JP6856610B2 - ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製 - Google Patents

ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製 Download PDF

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Description

本発明は、全般的に、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の方法に関する。プロテインＡまたはＧに対する親和性を喪失させる特異的置換を、ヘテロ二量体免疫グロブリンの一方の重鎖に導入できる。本発明のさらなる態様では、プロテインＡに対する親和性を喪失させる置換をヘテロ二量体免疫グロブリンの一方の重鎖に導入でき、プロテインＧに対する親和性を喪失させる置換をヘテロ二量体免疫グロブリンの他方の重鎖に導入し、そのことによりプロテインＡおよびプロテインＧ親和性クロマトグラフィーの組み合わせを用いてヘテロ二量体免疫グロブリンを容易に精製するための方法を提供する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンを生成するための方法は当該技術において知られており、最も単純な方法の１つは、単一細胞中で２つの異なる免疫グロブリン鎖を発現させることに依拠する（ＷＯ９５／３３８４４、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ＨおよびＴｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ Ｓ）。工学的操作なしで、この単純な方法は、対象のヘテロ二量体を超えるホモ二量体種の形成により制限される（Ｋｕｆｅｒら、（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２（５）：２３８〜２４４頁）。重鎖ヘテロ二量体形成を増加させる補完的技術を用いる場合（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ＡＭら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６（７）：６７７〜６８１頁）、より多いヘテロ二量体生成が達成できるが、著しい量の望ましくないホモ二量体がまだ生成される（Ｊａｃｋｍａｎ Ｊら、（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２８５（２７）：２０８５０〜９頁、Ｋｌｅｉｎ Ｃら、（２０１２）ＭＡｂｓ、４（６）：６５３〜６３頁）。
親和性試薬に対するヘテロ二量体の差次的親和性に基づいてホモ二量体からヘテロ二量体を容易に回収する技術が知られている。差次的親和性技術の最初の例は、２種の異なる動物由来の２つの異なる重鎖であって、そのうちの一方が親和性試薬プロテインＡと結合しない重鎖の使用を含んだ（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ Ｈら、（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５（１）：２１９〜２２５頁）。同じ著者らは、２つの異なるヒト免疫グロブリンアイソタイプ（ＩＧＨＧ１およびＩＧＨＧ３）を起源とする２つの異なる重鎖であって、そのうちの１つが親和性試薬プロテインＡと結合しない重鎖の使用についても記載した（ＩＧＨＧ３；ＵＳ６，５５１，５９２ Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ Ｈらを参照されたい）。後者の技術の変形が、ＷＯ１０／１５１７９２（Ｄａｖｉｓ Ｓら）に記載され、これは、一方のヘテロ二量体重鎖における試薬プロテインＡに対する親和性を排除するための、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇら（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１（１）：２５〜３４頁）により記載された２つのアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆの使用を含んだ。
プロテインＡに基づく現在の差次的精製技術の欠点は、重鎖中に存在し、そのことにより精製方法に干渉するさらなるプロテインＡ結合部位を創出する可能性があるＶＨ３ドメインの寄与についてこの技術が対処していないことである。
上記の既知の差次的精製技術は、ヘテロ二量体からホモ二量体を分離することを可能にする勾配モードのクロマトグラフィーを好ましく用いる。捕捉−溶出モードを用いて対象のヘテロ二量体から重鎖の２つのホモ二量体を容易に分離するために、２つの異なる精製方法を逐次的に行う必要がある。
ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＩｇＧ−ＣＨ１親和性試薬との結合を低減するためのヘテロ二量体抗体の一方のＣＨ１ドメインの改変に基づく差次的精製技術の組み合わせが提案されている（ＰＣＴパンフレットＷＯ１３／１３６１８６ Ｆｉｓｃｈｅｒ
Ｎら）。しかし、この技術の欠点は、少なくとも一方の重鎖が、両方のホモ二量体を除去するためにＣＨ１領域を包含する必要があり、そのことによりこの技術の範囲が制限されることである。よって、抗原結合部位の改変を回避するように免疫グロブリンのＦｃ領域に限定された領域と理想的に結合して、第２の親和性試薬との結合の差を創出し、かつ任意の抗原結合の土台に修正できる、差次的プロテインＡ精製技術を補完する技術に対する必要性が存在する。
細菌の表面のプロテインＡおよびプロテインＧと結合することが知られているガンマアイソタイプの自然に存在するヒト免疫グロブリン（ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ４；Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇら、（１９９７）、既出ならびにＮｅｚｌｉｎ ＲおよびＧｈｅｔｉｅ Ｖ、（２００４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第８２巻：１５５〜２１５頁）では、各重鎖は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面に２つの細菌の表面タンパク質それぞれに対する結合部位を保有する。重鎖においてプロテインＡおよびプロテインＧに対する結合部位はオーバーラップするので、プロテインＧ結合を低減させるまたは喪失させる特異的置換は、上記のプロテインＡベースの方法と同様の方法で重鎖のヘテロ二量体を精製するために有用である。さらに、プロテインＧに基づく差次的親和性方法は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製の新しい方策を提供する。両方の差次的親和性方法を組み合わせることは、高い純度で、いずれの形の勾配溶出も行うことなく重鎖のヘテロ二量体を容易に調製するために有利である。このアプローチでは、重鎖のヘテロ二量体は、プロテインＡと結合するがプロテインＧとの結合が低減されているかまたは結合しない一方の重鎖を有し、他方の重鎖は、プロテインＧと結合するが、プロテインＡとの結合が低減されているかまたは結合しない。
プロテインＡまたはＧ結合に関与するアミノ酸残基は、細菌の表面タンパク質との複合体中の免疫グロブリンの実験的に解明された結晶構造（プロテインデータバンク（ＰＤＢ）データベース；ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）から導き出すことができるが、プロテインＡ、プロテインＧおよびＦｃＲｎ受容体に対する結合部位は同じＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面にてオーバーラップするので、プロテインＡまたはプロテインＧのいずれかに対する親和性に対する効果、さらにＦｃＲｎ親和性に与えるその影響の点で、いずれの置換による結果も予測することは不可能である。
重鎖がホモ二量体である、自然に存在する免疫グロブリンとは対照的に、本発明のヘテロ二量体免疫グロブリンは、２つの異なる重鎖（重鎖のヘテロ二量体）を有し、それらに限定されないが、全長二重特異性抗体、一価ＦＡＢ−Ｆｃ融合体および二重特異性ｓｃＦｖ／ＦＡＢ Ｆｃ融合体を含む。
本発明は、全般的に、プロテインＧ、プロテインＡまたはプロテインＧおよびプロテインＡの両方との結合が低減または喪失した新規な免疫グロブリンおよびヘテロ二量体免疫グロブリンバリアントに関する。本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の方法も包含する。
第１の態様では、本発明は、
エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチド
を含む免疫グロブリンまたはその断片であって、
免疫グロブリン定常領域が、
ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域
からなる群から選択され、
免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
免疫グロブリン定常領域がＣＨ２および／またはＣＨ３領域であるならば、前記低減が、未改変の免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して少なくとも３０％である、
免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
免疫グロブリンまたはその断片は、免疫グロブリン定常領域を含み、これは、好ましくはヒトＩＧＨＧ由来である。免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ３領域またはＣＨ２領域を含むことができ、好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ３およびＣＨ２領域を含む。
免疫グロブリンまたはその断片は、免疫グロブリン定常領域中で、プロテインＧとの結合を低減するために改変されてよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、３１１位、３８０位、３８２位、３８５位、３８７位、４２６位、４２８位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位および４３８位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む。全ての位置は、ＥＵナンバリングシステム（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭら、（１９６９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５頁）に従って番号付けされている。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、３１１位、３８０位、３８２位、４２６位、４２８位、４３４位、４３５位、４３６位および４３８位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む。より好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０Ｍ、３８２Ａ、３８２Ｌ、４２６Ｍ、４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３Ｄ、４３４Ａ、４３４Ｇ、４３４Ｓおよび４３８Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、２５０位にてアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、このアミノ酸置換は、２５０Ｑでない。免疫グロブリン定常領域は、４２８位にてアミノ酸置換を含んでよく、ここで、この置換は、４２８Ｌでない。
一実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、１つより多いアミノ酸置換、例えば２５２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２６Ｍ／４２８Ｇおよび４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａからなる群から選択される置換を含んでよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２からなる群から選択されるヒトＩＧＨＧ１のバリアントＦｃ断片を含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔもしくは４２８Ｖから選択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換とを含むか、または代わりに、免疫グロブリン定常領域は、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換とを含む。より好ましくは、アミノ酸置換は、４２８Ｇと４３４位でのさらなる置換とであってよいか、または代わりに、アミノ酸置換は、４３４Ａもしくは４３４Ｓと４２８位でのさらなる置換とであってよい。さらにより好ましくは、アミノ酸置換は、４２８Ｇと４３４Ａまたは４３４Ｓのいずれかとであってよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号２４または配列番号２５から選択されるヒトＩＧＨＧ１のバリアントＦｃ断片を含む。
免疫グロブリン定常領域のＣＨ２および／またはＣＨ３領域中の上記の改変の他に、本発明の免疫グロブリンまたはその断片は、免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域も含んでよく、ここで、ＣＨ１領域は、プロテインＧとの結合の低減または喪失をもたらすように改変されている。好ましくは、ＣＨ１領域は、ヒトＩＧＨＧ由来である。
ＣＨ１領域がヒトＩＧＨＧ由来である一実施形態では、ＣＨ１領域は、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域で置き換えられてよい。代わりに、ＣＨ１領域のＣＨ１ストランドＧおよび一部のＦＧループは、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域のＣＨ１ストランドＧおよび一部のＦＧループで置き換えられてよい。
代替の実施形態では、改変免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域は、２０９位、２１０位、２１３位および２１４位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含んでよい。好ましくは、アミノ酸置換は、２０９位および２１３位にある。代わりに、改変免疫グロブリン定常領域は、２０９Ｐ／２１０Ｓ、２１３Ｖ／２１４Ｔおよび２０９Ｇ／２１０Ｎからなる置換の群から選択されるアミノ酸置換を含んでよい。より好ましくは、改変免疫グロブリン定常領域は、アミノ酸改変２０９Ｇまたは２１３Ｖを含んでよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号５７、５９または５６のアミノ酸１１８〜２２２を含むバリアントヒトＩＧＨＧ１ ＣＨ１領域を含んでよい。
上記の置換は、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合を低減する効果を有する。結合の低減は、少なくとも最小限で１０％であってよい。好ましくは、プロテインＧとの結合は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％低減される。プロテインＧとの結合は、１００％まで低減されてよく、これは、喪失に相当し、このことは、プロテインＧと全く結合しないことを意味する。
上記の置換は、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリン定常領域の結合親和性を変化させる効果を有してよい。しかし、ＦｃＲｎとの結合は、エフェクター機能のために必要であり、よって、ＦｃＲｎとの結合の消失は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣのようなエフェクター機能が望まれる場合は、望ましくない。
さらなる実施形態では、本発明は、エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチドを含む免疫グロブリンまたはその断片であって、免疫グロブリン定常領域が、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域からなる群から選択され、免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリンまたはその断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリン定常領域の結合親和性を変化させ、
免疫グロブリンまたはその断片が、未改変の免疫グロブリンまたはその断片と比較して、少なくとも８０％のＦｃＲｎとの結合を保持する、
免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
代替の実施形態では、本発明は、
（ａ）第１エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含む第１ポリペプチドと、
（ｂ）第２エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域（免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２領域およびＣＨ３からなる群から選択される）とを含む第２ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第２ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域中に、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリン定常領域の結合親和性を変化させ、
改変第２ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域中に改変を有さない未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して、少なくとも８０％のＦｃＲｎとの結合を保持する、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
親和性試薬は、免疫グロブリン定常領域中のヒトＦｃＲｎに対する結合部位とオーバーラップする、免疫グロブリンもしくはヘテロ２量体免疫グロブリンまたはその断片の免疫グロブリン定常領域中の結合部位と結合してよい。このオーバーラップは、部分的または完全であってよい。好ましくは、親和性試薬は、細菌の表面タンパク質である。より好ましくは、親和性試薬は、プロテインＧである。
一実施形態では、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第２ポリペプチドの免疫グロブリンは、その免疫グロブリン定常領域中に、プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩＧＨＧ由来である。このような改変は、本明細書に記載するように、ＣＨ３および／またはＣＨ２領域中のアミノ酸置換であってよい。
第２の態様では、本発明は、ＶＨ３領域を少なくとも有するエピトープ結合領域を含むポリペプチドを含む免疫グロブリンまたはその断片であって、ＶＨ３領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、免疫グロブリンまたはその断片を提供する。免疫グロブリンまたはその断片は、ＶＨ３領域を少なくとも有する１または複数のさらなるエピトープ結合領域を含んでよい。
免疫グロブリンまたはその断片は、ＶＨ３領域中で、プロテインＡとの結合を低減するように改変されてよい。好ましくは、ＶＨ３領域は、６５位にてアミノ酸置換ならびに／または５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６８Ｖ、８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。ＶＨ３領域中のアミノ酸の位置の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔナンバリング（Ｄａｒｉａｖａｃｈ Ｐら、（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８４（２４）：９０７４〜８頁およびＦｒａｎｇｉｏｎｅ Ｂら、（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ、８２（１０）：３４１５〜９頁に記載されるように、Ｋａｂａｔ ＥＡら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第９１号、３２４２頁）に従う。より好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、６５Ｓ、８１Ｅおよび８２ａＳからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。さらにより好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、アミノ酸置換６５Ｓを含む。最も好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、アミノ酸置換８２ａＳを含む。例えば、配列番号３４は、置換Ｇ６５Ｓを有する抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列である。配列番号４４は、置換Ｇ６５Ｓと、自然に存在するヒトＩＧＨＧ１アイソタイプ由来のヒンジ配列全体で置換されたヒンジ領域とを有するアイソタイプＩＧＨＧ３の抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖のアミノ酸配列である。配列番号９５は、置換８２ａＳを有する抗ＨＥＲ３ ＶＨのアミノ酸配列である。配列番号８３は、ＶＨ配列中に置換８２ａＳを有する抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
一実施形態では、免疫グロブリンまたはその断片は、ＶＨ３領域に加えて、免疫グロブリン定常領域をさらに含んでよい。免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域を少なくとも含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩＧＨＧ由来である。ヒトＩＧＨＧは、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２およびＩＧＨＧ４から選択してよい。さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域がＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４由来のＣＨ３領域を含む場合、ＣＨ３領域は、ヒトＩＧＨＧ３由来のＣＨ３領域で置換される。具体的に、免疫グロブリン領域は、配列番号２を有するＦｃ領域を含む。代替の実施形態では、免疫グロブリン定常領域がＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４由来のＣＨ３領域を含む場合、ＣＨ３領域は、４３５位（ＥＵ番号付け）にてアミノ
酸置換を含む。好ましくは、アミノ酸置換は、４３５Ｒである。さらに、ＣＨ３領域は、４３５位および４３６位にてアミノ酸置換を含んでよい。好ましくは、アミノ酸置換は、４３５Ｒおよび４３６Ｆである。
代替の実施形態では、本発明は、
（ａ）第１エピトープと結合するエピトープ結合領域を含む第１ポリペプチドと、
（ｂ）第２エピトープと結合するＶＨ３領域を少なくとも有するエピトープ結合領域を含む第２ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第２ポリペプチドのＶＨ３領域が、ヘテロ二量体免疫グロブリンとプロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第２ポリペプチドは、ＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域をさらに含んでよい。ＣＨ３領域は、本明細書に記載するように置き換えまたは改変されてよい。
代わりに、本発明は、
（ａ）プロテインＡと結合し、第１エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含む第１ポリペプチドと、
（ｂ）プロテインＡと結合しないかまたはプロテインＡとの結合が低減され、第２エピトープと結合するＶＨ３領域を少なくとも有するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含む第２ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第２ポリペプチドのＶＨ３領域が、第２ポリペプチドとプロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
第２ポリペプチドのＶＨ３領域は、ＶＨ３領域を少なくとも有する１または複数のさらなるエピトープ結合領域を含んでよい。ヘテロ二量体免疫グロブリンまたは断片の第２ポリペプチドは、そのＶＨ３領域中に、プロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含んでよい。このような改変は、上記のようなＶＨ３領域中のアミノ酸置換であってよい。
第３の態様では、本発明は、
（ａ）第１エピトープと結合するエピトープ結合領域と、ＣＨ１および／またはＣＨ２および／またはＣＨ３領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域とを含む第１ポリペプチドと、
（ｂ）ＶＨ３を少なくとも含む第２エピトープと結合するエピトープ結合領域ならびに／またはＣＨ２および／もしくはＣＨ３領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域を含む第２ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第１ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第１親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
第２ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第２親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
第１親和性試薬は、プロテインＧであり得、第２親和性試薬は、プロテインＡであり得る。
好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩＧＨＧ由来である。より好ましくは、第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩＧＨＧ由来であり、第２ポリペプチドは、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４から選択される。
第１親和性試薬がプロテインＧである場合、第１ポリペプチドは、ＣＨ３領域またはＣＨ２領域を含む免疫グロブリン定常領域を含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ３およびＣＨ２領域を含む。免疫グロブリン定常領域は、プロテインＧとの結合を低減するように改変されてよい。好ましくは、改変免疫グロブリン定常領域は、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、２５５位、３１１位、３８０位、３８２位、３８５位、３８７位、４２６位、４２８位、４３３位、４３４位、４３５位、４３６位、４３７位および４３８位（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、２５１位、２５２位、２５３位、２５４位、３１１位、３８０位、３８２位、４２６位、４２８位、４３４位、４３５位、４３６位および４３８位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む。より好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、２５２Ａ、２５４Ｍ、３８０Ａ、３８０Ｍ、３８２Ａ、３８２Ｌ、４２６Ｍ、４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔ、４２８Ｖ、４３３Ｄ、４３４Ａ、４３４Ｇ、４３４Ｓおよび４３８Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、２５０位にてアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、このアミノ酸置換は、２５０Ｑでない。免疫グロブリン定常領域は、４２８位にてアミノ酸置換を含んでよく、ここで、この置換は、４２８Ｌでない。
一実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、１つより多いアミノ酸置換、例えば２５２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２６Ｍ／４２８Ｇおよび４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａからなる群から選択される置換を含んでよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２からなる群から選択されるヒトＩＧＨＧ１のバリアントＦｃ断片を含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、４２８Ｇ、４２８Ｓ、４２８Ｔもしくは４２８Ｖから選択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域中の任意の位置にてさらなる置換とを含むか、または代わりに、免疫グロブリン定常領域は、４３４Ａもしくは４３４Ｓから選択されるアミノ酸置換と、そのＣＨ２領域および／もしくはＣＨ３領域内の任意の位置にてさらなる置換とを含む。より好ましくは、アミノ酸置換は、４２８Ｇと４３４位でのさらなる置換とであってよいか、または代わりに、アミノ酸置換は、４３４Ａもしくは４３４Ｓと４２８位でのさらなる置換とであってよい。さらにより好ましくは、アミノ酸置換は、４２８Ｇと４３４Ａまたは４３４Ｓのいずれかとであってよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号２４または配列番号２５から選択されるヒトＩＧＨＧ１のバリアントＦｃ断片を含む。
第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域のＣＨ２および／またはＣＨ３領域中の上記の改変の他に、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ１領域も含んでよく、ここで、ＣＨ１領域は、プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させるように改変されている。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域は、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域で置き換えられてよい。代わりに、ＣＨ１領域のＣＨ１ストランドＧおよび一部のＦＧループは、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来のＣＨ１領域のＣＨ１ストランドＧおよび一部のＦＧループで置き換えられている。
代替の実施形態では、改変免疫グロブリン定常領域のＣＨ１領域は、２０９位、２１０位、２１３位および２１４位の群から選択される位置にてアミノ酸置換を含んでよい。好ましくは、アミノ酸置換は、２０９位および２１３位にある。代わりに、改変免疫グロブリン定常領域は、２０９Ｐ／２１０Ｓ、２１３Ｖ／２１４Ｔおよび２０９Ｇ／２１０Ｎか
らなる置換の群から選択されるアミノ酸置換を含んでよい。より好ましくは、改変免疫グロブリン定常領域は、アミノ酸改変２０９Ｇまたは２１３Ｖを含んでよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号５７、５９または５６のアミノ酸１１８〜２２２を含むバリアントヒトＩＧＨＧ１ ＣＨ１領域を含んでよい。
第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域に対する改変は、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第１ポリペプチドとプロテインＧとの結合の１００％までの低減をもたらしてよく、代わりに、第１ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域に対する改変は、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較した場合に、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第１ポリペプチドとプロテインＧとの結合の喪失をもたらしてよい。
第２親和性試薬がプロテインＡである場合、第２ポリペプチドは、プロテインＡとの結合を低減するように改変されたＶＨ３領域を含んでよい。好ましくは、改変ＶＨ３領域は、６５位にてアミノ酸置換ならびに／または５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、６６Ｑ、６８Ｖ、８１Ｅ、８２ａＳおよび組み合わせ１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔナンバリング）。より好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、６５Ｓ、８１Ｅおよび８２ａＳからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。さらにより好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、アミノ酸置換６５Ｓを含む。最も好ましくは、ＶＨ３領域の改変は、アミノ酸置換８２ａＳを含む。例えば、配列番号３４は、置換Ｇ６５Ｓを有する抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列である。配列番号４４は、置換Ｇ６５Ｓと、自然に存在するヒトＩＧＨＧ１アイソタイプ由来のヒンジ配列全体で置換されたヒンジ領域とを有するアイソタイプＩＧＨＧ３の抗ＨＥＲ２ Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖のアミノ酸配列である。配列番号９５は、置換８２ａＳを有する抗ＨＥＲ３ ＶＨのアミノ酸配列である。配列番号８３は、ＶＨ配列中に置換８２ａＳを有する抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
改変ＶＨ３領域に加えて、第２ポリペプチドは、プロテインＡとの結合を低減するように改変された免疫グロブリン定常領域を含んでよい。免疫グロブリン定常領域は、少なくともＣＨ２および／またはＣＨ３領域を含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩＧＨＧ由来であり、より好ましくはＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４由来である。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域がＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４由来のＣＨ３領域を含む場合、ＣＨ３領域は、ヒトＩＧＨＧ３由来のＣＨ３領域で置換されてよい。代替の実施形態では、免疫グロブリン定常領域がＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２またはＩＧＨＧ４由来のＣＨ３領域を含む場合、ＣＨ３領域は、４３５位（ＥＵ番号付け）にてアミノ酸置換を含む。好ましくは、アミノ酸置換は、４３５Ｒである。さらに、ＣＨ３領域は、４３５位および４３６位にてアミノ酸置換を含んでよい。好ましくは、アミノ酸置換は、４３５Ｒおよび４３６Ｆである。
第２ポリペプチドのＶＨ３領域および免疫グロブリン定常領域に対する改変は、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第２ポリペプチドとプロテインＡとの結合の１００％までの低減をもたらしてよく、代わりに、第２ポリペプチドのＶＨ３領域および免疫グロブリン定常領域に対する改変は、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較した場合に、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第２ポリペプチドとプロテインＡとの結合の喪失
をもたらしてよい。
本発明の実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、免疫グロブリンもしくはヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片のｉｎ ｖｉｖｏ半減期の変化をもたらしてよい。好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体
免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンのｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加をもたらす。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、ヒトＦｃＲｎに対する免疫グロブリンもしくはヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片の親和性の変化をもたらしてよい。好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、ＦｃＲｎに対する免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの親和性の増加をもたらす。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、免疫グロブリンもしくはヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片とＦｃＲｎとの結合の変化をもたらしてよい。好ましくは、改変は、１０％の免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンとＦｃＲｎとの結合の保持をもたらす。より好ましくは、改変は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％の免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンとＦｃＲｎとの結合の保持をもたらす。さらにより好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンとＦｃＲｎとの結合の保持をもたらす。ＦｃＲｎとの結合の保持は、実施例４に記載するような表面プラズモン共鳴を用いて測定できる。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、ＦｃγＲ３ａに対する免疫グロブリンもしくはヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片の特異性または親和性に影響を与えてよい。好ましくは、改変は、ＦｃγＲ３ａに対する免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの特異性または親和性にほとんどまたは全く影響を与えない。より好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、ＦｃγＲ３ａに対する免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの特異性または親和性にほとんどまたは全く影響を与えない。ＦｃγＲ３ａに対する結合特異性または親和性は、実施例４に記載するような表面プラズモン共鳴を用いて測定できる。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域および／またはＶＨ３領域中の改変は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの免疫原性をもたらしてよく、ヒトにおいて抗薬物抗体応答を誘導できる。好ましくは、改変は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの低い免疫原性だけをもたらすかまたは全く免疫原性をもたらさず、よって低い免疫原性または免疫原性の危険性を示す。本発明で用いる改変の免疫原性は、実施例に５に記載する方法を用いて予測できる。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域および／またはＶＨ３領域中の改変は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの熱安定性を変化させてよい。好ましくは、プロテインＧ結合を排除する改変は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの熱安定性に与える影響が低い。好ましくは、プロテインＡ結合を排除する改変は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの熱安定性に与える影響が低いかまたは全く影響を与えない。本発明に従って改変された免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの熱安定性は、実施例６に記載するように分析できる。
さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域中の改変は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの血清半減期に影響を与えることがある。好ましくは、改変は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの血清半減期にほとんどまたは全く影響を与えない。より好ましくは、改変は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％ま
たは５％未満の血清半減期の低減をもたらす。最も好ましくは、改変は、２０％未満の血清半減期の低減をもたらす。免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの薬物動態は、実施例７に記載するように測定できる。
本明細書に記載する本発明の免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンは、軽鎖も含んでよい。好ましくは、免疫グロブリンは、以前に決定された抗原結合能を有する重鎖および軽鎖を含み、すなわち、免疫グロブリンは、既知の抗原と結合する。より好ましくは、免疫グロブリンは、共通軽鎖、すなわち異なる重鎖と対形成できる軽鎖を含む。よって、ヘテロ二量体免疫グロブリン中で、例えば、２つの異なる重鎖が、共通軽鎖（同一可変および定常領域を有する軽鎖）と対形成してよい．共通軽鎖は、様々な方法を用いて同定できる。これらの方法は、例えば軽鎖可変配列またはｓｃＦｖ抗体断片を提示する抗体ディスプレイライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーから、最も頻繁に用いられる軽鎖可変領域を選択することを含んでよい。代わりに、ヘテロ二量体免疫グロブリンの両方の重鎖可変領域配列をライブラリー中でプローブとして用いて、両方の重鎖可変領域と結合する軽鎖を同定できる。
さらなる態様では、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の方法を提供する。
第１の実施形態は、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を精製する方法であって、
（ｉ）免疫グロブリンの混合物から、１つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、免疫グロブリン定常領域のＣＨ１および／またはＣＨ２および／またはＣＨ３領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二量体免疫グロブリンとプロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、（ｉｉ）免疫グロブリンの混合物をプロテインＧに供するステップと、
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインＧから溶出するステップと
を含む方法を提供する。
免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体の精製のための親和性クロマトグラフィーの方法であって、
（ｉ）ＣＨ１および／またはＣＨ２および／またはＣＨ３領域中で重鎖の一方を改変して、プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
（ｉｉ）両方の重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
（ｉｉｉ）同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインＧに供するステップと、
（ｉｖ）重鎖のヘテロ二量体をプロテインＧから溶出するステップと
を含む方法も提供される。
少なくとも１つのＣＨ１領域と１つのＣＨ２および／またはＣＨ３領域とを含む免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの方法であって、
（ｉ）ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中で重鎖の一方を改変して、プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
（ｉｉａ）ヘテロ二量体内に１つだけＣＨ１領域が存在するならば、前記ＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記ＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは（ｉｉｂ）ヘテロ二量体内に２つ以上のＣＨ１領域が存在するならば、１つを除く全てのＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、
未改変のＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または全てのＣＨ１領域が、プロテインＧとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるステップと、
（ｉｉｉ）重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
（ｉｖ）同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインＧに供するステップと、
（ｖ）重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインＧから溶出するステップと
を含む方法も提供される。
これらの方法に記載する改変重鎖は、本明細書に記載するような、プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を免疫グロブリン定常領域中に含むことができる。
第２の実施形態は、ＶＨ３領域を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を精製する方法であって、
（ｉ）免疫グロブリンの混合物から、１つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、ＶＨ３領域中またはＶＨ３領域および免疫グロブリン定常領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
（ｉｉ）免疫グロブリンの混合物をプロテインＡに供するステップと、
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインＡから溶出するステップと
を含む方法を提供する。
少なくとも１つのＶＨ３領域が存在する免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの方法であって、
（ｉ）重鎖の一方を改変して、プロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
（ｉｉａ）ヘテロ二量体内に１つだけＶＨ３領域が存在するならば、前記ＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記ＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは（ｉｉｂ）ヘテロ二量体内に２つ以上のＶＨ３領域が存在するならば、１つを除く全てのＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、未改変のＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または全てのＶＨ３領域が、プロテインＡとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるステップと、
（ｉｉｉ）２つの重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
（ｉｖ）同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインＡに供するステップと、
（ｖ）重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインＡから溶出するステップと
を含む方法も提供される。
これらの方法に記載する改変ＶＨ３領域または改変ＶＨ３および免疫グロブリン定常領域は、本明細書に記載するような、プロテインＡとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含むことができる。
第３の実施形態は、重鎖のヘテロ二量体の差次的精製の方法であって、
（ｉ）重鎖の混合物から、第１親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む第１重鎖と、第２親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む第２重鎖とを有する重鎖のヘテロ二量体またはその断片を単離するステップと、
（ｉｉ）重鎖の混合物を、第１親和性試薬を含む第１カラムに供するステップと、
（ｉｉｉ）重鎖のヘテロ二量体を第１カラムから溶出するステップと、
（ｉｖ）第１カラムからの溶出物を、第２親和性試薬を含む第２カラムに供するステップと、
（ｖ）重鎖のヘテロ二量体またはその断片を第２カラムから溶出するステップと
を含む方法を提供する。
この方法では、第１および第２親和性試薬は、細菌の表面タンパク質に由来する。第１親和性試薬がプロテインＡである場合、第２親和性試薬は、プロテインＧであるか、または第１親和性試薬がプロテインＧである場合、第２親和性試薬は、プロテインＡである。この方法に記載する改変重鎖は、本明細書に記載するような、プロテインＡおよびプロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含むことができる。
ヘテロ二量体は、７０％より大きい純度まで精製してよい。好ましくは、ヘテロ二量体は、８０％または９０％より大きい純度まで精製される。より好ましくは、ヘテロ二量体は、９５％より大きい純度まで精製される。さらにより好ましくは、ヘテロ二量体は、９８％より大きい純度まで精製される。
本発明のさらなる態様は、対象の免疫グロブリンまたはその断片を免疫グロブリンの混合物から単離する方法であって、
（ｉ）対象の免疫グロブリンまたはその断片を免疫グロブリンの混合物から単離するステップであって、対象の免疫グロブリンまたはその断片が、プロテインＡおよび／またはプロテインＧに対する結合部位を全て喪失しているステップと、
（ｉｉ）第１ステップにおける免疫グロブリンの混合物をプロテインＡまたはプロテインＧに供するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収するステップと、場合によって、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片をプロテインＡまたはプロテインＧに供するステップと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収するステップと
を含み、
ステップ（ｉｉ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＡに供し、ステップ（ｉｖ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＧに供するか、または
ステップ（ｉｉ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＧに供し、ステップ（ｉｖ）において、免疫グロブリンの混合物をプロテインＡに供する、
方法を提供する。
対象の免疫グロブリンまたはその断片中のプロテインＡに対する結合部位は、ＶＨ３および免疫グロブリン定常領域中に位置する。プロテインＧに対する結合部位は、免疫グロブリン定常領域中に位置する。
一実施形態では、対象の免疫グロブリンまたはその断片は、ホモ二量体免疫グロブリンであってよい。代替の実施形態では、対象の免疫グロブリンまたはその断片は、ヘテロ二量体免疫グロブリンであってよい。
好ましくは、対象の免疫グロブリンは、ヘテロ二量体免疫グロブリン、より好ましくは二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または腫瘍抗原、サイトカイン、血管増殖因子およびリンパ−血管形成性増殖因子の群から選択される抗原と結合する二重特異性全長抗体であり得る。好ましくは、抗原は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、ＩｇＥおよびＶＬＡ−２からなる群
から選択される。好ましくは、抗原は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭ、ＣＤ３およびＨＥＲ２、ＣＤ１９およびＩｇＥならびにＣＤ２０およびＩｇＥである。
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、ＨＥＲ３エピトープ結合領域を含む二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンである。好ましくは、ＨＥＲ３エピトープ結合領域は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３とを含む。好ましくは、ＨＥＲ３エピトープ結合領域は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号９２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。より好ましくは、ＨＥＲ３エピトープ結合領域は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号９２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。さらにより好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンであり、ＨＥＲ３と結合し、ここで、ＨＥＲ３結合領域は、配列番号８６の重鎖配列と配列番号８５の軽鎖配列とを含む。同等により好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンであり、ＨＥＲ３と結合し、ここで、ＨＥＲ３結合領域は、配列番号９５の重鎖可変領域配列と配列番号８２の軽鎖可変領域配列とを含む。
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、配列番号８６のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号８５のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３と結合する二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンである。より好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンであり、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３と結合し、配列番号８７の第１重鎖アミノ酸配列と、配列番号８６の第２重鎖アミノ酸配列と、配列番号８５の軽鎖アミノ酸配列とを有する。
本明細書に記載する対象の免疫グロブリンを単離する方法は、医療用途、特に診断において有用であり得る。血清中の対象の免疫グロブリンの量を決定するために対象の免疫グロブリンを患者血清から単離することは、単純なプロセスではない。一実施形態では、免疫グロブリンの混合物は、対象の免疫グロブリンまたはその断片を投与された患者または動物の血清を含むかまたは該血清に由来する。代替の実施形態では、免疫グロブリンの混合物は、患者または動物の血清であり、ここで、患者または動物は、対象の免疫グロブリンまたはその断片を投与されている。
プロテインＡおよび／またはプロテインＧに対する結合部位の排除は、対象の免疫グロブリンまたはその断片を、そのＶＨ３および／または免疫グロブリン定常領域中で、本明細書に記載する改変に従って改変することにより達成してよい。
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載するヘテロ二量体免疫グロブリンの精製方法は、Ｆｃ領域、より具体的にはヘテロ二量体免疫グロブリンのＣＨ３領域の相互作用を最適化するための当該技術において既知の技術と組み合わせることができる。
例えば、工学的に操作されたＣＨ３ヘテロ二量体ドメイン対については、ヘテロ二量体Ｆｃ部分を作製するための「腔への***のあてはめ（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）」アプローチについて記載するＣａｒｔｅｒらにより最初に報告された（米国特許第５，８０７，７０６号；「穴へのノブのあてはめ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ＡＭら、１９８８ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６（７）：６７７〜８１頁）。この方法では、第１抗体分子の界面からの１また
は複数の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置き換えて、「***」を作製する。大きい側鎖と同一または同様のサイズの代償性の「腔」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはトレオニン）で置き換えることにより第２抗体分子の界面に創出する。代替の設計が最近開発されたが、これは、ＷＯ０７／１１０２０５（Ｄａｖｉｓ ＪＨおよびＨｕｓｔｏｎ ＪＳ）により記載されるように、分子のコア組成を改変することによる新しいＣＨ３モジュール対の設計、またはＷＯ０７／１４７９０１（Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ Ｋら）もしくはＷＯ０９／０８９００４（Ｋａｎｎａｎ Ｇら）に記載されるように、モジュール間の補完的塩橋の設計を含む。好ましくは、本発明で用いるヘテロ二量体免疫グロブリンは、ＰＣＴパンフレットＷＯ１３／１３１５５５（Ｂｌｅｉｎ Ｓら）に記載されるように、工学的に操作された免疫グロブリン定常領域を含む。
プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図１Ａ：Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図１Ｂ：Ｆｃ１３３。 同上。図１Ｃ：Ｆｃ１１３。 同上。図１Ｄ：Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ。 プロテインＧ捕捉−溶出モードクロマトグラフィー画分（プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（１）Ｆｃ ＩＧＨＧ１。（２）Ｆｃ１１３。（３）Ｆｃ１３３。（４）Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ｇ）プロテインＧからの溶出。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図３Ａ：Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図３Ｂ：Ｆｃ Ｅ３８０Ｙ。 同上。図３Ｃ：Ｆｃ Ｅ３８２Ｒ。 同上。図３Ｄ：Ｆｃ Ｅ３８２Ｙ。 同上。図３Ｅ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｒ。 同上。図３Ｆ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｙ。 同上。図３Ｇ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｗ。 同上。図３Ｈ：Ｆｃ Ｑ４３８Ｒ。 同上。図３Ｉ：Ｆｃ Ｑ４３８Ｙ。 同上。図３Ｊ：Ｆｃ Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ。 同上。図３Ｋ：Ｆｃ Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ。 同上。図３Ｌ：Ｆｃ Ｅ３８０Ｙ／Ｅ３８２Ｒ。 同上。図３Ｍ：Ｆｃ Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ。 同上。図３Ｎ：Ｆｃ Ｓ２５４Ｅ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ。 同上。図３Ｏ：Ｆｃ Ｓ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ。 同上。図３Ｐ：Ｆｃ Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８３Ａ／Ｙ４３６Ａ／Ｑ４３８Ａ。 同上。図３Ｑ：Ｆｃ Ｓ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ。 同上。図３Ｒ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ／Ｈ４３３Ｄ／Ｎ４３４Ａ。 プロテインＡ捕捉−溶出モードクロマトグラフィー画分（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。図４Ａ：（１）Ｆｃ ＩＧＨＧ１、（２）Ｆｃ Ｅ３８０Ｙ、（３）Ｆｃ Ｅ３８２Ｒ、（４）Ｆｃ Ｅ３８２Ｙ、（５）Ｆｃ Ｅ３８０Ｙ／Ｅ３８２Ｒ、（６）Ｆｃ Ｑ４３８Ｒ、（７）Ｆｃ Ｓ４２６Ｗ、（８）Ｆｃ Ｓ４２６Ｒおよび（９）Ｆｃ Ｓ４２６Ｙ。 同上。図４Ｂ：（１０）Ｆｃ Ｑ４３８Ｙ、（１１）Ｆｃ Ｓ２５４Ｅ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇおよび（１２）Ｆｃ Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ。 同上。図４Ｃ：（１３）Ｆｃ Ｓ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ、（１４）Ｆｃ Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ、（１５）Ｆｃ Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ、（１６）Ｆｃ Ｓ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ、（１７）Ｆｃ Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ／Ｙ４３６Ａ／Ｑ４３８Ａおよび（１８）Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ／Ｈ４３３Ｄ／Ｎ４３４Ａ。図４Ａ〜Ｃ：（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ａ）プロテインＡからの溶出。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図５Ａ：Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図５Ｂ：Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｈ４３３Ｄ。 同上。図５Ｃ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ。 同上。図５Ｄ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図５Ｅ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図５Ｆ：Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ｓ。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図６Ａ：Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図６Ｂ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図６Ｃ：Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ。 同上。図６Ｄ：Ｆｃ Ｎ４３４Ａ。 プロテインＡ捕捉−溶出モードクロマトグラフィー画分（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（１）Ｆｃ ＩＧＨＧ１。（２）Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。（３）Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ／ Ｈ４３３Ｄ／Ｎ４３４Ａ。（４）Ｆｃ Ｍ２４８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ。（５）Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ｓ。（６）Ｆｃ Ｍ２４８Ｌ／Ｎ４３４Ａ。（７）Ｆｃ Ｓ４２６Ｍ／Ｈ４３３Ｄ。（８）Ｆｃ Ｍ２４８Ｇ。（９）Ｆｃ Ｎ４３４Ａ。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ａ）プロテインＡからの溶出。 プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図８Ａ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。 同上。図８Ｂ：抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ１３３（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。 同上。図８Ｃ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムおよびＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム）。 ７つの既知のヒトＶＨフレームワークサブクラスのそれぞれについての代表的なアミノ酸配列。配列は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って整列させた。プロテインＡのドメインＤと相互作用する位置を太字で示す。 プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図１０Ａ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ。 同上。図１０Ｂ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｔ５７Ａ。 同上。図１０Ｃ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｔ５７Ｅ。 同上。図１０Ｄ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｇ６５Ｓ。 同上。図１０Ｅ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｒ６６Ｑ。 同上。図１０Ｆ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｔ６８Ｖ。 同上。図１０Ｇ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｑ８１Ｅ。 同上。図１０Ｈ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｎ８２ａＳ。 同上。図１０Ｉ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ Ｒ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａ。 ＨＥＲ２抗原に対する選択された抗ＨＥＲ２ ＦＡＢバリアントの平衡解離定数（ＫＤ）。 プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図１２Ａ：抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。 同上。図１２Ｂ：抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。 同上。図１２Ｃ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。 同上。図１２Ｄ：抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。 プロテインＧ 捕捉−溶出モードクロマトグラフィー画分（プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（１）抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。（２）抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。（３）抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ１３３。（４）抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３。（５）抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３。（６）抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ｇ）プロテインＧからの溶出。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４ＡのプロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。 ヒトＩＧＨＭ、ＩＧＨＡ１およびＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインの配列。ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けを用いる。プロテインＧのドメインＩＩＩとの結合に関与する残基を太字で示す。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図１６Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１６Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−Ａ−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１６Ｃ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−Ａ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１６Ｄ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図１７Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１７Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ−Ａ−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１７Ｃ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ−Ａ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１７Ｄ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図１８Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｃ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｄ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｅ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１８Ｆ：抗ＨＥＲ３抗体バリアントについてのＫＤ測定の決定。 プロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。図１９Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図１９Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｄ２１２Ｅ／Ｋ２１４Ｎ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 プロテインＡ捕捉−溶出モードクロマトグラフィー画分（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。図２０Ａ：（１）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（２）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（３）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（４）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−Ａ−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（５）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａおよび（６）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−Ａ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図２０Ｂ：（７）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ−Ａ−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（８）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（９）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ−Ａ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（１０）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（１１）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、（１２）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａおよび（１３）抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｄ２１２Ｅ／Ｋ２１４Ｎ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。図２０Ａおよび図２０Ｂ：（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（Ａ）プロテインＡからの溶出。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ １３３×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１ヘテロ二量体のプロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。 図２１Ａに示すトレースからのクロマトグラフィー画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（１）細胞培養上清。（２）通過画分。（３）ピーク１。（４）ピーク２。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａヘテロ二量体のプロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。 図２２Ａに示すトレースからのクロマトグラフィー画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（１）細胞培養上清。（２）通過画分。（３）ピーク１。（４）ピーク２。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１ヘテロ二量体のプロテインＧ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。 図２３Ａに示すトレースからのクロマトグラフィー画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（１）細胞培養上清。（２）通過画分。（３）ピーク１。（４）ピーク２。 プロテインＡおよびプロテインＧ捕捉−溶出モードクロマトグラフィーの組み合わせを用いる、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａヘテロ二量体の精製スキーム（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムおよびＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。 図２４Ａに示す精製スキームに従って行ったプロテインＡおよびプロテインＧステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（ＦＴＡ）プロテインＡ捕捉−溶出ステップからの通過画分。（Ａ）プロテインＡ捕捉−溶出ステップからの溶出。（ＦＴＧ）プロテインＧ捕捉−溶出ステップからの通過画分。（Ｇ）プロテインＧ捕捉−溶出ステップからの溶出。 プロテインＡおよびＧ捕捉−溶出精製後の抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａヘテロ二量体の相対的割合を評価する走査デンシトメトリー分析（４〜１２％ ＳＤＳ Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル）。 プロテインＡおよびプロテインＧ捕捉−溶出モードクロマトグラフィーの組み合わせを用いる、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３ヘテロ二量体の精製スキーム（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムおよびＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム）。 図２５Ａに示す精製スキームに従って行ったプロテインＡおよびプロテインＧステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（ＭＷ）記載するとおりの分子量マーカー。（ＳＮ）細胞培養上清。（ＦＴＡ）プロテインＡ捕捉−溶出ステップからの通過画分。（Ａ）プロテインＡ捕捉−溶出ステップからの溶出。（ＦＴＧ）プロテインＧ捕捉−溶出ステップからの通過画分。（Ａ）プロテインＧ捕捉−溶出ステップからの溶出。 プロテインＡおよびＧ捕捉−溶出精製後の抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３ヘテロ二量体の相対的割合を評価する走査デンシトメトリー分析（４〜１２％ ＳＤＳ Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル）。 ヒトＦｃＲｎに対する選択された抗ｈＣＤ１９ＦＡＢ−Ｆｃバリアントの平衡解離定数（ＫＤ）。 未改変の抗ｈＣＤ１９ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１対照に対する相対的比率として表す、ヒトＦｃＲｎに対する選択された抗ｈＣＤ１９ＦＡＢ−Ｆｃバリアントの平衡解離定数（ＫＤ）。 ヒトＦｃＲｎに対する選択された抗ｈＣＤ１９ＦＡＢ−Ｆｃバリアント（記載するとおり）の表面プラズモン共鳴測定。データは、応答単位の数（ＲＵと省略する；Ｙ軸） 対 時間（Ｘ軸）として表す。図２８Ａ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図２８Ｂ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図２８Ｃ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３。 同上。図２８Ｄ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ。 上のプロットは、ヒトＦｃγＲ３ａに対する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａの表面プラズモン共鳴のある測定を示す。データは、応答単位の数（ＲＵと省略する；Ｙ軸） 対 時間（Ｘ軸）として表す。３回の独立した実験から算出した平均ＫＤ値を示す。下のプロットは、上のプロットに基づく、抗体濃度に対して算出されたＲｅｑ値を示す（ここからＫＤ値を決定する）。 上のプロットは、ヒトＦｃγＲ３ａに対する抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１の表面プラズモン共鳴のある測定を示す。データは、応答単位の数（ＲＵと省略する；Ｙ軸） 対 時間（Ｘ軸）として表す。３回の独立した実験から算出した平均ＫＤ値を示す。下のプロットは、上のプロットに基づく、抗体濃度に対して算出されたＲｅｑ値を示す（ここからＫＤ値を決定する）。 置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａならびに置換Ｎ８２ａＳについてのＥｐｉｂａｓｅ（商標）免疫原性の結果を示す表。ＤＲＢ１アロタイプ群との強いおよび中程度の結合のカウントを示す。治療用抗体の選択についての結果も示す。 置換Ｔ２０９Ｇ、Ｔ２０９ＰおよびＫ２１３ＶについてのＥｐｉｂａｓｅ（商標）免疫原性の結果を示す表。それぞれの位置について、全ての可能な置換についての全体的なＤＲＢ１スコアの差を示す。 同上。 示差走査熱量分析を用いるＦｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４ＡおよびＦｃ ＩＧＨＧ１の熱安定性測定。データは、過剰モル熱容量（Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］と省略する；Ｙ軸） 対 温度（℃；Ｘ軸）として表す。 示差走査熱量分析を用いる熱安定性測定。データは、過剰モル熱容量（Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］と省略する；Ｙ軸） 対 温度（℃；Ｘ軸）として表す。図３３Ａ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａおよび抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 同上。図３３Ｂ：抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａおよび抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。 示差走査熱量分析を用いる熱安定性測定。データは、過剰モル熱容量（Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］と省略する；Ｙ軸） 対 温度（℃；Ｘ軸）として表す。図３４Ａ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１。 同上。図３４Ｂ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３。 同上。図３４Ｃ：抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ１１３。 ホモ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１またはヘテロ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ免疫グロブリンの雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの静脈内投与（急速投与）後の片対数血漿濃度−時間プロファイル。結果は、４匹のラットの平均±ＳＤとして表す。データは、平均血清濃度（平均濃度と省略する、μｇ／ｍｌ；Ｙ軸） 対 時間（時間、Ｘ軸）として表す。 １０ｍｇ／ｋｇのホモ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１またはヘテロ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ免疫グロブリンのＩＶ急速投与後の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＰＫパラメータのまとめを示す表。（ｔ1/2）は、免疫グロブリン排出半減期に相当する。 抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−ＢＴＡ ＩＧＨＧ３×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−ＢＴＢ ＩＧＨＧ１ヘテロ二量体のプロテインＡ勾配モードクロマトグラフィートレース（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度 対 移動相の全容量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨおよび移動相中に存在する溶離緩衝液（Ｂ）のパーセンテージのプロットを、それぞれ破線および点線−破線で示す。 Ｃａｌｕ−３細胞増殖アッセイ。３ｎＭのヘレグリンベータの存在下でＣａｌｕ−３細胞を、１％血清含有成長培地の存在下の抗体の系列希釈で処理した。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）染色を用いて細胞増殖を３日後に測定した。結果は、片対数抗体濃度 対 蛍光単位（５４０ｎｍでの励起、６２０ｎｍでの発光）で表す。ＩｇＧ１アイソタイプ対照は、細胞増殖の阻害の陰性対照として示す。図３８Ａ：ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３抗体および抗ＨＥＲ２と抗ＨＥＲ３抗体との等モル混合物。 同上。図３８Ｂ：ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３抗体およびＤＬ１１ｆ抗体（抗ＥＧＦＲおよび抗ＨＥＲ３二重特異性抗体）。 同上。図３８Ｃ：ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３抗体、抗ＨＥＲ２と抗ＨＥＲ３抗体との等モル混合物およびＤＬ１１ｆ抗体。
本発明は、全般的に、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＡおよびプロテインＧの両方との結合が低減または喪失した新規なヘテロ二量体免疫グロブリンバリアントに関する。本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の方法も包含する。
この明細書を理解する目的のために、以下の定義を用い、適切であればいつでも、単数形で用いる用語は複数形も包含し、その逆もまた真である。本明細書で用いる術語は、特定の実施形態について記載する目的のためだけであり、限定することを意図しない。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体のことをいい、ここで、アミノ酸は、ペプチド結合により組み合わされて、脱水合成により一緒に連結されたアミノ酸の鎖を形成する。ポリペプチドおよびタンパク質は、化学合成または組換え発現により合成でき、最小限のアミノ酸の長さに限定されない。
本発明によると、タンパク質が単一ポリペプチド鎖から構成される限り、ポリペプチドの群は「タンパク質」を含む。ポリペプチドは、二量体、三量体およびより高いオリゴマー（すなわち１つより多いポリペプチド分子から構成される）のようなマルチマーをさらに形成してよい。このような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一または非同一であってよい。このようなマルチマーの、対応するより高い次元の構造は、よって、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと命名される。ヘテロマルチマーの例は、その自然に存在する形では２つの同一軽鎖ポリペプチド鎖と２つの同一重鎖ポリペプチド鎖とから構成される抗体分子である。用語「ポリペプチド」および「タン
パク質」は、改変が例えば糖鎖付加、アセチル化、リン酸化などの翻訳後改変により行われる、自然に改変されたポリペプチド／タンパク質のこともいう。このような改変は、当該技術において公知である。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、天然の配列に対する欠失、付加および置換（保存的な性質であり得る）のような改変を含むタンパク質のこともいう。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発によるように計画的であってよいか、またはタンパク質を生成する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅による誤りのように偶発的であってよい。
用語「免疫グロブリン」は、本明細書で言及する場合、用語「抗体」と交換可能に用いることができる。免疫グロブリンは、全長抗体およびその任意の抗原結合断片または単鎖を含む。免疫グロブリンは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。免疫グロブリン、具体的に、自然に存在する抗体は、４つのポリペプチド鎖で構成されるＹ字型単位の１または複数のコピーとして存在する糖タンパク質である。それぞれの「Ｙ」字型は、それらの相対的分子量によりそのように命名される重（Ｈ）鎖の２つの同一コピーと、軽（Ｌ）鎖の２つの同一コピーとを含有する。それぞれの軽鎖は重鎖と対形成し、それぞれの重鎖は別の重鎖と対形成する。鎖間ジスルフィド共有結合および非共有相互作用が鎖を一緒に連結する。免疫グロブリン、具体的に、自然に存在する抗体は、抗原結合部位の２コピーである可変領域を含有する。タンパク質分解酵素であるパパインは、「Ｙ」字型を３つの別々の分子、２つのいわゆる「Ｆａｂ」または「ＦＡＢ」断片（Ｆａｂ＝断片−抗原−結合）と、１つのいわゆる「Ｆｃ」断片または「Ｆｃ領域」（Ｆｃ＝断片−結晶化可能）に分ける。Ｆａｂ断片は、軽鎖全体と重鎖の一部とから構成される。重鎖は、１つの可変領域（ＶＨ）と３または４つの定常領域（抗体クラスまたはアイソタイプに依存して、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）とから構成される。ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間の領域は、ヒンジ領域とよばれ、Ｙ字型抗体分子の２つのＦａｂ腕の間の柔軟性を可能にし、一定の距離で分けられた２つの抗原決定基との結合を受け入れるために、腕が開閉することを可能にする。「ヒンジ領域」は、本明細書で言及する場合、６〜６２アミノ酸の長さの配列領域であり、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧにのみ存在し、２つの重鎖を橋かけするシステイン残基を包含する。ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの重鎖はそれぞれ、４つの領域、すなわち１つの可変領域（ＶＨ）と３つの定常領域（ＣＨ１〜３）とを有する。ＩｇＥおよびＩｇＭは、１つの可変領域と４つの定常領域（ＣＨ１〜４）とを重鎖上に有する。免疫グロブリンの定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系経路の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子との結合を媒介することがある。各軽鎖は、通常、１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結する。各軽鎖は、１つの可変領域（ＶＬ）と１つの軽鎖定常領域とを含有する。軽鎖定常領域は、本明細書においてＩＧＫＣと称するカッパ軽鎖定常領域、または本明細書においてＩＧＬＣと称するラムダ軽鎖定常領域である。ＩＧＫＣは、本明細書において、ＣκまたはＣＫと同等に用い、同じ意味を有する。ＩＧＬＣは、本明細書において、ＣλまたはＣＬと同等に用い、同じ意味を有する。用語「ＩＧＬＣ領域」は、本明細書で用いる場合、全てのラムダ軽鎖定常領域、例えばＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６およびＩＧＬＣ７からなる群から選択される全てのラムダ軽鎖定常領域のことをいう。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる超可変性の領域（この中に、フレームワーク領域（ＦＲまたはＦＷ）をよばれるより保存的な領域が散在する）にさらに細分化できる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用するエピトープ結合領域を含有する。
用語「全長抗体」は、本明細書で用いる場合、可変および定常領域を含む、抗体の自然な生物学的形を構成する構造を含む。例えば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物では、ＩｇＧクラスの全長抗体は四量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一
の対から構成される（各対は、１つの軽鎖と１つの重鎖とを有し、各軽鎖は、免疫グロブリン領域ＶＬおよび軽鎖定常領域を含み、各重鎖は、抗体クラスまたはアイソタイプに依存して、免疫グロブリン領域ＶＨ、ＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）、ＣＨ３（Ｃγ３）およびＣＨ４（Ｃγ４）を含む）。いくつかの哺乳動物、例えばラクダおよびラマでは、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖（各重鎖は、Ｆｃ領域と結合した可変領域を含む）だけから構成されることがある。
抗体は、定常領域により遺伝子的に決定される、アイソタイプともよばれるクラスに群分けされる。ヒト定常軽鎖は、カッパ（ＣＫ）およびラムダ（Ｃλ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）またはイプシロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの抗体のアイソタイプを規定する。よって、「アイソタイプ」は、本明細書で用いる場合、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴により規定される免疫グロブリンのクラスおよび／またはサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩＧＨＧ１（ＩｇＧ１）、ＩＧＨＧ２（ＩｇＧ２）、ＩＧＨＧ３（ＩｇＧ３）、ＩＧＨＧ４（ＩｇＧ４）、ＩＧＨＡ１（ＩｇＡ１）、ＩＧＨＡ２（ＩｇＡ２）、ＩＧＨＭ（ＩｇＭ）、ＩＧＨＤ（ＩｇＤ）およびＩＧＨＥ（ＩｇＥ）である。いわゆるヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、配列決定されたが、スイッチ領域の変化によりタンパク質をコードしないさらなるヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子である（Ｂｅｎｓｍａｎａ Ｍら、（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１６（７）：３１０８頁）。変化したスイッチ領域を有するにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、全ての重鎖定常領域（ＣＨ１〜ＣＨ３）およびヒンジについてのオープンリーディングフレームを有する。その重鎖定常領域についての全てのオープンリーディングフレームは、予測される構造特徴を有する全てのヒト免疫グロブリン定常領域とよく合致するタンパク質領域をコードする。このさらなる偽ガンマアイソタイプは、本明細書において、ＩｇＧＰまたはＩＧＨＧＰという。ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域イプシロンＰ１およびＰ２偽遺伝子（ＩＧＨＥＰ１およびＩＧＨＥＰ２）のような、その他の偽免疫グロブリン遺伝子が報告されている。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に用いられる。ヒトでは、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を含む。
用語「免疫グロブリン断片」は、本明細書で用いる場合、それらに限定されないが、（ｉ）例えばＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３領域を含む領域、（ｉｉ）Ｆａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬまたはＣＫ領域とＣＨ１領域とから構成されるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ領域とＣＨ１領域とから構成されるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一可変領域から構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ＥＳら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１（６２４２）：５４４〜６頁）、（ｉｖ）２つのＦａｂ断片が連結された二価断片であるＦ（ａｂ’）2断片、（ｖ）ＶＨ領域とＶＬ領域とが、２つの領域が結合して抗原結合部位
を形成することを可能にするペプチドリンカーで連結された単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ＲＥら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２（４８７７）：４２３〜６頁；Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳら、（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５（１６）：５８７９〜８３頁）、（ｖｉ）遺伝子融合により構築された多価または多重特異性断片である「ダイアボディ」または「トリアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐら、（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０（１４）：６４４４〜８頁；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ＩおよびＨｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２６：４６１〜７９頁）、（ｖｉｉ）Ｆｃ領域と融合したｓｃＦｖ、ダイアボディまたは領域抗体ならびに（ｖｉｉｉ）同じまたは異なる抗体と融合したｓｃＦｖを含む。
用語「可変領域」は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する領域またはドメインのことをいう。自然に存在する抗体では、抗原結合部位は、特異性を規定する２つの可変領域（一方は重鎖に位置し、本明細書において重鎖可変領域（ＶＨ）といい、他方は軽鎖に位置し、本明細書において軽鎖可変領域（ＶＬ）という）から構成される。ヒトでは、重鎖可変領域（ＶＨ）は、７つのサブグループＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６およびＶＨ７に分けることができる。いくつかの場合では、特異性は、ラクダ科で見出される重鎖抗体由来の単一ドメイン抗体におけることと同様に、２つの領域のうちの一方のみに排他的にあることがある。Ｖ領域は、通常、約１１０アミノ酸の長さであり、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲまたは「非ＣＤＲ領域」）とよばれる比較的不変のアミノ酸配列のひと続きと、それらを分ける７〜１７アミノ酸の長さの非常に変動性の「超可変領域」とよばれるより短い領域とから構成される。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ほぼベータシート立体構造をとり、ループを形成する３つの超可変領域により接続される４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域は、ＦＲにより近接して一緒にされ、他の鎖由来の超可変領域と一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ ＥＡら、既出を参照されたい）。用語「超可変領域」は、本明細書で用いる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、通常「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列変動性を有し、かつ／または抗原認識に関与する。全ての可変領域について、番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ＥＡら、既出）に従う。
いくつかのＣＤＲ定義が用いられており、それらを本明細書において用いて包含する。Ｋａｂａｔ定義は、配列変動性に基づき、最も一般的に用いられる（Ｋａｂａｔ ＥＡら、既出）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置に言及する（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ Ｊ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁）。ＡｂＭ定義は、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義との間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより用いられる（Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲら、（１９８９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：９２６８〜９２７２頁；Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１〜１５３頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＪＴら、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １：１２６〜１３６頁；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ中のＲｅｅｓ ＡＲら、（１９９６）、１４１〜１７２頁）。接触定義は、最近導入され（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５頁）、プロテインデータバンクにおいて入手可能な、入手可能な複合体構造の分析に基づく。ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によるＣＤＲの定義は、全ての種の全ての免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体Ｖ領域についてのＩＭＧＴ番号付けに基づく（ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰら、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（１）：２０９〜１２頁；Ｒｕｉｚ Ｍら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１）：２１９〜２１頁；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１）：２０７〜９頁；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１）：３０７〜１０頁；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰら、（２００５）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１８５〜２０３頁；Ｋａａｓ Ｑら、（２００７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、６（４）：２５３〜６４頁）。本発明において言及する全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）は、好ましくは、以下のように定義される（Ｋａｂａｔ ＥＡら、既出に従う番号付け）：
ＬＣＤＲ１：２４〜３４
ＬＣＤＲ２：５０〜５６
ＬＣＤＲ３：８９〜９８
ＨＣＤＲ１：２６〜３５
ＨＣＤＲ２：５０〜６５
ＨＣＤＲ３：９５〜１０２
可変ドメインの「非ＣＤＲ領域」は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる。ＶＬ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１〜２３（ＦＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）および９９〜１０７（ＦＲ４）を含む。
ＶＨ領域の「非ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１〜２５（ＦＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）および１０３〜１１３（ＦＲ４）を含む。
本発明のＣＤＲは、上記の定義に基づき、以下のような可変ドメイン残基：ＬＣＤＲ１：２４〜３６、ＬＣＤＲ２：４６〜５６、ＬＣＤＲ３：８９〜９７、ＨＣＤＲ１：２６〜３５、ＨＣＤＲ２：４７〜６５、ＨＣＤＲ３：９３〜１０２を有する「拡張ＣＤＲ」を含んでよい。これらの拡張ＣＤＲも、Ｋａｂａｔら、既出に従って番号付けされる。ＶＬ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１〜２３（ＦＲ１）、３７〜４５（ＦＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）および９８〜およそ１０７（ＦＲ４）を含む。ＶＨ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列１〜２５（ＦＲ１）、３７〜４６（ＦＲ２）、６６〜９２（ＦＲ３）および１０３〜およそ１１３（ＦＲ４）を含む。
用語「Ｆａｂ」または「ＦＡＢ」または「Ｆａｂ領域」または「ＦＡＢ領域」は、本明細書で用いる場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよび軽鎖定常免疫グロブリン領域を含むポリペプチドを含む。Ｆａｂは、単離されたこの領域、または全長抗体もしくは抗体断片の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
用語「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、本明細書で用いる場合、第１定常領域免疫グロブリン領域を除く抗体重鎖の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリン領域、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリン領域と、これらの領域に対してＮ末端の柔軟性ヒンジのことをいう。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含むことがある。ＩｇＧについて、Ｆｃは、免疫グロブリン領域Ｃガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）と、Ｃガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジとを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義される（ここで、番号付けは、ＥＵインデックスに従う）。Ｆｃは、単離されたこの領域またはＦｃポリペプチド、例えば抗体の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
用語「免疫グロブリン定常領域」は、本明細書で用いる場合、ヒトまたは動物種由来の免疫グロブリンまたは抗体重鎖定常領域のことをいい、全てのアイソタイプを包含する。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒト起源のものであり、それらに限定されないが、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１、ＩＧＨＧ２ ＣＨ１、ＩＧＨＧ３ ＣＨ１、ＩＧＨＧ４ ＣＨ１、ＩＧＨＡ１ ＣＨ１、ＩＧＨＡ２ ＣＨ１、ＩＧＨＥ ＣＨ１、ＩＧＨＥＰ１ ＣＨ１、ＩＧＨＭ ＣＨ１、ＩＧＨＤ ＣＨ１、ＩＧＨＧＰ ＣＨ１、ＩＧＨＧ１ ＣＨ２、ＩＧＨＧ２ ＣＨ２、ＩＧＨＧ３ ＣＨ２、ＩＧＨＧ４ ＣＨ２、ＩＧＨＡ１ ＣＨ２、ＩＧＨＡ２ ＣＨ２、ＩＧＨＥ ＣＨ２、ＩＧＨＥＰ１ ＣＨ２、ＩＧＨＭ ＣＨ２、Ｉ
ＧＨＤ ＣＨ２、ＩＧＨＧＰ ＣＨ２、ＩＧＨＧ１ ＣＨ３、ＩＧＨＧ２ ＣＨ３、ＩＧＨＧ３ ＣＨ３、ＩＧＨＧ４ ＣＨ３、ＩＧＨＡ１ ＣＨ３、ＩＧＨＡ２ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ３、ＩＧＨＥＰ１ ＣＨ３、ＩＧＨＭ ＣＨ３、ＩＧＨＤ ＣＨ３、ＩＧＨＧＰ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ４およびＩＧＨＭ ＣＨ４からなる群から選択される。好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトＩＧＨＥ ＣＨ２、ＩＧＨＭ ＣＨ２、ＩＧＨＧ１ ＣＨ３、ＩＧＨＧ２ ＣＨ３、ＩＧＨＧ３ ＣＨ３、ＩＧＨＧ４ ＣＨ３、ＩＧＨＡ１ ＣＨ３、ＩＧＨＡ２ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ３、ＩＧＨＭ ＣＨ３、ＩＧＨＤ ＣＨ３およびＩＧＨＧＰ ＣＨ３からなる群から選択される。より好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトＩＧＨＧ１ ＣＨ３、ＩＧＨＧ２ ＣＨ３、ＩＧＨＧ３ ＣＨ３、ＩＧＨＧ４ ＣＨ３、ＩＧＨＡ１ ＣＨ３、ＩＧＨＡ２ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ３、ＩＧＨＭ ＣＨ３、ＩＧＨＤ ＣＨ３およびＩＧＨＧＰ ＣＨ３からなる群から選択される。
用語「エピトープ結合領域」は、免疫グロブリン分子と１または複数のエピトープとの特異的結合を許容する最小限のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片を含む。自然に存在する抗体は、抗原結合（ｂｉｎｄｉｎｇまたはｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）部位またはパラトープとしても知られる２つのエピトープ結合領域を有する。自然に存在する抗体中のエピトープ結合領域は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインのＣＤＲ領域内に限定され、ここで、アミノ酸媒介エピトープ結合がみられる。自然に存在する抗体に加えて、人工ＶＨドメインもしくはＶＬドメインまたはそれらの断片およびそれらの組み合わせを工学的に操作して、エピトープ結合領域を得ることができる（Ｈｏｌｔ ＬＪら、（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２１（１１）：４８４〜４９０頁；Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉ Ｌら、（２００８）ＰＬｏＳ ＯＮＥ、３（６）：ｅ２３７１）。非免疫グロブリンベースのエピトープ結合領域の例は、エピトープ結合領域（Ｂｉｎｚ ＨＫら、（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３（１０）：１２５７〜１２６８頁）またはペプチド模倣物（Ｍｕｒａｌｉ ＲおよびＧｒｅｅｎｅ ＭＩ（２０１２）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、５（２）：２０９〜２３５頁）を工学的に操作するための「土台」として用いられる人工タンパク質ドメインで見出すことができる。好ましくは、用語「エピトープ結合領域」は、１または複数の重鎖可変ドメインと１または複数の相補的軽鎖可変ドメインとの組み合わせを含み、これらは一緒に、免疫グロブリン分子と１または複数のエピトープとの特異的結合を許容する結合部位を形成する。
本明細書で用いる場合、用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原または免疫原性活性を有するポリペプチドまたはタンパク質または非タンパク質分子の断片を含む。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原活性を有するエピトープは、当業者に公知の任意の方法、例えばイムノアッセイにより決定されるように、抗体またはポリペプチドが特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原性エピトープは、免疫原性である必要はない。好ましくは、用語「エピトープ」は、本明細書で用いる場合、少なくとも約３から５、好ましくは約５から１０または１５で、約１，０００以下のアミノ酸（またはそれらの間の任意の整数）のポリペプチド配列のことをいい、該配列は、この配列に応答して作製される抗体が結合する、それ自体またはより大きい配列の一部としての配列を規定する。断片の長さについて臨界的な上限はなく、ほぼ全長のタンパク質配列、または１もしくは複数のエピトープを含む融合タンパク質さえ含むことがある。主題の発明において用いるエピトープは、それが由来する親タンパク質の一部分と全く同じ配列を有するポリペプチドに限定されない。よって、用語「エピトープ」は、天然の配列と同一の配列と、欠失、付加および置換（通常、保存的な性質）のような天然の配列に対する改変とを包含する。タンパク質抗原のエピトープは、それらの構造およびエピトープ結合部位との相互作用に基づいて２つのカテゴリー、すなわち立体構造エピトープおよび直鎖状エピトープに分けられる（Ｇｏｌｄｓｂｙ Ｒら、（２００
３）「Ａｎｔｉｇｅｎｓ（第３章）」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第５版）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．５７〜７５頁、ＩＳＢＮ０−７１６７−４９４７−５）。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続な区画で構成される。これらのエピトープは、３Ｄ表面の特徴および抗原の形状または３次元構造に基づいてパラトープと相互作用する。ほとんどのエピトープは、立体構造エピトープである。対照的に、直鎖状エピトープは、それらの１次構造に基づいてパラトープと相互作用する。直鎖状エピトープは、抗原由来のアミノ酸の連続する配列で形成される。
用語「ヘテロ二量体免疫グロブリン」または「ヘテロ二量体断片」または「ヘテロ二量体」または「重鎖のヘテロ二量体」は、本明細書で用いる場合、第１および第２領域のような第１および第２ポリペプチドを少なくとも含む免疫グロブリン分子またはその一部を含み、ここで、第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第１鎖は、第２鎖と同一でない少なくとも１つの領域を有し、両方の鎖は、それらの非同一領域により集合、すなわち相互作用する。より好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、少なくとも２つの異なるリガンド、抗原または結合部位に対する結合特異性を有し、すなわち二重特異的である。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、本明細書で用いる場合、それらに限定されないが、全長二重特異性抗体、二重特異性Ｆａｂ、二重特異性Ｆ（ａｂ’）2
、Ｆｃ領域と融合した二重特異性ｓｃＦｖ、Ｆｃ領域と融合したダイアボディ、およびＦｃ領域と融合したドメイン抗体を含む。
用語「ホモ二量体免疫グロブリン」または「ホモ二量体断片」または「ホモ二量体」または「重鎖のホモ二量体」は、本明細書で用いる場合、第１および第２領域のような第１および第２ポリペプチドを少なくとも含む免疫グロブリン分子またはその一部を含み、ここで、第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリンは、２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第１鎖は、第２鎖と同一の少なくとも１つの領域を有し、両方の鎖は、それらの同一領域により集合、すなわち相互作用する。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリン断片は、少なくとも２つの領域を含み、ここで、第１領域は、第２領域と同一であり、両方の領域は、それらのタンパク質−タンパク質界面により集合、すなわち相互作用する。
本発明に含まれる全ての免疫グロブリン定常領域について、番号付けは、ＩＭＧＴ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標）；既出）に従うことができる。
ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３およびＩＧＨＧ４からなる群から選択される全てのヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常領域について、番号付けは、「ＥＵナンバリングシステム」（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭら、（１９６９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５頁）に従うことができる。ＩＧＨＧ１のヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３定常領域についての完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標）；既出）で見出すことができる。
ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＫＣ）について、番号付けは、「ＥＵナンバリングシステム」（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭら、既出）に従うことができる。ヒトＣＫ領域についての完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標））；既出）で見出すことができる。
ヒトラムダ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６およびＩＧＬＣ７）について、番号付けは、「Ｋａｂａｔナンバリングシステム」（Ｋａｂａｔ ＥＡら、既出）に従うことができる。ヒトＩＧＬＣ領域についての完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（ＩＭＧＴ（登録商標）；既出）で見出すことができる。
ヒトＩＧＨＧ１免疫グロブリン重鎖定常領域は、本明細書で言及する場合、以下の領域境界、ＣＨ１領域（ＥＵ番号付け：１１８〜２１５）、ヒンジγ１領域（ＥＵ番号付け：２１６〜２３０）、ＣＨ２領域（ＥＵ番号付け：２３１〜３４０）およびＣＨ３領域（ＥＵ番号付け：３４１〜４４７）を有する。本明細書で言及するヒトＣＫ領域は、残基１０８から２１４（ＥＵ番号付け）にわたる。本明細書で言及するヒトＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６およびＩＧＬＣ７領域は、残基１０８〜２１５（Ｋａｂａｔナンバリング）にわたる。
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、本明細書で用いる場合、自然のアミノ酸および自然でないアミノ酸を含む。好ましくは、自然のアミノ酸が含まれる。
用語「改変」または「アミノ酸改変」は、本明細書において、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む。用語「置換」または「アミノ酸置換」または「アミノ酸残基置換」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列中の第１アミノ酸残基を第２アミノ酸残基で置換することをいい、ここで、第１アミノ酸残基は、第２アミノ酸残基とは異なり、すなわち置換アミノ酸残基は、置換されたアミノ酸とは異なる。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、９４位のアルギニンがリジンで置き換えられたバリアントポリペプチドのことをいう。例えば、９４Ｋは、９４位のリジンでの置換を示す。本明細書での目的のために、複数の置換を、典型的に、斜線またはコンマで分ける。例えば「Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖ」または「Ｒ９４Ｋ，Ｌ７８Ｖ」は、置換Ｒ９４ＫおよびＬ７８Ｖを含む二重バリアントのことをいう。「アミノ酸挿入」または「挿入」により、本明細書で用いる場合、親のポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入−９４は、９４位での挿入を示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」により、本明細書で用いる場合、親のポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４位でのアルギニンの欠失を示す。
ある種の実施形態では、プロテインＡとの結合における用語「減少する」、「低減する」または「低減」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＡとの結合の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％、１００％（喪失）までの全体的な減少のことをいう。ある種の実施形態では、これらの用語は、代わりに、１０倍（すなわち１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１，０００倍（または３ｌｏｇ）、１０，０００倍（または４ｌｏｇ）または１００，０００倍（または５ｌｏｇ）の全体的な減少のことをいうことがある。
プロテインＡとの結合についての用語「喪失する」、「排除する」、「喪失」または「排除」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＡとの結合の１００％の全体的な減少、すなわち改変免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＡとの結合の完全な消失のことをいう。
同様に、プロテインＧとの結合における用語「減少する」、「低減する」または「低減」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、
８５％、９０％、９５％、９７％または９９％、１００％（喪失）までの全体的な減少のことをいう。ある種の実施形態では、これらの用語は、代わりに、１０倍（すなわち１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１，０００倍（または３ｌｏｇ）、１０，０００倍（または４ｌｏｇ）または１００，０００倍（または５ｌｏｇ）の全体的な減少のことをいうことがある。
プロテインＧとの結合についての用語「喪失する」、「排除する」、「喪失」または「排除」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合の１００％の全体的な減少、すなわち改変免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合の完全な消失のことをいう。
同様に、親和性試薬との結合における用語「減少する」、「低減する」または「低減」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒトＩｇＧ
Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片と親和性試薬との結合の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％、１００％（喪失）までの全体的な減少のことをいう。ある種の実施形態では、これらの用語は、代わりに、１０倍（すなわち１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１，０００倍（または３ｌｏｇ）、１０，０００倍（または４ｌｏｇ）または１００，０００倍（または５ｌｏｇ）の全体的な減少のことをいうことがある。
親和性試薬との結合についての用語「喪失する」、「排除する」、「喪失」または「排除」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型ＩｇＧまたは野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片と親和性試薬との結合の１００％の全体的な減少、すなわち改変免疫グロブリンまたはその断片と親和性試薬との結合の完全な消失のことをいう。
「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の実施形態では、二重特異性抗体は、親の抗体と比べてＶＨ領域中に１または複数のアミノ酸改変を有する二重特異性抗体である。ある種の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であってよい。二重特異性抗体は、標的抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性薬剤を局在化するために用いてもよい。これらの抗体は、標的抗原と結合する腕と、例えばサポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射活性同位体ハプテンのような細胞傷害性薬剤と結合する腕とを保有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製できる。二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術において知られている。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生成は、免疫グロブリン重鎖−軽鎖の２つの対の同時発現に基づき、ここで、２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜４０頁）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為な取り合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、異なる抗体分子の混合物をおそらく生成し、これらの抗体のうち１つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、親和性クロマトグラフィーステップにより通常行われるが、面倒であり、生成物収率は低い。同様の手順がＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ、１０：３６５５〜９頁に開示されている。異なるアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変領域を、免疫グロブリン定常領域配列と融合させる。融合体は、例えば、ヒン
ジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域を有する。ある種の実施形態では、軽鎖結合のために必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合体のうちの少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と所望であれば免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に該ベクターを同時トランスフェクトする。このことにより、構築において用いる３つのポリペプチド鎖の比率が等しくない場合に最適な収率が得られる実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合を柔軟に調節できる。しかし、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらすか、または比率が特に重要でない場合に、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方はアビジンと結合でき、他方はビオチンと結合できる。このような抗体は、例えば、免疫系の細胞を不要な細胞に標的化させること（ＵＳ４，６７６，９８０）およびＨＩＶ感染の処置のため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３およびＥＰ０３０８９）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製してよい。適切な架橋剤は、いくつかの架橋技術とともに、当該技術において公知である（ＵＳ４，６７６，９８０を参照されたい）。２価を超える抗体も企図される。例えば、三重特異性抗体を調製できる（Ｔｕｔｔ Ａら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜９頁を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍抗原、サイトカイン、血管増殖因子およびリンパ−血管形成性増殖因子からなる群から選択される抗原と結合する二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性全長抗体を提供する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性抗体は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、ＩｇＥおよびＶＬＡ−２からなる群から選択される抗原と結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性抗体は、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３と結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性抗体は、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭ、またはＣＤ３およびＨＥＲ２と結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性抗体は、ＣＤ１９およびＩｇＥ、またはＣＤ２０およびＩｇＥと結合する。
用語「細菌の表面タンパク質」は、自然に存在する免疫グロブリンもしくはそれらの断片および／または工学的に操作された可変ドメインもしくはＦａｂ断片もしくはＦｃ領域のような人工免疫グロブリンもしくはそれらの断片と結合する、溶媒とアクセス可能な細菌の表面に繋留または埋め込まれたタンパク質を含む。別の態様では、細菌の表面タンパク質は、可溶性バリアントとして遊離され得る。さらに、本発明の目的のために、「細菌の表面タンパク質」は、天然配列に対して欠失、付加および置換（保存的な性質であり得る）のような改変を含み、自然に存在する免疫グロブリンもしくはそれらの断片および／または人工免疫グロブリンもしくはそれらの断片との結合を保持するタンパク質を含む。
免疫グロブリンと相互作用する既知の細菌の表面タンパク質の例は、グラム陽性細菌で見出され、ここで、これらのタンパク質は、細菌が独特の場所にてとどまるか、または免疫系を回避するための手段として働く。免疫グロブリンまたはそれらの断片と結合するいくつかの細菌の表面タンパク質は、抗体の分析、精製および調製、またはその他の診断および生物学的研究用途において用いられている。免疫グロブリンまたはそれらの断片と結合する細菌の表面タンパク質は、それらに限定されないが、以下の例を含む。
プロテインＡ：プロテインＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのいく
つかの株により生成される細胞壁成分であり、単一ポリペプチド鎖から構成される。プロテインＡ遺伝子生成物は、病原体の細胞壁とタンデムな様式で結合する５つの相同反復から構成される。５つのドメインはおよそ５８アミノ酸の長さであり、ＥＤＡＢＣと表示され、それぞれ免疫グロブリン結合活性を示す（Ｔａｓｈｉｒｏ ＭおよびＭｏｎｔｅｌｉｏｎｅ ＧＴ（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５（４）：４７１〜４８１頁）。５つの相同免疫グロブリン結合ドメインは、３らせんの束に折り畳まれる。各ドメインは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質、最も顕著にはＩｇＧと結合できる（Ｈｏｂｅｒ Ｓら、（２００７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、８４８（１）：４０〜４７頁）。プロテインＡは、ほとんどの免疫グロブリンの重鎖とＦｃ領域内で結合するが、ヒトＶＨ３ファミリーの場合にＦａｂ領域内でも結合する（Ｊａｎｓｓｏｎ Ｂら、（１９９８）ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０（１）：６９〜７８頁）。プロテインＡは、ヒト、マウス、ウサギおよびモルモットを含む様々な種由来のＩｇＧと結合するが、ヒトＩｇＧ３と結合しない（Ｈｏｂｅｒ Ｓら、（２００７）既出）。ヒトＩｇＧ３がプロテインＡと結合できないことは、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域中のＨ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ置換により説明できる（ＥＵ番号付け、Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１（１）：２５〜３４頁）。ＩｇＧの他に、プロテインＡは、ＩｇＭおよびＩｇＡとも相互作用する。
プロテインＡが抗体とこのような高い親和性で結合する能力は、生物薬におけるその工業的規模での使用のための動機づけとなる。生物薬における抗体の生成のために用いるプロテインＡは、通常、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換え生成され、天然プロテインＡと本質的に同じように機能する（Ｌｉｕ ＨＦら、（２０１０）ＭＡｂｓ、２（５）：４８０〜４９９頁）。
最も一般的に、組換えプロテインＡは、抗体の精製のための定常相クロマトグラフィー樹脂に結合させる。最適な結合は、ｐＨ８．２にて生じるが、結合は、中性または生理的条件（ｐＨ７．０〜７．６）でも良好である。溶出は、通常、酸性ｐＨ（グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５〜３．０）に向かうｐＨシフトにより達成される。このことは、タンパク質構造に永続的に影響を与えることなく、ほとんどのタンパク質−タンパク質および抗体−抗原結合相互作用を効率的に解離する。それにもかかわらず、いくつかの抗体およびタンパク質は、低ｐＨにより損傷を受け、１／１０容量のアルカリ性緩衝液、例えば１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えることにより回収後に直ちに中和して、低ｐＨ条件下にある期間を最小限にすることが最適である。
様々な市販のプロテインＡクロマトグラフィー樹脂が存在する。これらの媒体間の主な違いは、支持マトリクスのタイプ、プロテインＡリガンド修飾、孔サイズおよび粒子サイズである。これらの因子の違いは、圧縮率、化学的および物理的頑強性、拡散抵抗および吸着剤の結合能の違いを生じる（Ｈｏｂｅｒ Ｓら、（２００７）、既出）。プロテインＡクロマトグラフィー樹脂の例は、それらに限定されないが、実施例において用いるように、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡ樹脂を含む。
プロテインＧ：プロテインＧは、ＣおよびＧ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉから単離された細菌細胞壁タンパク質である。異なるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉから単離された天然のプロテインＧのＤＮＡ配列決定により、免疫グロブリン結合ドメインならびにアルブミンおよび細胞表面結合のための部位が同定された。株に依存して、免疫グロブリン結合領域およびアルブミン結合領域はともに、２〜３つの独立して折り畳まれた単位から構成される（Ｔａｓｈｉｒｏ ＭおよびＭｏｎｔｅｌｉｏｎｅ ＧＴ（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５（４）：４７１〜４８１頁）。Ｇ１４８株由来のプ
ロテインＧは、それぞれＡＢＤ１、ＡＢＤ２およびＡＢＤ３ならびにＣ１、Ｃ２およびＣ３と表示される、３つのアルブミンおよび免疫グロブリン結合ドメインから構成される（Ｏｌｓｓｏｎ Ａら、（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６８（２）：３１９〜３２４頁）。Ｃ１、Ｃ２およびＣ３と表示される各免疫グロブリン結合ドメインは、およそ５５残基であり、約１５残基のリンカーにより分けられている。プロテインＧ免疫グロブリン結合ドメインの全ての実験的に解明された３Ｄ構造は、いずれのジスルフィドブリッジも、堅く結合した補欠分子族も有さない、非常に密に詰まった球状構造を示す（Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ＡＥら、（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、３（３）：２６５〜２７８頁；Ｄｅｒｒｉｃｋ ＪＰおよびＷｉｇｌｅｙ ＤＢ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ、３５９（６３９７）：７５２〜７５４頁；Ｄｅｒｒｉｃｋ ＪＰおよびＷｉｇｌｅｙ ＤＢ（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４３（５）：９０６〜９１８頁；Ｌｉａｎ ＬＹら、（１９９４）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１（６）：３５５〜３５７頁）。構造は、アルファ−らせんにより接続された２つの逆平行ベータヘアピンで構成された４本鎖ベータシートを含む。
ＣおよびＧ群由来の連鎖球菌株は、プロテインＡとは対照的に、ＩｇＧ３を含むＩｇＧの全てのヒトサブクラスとの結合を示す。プロテインＧは、マウス、ウサギおよびヒツジを含むいくつかの動物ＩｇＧとも結合する（Ｂｊｏｒｃｋ ＬおよびＫｒｏｎｖａｌｌ Ｇ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３（２）：９６９〜９７４頁；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ Ｂら、（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５（４）：２５８９〜２５９２頁；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ ＢおよびＢｊｏｒｃｋ Ｌ（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１（２２）：１０２４０〜１０２４７頁；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ＳＲら、（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６７（３）：８７０〜８８０頁）。よって、プロテインＧは、プロテインＡと比較して、異なる種のサブクラスに対する、より広い結合スペクトルを示す。
さらに、プロテインＧは、ＩｇＧのＦａｂ部分と高い親和性で結合する。連鎖球菌プロテインＧの結合ドメインの構造は、単独（ＮＭＲによる、Ｌｉａｎ ＬＹら、（１９９４）既出）およびＩｇＧ１ Ｆａｂとの複合体（ｘ線結晶解析による、Ｄｅｒｒｉｃｋ ＪＰおよびＷｉｇｌｅｙ ＤＢ（１９９２）既出ならびにＤｅｒｒｉｃｋ ＪＰおよびＷｉｇｌｅｙ ＤＢ（１９９４）既出）の両方で決定されている。全ての実験的に解明された３Ｄ構造は、ＩｇＧ重鎖のＣＨ１ドメイン内での結合を示した。
プロテインＡと同様に、Ｅ．ｃｏｌｉで生成される組換えプロテインＧは、抗体を精製するために日常的に用いられる。アルブミンおよび細胞表面結合ドメインは、非特異的結合を低減するために組換えプロテインＧから取り除かれており、よって、粗試料からＩｇＧを分離するために用いることができる。プロテインＡと同様に、組換えプロテインＧは、抗体の精製のための定常相クロマトグラフィー樹脂に結合させる。最適な結合は、ｐＨ５にて生じるが、結合は、ｐＨ７．０〜７．２においても良好である。プロテインＡについてと同様に、溶出も、酸性ｐＨ（グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５〜３．０）に向かうｐＨシフトにより達成される。プロテインＧクロマトグラフィー樹脂の例は、それらに限定されないが、実施例において用いるように、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのプロテインＧ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂およびＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラムを含む。
プロテインＬ：プロテインＬは、細菌Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓに元々由来するが、現在では組換え生成される、免疫グロブリン結合タンパク質である（Ｂｊｏｒｃｋ Ｌ（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０（４）：１１９４〜１１９７頁；Ｋａｓｔｅｒｎ Ｗら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７（１８）：１２８２０〜１２８２５頁）。プロテインＬは、抗体の抗原結合部位に干渉する
ことなく、カッパ軽鎖相互作用により結合する独特の能力を有する（Ｎｉｌｓｏｎ ＢＨら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６４（１）：３３〜４０頁）。このことにより、プロテインＬは、他の抗体結合タンパク質よりも広い範囲の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスと結合する能力を有する。プロテインＬは、全てのクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤ）と結合する。プロテインＬは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）およびＦａｂ断片とも結合する（Ｎｉｌｓｏｎ ＢＨら、（１９９３）既出；Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ ＳＰら、（１９９５）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、５（６）：３５９〜３６７頁）。プロテインＬは、カッパＩ、ＩＩＩおよびＩＶサブクラスのヒト可変ドメインならびにマウスカッパＩサブクラスと結合する（Ｎｉｌｓｏｎ ＢＨら、（１９９２）既出）。プロテインＬクロマトグラフィー樹脂の例は、それらに限定されないが、実施例において用いるように、ＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔのプロテインＬ樹脂を含む。
Ｍ１タンパク質およびプロテインＨ：Ｍ１タンパク質およびプロテインＨは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのある種の株の表面に同時に存在する表面タンパク質である。プロテインＨは、ＩｇＧのＦｃ領域に対する親和性を有する（Ａｋｅｓｓｏｎ Ｐら、（１９９０）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７（６）：５２３〜５３１頁；Ａｋｅｓｓｏｎ Ｐら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００（Ｐｔ３）：８７７〜８８６頁）。プロテインＨは、ヒト、サルおよびウサギ由来のＩｇＧのＦｃ領域と結合する（Ａｋｅｓｓｏｎ Ｐら、（１９９０）、既出；Ｆｒｉｃｋ ＩＭら、（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．、１４（８）：１６７４〜１６７９頁）。Ｍタンパク質も、フィブリノゲンと結合することが知られており（Ｋａｎｔｏｒ ＦＳ（１９６５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１２１：８４９〜８５９頁）、以前の研究により、ＡＰＩ株由来のＭ１タンパク質がアルブミンおよびポリクローナルＩｇＧに対する親和性を有することが示されている（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＫＨおよびＷａｄｓｔｒｏｍ Ｔ（１９９０）Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．、２７３（２）：２１６〜２２８頁）。
細菌の表面タンパク質は、親和性試薬の例である。その他の例は、それらに限定されないが、人工的に作製されたタンパク質、例えば抗体およびそれらの断片、例えばＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔおよびＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ親和性樹脂またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ−ＣＨ１を含む。
用語「ヒトＦｃＲｎ」は、ＩｇＧ受容体ＦｃＲｎ大サブユニットｐ５１（ＩｇＧ Ｆｃ断片受容体トランスポーターアルファ鎖またはＦｃＲｎ膜貫通アルファ鎖ともよばれる；ＵｎｉＰｒｏｔデータベース受託番号Ｐ５５８９９）から構成されるヒトヘテロ二量体タンパク質を含み、ベータ２−ミクログロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース受託番号Ｐ６１７６９）と非共有的に結合する。ヒトＦｃＲｎは、ＩｇＧについてのＭＨＣクラスＩ関連受容体であり、その発現は、げっ歯類および全ての年齢のヒトにおける上皮細胞、内皮細胞、マクロファージおよび樹状細胞を含む多様な細胞型において同定されている（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ＤＣおよびＡｋｉｌｅｓｈ Ｓ（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７（９）：７１５〜７２５頁）。ヒトＦｃＲｎは、内皮細胞でのエンドサイトーシスの経路において出現することにより、成体でのＩｇＧの再利用において役割を演じる（Ｔｅｓａｒ ＤＢおよびＢｊｏｒｋｍａｎ ＰＪ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２０（２）：２２６〜２３３頁）。酸性のエンドソームにあるＦｃＲｎ受容体は、内在化したＩｇＧと結合し、それを細胞表面にて再生する。ＩｇＧは、ＦｃＲｎ受容体から、血液の塩基性ｐＨにて放出され、そのことによりリソソーム分解を逃れる。この機構は、他のアイソタイプと比較してより長い血液中のＩｇＧの半減期を説明する。ＦｃＲｎは、免疫グロブリン分子と２：１複合体を形成し、すなわち、２
つのＦｃＲｎ分子は、１つのＦｃ領域と結合するか、またはＦｃ領域由来の２つの重鎖はそれぞれ、１分子のＦｃＲｎと結合する（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ＤＣおよびＡｋｉｌｅｓｈ Ｓ（２００７）既出）。ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域と、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の接合部にて結合する。ＦｃＲｎの機能にとって重要なことは、ＩｇＧのｐＨ依存性結合である。ｐＨ６．０では、ＦｃＲｎはＩｇＧと結合するが、ＩｇＧとＦｃＲｎとの結合は、ｐＨ７．５にて検出不能である。ＦｃＲｎ／ＩｇＧ相互作用の厳密なｐＨ依存性は、６．０〜６．５のｐＨ範囲にわたって脱プロトン化する、ヒスチジンのイミダゾール側鎖の関与を示唆する。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの３１０位および４３５位での表面とアクセス可能なヒスチジン残基の変異は、ＩｇＧとＦｃＲｎとの結合を著しく低減させまたは喪失させた。ヒトＦｃＲｎ、プロテインＡおよびプロテインＧ結合部位は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域中でオーバーラップする（Ｎｅｚｌｉｎ ＲおよびＧｈｅｔｉｅ
Ｖ（２００４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．第８２巻：１５５〜２１５頁）。
用語「クロマトグラフィー」は、タンパク質液体クロマトグラフィーのことをいい、タンパク質の混合物を分析および精製するために頻繁に用いられる液体クロマトグラフィーの一形態である高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を含む。他の形態のクロマトグラフィーと同様に、混合物中の異なる成分が、２つの物質、多孔質の固体（定常相）の中を通過する移動流体（移動相）に対して異なる親和性を有するので、分離が可能である。ＦＰＬＣでは、移動相は、水性溶液または「緩衝液」である。緩衝液の流速は、重力流の下で運転できるか、または一定の速度に通常保たれる容積型ポンプにより制御できる。一方、緩衝液の組成は、２つ以上の外部の貯水槽から異なる割合で流体を引き出すことにより変動できる。定常相は、ビーズ、通常、架橋アガロースで構成される樹脂であり、円柱形のガラスまたはプラスチックカラムに充填される。ＦＰＬＣ樹脂は、用途に応じて広い範囲のビーズサイズおよび表面リガンドで入手可能である。
最も一般的なＦＰＬＣ方策であるイオン交換または親和性クロマトグラフィーでは、緩衝液Ａ（ランニング緩衝液）中で対象のタンパク質が樹脂と結合するが、緩衝液Ｂ（溶出緩衝液）中で解離して溶液に戻るように樹脂が選択される。１または複数種の対象のタンパク質を含有する混合物を、１００％緩衝液Ａに溶解し、カラムにロードする。対象のタンパク質は樹脂と結合し、その他の成分は緩衝液中で運び出される。緩衝液の全流速は一定に保つ。しかし、緩衝液Ｂ（「溶出」緩衝液）の割合を、０％から１００％まで徐々にまたは段階的な様式でプログラムされた濃度変化（「勾配」）に従って増加させることができる。このプロセス中のある時点で、結合したタンパク質のそれぞれは、解離して、排出液中に出現する。典型的な実験室ＦＰＬＣ検出システムは、１または２つの高精度ポンプ、制御ユニット、カラム、検出システムおよび分画回収器から構成される。システムを手動で運転することが可能であるが、これらの構成要素は、通常、パーソナルコンピュータまたはより古いユニットでは、マイクロコントローラと連結されている。これらの半自動化ＦＬＰＣシステムを用いて運転する場合（例えばＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡシステムを用いる場合）、排出液は、通常、塩濃度（導電率により）およびタンパク質濃度（２８０ｎｍの波長での紫外光の吸収により）を測定する２つの検出器を通過する。紫外線の吸収 対 用いた移動相の全容量を記録するプロットは、精製プロセスを視覚的に表示する。これらのプロットは、クロマトグラムまたはクロマトグラフィートレースとよばれる。各タンパク質が溶出されるにつれて、該タンパク質は、タンパク質濃度の「ピーク」として（かついわゆるクロマトグラムまたはクロマトグラフィートレース中の図形的な「ピーク」としても）排出液中に出現し、これをさらなる使用のために回収できる。
ＦＰＬＣは、１９８２年にＰｈａｒｍａｃｉａ（現在ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりスウェーデンにおいて開発および販売され、ＨＰＬＣまたは高性能液体クロマトグラ
フィーと対比するために高速高性能液体クロマトグラフィーと元々よばれた。ＦＰＬＣは、一般的に、タンパク質に対してのみ用いられる。しかし、樹脂および緩衝液の広い選択肢があるために、ＦＰＬＣは、より広い用途を有する。ＨＰＬＣとは対照的に、用いる緩衝液圧力は比較的低く、典型的に５バール未満であるが、流速は比較的高く、典型的に１〜５ｍｌ／分である。ＦＰＬＣは、カラム中のミリグラム量の混合物の全容量５ｍｌ以下での分析から、カラム中のキログラム量の精製タンパク質の何リットルもの容量での工業的生成まで容易にスケールアップできる。溶出タンパク質またはその混合物は、異なる分析技術、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析および当該技術において既知のその他の既知の分析技術によりさらに分析できる。
「親和性クロマトグラフィー」のプロセスは、定常相に架橋され、特異的分子または分子のクラスに対する結合親和性を有するリガンドとしての親和性試薬の使用を含む。リガンドは、生体分子、例えばタンパク質リガンドであり得るか、または合成分子であり得る。両方のタイプのリガンドは、良好な特異性を有する傾向にある。生成において最も一般的に用いられるタンパク質リガンドは、親和性試薬プロテインＡである。親和性クロマトグラフィーでは、溶液（例えば対象のタンパク質を含有する粗細胞上清）をカラムにロードすると、標的タンパク質は、通常、吸着されるが、混入物（その他のタンパク質、脂質、炭水化物、ＤＮＡ、色素など）はカラムを通過できる。吸着剤自体は、通常、クロマトグラフィーカラムに充填されるが、吸着段階は、バッチ結合モードで撹拌したスラリーとして吸着剤を用いることにより行うことができる。吸着の後の次の段階は、洗浄段階であり、ここでは、吸着剤を洗浄して残存混入物を除去する。結合したタンパク質は、次いで、半純粋または純粋な形で溶出される。溶出は、タンパク質が固定化リガンドともはや相互作用できず、遊離されるように緩衝液または塩組成を変化させることにより、通常、達成される。いくつかの場合では、対象のタンパク質は、親和性樹脂と結合しないことがあり、親和性クロマトグラフィーは、不要な混入物との結合に充てられ、よって、未結合の画分を回収して、対象のタンパク質を単離する。親和性クロマトグラフィーは、固定床または流動床で行うことができる。
用語「勾配モードクロマトグラフィー」は、「溶出」緩衝液（緩衝液Ｂ）の割合を０％から１００％まで徐々にまたは段階的な様式で増加させるクロマトグラフィー法のことをいう。
用語「捕捉−溶出モードクロマトグラフィー」または「捕捉−溶出精製モード」または「捕捉−溶出精製」は、「溶出」緩衝液（緩衝液Ｂ）の割合を０％から１００％まで徐々にまたは段階的な様式で増加させないが、捕捉の後に１００％で直接用いて、場合によってランニング緩衝液（緩衝液Ａ）を用いる洗浄ステップを行うクロマトグラフィー法のことをいう。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製
二重特異性抗体の生成の最も一般的な方法の１つは、単一細胞中で２つの別個の抗体を発現させることである。このような方法は、別個の抗体の重鎖がホモおよびヘテロ二量体の両方を形成するので、複数の種を生じる。必要なのはヘテロ二量体だけであるので、これらを、ホモおよびヘテロ二量体の混合物から分離する必要がある。本発明は、通常のプロテインＡおよびプロテインＧ親和性クロマトグラフィーを利用することにより、ホモおよびヘテロ二量体の混合物からヘテロ二量体免疫グロブリンを分離するための高度に効率的な方法を提供する。
第１ステップ（実施例１）として、プロテインＡまたはプロテインＧ結合を喪失させる置換を設計し、両方の単量体が置換を有するホモ二量体免疫グロブリンＦｃ断片において試験した。プロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させる新しい置換を選択し、最
小限の数である２まで低減した。
第２ステップ（実施例２）では、ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＡまたはＧとの結合を低減させるまたは喪失させる置換を、ＦＡＢまたはｓｃＦｖ断片に基づくホモ二量体免疫グロブリン中でアッセイした。このことにより、両方の技術についての重要なネックとなるところを同定できた。プロテインＡとの結合を低減またはなくすための置換を有する重鎖内にＶＨ３サブクラスの可変重鎖ドメインが存在することにより、プロテインＡに基づくいずれの差次的親和性方法も妨げられることがわかった。一方、プロテインＧとの結合を低減またはなくすための置換を有する重鎖内にガンマＣＨ１定常ドメインが存在することにより、プロテインＧに基づく新しい差次的親和性方法が妨げられる。これらの主な障害に対する解決法は、プロテインＡに基づく差次的親和性方法についてプロテインＡとＶＨ３サブクラスとの結合を低減させるまたは喪失させるフレームワーク置換の形で、かつプロテインＧに基づく新しい差次的親和性方法についてプロテインＧとガンマＣＨ１ドメインとの結合を低減させるまたは喪失させるＣＨ１ベースの置換の形で見出された。
最後のステップ（実施例３）では、プロテインＡおよびＧ差次的親和性方法をともに、それら自体でかつ上記の溶液との組み合わせで用いて、ヘテロ二量体免疫グロブリンを精製することに成功した。より重要なことには、プロテインＡおよびＧ差次的親和性方法を組み合わせて、逐次的に用いた場合に、２つの逐次的な捕捉および直接溶出のクロマトグラフィーステップのみに依拠して、勾配溶出を必要とせずにヘテロ二量体免疫グロブリンの精製ができたことを示した。
ヒトＦｃＲｎとの結合は、免疫グロブリンを分解から保護し、免疫グロブリンの半減期を増加させるので、プロテインＡまたはＧとの結合を喪失させるＦｃ領域中の変異がＦｃＲｎとの結合を破壊しないことが必須である。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定（実施例４）から、本明細書に示すプロテインＧに基づく新しい差次的親和性方法において用いる置換が、ヒトＦｃＲｎ結合の＞９０％の保持を可能にしたが、プロテインＡに基づく以前に記載された差次的親和性方法は、ヒトＦｃＲｎ結合を約７５％だけ保持したことが見出された。プロテインＧに基づく新しい差次的親和性方法を作製することヒト治療用のヘテロ二量体免疫グロブリンを開発する場合に選択される技術。免疫グロブリンのＦｃ領域中のプロテインＧ結合を排除する置換は、ＦｃとヒトＦｃγＲ３ａとの結合に影響を与えなかった。
実施例５から７は、ガンマ免疫グロブリンのＦｃ領域およびＣＨ１領域中のプロテインＧ結合を排除する置換の特徴を決定する。実施例８は、本発明に基づく治療用ヘテロ二量体免疫グロブリンの設計および機能的試験を示す。
実施例
方法：
一般的な方法
発現ベクターの構築
適当なｃＤＮＡ鋳型を用いる標準的なオーバーラップＰＣＲ技術により、ｃＤＮＡコード配列中に変異を導入した。ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ ＤＮＡ制限酵素で消化し、精製し、同じＤＮＡ制限酵素で予め消化した、ＣＭＶプロモーターおよびウシホルモンポリアデニル化を保有する改変ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にライゲーションした。軽鎖を、同じ発現ベクターに独立してライゲーションした。全ての発現ベクターにおいて、分泌は、ネズミＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより駆動された。
組換え抗体およびその断片の発現
一過性発現のために、等量の工学的に操作した各鎖のベクターを、懸濁馴化ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて同時トランスフェクトした。典型的に、１ｍｌあたり０．８〜１．２百万細胞の密度の１００ｍｌの細胞懸濁物にＤＮＡ−ＰＥＩ混合物をトランスフェクトする。工学的に操作した各鎖遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、細胞を４〜５日間さらに培養して培養培地（０．１％プルロニック酸、４ｍＭグルタミンおよび０．２５μｇ／ｍｌジェネテシンを補ったＥＸ−ＣＥＬＬ２９３、ＨＥＫ２９３血清フリー培地（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））中に分泌させることにより、免疫グロブリン構築物を生成する。分泌された免疫グロブリンを含有する細胞フリー培養上清は、遠心分離の後にろ過することにより調製し、さらなる分析に用いた。
実施例１の方法：プロテインＡまたはＧ結合が排除されたＦｃ断片の精製および試験
捕捉−溶出モードクロマトグラフィー
上清を、０．１容量（Ｖ）の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を用いて前処理した後に精製した。プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（プロテインＡ結合部位変異体）またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂（プロテインＧ結合部位変異体）（ともにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから；それぞれカタログ番号１７−０６１８−０１および１７−５４３８−０１）を、前処理した上清にそれぞれ加えた。混合物を一晩４℃にてインキュベートした。インキュベーションの後に、結合したタンパク質を１０ＣＶのＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄し、４カラム容量（ＣＶ）の０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出し、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビス−トリス４〜１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により非還元条件下で分析した。
勾配モードクロマトグラフィー
生成の後に、ホモ二量体Ｆｃバリアントを含有する細胞培養上清を、まず、プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（プロテインＡ結合部位変異体）またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ樹脂（プロテインＧ結合部位変異体）（以下を参照されたい、ともにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨの樹脂；それぞれカタログ番号１７−０６１８−０１および１７−５４３８−０１）を用いる捕捉−溶出モードクロマトグラフィーで精製した。捕捉−溶出モードクロマトグラフィーから溶出された物質を、続いて、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム（プロテインＡ結合部位変異体）または１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム（プロテインＧ結合部位変異体）にロードした。両方のカラムを、０．２Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ８．０で予め平衡化し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（商標）クロマトグラフィーシステム（ともにＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨから；それぞれカタログ番号１１−００３４−９３および１７−０４０４−０１）上で、１ｍｌ／分の流速にて操作した。溶出は、様々な量の２種の緩衝液（ランニング緩衝液（Ａ）：０．２Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ８．０および溶出緩衝液（Ｂ）：０．０４Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０（実施例１．１）または０．０２Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ２．６（実施例１．２）を組み合わせるｐＨ直線勾配を用いて行った。直線勾配は、０％Ｂから１００％Ｂまで５カラム容量（ＣＶ）で（実施例１．１）、または１０ＣＶ（実施例１．２）で進めた。溶出画分を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビス−トリス４〜１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により非還元条件下で分析した。
実施例２の方法：プロテインＡまたはＧ結合が排除されたホモ二量体免疫グロブリンの精製および試験
実施例２．１：プロテインＡ結合が排除されたホモ二量体免疫グロブリン
プロテインＡ結合が排除されたＦＡＢ断片の精製および試験。
生成の後に、細胞培養上清を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で前処理した。プロテインＬ樹脂（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）を前処理した上清に加え、一晩４℃にてインキュベートした。インキュベーションの後に、結合したタンパク質を１０ＣＶのＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄し、４ＣＶの０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出し、最後に、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。プロテインＡ結合を評価するために、プロテインＬ精製ＦＡＢを１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ
ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にｐＨ８．０（クエン酸／Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液）にて注入した。溶出は、様々な量の２種の緩衝液（ランニング緩衝液（Ａ）：０．２Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ８．０および溶出緩衝液（Ｂ）：０．０４Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０）を組み合わせるｐＨ直線勾配を用いて行った。直線勾配は、０％Ｂから１００％Ｂまで５ＣＶで進めた。溶出画分を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビス−トリス４〜１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により非還元条件下で分析した。
プロテインＡ結合が排除されたＦＡＢ断片のＳＰＲ試験
ＩＧＨＧ１ Ｆｃ断片と融合したヒトＨＥＲ２細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、上記の重鎖および軽鎖発現ベクターと同様の発現ベクターにクローニングし、ＰＥＩ法（ＰＣＴパンフレットＷＯ１２／１３１５５５を参照されたい）を用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトした。上清を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で前処理し、実施例１に記載したように抗原をプロテインＡ捕捉−溶出クロマトグラフィーにより精製した。ＳＰＲ実験のために、モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体センサチップを用いた。これは、Ｆｃと融合した組換えＨＥＲ２抗原を正しい向きで捕捉することを可能にした（ヒト抗体捕捉キット、カタログ番号ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）。測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で記録した。異なる希釈の抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５７、０．７８、０．３９ｎＭ）をセンサチップ上に４分間、３０μｌ／分にて注入した。各測定について、７分間の解離の後に、３Ｍ ＭｇＣｌ2溶液を１分間、３０μｌ／分にて再生のために注入した。データ
（センサグラム：ｆｃ２−ｆｃ１）を、１：１ラングミュアを用いてフィットさせた。捕捉されたＨＥＲ２−ｃの各測定の初めの実験的変動を埋め合わせるために、全てのフィッティングにおいてＲｍａｘ値をローカルに設定した。測定は、１点につき２個の試料を用いて行い、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ２および残差の値をともに用いて、実験データと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
ＦｃおよびＶＨ３ドメイン中でプロテインＡが排除されたＶＨ３ベースのホモ二量体免疫グロブリンの精製および試験。
勾配モードクロマトグラフィーおよび捕捉−溶出モードクロマトグラフィーは、実施例１について記載した手順に従って行った。
実施例２．２：プロテインＧ結合が排除されたホモ二量体免疫グロブリン
クロマトグラフィー
勾配モードクロマトグラフィーおよび捕捉−溶出モードクロマトグラフィーは、実施例１について記載した手順に従って行った。
プロテインＧ結合が排除されたＦＡＢ断片のＳＰＲ試験
アミノ酸配列ＳＡＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１００）と融合したヒトＨＥＲ３細胞外領域をコードするｃＤＮＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２１８６０（ＥＲＢＢ３＿ＨＵＭＡＮ）残基２０〜６３２、配列番号７３、本明細書においてＨＥＲ３抗原という；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、４１（データベース版）：Ｄ４３〜７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）を、上記の重鎖および軽鎖発現ベクターと同様の発現ベクターにクローニングし、ＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトした。生成の後に、細胞フリー上清を調製し、ろ過し、滅菌し、０．１容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８で前処理し、Ｎｉ2+−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１７−５３１８−０２）で精製した。
ＳＰＲ実験のために、抗体バリアントを、プロテインＡ結合ＣＭ５研究グレードセンサチップ（チップ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ；Ｃａｔ．Ｎｏ：ＢＲ−１０００−１４；プロテインＡ Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｐ７８３７）上に捕捉し、分析物として組換えＨＥＲ３抗原を用いた。測定は、以下のように行った：（捕捉）１５０ＲＵの抗体、（流速）３０μｌ／分ＨＢＳ−Ｐ緩衝液、（再生）グリシンｐＨ１．５、（注入）５分間、（解離）８分間、（注入したＨＥＲ３抗原濃度）５０、２５、１０、５、１および０．５ｎＭ、（データフィッティング）物質移動なしの１：１結合。捕捉された抗体の各測定の初めの実験的変動を埋め合わせるために、全てのフィッティングにおいてＲｍａｘ値をローカルに設定した。測定は、１点につき３個の試料を用いて行い、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ２および残差の値をともに用いて、実験データと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
実施例３の方法：プロテインＡまたはＧ結合が排除されたヘテロ二量体免疫グロブリンの精製および試験
実施例３．１および３．２：プロテインＡまたはＧを用いるヘテロ二量体免疫グロブリンの１ステップ精製
生成の後に、細胞培養上清を、０．１Ｖの０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4を用いてｐＨ６．０に調節し、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラム（実施例３．１）または１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧ ＨＰカラム（実施例３．２）に１ｍｌ／分にてロードした。ロードした後に、結合したタンパク質を、０．１２５Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０を用いて十分に洗浄した。溶出は、２種の緩衝液（ランニング緩衝液（Ａ）：０．１２５Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０および溶出緩衝液（Ｂ）：０．０４Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０）を組み合わせる２種の均一濃度勾配を用いて行った。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、以下：実施例３．１において５５％Ｂ、実施例３．２において示す第１および第２の場合において９０％Ｂおよび８０％Ｂのように変動する第１均一濃度勾配を７０ＣＶにわたって用いて溶出した。非排除ホモ二量体分子は、全ての実施例において２０ＣＶにわたって１００％Ｂの第２均一濃度勾配で溶出した。溶出画分を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビス−トリス４〜１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により非還元条件下で分析した。
実施例３．３：プロテインＡおよびプロテインＧを用いるヘテロ二量体免疫グロブリンの逐次的精製。
生成の後に、細胞培養上清を、０．１Ｖの０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4を用いてｐＨ６．０
に調節し、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムに１ｍｌ／分にてロードした。ロードした後に、結合したタンパク質を、０．１２５Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０を用いて十分に洗浄した。プロテインＧ結合部位を有さないヘテロ二量体免疫グロブリンおよびホモ二量体免疫グロブリンを、１０ＣＶの０．０４Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０で溶出した。ヘテロおよびホモ二量体混合物を含有する画分をプールし、１０Ｖの０．１２５Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０でさらに希釈した。希釈混合物を、次いで、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にロードし、結合したタンパク質を、０．１２５Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０を用いて十分に洗浄した。ヘテロ二量体免疫グロブリンを、１０ＣＶの０．０４Ｍリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０で溶出した。溶出画分を、０．１Ｖの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ビス−トリス４〜１２％アクリルアミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により非還元条件下で分析した。
実施例４の方法：ヒトＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体３ａについてのＳＰＲ実験
ヒトＦｃＲｎについてのＳＰＲ実験
簡単に述べると、組換えヒトＦｃＲｎをＣＨＯ−Ｓ細胞で発現させた。ヒトＦｃＲｎアルファ鎖およびベータ２ミクログロブリンタンパク質をコードするｃＤＮＡ（それぞれＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ５５８９９（ＩｇＧ受容体ＦｃＲｎ大サブユニットｐ５１）残基２４〜２９７およびＰ６１７６９（ベータ−２−ミクログロブリン）残基２１〜１１９）を、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有する２つの別々の哺乳動物発現ベクターにクローニングした。ＣＨＯ−Ｓ細胞を、以前に記載したＰＥＩ法を用いて安定的に同時トランスフェクトし、安定クローンを、７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下での成長により選択した。成長培地は、ＰｏｗｅｒＣＨＯ２（Ｌｏｎｚａ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）であった。精製の前で生成の後の上清を、０．２Ｍ ＮａＨ2
ＰＯ4、０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６．０で前処理して、ｐＨを６．０に調節した。Ｆｃ
Ｒｎを、ヒトＩｇＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製し、ＰＢＳ ｐＨ７．４で溶出した。測定は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で記録した。各免疫グロブリンバリアントを、ＣＭ５センサチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上に、製造者により提供される標準的なプロトコールを用いてアミン結合により固定化して、およそ１５００ＲＵの応答に達した。ＦｃＲｎは、エンドソーム中で免疫グロブリンのＦｃ領域と酸性ｐＨにて結合するが（ｐＨ６．０）、血液の塩基性ｐＨで結合を示さず（ｐＨ７．４）、よって、全ての測定は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０−０．１Ｍ ＮａＣｌ（ランニング緩衝液）を用いて行った。異なる希釈のヒトＦｃＲｎ（６０００、３０００、１５００、７５０、３７５、１８７．５、９３．８、４６．９ｎＭ）を３分間、１０μｌ／分にて注入した。３分間の解離の後に、ＰＢＳ ｐＨ７．４を１分間、３０μｌ／分にて表面再生のために注入した。ＫＤ値を、定常状態親和性モデルを用いて決定した。平衡定数は、濃度の範囲にわたる定常状態応答 対 ヒトＦｃＲｎの濃度を１：１結合モデル（化学量論（ｎ）＝１）にフィッティングさせることにより決定した。測定は、１点につき３個の試料を用いて行い、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ２および残差の値をともに用いて、実験データと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
ヒトＦｃガンマ受容体３ａについてのＳＰＲ実験
ヒトＦｃガンマ受容体３ａ（ＦｃγＲ３ａと省略する、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ０
８６３７（ＦＣＧ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ）残基１７〜１９２）をクローニングし、上記のＨＥＲ３抗原と同様に発現させた。精製を、０．１ＭグリシンｐＨ３の溶出ステップを用いるＩｇ−Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１７−０９６９−０１）で行った。ＦｃγＲ３ａを、ゲルろ過（ＳＵＰＥＲＤＥＸ７５ １０／３００ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１７−５１７４−０１）によりさらに精製して、痕跡量のＩｇＧ混入物を除去した。測定は、以下のように行った：（チップ）１７０００ＲＵの抗体と結合したＣＭ５チップ、（流速）１０μｌ／分ＨＢＳ−Ｐ、（再生）なし、（注入）８分間、（解離）１０分間、（注入したＦｃγＲ３ａ濃度）２５００、１２５０、６２５、３１２、１５６、７８および３９ｎＭ、（データフィッティング）定常状態親和性。
実施例５の方法：プロテインＡおよびＧ排除置換の免疫原性予測
プロテインＡおよびプロテインＧ排除変異の予測される免疫原性を、ＬｏｎｚａのＥｐｉｂａｓｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて調べた。
実施例６の方法：プロテインＡおよびＧ排除置換の熱安定性分析
免疫グロブリンの熱安定性を、熱量分析により比較した。測定は、ＶＰ−ＤＳＣ示差走査マイクロ熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）で行った。セル容量は０．１２８ｍｌであり、昇温速度は１℃／分であり、過剰圧力は６４ｐ．ｓ．ｉ．に保った。全てのタンパク質断片は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いた。各タンパク質のモル熱容量は、タンパク質を除いた同一緩衝液を含有する、１点につき２個の試料との比較により見積もった。部分モル熱容量および融解曲線は、標準的な手順を用いて分析した。サーモグラムは、ベースライン補正し、濃度を標準化した後に、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ ｖ７．０（ＭｉｃｒｏＣａｌ−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）において非２状態モデルを用いてさらに分析した。
実施例７の方法：プロテインＧ排除置換の薬物動態分析
薬物動態分析は、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで行った。各群は、４匹のラットを含んだ。ラットに１０ｍｇ／ｋｇの抗体を静脈内急速投与注射により与えた。血液試料を注射の０．２５時間、１時間、４時間、６時間ならびに１、２、４、７、１０、１４、２１、２８、３５および４２日後に回収した。
抗体の血清レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した。２μｇ／ｍｌの濃度にてＨＥＲ２抗原で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを被覆し、一晩４℃にてインキュベートした。プレートをＢＳＡでブロックした後に、血清試料、参照標準物質（１１の系列希釈）および品質管理試料をプレートに加え、１時間室温にてインキュベートした。洗浄して未結合抗体を除去した後に、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ＿Ｆ（ａｂ’）2断片特異的検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、販売者
：ＭＩＬＡＮ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡ ＡＧ、Ｒｈｅｉｎｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｔ Ｎｏ：１０９−０３５−００６）を加え、製造者の推奨に従って標準的な比色テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓ．Ａ．、Ｌａｕｓａｎｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．：３４０２１）により発色させた。４５０ｎｍの吸光度の値をプレートリーダで記録し、血清試料中の抗体の濃度を、４パラメータ回帰モデルを用いて試料プレート中で作製した参照標準曲線を用いて算出した。薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）バージョン５．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてノンコン
パートメント解析により評価した。
実施例８の方法：プロテインＡ置換の機能解析
ファージディスプレイライブラリー構築およびスクリーニング
抗ＨＥＲ３抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーから単離できる。この目的のために、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーをスクリーニングした。ここで用いたライブラリーは、それぞれ可変重鎖および軽鎖のＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３に制限される多様性を有する、合成起源のものからであった。ライブラリー構築は、以下に記載するいくらかの改変を加えたＳｉｌａｃｃｉ Ｍ．ら（２００５、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、５（９）：２３４０〜５０頁）のプロトコールに従った。
ライブラリーのために用いた抗体の土台は、軽鎖可変生殖系列ドメインＤＰＫ２２と一緒に集合させた重鎖可変生殖系列ドメインＤＰ４７に基づいた。Ｇ４Ｓペプチド反復（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＡＳ；配列番号９４）に基づくフレキシブルリンカーを、２つの可変ドメインを集合させるために用いた。５つのサブライブラリーをクローニングしたが、これらはそれぞれ、それぞれ８または９または１０または１１または１２残基の長さのＣＤＲ−Ｈ３を有する可変重鎖ドメインに対応する以下の配列Ｋ（Ｘ）ｎＦＤＹ（Ｋａｂａｔ残基９４〜１０２）（ここで、Ｘは、無作為の自然に存在するアミノ酸であり、ｎは、５または６または７または８または９である）を有する、ＣＤＲ−Ｈ３を有する１つの重鎖可変生殖系列ドメインＤＰ４７と、以下の配列ＣＱＱＸＧＸＸＰＸＴＦ（配列番号９６）またはＣＱＱＸＸＧＸＰＸＴＦ（配列番号９７）またはＣＱＱＸＸＸＸＰＸＴＦ（配列番号９８）（Ｋａｂａｔ残基８８〜９８）（ここで、Ｘは、無作為の自然に存在するアミノ酸である）の１つを有する、ＣＤＲ−Ｌ３を有する３つの異なる軽鎖可変生殖系列ドメインＤＰＫ２２の集合から得られる可変軽鎖ドメインのプールとの集合から得られた。ＤＰ４７−ＤＰＫ２２ ｓｃＦｖ断片のそれぞれのサブライブラリーは、１×１０ｅ９から３．７×１０ｅ９の間の多様性を有し、一旦組み合わせると、５つのサブライブラリーは、１．０５×１０ｅ１０の全多様性に達した。
ヒトＨＥＲ３を認識するＳｃＦｖ断片を、上記の合成ファージディスプレイライブラリーから、組換え由来ヒトＨＥＲ３抗原についての一連の反復選択サイクルで単離した（上記の方法の項を参照されたい）。抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法は、既知である（Ｖｉｔｉ Ｆ．ら、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２６：４８０〜５０５頁）。簡単に述べると、プラスチックイムノチューブを予め被覆した固定化抗原（２０μｇ／ｍｌの濃度にてＰＢＳ中で一晩）を、ライブラリーとインキュベートした。チューブをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。結合したファージをトリエチルアミンで溶出し、Ｓｉｌａｃｃｉ Ｍ．ら、既出に記載されるようにレスキューした。この選択プロセスを３回反復した。２回目および３回目の選択による１０００を超えるクローンを発現させ、標的抗原に対してＥＬＩＳＡにより分析した。陽性クローンをＤＮＡ配列決定に供し、ユニーククローンのいくつかを、ヒトＨＥＲ３を発現する株化細胞と結合する能力についてさらに分析した。
単離ｓｃＦｖ断片のほとんどがヒトＨＥＲ３の第１および第２ドメインに特異的であったので、組換えファージのライブラリープールをヒトＨＥＲ３細胞外領域の第１ドメインの組換え形に対して枯渇させるさらなる選択を行った（アミノ酸配列ＳＡＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１００）と融合したヒトＨＥＲ３ドメイン１は、ＨＥＲ３細胞外領域について記載したように発現させた、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２１８６０（ＥＲＢＢ３＿ＨＵＭＡＮ）残基２０〜２０９、配列番号７４）。この選択スキームにより、ヒトＨＥＲ３の第４ドメインに特異的なｓｃＦｖ断片の単離が可能になった。まとめると、ここで報告する選択により、ヒトＨＥＲ３に対するナノモル親和性を、広いエピトープカバー範囲とともに有するｓｃＦｖ断片が得られた。高い熱安定性を示すｓｃＦｖ断片を、未処理の細
菌上清由来の分泌ｓｃＦｖ断片を熱負荷に供した後に抗原ＥＬＩＳＡを行う「クック−アンド−バインド（ｃｏｏｋ−ａｎｄ−ｂｉｎｄ）ＥＬＩＳＡ」により単離した（Ｍｉｌｌｅｒ ＢＲら、（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５２５：２７９〜８９頁）。好ましいｓｃＦｖ断片を、これらの選択から単離した。異なる選択によるほとんどのｓｃＦｖ断片は、ＦＡＣＳにより、ＨＥＲ３陽性株化細胞と結合することが見出された。
ヒトＨＥＲ３陽性株化細胞
ＨＥＲ３抗原を表面で発現するヒト細胞は、ＰＣＴパンフレットＷＯ１０／１０８１２７（Ｆｕｈ Ｇら）に記載されている。Ｃａｌｕ−３（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ；Ｃａｔ．Ｎｏ：ＨＴＢ−５５）、ＢｘＰＣ３（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ ｓｔａｎｄａｒｄｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）およびＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ ｓｔａｎｄａｒｄｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ：ＨＴＢ−２５）は、ヒトＨＥＲ３陽性株化細胞の例である。ここでは、Ｃａｌｕ−３株化細胞を主に用いて、ファージディスプレイにより単離されたｓｃＦｖ断片について確認した。
細胞培養条件
Ｃａｌｕ−３細胞は、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）および１％Ｇｌｕｔａｍａｘ／ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）を補ったＲＰＭＩ培地で維持した。
細胞増殖アッセイ
Ｃａｌｕ−３細胞を９６ウェルプレート（１０，０００細胞／ウェル）に播種した。以下の日に、１％ＦＣＳを含有する培地で希釈した抗体または組み合わせ抗体または二重特異性抗体で細胞を処理した。最終濃度３ｎＭのベータヘレグリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ、Ｃａｔ．Ｎｏ：３９６−ＨＢ）を、抗体とのインキュベーションの１時間後に加えた。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＢＵＦ１０２）を７２時間後にウェルに加え、細胞を２４時間までインキュベートした後に、５４０ｎｍの励起波長および６２０ｎｍの発光波長にてＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ、Ｌｕｚｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で蛍光を読み取った。
ホモ二量体Ｆｃ断片中でプロテインＡまたはＧとの結合を低減または排除する変異。
プロテインＡまたはプロテインＧとの結合が低減またはなくなったＦｃバリアントを同定するために、工学的に操作したバリアントを設計し、スーパー抗原結合部位のコピーがともに変異されているホモ二量体として発現させた。このことにより、スーパー抗原に対する結合がほとんどまたは全く残っていない（差次的精製の概念はこのことに基づく）ホモ二量体免疫グロブリンを導く置換を選択できた。
１．１ プロテインＡと結合しないかまたは結合が低減されたホモ二量体Ｆｃ断片
混合ＩＧＨＧ１−ＩＧＨＧ３フォーマットの使用をさらに調べるために、３つのＩＧＨＧ１−ＩＧＨＧ３混合Ｆｃバリアントを調製し、プロテインＡ結合についてアッセイした。
第１バリアントは、ヒンジ配列が自然に存在するヒトＩＧＨＧ１アイソタイプ由来のヒンジ配列全体で置換された、自然に存在するヒトＩＧＨＧ３アイソタイプを起源とする配列を有した（Ｆｃ１３３と省略する（名称中の数字は、ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３の順序での各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソタイプサブクラスに対応する）；配列番号１
）。
第２Ｆｃバリアントは、ＣＨ３ドメイン配列全体が自然に存在するヒトＩＧＨＧ３ アイソタイプ由来のＣＨ３ドメイン配列全体で置換された、自然に存在するヒトＩＧＨＧ１アイソタイプを起源とする配列を有した（Ｆｃ１１３と省略する（名称中の数字は、ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３の順序での各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソタイプサブクラスに対応する）；配列番号２）。
第３バリアントは、ＵＳ２０１００３３１５２７に記載される置換Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆが導入された、自然に存在するＩＧＨＧ１アイソタイプを起源とする配列を有した（ＥＵ番号付け；Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆと省略する；配列番号３）。
さらに、ヒトＩＧＨＧ１ Ｆｃ断片（Ｆｃ ＩＧＨＧ１と省略する；配列番号４）を調製し、陽性対照として用いた。
ホモ二量体Ｆｃバリアントおよび対照Ｆｃ断片を、プロテインＡ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図１は、３つのバリアントおよびＦｃ ＩＧＨＧ１対照断片のクロマトグラフィープロファイルを示す。
３つのバリアントはいずれもプロテインＡ結合を保持しなかったが、Ｆｃ ＩＧＨＧ１対照断片は強い結合を示した。ヒトＩＧＨＧ３ ＣＨ３ドメインの自然に存在する配列を包含するホモ二量体Ｆｃバリアントは、プロテインＡとの結合が低減されたかまたは結合しないと結論付けた。
プロテインＡおよびプロテインＧに対する結合部位はＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面でオーバーラップするので、上記のＦｃバリアントを、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う捕捉−溶出精製モードにおいて試験した。結果を図２に示す。３つのバリアントは全て、プロテインＧ結合を保持した。
１．２ プロテインＧと結合しないかまたは結合が低減されたホモ二量体Ｆｃ断片
免疫グロブリン重鎖中の重要なプロテインＧ結合残基を同定するために、プロテインＧのＣ２ドメインとの複合体中のヒトＦｃ断片の構造を、合理的設計のための出発点として用いた（ＰＤＢコード：１ＦＣＣ、ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ＦＣら、（１９７７）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、８０（２）：３１９〜３２４頁およびＢｅｒｍａｎ ＨＭら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２８（１）：２３５〜２４２頁；Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ＡＥら、（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、３（３）：２６５〜２７８頁）。ＰＩＳＡサーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｓｄ−ｓｒｖ／ｐｒｏｔ＿ｉｎｔ／ｐｉｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；Ｔｉｎａ ＫＧら、（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３５（ウェブサーバ版）：Ｗ４７３〜４７６）を用いる両方の分子間の界面の分析により、Ｆｃ断片中の１８のプロテインＧ相互作用残基の部分集合が同定され、そのうちＬ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｑ３１１、Ｅ３８０、Ｅ３８２、Ｓ４２６、Ｍ４２８、Ｎ４３４、Ｈ４３５、Ｙ４３６およびＱ４３８が主に貢献した（ＥＵ番号付け）。残基Ｌ２５１、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｈ４３５およびＹ４３６は、これらの残基がＦｃＲｎ結合のために必須であることが当該技術において知られていることに基づいて（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ＤＣおよびＡｋｉｌｅｓｈ Ｓ、（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７（９）：７１５〜２５頁）、元々の候補リストから省いた。物理化学的特性に加えて、置換の性質を、プロテインＧ結合および非結合免疫グロブリンヒトアイソタイプ間の配列比較に基づいて合理化した（ガンマアイソタイプ 対 ＩＧＨＡ１、ＩＧＨＡ２および
ＩＧＨＭ；Ｂｊｏｒｃｋ ＬおよびＫｒｏｎｖａｌｌ Ｇ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３（２）：９６９〜９７４頁）。
ヒトＩＧＨＧ１のＦｃ断片（配列番号４）の関係において、標準的ＰＣＲベースの突然変異誘発技術により変異を導入した。作製した置換は、それらに限定されないが、以下の変更を含んだ：Ｅ３８０Ｙ（配列番号５）、Ｅ３８２Ｒ（配列番号６）、Ｅ３８２Ｙ（配列番号７）、Ｓ４２６Ｍ（配列番号８）、Ｓ４２６Ｒ（配列番号９）、Ｓ４２６Ｙ（配列番号１０）、Ｓ４２６Ｗ（配列番号１１）、Ｑ４３８Ｒ（配列番号１２）、Ｑ４３８Ｙ（配列番号１３）ならびに組み合わせＥ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ（配列番号１４）、Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ（配列番号１５）、Ｅ３８０Ｙ／Ｅ３８２Ｒ（配列番号１６）、Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ（配列番号１７）、Ｓ２５４Ｅ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ（配列番号１８）およびＳ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ（配列番号１９）。
ホモ二量体Ｆｃバリアントおよび対照Ｆｃ断片を、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。
試験した単一置換またはそれらの組み合わせはいずれも、プロテインＧ ＨＰカラムとの結合の完全な排除を導かなかった（図３）。Ｓ２５４位、Ｅ３８０位およびＥ３８２位での置換を組み合わせた変異体（図３Ｍ）を用いて結合の小さい低減が観察され、これらを、Ｍ２５２位、Ｍ４２８位、Ｙ４３６位およびＱ４３８位でのさらなる置換との４または５つの群によりさらに調べた。２つの新しい組み合わせを、次いで、調製した：Ｍ２５２Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｅ３８２Ａ／Ｙ４３６Ａ／Ｑ４３８Ａ（配列番号２０）およびＳ２５４Ｍ／Ｅ３８０Ｍ／Ｅ３８２Ｌ／Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ（配列番号２１）。さらに、Ｓ４２６位およびＭ４２８位での以前に調べられた置換をＨ４３３位およびＮ４３４位での置換とさらに組み合わせた第３の組み合わせ：Ｓ４２６Ｍ／Ｍ４２８Ｇ／Ｈ４３３Ｄ／Ｎ４３４Ａ（配列番号２２）を調製した。
この新しいセットのホモ二量体Ｆｃバリアントは、プロテインＧ結合についても、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。３つ全てのホモ二量体Ｆｃ組み合わせ変異体は、プロテインＧカラムとの結合の完全な排除を示し、ローディングステップ中に溶出された。
プロテインＡおよびプロテインＧに対する結合部位はＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面でオーバーラップするので、上記のＦｃバリアントを、プロテインＡ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う捕捉−溶出精製モードにおいて試験した。結果を図４に示す。３つのバリアントは全て、プロテインＡと結合し、よって、全てのバリアントがプロテインＡ結合を保持したことが示された。
ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＧ結合を排除する最小限の数の置換を同定するために、Ｓ４２６、Ｍ４２８、Ｈ４３３およびＮ４３４からなる４つのアミノ酸の位置の群を対で調べ、いくつかの場合においては異なるアミノ酸で置換した。以下の組み合わせを調製した：Ｓ４２６Ｍ／Ｈ４３３Ｄ（配列番号２３）、Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ（配列番号２４）、Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ｓ（配列番号２５）、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ（配列番号２６）およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（配列番号２７）。ホモ二量体Ｆｃバリアントおよび対照Ｆｃ断片を、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図５から、Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａ、またはＭ４２８ＧおよびＮ４３４Ｓ置換を有するホモ二量体Ｆｃ組み合わせ変異体だけが、プロテインＧカラムとの結合の完全な排除を示し、ローディングステップ中に溶出されたことがわかる。ヒトＩＧＨＧ１免疫グロブリンの血清半減期を延長することが当該技術において知られており、ここで示す置換の組み合わせＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（Ｚａｌｅ
ｖｓｋｙ Ｊら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２８（２）：１５７〜１５９頁）は、プロテインＧ結合のいずれの低減も導かなかったことに触れておく価値がある（図５Ｃ）。
最後に、置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを、プロテインＧ結合の低減または排除に向かうそれらの個別の貢献の点で評価した。２つのホモ二量体Ｆｃバリアント（一方のバリアントはＭ４２８Ｇ置換（配列番号２８）を有し、他方のバリアントはＮ４３４Ａ置換（配列番号２９）を有する）を調製し、上記のようにアッセイした。驚くべきことに、Ｍ４２８Ｇ置換もＮ４３４Ａ置換も、プロテインＧ結合の低減または排除を導かなかった（図６）。よって、これらの結果から、ホモ二量体Ｆｃ断片中でプロテインＧ結合の完全な排除を誘導するために、Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａ置換の組み合わせが必要十分であると結論付けた。
プロテインＡおよびプロテインＧに対する結合部位はＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面でオーバーラップするので、上記のＦｃバリアントを、プロテインＡ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う捕捉−溶出精製モードにおいて試験した。結果を図７に示す。全てのバリアントがプロテインＡ結合を保持した。
プロテインＡまたはＧとの結合が低減されたかまたは結合しないホモ二量体Ｆｃ断片を有するホモ二量体免疫グロブリン中のプロテインＡまたはＧとの結合を低減または排除する変異
２．１ プロテインＡとの結合が低減されたかまたは結合しないホモ二量体免疫グロブリン
ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＡ結合を排除する方法は、実施例１．１に示した。全長ホモ二量体免疫グロブリン中でのプロテインＡ排除法の使用を評価するために、混合ＩＧＨＧ１−ＩＧＨＧ３ Ｆｃフォーマットに基づく抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンを調製した。抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンは、自然に存在する抗体と同様にフォーマットされ、上記のＦｃ１３３断片と融合した抗ＨＥＲ２特異性を有するＦＡＢ断片（本明細書において抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３と省略する；配列番号３０の重鎖および配列番号３１の軽鎖）から構成されていた。トランスフェクションの後に、抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３ホモ二量体を、プロテインＡ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図８Ａに示すように、抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３ホモ二量体は、市販のＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）とまだ結合した。Ｆｃ１３３バリアントはプロテインＡと結合しないことが以前に示されているので、さらなる実験を行って、結合に対するＦＡＢ領域の貢献について調べた。
ＦＡＢ定常ドメインの貢献を評価するために、上記の抗ＨＥＲ２ホモ二量体を、ｓｃＦｖ単位が、１５アミノ酸リンカーと融合した親の免疫グロブリン可変ドメインから構成される抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子として再フォーマットした（本明細書において抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ１３３と省略する；配列番号３２の重鎖）。得られた抗ＨＥＲ２
ｓｃＦｖ−Ｆｃ１３３ホモ二量体は、よって、親の抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３ホモ二量体免疫グロブリンと同一であるが、ＣＨ１およびＣＫ定常ドメインを欠いた。図８Ｂに示すように、ｓｃＦｖ−Ｆｃ１３３ホモ二量体は、親の抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンで観察されたことと同様に、プロテインＡ結合を示した。この知見により、抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ断片の可変ドメインが、ホモ二量体免疫グロブリンのＦｃ部分中のプロテインＡ結合を排除する方法の有効性を妨げる原因であるという結論が導かれた。より重要なことには、ホモ二量体免疫グロブリンの可変ドメイン中のプロテインＡ結合は、プロテインＡ差次的精製技術に基づくヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を妨げると結論付けた
。
プロテインＡの５つ全てのドメインは、ＶＨ３可変ドメインサブクラス由来の可変重鎖ドメインと結合することが知られており（Ｊａｎｓｓｏｎ Ｂら、（１９９８）ＦＥＭＳ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０（１）：６９〜７８頁）、この特徴は、抗体分子全体のパパイン消化の後のＶＨ３ベースのＦＡＢ断片の調製を妨げることが知られている（なぜなら、プロテインＡがＶＨ３ベースのＦＡＢおよびＦｃ断片の両方と結合するからである）。ホモ二量体抗ＨＥＲ２免疫グロブリンまたはそのｓｃＦｖ−Ｆｃバージョン中で見出される重鎖可変ドメインは、ＶＨ３−２３サブクラスに属し、工学的に操作されたＦｃ部分内にプロテインＡ結合部位を有さないにもかかわらず、これらのホモ二量体分子がなぜプロテインＡと結合するかを説明した。
ＶＨ３ベースの免疫グロブリンまたはその断片は、生物工学産業にとって非常に重要である。ＶＨ３ベースの分子は、プロテインＡと結合する能力がそれらの機能的プレスクリーニングを容易にするので、広く開発されており、よって、抗体発見のために用いられる多くの合成またはドナーベースのファージディスプレイライブラリーまたはトランスジェニック動物技術は、ＶＨ３ドメインサブクラスに基づく。さらに、ＶＨ３ベースの分子は、その他の既知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも良好な発現および安定性のために、頻繁に選択される。ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片と結合しない組換えバージョンのプロテインＡが開発され、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）の商品名の下でＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより市販されている。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムを上で論じた２つのホモ二量体抗ＨＥＲ２免疫グロブリンのプロテインＡ結合の評価のためにここで用いたので、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムは、プロテインＡ差次的精製技術を用いる場合、少なくとも１つのＶＨ３可変ドメインを有するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製のために適切でないと結論付けた。なぜなら、Ｆｃ領域中にプロテインＡ結合を有さないホモ二量体種は、それらのＶＨ３ドメインによりプロテインＡとまだ結合するからである。
ＶＨ３ベースのホモ二量体免疫グロブリンまたはその断片を排除または低減する置換を調べるために、ＶＨ３ベースのＦＡＢバリアントをプロテインＡ結合についてアッセイする必要がある。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂の種はＶＨ３ドメインサブクラス結合を欠くことが知られているが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）として知られる別の市販のプロテインＡ樹脂は、ＶＨ３ドメインサブクラスと結合する（これもまたＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからである）ので、ＶＨ３ベースのＦＡＢバリアントをプロテインＡ結合について分析するために選択した。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂の使用は、ＶＨ３−２３可変ドメインサブクラスのものであることが知られている以前に記載した親の抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンに由来する組換え抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ断片（本明細書において抗ＨＥＲ２ ＦＡＢと省略する；配列番号３３の重鎖および配列番号３１の軽鎖）を調製し、該断片を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムでアッセイすることにより確認した（ＶＫサブクラスＩに基づく軽鎖を有する、ＦＡＢ断片は、まず、プロテインＬクロマトグラフィーを用いて捕捉−溶出モードで精製した後に、プロテインＡ勾配クロマトグラフィーをＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラムで行った、両方のカラムのプロトコールは、方法の項に記載したプロトコールに従った）。図８Ｃに示すように、ＶＨ３ベースの抗ＨＥＲ２ ＦＡＢだけがＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムと結合し、このことにより、単量体ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片に少なくとも関する限り、そしてプロテインＡとの結合がない工学的に操作されたＦｃ領域を有するＶＨ３ベースのホモ二量体免疫グロブリンについて以前に観察された結果と
さらに対照的に、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂がＶＨ３ベースのＦＡＢ断片との結合を欠くことが確認された。逆に、抗ＨＥＲ２ ＦＡＢは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムとの強い結合を示し、このことは、プロテインＡと結合しないかまたは結合が低減されたＶＨ３ベースのＦＡＢバリアントについてアッセイする可能性をもたらした。
ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片中のプロテインＡ結合を排除するために、ＶＨ３ドメイン中の重要なプロテインＡ結合残基を、プロテインＡのＤドメインとの複合体中のヒトＦＡＢ断片の結晶構造（ＰＤＢコード：１ＤＥＥ；ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ；Ｇｒａｉｌｌｅ Ｍら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（１０）：５３９９〜５４０４頁）から同定した。この分析は、合理的設計のための出発点として用い、ここでは、行った置換の性質が、ヒト起源のプロテインＡ結合ＶＨサブクラスとプロテインＡ非結合ＶＨサブクラスとの間の配列比較に基づいた。図９は、各ヒト重鎖可変ドメインサブクラスについての１つの代表的なフレームワークのアラインメントを示す。アミノ酸１５位、１７位、１９位、５７位、５９位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、８１位、８２ａ位および８２ｂ位（Ｋａｂａｔナンバリング）を、１ＤＥＥ構造中のプロテインＡのＤドメインとＶＨ３ベースのＦＡＢ断片との間のタンパク質−タンパク質相互作用界面の一部として同定した。ヒトＶＨサブクラスのうち、ＶＨ３は、プロテインＡと結合する唯一のサブクラスであり、その他のサブクラス中の等価なアミノ酸配列の位置の残基を、おそらく免疫原性を低減しながらプロテインＡ結合を排除または低減する観点で、置換の供給源として選択した。なぜならこれらの置換は、プロテインＡ非結合ヒトＶＨサブクラス中で見出される同じ等価なアミノ酸の位置でのある残基の、別の自然に存在する残基への置き換えを含んでいたからである。
上記の抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ断片配列中に、標準的なＰＣＲベースの突然変異誘発技術により変異を導入し、以下の置換を作製した：Ｇ６５Ｓ（配列番号３４の重鎖および配列番号３１の軽鎖）、Ｒ６６Ｑ（配列番号３５の重鎖および配列番号３１の軽鎖）、Ｔ６８Ｖ（配列番号３６の重鎖および配列番号３１の軽鎖）、Ｑ８１Ｅ（配列番号３７の重鎖および配列番号３１の軽鎖）、Ｎ８２ａＳ（配列番号３８の重鎖および配列番号３１の軽鎖）および組み合わせＲ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａ（配列番号３９の重鎖および配列番号３１の軽鎖）。
さらに、Ｔ５７Ａ置換（配列番号４０の重鎖および配列番号３１の軽鎖）およびＴ５７Ｅ置換（配列番号４１の重鎖および配列番号３１の軽鎖）を作製した。Ｔ５７Ａは、ＷＯ２０１０／０７５５４８においてプロテインＡ結合を排除することが以前に示され、Ｔ５７Ｅは、電荷交換（正荷電アミノ酸から負荷電アミノ酸への変更）を工学的に作製するために設計した。ＶＫサブファミリーＩに基づく軽鎖を有するので、ＦＡＢ変異体を、まず、プロテインＬクロマトグラフィーを用いて捕捉−溶出モードで精製し、さらに、プロテインＡ結合について、方法の項に記載したように勾配モードの下で操作するＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムを用いてアッセイした。図１０は、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｅ、Ｇ６５Ｓ、Ｑ８１Ｅ、Ｎ８２ａＳおよび組み合わせＲ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａだけが、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂との抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ結合を排除または低減したことを示す。置換Ｇ６５Ｓ、Ｑ８１ＥおよびＮ８２ａＳは、ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片中のプロテインＡ結合を排除する場合に好ましい。なぜなら、これらの変異は、プロテインＡ非結合ＶＨサブクラスで見出される配列等価残基について置換することにより、おそらく免疫原性を低減するからである。
抗体の親和性および特異性は、ＣＤＲ領域に本質的に限定されるが、フレームワーク置換は、いくつかのヒト化抗体の場合に示されるように、抗体特性に影響を与えることがある。上記の置換がＶＨ３由来抗体の特異性および／または親和性に影響を与えるかを評価
するために、好ましいＦＡＢ変異体のうち２つを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりＨＥＲ２抗原結合についてアッセイした。組換えＨＥＲ２抗原を用いるＳＰＲ測定を、方法の項に記載したように行った。好ましい変異体はともに、元のＦＡＢ分子と比較して同一のＨＥＲ２抗原との結合を示し（図１１）、このことは、置換が特異性または親和性の点で影響を与えなかったことを証明した。よって、抗原結合を著しく失うことなくＶＨ３由来抗体分子中のプロテインＡ結合を工学的に操作するために、これらの置換を広く用いることができることが期待される。
これらの好ましい置換のうちの２つを、以前に記載した抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンおよび抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子に導入し、バリアントを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）樹脂との結合についてアッセイした。以下のバリアントを調製した：抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３（配列番号４２の重鎖）、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３（配列番号４３の重鎖）、抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３（配列番号４４の重鎖および配列番号３１の軽鎖）、および抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ１３３（配列番号４５の重鎖および配列番号３１の軽鎖）。
図１２は、４つ全ての変異体についてのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）クロマトグラフィーのプロファイルを示す。全てのバリアントは、ここで、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ
ＳｕＲｅ（商標）カラムとの結合の低減または結合がほとんどないことを示し、以前に同定した置換を用いてプロテインＡ結合がうまく除去されたことを示した。より重要なことには、プロテインＡ差次的精製技術と組み合わせた場合に、プロテインＡに対するＶＨ３ベースのＦＡＢの親和性を排除または低減する置換は、少なくとも１つのＶＨ３可変ドメインが存在するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を可能にすると結論付けた。
上記のバリアントは、方法の項に記載したプロトコールに従う捕捉−溶出精製モードでプロテインＧ結合について試験した。結果を図１３に示す。全てのバリアントは、プロテインＧ結合を保持した。
２．２プロテインＧとの結合が低減されたかまたは結合しないホモ二量体免疫グロブリン
ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＧ結合を排除する方法は、実施例１．２に示した。全長ホモ二量体免疫グロブリン中のプロテインＧ排除法の使用を評価するために、Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ断片に基づく抗ＨＥＲ３ホモ二量体免疫グロブリンを調製した。抗ＨＥＲ３ホモ二量体免疫グロブリンは、自然に存在する抗体と同様にフォーマットされ、上記のＦｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ断片と融合した抗ＨＥＲ３特異性を有するＦＡＢ断片（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する、配列番号４６の重鎖および配列番号４７の軽鎖）から構成されていた。トランスフェクションの後に、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａホモ二量体を、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図１４に示すように、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａホモ二量体は、市販のプロテインＧ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）とまだ結合した。Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ断片はプロテインＧと結合しないことが以前に示されているので、結合に対するＦＡＢ領域の貢献が疑われた。このような貢献は、ホモ二量体免疫グロブリンのＦｃ部分中のプロテインＧ結合を排除する方法の有効性を妨げ、より重要なことには、この新しい差次的精製技術に基づくヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を妨げる。
全てのヒト免疫グロブリンガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片は、ＣＨ１ドメイン内でプロテインＧと結合することが知られている（Ｎｅｚｌｉｎ ＲおよびＧｈｅｔｉｅ Ｖ、（２００４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｖｏｌ．８２：１５５〜２１５頁）。ヒト免疫グロブリンアイソタイプのうち、ＩＧＨＡ１、ＩＧＨＡ２およびＩＧＨＭを起源とするＣＨ１ドメインは、プロテインＧと結合しないことが知られている（Ｂｊｏｒｃｋ ＬおよびＫｒｏｎｖａｌｌ Ｇ、既出）。ガンマアイソタイプ由来のＣＨ１ドメインと、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＡ２またはＩＧＨＭ由来のＣＨ１ドメインとの間のアミノ酸配列の違いは、ガンマアイソタイプ由来のＣＨ１ドメイン中のプロテインＧ結合を低減または排除しながら、おそらく低い免疫原性を有する置換の合理的設計を可能にする。図１５は、ＩＧＨＧ１由来のヒトＣＨ１ドメインと、ヒトＩＧＨＡ１およびヒトＩＧＨＭ由来のＣＨ１ドメイン配列とのＩＭＧＴ配列アラインメントを示す（ＩＭＧＴ（登録商標）、既出）。ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けは、免疫グロブリンスーパーファミリードメインの３Ｄ構造の比較解析に基づくので、これは、ＣＨ１ドメイン間の３Ｄ等価位置を規定する。よって、ＩＧＨＧ１のＣＨ１ドメイン内のプロテインＧ結合を低減または排除する置換を、図１５に示す配列アラインメントから選択した。どの３Ｄ位置を置換するかを選択するための別のインプットは、複合体中のマウスＦＡＢ断片およびプロテインＧの第３ドメインの結晶構造の解析であった（ＰＤＢコード１ＩＧＣ、ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ、既出；Ｄｅｒｒｉｃｋ ＪＰおよびＷｉｇｌｅｙ ＤＢ、（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４３：９０６〜９１８頁）。ＣＨ１ドメイン結晶構造内の２つのベータ鎖（ストランドＡ（ＥＵ番号付け１２２から１３６）およびストランドＧ（ＥＵ番号付け２１２から２１５）、図１５）およびループ構造（ＦＧループ（ＥＵ番号付け２０１から２１１）、図１５）は、ほとんどのタンパク質−タンパク質相互作用を媒介するように見受けられ、工学的作業の焦点となった。
ヒトＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来置換の使用を評価するために、以下の変異体を、上記の抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａホモ二量体免疫グロブリンの背景で調製した：ＩＧＨＧ１由来のＣＨ１ドメイン全体がＩＧＨＡ１由来のＣＨ１ドメイン全体で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号４８の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１由来のＣＨ１ドメイン全体がＩＧＨＭ由来のＣＨ１ドメイン全体で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号４９の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ、ストランドＧおよび一部のＦＧループ配列が、ＩＧＨＡ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ、ストランドＧおよび一部のＦＧループ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−Ａ−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する、配列番号５０の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ、ストランドＧおよび一部のＦＧループ配列がＩＧＨＭ ＣＨ１ドメインストランドＡ、ストランドＧおよび一部のＦＧループ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ−Ａ−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号５１の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ配列がＩＧＨＡ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−Ａ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号５２の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列がＩＧＨＡ１ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号５３の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＡ配列がＩＧＨＭ ＣＨ１ドメインストランドＡ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＭ−Ａ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号５４の重鎖および配列番号４７の軽鎖）、ならびにＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列がＩＧＨＭ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列で置き換えられたバリアント（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧ
ＨＭ−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号５５の重鎖および配列番号４７の軽鎖）。トランスフェクションの後に、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃバリアントを、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図１６および図１７は、それぞれＩＧＨＡ１およびＩＧＨＭベースのバリアントについてのプロテインＧ結合プロファイルを示す。これらの結果から、ＩＧＨＧ１由来のＣＨ１ドメイン配列全体をＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭのいずれか由来のＣＨ１ドメイン配列全体で置き換えることにより、ガンマＦＡＢベースのホモ二量体免疫グロブリン（ここで、Ｆｃ領域も、プロテインＧと結合しないかまたは結合が低減している）中のプロテインＧ結合の完全な排除が可能になると結論付けた。さらに、単一鎖交換による排除が、ＩＧＨＡ１またはＩＧＨＭ由来のストランドＧをＦＧループの一部とともに用いた場合にのみ成功したが、ストランドＡでの置き換えは、プロテインＧ結合にほとんどまたは全く影響を与えなかったことがわかった。
ガンマアイソタイプＦＡＢ断片中のプロテインＧ結合を排除する最小限の数の置換を同定するために、ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列の分析に由来するさらなる置換を調べた。以下の置換の対を試験した：Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ（ＦＧループ）、Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ（ストランドＧ）、Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ（ＦＧループ）およびＤ２１２Ｅ／Ｋ２１４Ｎ（ストランドＧ）（ＥＵ番号付け；ＩＭＧＴ１１５位、１１６位、１１８位、１１９位および１２０位にそれぞれ相当するＥＵ２０９位、２１０位、２１２位、２１３位および２１４位）。最初の２つの組み合わせは、ＩＧＨＡ１ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列に対するＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列の分析に由来し、置換の他の２対は、ＩＧＨＭ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列に対するＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインストランドＧおよび一部のＦＧループ配列の解析に由来した。バリアントは、上記のようにフォーマットされ、以下のように記載できる：配列番号５６の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、配列番号５７の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、配列番号５８の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｄ２１２Ｅ／Ｋ２１４Ｎ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、ならびに配列番号５９の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。
ホモ二量体免疫グロブリンバリアントを、次いで、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図１８は、ＩＧＨＡ１由来置換についての勾配クロマトグラフィープロファイルを示し、Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０ＳおよびＫ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ置換はともに、プロテインＧ結合を完全に排除できた。ＩＧＨＭベースの置換の場合、Ｔ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ置換だけがプロテインＧ結合の完全な排除を導き、Ｄ２１２Ｅ／Ｋ２１４Ｎ置換は、プロテインＧ結合に影響を与えなかった（図１９）。これらの結果から、置換Ｔ２０９Ｐ／Ｋ２１０Ｓ、Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４ＴおよびＴ２０９Ｇ／Ｋ２１０Ｎ（ＥＵ番号付け）は、ガンマアイソタイプＦＡＢベースのホモ二量体免疫グロブリン（ここで、Ｆｃ領域も、プロテインＧと結合しないかまたは結合が低減している）中のプロテインＧ結合を排除できると結論付けた。より重要なことには、ガンマアイソタイプＦＡＢとプロテインＧとの結合を排除または低減する置換は、実施例１．２に記載するプロテインＧ差次的精製技術と組み合わせた場合に、少なくとも１つのＣＨ１ドメインが存在するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を可能にする。
上記のバリアントを、プロテインＡ結合について、捕捉−溶出精製モードで試験した。結果を図２０に示す。全てのバリアントは、プロテインＡ結合を保持した。
ガンマアイソタイプ由来のＣＨ１ドメイン配列はアミノ酸２０９位および２１０位にて不変であるので、本明細書で示す２０９位および２１０位の置換は、全てのガンマアイソタイプＣＨ１ドメイン中のＣＨ１ドメインとプロテインＧとの結合を排除できると期待される。２つの位置のうち、２０９位は、ＣＨ１−プロテインＧ相互作用において主な役割を演じると期待される。ＰＤＢｓｕｍオンラインツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｓｕｍ／、Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ＲＡら、（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２２（１２）：４８８〜４９０頁）を用いる１ＩＧＣ中の水素結合ネットワークの分析は、Ｔ２０９の側鎖とプロテインＧ由来のアミノ酸側鎖（残基Ｔ２１、１ＩＧＣの配列に従う番号付け）との間の重要な水素結合相互作用を明らかにした。Ｋ２１０も、プロテインＧ由来のアミノ酸（Ｅ２０、１ＩＧＣの配列に従う番号付け）との間に水素結合相互作用することが示されたが、この相互作用は主鎖原子のみに関与するので、アミノ酸置換により破壊されにくいと期待される。
Ｋ２１３位は、ガンマアイソタイプ間で保存されているが、ＩＧＨＧ１中のＫ２１４は、ＩＧＨＧ３およびＩＧＨＧ４中のＲ２１４に相当する（これは、保存的アミノ酸変化である。なぜなら、正電荷がこの位置で維持されるからである）。ＩＧＨＧ２中で、２１４位はトレオニンであり、よって、非保存的変化である。Ｋ２１３Ｖ／Ｋ２１４Ｔ置換はプロテインＧとＩＧＨＧ１ ＣＨ１ドメインとの結合を排除したので（本明細書で示すとおり）、２１３位の置換は、全てのガンマアイソタイプ中のプロテインＧ結合を排除するために十分であると期待される。２０９位と同様に、Ｋ２１３の側鎖も、プロテインＧ由来のアミノ酸側鎖（残基Ｔ１６、１ＩＧＣの配列に従う番号付け）との重要な水素結合相互作用を媒介するが、Ｋ２１０と同様に、Ｋ２１４は、プロテインＧ由来のアミノ酸（Ｋ１５およびＴ１６、１ＩＧＣの配列に従う番号付け）と、主鎖原子が関与する水素結合相互作用だけを行い、この相互作用は、よって、アミノ酸置換により破壊されにくいと期待される。
ガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片内のプロテインＧ結合を排除する単一置換を同定するために、以下の単一置換を調べた：Ｔ２０９Ｐ、Ｋ２１３Ｖ（ともにＩＧＨＡ１由来置換）およびＴ２０９Ｇ（ＩＧＨＭ由来置換）。
バリアントは、上記のようにフォーマットされ、以下のように記載できる：配列番号７５の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｐ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、配列番号７６の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｋ２１３Ｖ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ、ならびに配列番号７７の重鎖および配列番号４７の軽鎖を有する抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｔ２０９Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ。
図１８Ｃおよび１８Ｄは、ＩＧＨＡ１由来置換についての勾配クロマトグラフィープロファイルを示し、Ｔ２０９ＰおよびＫ２１３Ｖ置換はともに、プロテインＧ結合を完全に排除できた。ＩＧＨＭベースの置換の場合、Ｔ２０９Ｇは、プロテインＧ結合の完全な排除を導いた（図１８Ｅ）。これらの結果から、置換Ｔ２０９Ｐ、Ｋ２１３ＶおよびＴ２０９Ｇ（ＥＵ番号付け）は、ホモ二量体免疫グロブリン（ここで、Ｆｃ領域も、プロテインＧと結合しないかまたは結合が低減している）内のガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片中のプロテインＧ結合を排除できると結論付けた。より重要なことには、実施例１．２に記載するプロテインＧ差次的精製技術と組み合わせた場合に、プロテインＧとのＦＡＢ結合を排除または低減する置換は、少なくとも１つのＣＨ１ドメインを有するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を可能にする。
上記の置換が得られた抗体中の抗原特異性および／または親和性に影響を与えるかを評
価するために、上記の３つ全てのＣＨ１単一変異抗体を、ＨＥＲ３抗原結合についてＳＰＲによりアッセイした。組換えＨＥＲ３抗原についての測定は、方法の項において記載したように行った。３つ全ての変異体は、対照抗体と比較して同一の抗原結合を示し（図１８Ｆ）、このことは、置換が特異性または親和性の点で影響を与えなかったことを証明した。よって、抗原結合を著しく失うことなくガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片内のプロテインＧ結合を工学的に操作するために、これらの置換を広く用いることができることが期待される。
プロテインＡおよび／またはＧについての差次的精製を有するヘテロ二量体免疫グロブリンの精製。
ホモ二量体免疫グロブリン中のプロテインＡまたはプロテインＧ結合を排除または低減する方法は、実施例１および２に示した。これらの方法は、それら自体または組み合わせでのヘテロ二量体免疫グロブリンの精製を可能にするために開発した。
それら自体で用いる場合、これらの方法はともに、一方の重鎖が他方の重鎖と比較した場合にプロテインＡまたはＧとの結合が低減されているかまたは結合しない重鎖のヘテロ二量体の分離を可能にするために、勾配モードクロマトグラフィーを必要とする。組み合わせで用いる場合、これらの方法は、２回の捕捉−溶出クロマトグラフィーステップ（順序は特に限定されないが、一方はプロテインＡに対して、そして他方はプロテインＧに対して）を連続して行うことにより重鎖のヘテロ二量体の調製のために簡便に用いることができる。両方の技術を包含するヘテロ二量体免疫グロブリンは、プロテインＡと結合できるがプロテインＧとの結合が低減されたかまたは結合しない１つの重鎖と、それと対になった、プロテインＧと結合できるがプロテインＡとの結合が低減されたかまたは結合しない別の重鎖とから構成される。対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、そのホモ二量体種（プロテインＡと結合しないかまたはプロテインＧと結合しない２種の可能性のあるホモ二量体種）の両方に対して差次的精製特性を有する。
重要なことには、これら２つの方法の組み合わせだけが、捕捉−溶出モードでのヘテロ二量体免疫グロブリンの均質な調製を可能にする。なぜなら、各親和性ステップにて、２種のホモ二量体免疫グロブリン混入物の一方（なぜなら、これは親和性樹脂と結合しないからである）が、勾配モードクロマトグラフィーを使用することなく効率的に除去されるからである。このことは、特に興味深い。なぜなら、捕捉−溶出モードクロマトグラフィーは、工業的規模の調製にとって好ましいからである。よって、これら２つの技術と、プロテインＡクロマトグラフィーとその後のプロテインＧクロマトグラフィー（またはその逆）との逐次的使用との組み合わせにより、いずれの形の勾配クロマトグラフィーも行う必要なく捕捉−溶出モードで、最高の純度（９５％を超える、より好ましくは９８％を超える）のヘテロ二量体免疫グロブリンの調製が可能になる。
３．１ プロテインＡについての差次的精製を有するヘテロ二量体免疫グロブリン
ヘテロ二量体免疫グロブリンの調製のためのプロテインＡ排除法の使用を評価するために、混合ＩＧＨＧ１−ＩＧＨＧ３ Ｆｃフォーマットに基づく抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンを調製した。
重鎖のヘテロ二量体に基づくヘテロ二量体免疫グロブリンを作製する場合、自然に存在する重鎖は同一の分子量を有するので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりホモ二量体からヘテロ二量体を同定することは不可能である。その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの移動度に差を持たせ、ヘテロ二量体形成の同定を容易にするために、一方の重鎖がＦＡＢ断片を保有し、他方の重鎖がｓｃＦｖ断片を保有するｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマットを用いた。
抗ＨＥＲ３重鎖は、実施例２に記載したようにフォーマットされ、上記のＦｃ１３３断片と融合した抗ＨＥＲ３特異性を有するＦＡＢ断片（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３と省略する；配列番号６０の重鎖および配列番号４７の軽鎖）から構成されていた。重要なことには、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３重鎖中で見出される可変重鎖ドメインは、ＶＨサブクラス２に属し、プロテインＡと結合しない。抗ＨＥＲ２重鎖は、実施例２に記載したようにフォーマットされ、自然に存在するＩＧＨＧ１アイソタイプ由来のＦｃ部分を有する抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖（本明細書において抗ＨＥＲ２
ｓｃＦｖ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１と省略する；配列番号６１の重鎖）から構成されていた。重要なことには、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖中で見出される可変重鎖ドメインは、ＶＨサブクラス３（ＶＨ３）に属し、プロテインＡと結合する。
抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３重鎖と抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖との共有結合により得られる抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインＡとの結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３重鎖は、そのＦｃ領域中でプロテインＡ結合が排除され、その可変重鎖ドメイン中にプロテインＡ結合部位が存在しない）と、プロテインＡに対する２つの結合部位を有する１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖は、ＩＧＨＧ１ Ｆｃ領域中で見出される自然のプロテインＡ結合部位を有し、ＶＨ３ドメイン中に存在する第２プロテインＡ結合部位を有する）とを有すると期待された。この特定の重鎖組み合わせは、合計で２つのプロテインＡ結合部位を有する対象の抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンとともに、２つのホモ二量体免疫グロブリン種（一方はプロテインＡに対する結合部位を有さず、第２の種は、合計で４つを有する）の生成をもたらす。ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＡ結合部位の数が異なることにより、以下に示すように、３つ全ての分子を勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能になる。
生成の後に、３つ全ての種を含有する細胞培養上清を、プロテインＡ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図２１に示すように、３つ全ての種は、プロテインＡ勾配クロマトグラフィーにより分離され、結合部位を有さない種はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムと結合しなかったが、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、最大数のプロテインＡ結合部位を有するホモ二量体種の前に溶出された。
この直前の実施例は、１つのＶＨ３ドメインだけが存在する重鎖のヘテロ二量体を精製するためにプロテインＡ排除法を実行する場合、ＶＨ３ドメインがプロテインＡと結合しかつＦｃ領域において改変されていない重鎖の一部となるように工学的に操作されている場合にのみ、ヘテロ二量体精製が成功できることを示す。
各重鎖が１つのＶＨ３ドメインを保有する重鎖のヘテロ二量体を扱う場合、実施例２．１に示す置換を用いて少なくとも１つのＶＨ３ドメインまたは両方においてプロテインＡ結合を変異させることにより、この差次的精製技術の基礎であるプロテインＡ結合部位不均衡を保存できる。
３．２ プロテインＧについての差次的精製を有するヘテロ二量体免疫グロブリン
ヘテロ二量体免疫グロブリンの調製のためのプロテインＧ排除法の使用を評価するために、ホモ二量体Ｆｃ断片中のプロテインＧ結合を排除する最小限の数の置換に基づく抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンを調製した。実施例３．１と同様に、ｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマットを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度の差を作製し、ヘテロ二量体同定を容易にした。
抗ＨＥＲ２重鎖は、実施例２に記載したようにフォーマットされ、実施例２．１で用い
た抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖと上記のＦｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ断片とから構成されたｓｃＦｖ−Ｆｃ型の重鎖（本明細書において抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａと省略する；配列番号６２の重鎖）に相当した。
抗ＨＥＲ３重鎖は、実施例２に記載したようにフォーマットされ、自然に存在するＩＧＨＧ１ Ｆｃ断片と融合した抗ＨＥＲ３特異性を有するＦＡＢ断片（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１と省略する；配列番号６３の重鎖および配列番号４７の軽鎖）から構成されていた。
抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖と抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖との共有結合により得られる抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインＧに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａは、そのＦｃ部分中でプロテインＧ結合が排除され、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテインＧ結合部位は存在せず、すなわちＣＨ１ドメインは存在しない）と、プロテインＧに対する２つの結合部位を有する１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖は、ＩＧＨＧ １Ｆｃ領域中で見出される自然のプロテインＧ結合部位を有し、そのＣＨ１ドメイン中に存在する第２プロテインＧ結合部位を有する）とを有すると期待された。この特定の重鎖組み合わせは、合計で２つのプロテインＧ結合部位を有する対象の抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンとともに、２つのホモ二量体免疫グロブリン種（一方はプロテインＧに対する結合部位を有さず、第２の種は、合計で４つを有する）の生成をもたらす。ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＧ結合部位の数が異なることにより、３つ全ての分子を勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能になる。生成の後に、３つ全ての種を含有する細胞培養上清を、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図２２に示すように、３つ全ての種は分離され、結合部位を有さない種はプロテインＧ ＨＰカラムと結合しなかったが、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、最大数のプロテインＧ結合部位を有するホモ二量体種の前に溶出された。
上記の実験では、ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製のためのプロテインＧ排除法の使用は、プロテインＧ結合を排除する置換を保有する重鎖がＣＨ１ドメインを有さないフォーマットに限定される。なぜなら、ＦＡＢフォーマットを用いることは、不要なホモ二量体種のプロテインＧ結合を本質的に回復するからである。ＦＡＢ断片のＣＨ１ドメイン中のプロテインＧ結合部位を排除することにより、Ｆｃ領域中のプロテインＧ結合を排除する置換を保有する重鎖内にＦＡＢ断片が存在するヘテロ二量体免疫グロブリンを調製できる。この例を以下に示す。
直前の実験と同様に、抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンを、ｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマットを用いて調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度の差を作製し、ヘテロ二量体同定を容易にした。
抗ＨＥＲ２重鎖は、実施例３．１に記載した抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖（配列番号６１の重鎖）であった。抗ＨＥＲ３重鎖は、実施例２．２に記載した抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖（配列番号５３の重鎖および配列番号４７の軽鎖）であった。
抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖と抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖との共有結合により得られる抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインＧに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ
４３４Ａ重鎖は、そのＦｃ領域およびＣＨ１ドメインの両方においてプロテインＧ結合が排除されている）と、プロテインＧに対する結合部位を１つだけ有する１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖は、ＩＧＨＧ１Ｆｃ領域中で見出される自然のプロテインＧ結合部位を有し、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテインＧ結合部位は存在せず、すなわちＣＨ１ドメインは存在しない）とを有すると期待された。この特定の重鎖組み合わせは、１つだけのプロテインＧ結合部位を有する対象の抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンとともに、２つのホモ二量体免疫グロブリン種（一方はプロテインＧに対する結合部位を有さず、第２の種は、合計で２つを有する）の生成をもたらす。ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＧ結合部位の数が異なることにより、３つ全ての分子を勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能になる。生成の後に、３つ全ての種を含有する細胞培養上清を、プロテインＧ結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図２３に示すように、３つ全ての種は分離され、結合部位を有さない種はプロテインＧ ＨＰカラムと結合しなかったが、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、最大数のプロテインＧ結合部位を有するホモ二量体種の前に溶出された。
３．３ プロテインＡおよびプロテインＧについての差次的精製を有するヘテロ二量体免疫グロブリン
プロテインＡまたはプロテインＧでのヘテロ二量体免疫グロブリンの差次的精製の方法を、逐次的様式で組み合わせて、捕捉−溶出モードで、すなわちいずれの形の勾配クロマトグラフィーも行う必要なくヘテロ二量体免疫グロブリンを容易に精製できる。２つの例を以下に示す。
実施例３．１および３．２と同様に、抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンを、ｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマットを用いて調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度の差を作製し、ヘテロ二量体同定を容易にした。抗ＨＥＲ２重鎖は、実施例３．２に記載した抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖（配列番号６２の重鎖）であった。抗ＨＥＲ３重鎖は、実施例３．１に記載した抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３重鎖（配列番号６０の重鎖および配列番号４７の軽鎖）であった。
抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖と抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３重鎖との共有結合により得られる抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインＧに対する２つの結合部位を有するがプロテインＡに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３重鎖は、そのＦｃ領域中でプロテインＡ結合が排除され、その可変ドメインはＶＨ２サブクラスに属するのでプロテインＡと結合せず、さらに、２つのプロテインＧ結合部位（一方はそのＦｃ部分中に、他方はそのＣＨ１ドメイン中）が存在する）と、プロテインＡに対する２つの結合部位を有するがプロテインＧに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖は、そのＦｃ領域中でプロテインＧ結合が排除され、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテインＧ結合部位は存在せず、すなわちＣＨ１ドメインは存在しない；２つのプロテインＡ結合部位（一方はそのＦｃ部分中に、他方はそのＶＨドメイン中）も存在する（なぜなら後者はＶＨ３サブクラスに属するからである）とを有すると期待された。他方、２種のホモ二量体免疫グロブリンの一方は、プロテインＧに対する結合部位を有さず、プロテインＡに対する４つの結合部位を有する（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖のホモ二量体）が、他方のホモ二量体免疫グロブリン種は、プロテインＡに対する結合部位を有さず、プロテインＧに対する４つの結合部位を有する（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３重鎖のホモ二量体）。
ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＧおよびＡ結合部位の数が異なることにより、３つ全ての分子を、プロテインＡでの捕捉−溶出クロマトグラフィーステップ
とその後のプロテインＧでの第２捕捉−溶出クロマトグラフィーステップを用いて効率的に分離することが可能になる。
生成の後に、３つ全ての種を含有する細胞培養上清を、一連の２つの捕捉−溶出クロマトグラフィーステップ、すなわちまずプロテインＡおよび次いでプロテインＧ（ともに方法の項に記載したプロトコールに従う）により精製した。図２４に示すように、３つ全ての種は分離された。各精製ステップにて、捕捉−溶出モードで、ホモ二量体免疫グロブリン種のうち一方は、親和性樹脂と結合しないので、効率的に除去された。非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（４〜１２％）ゲルバンドの走査デンシトメトリー分析により、精製された調製物中でヘテロ二量体の割合を評価することが可能である。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ
ＳＰイメージングシステム（Ｗｉｔｅｃ ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および製造者により提供されるプロトコールを用いて、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンが、均質に＞９９％の純度で精製されたことがわかった（図２４Ｃ）。
最終の実施例では、プロテインＡおよびＧ差次的精製法の例を、ＶＨ３ドメイン中のプロテインＡ結合を排除する補完的方法およびＣＨ１ドメイン中のプロテインＧ結合を排除する補完的方法と組み合わせた。
直前の実施例と同様に、抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンを、ｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマットを用いて調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度の差を作製し、ヘテロ二量体同定を容易にした。抗ＨＥＲ２重鎖は、実施例２．１に記載した抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３重鎖（配列番号４２の重鎖）であった。抗ＨＥＲ３重鎖は、実施例２．２に記載した抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖（配列番号５３の重鎖および配列番号４７の軽鎖）であった。
抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３重鎖と抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖との共有結合により得られる抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインＧに対する１つの結合部位を有するがプロテインＡに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３重鎖は、そのＦｃ領域およびＶＨ３ドメイン中でプロテインＡ結合が排除され、さらに、そのＦｃ領域中に１つのプロテインＧ結合部位が存在するが、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテインＧ結合部位は存在せず、すなわちＣＨ１ドメインは存在しない）と、プロテインＡに対する１つの結合部位を有するがプロテインＧに対する結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖は、そのＦｃ領域およびＣＨ１ドメイン中でプロテインＧ結合が排除され、そのＦｃ部分中に１つのプロテインＡ結合部位が存在し、その可変ドメインは、ＶＨ２サブクラスに属するのでプロテインＡと結合しない）とを有すると期待された。他方、２種のホモ二量体免疫グロブリンの一方は、プロテインＧに対する結合部位を有さず、プロテインＡに対する２つの結合部位を有する（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（ＩＧＨＡ１−ＦＧ／Ｇ）−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖のホモ二量体）が、他方のホモ二量体免疫グロブリン種は、プロテインＡに対する結合部位を有さず、プロテインＧに対する２つの結合部位を有する（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ１３３重鎖のホモ二量体）。
ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＧおよびＡ結合部位の数が異なることにより、３つ全ての分子を、プロテインＡでの捕捉−溶出クロマトグラフィーステップとその後のプロテインＧでの第２捕捉−溶出クロマトグラフィーステップを用いて効率的に分離することが可能になる。
生成の後に、３つ全ての種を含有する細胞培養上清を、一連の２つの捕捉−溶出クロマ
トグラフィーステップ、すなわちまずプロテインＡおよび次いでプロテインＧ（ともに方法の項に記載したプロトコールに従う）により精製した。図２５に示すように、３つ全ての種は分離された。各精製ステップにて、捕捉−溶出モードで、ホモ二量体免疫グロブリン種のうち一方は、親和性樹脂と結合しないので、効率的に除去された。非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（４〜１２％）ゲルバンドの走査デンシトメトリー分析により、精製された調製物中でヘテロ二量体の割合を評価することが可能である。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ
ＳＰイメージングシステム（Ｗｉｔｅｃ ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および製造者により提供されるプロトコールを用いて、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンが、均質に＞９９％の純度で精製されたことがわかった（図２５Ｃ）。
この直前の実施例は、ＶＨ３ドメイン中のプロテインＡ結合を排除する補完的方法と、ＣＨ１ドメイン中のプロテインＧ結合を排除する補完的方法とを用いて、ヘテロ二量体免疫グロブリン内のプロテインＡおよびＧ部位の数を調整できることを示す。これらの補完的技術を用いて、よって、差次的精製を可能にする結合部位の数を最小限に減らして、そのことにより、より穏やかな溶出条件を用いることが可能になる。これは、ヘテロ二量体の全体的な回収の点で有利であると期待される特徴である。
プロテインＡおよびＧ排除変異の表面プラズモン共鳴分析
４．１ ヒト新生児Ｆｃ受容体との結合
新生児Ｆｃ受容体との結合は、分解から免疫グロブリンを保護し、それらの半減期を増加させる。よって、プロテインＡまたはＧとの結合を排除または低減するＦｃ領域中で作製した置換が新生児受容体との結合を破壊しないことが必須である。
本明細書で用いる置換がヒトＦｃＲｎ結合に与える影響を評価するために、ＳＰＲ実験をホモ二量体免疫グロブリンに対して行った。工学的に操作されたＦｃ領域を保有する一方の工学的に操作された重鎖と、１つの未改変のＦｃ領域を保有する他方の重鎖とを有する重鎖のヘテロ二量体は、ＳＰＲ実験において用いることができない。なぜなら、未改変の重鎖由来の結合シグナルが、工学的に操作された重鎖に導入された可能性があるいずれの負の影響も埋め合わせる可能性があるからである。
ホモ二量体免疫グロブリンは、全て、ＰＣＴパンフレットＷＯ１０／０９５０３１に開示されるヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体を起源とする同じ可変重鎖と可変軽鎖ドメインを用いてフォーマットした。
ＳＰＲ測定を行う場合、二価分子、例えばホモ二量体免疫グロブリンをセンサチップ上に固定化することが最良である。二価分子を分析物として用いるならば、ＳＰＲ測定は、親和性に加えてアビディティー成分を有する。ソフトウェア分析は、二価の結合化をモデル化し、親和性定数を抽出できるが、可能である場合はいつでも一価分析物を用いて作業することにより、いずれのアビディティーの偏りも回避することが常に好ましい。この目的に沿うために、各ホモ二量体免疫グロブリンを、ＣＭ５センサチップ上に直接結合させた。ベータ２−ミクログロブリンタンパク質と非共有的に結合したアルファ鎖から構成されるヒトＦｃＲｎの可溶型の細胞外領域を調製し、分析物として用いた。
ヒトＦｃＲｎ生成およびＳＰＲ測定の実験手順の詳細は、方法の項で見出すことができる。
重要なことには、全てのバリアントは、ｐＨ６．０にて結合を示し、ｐＨ依存性放出を保持した。ヒトＦｃＲｎに対するこれらの親和性および相対的親和性をそれぞれ図２６および２７に示し、ＳＰＲセンサグラムの例を図２８に示す。
図２６は、プロテインＡまたはプロテインＧ排除に基づく方法において用いた置換についてのＫＤ値を示す。未改変のＩＧＨＧ１対照免疫グロブリンは、約２０００ｎＭのＫＤを有したが、これは、天然ヒトＩＧＨＧ１抗体とヒトＦｃＲｎとの結合について以前に報告されたＫＤ値と一致する値である（１７００〜２５００ｎＭ、Ｚａｌｅｖｓｋｙ Ｊら、（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２８（２）：１５７〜１５９）。プロテインＡ排除法において用いた全てのＩＧＨＧ１−ＩＧＨＧ３ベースの置換は、より上の範囲または天然ヒトＩＧＨＧ１抗体とヒトＦｃＲｎとの結合について観察される値よりも高いＫＤ値を有した（抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ１３３、抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ１１３および抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ）。この観察は、未改変のＩＧＨＧ１対照免疫グロブリンのものに対する相対的結合の点で種々のバリアントの結合を表した場合に、明白であった（図２７）。最小限の置換の対Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆを含むプロテインＡ法で用いた置換は、天然ヒトＩＧＨＧ１対照について観察された結合の７３から７７％だけを保持したが、プロテインＧ法において用いた最小限の置換の対は、９３％の保持を達成した（Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ）。これらの測定から、プロテインＧでの差次的精製の方法が、ヒトＦｃＲｎ結合を維持しながらヘテロ二量体免疫グロブリンを精製するために最も効率的な方法であると結論付けることができる。驚くべきことに、置換Ｎ４３４Ａは、Ｍ４２８Ｇ置換の負の影響を埋め合わせることがわかった（相対的比率がそれぞれ３．１３および０．４５）。
４．２ ヒトＦｃガンマ受容体３ａとの結合
ｈＦｃγＲ３ａに対する抗体親和性は、抗体のＦｃ領域に限定される。Ｆｃ工学操作研究は、Ｆｃ置換がｈＦｃγＲ３ａと結合し、かつ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のようなエフェクター機能を誘発する抗体の能力に大きい影響を与えることができることを示している（Ｓｔｒｏｈｌ ＷＲら（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０（６）：６８５〜９１頁）。
置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４ＡがｈＦｃγＲ３ａ親和性に影響を与えたかを評価するために、ホモ二量体抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ抗体およびアイソタイプ対照抗体（ホモ二量体抗ｈＣＤ１９ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１抗体）を、ｈＦｃγＲ３ａ結合について、ＳＰＲによりアッセイした。組換えｈＦｃγＲ３ａについての測定を行い、結果を図２９に示す。両方の抗体は、ＫＤ値が近く、このことは、置換が特異性または親和性の点で影響を与えなかったことを証明した。よって、ｈＦｃγＲ３ａ結合を著しく失うことなくガンマアイソタイプＦｃ領域内のプロテインＧ結合を工学的に操作するために、置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを広く用いることができることが期待される。
プロテインＡおよびＧ排除置換の免疫原性予測
多くの認可済みキメラ、ヒト化および完全ヒト抗体は、著しい抗薬物抗体応答をヒトにおいて誘導する。中和抗薬物抗体は、薬物−標的相互作用に干渉して、有効性の減少をもたらす。いくつかの場合では、抗薬物抗体は、免疫複合体の形成により毒性を導くことがある。コンピュータモデルおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞シミュレーション試験を開発して、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを予測した。
プロテインＡおよびプロテインＧ排除変異の予測される免疫原性を、ＬｏｎｚａのＥｐｉｂａｓｅプラットフォーム（商標）（Ｌｏｎｚａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて調べた。免疫原性を予測するための構造的バイオインフォーマティクスアプローチであるＥｐｉｂａｓｅ（商標）ｖ．３技術を用いて、標的アミノ酸配列中の可能性のあるＴ細胞エピトープを探索した。この技
術は、ＨＬＡ受容体とのペプチドの実験的に得られる結合親和性とともに、ＨＬＡ受容体の最新の３Ｄ構造の特徴を統合する。実際上、このｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ法は、アミノ酸配列を１０アミノ酸の長さのペプチド（１０マー）に切断し、４３のＤＲＢ１アロタイプ由来のＨＬＡクラスＩＩ受容体とのその結合強度の量の見積を算出する。ヒト抗体生殖系列アミノ酸配列に相当する自己ペプチドは、分析から除外される。
ＩｇＧ Ｆｃ領域中のプロテインＧ結合を排除する置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４ＡならびにＶＨ３ドメインサブクラス中のプロテインＡ結合を排除する置換Ｎ８２ａＳについての免疫原性予測を調べた。
Ｆｃ ＩＧＨＧ１領域と融合した実施例２．１で言及した抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ断片のアミノ酸配列（配列番号６１）を対照配列として用い、さらに改変して、Ｅｐｉｂａｓｅのためのさらに２つのインプット配列を設計した：置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを有する第２アミノ酸配列ならびに置換Ｎ８２ａＳを有する第３アミノ酸配列。
置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを包含するように作製した１６のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏペプチドのうち、１つのペプチドだけが、ＤＲＢ１*１５およびＤＲＢ１*１６についての強いエピトープであると見られ（ＬＨＡＨＹＴＱＫＳＬ（配列番号９９））、その他のＤＲＢ１アロタイプは、この特定のペプチドと中程度の結合を示したかまたは全く結合を示さなかった。１６のうち２つのペプチドが、いくつかのＤＲＢ１アロタイプに対する中程度の親和性を有すると予測された。
置換Ｎ８２ａＳを包含するように作製したペプチドは、強いＤＲＢ１結合を示さなかった。さらに、強く結合すると予測された対照配列由来の１つのペプチドだけが、置換Ｎ８２ａＳを導入した場合に中程度の親和性で結合した。これらの結果を図３０にまとめ、参照抗体としてのＬｏｎｚａから提供されるその他の治療用抗体と比較する。
ＩｇＧ ＦＡＢ領域中のプロテインＧ結合を排除する置換Ｔ２０９Ｇ、Ｔ２０９ＰおよびＫ２１３Ｖについての免疫原性予測を調べた。これらの置換はＥｐｉｂａｓｅを用いて直接試験せず、代わりに、無作為化分析を行って、それらの免疫原性能力を評価した。この分析では、Ｅｐｉｂａｓｅは、全ての可能性のある置換について相対的スコアを与える。スコアが高いほど、この置換について予測される結合がより強い。全体的なＤＲＢ１スコアは、重要なエピトープカウント、影響されるアロタイプの数、および影響されるアロタイプの頻度を考慮に入れる。ここで、置換は、ＣＨ１ ＩＧＨＧ１の関係において分析した（図３１）。好ましい置換Ｋ２１３Ｖは、他の２つのアミノ酸置換と比較して非常に低い免疫原性能力を示した。２０９位の置換は、より高いスコアを与えたが、非常に低い免疫原性の危険性をまだ示した。
全体的に、本実施例で用いた全ての置換は、ヒト治療において現在用いられているヒトまたはヒト化抗体と比較して、低い免疫原性能力を示した。
プロテインＡおよびＧ排除置換の熱安定性分析
ヒトＩｇＧサブクラスについての融解プロファイルは、知られており（Ｇａｒｂｅｒ ＥおよびＤｅｍａｒｅｓｔ ＳＪ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３５５（３）：７５１〜７頁）、全てのプロファイルは、ＣＨ２、ＣＨ３およびＦＡＢ領域の独立したアンフォールディングに相当する３つのアンフォールディング推移を含むことが示されている。４つのヒトＩｇＧサブクラスのうち、ＩＧＨＧ１は最も安定なＣＨ３ドメイン（約８５℃）を有する。その他のＩｇＧサブクラス由来のＣＨ３ドメインは、安定性がより低いが、生理的条件下で約７０℃未満で融解するものは知
られていない。同様に、全てのサブクラスは、約７０℃の融解温度を有するＣＨ２ドメインを有することが知られている。
６．１ プロテインＧ排除置換の熱安定性分析
図３２は、置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを有するヒトホモ二量体Ｆｃ領域（γ１ヒンジ領域とγ１ ＣＨ２ドメインとγ１ ＣＨ３ドメインとを包含する鎖の二量体）、ならびに非置換対照Ｆｃ領域の融解プロファイルを示す。６１．６℃のＴｍを有する第１推移は、ＣＨ２ドメインの融解を表すが、７９．１℃のＴｍを有する第２推移は、ＣＨ３ドメインの融解を表す。これらの２つの推移は、対照Ｆｃ領域について観察される２つの推移とよく対照する。これらの結果から、置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａは、熱安定性の点で与える影響が小さいと結論付けた。なぜなら、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、それぞれ５．９℃および５．２℃の熱安定性を失ったからである。
置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａの影響を、ホモ二量体免疫グロブリンの関係においても調べた。実施例２．２の置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａを有する抗ＨＥＲ３ホモ二量体免疫グロブリンの融解プロファイルを、図３３Ａに示す。このプロファイルは、同じ置換を有するホモ二量体Ｆｃ領域について得られたプロファイルと比較して、８２℃のＴｍを有するさらなる第３の推移を示す（図３２）。このさらなる推移は、ＦＡＢ領域の融解を表すが、その他の２つの推移は、上記のようにＣＨ２およびＣＨ３ドメインの融解を表す。６５℃のＴｍを有する第１の推移は、ＣＨ２ドメインの融解を表し、７９℃のＴｍを有する第２の推移は、ＣＨ３ドメインの融解を表す。この結果から、置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａも、ホモ二量体免疫グロブリン内で熱安定性に与える影響が小さいと結論付けた。なぜなら、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、図３４Ａに示す抗ｈＣＤ１９抗体のような非置換の等価な免疫グロブリンの融解プロファイルと比較して、それぞれ６．１℃および４℃の熱安定性を失ったからである。
最後に、ガンマアイソタイプ由来のＦＡＢ断片内のプロテインＧ結合を排除する置換Ｔ２０９Ｇ、Ｔ２０９ＰおよびＫ２１３Ｖの影響も、ホモ二量体免疫グロブリンの関係において調べた。実施例２．２のＦｃ置換Ｍ４２８ＧおよびＮ４３４Ａと組み合わせて置換Ｔ２０９ＧまたはＴ２０９ＰまたはＫ２１３Ｖを有する抗ＨＥＲ３ホモ二量体免疫グロブリンの融解プロファイルを、図３３Ａおよび３３Ｂに示す。これらのプロファイルは、ＦＡＢ熱安定性が、置換Ｔ２０９ＧおよびＫ２１３Ｖ（それぞれ−３．６℃および−３．４℃）によってわずかに影響されただけであったが、置換Ｔ２０９Ｐは、最大の影響を有し、消失が１０．８℃であったことを示す。置換Ｔ２０９ＧおよびＫ２１３Ｖは、よって、免疫グロブリンを置換してＦＡＢ領域内でプロテインＧ結合を排除する場合に好ましい。
６．２ プロテインＡとの結合が低減されたかまたは結合しないホモ二量体免疫グロブリンの熱安定性分析
Ｆｃ領域中のプロテインＡ結合を低減または排除するガンマアイソタイプＣＨ２およびＣＨ３ドメインの異なる組み合わせの熱安定性を、ホモ二量体免疫グロブリンフォーマットの関係において調べた。実施例４で論じた抗ｈＣＤ１９ホモ二量体免疫グロブリンの融解プロファイルを図３４に示す。これらのプロファイルは、２つの推移を示し、第１の推移は、ＣＨ２ドメインの融解を表し（約７０℃）、第２の推移は、ＦＡＢ領域の融解を表し、これは、ＣＨ３ドメインの融解について期待される推移（約８２℃）とオーバーラップする。これらの結果から、ドメインの組み合わせＦｃ１１３およびＦｃ１３３（ここで、数字は、ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３の順序での各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソタイプサブクラスに対応する）ならびにそれらのＩＧＨＧ１対照（図３４Ａ）は、ほぼ同一の融解プロファイルを有し（−０．８から−２．１℃の差）、よって、これらのドメインの組み合わせは、ホモ二量体免疫グロブリンフォーマット内で熱安定性の点でわずかな影響だけを有したと結論付けた。
プロテインＧ排除置換の薬物動態分析
ヘテロ二量体抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ２抗体および関連するホモ二量体抗ＨＥＲ２対照抗体の薬物動態を調べた。
抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ２ヘテロ二量体免疫グロブリンは、実施例３．２の抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体免疫グロブリンについて記載したように構築および精製し、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａ重鎖（配列番号６２）と抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖（配列番号７８の重鎖および配列番号３１の軽鎖）との共有結合により得られた。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインＧとの結合部位を有さない１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−Ｆｃ Ｍ４２８Ｇ／Ｎ４３４Ａは、そのＦｃ部分中でプロテインＧ結合が排除され、ｓｃＦｖフォーマット中にさらなるプロテインＧ結合部位は存在しない、すなわちＣＨ１ドメインは存在しない）と、プロテインＧに対する２つの結合部位を有する１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖は、ＩＧＨＧ１ Ｆｃ領域中で見出される自然のプロテインＧ結合部位を有し、そのＣＨ１ドメイン中に存在する第２プロテインＧ結合部位を有する）とを有すると期待された。重要なことには、この特定の重鎖組み合わせは、１つの特異性、すなわちＨＥＲ２に対する特異性だけを有するヘテロ二量体免疫グロブリンの生成をもたらした。
ホモ二量体抗ＨＥＲ２対照抗体は、２コピーの抗ＨＥＲ２ ＦＡＢ−Ｆｃ ＩＧＨＧ１重鎖（配列番号７８の重鎖および配列番号３１の軽鎖）の共有的集合から得られ、トラスツズマブとして知られる市販の抗ＨＥＲ２抗体と同一であった（ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２、ｈｕＭＡＢ４Ｄ５−８、商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）。
ＨＥＲ２に対する特異性だけを有する一方の重鎖中のプロテインＧ結合が排除されたこのヘテロ二量体免疫グロブリンを設計して、薬物動態分析において、同じ特異性を有するホモ二量体免疫グロブリンと直接比較ができるようにした。同じ特異性を有することにより、ヘテロ二量体免疫グロブリンと関連するホモ二量体免疫グロブリン対照とは、同様のレベルの標的に関連する分解を有すると期待された。
薬物動態測定（図３５）は、ヘテロおよびホモ二量体抗体について、近い血清半減期を示した。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、およそ１９４±１５時間（約８日）の血清半減期を有したのに比較して、対照ホモ二量体免疫グロブリンについて２４９±５８時間（約１０日）であった（図３６）。
プロテインＡ置換の機能分析
ＨＥＲ３は、乳癌および卵巣癌を含む様々なヒトのがんの腫瘍発生に関与する（Ｈｓｉｅｈ ＡＣおよびＭｏａｓｓｅｒ ＭＭ（２００７）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、９７：４５３〜４５７頁；Ｂａｓｅｌｇａ ＪおよびＳｗａｉｎ ＳＭ（２００９）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、９（７）：４６３〜７５頁）。いくつかの抗ＨＥＲ３抗体が記載され、いくつかは、ヒト臨床試験で調べられている（ＭＭ−１２１抗体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、ＰＣＴパンフレットＷＯ０８／１００６２４）およびＵ３−１２８７またはＡＭＧ−８８８（Ｕ３ ＰｈａｒｍａＡＧ／Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ／Ａｍｇｅｎ、ＰＣＴパンフレットＷＯ０７／０７７０２８）。
ＨＥＲ３および別のがん抗原を標的にする二重特異性抗体は、従来のもの、すなわち「一重特異性」抗ＨＥＲ３抗体よりも大きい治療的影響を有する可能性がある。腫瘍学にお
けるある特に魅力的な標的の組み合わせは、２つのＨＥＲファミリーメンバーを同時に標的にすることである。増殖因子受容体のＨＥＲファミリーのうち、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、またはＨＥＲ２およびＨＥＲ３を、二重特異性抗体を用いて同時に標的にすることについて、記載されている（Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｇら（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２０（４）：４７２〜８６頁；ＭｃＤｏｎａｇｈ ＣＦら（２０１２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、１１（３）：５８２〜９３頁）。
ＨＥＲ３およびＨＥＲ２抗原は、腫瘍学における２つの好ましい標的であるので、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を同時に標的にする重鎖のヘテロ二量体を、本発明のプロテインＡ差次的精製技術を用いて生成することについて調べた。重鎖ヘテロ二量体形成を改善するために、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を同時に標的にするヘテロ二量体免疫グロブリンもＢＥＡＴ（登録商標）技術を使用した。
ＢＥＡＴ抗体は、「穴へのノブのあてはめ」法よりも優れたヘテロ二量体形成を示す生体模倣の独特の概念に基づく重鎖ヘテロ二量体である（ＰＣＴパンフレットＷＯ１２／１３１５５５ Ｂｌｅｉｎ Ｓら）。ＢＥＡＴプラットフォームは、二重特異性抗体を設計するための基礎単位として用いることができる新しいヘテロ二量体を創出するための、自然に存在するホモまたはヘテロ二量体免疫グロブリンドメイン対間の界面交換に基づく。この技術は、任意のタイプの抗原結合の土台に基づく二重特異性抗体の設計を可能にする。ｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマットをここで用いて、抗原結合部位に対する共通軽鎖を開発する必要なく二重特異性抗体を設計する。
実施例２および３に記載した抗ＨＥＲ３抗体由来の可変重鎖および軽鎖ドメインは、ＰＣＴパンフレットＷＯ０７／０７７０２８（Ｒｏｔｈｅ Ｍら）において最初に報告された。この可変重鎖ドメインは、ＶＨ２サブクラスに属するのでプロテインＡと結合しないので、ＶＨ３サブクラスに基づく別の抗ＨＥＲ３抗体を開発して、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンを開発する場合のＶＨ３ドメイン中のプロテインＡ排除の有用性を証明した。
この目的のために、ｓｃＦｖ−ファージディスプレイライブラリーを、方法の項に記載したようにスクリーニングした。ある好ましいｓｃＦｖ断片は、高い熱安定性を示し、親和性成熟のためにさらに選択した（配列番号７９）。ファージディスプレイを用いて抗体を親和性成熟させる技術は、知られている（Ｂｅｎｈａｒ Ｉ（２００７）Ｅｘｐｅｒｔ
Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．、７（５）：７６３〜７９頁）。多様性は、ｓｃＦｖ遺伝子配列内に、ＣＤＲ−Ｈ１（Ｋａｂａｔ残基：３１および３２）およびＣＤＲ−Ｈ２（Ｋａｂａｔ残基：５２、５３、５６および５８）中の同時のＮＮＫ多様化により導入し、全てのその他のＣＤＲは一定に保った。得られた親和性成熟ライブラリーは、２．５×１０ｅ７の多様性を有し、ビオチン化抗原およびストレプトアビジン捕捉を用いる３回の選択を行ったが、ここでは漸減量の抗原とともに非ビオチン化抗原との競合を用いた。１つの好ましい親和性成熟ｓｃＦｖ断片（配列番号８０、配列番号８１のＶＨドメイン、配列番号８２のＶＬドメイン）は、ＨＥＲ３に対してナノモル以下の親和性を有し（ＳＰＲにより測定、データは示さず）、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンにフォーマットするためにさらに選択した。
この親和性成熟ｓｃＦｖ断片は、ＶＨ３サブクラスに基づいたので、置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔナンバリング、配列番号８３）を用いてプロテインＡ結合をまず排除し、次いで、ＦＡＢ断片にフォーマットした（本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）と省略する）。配列番号８４の重鎖および配列番号８５の軽鎖を有する、得られた抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）断片を、次いで、実施例２．１に記載した抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリン由来の上記の抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ断片を有する二重特異性ＢＥＡ
Ｔ抗体の設計に用いた。
ＢＥＡＴ抗体は重鎖ヘテロ二量体であるので、２つの異なる重鎖を区別する必要がある。これらは、本明細書において、ＢＴＡ鎖およびＢＴＢ鎖という。ＢＴＡおよびＢＴＢ鎖は、本明細書で用いる場合、抗原結合部位と、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域と、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプを起源とするＣＨ２ドメインと、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプを起源とする改変ＣＨ３ドメインとを包含する。ＢＴＡおよびＢＴＢ鎖は、適当であれば、プロテインＡおよび／またはＧ結合を非対称的に排除できる。
ＢＥＡＴ抗体の抗ＨＥＲ３部分は、上記の抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）断片と、ＣＨ１γ１領域と、γ１ヒンジ領域と、γ３ ＣＨ２領域と、γ３ベースのＢＴＡ ＣＨ３ドメインとを包含した（配列番号８５を有する同族軽鎖と集合した配列番号８６の完全重鎖配列、本明細書において抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−ＢＴＡ ＩＧＨＧ３重鎖という）。γ３ベースのＢＴＡ ＣＨ３ドメインは、ＷＯ１２／１３１５５５、既出に配列番号７５（ＣＨ３−ＢＴアルファＩＧＨＧ３ドメイン）として記載されている。
ヘテロ２量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２部分は、上記の抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ断片と、ＣＨ１γ１領域と、γ１ヒンジ領域と、γ１ ＣＨ２領域と、γ１ベースのＢＴＢ
ＣＨ３ドメインとを包含した（配列番号８７の完全重鎖配列、本明細書において抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−ＢＴＢ ＩＧＨＧ１重鎖という）。γ１ベースのＢＴＢ ＣＨ３ドメインは、ＷＯ１２／１３１５５５、既出に配列番号１４（置換Ｆ４０５Ａを有するＣＨ３−ＢＴベータドメイン）として記載されている。
これらの２つの重鎖（その同族軽鎖と集合したもの）の集合により得られるヘテロ二量体免疫グロブリンは、本明細書においてＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３という。
まとめると、本明細書に記載するＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３は、抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−ＢＴＡ ＩＧＨＧ３重鎖と抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−ＢＴＢ ＩＧＨＧ１重鎖との共有結合により得られ、よって、プロテインＡに対する結合部位がない１つの重鎖（抗ＨＥＲ３ ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−ＢＴＡ ＩＧＨＧ３重鎖は、そのＦｃ領域中でプロテインＡ結合が排除され、その可変重鎖ドメイン中に存在するプロテインＡ結合部位は、置換Ｎ８２ａＳを用いて排除されている）と、プロテインＡに対する２つの結合部位を有する１つの重鎖（抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ−ＢＴＢ ＩＧＨＧ１重鎖は、ＩＧＨＧ１
Ｆｃ領域中で見出される自然のプロテインＡ結合部位を有し、そのＶＨ３ドメイン中に存在する第２プロテインＡ結合部位を有した）とを有すると期待された。この特定の重鎖組み合わせは、合計で２つのプロテインＡ結合部位を有する対象のＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３とともに、２つのホモ二量体免疫グロブリン種（一方はプロテインＡに対する結合部位を有さず、第２の種は、合計で４つを有する）の生成をもたらした。
ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインＡ結合部位の数が異なることにより、３つ全ての分子を図３７に示すようにプロテインＡ勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能になった（実施例３に記載したものと同じ方法）。
ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３が、肺癌株化細胞Ｃａｌｕ−３のヘレグリン誘発増殖を阻害できるかを決定するために、増殖アッセイの阻害を、方法の項に記載したように行った。図３８Ａは、ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３が、用量依存的様式で、抗ＨＥＲ２および抗ＨＥＲ３対照抗体（それぞれトラスツズマブおよびＷＯ０７／０７７０２８、既出に記載される上記の抗ＨＥＲ３、データは示さず）またはそれらの組み合わせよりも大きい程度でヘレグリン誘発細胞増殖を阻害したことを証明する。さらに、ＢＥＡＴ ＨＥＲ２／ＨＥＲ３は、ＷＯ１０／１０８１２７、既出に記載されるＤＬ１１ｆ抗体、抗ＥＧＦＲ
および抗ＨＥＲ３二重特異性抗体よりも大きい程度でヘレグリン誘発細胞増殖を阻害した（図３８ＢおよびＣ）。

Claims (1)

  1. 免疫グロブリンまたはその断片であって、
    エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチドを含み、
    免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインＧとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
    前記改変が、２５２Ａ／３８０Ａ／３８２Ａ／４３６Ａ／４３８Ａ、２５４Ｍ／３８０Ｍ／３８２Ｌ／４２６Ｍ／４２８Ｇ、４２６Ｍ／４２８Ｇ／４３３Ｄ／４３４Ａ、４２８Ｇ／４３４Ａ、４２８Ｇ／４３４Ｓ（ＥＵナンバリングシステム）からなる群から選択されるアミノ酸置換である、
    免疫グロブリンまたはその断片。
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