JP4937904B2 - 制御されたフローエレクトロポレーションチャンバーに関連した方法および装置 - Google Patents
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Description
本発明は、概して一時的な電界による細胞処理の分野、および特に細胞のエレクトロポレーションに関する。より具体的には、制御されたフローエレクトロポレーションのための方法、エレクトロポレーションチャンバー、および関連装置に関する。なお、本出願は、2004年3月12日付で出願された米国特許仮出願第60/570,317号の優先権を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。
エレクトロポレーションは、1970年代初頭以来、動物または植物の細胞中に分子を挿入するために使用されている。研究者たちは、短時間、高圧電場へ細胞を曝すことにより、タンパク質およびDNAなどの高分子を含む分子が細胞の中に入ることができる開口部が細胞膜において形成されることを明らかにしてきた。電気穿孔(electropore)と呼ばれるこれらの開口部は、高圧電場に起因する細胞膜における局所的な破壊によって生じる透過性の増大領域である。これらの孔は、一時的だが、プラスミドDNA分子などの高分子が細胞の中に入るには十分な時間存在する。細胞は、これらの孔ができるのを許容することができるが、それらを作り出して分子を導入する処理は、もし過度に実施されると細胞を殺す可能性がある。このエレクトロポレーションは、導電性細胞懸濁液への電流の(一時的ではあるが)通過を伴うため、電極はジュールの法則に従って発熱する。この熱は、細胞懸濁液の温度を上昇させることができ、もし過度になると、細胞温度を細胞が死ぬところまで引き上げる。エレクトロポレーションの最も早期の適用では、実質的に一様な電場がこれらの間に発生可能なように、互いに対して置かれた電極を含む特殊化したキュベットを使用して実施された。最も好都合なことには、これは、長方形のキュベットまたはチャンバーの対壁に取り付けられた2つの平板電極によって提供される。操作者が細胞中への導入を意図する1つの分子または複数の分子と混合された電気穿孔すべき細胞の懸濁液を、キュベットまたはチャンバーの中に配置し、次にそれを細胞懸濁液が電極と液体中で接触するよう電極間に設置する。細胞の中へエレクトロポレーションによる分子の導入を達成するため、高圧および短時間の電場パルスを、電極、およびそれによって電極間の細胞懸濁液に1回または複数回加えた。最も多く市販されているエレクトロポレーション用キュベットは、容量が制限されており、一度に少量の細胞懸濁液しか処理できない(通常1 ml未満)。キュベットの充填ごとにエレクトロポレーション処理されうる少容量の細胞を前提とすると、大量の細胞懸濁液のエレクトロポレーションは実用可能ではなかった。
本発明の態様は、エレクトロポレーション法、ならびに大量のエレクトロポレーションが可能な関連したエレクトロポレーション用装置および器具を含む。ある局面において、本発明は、チャンバーの温度が許容できない温度まで上昇するのを避けるため、熱産生の平衡を保つことが可能である。さらに、電気パルスは、個々の単位体積の処理、および/または対象とする試料のすべて、もしくは一部の処理のために最適化することができる。本明細書において使用される場合、「単位体積」または「単位」は、エレクトロポレーションチャンバーを満たす、または部分的に満たす試料または流体の塊である。単位とは、通常、特定の電気パルスまたは一連のパルスに曝される試料の部分である。それぞれの単位は、試料の画分または部分として見なすことができる。この単位は、操作者によって決めることができ、エレクトロポレーションチャンバーを充填および空にする事によって、またはチャンバーを通る流速を変えることによって制御される。それぞれの単位は、2つまたはそれ以上の試料の単位の間に試料でない気体または液体を導入することによって生成される異なった個々の試料画分であることも可能である。様々な態様において、試料の処理は、閉鎖系、すなわち装置または器具の容器の内側、流路、およびエレクトロポレーション用装置のチャンバーの外部となる環境に対し限定的に曝露される系で実施される。このような閉鎖系は、試料の無菌性および完全性を維持するのに使用され得る。
本発明の態様は、エレクトロポレーションのための様々な新しい器具および方法を含む。特に、ある態様は、分子、化合物、または組成物を、バクテリア、菌類、植物細胞、動物細胞、培養細胞、初代細胞、赤血球、白血球、血小板、幹細胞、遺伝子組み換え幹細胞、または幹細胞の拡大させた集団を含むがこれらに限定されない細胞または細胞の断片に導入するフローエレクトロポレーション用の装置および方法を提供する。ある局面において、一時的な高圧電場は、細胞の代謝を妨害し、高すぎる電圧、または長すぎる時間で加えられると一部の細胞を殺すことが可能である。異なった細胞型は、一時的な電場による一時的な電場処理で区別されて影響されうるため、エレクトロポレーションによって分子を細胞に取り込んだ、または導入したものなど、細胞の集団における異なった細胞は、区別されて殺され、それによってその集団から取り除くことができる。他の局面において、分子は導入される必要はないが電場への曝露によって、試料は処理される必要がある。さらに他の態様において、目的は外来の分子を細胞内に導入することではなく、むしろ処理された細胞、すなわち電場への曝露の前、間、または後にいくつかの他の薬理学的な作用物質または条件に曝された細胞の変容 - 変容の極端な例は殺すことである - である。1つの態様において、本発明の装置は、中で細胞がエレクトロポレーション処理されるエレクトロポレーションチャンバーと、器具中における細胞懸濁液の調節された、または可変的な流動とを組み合わせ、これにより電気パルスで調整されるエレクトロポレーションチャンバーを繰り返し充填するおよび空にする事を可能とする。好ましくは、チャンバーならびにその関連した流路および容器は、閉鎖的な滅菌環境を形成することができる。本発明によってもたらされる他の利点は、細胞のより均一なパルスを提供する器具の能力を含む。新規の制御されたフローエレクトロポレーションチャンバーによって、大量の細胞懸濁液が単位体積でエレクトロポレーション処理することができる。試料でない気体もしくは流体によって物理的に分離することができ、またはバルブの開閉などの他の手段によって互いから分離することができる、エレクトロポレーションチャンバーを流れた試料の量を、個々の画分または単位体積によって定義する。試料の塊の間の本分離は、連続した塊が同じエレクトロポレーションの条件を経験していない、または連続した塊がエレクトロポレーションによる取り込みのための細胞および分子の異なる組合せを含むことが可能な場合に、各分離した塊の分離した収集を促進する。本発明のエレクトロポレーションチャンバーを含む方法および器具は、薬理学的な作用物質または条件に曝された、曝されている、または曝される予定の細胞を電場へ十分に曝露するとき、様々な細胞集団への様々な物質の封入に使用され得る。電場への曝露によって、それ自体で、およびそれだけで細胞の処理を行うことができる。
図1は、本明細書において記載されている制御された、または断続的なフローエレクトロポレーション法の例示的なエレクトロポレーションの循環を表した概略図である。パネル2が、チャンバーをエレクトロポレーション処理する試料で同時に満たすことを図解するとともに、パネル1は、チャンバーから試料でない流体または気体を除去することを図解する。パネル3および4は、試料が流入してから流出するまで移行する間の試料のエレクトロポレーションを図解する。パネル5および6は、処理試料がチャンバーから除去されるよう、試料でない流体または気体が同時に流入することを図解する。本発明の局面は、1、2、3、4、5、6、またはそれ以上のエレクトロポレーションチャンバーポートを通じて生じる流入、流出、または流入および流出両方を含む。流入および流出は、同じまたは異なるポートを通してであることができる。チャンバー自体は、マニホールドとして使用することが可能であり、または分かれたマニホールドは、試料供給源とチャンバーとの間、収集地点とチャンバーとの間、または試料供給源および収集地点両方の間のチャンバーの外側に置くことができる。マニホールドは、本発明のすべての態様に必須ではない。
式中、
mは、滴の質量であり、
V(t)は、その速度であり、
gは、重力加速度であり、および
h(t)は、パイプ開口部より上の滴の高度である。
エレクトロポレーションチャンバーの組立部品は、外部の供給源からエレクトロポレーションチャンバー組立部品に導入される細胞などの、選択的に分画された生物学的単位に対して使用することができる。生物学的な単位は、次に、生物学的または科学的な物質の存在下でエレクトロポレーションに供し、物質を生物学的単位の膜に一時的に開けられた孔に侵入させてもよい。いったんエレクトロポレーションされると、生物学的な単位は、エレクトロポレーション処理された細胞のさらなる操作を可能にし、かつ細胞懸濁液の新たな画分、部位、または単位体積についてエレクトロポレーションを可能にするため、エレクトロポレーションチャンバーから除去される。本発明の例示的な態様に係るエレクトロポレーションチャンバーの構造および構成の詳細な説明は、以下で提供される。
使い捨てセットは、様々な容器(例えば、PVCバッグ)、PVC管類、連結装置、シリコーンポンプ管類、および本明細書において記載されているエレクトロポレーションチャンバーを含むことができる。血液または他の細胞物質と接触するすべてのプラスチック構成部品は、医療グレードクラス(Medical Grade Class)VIの材料であることが可能である。
本発明と関連するであろう様々な流体および/または気体の流れは、1つまたは複数のポンピング手段、バルブ、または流れを引き起こし、抑制し、もしくは全体的には遮断するかでなければ流れを制御するように設計された他の手段によって制御することができる。これは、細胞懸濁液もしくは他の流体をエレクトロポレーションチャンバーにポンプで注入する1つまたは複数のポンプ、細胞懸濁液もしくは他の流体をエレクトロポレーションチャンバーからポンプで排出する1つまたは複数のポンプ、またはこれらの組み合わせによって達成することができる。細胞懸濁液は、エレクトロポレーションチャンバー内部の空気圧または空気量を変化させるポンプまたは他の機械装置によってエレクトロポレーションに流入、およびエレクトロポレーションから流出されうる。ある態様において、重力は、1対の電極間で試料の単位を移動させるのに使用することができる。使用されうるバルブはピンチバルブ、バタフライバルブ、および/またはボールバルブを含み、完全または部分的に流路を開閉するために使用することができる。様々な態様において、ポンプは、装置内の流体の流れを制御かつ測定するために用いることができる。流体のポンピングは、多くの装置で一般的である。試験試料から様々な試薬まで及ぶ流体、および洗浄液は、用途に応じて移動、分配、または測定されなければならない。これらの装置は、より少ない量の流体を使用するよう設計されているので、極めて正確な定量ポンプに対する要求は、さらに大きくなっている。
本明細書において記載されているようなエレクトロポレーション装置は、1つまたは複数の電子モジュールインターフェース、コンピュータ、モニター、および他の電子回路、および当業者が容易に供給するソフトフェアなどの様々な他の構成部品を含む。エレクトロポレーションシステムの一般的な構成、およびこのようなシステムの様々な他の構成部品の説明は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第200400292240号、第20030073238号、第20030059945号、および第20010001064号に見出すことが可能である。
以下の例は、本発明の好ましい態様をこと証明するために含まれる。以下に続く例に開示されている技術が、本発明の実施に際してうまく機能するよう本発明者らによって発見された技術を説明し、したがってその実施のための好適な様式を構成するとみなすことができる事が、当業者に認識されるべきである。しかし、当業者は、本発明の開示の観点から、多くの変更が開示される具体的な態様において成され、かつ本発明の精神および範囲から逸脱することなしに同等のものまたは同様の結果が以前として得ることができると認識すべきである。
例示的なエレクトロポレーションの研究が、制御された、または可変的なフローエレクトロポレーションを使用して実施された。ジャーカット細胞は、モデル系として使用され、GFP発現ベクターが形質転換のためにモデル化合物として使用された。全細胞密度は、4×107 ジャーカット細胞/mLであり、プラスミド濃度は、eGFP(green fluorescent protein)を発現することができるpTM2 プラスミドのDNA(〜5 Kb)が、100 μg/mLだった。この処理は、試料でない流体または気体をチャンバーから除去することを含み;同時にジャーカット細胞およびGFPベクターを含む試料でチャンバーを充填した。単位試料は、試料が流入してから流出するまで移行する間エレクトロポレーションされた。処理試料は、試料でない流体または気体を同時に流入させてチャンバーから除去された。図11は、ヨウ化プロピジウム蛍光またはGFP蛍光で評価された、対照細胞、400 μLの静的な処理を使用して処理された細胞、および100 mLの可変的な流れによる処理を使用して処理された細胞を示す。図12は、対照細胞(図12A)、400 μLの静的な処理を使用して処理された細胞(図12B)、および100 mLの可変的な流れによる処理を使用して処理された細胞(図12C)におけるGFP蛍光でのFACS分析の結果を図解したヒストグラムを示す。図13は、14の連続的な試料画分を通じた単位試料ごとの可変的なフローエレクトロポレーションを使用した結果の整合性を示す。細胞は、GFPトランスフェクションおよび生存度で評価され、死細胞、トランスフェクションに対して陰性の生細胞、およびトランスフェクションに対して陽性の生細胞の順でソートされた。
以下の参考文献は、本明細書に示したものに対して例示的な手順、または他の詳細の補足を提供する限りにおいて、具体的には参照により本明細書に組み入れられる。
米国特許第4,752,586号
米国特許第5,612,207号
米国特許第6,074,605号
米国特許第6,090,617号
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米国特許出願第20030059945号
米国特許出願第20030073238号
米国特許出願第200400292240号
Claims (18)
- (a)ガスケットによって分離された少なくとも2つの電極を含むチャンバーであって、該電極とガスケットがチャンバーを形成する、チャンバーと;
(b)(i)第1のポートはチャンバーへの試料流入用であり;
(ii)第2のポートは、チャンバーからの処理試料流出用であり;かつ
(iii)第3のポートは、試料でない流体または気体のチャンバーへの流入またはチャンバーからの流出用であり、
試料がチャンバーに流入する際、試料でない流体または気体がチャンバーから流出し、処理試料がチャンバーから流出する際、試料でない流体または気体がチャンバーに流入する、
ガスケットを横切る少なくとも3つのポートとを含む、
フローエレクトロポレーションチャンバー。 - 第1のポートが1つまたは複数の試料用容器と流体連絡する、請求項1記載のチャンバー。
- 第2のポートが1つまたは複数の処理試料用容器と流体連絡する、請求項1記載のチャンバー。
- 第3のポートが貯蔵用容器と流体連絡し、貯蔵用容器が、チャンバーが試料の塊で満たされているかまたは部分的に満たされているとき、試料でない流体または気体の塊のすべてまたは一部を含む、請求項1記載のチャンバー。
- 少なくとも4つのポートを有する、請求項1記載のチャンバー。
- 少なくとも第4のポートが、試料用容器、処理試料用容器、試料でない気体もしくは流体用の貯蔵器、または試薬用容器と流体連絡する、請求項5記載のチャンバー。
- (a)第1の流路を形成する、第1のチャンバーポートを通じて請求項1記載のエレクトロポレーションチャンバーと流体連絡する少なくとも1つの試料用容器と;
(b)第2の流路を形成する、第2のチャンバーポートを通じて請求項1記載のエレクトロポレーションチャンバーと流体連絡する少なくとも1つの処理試料用容器とを含む、
フローエレクトロポレーション装置。 - 第3の流路を形成する、第3のチャンバーポートを通じてエレクトロポレーションチャンバーと流体連絡する少なくとも1つの試料でない流体または気体の貯蔵器をさらに含む、請求項7記載の装置。
- 少なくとも1つの流路が閉鎖的な流路である、請求項8記載の装置。
- 第1、第2、および第3の流路が閉鎖的な流路である、請求項9記載の装置。
- 試料でない気体または流体用の貯蔵器が、試料用容器、処理試料用容器、または試料用容器および処理試料用容器の両方である、請求項8記載の装置。
- 第2の流路が、第2の流路における処理試料用容器に関してエレクトロポレーションチャンバーの位置に対して末端側にある、第1の流路の試料用容器、および第3の流路の試料でないもの用の貯蔵器と流体連絡する、請求項8記載の装置。
- 少なくとも1つの流路と動作可能なように連結した少なくとも1つのポンピング手段をさらに含む、請求項8記載の装置。
- 試料用容器が、折り畳み可能な、拡張できる、または固定した容量である、請求項8記載の装置。
- 処理試料用容器が、折り畳み可能な、拡張できる、または固定した容量である、請求項8記載の装置。
- 流体の流れが、1つまたは複数のバルブをさらに含めることによって調節される、請求項8記載の装置。
- ポンプが蠕動ポンプである、請求項13記載の装置。
- 蠕動ポンプが十分に圧縮された蠕動ポンプである、請求項17記載の装置。
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