溶液の不利な加熱をひき起こすこともなく、そのため***細胞のほか、休止期にある細胞または***活性の弱い細胞も、高い効率とともに低い死亡率でトランスフェクトすることができる。むしろ、高いイオン強度と短い高圧パルスの相互作用が効率的な細孔開放をひき起こし、ここで強い緩衝作用によりｐＨ値の極端な変動も補正しうる。
２〜１４Ａ×ｃｍ−２、好ましくは５Ａ×ｃｍ−２までの電流密度、および１〜１００ｍｓ、好ましくは５０ｍｓまでの持続時間で中断なく前記高圧パルスに続く電流の適用も、方法における本発明による緩衝液の使用によって特に有利な様式で可能となる。この場合、本発明による緩衝溶液の高い緩衝能は、ＤＮＡの電気泳動に寄与する長く持続する第２のパルス中の電極の近くのｐＨ値の変化を減少し、細胞死亡率を有効に減少させることができる。
本発明による方法によって、電流による動物またはヒトの細胞の細胞核への生体活性分子のトランスフェクションも有利な様式で最適化される。この場合、核酸、タンパク質、またはペプチドを休止期にあるまたは***中の動物およびヒトの細胞に高い効率で導入することができる。本発明による緩衝溶液は、高圧パルスの助けによって核酸、タンパク質、またはペプチドの初代細胞への導入にも有利である。
緩衝溶液中では核酸はペプチド、タンパク質、または他の生体活性分子との複合体として、または混合物として存在することもできる。
本発明による方法は、初代ヒト血球細胞、ヒト血液の多能性前駆細胞、初代ヒト線維芽細胞および内皮細胞のほか、筋細胞またはメラニン細胞のトランスフェクションにも特に適している。
本発明による方法によって調製される細胞は、診断および／または分析方法、ならびに生体外遺伝子治療のための医薬品の調製に特に有利な様式で適している。
表１には本発明による緩衝溶液の具体的な組成が示されているが、これらはそれぞれ種々の適用または細胞型のために最適化され、高いトランスフェクション効率および細胞死亡率の減少に関して特に有利であることが明らかにされた。しかし、本発明の範囲内で別の組成も可能であり、これらの例も限定として理解してはならない。
以下、個別の緩衝溶液の適用例を図面と関連して詳しく述べる。
以下の実施例は本発明を例示しているが、限定的に理解すべきではない。
初代ヒト内皮細胞のトランスフェクション効率および生存率
緩衝能およびイオン強度の作用としてエレクトロトランスフェクションにおける細胞のトランスフェクション効率および生存率を研究するために、マウスＭＨＣクラスＩタンパク質Ｈ−２ＫＫの重鎖をコードするベクターで初代ヒト内皮細胞をトランスフェクトした。
緩衝能およびイオン強度の作用としてエレクトロトランスフェクションにおける細胞のトランスフェクション効率および生存率を研究するために、マウスＭＨＣクラスＩタンパク質Ｈ−２ＫＫの重鎖をコードするベクターで初代ヒト内皮細胞をトランスフェクトした。
それぞれ７×１０５細胞をそれぞれエレクトロトランスフェクション緩衝液を含むそれぞれ５μｇのベクターＤＮＡとともに室温下に電極距離２ｍｍのキュベットに添加し、１０００Ｖおよび１００μｓの持続時間のパルスによってトランスフェクトした。さらに、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２＋１３７ｍＭ ＮａＣｌ、イオン強度＝１６１．５ｍＭ、緩衝能＝４．８ｍＭ／ｐＨ）を用いて比較値を測定した。エレクトロトランスフェクションの直後、培養培地４００μｌでキュベットから細胞を洗浄し、３７℃下に１０分間インキュベートし、予め温めた培地を含む培養シャーレに移した。６時間のインキュベーション後、細胞をＣｙ５結合抗Ｈ−２ＫＫ抗体でインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で分析した。
図１から明らかであるように、トランスフェクション効率および生存率は緩衝能とイオン強度の上昇とともに増大する。それぞれの場合について、きわめて高い死亡率が生じた比較溶液のＰＢＳよりも明らかに良好な値を得ることができた。一部の緩衝溶液の場合には、死亡率はきわめて高く、この値は統計的に評価不可能であった。
初代ヒトリンパ球のトランスフェクション効率および生存率
さらに、緩衝能およびイオン強度の作用としてエレクトロトランスフェクションにおける初代ヒトリンパ球のトランスフェクション効率および生存率を研究した。
さらに、緩衝能およびイオン強度の作用としてエレクトロトランスフェクションにおける初代ヒトリンパ球のトランスフェクション効率および生存率を研究した。
そのために、それぞれ５×１０６細胞をそれぞれエレクトロトランスフェクション緩衝液を含むそれぞれ５μｇのＨ−２ＫＫ発現ベクターＤＮＡとともに室温下に電極距離２ｍｍのキュベットに添加し、１０００Ｖおよび１００μｓのパルスの後、４Ａ×ｃｍ−２および４０ｍｓの電流密度によってトランスフェクトした。さらに、ＰＢＳ（イオン強度＝１６１．５ｍＭ、緩衝能＝４．８ｍＭ／ＰＨ）を使用して比較値を測定した。１６時間後に分析を行った。
図２においてわかるように、この場合、使用した緩衝溶液の緩衝能およびイオン強度の上昇とともに細胞の生存率は増大するが、トランスフェクション効率に対する最大値が得られることが明らかである。比較溶液（ＰＢＳ：トランスフェクトされた細胞４０．１％、生細胞３８．３％）よりも部分的に明らかに良好な値を得ることができた。この場合、エレクトロトランスフェクションの効率は、例えば培地やＰＢＳなど従来の溶液と比べて適切な本発明による緩衝溶液の選択によっても明らかに増大しうる。
初代ヒト線維芽細胞のトランスフェクション
図３は、Ｈ−２ＫＫ発現ベクターでトランスフェクトした初代ヒト線維芽細胞のＦＡＣＳｃａｎ分析を示す。５×１０５細胞を表１の緩衝液６中のベクターＤＮＡ５μｇとともに室温下に２ｍｍの電極距離のキュベットに添加し、１０００ｖおよび１００μｓのパルスの後、電流密度６Ａ×ｃｍ−２および３３ｍｓの電流によってトランスフェクトした。５時間のインキュベーション後、Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫＫ抗体で細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で分析した。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｊｏｄｉｄ）染色によって、死細胞の数を測定した。生細胞の９３％がＨ−２ＫＫ抗原を発現し、これはきわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
図３は、Ｈ−２ＫＫ発現ベクターでトランスフェクトした初代ヒト線維芽細胞のＦＡＣＳｃａｎ分析を示す。５×１０５細胞を表１の緩衝液６中のベクターＤＮＡ５μｇとともに室温下に２ｍｍの電極距離のキュベットに添加し、１０００ｖおよび１００μｓのパルスの後、電流密度６Ａ×ｃｍ−２および３３ｍｓの電流によってトランスフェクトした。５時間のインキュベーション後、Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫＫ抗体で細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で分析した。ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｊｏｄｉｄ）染色によって、死細胞の数を測定した。生細胞の９３％がＨ−２ＫＫ抗原を発現し、これはきわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
ヒト平滑筋細胞のトランスフェクション
図４は、Ｈ−２ＫＫ発現ベクターでトランスフェクトしたヒト平滑筋細胞のＦＡＣＳｃａｎ分析を示す。５×１０５細胞を表１の緩衝液６中のベクターＤＮＡ５μｇとともに室温下に２ｍｍの電極距離のキュベットに添加し、１０００Ｖおよび１００μｓのパルスの後、電流密度５．６Ａ×ｃｍ−２および４０ｍｓの電流によってトランスフェクトした。１３．５時間のインキュベーション後、Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫＫ抗体で細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で分析した。ヨウ化プロピジウム染色によって、死細胞の数を測定した。生細胞の５３．８％がＨ−２ＫＫ抗原を発現し、これも高いトランスフェクション効率に相当する。
図４は、Ｈ−２ＫＫ発現ベクターでトランスフェクトしたヒト平滑筋細胞のＦＡＣＳｃａｎ分析を示す。５×１０５細胞を表１の緩衝液６中のベクターＤＮＡ５μｇとともに室温下に２ｍｍの電極距離のキュベットに添加し、１０００Ｖおよび１００μｓのパルスの後、電流密度５．６Ａ×ｃｍ−２および４０ｍｓの電流によってトランスフェクトした。１３．５時間のインキュベーション後、Ｃｙ５結合抗Ｈ−２ＫＫ抗体で細胞をインキュベートし、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で分析した。ヨウ化プロピジウム染色によって、死細胞の数を測定した。生細胞の５３．８％がＨ−２ＫＫ抗原を発現し、これも高いトランスフェクション効率に相当する。
初代ヒトメラニン細胞のトランスフェクション
図５は、ＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトした初代ヒトメラニン細胞のＦＡＣＳｃａｎ分析を示す。５×１０５細胞を表１による緩衝液４０中のｐＥＧＦＰ−Ｃ１−ベクター（クロンテク・ラボ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．）５μｇとともに室温下に２ｍｍの電極距離のキュベットに添加し、１０００Ｖおよび１００μｓのパルスの後、電流密度６Ａ×ｃｍ−２および３３ｍｓの電流によってトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム染色によって、死細胞の数を測定した。生細胞の５６．２％がＧＦＰを発現し、これもきわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
図５は、ＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトした初代ヒトメラニン細胞のＦＡＣＳｃａｎ分析を示す。５×１０５細胞を表１による緩衝液４０中のｐＥＧＦＰ−Ｃ１−ベクター（クロンテク・ラボ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．）５μｇとともに室温下に２ｍｍの電極距離のキュベットに添加し、１０００Ｖおよび１００μｓのパルスの後、電流密度６Ａ×ｃｍ−２および３３ｍｓの電流によってトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム染色によって、死細胞の数を測定した。生細胞の５６．２％がＧＦＰを発現し、これもきわめて高いトランスフェクション効率に相当する。
ヒトＣＭＬ細胞株Ｋ５６２のトランスフェクション
図６は、ＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトしたヒトＣＭＬ細胞株Ｋ５６２のＦＡＣＳｃａｎ分析を示す。５×１０５細胞を表１による緩衝液４２中のｐＥＧＦＰ−Ｃ１−ベクター（クロンテク・ラボ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．）５μｇとともに室温下に２ｍｍの電極距離のキュベットに添加し、１０００Ｖおよび７０μｓのパルスの後、電流密度４Ａ×ｃｍ−２および１０ｍｓの電流によってトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム染色によって、死細胞の数を測定した。生細胞の７７．７％がＧＦＰを発現し、これも高いトランスフェクション効率に相当する。
図６は、ＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトしたヒトＣＭＬ細胞株Ｋ５６２のＦＡＣＳｃａｎ分析を示す。５×１０５細胞を表１による緩衝液４２中のｐＥＧＦＰ−Ｃ１−ベクター（クロンテク・ラボ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂ．）５μｇとともに室温下に２ｍｍの電極距離のキュベットに添加し、１０００Ｖおよび７０μｓのパルスの後、電流密度４Ａ×ｃｍ−２および１０ｍｓの電流によってトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））で細胞を分析した。ヨウ化プロピジウム染色によって、死細胞の数を測定した。生細胞の７７．７％がＧＦＰを発現し、これも高いトランスフェクション効率に相当する。
使用した略語リスト
ドゥーデンにおいて用いられる略語のほかに、以下の略語を用いた。
Ａ アンペア
ＡＰＣ アルフィコシアニン（Ａｌｌｐｈｙｃｏｓｙａｎｉｎ）
ＣＤ 分化クラスター
ｃｍ センチメートル
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＦＡＣＳｃａｎ 蛍光活性化細胞分析装置
ＦＣＳ ウシ胎児血清
ＦＬ 蛍光
ＦＳＣ 前方散乱
ＨＥＰＥＳ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ'−（２−エタンスルホン酸）
ｍｌ ミリリットル
ｍＭ ミリモラー
ｍｓｅｃ ミリ秒
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＥ フィコエリトリン
ＰｅｒＣＰ ペリジニンクロロフィルタンパク質
ｐＨ 水素イオン濃度の負の１０進対数
ＲＮＡ リボ核酸
ＲＰＭＩ ロズウェルパーク記念研究所
ＳＳＣ 側方散乱
Ｔｒｉｓ トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノエタン−ヒドロクロリド
μｇ マイクログラム
μｌ マイクロリットル
μｓｅｃ マイクロ秒
Ｖ ボルト
ドゥーデンにおいて用いられる略語のほかに、以下の略語を用いた。
Ａ アンペア
ＡＰＣ アルフィコシアニン（Ａｌｌｐｈｙｃｏｓｙａｎｉｎ）
ＣＤ 分化クラスター
ｃｍ センチメートル
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＦＡＣＳｃａｎ 蛍光活性化細胞分析装置
ＦＣＳ ウシ胎児血清
ＦＬ 蛍光
ＦＳＣ 前方散乱
ＨＥＰＥＳ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ'−（２−エタンスルホン酸）
ｍｌ ミリリットル
ｍＭ ミリモラー
ｍｓｅｃ ミリ秒
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＥ フィコエリトリン
ＰｅｒＣＰ ペリジニンクロロフィルタンパク質
ｐＨ 水素イオン濃度の負の１０進対数
ＲＮＡ リボ核酸
ＲＰＭＩ ロズウェルパーク記念研究所
ＳＳＣ 側方散乱
Ｔｒｉｓ トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノエタン−ヒドロクロリド
μｇ マイクログラム
μｌ マイクロリットル
μｓｅｃ マイクロ秒
Ｖ ボルト
Claims (40)
- 動物またはヒトの細胞を懸濁し、生体活性分子を電流によって細胞に導入するために前記生体活性分子を溶解するための緩衝溶液であって、ｐＨ値ｐＨ７からｐＨ８の変化で、温度が２５℃において、少なくとも２０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能、および少なくとも２００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示し、２〜６ｍｍｏｌ×ｌ -1 Ｋ + 濃度のカリウムイオン（Ｋ+）および１００〜１５０ｍｍｏｌ×ｌ -1 Ｎａ + 濃度のナトリウムイオン（Ｎａ+）を含有する緩衝溶液。
- ２２〜８０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能（ｐＨ７〜８、２５℃）を示すことを特徴とする、請求項１に記載の緩衝溶液。
- ４０〜７０ｍｍｏｌ×ｌ-1×ｐＨ-1の緩衝能（ｐＨ７〜８、２５℃）を示すことを特徴とする、請求項１または２に記載の緩衝溶液。
- ２００〜５００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示すことを特徴とする、請求項１、２、または３に記載の緩衝溶液。
- ２５０〜４００ｍｍｏｌ×ｌ-1のイオン強度を示すことを特徴とする、請求項１、２、３、または４に記載の緩衝溶液。
- 少なくとも１０ｍｍｏｌ×ｌ-1のマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）を含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- １５〜２０ｍｍｏｌ×ｌ-1のマグネシウムイオンを含有することを特徴とする、請求項６に記載の緩衝溶液。
- 塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）を含有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- 緩衝物質としてＨＥＰＥＳおよび／またはＮａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 および／またはＴｒｉｓ／ＨＣｌおよび／またはＫ 2 ＨＰＯ 4 ／ＫＨ 2 ＰＯ 4 を含有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- 追加の成分として、塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、マニトール、グルコース、ラクトビオン酸ナトリウムおよび／またはペプチドが緩衝溶液中に含有されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- ４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、および１２０〜１６０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）を含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- ４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、５〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１２０〜１６０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）を含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- ４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、５０〜１６０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭマニトールまたは５〜１００ｍＭコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- ４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、５〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０〜１６０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウム、または５〜１００ｍＭマニトールまたは５〜１００ｍＭコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- ４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、８０〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、８〜１２ｍＭグルコース、０．３〜０．５ｍＭ Ｃａ（ＮＯ 3 ） 2 、２０〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および５０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたは３０〜５０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）を含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- ０．１〜３．０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、５０〜２００ｍＭ Ｋ 2 ＨＰＯ 4 ／ＫＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ６．５）および／または１〜５０ｍＭマニトールおよび／または１〜５０ ｍＭコハク酸ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の緩衝溶液。
- 生体活性分子を電流によって動物またはヒトの細胞に導入する方法であって、
ｉ．ｐＨ値ｐＨ７からｐＨ８の変化で、温度が２５℃において、少なくとも２０ｍｍｏｌ×ｌ -1 ×ｐＨ -1 の緩衝能、および少なくとも２００ｍｍｏｌ×ｌ -1 のイオン強度を示す緩衝溶液中に細胞を懸濁し、前記生体活性分子を溶解するステップと、
ｉｉ．前記懸濁液に電圧をかけるステップと、
を含む方法。 - 前記緩衝溶液が２２〜８０ｍｍｏｌ×ｌ -1 ×ｐＨ -1 の緩衝能（ｐＨ７〜８、２５℃）を示す、請求項１７に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が４０〜７０ｍｍｏｌ×ｌ -1 ×ｐＨ -1 の緩衝能（ｐＨ７〜８、２５℃）を示す、請求項１７または１８に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が２００〜５００ｍｍｏｌ×ｌ -1 のイオン強度を示す、請求項１７、１８または１９に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が２５０〜４００ｍｍｏｌ×ｌ -1 のイオン強度を示す、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が少なくとも１０ｍｍｏｌ×ｌ -1 のマグネシウムイオン（Ｍｇ 2+ ）を含有する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が１５〜２０ｍｍｏｌ×ｌ -1 のマグネシウムイオンを含有する、請求項２２に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ 2 ）および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ 4 ）を含有する、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が細胞の細胞質と比較して低い濃度のカリウムイオン（Ｋ + ）および高い濃度のナトリウムイオン（Ｎａ + ）を含有する、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液に、緩衝物質としてＨＥＰＥＳおよび／またはＮａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 および／またはＴｒｉｓ／ＨＣｌおよび／またはＫ 2 ＨＰＯ 4 ／ＫＨ 2 ＰＯ 4 が含有されている、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
- 追加の成分として、塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、マニトール、グルコース、ラクトビオン酸ナトリウムおよび／またはペプチドが前記緩衝溶液中に含有されている、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、および１２０〜１６０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）を含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、５〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１２０〜１６０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）を含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、５０〜１６０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭマニトールまたは５〜１００ｍＭコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、５〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０〜１６０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）、および５〜１００ｍＭラクトビオン酸ナトリウム、または５〜１００ｍＭマニトールまたは５〜１００ｍＭコハク酸ナトリウムまたは５〜１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が４〜６ｍＭ ＫＣｌ、１０〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、８０〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、８〜１２ｍＭグルコース、０．３〜０．５ｍＭ Ｃａ（ＮＯ 3 ） 2 、２０〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および５０〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたは３０〜５０ｍＭ Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ／ＮａＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ７．２）を含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が０．１〜３．０ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、５０〜２００ｍＭ Ｋ 2 ＨＰＯ 4 ／ＫＨ 2 ＰＯ 4 （ｐＨ６．５）および／または１〜５０ｍＭマニトールおよび／または１〜５０ｍＭコハク酸ナトリウムを含有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体活性分子の細胞への導入が、２〜１０ｋＶ×ｃｍ -1 の電界強度および１０〜２００μｓの持続時間ならびに少なくとも２Ａ×ｃｍ -2 の電流密度で電圧パルスによって行われる、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生体活性分子の細胞への導入が、２Ａ×ｃｍ -2 〜１４Ａ×ｃｍ -2 の電流密度および１〜１００ｍｓの持続時間で、中断なしに前記高電圧パルスに続く電流によって行われる、請求項３４に記載の方法。
- 前記生体活性分子が電流によって動物またはヒトの細胞の細胞核にトランスフェクトされる、請求項３４または３５に記載の方法。
- 核酸、タンパク質またはペプチドが、休止期にあるまたは***中の動物またはヒトの細胞に導入される、請求項１７〜３６のいずれか１項に記載の方法。
- 核酸、タンパク質、またはペプチドが動物またはヒトの初代細胞に導入される、請求項１７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記核酸がペプチド、タンパク質、または他の生体活性分子との複合体で、または混合物として存在する請求項３７または３８に記載の方法。
- 前記細胞が初代ヒト血球細胞、ヒト血液の多能性前駆細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、筋細胞またはメラニン細胞である、請求項１７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
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