JP7403505B2 - Cd3/cd38 t細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン及びその製造方法 - Google Patents
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Description
CD38タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号32のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、並びに配列番号34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む。
CD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号163のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号164のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号165のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、及び配列番号166のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、配列番号167のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号168のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む。
CD38タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、並びに配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号23のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含み、又は
CD38タンパク質複合体に結合する、ポリペプチドのエピトープ結合領域は、配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、並びに配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含み、又は
CD38タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号31のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号32のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、並びに配列番号34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む。
配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号46のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか;又は
配列番号44のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか;又は
配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか;又は
配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか;又は
配列番号45のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号49のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
i) 第一のポリペプチドが配列番号65のアミノ酸配列を有し、配列番号66のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号67、配列番号68、配列番号69、及び配列番号70のアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38;
ii) 第一のポリペプチドが配列番号71のアミノ酸配列を有し、配列番号72のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号67、配列番号68、配列番号69、及び配列番号70のアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38;
iii) 第一のポリペプチドが配列番号73のアミノ酸配列を有し、配列番号74のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号67、配列番号68、配列番号69、及び配列番号70のアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38。
第一のポリペプチドが配列番号75又は76のアミノ酸配列を有し、配列番号77のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号67、配列番号68、配列番号69、及び配列番号70からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38;
第一のポリペプチドが配列番号78のアミノ酸配列を有し、配列番号66のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、CD38に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号67、配列番号68、配列番号69、及び配列番号70からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、CD3イプシロンに結合する、CD3タンパク質複合体及びCD38。
本発明のさらなる態様によれば、(a)CH2ドメイン及び第一の操作されたCH3ドメインを有する免疫グロブリン定常領域を含む第一のポリペプチド;
(b)CH2ドメイン及び第二の操作されたCH3ドメインを有する免疫グロブリン定常領域を含む第二のポリペプチド
を含むヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片が提供され、この場合前記二つのポリペプチドは操作されたそれらのCH3ドメインを介してヘテロ二量体化し、第一のポリペプチドはプロテインA又はプロテインGに結合せず、第二のポリペプチドはその免疫グロブリン定常領域を介してプロテインA及び/又はプロテインGにのみ結合し、この場合第一の操作されたCH3ドメインは次の残基:20、22、26、79、85.1、86、88、90の一又は複数における置換を有し、第二の操作されたCH3ドメインは3、5、20、22、26、27、81、84、85.1、86、88からなる群から選択される少なくとも一の残基における置換を有し、この場合前記第二鎖もIMGT番号付けによる残基84.4における置換を含む。
最も一般的には、組換えプロテインAは、抗体精製用の固定相クロマトグラフィー樹脂に結合される。最適な結合はpH8.2で生ずるが、中性又は生理学的状態(pH7.0-7.6)においても結合は良好である。溶出は、酸性pH(グリシン-HCl、pH2.5-3.0)に対してpHを変化させることにより通常達成される。この溶出法は、タンパク質構造に永久的な影響を及ぼすことなく、ほとんどのタンパク質-タンパク質及び抗体-抗原結合相互作用を効率的に解離させる。それにもかかわらず、一部の抗体及びタンパク質は、低pHにより損傷を受けることもあり、低pH条件に置かれる時間を最低限に抑えるために、回収直後に1/10容量のアルカリ性バッファー、例えば1M トリス-HCl、pH8.0を添加することにより中和するのが最善である。
本発明は、上記のような重及び軽鎖CDRを含み、かつヒト遺伝子IGHV3-23*04(配列番号37)の産物であるか又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域をさらに含むCD3タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号38のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体OKT3の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。好ましくは、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。一般的に、7以下、好ましくは6以下、好ましくは5以下、好ましくは4以下、より好ましくは3以下、なお一層好ましくは2以下、最も好ましくは1以下のアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施態様において、本開示は、CD3タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供するが、この場合重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は34、48、49、58、69、71、及び73からなる群より選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置はKabat番号付けに基づいて示される。好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、I34M、V48I、A49G、R58N、R58Y、I69L、A71T、及びT73Kからなる群より選択される。重鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、34、49、及び71からなる群より選択されるアミノ酸位置にある。重鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、I34M、A49G、及びA71Tからなる群より選択される。
ヘテロ二量体免疫グロブリンを製造する方法は、当該技術分野において知られており、最も単純な方法の一つは、単一細胞内での二の異なる免疫グロブリン鎖の発現を利用することである(国際公開第95/33844号、Lindhofer H & Thierfelder S)。操作を用いないこの単純な方法は、目的のヘテロ二量体よりもホモ二量体種が形成されることにより制限される(Kufer P et al., (2004) Trends Biotechnol., 22(5): 238-244)。重鎖のヘテロ二量化を強化する補完的な技術(Merchant AM et al., (1998) Nat. Biotechnol., 16(7): 677-681)を用いると、より多くのヘテロ二量体の製造が実現し得るが、なおも顕著な量の望ましくないホモ二量体の製造を引き起こす(Jackman J et al., (2010) J Biol Chem., 285(27):20850-9, Klein C et al., (2012) MAbs, 4(6):653-63)。それゆえ本発明は、BEAT(登録商標)法に記載されている方法を利用するが(PCT公開番号:国際公開第2012/131555号)、同方法は先行技術の方法よりも優れたヘテロ二量体化を示すバイオミミクリーという独自の概念に基づく。BEAT法は、天然ホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメイン対間の界面交換に基づき、Fcベースの二重特異性抗体の構成要素として利用可能な新規のヘテロ二量体を作り出す。
ここで各群メンバーのアミノ酸位置は、IMGT(登録商標)番号付けに従って示される。
哺乳動物細胞の一過性発現のための発現ベクターの構築
異なるポリペプチド鎖を一部又は全部コードするcDNAをGENEART AG(ドイツ、レーゲンスブルク)によって最初に遺伝子合成し、これを標準的な分子生物学技法を用いて修飾した。PCR産物を、適切なDNA制限酵素で消化し、精製し、同じDNA制限酵素で予め消化しておいたウシホルモンポリアデニル化物(bovine hormone poly-adenylation)(ポリ(A))とCMVプロモーターとを有する修飾pcDNA3.1プラスミド(スイス、ツークのInvitrogen AG)にライゲートした。すべてのポリペプチド鎖を、この発現ベクターに独立にライゲートした。この場合、分泌は、マウスVJ2Cリーダーペプチドによって引き起こされた。
抗体、ScFv-Fc融合タンパク質、BEAT抗体、及び抗原は、別途明示しない限り、以下に記載のように発現した。一過性発現の場合、操作された各鎖と等量のベクターを、ポリエチレンイミン(PEI;スイス、ブーフスのSigma)を用いて、懸濁適合HEK293-EBNA細胞(英国、テディントンのATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-10852)にコトランスフェクトした。一般的に、1ml当たり細胞0.8-1.2百万個の密度で懸濁状態の細胞100mlを、DNA-PEI混合物と共にトランスフェクトする。操作された各鎖の遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入すると、該細胞を4から5日間さらに培養することにより免疫グロブリン構築物が生成されて、培地(0.1%プルロニック酸、4mM グルタミン、及び0.25μg/mlジェネテシンを補充した、EX-CELL 293、HEK293-無血清培地(Sigma))中への分泌が可能となる。分泌された免疫グロブリンを含有する無細胞培養上清を、遠心分離とその後の滅菌濾過により調製し、さらなる分析で用いた。
生成後、0.2M リン酸クエン酸バッファー(pH6.0)中で事前に平衡化した1mlのHiTrapTM MabSelect SuReTMプロテインAカラム上に無細胞上清を充填し、AKTApurifierTMクロマトグラフィーシステム(いずれもGE Healthcare Europe GmbH製;カラムカタログ番号:11-0034-93)で、流速1ml/分で稼働させた。ランニングバッファーは、0.2M リン酸クエン酸バッファー(pH6)であった。目的のヘテロ二量体の溶出を、20mM クエン酸ナトリウムバッファー(pH4)を用いて実施する一方、ホモ二量体種を0.1M グリシン(pH3.0)で溶出した。
溶出後、280nmでのOD読み取りを行い、目的のヘテロ二量体を含有する画分をプールし、0.1容量の1M トリス(pH8.0)(Sigma)で中和した。
上清、通過画分、及び溶出分画をSDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12%アクリルアミド、スイス、バーセルのInvitrogen AG)により非還元条件下で分析した。
熱量測定法を用い、抗体の熱安定性を比較した。熱量測定を、VP-DSC示差走査式マイクロカロリメーター(differential scanning microcalorimeter)(スイス、グラットブルックのGE Healthcare Europe GmbH)で実施した。細胞容積は0.128mlであり、加熱速度は1℃/分であった。また、過剰圧力は64p.s.iに保った。タンパク質断片はすべて、PBS(pH7.4)中1-0.5mg/mlの濃度で用いた。各タンパク質のモル熱容量を、同一のバッファーを含有するがタンパク質が省略された重複試料との比較により見積もった。部分的なモル熱容量及び融解曲線を、標準手順を用いて分析した。サーモグラムは、ベースライン補正し、濃度を正規化した後、Origin v7.0ソフトウェア内の非二状態モデル(Non-Two State model)を用いてさらに分析した。
非還元試料調製
40μgの脱塩したタンパク質試料を、5mMのヨードアセトアミド(Sigma)を含有するSDS試料バッファー(スイス、ニヨンのBeckman Coulter International S.A.;IgG Purity Kit、カタログ番号A10663)中で緩衝した。10kDaの内部標準をこの試料に添加した。試料混合物を、70℃で10分間加熱した。
試料調製後、220nmに設定したフォトダイオードアレイ検出器(DAD)が取り付けられたProteomeLab PA 800(スイス、ニヨンのBeckman Coulter International S.A.)で、試料を測定した。ID50μm×30.2cm(検出器までの有効長さ20.2cm)のベア溶融シリカキャピラリー(bare-fused silica capillary)を分離メディウムとして用いた。試料注入及び分離を、SDS-分子量ゲルバッファー中にて、逆極性で、それぞれ5及び15kVの定電圧で実施した。2Hzの速度でデータを記録し、電流は分離の間中、安定であった。キャピラリー及び試料を25℃にサーモスタット制御した。
SPR分析を用いて、異なる抗体(マウス及びヒト化抗体)の結合反応速度に関する結合及び解離速度定数を測定した。抗体の結合反応速度は、BIAcore 2000装置(スイス、グラットブルックのGE Healthcare Europe GmbH)で室温で測定し、BiaEvaluationソフトウェア(バージョン4.1、BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH)を用いて分析した。
測定は、市販のアミンカップリングキット(GE Healthcare Europe GmbH、カタログ番号:BR-1000-50)を使用して、目的のリガンドと個々に結合したCM5センサーチップ(GE Healthcare Europe GmbH、カタログ番号:BR-1000-14)で実施した。プロテインGリガンドは、Pierce(スイス、ローザンヌのThermo Fisher Scientific-Perbio Science S.A、カタログ番号:21193)からのものであった。
HPB-ALL細胞(ドイツ、ブラウンシュワイクのDSMZ、カタログ番号:ACC483)を、FACS染色用のCD3陽性細胞株として用いた。HPB-ALLを、10%FCS、100U/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンを補充したRPMI 1640中で維持した。キメラOKT3抗体及びヒト化バリアントの100μl希釈系列を、氷上で45分間(FACSバッファとしてで参照)、1%BSA及び0.1%アジ化ナトリウム(FACSバッファーという)を補充したPBS中の4×105HPB-ALL細胞とともにインキュベートした。無関係のヒトIgG1をアイソタイプコントロールとして、またキメラOKT3抗体をポジティブコントロールとして使用した。洗浄後、細胞を氷上で45分間、抗ヒトFc-PE(オーストリア、ウィーンのEBioscience)の1/200希釈物とともにインキュベートした。次いで、細胞を再び洗浄し、200μlのFACSバッファーに再懸濁させた。各試料の相対平均蛍光発光を、FACSCalibur(スイス、アルシュヴィルのBD Biosciences)で測定した。結果を、キメラOKT3抗体と比較したHBP-ALLの相対的染色として、図1に要約する。
ヒトCD38陽性細胞株
CD38抗原を発現するヒト細胞は、PCT公開番号:国際公開第2005103083号、国際公開第2008047242号、国際公開第2011154453号、及び国際公開第2012092612号に記載されている。本明細書で使用されるCD38陽性ヒト細胞株は以下の通りであった。
安定な組換えCHO[CD38]細胞
Source Biosciences(ドイツのベルリン、カタログ番号:IRAU37D11、4309086)で注文したヒトCD38をコードする遺伝子。ヒトCD38は、コザック配列、開始コドン、それに続いてシグナルペプチド(マウスのVリーダー)を5’末端に、NheI制限部位3’末端に付加したプライマーを用いて増幅させた。アンプリコンを、NheI及びHindIIIを用いて切断し、自社で開発したpcDNA3.1(Invitrogen AG)由来のベクターであるpT1の発現カセットにクローニングした。pT1の発現カセットは、多シストロン性mRNA上の二のIRES(内部リボソーム侵入部位)を用い、目的の遺伝子の発現をGFP及びPAC(ピューロマイシン耐性のための遺伝子)の発現と結び付ける。プラスミドのミディプレップを調製した。また、クローンCD38のオープンリーディングフレームをDNA配列決定により確認した。懸濁CHO-S細胞(Invitrogen AG)を、50mLバイオリアクター式(TubeSpin50バイオリアクター、スイス、トラザーディンゲンのTPP)中でポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、フランス、イルキーチュのPolyplus-transfection)を用いてトランスフェクトした。この目的のために、指数増殖細胞をOptiMEM培地(Invitrogen AG、カタログ番号:31985-047)に播種した。これらの細胞にJetPEI(登録商標):DNA複合体を添加した。エキソサイトーシスのために振とう(200 RPM)下37℃でJetPEI(登録商標):DNA複合体とともに5時間インキュベートした後、4mM Glnを補充した1容量の培地PowerCHO2(スイス、ベットラッハのLonza、販売店RUWAG Lifescience、カタログ番号:BE12-771Q)を細胞懸濁液に添加した。次いで、細胞を37℃、5%CO2及び80%湿度の振とうプラットフォーム上でインキュベートした。トランスフェクションの1日後、ピューロマイシン(Sigma、カタログ番号:P8833-25mg)を含有する選択培地中に異なる濃度で、細胞を96ウェルプレートに播種した。静状態で約14日間の選択後、TubeSpin 50バイオリアクターを用いて、46個の高GFP発現細胞プールを懸濁培養物として増やした。懸濁液にうまく適合したら、細胞のCD38についての分析をFACSにより行った。均一なCD38染色プロフィールを有する安定なCHO[CD38]クローンを選択し、ここで使用した。
その他のCD38陽性細胞株は以下を含む。
NCI-H929(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-9068)。
Namalwa(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CRL-1432)。
U266(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:TIB-196)
RPMI 8226(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-155)。
培養条件:10%熱不活性化FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen AG)、及び1%GlutaMAX-1(Invitrogen AG)を補充したRPMI 1640培地
Raji(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-86)
Daudi(ATCC-LGL標準品;カタログ番号:CCL-213)
ヒトCD3ガンマ-イプシロン-Fc融合タンパク質
26残基ペプチドリンカー(配列:GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS;配列番号169)によりヒトCD3イプシロン細胞外領域(UniProtアクセッション番号:P07766、残基22-118(配列番号185))と融合した、ヒトCD3ガンマ細胞外領域をコードするcDNA(UniProtアクセッション番号:P09693 残基23-103(配列番号184);UniProt Consortium (2013) Nucleic Acids Res., 41(データべース特集号(Database issue)):D43-7;http://www.uniprot.org/)を、GENEART AG(ドイツ、レーゲンスブルク)により最初に合成した。この合成遺伝子を、標準的なオーバーラップPCR法を用いてヒトIgG1 Fc部分と融合させ、ヒトIgG1 Fc cDNAテンプレートもGeneart AGから入手した。得られたcDNAを上記修飾pcDNA3.1プラスミドにクローニングした。
ヒトCD3イプシロンペプチド1-26をコードするcDNA(UniProtアクセッション番号:P07766、アミノ酸23-48、配列番号171)及びカニクイザルCD3イプシロンペプチド1-26(UniProtアクセッション番号:Q95LI5、アミノ酸22-47、配列番号172)をコードするcDNAを、ヒト及びカニクイザルCD3イプシロン細胞外領域それぞれについて、GENEART AGから入手した合成cDNAからPCR増幅させた。続いて、増幅された産物を、標準的なオーバーラップPCR法を用いてヒトIgG1 Fc部分と融合させた。ヒトIgG1 Fc cDNAテンプレートは、Geneart AGから入手した。得られたcDNAを上記修飾pcDNA3.1プラスミドにクローニングした。
ヒトCD38のcDNAをSource Biosciences(ドイツのErwin-Negelein-Haus、カタログ番号:IRAU37D11、4309086)から得、その細胞外領域(UniProtアクセッション番号:P28907 残基43-300)をPCR増幅し、pcDNA3.1(Invitrogen Ag)由来の自社製発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターは、コザック配列及び開始コドン、それに続いて、多重クローニング部位の5’末端に対するマウスVJ2Cリーダーペプチド及び3’末端に対する6-His-タグを包含した。6-His-タグと融合したヒトCD38の可溶性細胞外領域(配列番号175)は、次のように発現させ、精製した:HEK細胞、0.1%プルロニック酸(Invitrogen AG)、発現ベクター、及びポリエチレンイミン(JetPEI(登録商標)、フランス、イルキーチュのPolyplus-transfection)を含有する1容量のRPMI1640培地(PAA Laboratories、カタログ番号E15-039)を37℃、5%CO2及び80%湿度の振とうフラスコ中でインキュベートした。6mMのグルタミンを補充した1容量のExCell293培地を4時間後に混合物に添加し、さらに5日間インキュベーションを続けた。ポストプロダクション、無細胞上清を遠心分離により調製し、0.2μmフィルターを用いて濾過し、1Mトリス(pH8.7)を用いてpHを7.4(4℃)に調整した。Ni-Sepharose Excellビーズ(GE Healthcare、カタログ番号:17-3712-03)を溶液に添加し、撹拌しながら4℃で一晩インキュベートした。自然流下による精製(gravity-flow purification)のために、その溶液をEcono-Column(スイス、ライナハのBio-Rad Laboratories AG、カタログ番号:737-4252)に充填した。ビーズをPBS(2×)、20mMイミダゾールで洗浄し、タンパク質をPBS、500mMイミダゾール中で溶出させた。溶出画分をプールし、4℃で2回の透析工程によりバッファーをPBSと交換した。精製したヒトCD38細胞外領域を、0.22μmシリンジフィルターを用いて濾過した。
末梢血単核細胞の調製
末梢血単核細胞(PBMC)を製造するために、ヒト白血球含有血液フィルターをスイス、La Chaux-de-Fondsの血液採集センター(Blood Collection Centre)(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Serologie,rue Sophie-Mairet 29,CH-2300)から集めた。10U/mlのリケミン(liquemin)(スイス、ルツェルンのDrossapharm AG)を含有する60mlのPBSとともにバックフラッシングすることにより、細胞をフィルターから除去した。次いで、50mLのBlood-Sep-Filter Tube(スイス、バーゼルのBrunschwig)を用い、製造者の指示通りにPBMCを精製した。室温で800gで20分間、管を遠心分離し(ブレーキなし)、細胞を界面から回収した。FBS又はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を含まないロズウェルパーク記念研究所(RPMI、オーストリア、パッシングのPAA Laboratories)培地で細胞を3回洗浄した。RDL培地(10%熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS)及びペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI)中に10e6細胞/mLでPBMCを再懸濁させ、アッセイ前に5%CO2インキュベーター内で37℃で一晩培養した。
T細胞精製は、pan-T細胞単離キットII(ドイツ、ベルギッヒグラヂバッハのMyltenyi Biotec GmbH、カタログ番号130-091-156)を使用し、製造業者の支持通りにPBMC単離後すぐに行った。精製後、T細胞をRDL培地中に10e6細胞/mLで再懸濁させ、アッセイ前に5%CO2インキュベーター内で37℃で一晩培養した。
かなり類似した結果の二の異なる読み取りを使用して、リダイレクトキリングを定量化した。
2.1 ヒトCD3抗原に対する抗原結合部位
ヒトCD3イプシロンサブユニットは、二重特異性の関与を介してT細胞リダイレクトキリングを引き起こすように選択された。
本明細書で使用される抗ヒトCD3イプシロン抗原結合部位は、マウスOKT3抗体(Janssen-Cilagにより市販され、その後販売中止されたMuromonab-CD3、商品名Orthoclone OKT3;それぞれ配列番号38及び41を有するマウス可変重鎖及び軽鎖ドメイン)。OKT3マウス可変ドメインをヒト化し、scFv及びFAB断片トとしてフォーマットした。
マウス抗体SP34は、1985年に最初に記述された(Pessano S et al., (1985) EMBO J, 4(2):337-44)。それは、HPB-ALL細胞からの変性タンパク質抽出物で免疫したマウスから得られたハイブリドーマによって産生され、該抗体はヒト特異性及びカニクイザルに対する交差反応性を有する。
CD38は、造血細胞及び固形組織に通常見られるII型膜貫通糖タンパク質である。CD38は、様々な悪性血液病においても発現する。T細胞をリダイレクトしてCD38陽性がん細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、多発性骨髄腫、B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞急性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性/骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、NK細胞白血病、及び形質細胞白血病を含む様々な悪性血液病を治療するのに有用であろう。いくつかの抗CD38抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている(PCT公開番号:国際公開第2006099875号)。最もよく特徴がわかっている抗ヒトCD38抗体の中には、OKT-10及びHB-7マウスハイブリドーマがある(Hoshino S et al., (1997) J Immunol, 158(2): 741-7)。
抗CD38及び抗CD3イプシロンアームは、BEAT鎖と融合したscFv断片からなるscFv-Fc型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のBEAT鎖と融合したFAB断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。FABベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトCD38アームに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.2に記載)の組合せを用いて、BEAT CD38/CD3抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD38アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号72)と組み立てられた、g1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号153)から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにg3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号154)から構成された。この重鎖はヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、したがってプロテインAとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はVH3フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有したため、VHドメインをN82aS置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインA結合部位も除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT CD38-HB7ベストフィット/CD3抗体という(図8 フォーマットA)。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号68)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT CD38-9G7ベストフレームワーク/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号68)から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではBEAT CD38-767/CD3(SP34-カッパ2)抗体という。
ヒト化HB7/ベストフィットVH及びVL配列を用いてヒトCD38抗原及びヒトCD3イプシロンの両方を標的とするBEAT抗体の例は、次のようにフォーマットされた:抗ヒトCD3イプシロン及び抗ヒトCD38アームに対する抗原結合部位(それぞれ実施例2.1及び2.2に記載)の組み合わせを用いて、BEAT CD38/CD3を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD38アームは、可変重鎖領域、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg3 CH2領域、並びにその同族軽鎖(配列番号72)と組み立てられた、g3ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号71)から構成された。この重鎖は、ヒトIgG3 Fc領域の一部を包含し、非VH3ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、プロテインAへの結合を有しなかった。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトCD3イプシロンアームは、scFv断片、CH1 g1領域、g1ヒンジ領域、L234A及びL235A置換(EU番号付け)を有するg1 CH2領域、並びにg1ベースのBEAT CH3ドメインを包含するBEAT重鎖(配列番号157)から構成された。この重鎖及び軽会合体は、PCT公開番号:国際公開第2008119565号に記載されているような抗ヒトCD3イプシロン抗体(SP34)のヒト化バージョンを包含した。このBEAT抗体フォーマットは、本明細書ではBEAT CD38-HB7ベストフィット/CD3(SP34)抗体という(図12 フォーマットA)。
種々のSP34 scFvを、その発現を改善するように行った修飾が機能的特性、すなわちCD3の結合にも影響を与えたかどうかを決定するために、CD38×CD3二重特異性に関して試験した。FABとして存在するCD38結合アームは、配列番号60によってコードされる重鎖可変領域と、配列番号61によってコードされる軽鎖可変領域とを含む。CD3結合アームは、scFv(配列番号207)として再フォーマットされた元のマウスSP34、又は重/軽鎖組み合わせH1/L21(配列番号67)、H5/L32(配列番号68)、H5/L65(配列番号69)、及びH5/L67(配列番号70)を含む修飾ヒト化SP34 scFvを含む。
分析の目的で本発明者らは、FAB×scFv BEAT抗体のBTA及びBTBホモ二量体を製造したが、この場合FABアーム(BTAホモ二量体)は、上記と同様に、非VH3可変ドメイン及びヒトIgG3 Fc領域の一部を包含したことからプロテインAに結合せず、そのVH3ベースの可変ドメイン及びそのヒトIgG1 Fc領域の両方を用いて、scFvアーム(BTBホモ二量体)がプロテインAに結合した。(上記のような)発現及び精製時に、本発明者らは、BTAホモ二量体はプロテインG(重鎖配列番号156及び軽鎖配列番号74)によって容易に精製され得る。一方、BTBホモ二量体は、プロテインAによってしか単離することができず、プロテインGには結合しなかったことを見出した。これは、例えばBTB CH3ドメイン(配列番号159)を有するFc領域内のプロテインG結合部位におけるミスフォールディング又は立体構造の変化を示唆する。(CH2-CH3界面において)プロテインGはプロテインAが結合するのとほぼ同じFc領域の部分に結合することを考慮すると、BTBホモ二量体がプロテインAに結合するがプロテインGには結合しないことは、驚くべきことである。それで、BTBホモ二量体によるプロテインA結合は、上記のようにVH3ベースの可変ドメインを包含するscFv部分に位置するプロテインA結合部位によってのみ媒介されると仮定された。プロテインAへの結合に対するscFvの関与を評価するために、VH3ベースのscFvを欠く構築物を製造し、プロテインAに結合しないことが分かった(配列番号160、図17参照)。BTBホモ二量体において、Fc領域内のプロテインA及びG結合部位は、両方とも非機能的であると結論づけられた。
カニクイザル(macaca fascicularis、1用量当たりオス1匹、メス1匹)に、本実施例ではCD3/CD38 BEATという、CD3/CD38(scFv配列番号69としてフォーマットされた、CD3重鎖/軽鎖の組合せSP34 H5/L65と、FABとしてフォーマットされた、配列番号60によりコードされるCD38重鎖可変領域及び配列番号61によりコードされる軽鎖可変領域とを含む)を静脈内ボーラス注入によりを投与した。
二の異なる9G7ベースのBEAT抗体対OKT10ベースのBEAT抗体の力価をRDLアッセイで調べた。
1498705185381_0
2011 Apr 28;117(17):4542-51; Friedrich et al. Mol Cancer Ther 2012;11:2664-2673; Schlereth et al. Cancer Res 2005;65:2882-2889において用いられいた。エフェクター細胞は、健康なドナーからの非刺激PBMCであった。エフェクター:標的比は典型的には10:1であり、インキュベーション時間は48時間であった。簡潔に述べると、標的細胞(Daudi)をCFSEなどの蛍光細胞質色素で標識し、96ウェルプレート(TPP)に分配した。抗体段階希釈液(3×溶液)及びPBMC(50μL/ウェル)を分配し、次いで対応するウェルに分配した。プレートを37℃、5%CO2のインキュベーター内で48時間インキュベートした。細胞をピペッティングにより再懸濁させ、U底96ウェルプレート(TPP)に移した。U底プレートを300gで3分間遠心分離し、上清を捨て、1/40希釈で7-AAD(Becton Dickinson)を補充した冷FACSバッファー(PBS+2%FBS+10%バーゼン液)200μlに細胞を再懸濁させた。プレートは、guava easyCyteTM Flow Cytometer(Millipore)ですぐに得られた。各ウェルについて、flowjoソフトウェア(Treestar)を用いて色素(CFSE)陽性7ADD陰性集団についてゲーティングすることにより、生存標的細胞の絶対数を決定した。標的細胞のみをベースラインとしてインキュベートした条件又は標的細胞をPBMCと混合した条件(抗体なし条件)を用いて、各試料の特異的細胞傷害性の%を決定した。EC50値は、Prismソフトウェア(GraphPad Software)を用いた非線形変動傾き回帰法を用いて決定した。
CD38にはシグナル伝達能力があることから、9G7及び767抗体のアゴニスト特性を、CD38を本来発現するJurkatヒトT細胞リンパ腫細胞株のカルシウムフラックスアッセイにおいて、HB7クローンと比較して試験した。Jurkat細胞に2μMのFluo-4色素(Invitrogen)を37℃で1時間かけて負荷した。細胞を洗浄し、1mMのCa2+及び1mMのMg2+を補充したPBS PBSに再懸濁させた。ベースラインについて試料を、FACScaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)で40秒間測定した。次いで、試験抗体を10μg/mlの濃度で試料に添加し、再び7分まで測定を続けた。図Gは、Fluo-4色素(FL-1チャネル)の平均蛍光強度(MFI)を示し、時間の関数として、細胞の細胞質へのカルシウム動員の読み取りである。アイソタイプコントロール(IgG1ヒト抗体)は、カルシウムフラックスを誘発しなかったが、HB7抗CD38抗体は強いシグナルを誘導した。驚くべきことに、9G7抗体も767抗体も、HB7抗体とは対照的に、これらの抗体がCD38アゴニスト特性を有していないことを示すカルシウム動員シグナルを誘発することができなかった。
h9G7エピトープマッピング
線状ペプチドマッピングを使用して、ヒト化9G7(ベストフィットバージョン)のエピトープを決定した。ヒトCD38の細胞外ドメイン(残基43-300)を13アミノ酸長の19連続ペプチド、及び11アミノ酸長の最終ペプチドに分けた。Fc配列とペプチド配列との間に2アミノ酸リンカー(Ala-Ser)を有するヒトIgG1 Fc領域(CH2-CH3)にペプチドを融合させた。このような構築物をF1-F20(配列番号182-201)と命名し、それらの結合をSPRにより分析した。ヒト化9G7抗体(重鎖配列番号145及び軽鎖配列番号146)をCM5センサーチップに共有結合的に固定化した(約1800RU)。ペプチドFc融合物を15nMで240秒間注入した。ヒトCD38細胞外ドメインをコントロールとして注入した。F6及びコントロールのみが結合シグナル発した(図22)。すべての断片を200nMで再注入したところ、F6はより強いシグナルを発したが(図23)、残りの断片は依然として結合を示さなかった(データは示さず)。F6はPCT公開番号:国際公開第2008047242号に開示のSAR650984抗体(配列番号202を有する重鎖及び配列番号203を有する軽鎖)のエピトープの一部であるため、それらの相互作用はSPRによって、実証され、確認された(データは示さず)。したがって、h9G7及びSAR650984は、ヒトCD38に対する結合について競合する。さらに、F6配列をヒトCD38の細胞外ドメインの3D表面上にマッピングすると、SAR650984エピトープと重複する。ただし、SAR650984はカニクイザルCD38と交差反応性ではないことが示されていながら、一方、ヒト化9G7は、カニクイザルCD38に高親和性で結合する(図24)。このことは、この二の抗体が重複するが異なるエピトープを有することを示唆する。
767抗体のエピトープは、上記のエピトープマッピング実験に用いた線状ペプチド-Fc融合体の同じセットを用いてマッピングされた。767抗体(重鎖配列番号151及び軽鎖配列番号152)をCM5センサーチップに共有結合的に固定化した(約1800RU)。ペプチドFc融合体(F1-F20、配列番号182-201)を1000nMで240秒間注入した。ヒトCD38細胞外の細胞外ドメインをコントロールとして注入した。F3及びコントロールのみが結合シグナル発した(図25)。F3配列をヒトCD38の細胞外ドメインの3D表面上にマッピングすると(図26)、SAR650984エピトープと、より具体的には二つの残基:E76及びH79と部分的に重複する。しかしながら、767はカニクイザルCD38に対して交差反応性である(親和性はより低い)一方、SAR650984はそうではない。このことは、この二の抗体が重複しているが異なるエピトープを有することを示唆している。さらに、SAR650984は、SPRによってF3構築物に結合しなかった(図27)。したがって、767とSAR650984はヒトCD38に対する結合について競合するが、これらの抗体によって結合される残基は同一ではないと結論づけることができる。
Claims (13)
- 配列番号25若しくは配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、及び配列番号26若しくは配列番号209のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号27若しくは配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;及び配列番号28若しくは配列番号211若しくは配列番号214のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、及び配列番号29若しくは配列番号212のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号30若しくは配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、ヒトCD38に結合する、抗体又はその抗体断片。
- マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項1に記載の抗体又はその抗体断片。
- 抗体又はその抗体断片が配列番号52、配列番号58、配列番号60からなるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列か、又は前記重鎖可変領域配列のいずれかの非CDR領域と少なくとも80%同一の配列を含み、かつ/あるいは抗体又はその抗体断片が配列番号55、配列番号59、配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列、又は前記軽鎖可変領域配列のいずれか一つの非CDR領域と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗体断片。
- 抗体又はその抗体断片が配列番号73、配列番号75、配列番号76、配列番号145、配列番号147、配列番号149からなるアミノ酸配列を含む重鎖配列か、又は前記重鎖配列のいずれかの非CDR領域と少なくとも80%同一の配列を含み、かつ/あるいは抗体又はその抗体断片が配列番号74、配列番号77、配列番号146、配列番号148、配列番号150のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列か、又は前記軽鎖可変領域配列のいずれか一つの非CDR領域と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗体断片。
- 前記抗体又はその抗体断片がヒト重及び/又は軽鎖定常領域を含み、かつヒト重定常領域がIGHG1、非フコシル化IGHG1、及びIGHG4からなるヒト免疫グロブリンの群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗体断片。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の抗CD38抗体断片を含む、二重特異性抗体。
- 前記抗CD38抗体断片がFab、Fab’、Fab’-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab’)2、scFv、二重特異性一本鎖Fv二量体、ダイアボディ、トリアボディ、及びscFvからなる群より選択される、請求項6に記載の二重特異性抗体。
- Fab、Fab’、Fab’-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab’)2、scFv、二重特異性一本鎖Fv二量体、ダイアボディ、トリアボディ、及びscFvからなる群より選択される抗CD3抗体断片をさらに含む、請求項6又は7に記載の二重特異性抗体。
- 前記抗CD3抗体断片が配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号5又は配列番号9のアミノ酸配列とを含む重鎖CDR3、及び配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、配列番号7、配列番号11のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号8、配列番号10、配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含み、又は
前記抗CD3抗体断片が配列番号163のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号164のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号165のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、及び配列番号166のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、配列番号167のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号168のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む、請求項8に記載の二重特異性抗体。 - 請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗体断片又は請求項6から9のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗体断片又は請求項6から9のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体を含む、治療剤と連結されたイムノコンジュゲート。
- 医薬としての使用のための、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗体断片又は請求項6から9のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体。
- 多発性骨髄腫、B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞急性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性/骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、NK細胞白血病、及び形質細胞白血病を含む悪性血液病からなる群から選択される疾患を治療することにおける医薬としての使用のための、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗体断片又は請求項6から9のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体。
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