JP6854246B2 - 尿サンプルの分析方法 - Google Patents
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Description
a. 該尿サンプルを溶解バッファーに曝露するステップであって、このとき、該溶解バッファーは尿サンプル中の細胞から少なくとも1種のバイオマーカーを放出させることが可能である、上記ステップ;および
b. 該尿サンプル中の該少なくとも1種のバイオマーカーの濃度を決定するためのアッセイを行なうステップ
を含む。
a. 溶解バッファーは、0.4%デオキシコール酸ナトリウムおよび0.02%アジ化ナトリウムを含有するPBSではなく;
b. 該方法は、90℃を超える温度での約45分間の尿サンプルのインキュベーションを含まず;
c. 該方法は、該尿サンプルを21ゲージ針に通して核酸をせん断するステップを含まず;
d. 該方法は、該尿サンプルをDNase IまたはRNase Aに曝露することにより核酸を消化させるステップを含まず;かつ/または
e. 該方法は、該サンプルを15,000gで10分間、遠心分離するステップを含まず;
かつこのとき、該方法は、該尿サンプル中の少なくとも1種のバイオマーカーの濃度を決定するためのアッセイを行なうステップをさらに含む。
a. 該尿サンプル中の細胞を濃縮するステップ;および
b. 該濃縮された細胞を溶解バッファーに曝露するステップ
からなるプロセスを用いて調製され;
かつこのとき、該方法は、該尿サンプル中の少なくとも1種のバイオマーカーの濃度を決定するためのアッセイを行なうステップをさらに含む。
a. サンプルペレットを生じさせるために該サンプルを遠心分離するステップ;および
b. 該サンプル由来の該ペレット化された細胞を溶解バッファー中に再懸濁するステップ
からなるプロセスを用いて調製され;
かつこのとき、該方法は、該尿サンプル中の少なくとも1種のバイオマーカーの濃度を決定するためのアッセイを行なうステップをさらに含む。
注入口;
該注入口の下流に位置し、かつ該注入口と流体連通している、第1のバルブ配列;
該第1のバルブ配列の下流に配置され、かつ該第1のバルブ配列と流体連通している、尿由来の細胞を捕捉するためのフィルター;
該フィルターの下流に位置し、該フィルターと流体連通している、第2のバルブ配列;
該第2のバルブ配列の下流に配置され、かつ該第2のバルブ配列と流体連通している、流出口;
該第1のバルブ配列と流体連通している、溶解バッファーを保持するための第1のバッファー貯留部;
該第2のバルブ配列と流体連通している、溶解バッファーを保持するための第2のバッファー貯留部
を含み;
ここで、第1および第2のバルブ配列は:
該第1および第2のバルブ配列の第1の構成では、該第1のバッファー貯留部と該フィルターとの間の流体連通が遮断され、該第2のバッファー貯留部と該フィルターとの間の流体連通が遮断され、かつ該注入口、該フィルターおよび該流出口の間の流体連通が開放され、それにより該フィルターを介して該注入口から該流出口へと尿が流れることができ;かつ
該第1および第2のバルブ配列の第2の構成では、該第1のバッファー貯留部と該フィルターとの間の流体連通が開放され、該第2のバッファー貯留部と該フィルターとの間の流体連通が開放され、かつ該注入口を通って該流出口から出る流れが遮断され、それにより溶解バッファーが該フィルターを介して該第1のバッファー貯留部と該第2のバッファー貯留部との間を流れることができる
ように構成することができる。
細胞を捕捉するためのフィルターを通して該尿サンプルを通過させ、それにより細胞を該フィルターに捕捉するステップ;
該フィルターを通して溶解バッファーを通過させ、それにより該捕捉された細胞を該溶解バッファーに曝露するステップ;
該フィルターを一定時間インキュベートし、それにより該溶解バッファーによって細胞から少なくとも1種のバイオマーカーを放出させるステップ
を含む。
a. Mcmタンパク質の濃度を決定するために被験体由来のサンプルに対してアッセイを行なうステップ;
b. ステップa.で決定されるMcmタンパク質の濃度を参照値と比較するステップ
を含み;
このとき、該アッセイは免疫蛍光アッセイではない。
本発明の装置;および
該尿サンプル中の少なくとも1種のバイオマーカーの濃度を決定することが可能なアッセイデバイス
を含む。
用語「含む」(含む、含んでいる)は、当技術分野でのその通常の意味、すなわち、記載される特徴または特徴の群が含まれるという意味を有すること、しかし、この用語はいずれかの他の記載される特徴または特徴の群がこれもまた存在することを排除するものではないことが理解されるべきである。
本発明は、尿サンプルを溶解バッファーに曝露するステップを含む、尿サンプルを分析するための方法に関する。これらの方法は、先行技術の方法よりも、明らかに簡潔であり、かつコスト効率が高い。
a. 該尿サンプル中の細胞を濃縮するステップ;および
b. 該濃縮された細胞を溶解バッファーに曝露するステップ
からなるプロセスを用いて調製される。
好適には、ペレットは、使い捨てチップを取り付けた調節可能ピペットを用いて再懸濁される。
さらなる実施形態では、方法は、尿サンプルをDNase IまたはRNase Aに曝露することにより核酸を消化するステップを含まない。
一実施形態では、本発明の尿サンプルを分析するための方法は、被験体での泌尿器癌の診断を補助するための、より大きな方法の一部分である。
溶解バッファーは、一般的に、細胞を溶解する目的のために用いられるバッファーである。細胞から1種以上のバイオマーカーを放出させることに加えて、溶解バッファーは、引き続く分析のために用いられる方法と適合する必要がある。例えば、分析法が二重抗体サンドイッチELISAである場合、溶解バッファーは、マイクロタイタープレートの表面に結合した捕捉抗体を分解してはならない。溶解バッファーは、一般的には、しかし排他的ではなく、1種以上の界面活性剤(detergent)(surfactantとしても知られる)、1種以上の塩および緩衝剤を含む。これらの構成成分の濃度は、溶解バッファーの有効性に影響を与える。
一実施形態では、溶解バッファーは、0.4%デオキシコール酸ナトリウムおよび0.02%アジ化ナトリウムを含有するPBSではない。
(i) 1mM〜500mM Tris;
(ii) 5mM〜500mM塩化ナトリウム;
(iii) 0.1%〜20%BSA;
(iv) 0.001%〜10%Triton X-100;および
(v) 0.001%〜1%アジ化ナトリウム。
(i) 1mM〜500mM Tris;
(ii) 5mM〜500mM塩化ナトリウム;
(iii) 0.1%〜20%BSA;
(iv) 0.001%〜10%Triton X-100;および
(v) 0.001%〜1%アジ化ナトリウム。
(i) 1mM〜150mM Tris;
(ii) 50mM〜400mM塩化ナトリウム;
(iii) 0.5%〜10%BSA;
(iv) 0.01%〜5%Triton X-100;および
(v) 0.01%〜0.5%アジ化ナトリウム。
(i) 1mM〜150mM Tris;
(ii) 50mM〜400mM塩化ナトリウム;
(iii) 0.5%〜10%BSA;
(iv) 0.01%〜5%Triton X-100;および
(v) 0.01%〜0.5%アジ化ナトリウム。
(i) 1mM〜100mM Tris;
(ii) 100mM〜300mM塩化ナトリウム;
(iii) 1%〜5%BSA;
(iv) 0.01%〜1%Triton X-100;および
(v) 0.01%〜0.1%アジ化ナトリウム。
(i) 1mM〜100mM Tris;
(ii) 100mM〜300mM塩化ナトリウム;
(iii) 1%〜5%BSA;
(iv) 0.01%〜1%Triton X-100;および
(v) 0.01%〜0.1%アジ化ナトリウム。
(i) 約10mM Tris;
(ii) 約200mM塩化ナトリウム;
(iii) 約2.5%BSA;
(iv) 約0.1%Triton X-100;および
(v) 約0.09%アジ化ナトリウム。
(i) 約10mM Tris;
(ii) 約200mM塩化ナトリウム;
(iii) 約2.5%BSA;
(iv) 約0.1%Triton X-100;および
(v) 約0.09%アジ化ナトリウム。
本発明の一態様では、本発明の溶解バッファー、捕捉抗体および検出抗体を含むキットが提供され、このとき、捕捉抗体および検出抗体はMcm5に結合する。キットは、サンプル中のMcm5の濃度を決定するためのアッセイ(例えば、ELISAアッセイ)の一部分として用いることができる。溶解バッファーは、サンプル中の細胞からMcm5を放出させることができる。捕捉抗体および検出抗体は、サンプル中のMcm5の濃度を定量するために用いることができる。
「捕捉抗体」は、固相支持体、例えば、マイクロタイタープレートとしても知られるELISAプレートの表面に結合している抗体である。「捕捉抗体」は、Mcm5に結合することができ、したがってMcm5を固相支持体に結合させることができる。一実施形態では、「捕捉抗体」は、ELISAプレート上に固定化される。
用語「抗体」とは、天然に存在する形態、または単鎖抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体などの組み換え抗体を意味することができる。用語「抗体」(単数および複数)はまた、Mcm5のようなMcmタンパク質などの標的タンパク質に結合できる抗体の断片を包含すると考え得る。そのような断片としては、Fab'2、F'(ab)2、Fv、単鎖抗体またはダイアボディが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、(断片よりもむしろ)天然に存在する全長抗体である。さらなる好ましい実施形態では、抗体はヒト化抗体ではない。
一実施形態では、キットはキャリブレーターを含む。「キャリブレーター」は、1種以上の既知濃度のMcm5の調製物である。
一実施形態では、キットは基質試薬を含む。基質試薬は、検出抗体を検出するために用いることができる。例えば、「検出抗体」が西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化される場合、基質試薬は、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)、DAB(3,3'-ジアミノベンジジン)またはABTS(2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸))を含むことができる。好ましい実施形態では、基質試薬はTMBを含む。さらなる好ましい実施形態では、基質試薬は過酸化物およびTMBである。
一実施形態では、キットは、洗浄溶液および/または停止溶液をさらに含む。
一実施形態では、キットは、サンドイッチELISAを行なうために好適である。
本発明はまた、被験体での泌尿器癌の存在を検出するための方法も提供する。そのような方法は、好ましくはin vitro法である。そのような方法は、少なくとも1種のバイオマーカーの「濃度を決定するためのアッセイを行なう」ステップを含む。
本発明の一実施形態では、「バイオマーカーの存在を検出するステップ」との用語は、バイオマーカーの「濃度を決定するためのアッセイを行なうステップ」との用語と置換可能であると考えることができる。そのような実施形態では、バイオマーカーの存在は、その濃度が所定のカットオフレベルよりも高い場合に、検出されると考えることができる。
配列相同性は機能的類似性(すなわち、類似の化学的特性/機能を有するアミノ酸残基)に関して検討することもできるが、本明細書の文脈では、配列同一性に関して相同性を表わすことが好ましい。
本発明はまた、泌尿器癌を検出するための方法も提供する。そのような方法は、アッセイされる患者の泌尿器系(すなわち、腎臓、尿管、膀胱および尿道)での尿流または尿と密接に接触するいずれかの腫瘍を検出するであろうという顕著な利点を提示する。
例えば、尿道は陰茎を通過するので、尿道に影響を及ぼす場合には、陰茎癌などの他の原発癌も検出できることが、本発明の利点である。
一実施形態では、本発明は、有利には、前立腺癌の検出に応用される。
一実施形態では、本発明は、有利には、膀胱癌の検出に応用される。
一実施形態では、本発明は、前立腺癌および膀胱癌の両方の検出に応用される。
ミニ染色体維持(MCM)タンパク質は、子宮頸癌に対する診断用バイオマーカーとして既に用いられてきている。好適には、本発明に従う好ましいバイオマーカーは、Mcmタンパク質である。最も好適には、Mcmタンパク質はMcm5である。
本発明は、有用なことに、一般的な臨床検査室での使用および医療現場用途に適したMcm5に関する新規アッセイ法を提供する。
本発明の方法は、「被験体由来のサンプルを提供する」ステップを含むことができる。好ましくは、このステップは非侵襲的(非外科的)であり、例えば、採尿である。
サンプルは、血液、血清、唾液、***、尿もしくは尿沈渣などのいずれかの体液、またはそのような体液のうちの1種から調製される抽出物を含むことができる。
好適には、サンプルは尿である。
前立腺癌について試験する場合、最も好適には、サンプルは、前立腺のマッサージ後に取得できるもの(被験体が男性の場合)などの、初尿である。
さらにより好適には、サンプルは、初尿の最初の数ミリリットルを含むことができる。
さらにより好適には、サンプルは、尿から(全尿から、または上記の通りの初尿からなど)採取された沈殿細胞などの尿沈渣を含むことができる。
本発明の一態様では、サンドイッチELISA、または二部位ELISA(two-site ELISA)でのバイオマーカーと特異的抗体との間の結合を検出することにより、バイオマーカーの存在および/または濃度を決定するためのアッセイシステムが提供される。バイオマーカーは、別々に(例えば、好適には同じサンプルの一部分に対して行なわれる、物理的に別個のアッセイで)測定することができる。この実施形態では、各アッセイ中に、サンプルを、それに関して試験される対象であるバイオマーカーに対して特異的な抗体などの1種類のリガンドと接触させる。例えば、サンプルを、各ウェルに異なる抗体が入っているマイクロタイタープレートの異なるウェルへと添加することができる。
参照標準とは、典型的には、健康な個体、すなわち、泌尿器癌に罹患していない個体由来のサンプルを意味する。
参照標準は、並行して分析される実際のサンプルであり得る。あるいは、参照標準は、同等のサンプル、例えば、健康な被験体由来のサンプルから以前に誘導された1つ以上の値であり得る。そのような実施形態では、以前に分析された参照サンプルの数値に対して、被験体由来のサンプルについて決定される値を比較することにより、単なる数値比較を行なうことができる。このことの利点は、被験体由来のサンプルを分析するたびに、並行して個々の参照サンプル中の濃度を決定することによる分析を二重に行なう必要がないことである。
参照標準は、好適には、具体的な患者サブグループ、例えば、高齢被験体、または泌尿器癌に対する素因などの関連の既往歴を有する被験体と合致させることができる。
本明細書中で考察されるバイオマーカーの存在および/または濃度を決定する好ましい様式は、選択されたバイオマーカーに特異的に結合する好適な抗原結合性分子またはリガンドを用いる。好適には、リガンドは、抗体、またはscFvもしくはFabなどの抗体誘導体であり得る。
本発明は、尿サンプルから細胞を調製するための方法を提供する。
一実施形態では、尿サンプル由来の尿を、細胞を捕捉するためのフィルターに通し、それにより、尿サンプル中の細胞がフィルターに捕捉される。フィルターに通される尿の体積は、好ましくは1mL〜100mL、より好ましくは30mL〜70mL、さらにより好ましくは約50mLである。
本発明はまた、尿サンプルから細胞を調製するための装置も提供する。以下の装置の説明では、用語「上流」および「下流」は、装置を通る尿の流れの方向に対して相対的に定義され、すなわち、注入口から流出口への流れは下流方向の流れである。互いに「流体連通」していると記載される装置の構成要素は、流体がそれ以上は流れることができないかも知れない(例えば、閉鎖されたバルブの場合)が、これらの構成要素の間では流れることができることを意味する。そのような構成要素は、当技術分野で公知の手段(例えば、チューブまたはパイプ)を介して接続することができる。装置の各構成要素は、取り外し可能に他の構成要素に接続することができる。装置の構成要素の一部または全部が、一体的に形成されていても良い。
第1および第2のバルブ102、104の第1の構成では、第1のバッファー貯留部106とフィルター103との間の流体連通が遮断され、第2のバッファー貯留部107とフィルター103との間の流体連通が遮断され、かつ注入口101、フィルター103および流出口105の間の流体連通は開放されている。この第1の構成では、装置の使用時に、尿はフィルター103を介して注入口101から流出口105へと流れることができる。第1の構成では、好ましくは、尿は、注入口101または流出口105から第1および/または第2のバッファー貯留部106、107へと流れることができない。第1の構成では、好ましくは、溶解バッファーは、第1のバッファー貯留部106から、注入口101または流出口105へと流れることができない。第1の構成では、好ましくは、溶解バッファーは、第2のバッファー貯留部107から、注入口101または流出口105へと流れることができない。
本発明はまた、装置100の使用方法も提供する。上記の通り、用語「上流」および「下流」は、装置を通る尿の流れの方向に対して相対的に定義され、すなわち、注入口から流出口への流れは下流方向の流れである。
続いて、好ましくは、流出口を通って上流方向に尿が逆流することを防ぐために、流出口105が遮断または密封される。
ここで、本発明を実施例により説明し、この実施例は、限定的な性質のものではなく、むしろ例示的であることが意図される。
材料
単回排尿試料(single voided urine specimen)を、ヘザーウッド病院(Heatherwood Hospital;Heatherwood and Wexham Park Hospitals NHS Foundation Trust)の血尿外来を受診した患者から取得した(地域研究倫理委員会からの倫理的承認を得ている)。Multistix 10 SGディップスティック(Siemens社)を用いる尿検査を新鮮サンプルに対して行ない、残りの尿を1mLまたは15mL Falconチューブに分け入れ、検査室までの輸送のためにドライアイス上に置いた。
本発明の一実施形態はMcm5に対する簡潔なELISA試験であり、これは、特殊かつ複雑なMcm5 DELFIA(登録商標)テストを有用に代替し(Stoeber et al 2002(Journal of the National Cancer Institute, 94, 1071-1079; 2002)を参照されたい)、つまり、試験は典型的な臨床化学検査室で行なうことができるであろう。試験は直接的二重モノクローナル抗体サンドイッチ酵素結合免疫測定である。両方の抗体が、抗原Mcm5に対して高い親和性および特異性を有する。試験対象のサンプル中のMcm5は、マイクロタイタープレートウェルの表面に結合した特異的モノクローナル抗体により捕捉される。続いて、抗原の別の部位に結合するものであり、かつ酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に連結されている検出抗体(detector antibody)を添加する。プレートウェル中に保持されるHRPの存在および量は、HRPの発色性基質であるテトラメチルベンジジン(TMB)の添加後に発色する色の強度を測定することにより評価される。光学密度は、既定の限定範囲内で、サンプル中のMcm5の濃度に比例する。Mcm5の濃度範囲を試験することにより、用量応答曲線を作成することができ、ここから、未知サンプルの抗原濃度を確認することができる(図2および図3を参照されたい)。
キャリブレーターサンプルが提供される。これらは、アッセイの時点で連続希釈を用いて調製され、使用後は廃棄される(図3を参照されたい)。
表2は、典型的な実験からの結果を示す。
116名の患者から尿試料を取得し、これらの患者の大部分は、引き続いて軟性膀胱鏡検査(flexible cystoscopy)およびCTまたは超音波によるスキャン法により検査された。異常な結果が得られた場合、患者に生検を勧めた。可能な場合には、これらの検査の結果を収集して、データセットに加えた。Mcm5のレベルを、上記のELISA技術(実施例1)を用いて各被験体で測定した。8症例の膀胱癌が臨床的に確認され、そのうちの5症例がMcm5アッセイで陽性であると記録された。
標準的アッセイ統計を、Mcm5アッセイデータに対して算出した。真の臨床的エンドポイントは試験中のすべての患者に対しては入手可能でなかったが、当業者は、この適度なパネルが説得力のある結果を生んでいることを理解するであろう。特に、本研究は、96%(104/108)の特異度の現実的な推定をもたらした。
既知数のT24尿路上皮癌細胞を各バッファー中で溶解させ、溶解物をMcm5に関してELISAで試験した。結果は、本アッセイでの溶解効率の明らかな差異を実証する。SDSを含有するバッファーは文献に記載される典型的なものであるが、Cytobusterまたは「Urosens LB」(0.08%デオキシコール酸ナトリウム、0.08%CHAPS、2mM EDTA、150mM Trizma pH7.6)よりも顕著に効率が低い。結果を図4に提示する。
CytoBuster中での細胞の溶解を、DMEM(細胞培養培地)中に再調製された細胞ペレットの対照を用いて、TBS Tritonバッファー(TBST)およびRIPAバッファー中の細胞と比較した。結果を図5に記載する。
追加の構成要素を、TBST溶解物の安定性の改善を試みるためにTBTに添加した。溶解サンプル中のMcm5の効力を、新鮮細胞および凍結細胞の両方へのバッファーの添加後に試験した。この実験の結果を、図6に提示する。
種々の濃度のTrisおよびTriton X-100を含む様々なバッファーを比較した。溶解サンプル中のMcm5の効力を、新鮮細胞および凍結細胞の両方へのバッファーの添加後に試験した。結果を図8に提示する。
より高い緩衝剤濃度を用いた場合にシグナルが依然として増大するか否かを知るために、およびどの濃度で改善がプラトーに達するのかを知るために、Trisのさらなる滴定を行なった。結果を図10に提示する。
Tris濃度の変更は、イオン強度の増大に起因して有効であり得ることが仮説とされた。これはNaClの添加によって同様に達成できるので、NaClの様々な濃度を有する組成を試験した。結果を図11に提示する。
実施例8で示されたデータは、約10mMのTrisを有するバッファーが最も有効であることを示唆するので、10mM Trisおよび様々なNaCl濃度を有するバッファーを調べた。結果を図12に提示する。
様々な安定化剤を、TBS-Tと組み合わせた場合にMcm5サンプルを安定化させる上でのその有効性に関して試験した。
考えられる候補に関して、1%FBS(胎児ウシ血清)、2.5%BSA(ウシ血清アルブミン)、0.25mM Pefabloc SC、0.1mM Pefabloc SC、0.5% Sigma P8340プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび0.25×Roche cOmpleteプロテアーゼ阻害剤カクテルのすべてが、安定性添加剤を含有しないバッファーと比較して、バックグラウンドシグナルまたは陽性サンプルシグナルを低下させることなく、有望なデータを有した。これらのデータを、図13Aおよび図13Bに提示する。
TBSTr+2.5%BSA組成物を、TBSTrおよびCytoBusterと比較した。結果を、図15A、図15Bおよび図15Cに提示する。
すべての細胞株について、TBST+2.5%BSAは安定(新鮮溶解物の10%以内の濃度)であり、かつCytoBusterおよびTBSTの両方よりも、1回のFTサイクル後に最も高いシグナルを有することが証明された。大まかに言って、CytoBusterは新鮮溶解物に関して非常に変動の大きな結果を生じることが明らかになっているが、凍結融解が行なわれる場合には常に明らかな効力の低下が見られる。
BSA含有バッファーは微生物が増殖し易いので、2種類の抗微生物剤であるProClin950およびアジ化ナトリウム(NaN3)を、TBST+2.5%BSA処方を用いて試験した。結果を図16および図17に提示する。
参照バッファーから10%未満の逸脱であるので、0.09%アジ化ナトリウムが抗微生物剤に関して最良の候補である。
Claims (15)
- 以下のステップ:
a. 尿サンプルを溶解バッファーに曝露するステップであって、該溶解バッファーは、該尿サンプル中の細胞からMcm5を放出させることが可能であり、かつ該溶解バッファーは、Triton X-100を含むかまたはこれからなる界面活性剤を含む、上記ステップ;および
b. 該尿サンプル中の該Mcm5の存在を検出するためのアッセイを行なうステップ
を含む、被験体由来の尿サンプルを分析するための方法。 - a. 前記溶解バッファーが、0.4%デオキシコール酸ナトリウムおよび0.02%アジ化ナトリウムを含有するPBSではなく;
b. 前記方法が、90℃を超える温度での45分間を超える前記尿サンプルのインキュベーションを含まず;
c. 前記方法が、21ゲージ針に該尿サンプルを通過させることにより、該尿サンプル中の核酸をせん断するステップを含まず;
d. 前記方法が、該尿サンプルをDNase IまたはRNase Aに曝露させることにより、核酸を消化するステップを含まず;かつ/または
e. 前記方法が、15,000gで10分間、該サンプルを遠心分離するステップを含まない、
請求項1に記載の方法。 - 以下のステップ;
細胞を捕捉するためのフィルターに尿サンプルを通過させ、それにより該細胞を該フィルター中に捕捉するステップ;
該フィルターに尿サンプル中の細胞からMcm5を放出させることが可能である溶解バッファーを通過させ、それにより該捕捉された細胞を該溶解バッファーに曝露するステップ;
該フィルターを一定時間インキュベートし、それにより該溶解バッファーによって細胞からMcm5を放出させるステップであって、該溶解バッファーは、Triton X-100を含むかまたはこれからなる界面活性剤を含む、上記ステップ
を含む、尿サンプルから細胞を調製するための方法。 - (i)前記溶解バッファーが、Mcm5タンパク質を実質的に変性させない、
(ii)前記溶解バッファーが抗体を変性させない、
(iii)前記界面活性剤が、0.01%〜25%、0.01%〜10%、0.05%〜5%、0.05%〜1%、0.05%〜0.5%または約0.1%の濃度でTriton X-100を含む、
(iv)前記界面活性剤が、0.1%〜20%、0.5%〜10%、0.5%〜5%または約1%の濃度でデオキシコール酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリウムを含む、
(v)前記溶解バッファーが、0.01%〜0.15%、0.03%〜0.10%、0.05%〜0.09%または約0.08%の濃度でデオキシコール酸ナトリウムを含む、
(vi)前記溶解バッファーが緩衝剤成分を含む、
(vii)前記溶解バッファーが、5mM超、5mM〜350mM、200mM〜300mM、10mM〜25mM、約10mMもしくは約250mMの濃度のTris緩衝剤を含むかまたはこれからなる緩衝剤成分を含む、
(viii)前記溶解バッファーが、溶解バッファーのpHをpH4〜pH9、pH5〜pH8、pH6〜pH8または約pH7.6に維持する緩衝剤成分を含む、
(ix)前記溶解バッファーが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸マグネシウムからなる群より選択される塩を含む、
(x)前記溶解バッファーが、20mM〜300mM、150mM〜300mM、100mM〜200mMまたは約200mMの濃度の塩を含む、
(xi)前記溶解バッファーが、1mM〜500mM、50mM〜450mM、100mM〜250mM、または100mM〜175mMのイオン強度を有する、および/または
(xii)前記溶解バッファーがRIPAバッファーを含む、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - (i)尿サンプル中の細胞からMcm5を放出させ、細胞から放出されたMcm5の存在を検出するための方法である、
(ii)前記方法が、前記尿サンプルを溶解バッファーに曝露するステップに先立って尿サンプル中の細胞を濃縮し、溶解バッファー、またはサンプル由来のペレット化した細胞の溶解バッファー中の再懸濁液に濃縮した細胞を曝露するステップを含む、
(iii)前記方法が、被験体での泌尿器癌の存在を検出するための方法である、および/または
(iv)前記方法が、被験体での泌尿器癌の存在を検出するための方法であり、前記泌尿器癌が、前立腺癌および/または膀胱癌である、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - (i)前記方法が、高温での前記尿サンプルのインキュベーションを含まない、
(ii)前記方法が、50℃超、60℃超、70℃超、80℃超、50℃〜120℃、60℃〜110℃、70℃〜100℃、または80℃〜100℃の温度である高温での前記尿サンプルのインキュベーションを含まない、
(iii)前記方法が、30分間超、35分間超、40分間超、45分間超、30分間〜2時間、35分間〜2時間、または40分間〜2時間の高温での前記尿サンプルのインキュベーションを含まない、
(iv)前記方法が、機械的せん断による前記尿サンプル中の核酸のせん断を含まない、
(v)前記方法が、核酸を消化する酵素に前記尿サンプルを曝露するステップを含まない、および/または
(vi)前記方法が、15,000gで10分間、前記サンプルを遠心分離するステップを含まない、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - (i)Mcm5の濃度に関する異常値が、被験体での泌尿器癌の尤度の増大を示す、
(ii)Mcm5の存在を検出するための前記アッセイが、ELISAアッセイである、
(iii)Mcm5の存在を検出するための前記アッセイが、サンドイッチELISAアッセイである、および/または
(iv)Mcm5の存在を検出するための前記アッセイが、捕捉抗体を用いて前記サンプル中のMcm5を捕捉するステップ、および検出抗体を用いてMcm5の濃度を検出するステップを含むサンドイッチELISAアッセイであって、該捕捉抗体および該検出抗体はMcm5に特異的に結合し、場合によって該捕捉抗体がELISAプレート上に固定化され、および/または該検出抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化されている、
請求項1または2に記載の方法。 - 前記界面活性剤が、デオキシコール酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶解バッファーが、TrisまたはTrizma緩衝剤を含むかまたはこれらからなる緩衝剤成分を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶解バッファーが、20mM〜300mM、150mM〜300mM、100mM〜200mMまたは約200mMの濃度の塩化ナトリウムを含むかまたはこれからなる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶解バッファーが、溶解バッファーのpHをpH4〜pH9、pH5〜pH8、pH6〜pH8または約pH7.6に維持する緩衝剤成分を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記尿サンプルが、
(i)尿沈渣を含む、および/または
(ii)前立腺マッサージ後に採取された初尿から得られる尿沈査を含む、
請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。 - (i)前記フィルターに溶解バッファーを通過させるステップが、該フィルターを通る尿の流れに対して、上流方向で少なくとも1回該フィルターに該溶解バッファーを通過させるステップ、および下流方向で少なくとも1回該フィルターに該溶解バッファーを通過させるステップを含み、場合によって、前記溶解バッファーを、上流および下流へと前記フィルターに交互に通過させる、
(ii)前記尿サンプルの体積が、1〜100mL、好ましくは約50mLである、
(iii)前記溶解バッファーの体積が、250μL〜1,000μL、好ましくは約500μLである、
(iv)前記尿サンプルを、シリンジを用いて前記フィルターに通過させる、
(v)前記溶解バッファーを、シリンジを用いて前記フィルターに通過させる、
(vi)前記溶解バッファーを、2個のシリンジの間で前記フィルターを通過させ、該2個のシリンジおよび該フィルターが該溶解バッファーを通過させるステップのために閉鎖系を形成する、および/または
(vii)インキュベーション時間が、30秒間〜1時間、好ましくは約10分間である、
請求項3に記載の方法。 - 前記尿サンプルを溶解バッファーに曝露するステップが、請求項3または13に記載の方法を用いて行なわれる、請求項1、2または4〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 尿サンプル中の細胞からMcm5を放出させるための、請求項1〜14のいずれか1項に記載の溶解バッファーの使用。
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