JP2022116326A - ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製 - Google Patents
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Abstract
Description
テインAまたはGに対する親和性を喪失させる特異的置換を、ヘテロ二量体免疫グロブリ
ンの一方の重鎖に導入できる。本発明のさらなる態様では、プロテインAに対する親和性
を喪失させる置換をヘテロ二量体免疫グロブリンの一方の重鎖に導入でき、プロテインG
に対する親和性を喪失させる置換をヘテロ二量体免疫グロブリンの他方の重鎖に導入し、
そのことによりプロテインAおよびプロテインG親和性クロマトグラフィーの組み合わせ
を用いてヘテロ二量体免疫グロブリンを容易に精製するための方法を提供する。
最も単純な方法の1つは、単一細胞中で2つの異なる免疫グロブリン鎖を発現させること
に依拠する(WO95/33844、Lindhofer HおよびThierfeld
er S)。工学的操作なしで、この単純な方法は、対象のヘテロ二量体を超えるホモ二
量体種の形成により制限される(Kuferら、(2004)Trends Biote
chnol.、22(5):238~244頁)。重鎖ヘテロ二量体形成を増加させる補
完的技術を用いる場合(Merchant AMら、(1998)Nat.Biotec
hnol.、16(7):677~681頁)、より多いヘテロ二量体生成が達成できる
が、著しい量の望ましくないホモ二量体がまだ生成される(Jackman Jら、(2
010)J Biol Chem.、285(27):20850~9頁、Klein
Cら、(2012)MAbs、4(6):653~63頁)。
体を容易に回収する技術が知られている。差次的親和性技術の最初の例は、2種の異なる
動物由来の2つの異なる重鎖であって、そのうちの一方が親和性試薬プロテインAと結合
しない重鎖の使用を含んだ(Lindhofer Hら、(1995)J Immuno
l.、155(1):219~225頁)。同じ著者らは、2つの異なるヒト免疫グロブ
リンアイソタイプ(IGHG1およびIGHG3)を起源とする2つの異なる重鎖であっ
て、そのうちの1つが親和性試薬プロテインAと結合しない重鎖の使用についても記載し
た(IGHG3;US6,551,592 Lindhofer Hらを参照されたい)
。後者の技術の変形が、WO10/151792(Davis Sら)に記載され、これ
は、一方のヘテロ二量体重鎖における試薬プロテインAに対する親和性を排除するための
、Jendebergら(Jendebergら、(1997)J.Immunol.M
ethods、201(1):25~34頁)により記載された2つのアミノ酸置換H4
35R/Y436Fの使用を含んだ。
り精製方法に干渉するさらなるプロテインA結合部位を創出する可能性があるVH3ドメ
インの寄与についてこの技術が対処していないことである。
する勾配モードのクロマトグラフィーを好ましく用いる。捕捉-溶出モードを用いて対象
のヘテロ二量体から重鎖の2つのホモ二量体を容易に分離するために、2つの異なる精製
方法を逐次的に行う必要がある。
るためのヘテロ二量体抗体の一方のCH1ドメインの改変に基づく差次的精製技術の組み
合わせが提案されている(PCTパンフレットWO13/136186 Fischer
Nら)。しかし、この技術の欠点は、少なくとも一方の重鎖が、両方のホモ二量体を除
去するためにCH1領域を包含する必要があり、そのことによりこの技術の範囲が制限さ
れることである。よって、抗原結合部位の改変を回避するように免疫グロブリンのFc領
域に限定された領域と理想的に結合して、第2の親和性試薬との結合の差を創出し、かつ
任意の抗原結合の土台に修正できる、差次的プロテインA精製技術を補完する技術に対す
る必要性が存在する。
イソタイプの自然に存在するヒト免疫グロブリン(IGHG1、IGHG2およびIGH
G4;Jendebergら、(1997)、既出ならびにNezlin RおよびGh
etie V、(2004)Advances in Immunology、Acad
emic Press、第82巻:155~215頁)では、各重鎖は、CH2-CH3
ドメイン界面に2つの細菌の表面タンパク質それぞれに対する結合部位を保有する。重鎖
においてプロテインAおよびプロテインGに対する結合部位はオーバーラップするので、
プロテインG結合を低減させるまたは喪失させる特異的置換は、上記のプロテインAベー
スの方法と同様の方法で重鎖のヘテロ二量体を精製するために有用である。さらに、プロ
テインGに基づく差次的親和性方法は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの精製の新しい方策
を提供する。両方の差次的親和性方法を組み合わせることは、高い純度で、いずれの形の
勾配溶出も行うことなく重鎖のヘテロ二量体を容易に調製するために有利である。このア
プローチでは、重鎖のヘテロ二量体は、プロテインAと結合するがプロテインGとの結合
が低減されているかまたは結合しない一方の重鎖を有し、他方の重鎖は、プロテインGと
結合するが、プロテインAとの結合が低減されているかまたは結合しない。
体中の免疫グロブリンの実験的に解明された結晶構造(プロテインデータバンク(PDB
)データベース;www.pdb.org)から導き出すことができるが、プロテインA
、プロテインGおよびFcRn受容体に対する結合部位は同じCH2-CH3ドメイン界
面にてオーバーラップするので、プロテインAまたはプロテインGのいずれかに対する親
和性に対する効果、さらにFcRn親和性に与えるその影響の点で、いずれの置換による
結果も予測することは不可能である。
ロ二量体免疫グロブリンは、2つの異なる重鎖(重鎖のヘテロ二量体)を有し、それらに
限定されないが、全長二重特異性抗体、一価FAB-Fc融合体および二重特異性scF
v/FAB Fc融合体を含む。
ンAの両方との結合が低減または喪失した新規な免疫グロブリンおよびヘテロ二量体免疫
グロブリンバリアントに関する。本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の
方法も包含する。
エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチド
を含む免疫グロブリンまたはその断片であって、
免疫グロブリン定常領域が、
CH1領域、CH2領域およびCH3領域
からなる群から選択され、
免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインGとの結合を低
減させるまたは喪失させる改変を含み、
免疫グロブリン定常領域がCH2および/またはCH3領域であるならば、前記低減が、
未改変の免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して少なくとも30%である、
免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
はヒトIGHG由来である。免疫グロブリン定常領域は、CH3領域またはCH2領域を
含むことができ、好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、CH3およびCH2領域を含
む。
合を低減するために改変されてよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、251位
、252位、253位、254位、255位、311位、380位、382位、385位
、387位、426位、428位、433位、434位、435位、436位、437位
および438位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む。全ての位置は、
EUナンバリングシステム(Edelman GMら、(1969)Proc Natl
Acad Sci USA、63(1):78~85頁)に従って番号付けされている
。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、251位、252位、253位、254位、
311位、380位、382位、426位、428位、434位、435位、436位お
よび438位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む。より好ましくは、
免疫グロブリン定常領域は、252A、254M、380A、380M、382A、38
2L、426M、428G、428S、428T、428V、433D、434A、43
4G、434Sおよび438Aからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。一実施形
態では、免疫グロブリン定常領域は、250位にてアミノ酸置換をさらに含む。好ましく
は、このアミノ酸置換は、250Qでない。免疫グロブリン定常領域は、428位にてア
ミノ酸置換を含んでよく、ここで、この置換は、428Lでない。
2A/380A/382A/436A/438A、254M/380M/382L/42
6M/428Gおよび426M/428G/433D/434Aからなる群から選択され
る置換を含んでよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号20、配列番号2
1および配列番号22からなる群から選択されるヒトIGHG1のバリアントFc断片を
含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、428G、428S、428Tも
しくは428Vから選択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3
領域内の任意の位置にてさらなる置換とを含むか、または代わりに、免疫グロブリン定常
領域は、434Aもしくは434Sから選択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域およ
び/もしくはCH3領域内の任意の位置にてさらなる置換とを含む。より好ましくは、ア
ミノ酸置換は、428Gと434位でのさらなる置換とであってよいか、または代わりに
、アミノ酸置換は、434Aもしくは434Sと428位でのさらなる置換とであってよ
い。さらにより好ましくは、アミノ酸置換は、428Gと434Aまたは434Sのいず
れかとであってよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号24または配列番
号25から選択されるヒトIGHG1のバリアントFc断片を含む。
発明の免疫グロブリンまたはその断片は、免疫グロブリン定常領域のCH1領域も含んで
よく、ここで、CH1領域は、プロテインGとの結合の低減または喪失をもたらすように
改変されている。好ましくは、CH1領域は、ヒトIGHG由来である。
はIGHM由来のCH1領域で置き換えられてよい。代わりに、CH1領域のCH1スト
ランドGおよび一部のFGループは、IGHA1またはIGHM由来のCH1領域のCH
1ストランドGおよび一部のFGループで置き換えられてよい。
位、213位および214位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含んでよ
い。好ましくは、アミノ酸置換は、209位および213位にある。代わりに、改変免疫
グロブリン定常領域は、209P/210S、213V/214Tおよび209G/21
0Nからなる置換の群から選択されるアミノ酸置換を含んでよい。より好ましくは、改変
免疫グロブリン定常領域は、アミノ酸改変209Gまたは213Vを含んでよい。具体的
に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号57、59または56のアミノ酸118~22
2を含むバリアントヒトIGHG1 CH1領域を含んでよい。
を有する。結合の低減は、少なくとも最小限で10%であってよい。好ましくは、プロテ
インGとの結合は、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または9
0%低減される。プロテインGとの結合は、100%まで低減されてよく、これは、喪失
に相当し、このことは、プロテインGと全く結合しないことを意味する。
る効果を有してよい。しかし、FcRnとの結合は、エフェクター機能のために必要であ
り、よって、FcRnとの結合の消失は、ADCCまたはCDCのようなエフェクター機
能が望まれる場合は、望ましくない。
含むポリペプチドを含む免疫グロブリンまたはその断片であって、免疫グロブリン定常領
域が、CH2領域およびCH3領域からなる群から選択され、免疫グロブリン定常領域が
、免疫グロブリンまたはその断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改
変を含み、
免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトFcRnに対する免疫グロブリン定常領域の結合
親和性を変化させ、
免疫グロブリンまたはその断片が、未改変の免疫グロブリンまたはその断片と比較して、
少なくとも80%のFcRnとの結合を保持する、
免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
(a)第1エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含む
第1ポリペプチドと、
(b)第2エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域(免疫グ
ロブリン定常領域は、CH2領域およびCH3からなる群から選択される)とを含む第2
ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第2ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域中に、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたは
その断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトFcRnに対する免疫グロブリン定常領域の結合
親和性を変化させ、
改変第2ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域中に改変を有さない未改変のヘテロ二
量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して、少なくとも80%のFcRnとの
結合を保持する、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
ラップする、免疫グロブリンもしくはヘテロ2量体免疫グロブリンまたはその断片の免疫
グロブリン定常領域中の結合部位と結合してよい。このオーバーラップは、部分的または
完全であってよい。好ましくは、親和性試薬は、細菌の表面タンパク質である。より好ま
しくは、親和性試薬は、プロテインGである。
疫グロブリンは、その免疫グロブリン定常領域中に、プロテインGとの結合を低減させる
または喪失させる改変を含む。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒトIGHG由
来である。このような改変は、本明細書に記載するように、CH3および/またはCH2
領域中のアミノ酸置換であってよい。
ポリペプチドを含む免疫グロブリンまたはその断片であって、VH3領域が、免疫グロブ
リンまたはその断片とプロテインAとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
免疫グロブリンまたはその断片を提供する。免疫グロブリンまたはその断片は、VH3領
域を少なくとも有する1または複数のさらなるエピトープ結合領域を含んでよい。
ように改変されてよい。好ましくは、VH3領域は、65位にてアミノ酸置換ならびに/
または57A、57E、65S、66Q、68V、81E、82aSおよび組み合わせ1
9G/57A/59Aからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。VH3領域中のア
ミノ酸の位置の全ての番号付けは、Kabatナンバリング(Dariavach Pら
、(1987)Proc Natl Acad Sci USA、84(24):907
4~8頁およびFrangione Bら、(1985)Proc Natl Acad
Sci USA、82(10):3415~9頁に記載されるように、Kabat E
Aら、(1991)Sequences of proteins of immuno
logical interest.第5版、US Department of He
alth and Human Services、NIH publication第
91号、3242頁)に従う。より好ましくは、VH3領域の改変は、65S、81Eお
よび82aSからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。さらにより好ましくは、V
H3領域の改変は、アミノ酸置換65Sを含む。最も好ましくは、VH3領域の改変は、
アミノ酸置換82aSを含む。例えば、配列番号34は、置換G65Sを有する抗HER
2 Fab重鎖のアミノ酸配列である。配列番号44は、置換G65Sと、自然に存在す
るヒトIGHG1アイソタイプ由来のヒンジ配列全体で置換されたヒンジ領域とを有する
アイソタイプIGHG3の抗HER2 Fab-Fc重鎖のアミノ酸配列である。配列番
号95は、置換82aSを有する抗HER3 VHのアミノ酸配列である。配列番号83
は、VH配列中に置換82aSを有する抗HER3 scFvのアミノ酸配列である。
リン定常領域をさらに含んでよい。免疫グロブリン定常領域は、CH2および/またはC
H3領域を少なくとも含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒトIGH
G由来である。ヒトIGHGは、IGHG1、IGHG2およびIGHG4から選択して
よい。さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域がIGHG1、IGHG2または
IGHG4由来のCH3領域を含む場合、CH3領域は、ヒトIGHG3由来のCH3領
域で置換される。具体的に、免疫グロブリン領域は、配列番号2を有するFc領域を含む
。代替の実施形態では、免疫グロブリン定常領域がIGHG1、IGHG2またはIGH
G4由来のCH3領域を含む場合、CH3領域は、435位(EU番号付け)にてアミノ
酸置換を含む。好ましくは、アミノ酸置換は、435Rである。さらに、CH3領域は、
435位および436位にてアミノ酸置換を含んでよい。好ましくは、アミノ酸置換は、
435Rおよび436Fである。
(a)第1エピトープと結合するエピトープ結合領域を含む第1ポリペプチドと、
(b)第2エピトープと結合するVH3領域を少なくとも有するエピトープ結合領域を含
む第2ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第2ポリペプチドのVH3領域が、ヘテロ二量体免疫グロブリンとプロテインAとの結合
を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
免疫グロブリン定常領域をさらに含んでよい。CH3領域は、本明細書に記載するように
置き換えまたは改変されてよい。
(a)プロテインAと結合し、第1エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロ
ブリン定常領域とを含む第1ポリペプチドと、
(b)プロテインAと結合しないかまたはプロテインAとの結合が低減され、第2エピト
ープと結合するVH3領域を少なくとも有するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常
領域とを含む第2ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第2ポリペプチドのVH3領域が、第2ポリペプチドとプロテインAとの結合を低減させ
るまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
なるエピトープ結合領域を含んでよい。ヘテロ二量体免疫グロブリンまたは断片の第2ポ
リペプチドは、そのVH3領域中に、プロテインAとの結合を低減させるまたは喪失させ
る改変を含んでよい。このような改変は、上記のようなVH3領域中のアミノ酸置換であ
ってよい。
(a)第1エピトープと結合するエピトープ結合領域と、CH1および/またはCH2お
よび/またはCH3領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域とを含む第1ポリペプ
チドと、
(b)VH3を少なくとも含む第2エピトープと結合するエピトープ結合領域ならびに/
またはCH2および/もしくはCH3領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域を含
む第2ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第1ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第1親和性試薬との
結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
第2ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第2親和性試薬との
結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を提供する。
る。
第1ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、ヒトIGHG由来であり、第2ポリペプ
チドは、IGHG1、IGHG2またはIGHG4から選択される。
H2領域を含む免疫グロブリン定常領域を含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常
領域は、CH3およびCH2領域を含む。免疫グロブリン定常領域は、プロテインGとの
結合を低減するように改変されてよい。好ましくは、改変免疫グロブリン定常領域は、2
51位、252位、253位、254位、255位、311位、380位、382位、3
85位、387位、426位、428位、433位、434位、435位、436位、4
37位および438位(EUナンバリングシステム)からなる群から選択される位置にて
アミノ酸置換を含む。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、251位、252位、2
53位、254位、311位、380位、382位、426位、428位、434位、4
35位、436位および438位からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む
。より好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、252A、254M、380A、380
M、382A、382L、426M、428G、428S、428T、428V、433
D、434A、434G、434Sおよび438Aからなる群から選択されるアミノ酸置
換を含む。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、250位にてアミノ酸置換をさ
らに含む。好ましくは、このアミノ酸置換は、250Qでない。免疫グロブリン定常領域
は、428位にてアミノ酸置換を含んでよく、ここで、この置換は、428Lでない。
2A/380A/382A/436A/438A、254M/380M/382L/42
6M/428Gおよび426M/428G/433D/434Aからなる群から選択され
る置換を含んでよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号20、配列番号2
1および配列番号22からなる群から選択されるヒトIGHG1のバリアントFc断片を
含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、428G、428S、428Tも
しくは428Vから選択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3
領域中の任意の位置にてさらなる置換とを含むか、または代わりに、免疫グロブリン定常
領域は、434Aもしくは434Sから選択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域およ
び/もしくはCH3領域内の任意の位置にてさらなる置換とを含む。より好ましくは、ア
ミノ酸置換は、428Gと434位でのさらなる置換とであってよいか、または代わりに
、アミノ酸置換は、434Aもしくは434Sと428位でのさらなる置換とであってよ
い。さらにより好ましくは、アミノ酸置換は、428Gと434Aまたは434Sのいず
れかとであってよい。具体的に、免疫グロブリン定常領域は、配列番号24または配列番
号25から選択されるヒトIGHG1のバリアントFc断片を含む。
記の改変の他に、免疫グロブリン定常領域は、CH1領域も含んでよく、ここで、CH1
領域は、プロテインGとの結合を低減させるまたは喪失させるように改変されている。一
実施形態では、免疫グロブリン定常領域のCH1領域は、IGHA1またはIGHM由来
のCH1領域で置き換えられてよい。代わりに、CH1領域のCH1ストランドGおよび
一部のFGループは、IGHA1またはIGHM由来のCH1領域のCH1ストランドG
および一部のFGループで置き換えられている。
位、213位および214位の群から選択される位置にてアミノ酸置換を含んでよい。好
ましくは、アミノ酸置換は、209位および213位にある。代わりに、改変免疫グロブ
リン定常領域は、209P/210S、213V/214Tおよび209G/210Nか
らなる置換の群から選択されるアミノ酸置換を含んでよい。より好ましくは、改変免疫グ
ロブリン定常領域は、アミノ酸改変209Gまたは213Vを含んでよい。具体的に、免
疫グロブリン定常領域は、配列番号57、59または56のアミノ酸118~222を含
むバリアントヒトIGHG1 CH1領域を含んでよい。
リンまたはその断片の第1ポリペプチドとプロテインGとの結合の100%までの低減を
もたらしてよく、代わりに、第1ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域に対する改変は
、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較した場合に、ヘテロ
二量体免疫グロブリンまたはその断片の第1ポリペプチドとプロテインGとの結合の喪失
をもたらしてよい。
合を低減するように改変されたVH3領域を含んでよい。好ましくは、改変VH3領域は
、65位にてアミノ酸置換ならびに/または57A、57E、65S、66Q、68V、
81E、82aSおよび組み合わせ19G/57A/59Aからなる群から選択されるア
ミノ酸置換を含む(Kabatナンバリング)。より好ましくは、VH3領域の改変は、
65S、81Eおよび82aSからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。さらによ
り好ましくは、VH3領域の改変は、アミノ酸置換65Sを含む。最も好ましくは、VH
3領域の改変は、アミノ酸置換82aSを含む。例えば、配列番号34は、置換G65S
を有する抗HER2 Fab重鎖のアミノ酸配列である。配列番号44は、置換G65S
と、自然に存在するヒトIGHG1アイソタイプ由来のヒンジ配列全体で置換されたヒン
ジ領域とを有するアイソタイプIGHG3の抗HER2 Fab-Fc重鎖のアミノ酸配
列である。配列番号95は、置換82aSを有する抗HER3 VHのアミノ酸配列であ
る。配列番号83は、VH配列中に置換82aSを有する抗HER3 scFvのアミノ
酸配列である。
に改変された免疫グロブリン定常領域を含んでよい。免疫グロブリン定常領域は、少なく
ともCH2および/またはCH3領域を含んでよい。好ましくは、免疫グロブリン定常領
域は、ヒトIGHG由来であり、より好ましくはIGHG1、IGHG2またはIGHG
4由来である。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域がIGHG1、IGHG2また
はIGHG4由来のCH3領域を含む場合、CH3領域は、ヒトIGHG3由来のCH3
領域で置換されてよい。代替の実施形態では、免疫グロブリン定常領域がIGHG1、I
GHG2またはIGHG4由来のCH3領域を含む場合、CH3領域は、435位(EU
番号付け)にてアミノ酸置換を含む。好ましくは、アミノ酸置換は、435Rである。さ
らに、CH3領域は、435位および436位にてアミノ酸置換を含んでよい。好ましく
は、アミノ酸置換は、435Rおよび436Fである。
二量体免疫グロブリンまたはその断片の第2ポリペプチドとプロテインAとの結合の10
0%までの低減をもたらしてよく、代わりに、第2ポリペプチドのVH3領域および免疫
グロブリン定常領域に対する改変は、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断
片の結合と比較した場合に、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の第2ポリペプ
チドとプロテインAとの結合の喪失
をもたらしてよい。
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片のin vivo半減期の変化をもたら
してよい。好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体
免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、免疫グロブリンまたはヘテロ二量
体免疫グロブリンのin vivo半減期の増加をもたらす。
疫グロブリンもしくはヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片の親和性の変化を
もたらしてよい。好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ
二量体免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、FcRnに対する免疫グロ
ブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの親和性の増加をもたらす。
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片とFcRnとの結合の変化をもたらして
よい。好ましくは、改変は、10%の免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリン
とFcRnとの結合の保持をもたらす。より好ましくは、改変は、少なくとも20%、3
0%、40%、50%、60%または70%の免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グ
ロブリンとFcRnとの結合の保持をもたらす。さらにより好ましくは、改変は、未改変
の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの未改変断
片と比較して、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%または99%の免疫
グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンとFcRnとの結合の保持をもたらす。F
cRnとの結合の保持は、実施例4に記載するような表面プラズモン共鳴を用いて測定で
きる。
疫グロブリンもしくはヘテロ二量体免疫グロブリンまたはそれらの断片の特異性または親
和性に影響を与えてよい。好ましくは、改変は、FcγR3aに対する免疫グロブリンま
たはヘテロ二量体免疫グロブリンの特異性または親和性にほとんどまたは全く影響を与え
ない。より好ましくは、改変は、未改変の免疫グロブリンもしくは未改変のヘテロ二量体
免疫グロブリンまたはそれらの未改変断片と比較して、FcγR3aに対する免疫グロブ
リンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの特異性または親和性にほとんどまたは全く影響
を与えない。FcγR3aに対する結合特異性または親和性は、実施例4に記載するよう
な表面プラズモン共鳴を用いて測定できる。
、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの免疫原性をもたらしてよく、ヒト
において抗薬物抗体応答を誘導できる。好ましくは、改変は、免疫グロブリンまたはヘテ
ロ二量体免疫グロブリンの低い免疫原性だけをもたらすかまたは全く免疫原性をもたらさ
ず、よって低い免疫原性または免疫原性の危険性を示す。本発明で用いる改変の免疫原性
は、実施例に5に記載する方法を用いて予測できる。
、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの熱安定性を変化させてよい。好ま
しくは、プロテインG結合を排除する改変は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グ
ロブリンの熱安定性に与える影響が低い。好ましくは、プロテインA結合を排除する改変
は、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの熱安定性に与える影響が低いか
または全く影響を与えない。本発明に従って改変された免疫グロブリンまたはヘテロ二量
体免疫グロブリンの熱安定性は、実施例6に記載するように分析できる。
テロ二量体免疫グロブリンの血清半減期に影響を与えることがある。好ましくは、改変は
、免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの血清半減期にほとんどまたは全く
影響を与えない。より好ましくは、改変は、30%、25%、20%、15%、10%ま
たは5%未満の血清半減期の低減をもたらす。最も好ましくは、改変は、20%未満の血
清半減期の低減をもたらす。免疫グロブリンまたはヘテロ二量体免疫グロブリンの薬物動
態は、実施例7に記載するように測定できる。
鎖も含んでよい。好ましくは、免疫グロブリンは、以前に決定された抗原結合能を有する
重鎖および軽鎖を含み、すなわち、免疫グロブリンは、既知の抗原と結合する。より好ま
しくは、免疫グロブリンは、共通軽鎖、すなわち異なる重鎖と対形成できる軽鎖を含む。
よって、ヘテロ二量体免疫グロブリン中で、例えば、2つの異なる重鎖が、共通軽鎖(同
一可変および定常領域を有する軽鎖)と対形成してよい.共通軽鎖は、様々な方法を用い
て同定できる。これらの方法は、例えば軽鎖可変配列またはscFv抗体断片を提示する
抗体ディスプレイライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーから、最も頻
繁に用いられる軽鎖可変領域を選択することを含んでよい。代わりに、ヘテロ二量体免疫
グロブリンの両方の重鎖可変領域配列をライブラリー中でプローブとして用いて、両方の
重鎖可変領域と結合する軽鎖を同定できる。
する。
て、
(i)免疫グロブリンの混合物から、1つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリン
またはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、免疫グロブリン定常領域のC
H1および/またはCH2および/またはCH3領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二
量体免疫グロブリンとプロテインGとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
(ii)免疫グロブリンの混合物をプロテインGに供するステップと、
(iii)ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインGから溶出するステ
ップと
を含む方法を提供する。
あって、
(i)CH1および/またはCH2および/またはCH3領域中で重鎖の一方を改変して
、プロテインGとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
(ii)両方の重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
(iii)同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテイン
Gに供するステップと、
(iv)重鎖のヘテロ二量体をプロテインGから溶出するステップと
を含む方法も提供される。
ロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの
方法であって、
(i)CH2および/またはCH3領域中で重鎖の一方を改変して、プロテインGとの結
合を低減させるまたは喪失させるステップと、
(iia)ヘテロ二量体内に1つだけCH1領域が存在するならば、前記CH1領域が、
プロテインGとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記CH1領域が
、プロテインGとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは
(iib)ヘテロ二量体内に2つ以上のCH1領域が存在するならば、1つを除く全ての
CH1領域が、プロテインGとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、
未改変のCH1領域が、プロテインGとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、
または全てのCH1領域が、プロテインGとの結合を低減させるもしくは喪失させるよう
に改変されるステップと、
(iii)重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
(iv)同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインG
に供するステップと、
(v)重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインGから溶出するステップと
を含む方法も提供される。
合を低減させるまたは喪失させる改変を免疫グロブリン定常領域中に含むことができる。
製する方法であって、
(i)免疫グロブリンの混合物から、1つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリン
またはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、VH3領域中またはVH3領
域および免疫グロブリン定常領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二量体免疫グロブリン
またはその断片とプロテインAとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
(ii)免疫グロブリンの混合物をプロテインAに供するステップと、
(iii)ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインAから溶出するステ
ップと
を含む方法を提供する。
断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの方法であって、
(i)重鎖の一方を改変して、プロテインAとの結合を低減させるまたは喪失させるステ
ップと、
(iia)ヘテロ二量体内に1つだけVH3領域が存在するならば、前記VH3領域が、
プロテインAとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記VH3領域が
、プロテインAとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは
(iib)ヘテロ二量体内に2つ以上のVH3領域が存在するならば、1つを除く全ての
VH3領域が、プロテインAとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、
未改変のVH3領域が、プロテインAとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、
または全てのVH3領域が、プロテインAとの結合を低減させるもしくは喪失させるよう
に改変されるステップと、
(iii)2つの重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
(iv)同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインA
に供するステップと、
(v)重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインAから溶出するステップと
を含む方法も提供される。
域は、本明細書に記載するような、プロテインAとの結合を低減させるまたは喪失させる
改変を含むことができる。
(i)重鎖の混合物から、第1親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を
含む第1重鎖と、第2親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む第2
重鎖とを有する重鎖のヘテロ二量体またはその断片を単離するステップと、
(ii)重鎖の混合物を、第1親和性試薬を含む第1カラムに供するステップと、
(iii)重鎖のヘテロ二量体を第1カラムから溶出するステップと、
(iv)第1カラムからの溶出物を、第2親和性試薬を含む第2カラムに供するステップ
と、
(v)重鎖のヘテロ二量体またはその断片を第2カラムから溶出するステップと
を含む方法を提供する。
親和性試薬がプロテインAである場合、第2親和性試薬は、プロテインGであるか、また
は第1親和性試薬がプロテインGである場合、第2親和性試薬は、プロテインAである。
この方法に記載する改変重鎖は、本明細書に記載するような、プロテインAおよびプロテ
インGとの結合を低減させるまたは喪失させる改変を含むことができる。
は、80%または90%より大きい純度まで精製される。より好ましくは、ヘテロ二量体
は、95%より大きい純度まで精製される。さらにより好ましくは、ヘテロ二量体は、9
8%より大きい純度まで精製される。
合物から単離する方法であって、
(i)対象の免疫グロブリンまたはその断片を免疫グロブリンの混合物から単離するステ
ップであって、対象の免疫グロブリンまたはその断片が、プロテインAおよび/またはプ
ロテインGに対する結合部位を全て喪失しているステップと、
(ii)第1ステップにおける免疫グロブリンの混合物をプロテインAまたはプロテイン
Gに供するステップと、
(iii)ステップ(ii)からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収
するステップと、場合によって、
(iv)ステップ(iii)からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片をプロ
テインAまたはプロテインGに供するステップと、
(v)ステップ(iv)からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収する
ステップと
を含み、
ステップ(ii)において、免疫グロブリンの混合物をプロテインAに供し、ステップ(
iv)において、免疫グロブリンの混合物をプロテインGに供するか、または
ステップ(ii)において、免疫グロブリンの混合物をプロテインGに供し、ステップ(
iv)において、免疫グロブリンの混合物をプロテインAに供する、
方法を提供する。
よび免疫グロブリン定常領域中に位置する。プロテインGに対する結合部位は、免疫グロ
ブリン定常領域中に位置する。
であってよい。代替の実施形態では、対象の免疫グロブリンまたはその断片は、ヘテロ二
量体免疫グロブリンであってよい。
二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または腫瘍抗原、サイトカイン
、血管増殖因子およびリンパ-血管形成性増殖因子の群から選択される抗原と結合する二
重特異性全長抗体であり得る。好ましくは、抗原は、HER1、HER2、HER3、E
GFR、CD3、CD19、CD20、EpCAM、IgEおよびVLA-2からなる群
から選択される。好ましくは、抗原は、HER2およびHER3、CD3およびEpCA
M、CD3およびHER2、CD19およびIgEならびにCD20およびIgEである
。
を含む二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンである。好ましくは、HER3エピトープ
結合領域は、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号89のアミノ
酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号90のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3とを含む
。好ましくは、HER3エピトープ結合領域は、配列番号91のアミノ酸配列を含む軽鎖
CDR1と、配列番号92のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号93のアミノ
酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む。より好ましくは、HER3エピトープ結合領域は、
配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号89のアミノ酸配列を含む
重鎖CDR2と、配列番号90のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号91のア
ミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、配列番号92のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、
配列番号93のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む。さらにより好ましくは、ヘテ
ロ二量体免疫グロブリンは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンであり、HER3と
結合し、ここで、HER3結合領域は、配列番号86の重鎖配列と配列番号85の軽鎖配
列とを含む。同等により好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、二重特異性ヘテロ
二量体免疫グロブリンであり、HER3と結合し、ここで、HER3結合領域は、配列番
号95の重鎖可変領域配列と配列番号82の軽鎖可変領域配列とを含む。
を有する重鎖と、配列番号85のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、HER2およびH
ER3と結合する二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンである。より好ましくは、ヘテ
ロ二量体免疫グロブリンは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンであり、HER2お
よびHER3と結合し、配列番号87の第1重鎖アミノ酸配列と、配列番号86の第2重
鎖アミノ酸配列と、配列番号85の軽鎖アミノ酸配列とを有する。
いて有用であり得る。血清中の対象の免疫グロブリンの量を決定するために対象の免疫グ
ロブリンを患者血清から単離することは、単純なプロセスではない。一実施形態では、免
疫グロブリンの混合物は、対象の免疫グロブリンまたはその断片を投与された患者または
動物の血清を含むかまたは該血清に由来する。代替の実施形態では、免疫グロブリンの混
合物は、患者または動物の血清であり、ここで、患者または動物は、対象の免疫グロブリ
ンまたはその断片を投与されている。
ブリンまたはその断片を、そのVH3および/または免疫グロブリン定常領域中で、本明
細書に記載する改変に従って改変することにより達成してよい。
製方法は、Fc領域、より具体的にはヘテロ二量体免疫グロブリンのCH3領域の相互作
用を最適化するための当該技術において既知の技術と組み合わせることができる。
Fc部分を作製するための「腔への***のあてはめ(protuberance-int
o-cavity)」アプローチについて記載するCarterらにより最初に報告され
た(米国特許第5,807,706号;「穴へのノブのあてはめ(knobs-into
-holes)」;Merchant AMら、1988 Nat.Biotechno
l.、16(7):677~81頁)。この方法では、第1抗体分子の界面からの1また
は複数の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン
)で置き換えて、「***」を作製する。大きい側鎖と同一または同様のサイズの代償性の
「腔」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの(例えばアラニンまたはトレオニン)で
置き換えることにより第2抗体分子の界面に創出する。代替の設計が最近開発されたが、
これは、WO07/110205(Davis JHおよびHuston JS)により
記載されるように、分子のコア組成を改変することによる新しいCH3モジュール対の設
計、またはWO07/147901(Kjaergaard Kら)もしくはWO09/
089004(Kannan Gら)に記載されるように、モジュール間の補完的塩橋の
設計を含む。好ましくは、本発明で用いるヘテロ二量体免疫グロブリンは、PCTパンフ
レットWO13/131555(Blein Sら)に記載されるように、工学的に操作
された免疫グロブリン定常領域を含む。
ンGの両方との結合が低減または喪失した新規なヘテロ二量体免疫グロブリンバリアント
に関する。本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリンの選択的精製の方法も包含する。
形で用いる用語は複数形も包含し、その逆もまた真である。本明細書で用いる術語は、特
定の実施形態について記載する目的のためだけであり、限定することを意図しない。
ここで、アミノ酸は、ペプチド結合により組み合わされて、脱水合成により一緒に連結さ
れたアミノ酸の鎖を形成する。ポリペプチドおよびタンパク質は、化学合成または組換え
発現により合成でき、最小限のアミノ酸の長さに限定されない。
の群は「タンパク質」を含む。ポリペプチドは、二量体、三量体およびより高いオリゴマ
ー(すなわち1つより多いポリペプチド分子から構成される)のようなマルチマーをさら
に形成してよい。このような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一ま
たは非同一であってよい。このようなマルチマーの、対応するより高い次元の構造は、よ
って、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと命名される。ヘテロマル
チマーの例は、その自然に存在する形では2つの同一軽鎖ポリペプチド鎖と2つの同一重
鎖ポリペプチド鎖とから構成される抗体分子である。用語「ポリペプチド」および「タン
パク質」は、改変が例えば糖鎖付加、アセチル化、リン酸化などの翻訳後改変により行わ
れる、自然に改変されたポリペプチド/タンパク質のこともいう。このような改変は、当
該技術において公知である。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、天然
の配列に対する欠失、付加および置換(保存的な性質であり得る)のような改変を含むタ
ンパク質のこともいう。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発によるように計画的で
あってよいか、またはタンパク質を生成する宿主の変異もしくはPCR増幅による誤りの
ように偶発的であってよい。
ることができる。免疫グロブリンは、全長抗体およびその任意の抗原結合断片または単鎖
を含む。免疫グロブリンは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。免疫グロブリン
、具体的に、自然に存在する抗体は、4つのポリペプチド鎖で構成されるY字型単位の1
または複数のコピーとして存在する糖タンパク質である。それぞれの「Y」字型は、それ
らの相対的分子量によりそのように命名される重(H)鎖の2つの同一コピーと、軽(L
)鎖の2つの同一コピーとを含有する。それぞれの軽鎖は重鎖と対形成し、それぞれの重
鎖は別の重鎖と対形成する。鎖間ジスルフィド共有結合および非共有相互作用が鎖を一緒
に連結する。免疫グロブリン、具体的に、自然に存在する抗体は、抗原結合部位の2コピ
ーである可変領域を含有する。タンパク質分解酵素であるパパインは、「Y」字型を3つ
の別々の分子、2つのいわゆる「Fab」または「FAB」断片(Fab=断片-抗原-
結合)と、1つのいわゆる「Fc」断片または「Fc領域」(Fc=断片-結晶化可能)
に分ける。Fab断片は、軽鎖全体と重鎖の一部とから構成される。重鎖は、1つの可変
領域(VH)と3または4つの定常領域(抗体クラスまたはアイソタイプに依存して、C
H1、CH2、CH3およびCH4)とから構成される。CH1領域とCH2領域との間
の領域は、ヒンジ領域とよばれ、Y字型抗体分子の2つのFab腕の間の柔軟性を可能に
し、一定の距離で分けられた2つの抗原決定基との結合を受け入れるために、腕が開閉す
ることを可能にする。「ヒンジ領域」は、本明細書で言及する場合、6~62アミノ酸の
長さの配列領域であり、IgA、IgDおよびIgGにのみ存在し、2つの重鎖を橋かけ
するシステイン残基を包含する。IgA、IgDおよびIgGの重鎖はそれぞれ、4つの
領域、すなわち1つの可変領域(VH)と3つの定常領域(CH1~3)とを有する。I
gEおよびIgMは、1つの可変領域と4つの定常領域(CH1~4)とを重鎖上に有す
る。免疫グロブリンの定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)およ
び古典的補体系経路の第1成分(C1q)を含む、宿主組織または因子との結合を媒介す
ることがある。各軽鎖は、通常、1つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結する。各
軽鎖は、1つの可変領域(VL)と1つの軽鎖定常領域とを含有する。軽鎖定常領域は、
本明細書においてIGKCと称するカッパ軽鎖定常領域、または本明細書においてIGL
Cと称するラムダ軽鎖定常領域である。IGKCは、本明細書において、CκまたはCK
と同等に用い、同じ意味を有する。IGLCは、本明細書において、CλまたはCLと同
等に用い、同じ意味を有する。用語「IGLC領域」は、本明細書で用いる場合、全ての
ラムダ軽鎖定常領域、例えばIGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6およびI
GLC7からなる群から選択される全てのラムダ軽鎖定常領域のことをいう。VHおよび
VL領域は、相補性決定領域(CDR)とよばれる超可変性の領域(この中に、フレーム
ワーク領域(FRまたはFW)をよばれるより保存的な領域が散在する)にさらに細分化
できる。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序:FR1、
CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される3つのCDRおよ
び4つのFRで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用するエピトー
プ結合領域を含有する。
な生物学的形を構成する構造を含む。例えば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動
物では、IgGクラスの全長抗体は四量体であり、2つの免疫グロブリン鎖の2つの同一
の対から構成される(各対は、1つの軽鎖と1つの重鎖とを有し、各軽鎖は、免疫グロブ
リン領域VLおよび軽鎖定常領域を含み、各重鎖は、抗体クラスまたはアイソタイプに依
存して、免疫グロブリン領域VH、CH1(Cγ1)、CH2(Cγ2)、CH3(Cγ
3)およびCH4(Cγ4)を含む)。いくつかの哺乳動物、例えばラクダおよびラマで
は、IgG抗体は、2つの重鎖(各重鎖は、Fc領域と結合した可変領域を含む)だけか
ら構成されることがある。
分けされる。ヒト定常軽鎖は、カッパ(CK)およびラムダ(Cλ)軽鎖として分類され
る。重鎖は、ミュー(μ)、デルタ(δ)、ガンマ(γ)、アルファ(α)またはイプシ
ロン(ε)として分類され、それぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEの抗
体のアイソタイプを規定する。よって、「アイソタイプ」は、本明細書で用いる場合、そ
れらの定常領域の化学的および抗原的特徴により規定される免疫グロブリンのクラスおよ
び/またはサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは
、IGHG1(IgG1)、IGHG2(IgG2)、IGHG3(IgG3)、IGH
G4(IgG4)、IGHA1(IgA1)、IGHA2(IgA2)、IGHM(Ig
M)、IGHD(IgD)およびIGHE(IgE)である。いわゆるヒト免疫グロブリ
ン偽ガンマIGHGP遺伝子は、配列決定されたが、スイッチ領域の変化によりタンパク
質をコードしないさらなるヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子である(Bensma
na Mら、(1988)Nucleic Acids Res、16(7):3108
頁)。変化したスイッチ領域を有するにもかかわらず、ヒト免疫グロブリン偽ガンマIG
HGP遺伝子は、全ての重鎖定常領域(CH1~CH3)およびヒンジについてのオープ
ンリーディングフレームを有する。その重鎖定常領域についての全てのオープンリーディ
ングフレームは、予測される構造特徴を有する全てのヒト免疫グロブリン定常領域とよく
合致するタンパク質領域をコードする。このさらなる偽ガンマアイソタイプは、本明細書
において、IgGPまたはIGHGPという。ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域イプシロ
ンP1およびP2偽遺伝子(IGHEP1およびIGHEP2)のような、その他の偽免
疫グロブリン遺伝子が報告されている。IgGクラスは、治療目的のために最も一般的に
用いられる。ヒトでは、このクラスは、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3および
IgG4を含む。マウスでは、このクラスは、サブクラスIgG1、IgG2a、IgG
2b、IgG2cおよびIgG3を含む。
i)例えばCH1、CH2またはCH3領域を含む領域、(ii)Fab’およびFab
’-SHを含む、VL、VH、CLまたはCK領域とCH1領域とから構成されるFab
断片、(ii)VH領域とCH1領域とから構成されるFd断片、(iii)単一可変領
域から構成されるdAb断片(Ward ESら、(1989)Nature、341(
6242):544~6頁)、(iv)2つのFab断片が連結された二価断片であるF
(ab’)2断片、(v)VH領域とVL領域とが、2つの領域が結合して抗原結合部位
を形成することを可能にするペプチドリンカーで連結された単鎖Fv分子(scFv)(
Bird REら、(1988)Science、242(4877):423~6頁;
Huston JSら、(1988)Proc Natl Acad Sci USA、
85(16):5879~83頁)、(vi)遺伝子融合により構築された多価または多
重特異性断片である「ダイアボディ」または「トリアボディ」(Holliger Pら
、(1993)Proc Natl Acad Sci USA、90(14):644
4~8頁;Tomlinson IおよびHolliger P、(2000)Meth
ods Enzymol、326:461~79頁)、(vii)Fc領域と融合したs
cFv、ダイアボディまたは領域抗体ならびに(viii)同じまたは異なる抗体と融合
したscFvを含む。
定する領域またはドメインのことをいう。自然に存在する抗体では、抗原結合部位は、特
異性を規定する2つの可変領域(一方は重鎖に位置し、本明細書において重鎖可変領域(
VH)といい、他方は軽鎖に位置し、本明細書において軽鎖可変領域(VL)という)か
ら構成される。ヒトでは、重鎖可変領域(VH)は、7つのサブグループVH1、VH2
、VH3、VH4、VH5、VH6およびVH7に分けることができる。いくつかの場合
では、特異性は、ラクダ科で見出される重鎖抗体由来の単一ドメイン抗体におけることと
同様に、2つの領域のうちの一方のみに排他的にあることがある。V領域は、通常、約1
10アミノ酸の長さであり、15~30アミノ酸のフレームワーク領域(FRまたは「非
CDR領域」)とよばれる比較的不変のアミノ酸配列のひと続きと、それらを分ける7~
17アミノ酸の長さの非常に変動性の「超可変領域」とよばれるより短い領域とから構成
される。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ほぼベータシート立体構造をとり、ル
ープを形成する3つの超可変領域により接続される4つのFRを含む。各鎖中の超可変領
域は、FRにより近接して一緒にされ、他の鎖由来の超可変領域と一緒に、抗体の抗原結
合部位の形成に貢献する(Kabat EAら、既出を参照されたい)。用語「超可変領
域」は、本明細書で用いる場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可
変領域は、通常「相補性決定領域」または「CDR」由来のアミノ酸残基を含み、後者は
、最も高い配列変動性を有し、かつ/または抗原認識に関与する。全ての可変領域につい
て、番号付けは、Kabat(Kabat EAら、既出)に従う。
Kabat定義は、配列変動性に基づき、最も一般的に用いられる(Kabat EAら
、既出)。Chothiaは、代わりに、構造ループの位置に言及する(Chothia
およびLesk J.(1987)Mol.Biol.196:901~917頁)。A
bM定義は、Kabat定義とChothia定義との間の折衷であり、Oxford
MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアにより用いられる(Marti
n ACRら、(1989)PNAS USA 86:9268~9272頁;Mart
in ACRら、(1991)Methods Enzymol.203:121~15
3頁;Pedersen JTら、(1992)Immunomethods 1:12
6~136頁;Sternberg M.J.E.(編)、Protein Struc
ture Prediction.Oxford University Press、
Oxford中のRees ARら、(1996)、141~172頁)。接触定義は、
最近導入され(MacCallum RMら、(1996)J.Mol.Biol.26
2:732~745頁)、プロテインデータバンクにおいて入手可能な、入手可能な複合
体構造の分析に基づく。IMGT(登録商標)(the international
ImMunoGeneTics information system(登録商標))
(http://www.imgt.org)によるCDRの定義は、全ての種の全ての
免疫グロブリンおよびT細胞受容体V領域についてのIMGT番号付けに基づく(IMG
T(登録商標)(the international ImMunoGeneTics
information system(登録商標));Lefranc MPら、(
1999)Nucleic Acids Res.27(1):209~12頁;Rui
z Mら、(2000)Nucleic Acids Res.28(1):219~2
1頁;Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res.29(
1):207~9頁;Lefranc MP(2003)Nucleic Acids
Res.31(1):307~10頁;Lefranc MPら、(2005)Dev.
Comp.Immunol.29(3):185~203頁;Kaas Qら、(200
7)Briefings in Functional Genomics&Prote
omics、6(4):253~64頁)。本発明において言及する全ての相補性決定領
域(CDR)は、好ましくは、以下のように定義される(Kabat EAら、既出に従
う番号付け):
LCDR1:24~34
LCDR2:50~56
LCDR3:89~98
HCDR1:26~35
HCDR2:50~65
HCDR3:95~102
L領域の「非CDR領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列1~23(FR1)
、35~49(FR2)、57~88(FR3)および99~107(FR4)を含む。
1)、36~49(FR2)、66~94(FR3)および103~113(FR4)を
含む。
:24~36、LCDR2:46~56、LCDR3:89~97、HCDR1:26~
35、HCDR2:47~65、HCDR3:93~102を有する「拡張CDR」を含
んでよい。これらの拡張CDRも、Kabatら、既出に従って番号付けされる。VL領
域の「非拡張CDR領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列1~23(FR1)
、37~45(FR2)、57~88(FR3)および98~およそ107(FR4)を
含む。VH領域の「非拡張CDR領域」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列1~2
5(FR1)、37~46(FR2)、66~92(FR3)および103~およそ11
3(FR4)を含む。
細書で用いる場合、VH、CH1、VLおよび軽鎖定常免疫グロブリン領域を含むポリペ
プチドを含む。Fabは、単離されたこの領域、または全長抗体もしくは抗体断片の関係
におけるこの領域のことをいうことがある。
リン領域を除く抗体重鎖の定常領域を含むポリペプチドを含む。よって、Fcは、IgA
、IgDおよびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリン領域、ならびにIgEおよ
びIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリン領域と、これらの領域に対してN末端の
柔軟性ヒンジのことをいう。IgAおよびIgMについて、Fcは、J鎖を含むことがあ
る。IgGについて、Fcは、免疫グロブリン領域Cガンマ2およびCガンマ3(Cγ2
およびCγ3)と、Cガンマ1(Cγ1)とCガンマ2(Cγ2)との間のヒンジとを含
む。Fc領域の境界は変動し得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、そのカルボキシ
ル末端に残基C226またはP230を含むと定義される(ここで、番号付けは、EUイ
ンデックスに従う)。Fcは、単離されたこの領域またはFcポリペプチド、例えば抗体
の関係におけるこの領域のことをいうことがある。
免疫グロブリンまたは抗体重鎖定常領域のことをいい、全てのアイソタイプを包含する。
好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒト起源のものであり、それらに限定されない
が、IGHG1 CH1、IGHG2 CH1、IGHG3 CH1、IGHG4 CH
1、IGHA1 CH1、IGHA2 CH1、IGHE CH1、IGHEP1 CH
1、IGHM CH1、IGHD CH1、IGHGP CH1、IGHG1 CH2、
IGHG2 CH2、IGHG3 CH2、IGHG4 CH2、IGHA1 CH2、
IGHA2 CH2、IGHE CH2、IGHEP1 CH2、IGHM CH2、I
GHD CH2、IGHGP CH2、IGHG1 CH3、IGHG2 CH3、IG
HG3 CH3、IGHG4 CH3、IGHA1 CH3、IGHA2 CH3、IG
HE CH3、IGHEP1 CH3、IGHM CH3、IGHD CH3、IGHG
P CH3、IGHE CH4およびIGHM CH4からなる群から選択される。好ま
しい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトIGHE CH2、IGHM CH2、IGH
G1 CH3、IGHG2 CH3、IGHG3 CH3、IGHG4 CH3、IGH
A1 CH3、IGHA2 CH3、IGHE CH3、IGHM CH3、IGHD
CH3およびIGHGP CH3からなる群から選択される。より好ましい「免疫グロブ
リン定常領域」は、ヒトIGHG1 CH3、IGHG2 CH3、IGHG3 CH3
、IGHG4 CH3、IGHA1 CH3、IGHA2 CH3、IGHE CH3、
IGHM CH3、IGHD CH3およびIGHGP CH3からなる群から選択され
る。
特異的結合を許容する最小限のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片を含む
。自然に存在する抗体は、抗原結合(bindingまたはcombining)部位ま
たはパラトープとしても知られる2つのエピトープ結合領域を有する。自然に存在する抗
体中のエピトープ結合領域は、VHおよび/またはVLドメインのCDR領域内に限定さ
れ、ここで、アミノ酸媒介エピトープ結合がみられる。自然に存在する抗体に加えて、人
工VHドメインもしくはVLドメインまたはそれらの断片およびそれらの組み合わせを工
学的に操作して、エピトープ結合領域を得ることができる(Holt LJら、(200
3)Trends Biotechnol、21(11):484~490頁;Polo
nelli Lら、(2008)PLoS ONE、3(6):e2371)。非免疫グ
ロブリンベースのエピトープ結合領域の例は、エピトープ結合領域(Binz HKら、
(2005)Nat Biotechnol、23(10):1257~1268頁)ま
たはペプチド模倣物(Murali RおよびGreene MI(2012)Phar
maceuticals、5(2):209~235頁)を工学的に操作するための「土
台」として用いられる人工タンパク質ドメインで見出すことができる。好ましくは、用語
「エピトープ結合領域」は、1または複数の重鎖可変ドメインと1または複数の相補的軽
鎖可変ドメインとの組み合わせを含み、これらは一緒に、免疫グロブリン分子と1または
複数のエピトープとの特異的結合を許容する結合部位を形成する。
しくはヒトにおいて抗原または免疫原性活性を有するポリペプチドまたはタンパク質また
は非タンパク質分子の断片を含む。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗
体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原活性を有するエピト
ープは、当業者に公知の任意の方法、例えばイムノアッセイにより決定されるように、抗
体またはポリペプチドが特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。
抗原性エピトープは、免疫原性である必要はない。好ましくは、用語「エピトープ」は、
本明細書で用いる場合、少なくとも約3から5、好ましくは約5から10または15で、
約1,000以下のアミノ酸(またはそれらの間の任意の整数)のポリペプチド配列のこ
とをいい、該配列は、この配列に応答して作製される抗体が結合する、それ自体またはよ
り大きい配列の一部としての配列を規定する。断片の長さについて臨界的な上限はなく、
ほぼ全長のタンパク質配列、または1もしくは複数のエピトープを含む融合タンパク質さ
え含むことがある。主題の発明において用いるエピトープは、それが由来する親タンパク
質の一部分と全く同じ配列を有するポリペプチドに限定されない。よって、用語「エピト
ープ」は、天然の配列と同一の配列と、欠失、付加および置換(通常、保存的な性質)の
ような天然の配列に対する改変とを包含する。タンパク質抗原のエピトープは、それらの
構造およびエピトープ結合部位との相互作用に基づいて2つのカテゴリー、すなわち立体
構造エピトープおよび直鎖状エピトープに分けられる(Goldsby Rら、(200
3)「Antigens(第3章)」Immunology(第5版)、New Yor
k:W.H.Freeman and Company.57~75頁、ISBN0-7
167-4947-5)。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続な区画で
構成される。これらのエピトープは、3D表面の特徴および抗原の形状または3次元構造
に基づいてパラトープと相互作用する。ほとんどのエピトープは、立体構造エピトープで
ある。対照的に、直鎖状エピトープは、それらの1次構造に基づいてパラトープと相互作
用する。直鎖状エピトープは、抗原由来のアミノ酸の連続する配列で形成される。
体」または「重鎖のヘテロ二量体」は、本明細書で用いる場合、第1および第2領域のよ
うな第1および第2ポリペプチドを少なくとも含む免疫グロブリン分子またはその一部を
含み、ここで、第2ポリペプチドは、第1ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。好ま
しくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、2つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第1鎖
は、第2鎖と同一でない少なくとも1つの領域を有し、両方の鎖は、それらの非同一領域
により集合、すなわち相互作用する。より好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、
少なくとも2つの異なるリガンド、抗原または結合部位に対する結合特異性を有し、すな
わち二重特異的である。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、本明細書で用いる場合、それら
に限定されないが、全長二重特異性抗体、二重特異性Fab、二重特異性F(ab’)2
、Fc領域と融合した二重特異性scFv、Fc領域と融合したダイアボディ、およびF
c領域と融合したドメイン抗体を含む。
たは「重鎖のホモ二量体」は、本明細書で用いる場合、第1および第2領域のような第1
および第2ポリペプチドを少なくとも含む免疫グロブリン分子またはその一部を含み、こ
こで、第2ポリペプチドは、第1ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する。好ましく
は、ホモ二量体免疫グロブリンは、2つのポリペプチド鎖を含み、ここで、第1鎖は、第
2鎖と同一の少なくとも1つの領域を有し、両方の鎖は、それらの同一領域により集合、
すなわち相互作用する。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリン断片は、少なくとも2つ
の領域を含み、ここで、第1領域は、第2領域と同一であり、両方の領域は、それらのタ
ンパク質-タンパク質界面により集合、すなわち相互作用する。
録商標)(IMGT(登録商標);既出)に従うことができる。
のヒトCH1、CH2、CH3免疫グロブリン重鎖定常領域について、番号付けは、「E
Uナンバリングシステム」(Edelman GMら、(1969)Proc Natl
Acad Sci USA、63(1):78~85頁)に従うことができる。IGH
G1のヒトCH1、ヒンジ、CH2およびCH3定常領域についての完全な対応は、IM
GTデータベース(IMGT(登録商標);既出)で見出すことができる。
ンバリングシステム」(Edelman GMら、既出)に従うことができる。ヒトCK
領域についての完全な対応は、IMGTデータベース(IMGT(登録商標));既出)
で見出すことができる。
LC6およびIGLC7)について、番号付けは、「Kabatナンバリングシステム」
(Kabat EAら、既出)に従うことができる。ヒトIGLC領域についての完全な
対応は、IMGTデータベース(IMGT(登録商標);既出)で見出すことができる。
境界、CH1領域(EU番号付け:118~215)、ヒンジγ1領域(EU番号付け:
216~230)、CH2領域(EU番号付け:231~340)およびCH3領域(E
U番号付け:341~447)を有する。本明細書で言及するヒトCK領域は、残基10
8から214(EU番号付け)にわたる。本明細書で言及するヒトIGLC1、IGLC
2、IGLC3、IGLC6およびIGLC7領域は、残基108~215(Kabat
ナンバリング)にわたる。
および自然でないアミノ酸を含む。好ましくは、自然のアミノ酸が含まれる。
ミノ酸置換、挿入および/または欠失を含む。用語「置換」または「アミノ酸置換」また
は「アミノ酸残基置換」は、本明細書で用いる場合、アミノ酸配列中の第1アミノ酸残基
を第2アミノ酸残基で置換することをいい、ここで、第1アミノ酸残基は、第2アミノ酸
残基とは異なり、すなわち置換アミノ酸残基は、置換されたアミノ酸とは異なる。例えば
、置換R94Kは、94位のアルギニンがリジンで置き換えられたバリアントポリペプチ
ドのことをいう。例えば、94Kは、94位のリジンでの置換を示す。本明細書での目的
のために、複数の置換を、典型的に、斜線またはコンマで分ける。例えば「R94K/L
78V」または「R94K,L78V」は、置換R94KおよびL78Vを含む二重バリ
アントのことをいう。「アミノ酸挿入」または「挿入」により、本明細書で用いる場合、
親のポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入-9
4は、94位での挿入を示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」により、本明細書で用い
る場合、親のポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、
R94-は、94位でのアルギニンの欠失を示す。
」または「低減」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型IgGまたは
野生型ヒトIgG Fc領域を有するIgGと比較して、本明細書に記載するもののよう
な当該技術において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその
断片とプロテインAとの結合の少なくとも25%、30%、40%、50%、60%、7
0%、80%、85%、90%、95%、97%または99%、100%(喪失)までの
全体的な減少のことをいう。ある種の実施形態では、これらの用語は、代わりに、10倍
(すなわち1log)、100倍(2log)、1,000倍(または3log)、10
,000倍(または4log)または100,000倍(または5log)の全体的な減
少のことをいうことがある。
排除」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型IgGまたは野生型ヒト
IgG Fc領域を有するIgGと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術
において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロ
テインAとの結合の100%の全体的な減少、すなわち改変免疫グロブリンまたはその断
片とプロテインAとの結合の完全な消失のことをいう。
」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型IgGまたは野生型ヒトIg
G Fc領域を有するIgGと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術にお
いて既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロテイ
ンGとの結合の少なくとも25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
85%、90%、95%、97%または99%、100%(喪失)までの全体的な減少の
ことをいう。ある種の実施形態では、これらの用語は、代わりに、10倍(すなわち1l
og)、100倍(2log)、1,000倍(または3log)、10,000倍(ま
たは4log)または100,000倍(または5log)の全体的な減少のことをいう
ことがある。
排除」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型IgGまたは野生型ヒト
IgG Fc領域を有するIgGと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術
において既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片とプロ
テインGとの結合の100%の全体的な減少、すなわち改変免疫グロブリンまたはその断
片とプロテインGとの結合の完全な消失のことをいう。
は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型IgGまたは野生型ヒトIgG
Fc領域を有するIgGと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術におい
て既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片と親和性試薬
との結合の少なくとも25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85
%、90%、95%、97%または99%、100%(喪失)までの全体的な減少のこと
をいう。ある種の実施形態では、これらの用語は、代わりに、10倍(すなわち1log
)、100倍(2log)、1,000倍(または3log)、10,000倍(または
4log)または100,000倍(または5log)の全体的な減少のことをいうこと
がある。
除」は、親の、すなわち未改変の免疫グロブリンまたは野生型IgGまたは野生型ヒトI
gG Fc領域を有するIgGと比較して、本明細書に記載するもののような当該技術に
おいて既知の標準的な方法により検出される改変免疫グロブリンまたはその断片と親和性
試薬との結合の100%の全体的な減少、すなわち改変免疫グロブリンまたはその断片と
親和性試薬との結合の完全な消失のことをいう。
クローナル抗体である。ある種の実施形態では、二重特異性抗体は、親の抗体と比べてV
H領域中に1または複数のアミノ酸改変を有する二重特異性抗体である。ある種の実施形
態では、二重特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であってよい。二重特異性抗体は、標
的抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性薬剤を局在化するために用いてもよい。これら
の抗体は、標的抗原と結合する腕と、例えばサポリン、抗インターフェロン-α、ビンカ
アルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセートまたは放射活性同位体ハプテンのような細
胞傷害性薬剤と結合する腕とを保有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片と
して調製できる。二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術において知られている。伝
統的に、二重特異性抗体の組換え生成は、免疫グロブリン重鎖-軽鎖の2つの対の同時発
現に基づき、ここで、2つの重鎖は異なる特異性を有する(MilsteinおよびCu
ello、(1983)Nature、305:537~40頁)。免疫グロブリン重鎖
および軽鎖の無作為な取り合わせのために、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は
、異なる抗体分子の混合物をおそらく生成し、これらの抗体のうち1つだけが正しい二重
特異性構造を有する。正しい分子の精製は、親和性クロマトグラフィーステップにより通
常行われるが、面倒であり、生成物収率は低い。同様の手順がWO93/08829およ
びTrauneckerら、(1991)EMBO J、10:3655~9頁に開示さ
れている。異なるアプローチに従って、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有す
る抗体可変領域を、免疫グロブリン定常領域配列と融合させる。融合体は、例えば、ヒン
ジ、CH2およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域を有す
る。ある種の実施形態では、軽鎖結合のために必要な部位を含有する第1重鎖定常領域(
CH1)は、融合体のうちの少なくとも1つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と所
望であれば免疫グロブリン軽鎖とをコードするDNAを、別々の発現ベクターに挿入し、
適切な宿主生物に該ベクターを同時トランスフェクトする。このことにより、構築におい
て用いる3つのポリペプチド鎖の比率が等しくない場合に最適な収率が得られる実施形態
において、3つのポリペプチド断片の相互割合を柔軟に調節できる。しかし、等しい比率
の少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらすか、または比率が特に重
要でない場合に、2つまたは3つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を1つの発現ベクタ
ーに挿入することが可能である。
コンジュゲート中の抗体の一方はアビジンと結合でき、他方はビオチンと結合できる。こ
のような抗体は、例えば、免疫系の細胞を不要な細胞に標的化させること(US4,67
6,980)およびHIV感染の処置のため(WO91/00360、WO92/003
73およびEP03089)に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡
便な架橋法を用いて作製してよい。適切な架橋剤は、いくつかの架橋技術とともに、当該
技術において公知である(US4,676,980を参照されたい)。2価を超える抗体
も企図される。例えば、三重特異性抗体を調製できる(Tutt Aら(1991)J.
Immunol.147:60~9頁を参照されたい)。
ンパ-血管形成性増殖因子からなる群から選択される抗原と結合する二重特異性ヘテロ二
量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性全長抗体を提供する。好ましくは
、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性抗体は、H
ER1、HER2、HER3、EGFR、CD3、CD19、CD20、EpCAM、I
gEおよびVLA-2からなる群から選択される抗原と結合する。好ましくは、二重特異
性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片または二重特異性抗体は、HER2およ
びHER3と結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはそ
の断片または二重特異性抗体は、CD3およびEpCAM、またはCD3およびHER2
と結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片また
は二重特異性抗体は、CD19およびIgE、またはCD20およびIgEと結合する。
片および/または工学的に操作された可変ドメインもしくはFab断片もしくはFc領域
のような人工免疫グロブリンもしくはそれらの断片と結合する、溶媒とアクセス可能な細
菌の表面に繋留または埋め込まれたタンパク質を含む。別の態様では、細菌の表面タンパ
ク質は、可溶性バリアントとして遊離され得る。さらに、本発明の目的のために、「細菌
の表面タンパク質」は、天然配列に対して欠失、付加および置換(保存的な性質であり得
る)のような改変を含み、自然に存在する免疫グロブリンもしくはそれらの断片および/
または人工免疫グロブリンもしくはそれらの断片との結合を保持するタンパク質を含む。
見出され、ここで、これらのタンパク質は、細菌が独特の場所にてとどまるか、または免
疫系を回避するための手段として働く。免疫グロブリンまたはそれらの断片と結合するい
くつかの細菌の表面タンパク質は、抗体の分析、精製および調製、またはその他の診断お
よび生物学的研究用途において用いられている。免疫グロブリンまたはそれらの断片と結
合する細菌の表面タンパク質は、それらに限定されないが、以下の例を含む。
つかの株により生成される細胞壁成分であり、単一ポリペプチド鎖から構成される。プロ
テインA遺伝子生成物は、病原体の細胞壁とタンデムな様式で結合する5つの相同反復か
ら構成される。5つのドメインはおよそ58アミノ酸の長さであり、EDABCと表示さ
れ、それぞれ免疫グロブリン結合活性を示す(Tashiro MおよびMonteli
one GT(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.、5(4):
471~481頁)。5つの相同免疫グロブリン結合ドメインは、3らせんの束に折り畳
まれる。各ドメインは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質、最も顕著にはIgGと結合
できる(Hober Sら、(2007)J.Chromatogr.B Analyt
.Technol.Biomed.Life Sci.、848(1):40~47頁)
。プロテインAは、ほとんどの免疫グロブリンの重鎖とFc領域内で結合するが、ヒトV
H3ファミリーの場合にFab領域内でも結合する(Jansson Bら、(1998
)FEMS Immunol.Med.Microbiol.、20(1):69~78
頁)。プロテインAは、ヒト、マウス、ウサギおよびモルモットを含む様々な種由来のI
gGと結合するが、ヒトIgG3と結合しない(Hober Sら、(2007)既出)
。ヒトIgG3がプロテインAと結合できないことは、ヒトIgG3 Fc領域中のH4
35RおよびY436F置換により説明できる(EU番号付け、Jendebergら、
(1997)J.Immunol.Methods、201(1):25~34頁)。I
gGの他に、プロテインAは、IgMおよびIgAとも相互作用する。
業的規模での使用のための動機づけとなる。生物薬における抗体の生成のために用いるプ
ロテインAは、通常、E.coliにおいて組換え生成され、天然プロテインAと本質的
に同じように機能する(Liu HFら、(2010)MAbs、2(5):480~4
99頁)。
樹脂に結合させる。最適な結合は、pH8.2にて生じるが、結合は、中性または生理的
条件(pH7.0~7.6)でも良好である。溶出は、通常、酸性pH(グリシン-HC
l、pH2.5~3.0)に向かうpHシフトにより達成される。このことは、タンパク
質構造に永続的に影響を与えることなく、ほとんどのタンパク質-タンパク質および抗体
-抗原結合相互作用を効率的に解離する。それにもかかわらず、いくつかの抗体およびタ
ンパク質は、低pHにより損傷を受け、1/10容量のアルカリ性緩衝液、例えば1M
Tris-HCl、pH8.0を加えることにより回収後に直ちに中和して、低pH条件
下にある期間を最小限にすることが最適である。
違いは、支持マトリクスのタイプ、プロテインAリガンド修飾、孔サイズおよび粒子サイ
ズである。これらの因子の違いは、圧縮率、化学的および物理的頑強性、拡散抵抗および
吸着剤の結合能の違いを生じる(Hober Sら、(2007)、既出)。プロテイン
Aクロマトグラフィー樹脂の例は、それらに限定されないが、実施例において用いるよう
に、GE HealthcareのMabSelect SuRe(商標)プロテインA
樹脂およびMabSelect(商標)プロテインA樹脂を含む。
た細菌細胞壁タンパク質である。異なるStreptococciから単離された天然の
プロテインGのDNA配列決定により、免疫グロブリン結合ドメインならびにアルブミン
および細胞表面結合のための部位が同定された。株に依存して、免疫グロブリン結合領域
およびアルブミン結合領域はともに、2~3つの独立して折り畳まれた単位から構成され
る(Tashiro MおよびMontelione GT(1995)Curr.Op
in.Struct.Biol.、5(4):471~481頁)。G148株由来のプ
ロテインGは、それぞれABD1、ABD2およびABD3ならびにC1、C2およびC
3と表示される、3つのアルブミンおよび免疫グロブリン結合ドメインから構成される(
Olsson Aら、(1987)Eur.J.Biochem.、168(2):31
9~324頁)。C1、C2およびC3と表示される各免疫グロブリン結合ドメインは、
およそ55残基であり、約15残基のリンカーにより分けられている。プロテインG免疫
グロブリン結合ドメインの全ての実験的に解明された3D構造は、いずれのジスルフィド
ブリッジも、堅く結合した補欠分子族も有さない、非常に密に詰まった球状構造を示す(
Sauer-Eriksson AEら、(1995)Structure、3(3):
265~278頁;Derrick JPおよびWigley DB(1992)Nat
ure、359(6397):752~754頁;Derrick JPおよびWigl
ey DB(1994)J.Mol.Biol.、243(5):906~918頁;L
ian LYら、(1994)Nat.Struct.Biol.、1(6):355~
357頁)。構造は、アルファ-らせんにより接続された2つの逆平行ベータヘアピンで
構成された4本鎖ベータシートを含む。
の全てのヒトサブクラスとの結合を示す。プロテインGは、マウス、ウサギおよびヒツジ
を含むいくつかの動物IgGとも結合する(Bjorck LおよびKronvall
G(1984)J.Immunol.、133(2):969~974頁;Akerst
rom Bら、(1985)J.Immunol.、135(4):2589~2592
頁;Akerstrom BおよびBjorck L(1986)J.Biol.Che
m.、261(22):10240~10247頁;Fahnestock SRら、(
1986)J.Bacteriol.、167(3):870~880頁)。よって、プ
ロテインGは、プロテインAと比較して、異なる種のサブクラスに対する、より広い結合
スペクトルを示す。
テインGの結合ドメインの構造は、単独(NMRによる、Lian LYら、(1994
)既出)およびIgG1 Fabとの複合体(x線結晶解析による、Derrick J
PおよびWigley DB(1992)既出ならびにDerrick JPおよびWi
gley DB(1994)既出)の両方で決定されている。全ての実験的に解明された
3D構造は、IgG重鎖のCH1ドメイン内での結合を示した。
するために日常的に用いられる。アルブミンおよび細胞表面結合ドメインは、非特異的結
合を低減するために組換えプロテインGから取り除かれており、よって、粗試料からIg
Gを分離するために用いることができる。プロテインAと同様に、組換えプロテインGは
、抗体の精製のための定常相クロマトグラフィー樹脂に結合させる。最適な結合は、pH
5にて生じるが、結合は、pH7.0~7.2においても良好である。プロテインAにつ
いてと同様に、溶出も、酸性pH(グリシン-HCl、pH2.5~3.0)に向かうp
Hシフトにより達成される。プロテインGクロマトグラフィー樹脂の例は、それらに限定
されないが、実施例において用いるように、GE HealthcareのプロテインG
Sepharose(商標)4 Fast Flow樹脂およびHiTrap(商標)
プロテインG HPカラムを含む。
nusに元々由来するが、現在では組換え生成される、免疫グロブリン結合タンパク質で
ある(Bjorck L(1988)J.Immunol.、140(4):1194~
1197頁;Kastern Wら、(1992)J.Biol.Chem.、267(
18):12820~12825頁)。プロテインLは、抗体の抗原結合部位に干渉する
ことなく、カッパ軽鎖相互作用により結合する独特の能力を有する(Nilson BH
ら、(1993)J.Immunol.Methods、164(1):33~40頁)
。このことにより、プロテインLは、他の抗体結合タンパク質よりも広い範囲の免疫グロ
ブリンクラスおよびサブクラスと結合する能力を有する。プロテインLは、全てのクラス
の免疫グロブリン(IgG、IgM、IgA、IgEおよびIgD)と結合する。プロテ
インLは、単鎖可変断片(scFv)およびFab断片とも結合する(Nilson B
Hら、(1993)既出;Bottomley SPら、(1995)Biosepar
ation、5(6):359~367頁)。プロテインLは、カッパI、IIIおよび
IVサブクラスのヒト可変ドメインならびにマウスカッパIサブクラスと結合する(Ni
lson BHら、(1992)既出)。プロテインLクロマトグラフィー樹脂の例は、
それらに限定されないが、実施例において用いるように、Genescriptのプロテ
インL樹脂を含む。
ptococcus pyogenesのある種の株の表面に同時に存在する表面タンパ
ク質である。プロテインHは、IgGのFc領域に対する親和性を有する(Akesso
n Pら、(1990)Mol.Immunol.、27(6):523~531頁;A
kesson Pら、(1994)Biochem.J.、300(Pt3):877~
886頁)。プロテインHは、ヒト、サルおよびウサギ由来のIgGのFc領域と結合す
る(Akesson Pら、(1990)、既出;Frick IMら、(1995)E
MBO J.、14(8):1674~1679頁)。Mタンパク質も、フィブリノゲン
と結合することが知られており(Kantor FS(1965)J Exp Med、
121:849~859頁)、以前の研究により、API株由来のM1タンパク質がアル
ブミンおよびポリクローナルIgGに対する親和性を有することが示されている(Sch
midt KHおよびWadstrom T(1990)Zentralbl.Bakt
eriol.、273(2):216~228頁)。
いが、人工的に作製されたタンパク質、例えば抗体およびそれらの断片、例えばGE H
ealthcare(Glattbrugg、Switzerland)のKappaS
electおよびLambdaFabSelect親和性樹脂またはInvitroge
n AG(Basel、Switzerland)のCaptureSelect(商標
)IgG-CH1を含む。
断片受容体トランスポーターアルファ鎖またはFcRn膜貫通アルファ鎖ともよばれる;
UniProtデータベース受託番号P55899)から構成されるヒトヘテロ二量体タ
ンパク質を含み、ベータ2-ミクログロブリン(UniProtデータベース受託番号P
61769)と非共有的に結合する。ヒトFcRnは、IgGについてのMHCクラスI
関連受容体であり、その発現は、げっ歯類および全ての年齢のヒトにおける上皮細胞、内
皮細胞、マクロファージおよび樹状細胞を含む多様な細胞型において同定されている(R
oopenian DCおよびAkilesh S(2007)Nat.Rev.Imm
unol.、7(9):715~725頁)。ヒトFcRnは、内皮細胞でのエンドサイ
トーシスの経路において出現することにより、成体でのIgGの再利用において役割を演
じる(Tesar DBおよびBjorkman PJ(2010)Curr.Opin
.Struct.Biol.、20(2):226~233頁)。酸性のエンドソームに
あるFcRn受容体は、内在化したIgGと結合し、それを細胞表面にて再生する。Ig
Gは、FcRn受容体から、血液の塩基性pHにて放出され、そのことによりリソソーム
分解を逃れる。この機構は、他のアイソタイプと比較してより長い血液中のIgGの半減
期を説明する。FcRnは、免疫グロブリン分子と2:1複合体を形成し、すなわち、2
つのFcRn分子は、1つのFc領域と結合するか、またはFc領域由来の2つの重鎖は
それぞれ、1分子のFcRnと結合する(Roopenian DCおよびAkiles
h S(2007)既出)。FcRnは、IgGのFc領域と、CH2ドメインとCH3
ドメインとの間の接合部にて結合する。FcRnの機能にとって重要なことは、IgGの
pH依存性結合である。pH6.0では、FcRnはIgGと結合するが、IgGとFc
Rnとの結合は、pH7.5にて検出不能である。FcRn/IgG相互作用の厳密なp
H依存性は、6.0~6.5のpH範囲にわたって脱プロトン化する、ヒスチジンのイミ
ダゾール側鎖の関与を示唆する。CH2およびCH3ドメインの310位および435位
での表面とアクセス可能なヒスチジン残基の変異は、IgGとFcRnとの結合を著しく
低減させまたは喪失させた。ヒトFcRn、プロテインAおよびプロテインG結合部位は
、ヒトIgGのFc領域中でオーバーラップする(Nezlin RおよびGhetie
V(2004)Advances in Immunology、Academic
Press.第82巻:155~215頁)。
ンパク質の混合物を分析および精製するために頻繁に用いられる液体クロマトグラフィー
の一形態である高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を含む。他の形態の
クロマトグラフィーと同様に、混合物中の異なる成分が、2つの物質、多孔質の固体(定
常相)の中を通過する移動流体(移動相)に対して異なる親和性を有するので、分離が可
能である。FPLCでは、移動相は、水性溶液または「緩衝液」である。緩衝液の流速は
、重力流の下で運転できるか、または一定の速度に通常保たれる容積型ポンプにより制御
できる。一方、緩衝液の組成は、2つ以上の外部の貯水槽から異なる割合で流体を引き出
すことにより変動できる。定常相は、ビーズ、通常、架橋アガロースで構成される樹脂で
あり、円柱形のガラスまたはプラスチックカラムに充填される。FPLC樹脂は、用途に
応じて広い範囲のビーズサイズおよび表面リガンドで入手可能である。
衝液A(ランニング緩衝液)中で対象のタンパク質が樹脂と結合するが、緩衝液B(溶出
緩衝液)中で解離して溶液に戻るように樹脂が選択される。1または複数種の対象のタン
パク質を含有する混合物を、100%緩衝液Aに溶解し、カラムにロードする。対象のタ
ンパク質は樹脂と結合し、その他の成分は緩衝液中で運び出される。緩衝液の全流速は一
定に保つ。しかし、緩衝液B(「溶出」緩衝液)の割合を、0%から100%まで徐々に
または段階的な様式でプログラムされた濃度変化(「勾配」)に従って増加させることが
できる。このプロセス中のある時点で、結合したタンパク質のそれぞれは、解離して、排
出液中に出現する。典型的な実験室FPLC検出システムは、1または2つの高精度ポン
プ、制御ユニット、カラム、検出システムおよび分画回収器から構成される。システムを
手動で運転することが可能であるが、これらの構成要素は、通常、パーソナルコンピュー
タまたはより古いユニットでは、マイクロコントローラと連結されている。これらの半自
動化FLPCシステムを用いて運転する場合(例えばGE healthcareのAK
TAシステムを用いる場合)、排出液は、通常、塩濃度(導電率により)およびタンパク
質濃度(280nmの波長での紫外光の吸収により)を測定する2つの検出器を通過する
。紫外線の吸収 対 用いた移動相の全容量を記録するプロットは、精製プロセスを視覚
的に表示する。これらのプロットは、クロマトグラムまたはクロマトグラフィートレース
とよばれる。各タンパク質が溶出されるにつれて、該タンパク質は、タンパク質濃度の「
ピーク」として(かついわゆるクロマトグラムまたはクロマトグラフィートレース中の図
形的な「ピーク」としても)排出液中に出現し、これをさらなる使用のために回収できる
。
よりスウェーデンにおいて開発および販売され、HPLCまたは高性能液体クロマトグラ
フィーと対比するために高速高性能液体クロマトグラフィーと元々よばれた。FPLCは
、一般的に、タンパク質に対してのみ用いられる。しかし、樹脂および緩衝液の広い選択
肢があるために、FPLCは、より広い用途を有する。HPLCとは対照的に、用いる緩
衝液圧力は比較的低く、典型的に5バール未満であるが、流速は比較的高く、典型的に1
~5ml/分である。FPLCは、カラム中のミリグラム量の混合物の全容量5ml以下
での分析から、カラム中のキログラム量の精製タンパク質の何リットルもの容量での工業
的生成まで容易にスケールアップできる。溶出タンパク質またはその混合物は、異なる分
析技術、例えばSDS-PAGE、質量分析および当該技術において既知のその他の既知
の分析技術によりさらに分析できる。
子のクラスに対する結合親和性を有するリガンドとしての親和性試薬の使用を含む。リガ
ンドは、生体分子、例えばタンパク質リガンドであり得るか、または合成分子であり得る
。両方のタイプのリガンドは、良好な特異性を有する傾向にある。生成において最も一般
的に用いられるタンパク質リガンドは、親和性試薬プロテインAである。親和性クロマト
グラフィーでは、溶液(例えば対象のタンパク質を含有する粗細胞上清)をカラムにロー
ドすると、標的タンパク質は、通常、吸着されるが、混入物(その他のタンパク質、脂質
、炭水化物、DNA、色素など)はカラムを通過できる。吸着剤自体は、通常、クロマト
グラフィーカラムに充填されるが、吸着段階は、バッチ結合モードで撹拌したスラリーと
して吸着剤を用いることにより行うことができる。吸着の後の次の段階は、洗浄段階であ
り、ここでは、吸着剤を洗浄して残存混入物を除去する。結合したタンパク質は、次いで
、半純粋または純粋な形で溶出される。溶出は、タンパク質が固定化リガンドともはや相
互作用できず、遊離されるように緩衝液または塩組成を変化させることにより、通常、達
成される。いくつかの場合では、対象のタンパク質は、親和性樹脂と結合しないことがあ
り、親和性クロマトグラフィーは、不要な混入物との結合に充てられ、よって、未結合の
画分を回収して、対象のタンパク質を単離する。親和性クロマトグラフィーは、固定床ま
たは流動床で行うことができる。
から100%まで徐々にまたは段階的な様式で増加させるクロマトグラフィー法のことを
いう。
「捕捉-溶出精製」は、「溶出」緩衝液(緩衝液B)の割合を0%から100%まで徐々
にまたは段階的な様式で増加させないが、捕捉の後に100%で直接用いて、場合によっ
てランニング緩衝液(緩衝液A)を用いる洗浄ステップを行うクロマトグラフィー法のこ
とをいう。
二重特異性抗体の生成の最も一般的な方法の1つは、単一細胞中で2つの別個の抗体を
発現させることである。このような方法は、別個の抗体の重鎖がホモおよびヘテロ二量体
の両方を形成するので、複数の種を生じる。必要なのはヘテロ二量体だけであるので、こ
れらを、ホモおよびヘテロ二量体の混合物から分離する必要がある。本発明は、通常のプ
ロテインAおよびプロテインG親和性クロマトグラフィーを利用することにより、ホモお
よびヘテロ二量体の混合物からヘテロ二量体免疫グロブリンを分離するための高度に効率
的な方法を提供する。
置換を設計し、両方の単量体が置換を有するホモ二量体免疫グロブリンFc断片において
試験した。プロテインGとの結合を低減させるまたは喪失させる新しい置換を選択し、最
小限の数である2まで低減した。
合を低減させるまたは喪失させる置換を、FABまたはscFv断片に基づくホモ二量体
免疫グロブリン中でアッセイした。このことにより、両方の技術についての重要なネック
となるところを同定できた。プロテインAとの結合を低減またはなくすための置換を有す
る重鎖内にVH3サブクラスの可変重鎖ドメインが存在することにより、プロテインAに
基づくいずれの差次的親和性方法も妨げられることがわかった。一方、プロテインGとの
結合を低減またはなくすための置換を有する重鎖内にガンマCH1定常ドメインが存在す
ることにより、プロテインGに基づく新しい差次的親和性方法が妨げられる。これらの主
な障害に対する解決法は、プロテインAに基づく差次的親和性方法についてプロテインA
とVH3サブクラスとの結合を低減させるまたは喪失させるフレームワーク置換の形で、
かつプロテインGに基づく新しい差次的親和性方法についてプロテインGとガンマCH1
ドメインとの結合を低減させるまたは喪失させるCH1ベースの置換の形で見出された。
それら自体でかつ上記の溶液との組み合わせで用いて、ヘテロ二量体免疫グロブリンを精
製することに成功した。より重要なことには、プロテインAおよびG差次的親和性方法を
組み合わせて、逐次的に用いた場合に、2つの逐次的な捕捉および直接溶出のクロマトグ
ラフィーステップのみに依拠して、勾配溶出を必要とせずにヘテロ二量体免疫グロブリン
の精製ができたことを示した。
を増加させるので、プロテインAまたはGとの結合を喪失させるFc領域中の変異がFc
Rnとの結合を破壊しないことが必須である。
基づく新しい差次的親和性方法において用いる置換が、ヒトFcRn結合の>90%の保
持を可能にしたが、プロテインAに基づく以前に記載された差次的親和性方法は、ヒトF
cRn結合を約75%だけ保持したことが見出された。プロテインGに基づく新しい差次
的親和性方法を作製することヒト治療用のヘテロ二量体免疫グロブリンを開発する場合に
選択される技術。免疫グロブリンのFc領域中のプロテインG結合を排除する置換は、F
cとヒトFcγR3aとの結合に影響を与えなかった。
G結合を排除する置換の特徴を決定する。実施例8は、本発明に基づく治療用ヘテロ二量
体免疫グロブリンの設計および機能的試験を示す。
方法:
一般的な方法
発現ベクターの構築
適当なcDNA鋳型を用いる標準的なオーバーラップPCR技術により、cDNAコー
ド配列中に変異を導入した。PCR生成物をHindIIIおよびNotI DNA制限
酵素で消化し、精製し、同じDNA制限酵素で予め消化した、CMVプロモーターおよび
ウシホルモンポリアデニル化を保有する改変pcDNA3.1プラスミド(Invitr
ogen AG、Basel、Switzerland)にライゲーションした。軽鎖を
、同じ発現ベクターに独立してライゲーションした。全ての発現ベクターにおいて、分泌
は、ネズミVJ2Cリーダーペプチドにより駆動された。
一過性発現のために、等量の工学的に操作した各鎖のベクターを、懸濁馴化HEK-E
BNA細胞(ATCC-CRL-10852)にポリエチレンイミン(PEI)を用いて
同時トランスフェクトした。典型的に、1mlあたり0.8~1.2百万細胞の密度の1
00mlの細胞懸濁物にDNA-PEI混合物をトランスフェクトする。工学的に操作し
た各鎖遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、細胞を4~5
日間さらに培養して培養培地(0.1%プルロニック酸、4mMグルタミンおよび0.2
5μg/mlジェネテシンを補ったEX-CELL293、HEK293血清フリー培地
(Sigma、Buchs、Switzerland))中に分泌させることにより、免
疫グロブリン構築物を生成する。分泌された免疫グロブリンを含有する細胞フリー培養上
清は、遠心分離の後にろ過することにより調製し、さらなる分析に用いた。
捕捉-溶出モードクロマトグラフィー
上清を、0.1容量(V)の1M Tris-HCl pH8.0を用いて前処理した
後に精製した。プロテインG Sepharose(商標)4 Fast Flow(プ
ロテインA結合部位変異体)またはMabSelect SuRe(商標)樹脂(プロテ
インG結合部位変異体)(ともにGE Healthcare Europe GmbH
、Glattbrugg、Switzerlandから;それぞれカタログ番号17-0
618-01および17-5438-01)を、前処理した上清にそれぞれ加えた。混合
物を一晩4℃にてインキュベートした。インキュベーションの後に、結合したタンパク質
を10CVのPBS pH7.4で洗浄し、4カラム容量(CV)の0.1Mグリシンp
H3.0で溶出し、0.1Vの1M Tris-HCl pH8.0で中和した。上清、
通過画分および溶出画分を、SDS-PAGE(NuPAGE ビス-トリス4~12%
アクリルアミド、Invitrogen AG、Basel、Switzerland)
により非還元条件下で分析した。
生成の後に、ホモ二量体Fcバリアントを含有する細胞培養上清を、まず、プロテイン
G Sepharose(商標)4 Fast Flow(プロテインA結合部位変異体
)またはMabSelect SuRe(商標)プロテインA樹脂(プロテインG結合部
位変異体)(以下を参照されたい、ともにGE Healthcare Europe
GmbHの樹脂;それぞれカタログ番号17-0618-01および17-5438-0
1)を用いる捕捉-溶出モードクロマトグラフィーで精製した。捕捉-溶出モードクロマ
トグラフィーから溶出された物質を、続いて、1ml HiTrap(商標)MabSe
lect SuRe(商標)プロテインAカラム(プロテインA結合部位変異体)または
1ml HiTrap(商標)プロテインG HPカラム(プロテインG結合部位変異体
)にロードした。両方のカラムを、0.2Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH8.0で予め
平衡化し、AKTApurifier(商標)クロマトグラフィーシステム(ともにGE
Healthcare Europe GmbHから;それぞれカタログ番号11-0
034-93および17-0404-01)上で、1ml/分の流速にて操作した。溶出
は、様々な量の2種の緩衝液(ランニング緩衝液(A):0.2Mリン酸塩クエン酸塩緩
衝液pH8.0および溶出緩衝液(B):0.04Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH3.
0(実施例1.1)または0.02Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH2.6(実施例1.
2)を組み合わせるpH直線勾配を用いて行った。直線勾配は、0%Bから100%Bま
で5カラム容量(CV)で(実施例1.1)、または10CV(実施例1.2)で進めた
。溶出画分を、0.1Vの1M Tris-HCl pH8.0で中和した。上清、通過
画分および溶出画分を、SDS-PAGE(NuPAGE ビス-トリス4~12%アク
リルアミド、Invitrogen AG、Basel、Switzerland)によ
り非還元条件下で分析した。
製および試験
実施例2.1:プロテインA結合が排除されたホモ二量体免疫グロブリン
プロテインA結合が排除されたFAB断片の精製および試験。
生成の後に、細胞培養上清を、0.1Vの1M Tris-HCl pH8.0で前処
理した。プロテインL樹脂(Genescript、Piscataway、USA)を
前処理した上清に加え、一晩4℃にてインキュベートした。インキュベーションの後に、
結合したタンパク質を10CVのPBS pH7.4で洗浄し、4CVの0.1Mグリシ
ンpH3.0で溶出し、最後に、0.1Vの1M Tris-HCl pH8.0で中和
した。プロテインA結合を評価するために、プロテインL精製FABを1ml HiTr
ap MabSelect(商標)カラム(GE Healthcare Europe
GmbH、Glattbrugg、Switzerland)にpH8.0(クエン酸
/Na2HPO4緩衝液)にて注入した。溶出は、様々な量の2種の緩衝液(ランニング緩
衝液(A):0.2Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH8.0および溶出緩衝液(B):0
.04Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH3.0)を組み合わせるpH直線勾配を用いて行
った。直線勾配は、0%Bから100%Bまで5CVで進めた。溶出画分を、0.1Vの
1M Tris-HCl pH8.0で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、S
DS-PAGE(NuPAGE ビス-トリス4~12%アクリルアミド、Invitr
ogen AG、Basel、Switzerland)により非還元条件下で分析した
。
IGHG1 Fc断片と融合したヒトHER2細胞外領域をコードするcDNAを、上
記の重鎖および軽鎖発現ベクターと同様の発現ベクターにクローニングし、PEI法(P
CTパンフレットWO12/131555を参照されたい)を用いてHEK293E細胞
に一過的にトランスフェクトした。上清を、0.1Vの1M Tris-HCl pH8
.0で前処理し、実施例1に記載したように抗原をプロテインA捕捉-溶出クロマトグラ
フィーにより精製した。SPR実験のために、モノクローナルマウス抗ヒトIgG(Fc
)抗体センサチップを用いた。これは、Fcと融合した組換えHER2抗原を正しい向き
で捕捉することを可能にした(ヒト抗体捕捉キット、カタログ番号BR-1008-39
、GE Healthcare Europe GmbH)。測定は、BIAcore(
商標)2000装置(GE Healthcare Europe GmbH、Glat
tbrugg、Switzerland)で記録した。異なる希釈の抗HER2 FAB
(50、25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39nM)を
センサチップ上に4分間、30μl/分にて注入した。各測定について、7分間の解離の
後に、3M MgCl2溶液を1分間、30μl/分にて再生のために注入した。データ
(センサグラム:fc2-fc1)を、1:1ラングミュアを用いてフィットさせた。捕
捉されたHER2-cの各測定の初めの実験的変動を埋め合わせるために、全てのフィッ
ティングにおいてRmax値をローカルに設定した。測定は、1点につき2個の試料を用
いて行い、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ2および残差の値をともに用いて、
実験データと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
グロブリンの精製および試験。
勾配モードクロマトグラフィーおよび捕捉-溶出モードクロマトグラフィーは、実施例
1について記載した手順に従って行った。
クロマトグラフィー
勾配モードクロマトグラフィーおよび捕捉-溶出モードクロマトグラフィーは、実施例
1について記載した手順に従って行った。
アミノ酸配列SAHHHHHHHH(配列番号100)と融合したヒトHER3細胞外
領域をコードするcDNA(UniProt受託番号:P21860(ERBB3_HU
MAN)残基20~632、配列番号73、本明細書においてHER3抗原という;Un
iProt Consortium(2013)Nucleic Acids Res.
、41(データベース版):D43~7;http://www.uniprot.or
g/)を、上記の重鎖および軽鎖発現ベクターと同様の発現ベクターにクローニングし、
PEIを用いてHEK293E細胞に一過的にトランスフェクトした。生成の後に、細胞
フリー上清を調製し、ろ過し、滅菌し、0.1容量の1M Tris-HCl pH8で
前処理し、Ni2+-NTA親和性クロマトグラフィー(GE Healthcare E
urope GmbH、Cat.No:17-5318-02)で精製した。
チップ(チップ:GE Healthcare Europe GmbH;Cat.No
:BR-1000-14;プロテインA Sigma、Cat.No:P7837)上に
捕捉し、分析物として組換えHER3抗原を用いた。測定は、以下のように行った:(捕
捉)150RUの抗体、(流速)30μl/分HBS-P緩衝液、(再生)グリシンpH
1.5、(注入)5分間、(解離)8分間、(注入したHER3抗原濃度)50、25、
10、5、1および0.5nM、(データフィッティング)物質移動なしの1:1結合。
捕捉された抗体の各測定の初めの実験的変動を埋め合わせるために、全てのフィッティン
グにおいてRmax値をローカルに設定した。測定は、1点につき3個の試料を用いて行
い、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ2および残差の値をともに用いて、実験デ
ータと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
精製および試験
実施例3.1および3.2:プロテインAまたはGを用いるヘテロ二量体免疫グロブリン
の1ステップ精製
生成の後に、細胞培養上清を、0.1Vの0.2M NaH2PO4を用いてpH6.0
に調節し、1ml HiTrap(商標)MabSelect SuRe(商標)カラム
(実施例3.1)または1ml HiTrap(商標)プロテインG HPカラム(実施
例3.2)に1ml/分にてロードした。ロードした後に、結合したタンパク質を、0.
125Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH6.0を用いて十分に洗浄した。溶出は、2種の
緩衝液(ランニング緩衝液(A):0.125Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH6.0お
よび溶出緩衝液(B):0.04Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH3.0)を組み合わせ
る2種の均一濃度勾配を用いて行った。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、以下:実施例3
.1において55%B、実施例3.2において示す第1および第2の場合において90%
Bおよび80%Bのように変動する第1均一濃度勾配を70CVにわたって用いて溶出し
た。非排除ホモ二量体分子は、全ての実施例において20CVにわたって100%Bの第
2均一濃度勾配で溶出した。溶出画分を、0.1Vの1M Tris-HCl pH8.
0で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、SDS-PAGE(NuPAGE ビ
ス-トリス4~12%アクリルアミド、Invitrogen AG、Basel、Sw
itzerland)により非還元条件下で分析した。
逐次的精製。
生成の後に、細胞培養上清を、0.1Vの0.2M NaH2PO4を用いてpH6.0
に調節し、1ml HiTrap MabSelect SuRe(商標)カラムに1m
l/分にてロードした。ロードした後に、結合したタンパク質を、0.125Mリン酸塩
クエン酸塩緩衝液pH6.0を用いて十分に洗浄した。プロテインG結合部位を有さない
ヘテロ二量体免疫グロブリンおよびホモ二量体免疫グロブリンを、10CVの0.04M
リン酸塩クエン酸塩緩衝液pH3.0で溶出した。ヘテロおよびホモ二量体混合物を含有
する画分をプールし、10Vの0.125Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH6.0でさら
に希釈した。希釈混合物を、次いで、1ml HiTrapプロテインG HPカラム(
GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrugg、Swi
tzerland)にロードし、結合したタンパク質を、0.125Mリン酸塩クエン酸
塩緩衝液pH6.0を用いて十分に洗浄した。ヘテロ二量体免疫グロブリンを、10CV
の0.04Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH3.0で溶出した。溶出画分を、0.1Vの
1M Tris-HCl pH8.0で中和した。上清、通過画分および溶出画分を、S
DS-PAGE(NuPAGE ビス-トリス4~12%アクリルアミド、Invitr
ogen AG、Basel、Switzerland)により非還元条件下で分析した
。
ヒトFcRnについてのSPR実験
簡単に述べると、組換えヒトFcRnをCHO-S細胞で発現させた。ヒトFcRnア
ルファ鎖およびベータ2ミクログロブリンタンパク質をコードするcDNA(それぞれU
niProt受託番号:P55899(IgG受容体FcRn大サブユニットp51)残
基24~297およびP61769(ベータ-2-ミクログロブリン)残基21~119
)を、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有する2つの別々の哺乳動物発現ベクターにクロ
ーニングした。CHO-S細胞を、以前に記載したPEI法を用いて安定的に同時トラン
スフェクトし、安定クローンを、7.5μg/mlのピューロマイシンの存在下での成長
により選択した。成長培地は、PowerCHO2(Lonza Ltd、Basel、
Switzerland)であった。精製の前で生成の後の上清を、0.2M NaH2
PO4、0.1M NaCl pH6.0で前処理して、pHを6.0に調節した。Fc
Rnを、ヒトIgG sepharose6 Fast flow(GE Health
care Europe GmbH、Glattbrugg、Switzerland)
を用いて精製し、PBS pH7.4で溶出した。測定は、BIAcore(商標)20
00装置(GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrug
g、Switzerland)で記録した。各免疫グロブリンバリアントを、CM5セン
サチップ(GE Healthcare Europe GmbH、Glattbrug
g、Switzerland)上に、製造者により提供される標準的なプロトコールを用
いてアミン結合により固定化して、およそ1500RUの応答に達した。FcRnは、エ
ンドソーム中で免疫グロブリンのFc領域と酸性pHにて結合するが(pH6.0)、血
液の塩基性pHで結合を示さず(pH7.4)、よって、全ての測定は、20mMリン酸
ナトリウム緩衝液pH6.0-0.1M NaCl(ランニング緩衝液)を用いて行った
。異なる希釈のヒトFcRn(6000、3000、1500、750、375、187
.5、93.8、46.9nM)を3分間、10μl/分にて注入した。3分間の解離の
後に、PBS pH7.4を1分間、30μl/分にて表面再生のために注入した。KD
値を、定常状態親和性モデルを用いて決定した。平衡定数は、濃度の範囲にわたる定常状
態応答 対 ヒトFcRnの濃度を1:1結合モデル(化学量論(n)=1)にフィッテ
ィングさせることにより決定した。測定は、1点につき3個の試料を用いて行い、参照の
ためにゼロ濃度試料を含めた。カイ2および残差の値をともに用いて、実験データと個別
の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
ヒトFcガンマ受容体3a(FcγR3aと省略する、UniProt受託番号:P0
8637(FCG3A_HUMAN)残基17~192)をクローニングし、上記のHE
R3抗原と同様に発現させた。精製を、0.1MグリシンpH3の溶出ステップを用いる
Ig-G Sepharoseクロマトグラフィー(GE Healthcare Eu
rope GmbH、Cat.No:17-0969-01)で行った。FcγR3aを
、ゲルろ過(SUPERDEX75 10/300GL、GE Healthcare
Europe GmbH、Cat.No:17-5174-01)によりさらに精製して
、痕跡量のIgG混入物を除去した。測定は、以下のように行った:(チップ)1700
0RUの抗体と結合したCM5チップ、(流速)10μl/分HBS-P、(再生)なし
、(注入)8分間、(解離)10分間、(注入したFcγR3a濃度)2500、125
0、625、312、156、78および39nM、(データフィッティング)定常状態
親和性。
プロテインAおよびプロテインG排除変異の予測される免疫原性を、LonzaのEp
ibase platform(商標)(Lonza、Applied Protein
Services、Cambridge、UK)を用いて調べた。
免疫グロブリンの熱安定性を、熱量分析により比較した。測定は、VP-DSC示差走
査マイクロ熱量計(MicroCal-GE Healthcare Europe G
mbH)で行った。セル容量は0.128mlであり、昇温速度は1℃/分であり、過剰
圧力は64p.s.i.に保った。全てのタンパク質断片は、PBS(pH7.4)中で
1~0.5mg/mlの濃度で用いた。各タンパク質のモル熱容量は、タンパク質を除い
た同一緩衝液を含有する、1点につき2個の試料との比較により見積もった。部分モル熱
容量および融解曲線は、標準的な手順を用いて分析した。サーモグラムは、ベースライン
補正し、濃度を標準化した後に、ソフトウェアOrigin v7.0(MicroCa
l-GE Healthcare Europe GmbH)において非2状態モデルを
用いてさらに分析した。
薬物動態分析は、雌性Sprague Dawleyラットで行った。各群は、4匹の
ラットを含んだ。ラットに10mg/kgの抗体を静脈内急速投与注射により与えた。血
液試料を注射の0.25時間、1時間、4時間、6時間ならびに1、2、4、7、10、
14、21、28、35および42日後に回収した。
てHER2抗原で96ウェルELISAプレートを被覆し、一晩4℃にてインキュベート
した。プレートをBSAでブロックした後に、血清試料、参照標準物質(11の系列希釈
)および品質管理試料をプレートに加え、1時間室温にてインキュベートした。洗浄して
未結合抗体を除去した後に、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG_F(a
b’)2断片特異的検出抗体(Jackson Immunoresearch、販売者
:MILAN ANALYTICA AG、Rheinfelden、Switzerl
and、Cat No:109-035-006)を加え、製造者の推奨に従って標準的
な比色テトラメチルベンジジン基質(TMB、Pierce-Thermo Fishe
r Scientific-Perbio Science S.A.、Lausann
e、Switzerland、Cat.No.:34021)により発色させた。450
nmの吸光度の値をプレートリーダで記録し、血清試料中の抗体の濃度を、4パラメータ
回帰モデルを用いて試料プレート中で作製した参照標準曲線を用いて算出した。薬物動態
パラメータを、WinNonlin(商標)バージョン5.3(Pharsight C
orporation、Mountain View、CA、USA)を用いてノンコン
パートメント解析により評価した。
ファージディスプレイライブラリー構築およびスクリーニング
抗HER3抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーから単離できる。この目的
のために、scFvファージディスプレイライブラリーをスクリーニングした。ここで用
いたライブラリーは、それぞれ可変重鎖および軽鎖のCDR-H3およびCDR-L3に
制限される多様性を有する、合成起源のものからであった。ライブラリー構築は、以下に
記載するいくらかの改変を加えたSilacci M.ら(2005、Proteomi
cs、5(9):2340~50頁)のプロトコールに従った。
緒に集合させた重鎖可変生殖系列ドメインDP47に基づいた。G4Sペプチド反復(G
GGGSGGGGSGGGAS;配列番号94)に基づくフレキシブルリンカーを、2つ
の可変ドメインを集合させるために用いた。5つのサブライブラリーをクローニングした
が、これらはそれぞれ、それぞれ8または9または10または11または12残基の長さ
のCDR-H3を有する可変重鎖ドメインに対応する以下の配列K(X)nFDY(Ka
bat残基94~102)(ここで、Xは、無作為の自然に存在するアミノ酸であり、n
は、5または6または7または8または9である)を有する、CDR-H3を有する1つ
の重鎖可変生殖系列ドメインDP47と、以下の配列CQQXGXXPXTF(配列番号
96)またはCQQXXGXPXTF(配列番号97)またはCQQXXXXPXTF(
配列番号98)(Kabat残基88~98)(ここで、Xは、無作為の自然に存在する
アミノ酸である)の1つを有する、CDR-L3を有する3つの異なる軽鎖可変生殖系列
ドメインDPK22の集合から得られる可変軽鎖ドメインのプールとの集合から得られた
。DP47-DPK22 scFv断片のそれぞれのサブライブラリーは、1×10e9
から3.7×10e9の間の多様性を有し、一旦組み合わせると、5つのサブライブラリ
ーは、1.05×10e10の全多様性に達した。
ーから、組換え由来ヒトHER3抗原についての一連の反復選択サイクルで単離した(上
記の方法の項を参照されたい)。抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニン
グする方法は、既知である(Viti F.ら、(2000)Methods Enzy
mol.、326:480~505頁)。簡単に述べると、プラスチックイムノチューブ
を予め被覆した固定化抗原(20μg/mlの濃度にてPBS中で一晩)を、ライブラリ
ーとインキュベートした。チューブをPBS/0.1% Tween20で洗浄した。結
合したファージをトリエチルアミンで溶出し、Silacci M.ら、既出に記載され
るようにレスキューした。この選択プロセスを3回反復した。2回目および3回目の選択
による1000を超えるクローンを発現させ、標的抗原に対してELISAにより分析し
た。陽性クローンをDNA配列決定に供し、ユニーククローンのいくつかを、ヒトHER
3を発現する株化細胞と結合する能力についてさらに分析した。
たので、組換えファージのライブラリープールをヒトHER3細胞外領域の第1ドメイン
の組換え形に対して枯渇させるさらなる選択を行った(アミノ酸配列SAHHHHHHH
H(配列番号100)と融合したヒトHER3ドメイン1は、HER3細胞外領域につい
て記載したように発現させた、UniProt受託番号:P21860(ERBB3_H
UMAN)残基20~209、配列番号74)。この選択スキームにより、ヒトHER3
の第4ドメインに特異的なscFv断片の単離が可能になった。まとめると、ここで報告
する選択により、ヒトHER3に対するナノモル親和性を、広いエピトープカバー範囲と
ともに有するscFv断片が得られた。高い熱安定性を示すscFv断片を、未処理の細
菌上清由来の分泌scFv断片を熱負荷に供した後に抗原ELISAを行う「クック-ア
ンド-バインド(cook-and-bind)ELISA」により単離した(Mill
er BRら、(2009)Methods Mol.Biol.、525:279~8
9頁)。好ましいscFv断片を、これらの選択から単離した。異なる選択によるほとん
どのscFv断片は、FACSにより、HER3陽性株化細胞と結合することが見出され
た。
HER3抗原を表面で発現するヒト細胞は、PCTパンフレットWO10/10812
7(Fuh Gら)に記載されている。Calu-3(ATCC-LGL standa
rds、Teddington、UK;Cat.No:HTB-55)、BxPC3(A
TCC-LGL standards;Cat.No:CRL-1687)およびMDA
-MB-175-VII(ATCC-LGL standards;Cat.No:HT
B-25)は、ヒトHER3陽性株化細胞の例である。ここでは、Calu-3株化細胞
を主に用いて、ファージディスプレイにより単離されたscFv断片について確認した。
Calu-3細胞は、10%胎児ウシ血清(FCS)および1%Glutamax/ペ
ニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen AG)を補ったRPMI培地で
維持した。
Calu-3細胞を96ウェルプレート(10,000細胞/ウェル)に播種した。以
下の日に、1%FCSを含有する培地で希釈した抗体または組み合わせ抗体または二重特
異性抗体で細胞を処理した。最終濃度3nMのベータヘレグリン(R&D System
s、Abingdon、UK、Cat.No:396-HB)を、抗体とのインキュベー
ションの1時間後に加えた。alamarBlue(登録商標)(AbD Serote
c、Dusseldorf、Germany、Cat.No:BUF102)を72時間
後にウェルに加え、細胞を24時間までインキュベートした後に、540nmの励起波長
および620nmの発光波長にてBiotek Synergy2プレートリーダ(Bi
oTek Instruments GmbH、Luzern、Switzerland
)で蛍光を読み取った。
プロテインAまたはプロテインGとの結合が低減またはなくなったFcバリアントを同
定するために、工学的に操作したバリアントを設計し、スーパー抗原結合部位のコピーが
ともに変異されているホモ二量体として発現させた。このことにより、スーパー抗原に対
する結合がほとんどまたは全く残っていない(差次的精製の概念はこのことに基づく)ホ
モ二量体免疫グロブリンを導く置換を選択できた。
混合IGHG1-IGHG3フォーマットの使用をさらに調べるために、3つのIGH
G1-IGHG3混合Fcバリアントを調製し、プロテインA結合についてアッセイした
。
ンジ配列全体で置換された、自然に存在するヒトIGHG3アイソタイプを起源とする配
列を有した(Fc133と省略する(名称中の数字は、ヒンジ/CH2/CH3の順序で
の各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソタイプサブクラスに対応する);配列番号1
)。
イソタイプ由来のCH3ドメイン配列全体で置換された、自然に存在するヒトIGHG1
アイソタイプを起源とする配列を有した(Fc113と省略する(名称中の数字は、ヒン
ジ/CH2/CH3の順序での各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソタイプサブクラ
スに対応する);配列番号2)。
436Fが導入された、自然に存在するIGHG1アイソタイプを起源とする配列を有し
た(EU番号付け;Fc H435R/Y436Fと省略する;配列番号3)。
製し、陽性対照として用いた。
項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図1は、
3つのバリアントおよびFc IGHG1対照断片のクロマトグラフィープロファイルを
示す。
対照断片は強い結合を示した。ヒトIGHG3 CH3ドメインの自然に存在する配列を
包含するホモ二量体Fcバリアントは、プロテインAとの結合が低減されたかまたは結合
しないと結論付けた。
ーバーラップするので、上記のFcバリアントを、プロテインG結合について、方法の項
に記載したプロトコールに従う捕捉-溶出精製モードにおいて試験した。結果を図2に示
す。3つのバリアントは全て、プロテインG結合を保持した。
免疫グロブリン重鎖中の重要なプロテインG結合残基を同定するために、プロテインG
のC2ドメインとの複合体中のヒトFc断片の構造を、合理的設計のための出発点として
用いた(PDBコード:1FCC、www.pdb.org、Bernstein FC
ら、(1977)Eur J Biochem、80(2):319~324頁およびB
erman HMら、(2000)Nucleic Acids Res、28(1):
235~242頁;Sauer-Eriksson AEら、(1995)Struct
ure、3(3):265~278頁)。PISAサーバ(http://www.eb
i.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html;Ti
na KGら、(2007)Nucleic Acids Res.、35(ウェブサー
バ版):W473~476)を用いる両方の分子間の界面の分析により、Fc断片中の1
8のプロテインG相互作用残基の部分集合が同定され、そのうちL251、M252、I
253、S254、Q311、E380、E382、S426、M428、N434、H
435、Y436およびQ438が主に貢献した(EU番号付け)。残基L251、I2
53、H310、H433、H435およびY436は、これらの残基がFcRn結合の
ために必須であることが当該技術において知られていることに基づいて(Roopeni
an DCおよびAkilesh S、(2007)Nat.Rev.Immunol.
、7(9):715~25頁)、元々の候補リストから省いた。物理化学的特性に加えて
、置換の性質を、プロテインG結合および非結合免疫グロブリンヒトアイソタイプ間の配
列比較に基づいて合理化した(ガンマアイソタイプ 対 IGHA1、IGHA2および
IGHM;Bjorck LおよびKronvall G(1984)J.Immuno
l.、133(2):969~974頁)。
変異誘発技術により変異を導入した。作製した置換は、それらに限定されないが、以下の
変更を含んだ:E380Y(配列番号5)、E382R(配列番号6)、E382Y(配
列番号7)、S426M(配列番号8)、S426R(配列番号9)、S426Y(配列
番号10)、S426W(配列番号11)、Q438R(配列番号12)、Q438Y(
配列番号13)ならびに組み合わせE380A/E382A(配列番号14)、E380
M/E382L(配列番号15)、E380Y/E382R(配列番号16)、M252
A/E380A/E382A(配列番号17)、S254E/S426M/M428G(
配列番号18)およびS254M/E380M/E382L(配列番号19)。
項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。
の結合の完全な排除を導かなかった(図3)。S254位、E380位およびE382位
での置換を組み合わせた変異体(図3M)を用いて結合の小さい低減が観察され、これら
を、M252位、M428位、Y436位およびQ438位でのさらなる置換との4また
は5つの群によりさらに調べた。2つの新しい組み合わせを、次いで、調製した:M25
2A/E380A/E382A/Y436A/Q438A(配列番号20)およびS25
4M/E380M/E382L/S426M/M428G(配列番号21)。さらに、S
426位およびM428位での以前に調べられた置換をH433位およびN434位での
置換とさらに組み合わせた第3の組み合わせ:S426M/M428G/H433D/N
434A(配列番号22)を調製した。
の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。3つ全
てのホモ二量体Fc組み合わせ変異体は、プロテインGカラムとの結合の完全な排除を示
し、ローディングステップ中に溶出された。
ーバーラップするので、上記のFcバリアントを、プロテインA結合について、方法の項
に記載したプロトコールに従う捕捉-溶出精製モードにおいて試験した。結果を図4に示
す。3つのバリアントは全て、プロテインAと結合し、よって、全てのバリアントがプロ
テインA結合を保持したことが示された。
に、S426、M428、H433およびN434からなる4つのアミノ酸の位置の群を
対で調べ、いくつかの場合においては異なるアミノ酸で置換した。以下の組み合わせを調
製した:S426M/H433D(配列番号23)、M428G/N434A(配列番号
24)、M428G/N434S(配列番号25)、M428L/N434A(配列番号
26)およびM428L/N434S(配列番号27)。ホモ二量体Fcバリアントおよ
び対照Fc断片を、プロテインG結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う
勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図5から、M428GおよびN434A、
またはM428GおよびN434S置換を有するホモ二量体Fc組み合わせ変異体だけが
、プロテインGカラムとの結合の完全な排除を示し、ローディングステップ中に溶出され
たことがわかる。ヒトIGHG1免疫グロブリンの血清半減期を延長することが当該技術
において知られており、ここで示す置換の組み合わせM428L/N434S(Zale
vsky Jら、Nat Biotechnol、28(2):157~159頁)は、
プロテインG結合のいずれの低減も導かなかったことに触れておく価値がある(図5C)
。
かうそれらの個別の貢献の点で評価した。2つのホモ二量体Fcバリアント(一方のバリ
アントはM428G置換(配列番号28)を有し、他方のバリアントはN434A置換(
配列番号29)を有する)を調製し、上記のようにアッセイした。驚くべきことに、M4
28G置換もN434A置換も、プロテインG結合の低減または排除を導かなかった(図
6)。よって、これらの結果から、ホモ二量体Fc断片中でプロテインG結合の完全な排
除を誘導するために、M428GおよびN434A置換の組み合わせが必要十分であると
結論付けた。
ーバーラップするので、上記のFcバリアントを、プロテインA結合について、方法の項
に記載したプロトコールに従う捕捉-溶出精製モードにおいて試験した。結果を図7に示
す。全てのバリアントがプロテインA結合を保持した。
するホモ二量体免疫グロブリン中のプロテインAまたはGとの結合を低減または排除する
変異
2.1 プロテインAとの結合が低減されたかまたは結合しないホモ二量体免疫グロブリ
ン
ホモ二量体Fc断片中のプロテインA結合を排除する方法は、実施例1.1に示した。
全長ホモ二量体免疫グロブリン中でのプロテインA排除法の使用を評価するために、混合
IGHG1-IGHG3 Fcフォーマットに基づく抗HER2ホモ二量体免疫グロブリ
ンを調製した。抗HER2ホモ二量体免疫グロブリンは、自然に存在する抗体と同様にフ
ォーマットされ、上記のFc133断片と融合した抗HER2特異性を有するFAB断片
(本明細書において抗HER2 FAB-Fc133と省略する;配列番号30の重鎖お
よび配列番号31の軽鎖)から構成されていた。トランスフェクションの後に、抗HER
2 FAB-Fc133ホモ二量体を、プロテインA結合について、方法の項に記載した
プロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図8Aに示すように、
抗HER2 FAB-Fc133ホモ二量体は、市販のMabSelect SuRe(
商標)プロテインAカラム(GE Healthcare Europe GmbH)と
まだ結合した。Fc133バリアントはプロテインAと結合しないことが以前に示されて
いるので、さらなる実験を行って、結合に対するFAB領域の貢献について調べた。
v単位が、15アミノ酸リンカーと融合した親の免疫グロブリン可変ドメインから構成さ
れる抗HER2 scFv-Fc分子として再フォーマットした(本明細書において抗H
ER2 scFv-Fc133と省略する;配列番号32の重鎖)。得られた抗HER2
scFv-Fc133ホモ二量体は、よって、親の抗HER2 FAB-Fc133ホ
モ二量体免疫グロブリンと同一であるが、CH1およびCK定常ドメインを欠いた。図8
Bに示すように、scFv-Fc133ホモ二量体は、親の抗HER2ホモ二量体免疫グ
ロブリンで観察されたことと同様に、プロテインA結合を示した。この知見により、抗H
ER2 FAB断片の可変ドメインが、ホモ二量体免疫グロブリンのFc部分中のプロテ
インA結合を排除する方法の有効性を妨げる原因であるという結論が導かれた。より重要
なことには、ホモ二量体免疫グロブリンの可変ドメイン中のプロテインA結合は、プロテ
インA差次的精製技術に基づくヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を妨げると結論付けた
。
ドメインと結合することが知られており(Jansson Bら、(1998)FEMS
Immunol.Med.Microbiol.、20(1):69~78頁)、この
特徴は、抗体分子全体のパパイン消化の後のVH3ベースのFAB断片の調製を妨げるこ
とが知られている(なぜなら、プロテインAがVH3ベースのFABおよびFc断片の両
方と結合するからである)。ホモ二量体抗HER2免疫グロブリンまたはそのscFv-
Fcバージョン中で見出される重鎖可変ドメインは、VH3-23サブクラスに属し、工
学的に操作されたFc部分内にプロテインA結合部位を有さないにもかかわらず、これら
のホモ二量体分子がなぜプロテインAと結合するかを説明した。
ある。VH3ベースの分子は、プロテインAと結合する能力がそれらの機能的プレスクリ
ーニングを容易にするので、広く開発されており、よって、抗体発見のために用いられる
多くの合成またはドナーベースのファージディスプレイライブラリーまたはトランスジェ
ニック動物技術は、VH3ドメインサブクラスに基づく。さらに、VH3ベースの分子は
、その他の既知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも良好な発現および安定性のために、
頻繁に選択される。VH3ベースのFAB断片と結合しない組換えバージョンのプロテイ
ンAが開発され、MabSelect SuRe(商標)の商品名の下でGE Heal
thcareにより市販されている。
2免疫グロブリンのプロテインA結合の評価のためにここで用いたので、MabSele
ct SuRe(商標)カラムは、プロテインA差次的精製技術を用いる場合、少なくと
も1つのVH3可変ドメインを有するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製のために適切で
ないと結論付けた。なぜなら、Fc領域中にプロテインA結合を有さないホモ二量体種は
、それらのVH3ドメインによりプロテインAとまだ結合するからである。
調べるために、VH3ベースのFABバリアントをプロテインA結合についてアッセイす
る必要がある。MabSelect SuRe(商標)樹脂の種はVH3ドメインサブク
ラス結合を欠くことが知られているが、MabSelect(商標)として知られる別の
市販のプロテインA樹脂は、VH3ドメインサブクラスと結合する(これもまたGE h
ealthcareからである)ので、VH3ベースのFABバリアントをプロテインA
結合について分析するために選択した。
のであることが知られている以前に記載した親の抗HER2ホモ二量体免疫グロブリンに
由来する組換え抗HER2 FAB断片(本明細書において抗HER2 FABと省略す
る;配列番号33の重鎖および配列番号31の軽鎖)を調製し、該断片を、MabSel
ect(商標)およびMabSelect SuRe(商標)カラムでアッセイすること
により確認した(VKサブクラスIに基づく軽鎖を有する、FAB断片は、まず、プロテ
インLクロマトグラフィーを用いて捕捉-溶出モードで精製した後に、プロテインA勾配
クロマトグラフィーをMabSelect(商標)またはMabSelect SuRe
(商標)カラムで行った、両方のカラムのプロトコールは、方法の項に記載したプロトコ
ールに従った)。図8Cに示すように、VH3ベースの抗HER2 FABだけがMab
Select(商標)カラムと結合し、このことにより、単量体VH3ベースのFAB断
片に少なくとも関する限り、そしてプロテインAとの結合がない工学的に操作されたFc
領域を有するVH3ベースのホモ二量体免疫グロブリンについて以前に観察された結果と
さらに対照的に、MabSelect SuRe(商標)樹脂がVH3ベースのFAB断
片との結合を欠くことが確認された。逆に、抗HER2 FABは、MabSelect
(商標)カラムとの強い結合を示し、このことは、プロテインAと結合しないかまたは結
合が低減されたVH3ベースのFABバリアントについてアッセイする可能性をもたらし
た。
の重要なプロテインA結合残基を、プロテインAのDドメインとの複合体中のヒトFAB
断片の結晶構造(PDBコード:1DEE;www.pdb.org;Graille
Mら、(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(10):5
399~5404頁)から同定した。この分析は、合理的設計のための出発点として用い
、ここでは、行った置換の性質が、ヒト起源のプロテインA結合VHサブクラスとプロテ
インA非結合VHサブクラスとの間の配列比較に基づいた。図9は、各ヒト重鎖可変ドメ
インサブクラスについての1つの代表的なフレームワークのアラインメントを示す。アミ
ノ酸15位、17位、19位、57位、59位、64位、65位、66位、68位、70
位、81位、82a位および82b位(Kabatナンバリング)を、1DEE構造中の
プロテインAのDドメインとVH3ベースのFAB断片との間のタンパク質-タンパク質
相互作用界面の一部として同定した。ヒトVHサブクラスのうち、VH3は、プロテイン
Aと結合する唯一のサブクラスであり、その他のサブクラス中の等価なアミノ酸配列の位
置の残基を、おそらく免疫原性を低減しながらプロテインA結合を排除または低減する観
点で、置換の供給源として選択した。なぜならこれらの置換は、プロテインA非結合ヒト
VHサブクラス中で見出される同じ等価なアミノ酸の位置でのある残基の、別の自然に存
在する残基への置き換えを含んでいたからである。
より変異を導入し、以下の置換を作製した:G65S(配列番号34の重鎖および配列番
号31の軽鎖)、R66Q(配列番号35の重鎖および配列番号31の軽鎖)、T68V
(配列番号36の重鎖および配列番号31の軽鎖)、Q81E(配列番号37の重鎖およ
び配列番号31の軽鎖)、N82aS(配列番号38の重鎖および配列番号31の軽鎖)
および組み合わせR19G/T57A/Y59A(配列番号39の重鎖および配列番号3
1の軽鎖)。
E置換(配列番号41の重鎖および配列番号31の軽鎖)を作製した。T57Aは、WO
2010/075548においてプロテインA結合を排除することが以前に示され、T5
7Eは、電荷交換(正荷電アミノ酸から負荷電アミノ酸への変更)を工学的に作製するた
めに設計した。VKサブファミリーIに基づく軽鎖を有するので、FAB変異体を、まず
、プロテインLクロマトグラフィーを用いて捕捉-溶出モードで精製し、さらに、プロテ
インA結合について、方法の項に記載したように勾配モードの下で操作するMabSel
ect(商標)カラムを用いてアッセイした。図10は、T57A、T57E、G65S
、Q81E、N82aSおよび組み合わせR19G/T57A/Y59Aだけが、MAb
Select(商標)樹脂との抗HER2 FAB結合を排除または低減したことを示す
。置換G65S、Q81EおよびN82aSは、VH3ベースのFAB断片中のプロテイ
ンA結合を排除する場合に好ましい。なぜなら、これらの変異は、プロテインA非結合V
Hサブクラスで見出される配列等価残基について置換することにより、おそらく免疫原性
を低減するからである。
換は、いくつかのヒト化抗体の場合に示されるように、抗体特性に影響を与えることがあ
る。上記の置換がVH3由来抗体の特異性および/または親和性に影響を与えるかを評価
するために、好ましいFAB変異体のうち2つを、表面プラズモン共鳴(SPR)により
HER2抗原結合についてアッセイした。組換えHER2抗原を用いるSPR測定を、方
法の項に記載したように行った。好ましい変異体はともに、元のFAB分子と比較して同
一のHER2抗原との結合を示し(図11)、このことは、置換が特異性または親和性の
点で影響を与えなかったことを証明した。よって、抗原結合を著しく失うことなくVH3
由来抗体分子中のプロテインA結合を工学的に操作するために、これらの置換を広く用い
ることができることが期待される。
ブリンおよび抗HER2 scFv-Fc分子に導入し、バリアントを、MabSele
ct SuRe(商標)樹脂との結合についてアッセイした。以下のバリアントを調製し
た:抗HER2 scFv(G65S)-Fc133(配列番号42の重鎖)、抗HER
2 scFv(N82aS)-Fc133(配列番号43の重鎖)、抗HER2 FAB
(G65S)-Fc133(配列番号44の重鎖および配列番号31の軽鎖)、および抗
HER2 FAB(N82aS)-Fc133(配列番号45の重鎖および配列番号31
の軽鎖)。
トグラフィーのプロファイルを示す。全てのバリアントは、ここで、MabSelect
SuRe(商標)カラムとの結合の低減または結合がほとんどないことを示し、以前に
同定した置換を用いてプロテインA結合がうまく除去されたことを示した。より重要なこ
とには、プロテインA差次的精製技術と組み合わせた場合に、プロテインAに対するVH
3ベースのFABの親和性を排除または低減する置換は、少なくとも1つのVH3可変ド
メインが存在するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を可能にすると結論付けた。
プロテインG結合について試験した。結果を図13に示す。全てのバリアントは、プロテ
インG結合を保持した。
ホモ二量体Fc断片中のプロテインG結合を排除する方法は、実施例1.2に示した。
全長ホモ二量体免疫グロブリン中のプロテインG排除法の使用を評価するために、Fc
M428G/N434A断片に基づく抗HER3ホモ二量体免疫グロブリンを調製した。
抗HER3ホモ二量体免疫グロブリンは、自然に存在する抗体と同様にフォーマットされ
、上記のFc M428G/N434A断片と融合した抗HER3特異性を有するFAB
断片(本明細書において抗HER3 FAB-Fc M428G/N434Aと省略する
、配列番号46の重鎖および配列番号47の軽鎖)から構成されていた。トランスフェク
ションの後に、抗HER3 FAB-Fc M428G/N434Aホモ二量体を、プロ
テインG結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィー
によりアッセイした。図14に示すように、抗HER3 FAB-Fc M428G/N
434Aホモ二量体は、市販のプロテインG HPカラム(GE Healthcare
Europe GmbH)とまだ結合した。Fc M428G/N434A断片はプロ
テインGと結合しないことが以前に示されているので、結合に対するFAB領域の貢献が
疑われた。このような貢献は、ホモ二量体免疫グロブリンのFc部分中のプロテインG結
合を排除する方法の有効性を妨げ、より重要なことには、この新しい差次的精製技術に基
づくヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を妨げる。
でプロテインGと結合することが知られている(Nezlin RおよびGhetie
V、(2004)Advances in Immunology、Academic
Press、Vol.82:155~215頁)。ヒト免疫グロブリンアイソタイプのう
ち、IGHA1、IGHA2およびIGHMを起源とするCH1ドメインは、プロテイン
Gと結合しないことが知られている(Bjorck LおよびKronvall G、既
出)。ガンマアイソタイプ由来のCH1ドメインと、IGHA1またはIGHA2または
IGHM由来のCH1ドメインとの間のアミノ酸配列の違いは、ガンマアイソタイプ由来
のCH1ドメイン中のプロテインG結合を低減または排除しながら、おそらく低い免疫原
性を有する置換の合理的設計を可能にする。図15は、IGHG1由来のヒトCH1ドメ
インと、ヒトIGHA1およびヒトIGHM由来のCH1ドメイン配列とのIMGT配列
アラインメントを示す(IMGT(登録商標)、既出)。IMGT(登録商標)番号付け
は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインの3D構造の比較解析に基づくので、こ
れは、CH1ドメイン間の3D等価位置を規定する。よって、IGHG1のCH1ドメイ
ン内のプロテインG結合を低減または排除する置換を、図15に示す配列アラインメント
から選択した。どの3D位置を置換するかを選択するための別のインプットは、複合体中
のマウスFAB断片およびプロテインGの第3ドメインの結晶構造の解析であった(PD
Bコード1IGC、www.pdb.org、既出;Derrick JPおよびWig
ley DB、(1994)J.Mol.Biol.、243:906~918頁)。C
H1ドメイン結晶構造内の2つのベータ鎖(ストランドA(EU番号付け122から13
6)およびストランドG(EU番号付け212から215)、図15)およびループ構造
(FGループ(EU番号付け201から211)、図15)は、ほとんどのタンパク質-
タンパク質相互作用を媒介するように見受けられ、工学的作業の焦点となった。
記の抗HER3 FAB-Fc M428G/N434Aホモ二量体免疫グロブリンの背
景で調製した:IGHG1由来のCH1ドメイン全体がIGHA1由来のCH1ドメイン
全体で置き換えられたバリアント(本明細書において抗HER3 FAB(IGHA1)
-Fc M428G/N434Aと省略する;配列番号48の重鎖および配列番号47の
軽鎖)、IGHG1由来のCH1ドメイン全体がIGHM由来のCH1ドメイン全体で置
き換えられたバリアント(本明細書において抗HER3 FAB(IGHM)-Fc M
428G/N434Aと省略する;配列番号49の重鎖および配列番号47の軽鎖)、I
GHG1 CH1ドメインストランドA、ストランドGおよび一部のFGループ配列が、
IGHA1 CH1ドメインストランドA、ストランドGおよび一部のFGループ配列で
置き換えられたバリアント(本明細書において抗HER3 FAB(IGHA1-A-F
G/G)-Fc M428G/N434Aと省略する、配列番号50の重鎖および配列番
号47の軽鎖)、IGHG1 CH1ドメインストランドA、ストランドGおよび一部の
FGループ配列がIGHM CH1ドメインストランドA、ストランドGおよび一部のF
Gループ配列で置き換えられたバリアント(本明細書において抗HER3 FAB(IG
HM-A-FG/G)-Fc M428G/N434Aと省略する;配列番号51の重鎖
および配列番号47の軽鎖)、IGHG1 CH1ドメインストランドA配列がIGHA
1 CH1ドメインストランドA配列で置き換えられたバリアント(本明細書において抗
HER3 FAB(IGHA1-A)-Fc M428G/N434Aと省略する;配列
番号52の重鎖および配列番号47の軽鎖)、IGHG1 CH1ドメインストランドG
および一部のFGループ配列がIGHA1 CH1ドメインストランドGおよび一部のF
Gループ配列で置き換えられたバリアント(本明細書において抗HER3 FAB(IG
HA1-FG/G)-Fc M428G/N434Aと省略する;配列番号53の重鎖お
よび配列番号47の軽鎖)、IGHG1 CH1ドメインストランドA配列がIGHM
CH1ドメインストランドA配列で置き換えられたバリアント(本明細書において抗HE
R3 FAB(IGHM-A)-Fc M428G/N434Aと省略する;配列番号5
4の重鎖および配列番号47の軽鎖)、ならびにIGHG1 CH1ドメインストランド
Gおよび一部のFGループ配列がIGHM CH1ドメインストランドGおよび一部のF
Gループ配列で置き換えられたバリアント(本明細書において抗HER3 FAB(IG
HM-FG/G)-Fc M428G/N434Aと省略する;配列番号55の重鎖およ
び配列番号47の軽鎖)。トランスフェクションの後に、抗HER3 FAB-Fcバリ
アントを、プロテインG結合について、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロ
マトグラフィーによりアッセイした。図16および図17は、それぞれIGHA1および
IGHMベースのバリアントについてのプロテインG結合プロファイルを示す。これらの
結果から、IGHG1由来のCH1ドメイン配列全体をIGHA1またはIGHMのいず
れか由来のCH1ドメイン配列全体で置き換えることにより、ガンマFABベースのホモ
二量体免疫グロブリン(ここで、Fc領域も、プロテインGと結合しないかまたは結合が
低減している)中のプロテインG結合の完全な排除が可能になると結論付けた。さらに、
単一鎖交換による排除が、IGHA1またはIGHM由来のストランドGをFGループの
一部とともに用いた場合にのみ成功したが、ストランドAでの置き換えは、プロテインG
結合にほとんどまたは全く影響を与えなかったことがわかった。
定するために、CH1ドメインストランドGおよび一部のFGループ配列の分析に由来す
るさらなる置換を調べた。以下の置換の対を試験した:T209P/K210S(FGル
ープ)、K213V/K214T(ストランドG)、T209G/K210N(FGルー
プ)およびD212E/K214N(ストランドG)(EU番号付け;IMGT115位
、116位、118位、119位および120位にそれぞれ相当するEU209位、21
0位、212位、213位および214位)。最初の2つの組み合わせは、IGHA1
CH1ドメインストランドGおよび一部のFGループ配列に対するIGHG1 CH1ド
メインストランドGおよび一部のFGループ配列の分析に由来し、置換の他の2対は、I
GHM CH1ドメインストランドGおよび一部のFGループ配列に対するIGHG1
CH1ドメインストランドGおよび一部のFGループ配列の解析に由来した。バリアント
は、上記のようにフォーマットされ、以下のように記載できる:配列番号56の重鎖およ
び配列番号47の軽鎖を有する抗HER3 FAB(T209G/K210N)-Fc
M428G/N434A、配列番号57の重鎖および配列番号47の軽鎖を有する抗HE
R3 FAB(T209P/K210S)-Fc M428G/N434A、配列番号5
8の重鎖および配列番号47の軽鎖を有する抗HER3 FAB(D212E/K214
N)-Fc M428G/N434A、ならびに配列番号59の重鎖および配列番号47
の軽鎖を有する抗HER3 FAB(K213V/K214T)-Fc M428G/N
434A。
項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図18は
、IGHA1由来置換についての勾配クロマトグラフィープロファイルを示し、T209
P/K210SおよびK213V/K214T置換はともに、プロテインG結合を完全に
排除できた。IGHMベースの置換の場合、T209G/K210N置換だけがプロテイ
ンG結合の完全な排除を導き、D212E/K214N置換は、プロテインG結合に影響
を与えなかった(図19)。これらの結果から、置換T209P/K210S、K213
V/K214TおよびT209G/K210N(EU番号付け)は、ガンマアイソタイプ
FABベースのホモ二量体免疫グロブリン(ここで、Fc領域も、プロテインGと結合し
ないかまたは結合が低減している)中のプロテインG結合を排除できると結論付けた。よ
り重要なことには、ガンマアイソタイプFABとプロテインGとの結合を排除または低減
する置換は、実施例1.2に記載するプロテインG差次的精製技術と組み合わせた場合に
、少なくとも1つのCH1ドメインが存在するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を可能
にする。
結果を図20に示す。全てのバリアントは、プロテインA結合を保持した。
不変であるので、本明細書で示す209位および210位の置換は、全てのガンマアイソ
タイプCH1ドメイン中のCH1ドメインとプロテインGとの結合を排除できると期待さ
れる。2つの位置のうち、209位は、CH1-プロテインG相互作用において主な役割
を演じると期待される。PDBsumオンラインツール(http://www.ebi
.ac.uk/pdbsum/、Laskowski RAら、(1997)Trend
s Biochem.Sci.、22(12):488~490頁)を用いる1IGC中
の水素結合ネットワークの分析は、T209の側鎖とプロテインG由来のアミノ酸側鎖(
残基T21、1IGCの配列に従う番号付け)との間の重要な水素結合相互作用を明らか
にした。K210も、プロテインG由来のアミノ酸(E20、1IGCの配列に従う番号
付け)との間に水素結合相互作用することが示されたが、この相互作用は主鎖原子のみに
関与するので、アミノ酸置換により破壊されにくいと期待される。
、IGHG3およびIGHG4中のR214に相当する(これは、保存的アミノ酸変化で
ある。なぜなら、正電荷がこの位置で維持されるからである)。IGHG2中で、214
位はトレオニンであり、よって、非保存的変化である。K213V/K214T置換はプ
ロテインGとIGHG1 CH1ドメインとの結合を排除したので(本明細書で示すとお
り)、213位の置換は、全てのガンマアイソタイプ中のプロテインG結合を排除するた
めに十分であると期待される。209位と同様に、K213の側鎖も、プロテインG由来
のアミノ酸側鎖(残基T16、1IGCの配列に従う番号付け)との重要な水素結合相互
作用を媒介するが、K210と同様に、K214は、プロテインG由来のアミノ酸(K1
5およびT16、1IGCの配列に従う番号付け)と、主鎖原子が関与する水素結合相互
作用だけを行い、この相互作用は、よって、アミノ酸置換により破壊されにくいと期待さ
れる。
するために、以下の単一置換を調べた:T209P、K213V(ともにIGHA1由来
置換)およびT209G(IGHM由来置換)。
5の重鎖および配列番号47の軽鎖を有する抗HER3 FAB(T209P)-Fc
M428G/N434A、配列番号76の重鎖および配列番号47の軽鎖を有する抗HE
R3 FAB(K213V)-Fc M428G/N434A、ならびに配列番号77の
重鎖および配列番号47の軽鎖を有する抗HER3 FAB(T209G)-Fc M4
28G/N434A。
ファイルを示し、T209PおよびK213V置換はともに、プロテインG結合を完全に
排除できた。IGHMベースの置換の場合、T209Gは、プロテインG結合の完全な排
除を導いた(図18E)。これらの結果から、置換T209P、K213VおよびT20
9G(EU番号付け)は、ホモ二量体免疫グロブリン(ここで、Fc領域も、プロテイン
Gと結合しないかまたは結合が低減している)内のガンマアイソタイプ由来のFAB断片
中のプロテインG結合を排除できると結論付けた。より重要なことには、実施例1.2に
記載するプロテインG差次的精製技術と組み合わせた場合に、プロテインGとのFAB結
合を排除または低減する置換は、少なくとも1つのCH1ドメインを有するヘテロ二量体
免疫グロブリンの調製を可能にする。
価するために、上記の3つ全てのCH1単一変異抗体を、HER3抗原結合についてSP
Rによりアッセイした。組換えHER3抗原についての測定は、方法の項において記載し
たように行った。3つ全ての変異体は、対照抗体と比較して同一の抗原結合を示し(図1
8F)、このことは、置換が特異性または親和性の点で影響を与えなかったことを証明し
た。よって、抗原結合を著しく失うことなくガンマアイソタイプ由来のFAB断片内のプ
ロテインG結合を工学的に操作するために、これらの置換を広く用いることができること
が期待される。
ンの精製。
ホモ二量体免疫グロブリン中のプロテインAまたはプロテインG結合を排除または低減
する方法は、実施例1および2に示した。これらの方法は、それら自体または組み合わせ
でのヘテロ二量体免疫グロブリンの精製を可能にするために開発した。
場合にプロテインAまたはGとの結合が低減されているかまたは結合しない重鎖のヘテロ
二量体の分離を可能にするために、勾配モードクロマトグラフィーを必要とする。組み合
わせで用いる場合、これらの方法は、2回の捕捉-溶出クロマトグラフィーステップ(順
序は特に限定されないが、一方はプロテインAに対して、そして他方はプロテインGに対
して)を連続して行うことにより重鎖のヘテロ二量体の調製のために簡便に用いることが
できる。両方の技術を包含するヘテロ二量体免疫グロブリンは、プロテインAと結合でき
るがプロテインGとの結合が低減されたかまたは結合しない1つの重鎖と、それと対にな
った、プロテインGと結合できるがプロテインAとの結合が低減されたかまたは結合しな
い別の重鎖とから構成される。対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、そのホモ
二量体種(プロテインAと結合しないかまたはプロテインGと結合しない2種の可能性の
あるホモ二量体種)の両方に対して差次的精製特性を有する。
二量体免疫グロブリンの均質な調製を可能にする。なぜなら、各親和性ステップにて、2
種のホモ二量体免疫グロブリン混入物の一方(なぜなら、これは親和性樹脂と結合しない
からである)が、勾配モードクロマトグラフィーを使用することなく効率的に除去される
からである。このことは、特に興味深い。なぜなら、捕捉-溶出モードクロマトグラフィ
ーは、工業的規模の調製にとって好ましいからである。よって、これら2つの技術と、プ
ロテインAクロマトグラフィーとその後のプロテインGクロマトグラフィー(またはその
逆)との逐次的使用との組み合わせにより、いずれの形の勾配クロマトグラフィーも行う
必要なく捕捉-溶出モードで、最高の純度(95%を超える、より好ましくは98%を超
える)のヘテロ二量体免疫グロブリンの調製が可能になる。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの調製のためのプロテインA排除法の使用を評価するため
に、混合IGHG1-IGHG3 Fcフォーマットに基づく抗HER2/HER3ヘテ
ロ二量体免疫グロブリンを調製した。
する重鎖は同一の分子量を有するので、SDS-PAGE分析によりホモ二量体からヘテ
ロ二量体を同定することは不可能である。その結果、SDS-PAGEの移動度に差を持
たせ、ヘテロ二量体形成の同定を容易にするために、一方の重鎖がFAB断片を保有し、
他方の重鎖がscFv断片を保有するscFv-FABフォーマットを用いた。
片と融合した抗HER3特異性を有するFAB断片(本明細書において抗HER3 FA
B-Fc133と省略する;配列番号60の重鎖および配列番号47の軽鎖)から構成さ
れていた。重要なことには、抗HER3 FAB-Fc133重鎖中で見出される可変重
鎖ドメインは、VHサブクラス2に属し、プロテインAと結合しない。抗HER2重鎖は
、実施例2に記載したようにフォーマットされ、自然に存在するIGHG1アイソタイプ
由来のFc部分を有する抗HER2 scFv-Fc重鎖(本明細書において抗HER2
scFv-Fc IGHG1と省略する;配列番号61の重鎖)から構成されていた。
重要なことには、抗HER2 scFv-Fc重鎖中で見出される可変重鎖ドメインは、
VHサブクラス3(VH3)に属し、プロテインAと結合する。
との共有結合により得られる抗HER2/HER3ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よっ
て、プロテインAとの結合部位を有さない1つの重鎖(抗HER3 FAB-Fc133
重鎖は、そのFc領域中でプロテインA結合が排除され、その可変重鎖ドメイン中にプロ
テインA結合部位が存在しない)と、プロテインAに対する2つの結合部位を有する1つ
の重鎖(抗HER2 scFv-Fc IGHG1重鎖は、IGHG1 Fc領域中で見
出される自然のプロテインA結合部位を有し、VH3ドメイン中に存在する第2プロテイ
ンA結合部位を有する)とを有すると期待された。この特定の重鎖組み合わせは、合計で
2つのプロテインA結合部位を有する対象の抗HER2/HER3ヘテロ二量体免疫グロ
ブリンとともに、2つのホモ二量体免疫グロブリン種(一方はプロテインAに対する結合
部位を有さず、第2の種は、合計で4つを有する)の生成をもたらす。ヘテロ二量体種と
ホモ二量体種との間でプロテインA結合部位の数が異なることにより、以下に示すように
、3つ全ての分子を勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能になる。
法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図2
1に示すように、3つ全ての種は、プロテインA勾配クロマトグラフィーにより分離され
、結合部位を有さない種はMabSelect SuRe(商標)プロテインAカラムと
結合しなかったが、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、最大数のプロテインA結合部
位を有するホモ二量体種の前に溶出された。
するためにプロテインA排除法を実行する場合、VH3ドメインがプロテインAと結合し
かつFc領域において改変されていない重鎖の一部となるように工学的に操作されている
場合にのみ、ヘテロ二量体精製が成功できることを示す。
1に示す置換を用いて少なくとも1つのVH3ドメインまたは両方においてプロテインA
結合を変異させることにより、この差次的精製技術の基礎であるプロテインA結合部位不
均衡を保存できる。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの調製のためのプロテインG排除法の使用を評価するため
に、ホモ二量体Fc断片中のプロテインG結合を排除する最小限の数の置換に基づく抗H
ER2/HER3ヘテロ二量体免疫グロブリンを調製した。実施例3.1と同様に、sc
Fv-FABフォーマットを用いて、SDS-PAGE移動度の差を作製し、ヘテロ二量
体同定を容易にした。
た抗HER2 scFvと上記のFc M428G/N434A断片とから構成されたs
cFv-Fc型の重鎖(本明細書において抗HER2 scFv-Fc M428G/N
434Aと省略する;配列番号62の重鎖)に相当した。
HG1 Fc断片と融合した抗HER3特異性を有するFAB断片(本明細書において抗
HER3 FAB-Fc IGHG1と省略する;配列番号63の重鎖および配列番号4
7の軽鎖)から構成されていた。
c IGHG1重鎖との共有結合により得られる抗HER2/HER3ヘテロ二量体免疫
グロブリンは、よって、プロテインGに対する結合部位を有さない1つの重鎖(抗HER
2 scFv-Fc M428G/N434Aは、そのFc部分中でプロテインG結合が
排除され、scFvフォーマット中にさらなるプロテインG結合部位は存在せず、すなわ
ちCH1ドメインは存在しない)と、プロテインGに対する2つの結合部位を有する1つ
の重鎖(抗HER3 FAB-Fc IGHG1重鎖は、IGHG 1Fc領域中で見出
される自然のプロテインG結合部位を有し、そのCH1ドメイン中に存在する第2プロテ
インG結合部位を有する)とを有すると期待された。この特定の重鎖組み合わせは、合計
で2つのプロテインG結合部位を有する対象の抗HER2/HER3ヘテロ二量体免疫グ
ロブリンとともに、2つのホモ二量体免疫グロブリン種(一方はプロテインGに対する結
合部位を有さず、第2の種は、合計で4つを有する)の生成をもたらす。ヘテロ二量体種
とホモ二量体種との間でプロテインG結合部位の数が異なることにより、3つ全ての分子
を勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能になる。生成の後に、3つ
全ての種を含有する細胞培養上清を、プロテインG結合について、方法の項に記載したプ
ロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。図22に示すように、3
つ全ての種は分離され、結合部位を有さない種はプロテインG HPカラムと結合しなか
ったが、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、最大数のプロテインG結合部位を有する
ホモ二量体種の前に溶出された。
用は、プロテインG結合を排除する置換を保有する重鎖がCH1ドメインを有さないフォ
ーマットに限定される。なぜなら、FABフォーマットを用いることは、不要なホモ二量
体種のプロテインG結合を本質的に回復するからである。FAB断片のCH1ドメイン中
のプロテインG結合部位を排除することにより、Fc領域中のプロテインG結合を排除す
る置換を保有する重鎖内にFAB断片が存在するヘテロ二量体免疫グロブリンを調製でき
る。この例を以下に示す。
-FABフォーマットを用いて調製して、SDS-PAGE移動度の差を作製し、ヘテロ
二量体同定を容易にした。
重鎖(配列番号61の重鎖)であった。抗HER3重鎖は、実施例2.2に記載した抗H
ER3 FAB(IGHA1-FG/G)-Fc M428G/N434A重鎖(配列番
号53の重鎖および配列番号47の軽鎖)であった。
G/G)-Fc M428G/N434A重鎖との共有結合により得られる抗HER2/
HER3ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインGに対する結合部位を有さ
ない1つの重鎖(抗HER3 FAB(IGHA1-FG/G)-Fc M428G/N
434A重鎖は、そのFc領域およびCH1ドメインの両方においてプロテインG結合が
排除されている)と、プロテインGに対する結合部位を1つだけ有する1つの重鎖(抗H
ER2 scFv-Fc IGHG1重鎖は、IGHG1Fc領域中で見出される自然の
プロテインG結合部位を有し、scFvフォーマット中にさらなるプロテインG結合部位
は存在せず、すなわちCH1ドメインは存在しない)とを有すると期待された。この特定
の重鎖組み合わせは、1つだけのプロテインG結合部位を有する対象の抗HER2/HE
R3ヘテロ二量体免疫グロブリンとともに、2つのホモ二量体免疫グロブリン種(一方は
プロテインGに対する結合部位を有さず、第2の種は、合計で2つを有する)の生成をも
たらす。ヘテロ二量体種とホモ二量体種との間でプロテインG結合部位の数が異なること
により、3つ全ての分子を勾配クロマトグラフィーにより効率的に分離することが可能に
なる。生成の後に、3つ全ての種を含有する細胞培養上清を、プロテインG結合について
、方法の項に記載したプロトコールに従う勾配クロマトグラフィーによりアッセイした。
図23に示すように、3つ全ての種は分離され、結合部位を有さない種はプロテインG
HPカラムと結合しなかったが、対象のヘテロ二量体免疫グロブリンは、最大数のプロテ
インG結合部位を有するホモ二量体種の前に溶出された。
疫グロブリン
プロテインAまたはプロテインGでのヘテロ二量体免疫グロブリンの差次的精製の方法
を、逐次的様式で組み合わせて、捕捉-溶出モードで、すなわちいずれの形の勾配クロマ
トグラフィーも行う必要なくヘテロ二量体免疫グロブリンを容易に精製できる。2つの例
を以下に示す。
ンを、scFv-FABフォーマットを用いて調製して、SDS-PAGE移動度の差を
作製し、ヘテロ二量体同定を容易にした。抗HER2重鎖は、実施例3.2に記載した抗
HER2 scFv-Fc M428G/N434A重鎖(配列番号62の重鎖)であっ
た。抗HER3重鎖は、実施例3.1に記載した抗HER3 FAB-Fc133重鎖(
配列番号60の重鎖および配列番号47の軽鎖)であった。
c133重鎖との共有結合により得られる抗HER2/HER3ヘテロ二量体免疫グロブ
リンは、よって、プロテインGに対する2つの結合部位を有するがプロテインAに対する
結合部位を有さない1つの重鎖(抗HER3 FAB-Fc133重鎖は、そのFc領域
中でプロテインA結合が排除され、その可変ドメインはVH2サブクラスに属するのでプ
ロテインAと結合せず、さらに、2つのプロテインG結合部位(一方はそのFc部分中に
、他方はそのCH1ドメイン中)が存在する)と、プロテインAに対する2つの結合部位
を有するがプロテインGに対する結合部位を有さない1つの重鎖(抗HER2 scFv
-Fc M428G/N434A重鎖は、そのFc領域中でプロテインG結合が排除され
、scFvフォーマット中にさらなるプロテインG結合部位は存在せず、すなわちCH1
ドメインは存在しない;2つのプロテインA結合部位(一方はそのFc部分中に、他方は
そのVHドメイン中)も存在する(なぜなら後者はVH3サブクラスに属するからである
)とを有すると期待された。他方、2種のホモ二量体免疫グロブリンの一方は、プロテイ
ンGに対する結合部位を有さず、プロテインAに対する4つの結合部位を有する(抗HE
R2 scFv-Fc M428G/N434A重鎖のホモ二量体)が、他方のホモ二量
体免疫グロブリン種は、プロテインAに対する結合部位を有さず、プロテインGに対する
4つの結合部位を有する(抗HER3 FAB-Fc133重鎖のホモ二量体)。
とにより、3つ全ての分子を、プロテインAでの捕捉-溶出クロマトグラフィーステップ
とその後のプロテインGでの第2捕捉-溶出クロマトグラフィーステップを用いて効率的
に分離することが可能になる。
トグラフィーステップ、すなわちまずプロテインAおよび次いでプロテインG(ともに方
法の項に記載したプロトコールに従う)により精製した。図24に示すように、3つ全て
の種は分離された。各精製ステップにて、捕捉-溶出モードで、ホモ二量体免疫グロブリ
ン種のうち一方は、親和性樹脂と結合しないので、効率的に除去された。非還元SDS-
ポリアクリルアミド(4~12%)ゲルバンドの走査デンシトメトリー分析により、精製
された調製物中でヘテロ二量体の割合を評価することが可能である。FluorChem
SPイメージングシステム(Witec AG、Littau、Switzerlan
d)および製造者により提供されるプロトコールを用いて、対象のヘテロ二量体免疫グロ
ブリンが、均質に>99%の純度で精製されたことがわかった(図24C)。
ロテインA結合を排除する補完的方法およびCH1ドメイン中のプロテインG結合を排除
する補完的方法と組み合わせた。
v-FABフォーマットを用いて調製して、SDS-PAGE移動度の差を作製し、ヘテ
ロ二量体同定を容易にした。抗HER2重鎖は、実施例2.1に記載した抗HER2 s
cFv(G65S)-Fc133重鎖(配列番号42の重鎖)であった。抗HER3重鎖
は、実施例2.2に記載した抗HER3 FAB(IGHA1-FG/G)-Fc M4
28G/N434A重鎖(配列番号53の重鎖および配列番号47の軽鎖)であった。
1-FG/G)-Fc M428G/N434A重鎖との共有結合により得られる抗HE
R2/HER3ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインGに対する1つの結
合部位を有するがプロテインAに対する結合部位を有さない1つの重鎖(抗HER2 s
cFv(G65S)-Fc133重鎖は、そのFc領域およびVH3ドメイン中でプロテ
インA結合が排除され、さらに、そのFc領域中に1つのプロテインG結合部位が存在す
るが、scFvフォーマット中にさらなるプロテインG結合部位は存在せず、すなわちC
H1ドメインは存在しない)と、プロテインAに対する1つの結合部位を有するがプロテ
インGに対する結合部位を有さない1つの重鎖(抗HER3 FAB(IGHA1-FG
/G)-Fc M428G/N434A重鎖は、そのFc領域およびCH1ドメイン中で
プロテインG結合が排除され、そのFc部分中に1つのプロテインA結合部位が存在し、
その可変ドメインは、VH2サブクラスに属するのでプロテインAと結合しない)とを有
すると期待された。他方、2種のホモ二量体免疫グロブリンの一方は、プロテインGに対
する結合部位を有さず、プロテインAに対する2つの結合部位を有する(抗HER3 F
AB(IGHA1-FG/G)-Fc M428G/N434A重鎖のホモ二量体)が、
他方のホモ二量体免疫グロブリン種は、プロテインAに対する結合部位を有さず、プロテ
インGに対する2つの結合部位を有する(抗HER2 scFv(G65S)-Fc13
3重鎖のホモ二量体)。
とにより、3つ全ての分子を、プロテインAでの捕捉-溶出クロマトグラフィーステップ
とその後のプロテインGでの第2捕捉-溶出クロマトグラフィーステップを用いて効率的
に分離することが可能になる。
トグラフィーステップ、すなわちまずプロテインAおよび次いでプロテインG(ともに方
法の項に記載したプロトコールに従う)により精製した。図25に示すように、3つ全て
の種は分離された。各精製ステップにて、捕捉-溶出モードで、ホモ二量体免疫グロブリ
ン種のうち一方は、親和性樹脂と結合しないので、効率的に除去された。非還元SDS-
ポリアクリルアミド(4~12%)ゲルバンドの走査デンシトメトリー分析により、精製
された調製物中でヘテロ二量体の割合を評価することが可能である。FluorChem
SPイメージングシステム(Witec AG、Littau、Switzerlan
d)および製造者により提供されるプロトコールを用いて、対象のヘテロ二量体免疫グロ
ブリンが、均質に>99%の純度で精製されたことがわかった(図25C)。
CH1ドメイン中のプロテインG結合を排除する補完的方法とを用いて、ヘテロ二量体免
疫グロブリン内のプロテインAおよびG部位の数を調整できることを示す。これらの補完
的技術を用いて、よって、差次的精製を可能にする結合部位の数を最小限に減らして、そ
のことにより、より穏やかな溶出条件を用いることが可能になる。これは、ヘテロ二量体
の全体的な回収の点で有利であると期待される特徴である。
4.1 ヒト新生児Fc受容体との結合
新生児Fc受容体との結合は、分解から免疫グロブリンを保護し、それらの半減期を増
加させる。よって、プロテインAまたはGとの結合を排除または低減するFc領域中で作
製した置換が新生児受容体との結合を破壊しないことが必須である。
をホモ二量体免疫グロブリンに対して行った。工学的に操作されたFc領域を保有する一
方の工学的に操作された重鎖と、1つの未改変のFc領域を保有する他方の重鎖とを有す
る重鎖のヘテロ二量体は、SPR実験において用いることができない。なぜなら、未改変
の重鎖由来の結合シグナルが、工学的に操作された重鎖に導入された可能性があるいずれ
の負の影響も埋め合わせる可能性があるからである。
示されるヒト化抗ヒトCD19抗体を起源とする同じ可変重鎖と可変軽鎖ドメインを用い
てフォーマットした。
に固定化することが最良である。二価分子を分析物として用いるならば、SPR測定は、
親和性に加えてアビディティー成分を有する。ソフトウェア分析は、二価の結合化をモデ
ル化し、親和性定数を抽出できるが、可能である場合はいつでも一価分析物を用いて作業
することにより、いずれのアビディティーの偏りも回避することが常に好ましい。この目
的に沿うために、各ホモ二量体免疫グロブリンを、CM5センサチップ上に直接結合させ
た。ベータ2-ミクログロブリンタンパク質と非共有的に結合したアルファ鎖から構成さ
れるヒトFcRnの可溶型の細胞外領域を調製し、分析物として用いた。
る。
保持した。ヒトFcRnに対するこれらの親和性および相対的親和性をそれぞれ図26お
よび27に示し、SPRセンサグラムの例を図28に示す。
いてのKD値を示す。未改変のIGHG1対照免疫グロブリンは、約2000nMのKD
を有したが、これは、天然ヒトIGHG1抗体とヒトFcRnとの結合について以前に報
告されたKD値と一致する値である(1700~2500nM、Zalevsky Jら
、(2010)Nat.Biotechnol.、28(2):157~159)。プロ
テインA排除法において用いた全てのIGHG1-IGHG3ベースの置換は、より上の
範囲または天然ヒトIGHG1抗体とヒトFcRnとの結合について観察される値よりも
高いKD値を有した(抗hCD19 FAB-Fc133、抗hCD19 FAB-Fc
113および抗hCD19 FAB-Fc H435R/Y436F)。この観察は、未
改変のIGHG1対照免疫グロブリンのものに対する相対的結合の点で種々のバリアント
の結合を表した場合に、明白であった(図27)。最小限の置換の対H435R/Y43
6Fを含むプロテインA法で用いた置換は、天然ヒトIGHG1対照について観察された
結合の73から77%だけを保持したが、プロテインG法において用いた最小限の置換の
対は、93%の保持を達成した(M428G/N434A)。これらの測定から、プロテ
インGでの差次的精製の方法が、ヒトFcRn結合を維持しながらヘテロ二量体免疫グロ
ブリンを精製するために最も効率的な方法であると結論付けることができる。驚くべきこ
とに、置換N434Aは、M428G置換の負の影響を埋め合わせることがわかった(相
対的比率がそれぞれ3.13および0.45)。
hFcγR3aに対する抗体親和性は、抗体のFc領域に限定される。Fc工学操作研
究は、Fc置換がhFcγR3aと結合し、かつ抗体依存性細胞傷害(ADCC)のよう
なエフェクター機能を誘発する抗体の能力に大きい影響を与えることができることを示し
ている(Strohl WRら(2009)Curr Opin Biotechnol
.、20(6):685~91頁)。
ために、ホモ二量体抗HER3 FAB-Fc M428G/N434A抗体およびアイ
ソタイプ対照抗体(ホモ二量体抗hCD19 FAB-Fc IGHG1抗体)を、hF
cγR3a結合について、SPRによりアッセイした。組換えhFcγR3aについての
測定を行い、結果を図29に示す。両方の抗体は、KD値が近く、このことは、置換が特
異性または親和性の点で影響を与えなかったことを証明した。よって、hFcγR3a結
合を著しく失うことなくガンマアイソタイプFc領域内のプロテインG結合を工学的に操
作するために、置換M428GおよびN434Aを広く用いることができることが期待さ
れる。
多くの認可済みキメラ、ヒト化および完全ヒト抗体は、著しい抗薬物抗体応答をヒトに
おいて誘導する。中和抗薬物抗体は、薬物-標的相互作用に干渉して、有効性の減少をも
たらす。いくつかの場合では、抗薬物抗体は、免疫複合体の形成により毒性を導くことが
ある。コンピュータモデルおよびin vitro T細胞シミュレーション試験を開発
して、CD4+ T細胞エピトープを予測した。
ibaseプラットフォーム(商標)(Lonza、Applied Protein
Services、Cambridge、UK)を用いて調べた。免疫原性を予測するた
めの構造的バイオインフォーマティクスアプローチであるEpibase(商標)v.3
技術を用いて、標的アミノ酸配列中の可能性のあるT細胞エピトープを探索した。この技
術は、HLA受容体とのペプチドの実験的に得られる結合親和性とともに、HLA受容体
の最新の3D構造の特徴を統合する。実際上、このin-silico法は、アミノ酸配
列を10アミノ酸の長さのペプチド(10マー)に切断し、43のDRB1アロタイプ由
来のHLAクラスII受容体とのその結合強度の量の見積を算出する。ヒト抗体生殖系列
アミノ酸配列に相当する自己ペプチドは、分析から除外される。
らびにVH3ドメインサブクラス中のプロテインA結合を排除する置換N82aSについ
ての免疫原性予測を調べた。
アミノ酸配列(配列番号61)を対照配列として用い、さらに改変して、Epibase
のためのさらに2つのインプット配列を設計した:置換M428GおよびN434Aを有
する第2アミノ酸配列ならびに置換N82aSを有する第3アミノ酸配列。
ペプチドのうち、1つのペプチドだけが、DRB1*15およびDRB1*16についての
強いエピトープであると見られ(LHAHYTQKSL(配列番号99))、その他のD
RB1アロタイプは、この特定のペプチドと中程度の結合を示したかまたは全く結合を示
さなかった。16のうち2つのペプチドが、いくつかのDRB1アロタイプに対する中程
度の親和性を有すると予測された。
た。さらに、強く結合すると予測された対照配列由来の1つのペプチドだけが、置換N8
2aSを導入した場合に中程度の親和性で結合した。これらの結果を図30にまとめ、参
照抗体としてのLonzaから提供されるその他の治療用抗体と比較する。
びK213Vについての免疫原性予測を調べた。これらの置換はEpibaseを用いて
直接試験せず、代わりに、無作為化分析を行って、それらの免疫原性能力を評価した。こ
の分析では、Epibaseは、全ての可能性のある置換について相対的スコアを与える
。スコアが高いほど、この置換について予測される結合がより強い。全体的なDRB1ス
コアは、重要なエピトープカウント、影響されるアロタイプの数、および影響されるアロ
タイプの頻度を考慮に入れる。ここで、置換は、CH1 IGHG1の関係において分析
した(図31)。好ましい置換K213Vは、他の2つのアミノ酸置換と比較して非常に
低い免疫原性能力を示した。209位の置換は、より高いスコアを与えたが、非常に低い
免疫原性の危険性をまだ示した。
またはヒト化抗体と比較して、低い免疫原性能力を示した。
ヒトIgGサブクラスについての融解プロファイルは、知られており(Garber
EおよびDemarest SJ(2007)Biochem.Biophys.Res
.Commun.、355(3):751~7頁)、全てのプロファイルは、CH2、C
H3およびFAB領域の独立したアンフォールディングに相当する3つのアンフォールデ
ィング推移を含むことが示されている。4つのヒトIgGサブクラスのうち、IGHG1
は最も安定なCH3ドメイン(約85℃)を有する。その他のIgGサブクラス由来のC
H3ドメインは、安定性がより低いが、生理的条件下で約70℃未満で融解するものは知
られていない。同様に、全てのサブクラスは、約70℃の融解温度を有するCH2ドメイ
ンを有することが知られている。
図32は、置換M428GおよびN434Aを有するヒトホモ二量体Fc領域(γ1ヒ
ンジ領域とγ1 CH2ドメインとγ1 CH3ドメインとを包含する鎖の二量体)、な
らびに非置換対照Fc領域の融解プロファイルを示す。61.6℃のTmを有する第1推
移は、CH2ドメインの融解を表すが、79.1℃のTmを有する第2推移は、CH3ド
メインの融解を表す。これらの2つの推移は、対照Fc領域について観察される2つの推
移とよく対照する。これらの結果から、置換M428GおよびN434Aは、熱安定性の
点で与える影響が小さいと結論付けた。なぜなら、CH2およびCH3ドメインは、それ
ぞれ5.9℃および5.2℃の熱安定性を失ったからである。
も調べた。実施例2.2の置換M428GおよびN434Aを有する抗HER3ホモ二量
体免疫グロブリンの融解プロファイルを、図33Aに示す。このプロファイルは、同じ置
換を有するホモ二量体Fc領域について得られたプロファイルと比較して、82℃のTm
を有するさらなる第3の推移を示す(図32)。このさらなる推移は、FAB領域の融解
を表すが、その他の2つの推移は、上記のようにCH2およびCH3ドメインの融解を表
す。65℃のTmを有する第1の推移は、CH2ドメインの融解を表し、79℃のTmを
有する第2の推移は、CH3ドメインの融解を表す。この結果から、置換M428Gおよ
びN434Aも、ホモ二量体免疫グロブリン内で熱安定性に与える影響が小さいと結論付
けた。なぜなら、CH2およびCH3ドメインは、図34Aに示す抗hCD19抗体のよ
うな非置換の等価な免疫グロブリンの融解プロファイルと比較して、それぞれ6.1℃お
よび4℃の熱安定性を失ったからである。
209G、T209PおよびK213Vの影響も、ホモ二量体免疫グロブリンの関係にお
いて調べた。実施例2.2のFc置換M428GおよびN434Aと組み合わせて置換T
209GまたはT209PまたはK213Vを有する抗HER3ホモ二量体免疫グロブリ
ンの融解プロファイルを、図33Aおよび33Bに示す。これらのプロファイルは、FA
B熱安定性が、置換T209GおよびK213V(それぞれ-3.6℃および-3.4℃
)によってわずかに影響されただけであったが、置換T209Pは、最大の影響を有し、
消失が10.8℃であったことを示す。置換T209GおよびK213Vは、よって、免
疫グロブリンを置換してFAB領域内でプロテインG結合を排除する場合に好ましい。
ンの熱安定性分析
Fc領域中のプロテインA結合を低減または排除するガンマアイソタイプCH2および
CH3ドメインの異なる組み合わせの熱安定性を、ホモ二量体免疫グロブリンフォーマッ
トの関係において調べた。実施例4で論じた抗hCD19ホモ二量体免疫グロブリンの融
解プロファイルを図34に示す。これらのプロファイルは、2つの推移を示し、第1の推
移は、CH2ドメインの融解を表し(約70℃)、第2の推移は、FAB領域の融解を表
し、これは、CH3ドメインの融解について期待される推移(約82℃)とオーバーラッ
プする。これらの結果から、ドメインの組み合わせFc113およびFc133(ここで
、数字は、ヒンジ/CH2/CH3の順序での各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソ
タイプサブクラスに対応する)ならびにそれらのIGHG1対照(図34A)は、ほぼ同
一の融解プロファイルを有し(-0.8から-2.1℃の差)、よって、これらのドメイ
ンの組み合わせは、ホモ二量体免疫グロブリンフォーマット内で熱安定性の点でわずかな
影響だけを有したと結論付けた。
ヘテロ二量体抗HER2/HER2抗体および関連するホモ二量体抗HER2対照抗体
の薬物動態を調べた。
ER3ヘテロ二量体免疫グロブリンについて記載したように構築および精製し、抗HER
2 scFv-Fc M428G/N434A重鎖(配列番号62)と抗HER2 FA
B-Fc IGHG1重鎖(配列番号78の重鎖および配列番号31の軽鎖)との共有結
合により得られた。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、よって、プロテインGとの結合部位
を有さない1つの重鎖(抗HER2 scFv-Fc M428G/N434Aは、その
Fc部分中でプロテインG結合が排除され、scFvフォーマット中にさらなるプロテイ
ンG結合部位は存在しない、すなわちCH1ドメインは存在しない)と、プロテインGに
対する2つの結合部位を有する1つの重鎖(抗HER2 FAB-Fc IGHG1重鎖
は、IGHG1 Fc領域中で見出される自然のプロテインG結合部位を有し、そのCH
1ドメイン中に存在する第2プロテインG結合部位を有する)とを有すると期待された。
重要なことには、この特定の重鎖組み合わせは、1つの特異性、すなわちHER2に対す
る特異性だけを有するヘテロ二量体免疫グロブリンの生成をもたらした。
重鎖(配列番号78の重鎖および配列番号31の軽鎖)の共有的集合から得られ、トラス
ツズマブとして知られる市販の抗HER2抗体と同一であった(rhuMAbHER2、
huMAB4D5-8、商品名Herceptin(登録商標);米国特許第5,821
,337号)。
のヘテロ二量体免疫グロブリンを設計して、薬物動態分析において、同じ特異性を有する
ホモ二量体免疫グロブリンと直接比較ができるようにした。同じ特異性を有することによ
り、ヘテロ二量体免疫グロブリンと関連するホモ二量体免疫グロブリン対照とは、同様の
レベルの標的に関連する分解を有すると期待された。
示した。ヘテロ二量体免疫グロブリンは、およそ194±15時間(約8日)の血清半減
期を有したのに比較して、対照ホモ二量体免疫グロブリンについて249±58時間(約
10日)であった(図36)。
HER3は、乳癌および卵巣癌を含む様々なヒトのがんの腫瘍発生に関与する(Hsi
eh ACおよびMoasser MM(2007)Br J Cancer、97:4
53~457頁;Baselga JおよびSwain SM(2009)Nat Re
v Cancer、9(7):463~75頁)。いくつかの抗HER3抗体が記載され
、いくつかは、ヒト臨床試験で調べられている(MM-121抗体(Merrimack
Pharmaceuticals Inc.、PCTパンフレットWO08/1006
24)およびU3-1287またはAMG-888(U3 PharmaAG/Daii
chi Sankyo/Amgen、PCTパンフレットWO07/077028)。
一重特異性」抗HER3抗体よりも大きい治療的影響を有する可能性がある。腫瘍学にお
けるある特に魅力的な標的の組み合わせは、2つのHERファミリーメンバーを同時に標
的にすることである。増殖因子受容体のHERファミリーのうち、EGFRおよびHER
3、またはHER2およびHER3を、二重特異性抗体を用いて同時に標的にすることに
ついて、記載されている(Schaefer Gら(2011)Cancer Cell
、20(4):472~86頁;McDonagh CFら(2012)Mol Can
cer Ther.、11(3):582~93頁)。
R2およびHER3を同時に標的にする重鎖のヘテロ二量体を、本発明のプロテインA差
次的精製技術を用いて生成することについて調べた。重鎖ヘテロ二量体形成を改善するた
めに、HER2およびHER3を同時に標的にするヘテロ二量体免疫グロブリンもBEA
T(登録商標)技術を使用した。
体模倣の独特の概念に基づく重鎖ヘテロ二量体である(PCTパンフレットWO12/1
31555 Blein Sら)。BEATプラットフォームは、二重特異性抗体を設計
するための基礎単位として用いることができる新しいヘテロ二量体を創出するための、自
然に存在するホモまたはヘテロ二量体免疫グロブリンドメイン対間の界面交換に基づく。
この技術は、任意のタイプの抗原結合の土台に基づく二重特異性抗体の設計を可能にする
。scFv-FABフォーマットをここで用いて、抗原結合部位に対する共通軽鎖を開発
する必要なく二重特異性抗体を設計する。
CTパンフレットWO07/077028(Rothe Mら)において最初に報告され
た。この可変重鎖ドメインは、VH2サブクラスに属するのでプロテインAと結合しない
ので、VH3サブクラスに基づく別の抗HER3抗体を開発して、二重特異性ヘテロ二量
体免疫グロブリンを開発する場合のVH3ドメイン中のプロテインA排除の有用性を証明
した。
したようにスクリーニングした。ある好ましいscFv断片は、高い熱安定性を示し、親
和性成熟のためにさらに選択した(配列番号79)。ファージディスプレイを用いて抗体
を親和性成熟させる技術は、知られている(Benhar I(2007)Expert
Opin Biol Ther.、7(5):763~79頁)。多様性は、scFv
遺伝子配列内に、CDR-H1(Kabat残基:31および32)およびCDR-H2
(Kabat残基:52、53、56および58)中の同時のNNK多様化により導入し
、全てのその他のCDRは一定に保った。得られた親和性成熟ライブラリーは、2.5×
10e7の多様性を有し、ビオチン化抗原およびストレプトアビジン捕捉を用いる3回の
選択を行ったが、ここでは漸減量の抗原とともに非ビオチン化抗原との競合を用いた。1
つの好ましい親和性成熟scFv断片(配列番号80、配列番号81のVHドメイン、配
列番号82のVLドメイン)は、HER3に対してナノモル以下の親和性を有し(SPR
により測定、データは示さず)、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリンにフォーマット
するためにさらに選択した。
Kabatナンバリング、配列番号83)を用いてプロテインA結合をまず排除し、次い
で、FAB断片にフォーマットした(本明細書において抗HER3 FAB(N82aS
)と省略する)。配列番号84の重鎖および配列番号85の軽鎖を有する、得られた抗H
ER3 FAB(N82aS)断片を、次いで、実施例2.1に記載した抗HER2ホモ
二量体免疫グロブリン由来の上記の抗HER2 scFv断片を有する二重特異性BEA
T抗体の設計に用いた。
。これらは、本明細書において、BTA鎖およびBTB鎖という。BTAおよびBTB鎖
は、本明細書で用いる場合、抗原結合部位と、ヒトIgG1ヒンジ領域と、ヒトIgG1
またはIgG3アイソタイプを起源とするCH2ドメインと、ヒトIgG1またはIgG
3アイソタイプを起源とする改変CH3ドメインとを包含する。BTAおよびBTB鎖は
、適当であれば、プロテインAおよび/またはG結合を非対称的に排除できる。
CH1γ1領域と、γ1ヒンジ領域と、γ3 CH2領域と、γ3ベースのBTA CH
3ドメインとを包含した(配列番号85を有する同族軽鎖と集合した配列番号86の完全
重鎖配列、本明細書において抗HER3 FAB(N82aS)-BTA IGHG3重
鎖という)。γ3ベースのBTA CH3ドメインは、WO12/131555、既出に
配列番号75(CH3-BTアルファIGHG3ドメイン)として記載されている。
片と、CH1γ1領域と、γ1ヒンジ領域と、γ1 CH2領域と、γ1ベースのBTB
CH3ドメインとを包含した(配列番号87の完全重鎖配列、本明細書において抗HE
R2 scFv-BTB IGHG1重鎖という)。γ1ベースのBTB CH3ドメイ
ンは、WO12/131555、既出に配列番号14(置換F405Aを有するCH3-
BTベータドメイン)として記載されている。
体免疫グロブリンは、本明細書においてBEAT HER2/HER3という。
B(N82aS)-BTA IGHG3重鎖と抗HER2 scFv-BTB IGHG
1重鎖との共有結合により得られ、よって、プロテインAに対する結合部位がない1つの
重鎖(抗HER3 FAB(N82aS)-BTA IGHG3重鎖は、そのFc領域中
でプロテインA結合が排除され、その可変重鎖ドメイン中に存在するプロテインA結合部
位は、置換N82aSを用いて排除されている)と、プロテインAに対する2つの結合部
位を有する1つの重鎖(抗HER2 scFv-BTB IGHG1重鎖は、IGHG1
Fc領域中で見出される自然のプロテインA結合部位を有し、そのVH3ドメイン中に
存在する第2プロテインA結合部位を有した)とを有すると期待された。この特定の重鎖
組み合わせは、合計で2つのプロテインA結合部位を有する対象のBEAT HER2/
HER3とともに、2つのホモ二量体免疫グロブリン種(一方はプロテインAに対する結
合部位を有さず、第2の種は、合計で4つを有する)の生成をもたらした。
、3つ全ての分子を図37に示すようにプロテインA勾配クロマトグラフィーにより効率
的に分離することが可能になった(実施例3に記載したものと同じ方法)。
阻害できるかを決定するために、増殖アッセイの阻害を、方法の項に記載したように行っ
た。図38Aは、BEAT HER2/HER3が、用量依存的様式で、抗HER2およ
び抗HER3対照抗体(それぞれトラスツズマブおよびWO07/077028、既出に
記載される上記の抗HER3、データは示さず)またはそれらの組み合わせよりも大きい
程度でヘレグリン誘発細胞増殖を阻害したことを証明する。さらに、BEAT HER2
/HER3は、WO10/108127、既出に記載されるDL11f抗体、抗EGFR
および抗HER3二重特異性抗体よりも大きい程度でヘレグリン誘発細胞増殖を阻害した
(図38BおよびC)。
Claims (148)
- エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチド
を含む免疫グロブリンまたはその断片であって、
免疫グロブリン定常領域が、CH1領域、CH2領域およびCH3領域からなる群から選
択され、
免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインGとの結合を低
減させるまたは喪失させる改変を含み、
免疫グロブリン定常領域がCH2および/またはCH3領域であるならば、前記低減が、
未改変の免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して少なくとも30%である、
免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域が、ヒトIGHG由来である、請求項1に記載の免疫グロブリ
ンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域が、CH3領域を含む、請求項1または請求項2に記載の免疫
グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域が、CH2領域を含む、請求項1または請求項2に記載の免疫
グロブリンまたはその断片。 - (i)免疫グロブリン定常領域の改変が、251位、252位、253位、254位、
255位、311位、380位、382位、385位、387位、426位、428位、
433位、434位、435位、436位、437位および438位(EUナンバリング
システム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含むか、または
(ii)免疫グロブリン定常領域の改変が、251位、252位、253位、254位、
311位、380位、382位、426位、428位、434位、435位、436位お
よび438位(EUナンバリングシステム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸
置換を含むか、または
(iii)免疫グロブリン定常領域の改変が、252A、254M、380A、380M
、382A、382L、426M、428G、428S、428T、428V、433D
、434A、434G、434Sおよび438A(EUナンバリングシステム)からなる
群から選択されるアミノ酸置換を含む、
請求項1から4のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、250位(EUナンバリングシステム)にてアミノ
酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、250Q(EUナンバリングシステム)でない
、請求項5に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - アミノ酸置換が、428L(EUナンバリングシステム)でない、請求項5に記載の免
疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)252A/380A/382A/436A/438A、
254M/380M/382L/426M/428Gおよび
426M/428G/433D/434A
からなる群から選択されるアミノ酸置換(EUナンバリングシステム)、あるいは
(ii)428G、428S、428Tおよび428Vからなる群から選択されるアミノ
酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置にてさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、434Aもしくは434Sから選
択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置に
てさらなる置換とを含む(EUナンバリングシステム)、
請求項1から5のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換428Gと434位でのさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換434Aもしくは4
34Sと428位(EUナンバリングシステム)でのさらなる置換とを含む、請求項8に
記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、428Gおよび434Aまたは434S(EUナン
バリングシステム)から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項9に記載の免疫グロブリ
ンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインGとの
結合を、未改変の免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して少なくとも10%低減
する、請求項8から10のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域が、CH1領域を含む、請求項1から11のいずれか一項に記
載の免疫グロブリンまたはその断片。 - 改変が、免疫グロブリン定常領域のCH1領域中にあり、免疫グロブリンまたはその断
片とプロテインGとの結合を喪失させる、請求項12に記載の免疫グロブリンまたはその
断片。 - 免疫グロブリン定常領域が、ヒトIGHG由来である、請求項12または請求項13に
記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域が、改変CH1領域を含み、
(i)CH1領域が、IGHA1もしくはIGHM由来のCH1領域で置き換えられてい
るか、またはCH1ストランドGおよび一部のFGループが、IGHA1もしくはIGH
M由来のCH1ストランドGおよび一部のFGループで置き換えられているか、あるいは
(ii)改変が、209位、210位、213位および214位(EUナンバリングシス
テム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、
請求項14に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域が、改変CH1領域を含み、
(i)改変が、209位および213位(EUナンバリングシステム)にてアミノ酸置換
を含むか、または
(ii)改変が、
209P/210S、
213V/214Tおよび
209G/210N
からなる置換の群(EUナンバリングシステム)から選択されるアミノ酸置換を含む、
請求項15に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - (a)第1エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含
む第1ポリペプチドと、
(b)第2エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含む
第2ポリペプチドであって、免疫グロブリン定常領域が、CH2領域およびCH3領域か
らなる群から選択される第2ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第2ポリペプチドが、免疫グロブリン定常領域中に、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたは
その断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトFcRnに対する免疫グロブリン定常領域の結合
親和性を変化させ、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片が、免疫グロブリン定常領域中に改変を有さ
ない未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して、少なくとも
80%のFcRnとの結合を保持する、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 親和性試薬が、ヒトFcRnに対する免疫グロブリン定常領域中の結合部位と部分的ま
たは完全にオーバーラップする部位と結合する、請求項17に記載のヘテロ二量体免疫グ
ロブリンまたはその断片。 - 親和性試薬が、細菌の表面タンパク質である、請求項17または請求項18に記載のヘ
テロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 親和性試薬が、プロテインGである、請求項17、18または19に記載のヘテロ二量
体免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域が、ヒトIGHG由来である、請求項17から20のいずれか
一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)251位、252位、253位、254位、255位、311位、380位、38
2位、385位、387位、426位、428位、433位、434位、435位、43
6位、437位および438位(EUナンバリングシステム)からなる群から選択される
位置にてアミノ酸置換、または
(ii)251位、252位、253位、254位、311位、380位、382位、4
26位、428位、434位、435位、436位および438位(EUナンバリングシ
ステム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
(iii)252A、254M、380A、380M、382A、382L、426M、
428G、428S、428T、428V、433D、434A、434G、434Sお
よび438A(EUナンバリングシステム)からなる群から選択されるアミノ酸置換
を含む、請求項17から21のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたは
その断片。 - 第2ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、250位(EUナンバリングシ
ステム)にてアミノ酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、250Q(EUナンバリン
グシステム)でない、請求項22に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - アミノ酸置換が、428L(EUナンバリングシステム)でない、請求項22に記載の
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)252A/380A/382A/436A/438A、
254M/380M/382L/426M/428Gおよび
426M/428G/433D/434A
からなる置換の群から選択されるアミノ酸置換(EUナンバリングシステム)、あるいは
(ii)428G、428S、428Tおよび428Vからなる群から選択されるアミノ
酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置にてさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、434Aもしくは434Sから選
択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置に
てさらなる置換とを含む(EUナンバリングシステム)、
請求項17から22のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片
。 - 第2ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換428Gと434
位でのさらなる置換とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換
434Aもしくは434Sと428位(EUナンバリングシステム)でのさらなる置換と
を含む、請求項25に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換428Gおよび4
34Aまたは434S(EUナンバリングシステム)を含む、請求項26に記載のヘテロ
二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第1ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、CH1領域を含む、請求項17から2
7のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、1または複数のCH1領域をさらに含
む、請求項17から27のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその
断片。 - 第1ポリペプチドおよび/または第2ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、改変
CH1領域を含み、改変が、ヘテロ二量体免疫グロブリンとプロテインGとの結合を低減
させるまたは喪失させる、請求項28または請求項29に記載のヘテロ二量体免疫グロブ
リンまたはその断片。 - (i)免疫グロブリン定常領域が、ヒトIGHG由来であり、CH1領域の改変が、I
GHA1もしくはIGHM由来のCH1領域でのCH1領域の置き換えを含むか、または
CH1ストランドGおよび一部のFGループが、IGHA1もしくはIGHM由来のCH
1ストランドGおよび一部のFGループで置き換えられているか、あるいは
(ii)CH1領域の改変が、209位、210位、213位および214位(EUナン
バリングシステム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、
請求項30に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - CH1領域の改変が、
(i)209位および213位(EUナンバリングシステム)にてアミノ酸置換、または
(ii)209P/210S、
213V/214Tおよび
209G/210N
からなる置換の群(EUナンバリングシステム)から選択されるアミノ酸置換
を含む、請求項31に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - (i)免疫グロブリン定常領域の改変が、未改変の免疫グロブリンもしくはその断片ま
たは未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免疫グロブリン
もしくはその断片またはヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片のin vivo
半減期を増加させるか、あるいは
(ii)免疫グロブリン定常領域の改変が、未改変の免疫グロブリンもしくはその断片ま
たは未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免疫グロブリン
もしくはその断片またはヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片のヒトFcRnに
対する親和性を増加させる、
請求項1から16のいずれか一項に記載の免疫グロブリンもしくはその断片、または請求
項17から32のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、未改変の免疫グロブリンまたはその断片と比較して
、免疫グロブリンまたはその断片とヒトFcRnとの結合の少なくとも10%の保持をも
たらす、請求項1から16のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片、ある
いは免疫グロブリン定常領域の改変が、表面プラズモン共鳴により測定して、未改変のヘ
テロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と比較して、ヘテロ二量体免疫グロブリンまた
はその断片とヒトFcRnとの結合の少なくとも80%の保持をもたらす、請求項17か
ら32のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - エピトープ結合領域と免疫グロブリン定常領域とを含むポリペプチド
を含む免疫グロブリンまたはその断片であって、
免疫グロブリン定常領域が、
CH2領域およびCH3領域からなる群から選択され、免疫グロブリン定常領域が、免疫
グロブリンまたはその断片と親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含
み、
免疫グロブリン定常領域の改変が、ヒトFcRnに対する免疫グロブリン定常領域の結合
親和性を変化させ、
免疫グロブリンまたはその断片が、未改変の免疫グロブリンまたはその断片と比較して、
少なくとも80%のFcRnとの結合を保持する、
免疫グロブリンまたはその断片。 - 親和性試薬が、免疫グロブリン定常領域中のヒトFcRnに対する結合部位と部分的ま
たは完全にオーバーラップする部位と結合する、請求項35に記載の免疫グロブリンまた
はその断片。 - 親和性試薬が、細菌の表面タンパク質である、請求項35または請求項36に記載の免
疫グロブリンまたはその断片。 - 親和性試薬が、プロテインGである、請求項35、36または37に記載の免疫グロブ
リンまたはその断片。 - ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を精製する方法であって、
(i)免疫グロブリンの混合物から、1つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリン
またはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、免疫グロブリン定常領域のC
H1および/またはCH2および/またはCH3領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二
量体免疫グロブリンまたはその断片とプロテインGとの結合を低減させるまたは喪失させ
るステップと、
(ii)免疫グロブリンの混合物をプロテインGに供するステップと、
(iii)ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインGから溶出するステ
ップと
を含む方法。 - 免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその断片の精製のための親和性クロマトグラ
フィーの方法であって、
(i)CH1および/またはCH2および/またはCH3領域中で重鎖の一方を改変して
、プロテインGとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
(ii)両方の重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
(iii)同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテイン
Gに供するステップと、
(iv)重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインGから溶出するステップと
を含む方法。 - 少なくとも1つのCH1領域と1つのCH2および/またはCH3領域とを含む免疫グ
ロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの
方法であって、
(i)CH2および/またはCH3領域中で重鎖の一方を改変して、プロテインGとの結
合を低減させるまたは喪失させるステップと、
(iia)ヘテロ二量体内に1つだけCH1領域が存在するならば、前記CH1領域が、
プロテインGとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記CH1領域が
、プロテインGとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは
(iib)ヘテロ二量体内に2つ以上のCH1領域が存在するならば、1つを除く全ての
CH1領域が、プロテインGとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、
未改変のCH1領域が、プロテインGとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、
または全てのCH1領域が、プロテインGとの結合を低減させるもしくは喪失させるよう
に改変されるステップと、
(iii)重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
(iv)同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインG
に供するステップと、
(v)重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインGから溶出するステップと
を含む方法。 - 改変重鎖が、ヒトIGHG由来の改変免疫グロブリン定常領域を含む、請求項39、4
0または41のいずれか一項に記載の方法。 - 改変免疫グロブリン定常領域が、CH3領域を含む、請求項42に記載の方法。
- 改変免疫グロブリン定常領域が、CH2領域を含む、請求項42に記載の方法。
- 免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)251位、252位、253位、254位、255位、311位、380位、38
2位、385位、387位、426位、428位、433位、434位、435位、43
6位、437位および438位(EUナンバリングシステム)からなる群から選択される
位置にてアミノ酸置換、または
(ii)251位、252位、253位、254位、311位、380位、382位、4
26位、428位、434位、435位、436位および438位(EUナンバリングシ
ステム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
(iii)252A、254M、380A、380M、382A、382L、426M、
428G、428S、428T、428V、433D、434A、434G、434Sお
よび438A(EUナンバリングシステム)からなる群から選択されるアミノ酸置換
を含む、請求項42、43または44のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、250位(EUナンバリングシステム)にてアミノ
酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、250Q(EUナンバリングシステム)でない
、請求項45のいずれか一項に記載の方法。 - アミノ酸置換が、428L(EUナンバリングシステム)でない、請求項45に記載の
方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)252A/380A/382A/436A/438A、
254M/380M/382L/426M/428Gおよび
426M/428G/433D/434A
からなる置換の群から選択されるアミノ酸置換(EUナンバリングシステム)、あるいは
(ii)428G、428S、428Tおよび428Vからなる群から選択されるアミノ
酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置にてさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、434Aもしくは434Sから選
択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置に
てさらなる置換とを含む(EUナンバリングシステム)、
請求項42から45のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換428Gと434位でのさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換434Aもしくは4
34Sと428位(EUナンバリングシステム)でのさらなる置換とを含む、請求項48
に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、428Gおよび434Aまたは434S(EUナン
バリングシステム)から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項49に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域が、CH1領域を含む、請求項42から50のいずれか一項に
記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域のCH1領域中の改変が、免疫グロブリンまたはその断片とプ
ロテインGとの結合を喪失させる、請求項51に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域が、
(i)改変CH1領域を含むIGHG由来の免疫グロブリン定常領域であって、CH1領
域が、IGHA1もしくはIGHM由来のCH1領域で置き換えられているか、またはC
H1ストランドGおよび一部のFGループが、IGHA1もしくはIGHM由来のCH1
ストランドGおよび一部のFGループで置き換えられている免疫グロブリン定常領域、あ
るいは
(ii)改変CH1領域であって、改変が、209位、210位、213位および214
位(EUナンバリングシステム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む
改変CH1領域
を含む、請求項51または請求項52に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域が、改変CH1領域を含み、改変が、
(i)209位および213位(EUナンバリングシステム)にてアミノ酸置換、または
(ii)209P/210S、
213V/214Tおよび
209G/210N
からなる置換の群(EUナンバリングシステム)から選択されるアミノ酸置換
を含む、請求項53に記載の方法。 - VH3領域を少なくとも有するエピトープ結合領域を含むポリペプチドを含む免疫グロ
ブリンまたはその断片であって、
VH3領域が、免疫グロブリンまたはその断片とプロテインAとの結合を低減させるまた
は喪失させる改変を含む、免疫グロブリンまたはその断片。 - ポリペプチドが、VH3領域を少なくとも有する1または複数のさらなるエピトープ結
合領域を含む、請求項55に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - VH3領域の改変が、
(i)65位にてアミノ酸置換ならびに/もしくは57A、57E、65S、66Q、6
8V、81E、82aSおよび組み合わせ19G/57A/59A(Kabatナンバリ
ング)からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
(ii)65S、81Eおよび82aS(Kabatナンバリング)からなる群から選択
されるアミノ酸置換、または
(iii)アミノ酸置換65S(Kabatナンバリング)
を含む、請求項55または56に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - ポリペプチドが、IGHG1、IGHG2およびIGHG4から選択されるヒトIGH
GのCH2および/またはCH3領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域をさらに
含む、請求項55から57のいずれか一項に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - (i)免疫グロブリン定常領域が、ヒトIGHG3由来のCH3領域で置き換えられて
いるCH3領域を含むか、または
(ii)免疫グロブリン定常領域が、アミノ酸置換435R(EUナンバリングシステム
)を含むCH3領域を含むか、または
(iii)免疫グロブリン定常領域が、アミノ酸置換435Rおよび436F(EUナン
バリングシステム)を含むCH3領域を含む、
請求項58に記載の免疫グロブリンまたはその断片。 - (a)第1エピトープと結合するエピトープ結合領域を含む第1ポリペプチドと、
(b)第2エピトープと結合するVH3領域を少なくとも有するエピトープ結合領域を含
む第2ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第2ポリペプチドのVH3領域が、ヘテロ二量体免疫グロブリンとプロテインAとの結合
を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - (a)プロテインAと結合し、第1エピトープと結合するエピトープ結合領域と免疫グ
ロブリン定常領域とを含む第1ポリペプチドと、
(b)プロテインAと結合しないかまたはプロテインAとの結合が低減され、第2エピト
ープと結合するVH3領域を少なくとも有するエピトープ結合領域と免疫グロブリン定常
領域とを含む第2ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第2ポリペプチドのVH3領域が、第2ポリペプチドとプロテインAとの結合を低減させ
るまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドのVH3領域が、VH3領域を少なくとも有する1または複数のさら
なるエピトープ結合領域を含む、請求項60または請求項61に記載のヘテロ二量体免疫
グロブリンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドのVH3領域の改変が、
(i)65位にてアミノ酸置換ならびに/もしくは57A、57E、65S、66Q、6
8V、81E、82aSおよび組み合わせ19G/57A/59A(Kabatナンバリ
ング)からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
(ii)65S、81Eおよび82aS(Kabatナンバリング)からなる群から選択
されるVH3アミノ酸置換、または
(iii)アミノ酸置換65S(Kabatナンバリング)
を含む、請求項60、61または62に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断
片。 - 第2ポリペプチドが、IGHG1、IGHG2およびIGHG4から選択されるヒトI
GHGのCH2および/またはCH3領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域を含
む、請求項60から63のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその
断片。 - 第2ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、
(i)ヒトIGHG3由来のCH3領域で置き換えられているCH3領域、または
(ii)アミノ酸置換435R(EUナンバリングシステム)を含むCH3領域、または
(iii)アミノ酸置換435Rおよび436F(EUナンバリングシステム)を含むC
H3領域
を含む、請求項64に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - (i)改変が、未改変の免疫グロブリンもしくはその断片または未改変のヘテロ二量体
免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免疫グロブリンもしくはその断片またはヘ
テロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片のin vivo半減期を増加させるか、あ
るいは
(ii)改変が、未改変の免疫グロブリンもしくはその断片または未改変のヘテロ二量体
免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免疫グロブリンもしくはその断片またはヘ
テロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片のヒトFcRnに対する親和性を増加させる
か、あるいは
(iii)改変が、表面プラズモン共鳴により測定して、未改変の免疫グロブリンもしく
はその断片または未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片と比較して、免
疫グロブリンもしくはその断片またはヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片とヒ
トFcRnとの結合の少なくとも10%の保持をもたらす、
請求項58から59のいずれか一項に記載の免疫グロブリンもしくはその断片、または請
求項64から65のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンもしくはその断片
。 - VH3領域を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片を精製する方法であって
、
(i)免疫グロブリンの混合物から、1つの改変重鎖を含むヘテロ二量体免疫グロブリン
またはその断片を単離するステップであって、改変重鎖が、VH3領域中またはVH3領
域および免疫グロブリン定常領域中に改変を含み、改変が、ヘテロ二量体免疫グロブリン
またはその断片とプロテインAとの結合を低減させるまたは喪失させるステップと、
(ii)免疫グロブリンの混合物をプロテインAに供するステップと、
(iii)ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片をプロテインAから溶出するステ
ップと
を含む方法。 - 少なくとも1つのVH3領域が存在する免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体またはその
断片の精製のための親和性クロマトグラフィーの方法であって、
(i)重鎖の一方を改変して、プロテインAとの結合を低減させるまたは喪失させるステ
ップと、
(iia)ヘテロ二量体内に1つだけVH3領域が存在するならば、前記VH3領域が、
プロテインAとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、または前記VH3領域が
、プロテインAとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変されるか、あるいは
(iib)ヘテロ二量体内に2つ以上のVH3領域が存在するならば、1つを除く全ての
VH3領域が、プロテインAとの結合を低減させるもしくは喪失させるように改変され、
未改変のVH3領域が、プロテインAとの結合を保持する未改変の重鎖の一部であるか、
または全てのVH3領域が、プロテインAとの結合を低減させるもしくは喪失させるよう
に改変されステップと、
(iii)2つの重鎖を別々または同時に発現させるステップと、
(iv)同時発現させた重鎖または予め集合させた別々に発現させた重鎖をプロテインA
に供するステップと、
(v)重鎖のヘテロ二量体またはその断片をプロテインAから溶出するステップと
を含む方法。 - VH3改変が、
(i)65位にてアミノ酸置換ならびに/もしくは57A、57E、65S、66Q、6
8V、81E、82aSおよび組み合わせ19G/57A/59A(Kabatナンバリ
ング)からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
(ii)65S、81Eおよび82aS(Kabatナンバリング)からなる群から選択
されるアミノ酸置換、または
(iii)アミノ酸置換65S(Kabatナンバリング)
を含む、請求項67または請求項68に記載の方法。 - 改変重鎖が、IGHG1、IGHG2およびIGHG4から選択されるヒトIGHGの
CH2および/またはCH3領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域を含む、請求
項67から69のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域が、
(i)ヒトIGHG3由来のCH3領域で置き換えられているCH3領域、または
(ii)アミノ酸置換435R(EUナンバリングシステム)を含むCH3領域、または
(iii)アミノ酸置換435Rおよび436F(EUナンバリングシステム)を含むC
H3領域
を含む、請求項70に記載の方法。 - (a)第1エピトープと結合するエピトープ結合領域と、CH1および/またはCH2
および/またはCH3領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域とを含む第1ポリペ
プチドと、
(b)VH3を少なくとも含む第2エピトープと結合するエピトープ結合領域ならびに/
またはCH2および/もしくはCH3領域を少なくとも含む免疫グロブリン定常領域を含
む第2ポリペプチドと
を含むヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片であって、
第1ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第1親和性試薬との
結合を低減させるまたは喪失させる改変を含み、
第2ポリペプチドが、ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と第2親和性試薬との
結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む、
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第1親和性試薬が、プロテインGである、請求項72に記載のヘテロ二量体免疫グロブ
リンまたはその断片。 - 第2親和性試薬が、プロテインAである、請求項72に記載のヘテロ二量体免疫グロブ
リンまたはその断片。 - 第1ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域が、ヒトIGHG由来であり、第2ポリペ
プチドが、IGHG1、IGHG2またはIGHG4から選択される、請求項72に記載
のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第1ポリペプチドの改変が、免疫グロブリン定常領域中の改変を含む、請求項72から
75のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)251位、252位、253位、254位、255位、311位、380位、38
2位、385位、387位、426位、428位、433位、434位、435位、43
6位、437位および438位(EUナンバリングシステム)からなる群から選択される
位置にてアミノ酸置換、または
(ii)251位、252位、253位、254位、311位、380位、382位、4
26位、428位、434位、435位、436位および438位(EUナンバリングシ
ステム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
(iii)252A、254M、380A、380M、382A、382L、426M、
428G、428S、428T、428V、433D、434A、434G、434Sお
よび438A(EUナンバリングシステム)からなる群から選択されるアミノ酸置換
を含む、請求項76に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域中の改変が、250位(EUナンバリングシステム)にてアミ
ノ酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、250Q(EUナンバリングシステム)でな
い、請求項76または請求項77に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - アミノ酸置換が、428L(EUナンバリングシステム)でない、請求項77に記載の
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域中の改変が、
(i)252A/380A/382A/436A/438A、
254M/380M/382L/426M/428Gおよび
426M/428G/433D/434A
からなる群から選択されるアミノ酸置換(EUナンバリングシステム)、あるいは
(ii)428G、428S、428Tおよび428Vからなる群から選択されるアミノ
酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置にてさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、434Aもしくは434Sから選
択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置に
てさらなる置換とを含む(EUナンバリングシステム)、
請求項76または請求項77に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換428Gと434位でのさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換434Aもしくは4
34Sと428位(EUナンバリングシステム)でのさらなる置換とを含む、請求項80
に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、428Gおよび434Aまたは434S(EUナン
バリングシステム)から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項81に記載のヘテロ二量
体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第1ポリペプチドが、CH1領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、請求項72か
ら82のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 免疫グロブリン定常領域が、改変CH1領域を含む、請求項83に記載のヘテロ二量体
免疫グロブリンまたはその断片。 - CH1領域が、ヒトIGHG由来であり、IGHA1もしくはIGHM由来のCH1領
域で置き換えられているか、またはCH1が、IGHG由来であり、ストランドGおよび
一部のFGループが、IGHA1もしくはIGHM由来のCH1ストランドGおよび一部
のFGループで置き換えられている、請求項83に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンま
たはその断片。 - CH1領域の改変が、209位、210位、213位および214位(EUナンバリン
グシステム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、請求項84に記載
のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - CH1領域の改変が、
(i)209位および213位(EUナンバリングシステム)にてアミノ酸置換、または
(ii)209P/210S、
213V/214Tおよび
209G/210N
からなる置換の群(EUナンバリングシステム)から選択されるアミノ酸置換
を含む、請求項86に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片とプロテインGとの結合の前記低減が、未
改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して100%までである
、請求項72から87のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断
片。 - 第2ポリペプチドが、IGHG1、IGHG2またはIGHG4から選択されるCH3
領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む、請求項74から88のいずれか一項に記載の
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - (i)CH3領域が、ヒトIGHG3由来のCH3領域で置き換えられているか、また
は
(ii)免疫グロブリン定常領域が、アミノ酸置換435R(EUナンバリングシステム
)を含むCH3領域を含むか、または
(iii)免疫グロブリン定常領域が、アミノ酸置換435Rおよび436F(EUナン
バリングシステム)を含むCH3領域を含む、
請求項89に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドが、VH3領域を少なくとも有する1または複数のさらなるエピトー
プ結合領域を含む、請求項72から90のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブ
リンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドの改変が、VH3領域中の改変を含む、請求項72から91のいずれ
か一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - VH3領域の改変が、
(i)65位にてアミノ酸置換ならびに/もしくは57A、57E、65S、66Q、6
8V、81E、82aSおよび組み合わせ19G/57A/59A(Kabatナンバリ
ング)からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
(ii)65S、81Eおよび82aS(Kabatナンバリング)からなる群から選択
されるアミノ酸置換、または
(iii)アミノ酸置換65S(Kabatナンバリング)
を含む、請求項92に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片とプロテインAとの結合の前記低減が、未
改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の結合と比較して100%までである
、請求項89から93のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断
片。 - (i)改変が、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と比較して、ヘテ
ロ二量体免疫グロブリンまたはその断片のin vivo半減期を増加させるか、または
(ii)改変が、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と比較して、ヒト
FcRnに対するヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片の親和性を増加させるか、
または
(iii)第1および/または第2ポリペプチド中の改変が、表面プラズモン共鳴により
測定して、未改変のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片と比較して、ヘテロ二量
体免疫グロブリンまたはその断片とヒトFcRnとの結合の少なくとも10%の保持をも
たらす、
請求項72から94のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片
。 - 重鎖のヘテロ二量体の差次的精製の方法であって、
(i)重鎖の混合物から、第1親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を
含む第1重鎖と、第2親和性試薬との結合を低減させるまたは喪失させる改変を含む第2
重鎖とを含む重鎖のヘテロ二量体を単離するステップと、
(ii)重鎖の混合物を、第1親和性試薬を含む第1カラムに供するステップと、
(iii)重鎖のヘテロ二量体を第1カラムから溶出するステップと、
(iv)第1カラムからの溶出物を、第2親和性試薬を含む第2カラムに供するステップ
と、
(v)重鎖のヘテロ二量体を第2カラムから溶出するステップと
を含む方法。 - 第1および第2親和性試薬が、細菌の表面タンパク質に由来する、請求項96に記載の
方法。 - 第1親和性試薬が、プロテインAであり、第2親和性試薬が、プロテインGであるか、
または第1親和性試薬が、プロテインGであり、第2親和性試薬が、プロテインAである
、請求項96または請求項97に記載の方法。 - 第1重鎖の改変が、ヒトIGHG由来の改変免疫グロブリン定常領域を含む、請求項9
6に記載の方法。 - 改変免疫グロブリン定常領域が、IGHG1、IGHG2およびIGHG4からなる群
から選択される、請求項99に記載の方法。 - 改変免疫グロブリン定常領域が、CH3領域を含む、請求項100に記載の方法。
- 改変免疫グロブリン定常領域が、CH2領域を含む、請求項100に記載の方法。
- 免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)251位、252位、253位、254位、255位、311位、380位、38
2位、385位、387位、426位、428位、433位、434位、435位、43
6位、437位および438位(EUナンバリングシステム)からなる群から選択される
位置にてアミノ酸置換、または
(ii)251位、252位、253位、254位、311位、380位、382位、4
26位、428位、434位、435位、436位および438位(EUナンバリングシ
ステム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
(iii)252A、254M、380A、380M、382A、382L、426M、
428G、428S、428T、428V、433D、434A、434G、434Sお
よび438A(EUナンバリングシステム)からなる群から選択されるアミノ酸置換
を含む、請求項99から102のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、250位(EUナンバリングシステム)にてアミノ
酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、250Q(EUナンバリングシステム)でない
、請求項103に記載の方法。 - アミノ酸置換が、428L(EUナンバリングシステム)でない、請求項103に記載
の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)252A/380A/382A/436A/438A、
254M/380M/382L/426M/428Gおよび
426M/428G/433D/434A
からなる置換の群から選択されるアミノ酸置換(EUナンバリングシステム)、あるいは
(ii)428G、428S、428Tおよび428Vからなる群から選択されるアミノ
酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置にてさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、434Aもしくは434Sから選
択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置に
てさらなる置換とを含む(EUナンバリングシステム)、
請求項99から103のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換428Gと434位でのさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換434Aまたは43
4Sと428位(EUナンバリングシステム)でのさらなる置換とを含む、請求項106
に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、428Gおよび434Aまたは434S(EUナン
バリングシステム)から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項107に記載の方法。 - 改変免疫グロブリン定常領域が、CH1領域を含む、請求項100に記載の方法。
- 改変が、免疫グロブリン定常領域のCH1領域中にあり、免疫グロブリンまたはその断
片とプロテインGとの結合を喪失させる、請求項109に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域が、改変CH1領域を含み、(i)CH1領域が、IGHA1
もしくはIGHM由来のCH1領域で置き換えられているか、またはCH1ストランドG
および一部のFGループが、IGHA1もしくはIGHM由来のCH1ストランドGおよ
び一部のFGループで置き換えられているか、あるいは
(ii)改変が、209位、210位、213位および214位(EUナンバリングシス
テム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、
請求項109または請求項110に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域が、改変CH1領域を含み、改変が、
(i)209位および213位(EUナンバリングシステム)にてアミノ酸置換、または
(ii)209P/210S、
213V/214Tおよび
209G/210N
からなる置換の群(EUナンバリングシステム)から選択されるアミノ酸置換
を含む、請求項111に記載の方法。 - 第2重鎖の改変が、ヒトIGHG由来の改変免疫グロブリン定常領域を含む、請求項9
6に記載の方法。 - 改変免疫グロブリン定常領域が、IGHG1、IGHG2およびIGHG4から選択さ
れるヒトIGHGのCH2および/またはCH3領域を少なくとも含む、請求項113に
記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域が、
(i)ヒトIGHG3由来のCH3領域で置き換えられているCH3領域、または
(ii)アミノ酸置換435R(EUナンバリングシステム)を含むCH3領域、または
(iii)アミノ酸置換435Rおよび436F(EUナンバリングシステム)を含むC
H3領域
を含む、請求項114に記載の方法。 - 第2重鎖の改変が、改変VH3領域を含む、請求項96に記載の方法。
- VH3改変が、
(i)65位にてアミノ酸置換ならびに/もしくは57A、57E、65S、66Q、6
8V、81E、82aSおよび組み合わせ19G/57A/59A(Kabatナンバリ
ング)からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
(ii)65S、81Eおよび82aS(Kabatナンバリング)からなる群から選択
されるアミノ酸置換、または
(iii)アミノ酸置換65S(Kabatナンバリング)
を含む、請求項116に記載の方法。 - (i)重鎖のヘテロ二量体が、95%より大きい純度まで精製されるか、または
(ii)重鎖のヘテロ二量体が、98%より大きい純度まで精製される、
請求項96から117のいずれか一項に記載の方法。 - 重鎖の1または複数が、軽鎖をさらに含む、請求項96から118のいずれか一項に記
載の方法。 - 対象の免疫グロブリンまたはその断片を免疫グロブリンの混合物から単離する方法であ
って、
(i)対象の免疫グロブリンまたはその断片を免疫グロブリンの混合物から単離するステ
ップであって、対象の免疫グロブリンまたはその断片が、プロテインAおよび/またはプ
ロテインGに対する結合部位を全て喪失しているステップと、
(ii)第1ステップにおける免疫グロブリンの混合物をプロテインAまたはプロテイン
Gに供するステップと、
(iii)ステップ(ii)からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収
するステップと、場合によって、
(iv)第2ステップにおけるステップ(iii)からの未結合の対象の免疫グロブリン
またはその断片をプロテインAまたはプロテインGに供するステップと、
(v)ステップ(iv)からの未結合の対象の免疫グロブリンまたはその断片を回収する
ステップと
を含み、
ステップ(ii)において、免疫グロブリンの混合物をプロテインAに供し、ステップ(
iv)において、免疫グロブリンの混合物をプロテインGに供するか、または
ステップ(ii)において、免疫グロブリンの混合物をプロテインGに供し、ステップ(
iv)において、免疫グロブリンの混合物をプロテインAに供する、
方法。 - 対象の免疫グロブリンまたはその断片中のプロテインAに対する結合部位が、VH3お
よび免疫グロブリン定常領域中に位置する、請求項120に記載の方法。 - 対象の免疫グロブリンまたはその断片中のプロテインGに対する結合部位が、免疫グロ
ブリン定常領域中に位置する、請求項120に記載の方法。 - 対象の免疫グロブリンもしくはその断片が、ホモ二量体免疫グロブリンであるか、また
は対象の免疫グロブリンもしくはその断片が、ヘテロ二量体免疫グロブリンである、請求
項120から122のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫グロブリンの混合物が、対象の免疫グロブリンまたはその断片を投与された患者ま
たは動物からの血清を含むかまたは該血清に由来する、請求項120から123のいずれ
か一項に記載の方法。 - 対象の免疫グロブリンまたはその断片が、IGHG1、IGHG2またはIGHG4か
ら選択されるヒトIGHGの改変免疫グロブリン定常領域を含む、請求項120から12
4のいずれか一項に記載の方法。 - 改変免疫グロブリン定常領域が、CH3領域を含む、請求項125に記載の方法。
- 改変免疫グロブリン定常領域が、CH2領域を含む、請求項125に記載の方法。
- 免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)251位、252位、253位、254位、255位、311位、380位、38
2位、385位、387位、426位、428位、433位、434位、435位、43
6位、437位および438位(EUナンバリングシステム)からなる群から選択される
位置にてアミノ酸置換、または
(ii)251位、252位、253位、254位、311位、380位、382位、4
26位、428位、434位、435位、436位および438位(EUナンバリングシ
ステム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換、または
(iii)252A、254M、380A、380M、382A、382L、426M、
428G、428S、428T、428V、433D、434A、434G、434Sお
よび438A(EUナンバリングシステム)からなる群から選択されるアミノ酸置換
を含む、請求項125から127のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、250位(EUナンバリングシステム)にてアミノ
酸置換をさらに含み、該アミノ酸置換が、250Q(EUナンバリングシステム)でない
、請求項125から128のいずれか一項に記載の方法。 - アミノ酸置換が、428L(EUナンバリングシステム)でない、請求項128に記載
の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、
(i)252A/380A/382A/436A/438A、
254M/380M/382L/426M/428Gおよび
426M/428G/433D/434A
からなる置換の群から選択されるアミノ酸置換(EUナンバリングシステム)、あるいは
(ii)428G、428S、428Tおよび428Vからなる群から選択されるアミノ
酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置にてさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、434Aもしくは434Sから選
択されるアミノ酸置換と、そのCH2領域および/もしくはCH3領域内の任意の位置に
てさらなる置換とを含む(EUナンバリングシステム)、
請求項125から128のいずれか一項に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換428Gと434位でのさらなる置換
とを含むか、または免疫グロブリン定常領域の改変が、アミノ酸置換434Aまたは43
4Sと428位(EUナンバリングシステム)でのさらなる置換とを含む、請求項131
に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域の改変が、428Gおよび434Aまたは434S(EUナン
バリングシステム)から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項132に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域が、CH1領域を含む、請求項125に記載の方法。
- 免疫グロブリン定常領域が、改変CH1領域を含み、
(i)CH1領域が、IGHA1もしくはIGHM由来のCH1領域で置き換えられてい
るか、またはCH1ストランドGおよび一部のFGループが、IGHA1もしくはIGH
M由来のCH1ストランドGおよび一部のFGループで置き換えられているか、あるいは
(ii)改変が、209位、210位、213位および214位(EUナンバリングシス
テム)からなる群から選択される位置にてアミノ酸置換を含む、
請求項134に記載の方法。 - 免疫グロブリン定常領域が、改変CH1領域を含み、
(i)改変が、209位および213位(EUナンバリングシステム)にてアミノ酸置換
を含むか、または
(ii)改変が、
209P/210S、
213V/214Tおよび
209G/210N
からなる置換の群(EUナンバリングシステム)から選択されるアミノ酸置換を含む、
請求項135に記載の方法。 - 対象の免疫グロブリンまたはその断片が、
(i)改変を含む改変免疫グロブリン定常領域であって、CH3領域が、ヒトIGHG3
由来のCH3領域で置き換えられている改変免疫グロブリン定常領域、または
(ii)435R(EUナンバリングシステム)の位置にてアミノ酸置換を含む改変CH
3領域を含む免疫グロブリン定常領域、または
(iii)435Rおよび436F(EUナンバリングシステム)の位置にてアミノ酸置
換を含む改変CH3領域を含む免疫グロブリン定常領域
を含む、請求項125に記載の方法。 - 対象の免疫グロブリンまたはその断片が、VH3領域をさらに含む、請求項120から
124のいずれか一項に記載の方法。 - VH3領域が、
(i)65位にてアミノ酸置換ならびに/もしくは57A、57E、65S、66Q、6
8V、81E、82aSおよび組み合わせ19G/57A/59A(Kabatナンバリ
ング)からなる群から選択されるアミノ酸置換、または
(ii)65S、81Eおよび82aS(Kabatナンバリング)からなる群から選択
されるアミノ酸置換、または
(iii)アミノ酸置換65S(Kabatナンバリング)
を含む、請求項138に記載の方法。 - 第2ポリペプチドが、第2エピトープと結合するエピトープ結合領域を含み、第2エピ
トープが、HER3である、請求項60、61または72のいずれか一項に記載のヘテロ
二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - エピトープ結合領域が、配列番号88のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号
89のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号90のアミノ酸配列を含む重鎖CD
R3とを含む、請求項140に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - エピトープ結合領域が、配列番号95のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を含む、
請求項140または請求項141に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - エピトープ結合領域が、配列番号82のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列をさらに
含む、請求項142に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - エピトープ結合領域が、配列番号83のアミノ酸配列を含むscFvを含む、請求項1
43に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - エピトープ結合領域が、配列番号84のアミノ酸配列を含む重鎖部分を含む、請求項1
43に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドが、配列番号86の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項140に記載の
ヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第2ポリペプチドが、配列番号86の重鎖アミノ酸配列を含み、ヘテロ二量体免疫グロ
ブリンまたはその断片が、配列番号85の軽鎖アミノ酸配列を含む第3ポリペプチドをさ
らに含む、請求項140に記載のヘテロ二量体免疫グロブリンまたはその断片。 - 第1ポリペプチドが、HER2と結合し、配列番号87のアミノ酸配列を含み、ヘテロ
二量体免疫グロブリンまたは断片が、第2ポリペプチドを含み、第3ポリペプチドをさら
に含み、第2および第3ポリペプチドが、HER3と結合し、配列番号86および85の
アミノ酸配列を含む、請求項60、61または72のいずれか一項に記載のヘテロ二量体
免疫グロブリン。
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EP3401337A1 (en) * | 2012-09-25 | 2018-11-14 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Purification of hetero-dimeric immunoglobulins |
CN105143262A (zh) | 2013-04-29 | 2015-12-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 结合人fcrn的修饰的抗体和使用方法 |
WO2015033223A2 (en) * | 2013-09-03 | 2015-03-12 | Novimmune S.A. | Readily isolated bispecific binding molecules with native format having mutated constant regions |
KR20160044060A (ko) | 2013-10-11 | 2016-04-22 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체 |
NZ720161A (en) * | 2013-11-04 | 2022-07-29 | Ichnos Sciences SA | Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins |
KR20160104636A (ko) * | 2014-01-15 | 2016-09-05 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 단백질 A-결합이 개선된 Fc-영역 변이체 |
US9822186B2 (en) | 2014-03-28 | 2017-11-21 | Xencor, Inc. | Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3 |
AR101262A1 (es) * | 2014-07-26 | 2016-12-07 | Regeneron Pharma | Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos |
EP3174897B1 (en) * | 2014-07-29 | 2020-02-12 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific antibodies |
MA40894A (fr) * | 2014-11-04 | 2017-09-12 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production |
US11773166B2 (en) | 2014-11-04 | 2023-10-03 | Ichnos Sciences SA | CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production |
TN2017000222A1 (en) | 2014-11-26 | 2018-10-19 | Xencor Inc | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38 |
WO2016087416A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Multispecific antibodies |
IL301140A (en) * | 2015-10-25 | 2023-05-01 | The Usa As Represented By The Sec Dep Of Health And Human Services | Trispecific and/or terrivalent binding proteins for the prevention or treatment of HIV infection |
GB201602156D0 (en) * | 2016-02-05 | 2016-03-23 | Jones Philip C And Boku University Of Natural Resources And Life Sciences | Heterodimers and purification thereof |
DK3443006T5 (da) | 2016-04-13 | 2023-11-06 | Sanofi Sa | Trispecifikke og/eller trivalente bindingsproteiner |
WO2017180913A2 (en) * | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Sanofi | Trispecific and/or trivalent binding proteins |
JP6675017B2 (ja) * | 2016-05-02 | 2020-04-01 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | コントースボディ−単鎖標的結合物質 |
AU2017336867B2 (en) * | 2016-09-29 | 2024-03-14 | Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | Heterodimeric immunoglobulin constructs and preparation methods thereof |
EA201990894A9 (ru) | 2016-11-18 | 2019-11-27 | Анти-pd-1/анти-her2 гетеродимерное биспецифическое антитело со структурой природного антитела и способ его получения | |
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WO2019183334A1 (en) | 2018-03-21 | 2019-09-26 | Waters Technologies Corporation | Non-antibody high-affinity-based sample preparation, sorbents, devices and methods |
WO2019200022A1 (en) | 2018-04-11 | 2019-10-17 | Inhibrx, Inc. | Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and related methods and uses |
FR3080621B1 (fr) * | 2018-04-26 | 2022-12-09 | Univ Limoges | Nouvelle classe d'immunoglobuline recombinante de type g : igg5, codee par le pseudo-gene gamma humain de chaine lourde |
CA3104390A1 (en) | 2018-06-22 | 2019-12-26 | Genmab A/S | Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies |
CN112789294A (zh) | 2018-07-24 | 2021-05-11 | 印希比股份有限公司 | 含有受限cd3结合结构域和受体结合区的多特异性多肽构建体及其使用方法 |
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CN113166262A (zh) | 2018-10-11 | 2021-07-23 | 英伊布里克斯公司 | Pd-1单结构域抗体及其治疗组合物 |
EP3902825A1 (en) | 2018-12-24 | 2021-11-03 | Sanofi | Pseudofab-based multispecific binding proteins |
US11613576B2 (en) | 2019-04-09 | 2023-03-28 | Sanofi | Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof |
AU2020414489A1 (en) * | 2019-12-26 | 2022-07-14 | Abl Bio Inc. | Method for purifying biologically active peptide by using protein a affinity chromatography |
CA3168832A1 (en) | 2020-01-29 | 2021-08-05 | Inhibrx, Inc. | Cd28 single domain antibodies and multivalent and multispecific constructs thereof |
MX2023004054A (es) | 2020-10-07 | 2023-06-29 | Dren Bio Inc | Anticuerpos anti-dectina 1 y metodos de uso de los mismos. |
WO2022266221A1 (en) | 2021-06-16 | 2022-12-22 | Alector Llc | Monovalent anti-mertk antibodies and methods of use thereof |
WO2022266223A1 (en) | 2021-06-16 | 2022-12-22 | Alector Llc | Bispecific anti-mertk and anti-pdl1 antibodies and methods of use thereof |
WO2023240109A1 (en) | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multispecific molecules for modulating t-cell activity, and uses thereof |
TW202405020A (zh) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | 美商阿列克特有限責任公司 | 轉鐵蛋白受體抗原結合域及其用途 |
WO2024026471A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Alector Llc | Cd98hc antigen-binding domains and uses therefor |
WO2024050493A2 (en) * | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Zoetis Services Llc | Equine antibody mutants |
WO2024102948A1 (en) | 2022-11-11 | 2024-05-16 | Celgene Corporation | Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6322788B1 (en) * | 1998-08-20 | 2001-11-27 | Stanley Arthur Kim | Anti-bacterial antibodies and methods of use |
US20100322944A1 (en) * | 1998-08-20 | 2010-12-23 | Strox Biopharmaceuticals, Llc | Anti-bacterial antibodies |
WO2011078332A1 (ja) * | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 |
JP2012504403A (ja) * | 2008-10-01 | 2012-02-23 | マイクロメット アーゲー | 異種間特異的psma×cd3二重特異性単鎖抗体 |
JP2012513414A (ja) * | 2008-12-23 | 2012-06-14 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | プロテインaに対する結合が変化した免疫グロブリン変異体 |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2413974A1 (fr) | 1978-01-06 | 1979-08-03 | David Bernard | Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
EP0739904A1 (en) | 1989-06-29 | 1996-10-30 | Medarex, Inc. | Bispecific reagents for aids therapy |
EP0547065B1 (en) | 1990-06-29 | 2001-08-29 | Large Scale Biology Corporation | Melanin production by transformed microorganisms |
LU91067I2 (fr) | 1991-06-14 | 2004-04-02 | Genentech Inc | Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
DE4419399C1 (de) | 1994-06-03 | 1995-03-09 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
DK0826696T3 (da) | 1996-09-03 | 2002-09-23 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Anvendelse af bi- og trispecifikke antistoffer til inducering af en tumorimmunitet |
EP1896504B1 (en) * | 2005-06-17 | 2012-11-21 | Wyeth LLC | Methods of purifying fc region containing antibodies |
AR056857A1 (es) | 2005-12-30 | 2007-10-24 | U3 Pharma Ag | Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos |
EP1999154B1 (en) | 2006-03-24 | 2012-10-24 | Merck Patent GmbH | Engineered heterodimeric protein domains |
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EP3248617A3 (en) | 2007-02-16 | 2018-02-21 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies against erbb3 and uses thereof |
JP6157046B2 (ja) | 2008-01-07 | 2017-07-05 | アムジェン インコーポレイテッド | 静電的ステアリング(electrostaticsteering)効果を用いた抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための方法 |
WO2010095031A2 (en) | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Humanized antibodies that bind to cd19 and their uses |
SG10201402742YA (en) | 2009-03-20 | 2014-08-28 | Genentech Inc | Bispecific anti-her antibodies |
KR20120027055A (ko) | 2009-06-26 | 2012-03-20 | 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드 | 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체 |
US9150663B2 (en) * | 2010-04-20 | 2015-10-06 | Genmab A/S | Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof |
CA2812739A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | Hetero-dimeric immunoglobulins |
US9114516B2 (en) | 2011-07-21 | 2015-08-25 | Illinois Tool Works Inc. | Portable combustion gas-powered tools with combustion chamber lockout system |
CN118290588A (zh) * | 2011-10-27 | 2024-07-05 | 健玛保 | 异二聚体蛋白的生成 |
CN104137107A (zh) | 2012-03-06 | 2014-11-05 | 福斯分析有限公司 | 用于为化学计量分析形成预测模型的方法、软件和图形用户界面 |
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6322788B1 (en) * | 1998-08-20 | 2001-11-27 | Stanley Arthur Kim | Anti-bacterial antibodies and methods of use |
US20100322944A1 (en) * | 1998-08-20 | 2010-12-23 | Strox Biopharmaceuticals, Llc | Anti-bacterial antibodies |
JP2012504403A (ja) * | 2008-10-01 | 2012-02-23 | マイクロメット アーゲー | 異種間特異的psma×cd3二重特異性単鎖抗体 |
JP2012513414A (ja) * | 2008-12-23 | 2012-06-14 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | プロテインaに対する結合が変化した免疫グロブリン変異体 |
WO2011078332A1 (ja) * | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 |
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