JP5196890B2 - 有核細胞回収装置および有核細胞の回収方法 - Google Patents

Description

本発明は、有核細胞回収装置および有核細胞の回収方法に関するものである。

従来、赤血球は実質的に捕捉しないが血管新生に有効な細胞は捕捉する細胞捕捉フィルタに血液を流して血管新生に有効な細胞を該細胞捕捉フィルタに捕捉させ、捕捉された細胞を回収する血管新生療法用細胞組成物の製造方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２００５−８２５６７号公報

しかしながら、細胞ソースを細胞捕捉フィルタに透過させる場合に、わずかな赤血球を捕捉してしまい、最終的に回収される血管新生に有効な細胞の中に赤血球が含まれてしまうという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡単な操作で短時間のうちに、細胞ソースから、赤血球を含むことなく、有核細胞を分離、回収することができる有核細胞回収装置および有核細胞の回収方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、該細胞捕捉フィルタの入口側に、第１の切替弁を介して接続され、細胞ソースを収容した細胞ソース容器および回収容器と、前記細胞捕捉フィルタの出口側に、第２の切替弁を介して接続され、前記細胞捕捉フィルタを透過した血小板を収容するドレインバッグおよび回収液を供給する回収液供給手段と、前記細胞ソース容器を区画可能なクリップとを備え、前記細胞ソース容器が、重力により前記細胞ソースを赤血球と有核細胞含有液とに分離し、前記クリップにより、分離したこれらの赤血球と有核細胞含有液とを相互に混合しないように分離させた状態で該有核細胞含有液を前記細胞捕捉フィルタに流入させる有核細胞回収装置を提供する。

本発明によれば、細胞ソース容器に細胞ソースを収容し、重力により赤血球を分離した後に、細胞捕捉フィルタの入口側に接続された第１の切替弁を細胞ソースを収容した細胞ソース容器側に接続し、細胞捕捉フィルタの出口側に接続された第２の切替弁をドレインバッグ側に接続した状態で、重力その他の手段によって細胞ソースを細胞捕捉フィルタに流入させると、該細胞捕捉フィルタにより、血管新生に有効な有核細胞、例えば、単核球細胞が捕捉される。一方、血小板は細胞捕捉フィルタにより捕捉されることなく通過して、ドレインバッグに流入させられる。

この後に、第１の切替弁を細胞ソース容器側から回収容器側に切り替え、第２の切替弁をドレインバッグ側から回収液供給手段側に切り替えるとともに、回収液供給手段の作動により、回収液を供給することによって、細胞捕捉フィルタを回収液により逆洗する。これにより、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞が回収液とともに回収容器に流入し回収される。すなわち、細胞ソースから回収された血管新生に有効な有核細胞を外気に触れさせることなく、簡易な操作で無菌的に回収容器内に回収することができる。

上記発明においては、前記回収容器が減圧されていることとしてもよい。
このようにすることで、第１の切替弁を細胞ソース容器側から回収容器側に切り替えると、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた有核細胞が回収液とともに回収容器内に吸引され易くなり、さらに容易に回収することが可能となる。
また、上記発明においては、前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかであることとしてもよい。
上記発明の参考例としての発明においては、前記細胞ソース容器が、他の容器に接続可能な第１接続部と、前記第１の切替弁を介して前記細胞捕捉フィルタの入口側に接続可能な第２接続部とを備え、前記第１接続部により、分離した前記赤血球を前記他の容器に放出し、前記第２接続部により、残留する前記有核細胞含有液を前記細胞捕捉フィルタに流入させることとしてもよい。

また、本発明は、容器内に収容した細胞ソースを該容器内において重力により赤血球と有核細胞含有液とに分離し、分離させた前記赤血球と前記有核細胞含有液とが相互に混合しないように、該容器をクリップにより挟んで区画する赤血球分離ステップと、該赤血球分離ステップにより赤血球から分離された有核細胞含有液を、血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに前記容器から流入させて透過させる細胞捕捉ステップと、回収液を前記細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させる逆洗ステップと、該細胞透過フィルタを逆方向に透過した液体を回収する回収ステップとを備える有核細胞の回収方法を提供する。

本発明によれば、赤血球分離ステップにおいて、容器内に収容した細胞ソースから重力により赤血球を分離し、細胞捕捉ステップにおいて残りの有核細胞含有液を細胞捕捉フィルタに透過させることにより、有核細胞含有液中に含まれる血管新生に有効な有核細胞が細胞捕捉フィルタに捕捉され、血小板等が透過させられる。そして、逆洗ステップにおいて、回収液を細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させることにより、細胞捕捉フィルタに捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞が回収液によって逆洗され、回収ステップにおいて回収される。
この場合に、前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかであることとしてもよい。
上記発明の参考例としての発明においては、前記細胞捕捉ステップが、前記赤血球分離ステップにより前記容器内において分離された前記赤血球を該容器の第１接続部から他の容器に放出した後、前記容器内に残留する前記有核細胞含有液を該容器の他の第２接続部から前記細胞捕捉フィルタに流入させることとしてもよい。

本発明によれば、簡単な操作で短時間のうちに、細胞ソースから、赤血球を含むことなく、有核細胞を分離、回収することができるという効果を奏する。

本発明の参考例としての発明の第１参考実施形態に係る有核細胞回収装置１および回収方法について、図１〜図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る有核細胞回収装置１は、図１に示されるように、血小板を捕捉せず血管新生に有効な細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタ２と、該細胞捕捉フィルタ２の入口側に接続される末梢血（細胞ソース）Ａを収容した血液容器（細胞ソース容器）３および回収容器４と、細胞捕捉フィルタ２の出口側に接続される細胞捕捉フィルタ２を透過した血小板を収容するドレインバッグ５および回収液Ｃを供給するシリンジ６からなる回収液供給手段とを備えている。

細胞捕捉フィルタ２と血液容器３および回収容器４との間には、第１の三方弁（切替弁）７が配置され、該第１の三方弁７の切り替えにより、血液容器３または回収容器４のいずれかが、択一的に細胞捕捉フィルタ２に接続されるようになっている。図中、符号８はピンチバルブである。
また、前記細胞捕捉フィルタ２と、ドレインバッグ５およびシリンジ６との間には、第２の三方弁（切替弁）９が配置され、該第２の三方弁９の切り替えにより、ドレインバッグ５またはシリンジ６からなる回収液供給手段のいずれかが、択一的に細胞捕捉フィルタ２に接続されるようになっている。

前記細胞捕捉フィルタ２としては、ポリエステルあるいはポリプロピレンからなる平均繊維径約０．０１〜１０μｍの不織布フィルタを積層したものが採用される。
また、前記血液容器３、回収容器４およびドレインバッグ５は、いずれも無菌的に細胞捕捉フィルタ２に接続されるようになっている。

血液容器３は、第１の三方弁７に接続するチューブ１０への接続部３ａを有し、該接続部３ａはバルブ３ｂによって開閉可能に設けられている。バルブ３ｂによって接続部３ａを閉じ、接続部３ａを下向きにして血液容器３を１０〜３０分間懸架することにより、図２（ａ）に示されるように、血液容器３内に収容されている末梢血Ａを、比重の違いによって赤血球Ｂと有核細胞含有液Ｃとに分離することができるようになっている。そして、この状態で、バルブ３ｂによって接続部３ａを開放することにより、図２（ｂ）に示されるように、血液容器３の下側に沈降している赤血球Ｂを接続部３ａから任意の容器１１へ放出し、血液容器３内に有核細胞含有液Ｃのみを残すことができるようになっている。

また、シリンジ６には、回収液Ｄとして、血管新生に有効な細胞の変性が少ない、例えば、生理食塩水、ダルベッコリン酸塩緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）、ハンクス液等の緩衝液、ＲＰＭＩ１６４０等の培地等が収容されている。
また、効率よく回収するために、一定の血液浸透圧を有する回収液Ｄを採用した方がよく、デキストラン等が添加されていてもよい。

また、細胞ソースとしては、末梢血Ａの他、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織を使用してもよい。これらの中で粘性の高いものについては酵素処理などを行い、粘性を低下させて液状化させた後に使用することが望ましい。

このように構成された本実施形態に係る有核細胞回収装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る有核細胞回収装置１を用いて末梢血Ａから有核細胞を分離回収するには、まず、図２に示されるように、血液容器３内において重力により赤血球Ｂを分離し接続部３ａを開放して赤血球Ｂを放出させ、有核細胞含有液Ｃのみが血液容器３内に残留した状態で、接続部３ａを第１の三方弁７に接続するチューブ１０に接続する。そして、第１の三方弁７を血液容器３側に接続し、第２の三方弁９をドレインバッグ５側に接続し、血液容器３を細胞捕捉フィルタ２よりも高位に配置する。

これにより、図３に示されるように、血液容器３内に収容されている有核細胞含有液Ｃが、重力によりチューブ１０内を下降する。有核細胞含有液Ｃは、例えば、４０ｃｃ〜２００ｃｃを、２０ｃｃ／ｍｉｎの滴下速度で下降させるのが好ましい。

下降する有核細胞含有液Ｃは、第１の三方弁７を通過して細胞捕捉フィルタ２に入口２ａ側から供給される。そして、細胞捕捉フィルタ２内を流動する際に、有核細胞含有液Ｃ内に含有されている血管新生に有効な有核細胞、例えば、単核球細胞が捕捉される。一方、有核細胞含有液Ｃ内に含有されている血小板Ｅは、図４に示されるように、細胞捕捉フィルタ２により捕捉されることなく通過して、第２の三方弁９を通過し、配管を介してドレインバッグ５に流入させられる。

そして、血液容器３内の有核細胞含有液Ａが十分に細胞捕捉フィルタ２を通過した時点で、第１の三方弁７を回収容器４側に切り替えるとともに、第２の三方弁９をシリンジ６側に切り替えてシリンジ６を加圧する。これにより、シリンジ６内の回収液Ｄを細胞捕捉フィルタ２の出口２ｂ側から供給する。

回収容器４内は減圧状態に設定されているので、第１の三方弁７を回収容器４側に切り替えることにより、図５に示されるように、配管を介して細胞捕捉フィルタ２内の液体Ｆが入口２ａ側に吸引される。
すなわち、シリンジ６の作動による出口２ｂ側の加圧と回収容器４による入口２ａ側の減圧とにより、シリンジ６内の回収液Ｃが細胞捕捉フィルタ２内に出口２ｂ側からスムーズに流入し、細胞捕捉フィルタ２を出口２ｂ側から入口２ａ側に向かって流動する。これにより、細胞捕捉フィルタ２は逆洗され、細胞捕捉フィルタ２に捕捉されていた血管新生に有効な有核細胞が、回収液Ｃとともに液体Ｆとなって、入口２ａ側から第１の三方弁７を介して回収容器４内に流入する。

この場合において、本実施形態に係る有核細胞回収装置１によれば、２つの三方弁７，９を切り替えて、回収液供給手段としてのシリンジ６を操作するだけで、末梢血Ａ内に含有されている有核細胞を回収できる。さらに、回収工程において末梢血Ａが、ほぼ外気に触れることなく容器３，４および配管内に維持されるので、感染のおそれがなく、無菌的に有核細胞を回収することができるという利点がある。

次に、本発明の一実施形態に係る有核細胞回収装置１′について、図６〜図８を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第１参考実施形態に係る有核細胞回収装置１と構成を共通とする箇所には同一の符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る有核細胞回収装置１′は、図６に示されるように、末梢血Ａを収容した血液容器３がチューブ１０を介して細胞捕捉フィルタ２に接続されている。
本実施形態においては、最初に、図６に示されるように、末梢血Ａを収容した血液容器３のチューブ１０への接続部３ａが上方に配されるように懸架し、静置することにより、血液容器３内の末梢血Ａを重力によって、赤血球Ｂとそれ以外の有核細胞含有液Ｃとに分離させる。

この状態で、図７に示されるように、血液容器３を幅方向全体にわたって区画可能なクリップ１２によって、赤血球Ｂと有核細胞含有液Ｃとの境界位置近傍を挟むことにより、血液容器３内において赤血球Ｂと有核細胞含有液Ｃとが相互に混合しないように分離することができる。
この後に、図８に示されるように、血液容器３を反転させて、接続部３ａが下方に配されるようにすることにより、クリップ１２によって分離された有核細胞含有液Ｃのみを接続部３ａおよびこれに接続するチューブ１０を介して細胞捕捉フィルタ２に導入することができる。以下の作用効果は、第１参考実施形態に係る有核細胞回収装置１と同様である。

このようにすることで、従来のように遠心分離機により末梢血Ａから赤血球Ｂを分離する作業および分離後の接続部３ａとチューブ１０との接続作業を行うことなく、有核細胞を回収することができる。したがって、作業の手間を省くことができるとともに、完全に密封された無菌的な空間内において末梢血Ａから簡易に有核細胞を回収することができるという利点がある。

次に、本発明の参考例としての第２参考実施形態に係る有核細胞回収装置１″について、図９〜図１１を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第１参考実施形態に係る有核細胞回収装置１と構成を共通とする箇所には同一の符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る有核細胞回収装置１″は、図９に示されるように、血液容器３に２つの接続部３ａ，３ｃを備えている。一方の接続部３ａは、第１参考実施形態と同様にして、チューブ１０を介して第１の三方弁７に接続され、他方の接続部３ｃは、チューブ１３を介して他の容器１４に接続されている。血液容器３と容器１４との間には、両者間のチューブ１３を開閉するピンチバルブ１５が備えられている。

このように構成された本実施形態に係る有核細胞回収装置１″を用いて末梢血Ａから有核細胞を回収するには、まず、図９に示されるように、２つの接続部３ａ，３ｃに接続される２本のチューブ１０，１３のピンチバルブ８，１５をそれぞれ閉止した状態とし、接続部３ａ，３ｃを下向きにして血液容器３を１０〜３０分間懸架する。これにより、血液容器３内に収容されている末梢血Ａを、比重の違いによって赤血球Ｂと有核細胞含有液Ｃとに分離する。

この状態で容器１４に接続されたチューブ１３のピンチバルブ１５を開くことにより、血液容器３内において分離されて沈降している赤血球Ｂがチューブ１３内を下降して容器１４内に流入する。
そして、全ての赤血球Ｂが容器１４内に流入した時点で、ピンチバルブ１５によってチューブ１３を再度閉止する。

この状態で、第１の三方弁７およびピンチバルブ８を開くことにより、血液容器３に収容されている有核細胞含有液Ｃをチューブ１０を介して細胞捕捉フィルタ２に導入することができる。以下の作用効果は、第１参考実施形態と同様である。

このようにすることによっても、従来のように遠心分離機により末梢血Ａから赤血球Ｂを分離する作業および分離後の接続部３ａとチューブ１０との接続作業を行うことなく、有核細胞を回収することができる。したがって、作業の手間を省くことができるとともに、完全に密封された無菌的な空間内において末梢血Ａから簡易に有核細胞を回収することができるという利点がある。

本発明の第１参考実施形態に係る有核細胞回収装置を示す全体構成図である。 図１の有核細胞回収装置の血液容器において、（ａ）重力により赤血球を分離する作業、（ｂ）分離された赤血球を放出する作業をそれぞれ説明する図である。 図２により、赤血球を放出した血液容器を細胞捕捉フィルタに続くチューブに接続した状態を示す図である。 図３の状態からの有核細胞回収装置の作用を説明する図であり、細胞捕捉フィルタに有核細胞を捕捉させるステップを示す図である。 有核細胞回収装置の作用を説明する図であり、細胞捕捉フィルタに捕捉された有核細胞を回収容器内に回収するステップを説明する図である。 本発明の一実施形態に係る有核細胞回収装置を示す全体構成図である。 図６の有核細胞回収装置の血液容器において、重力により有核細胞含有液から分離された赤血球をクリップにより混合しないように区画するステップを説明する図である。 図７の状態からの有核細胞回収装置の作用を説明する図であり、細胞捕捉フィルタに有核細胞を捕捉させるステップを示す図である。 本発明の第２参考実施形態に係る有核細胞回収装置を示す全体構成図である。 図９の有核細胞回収装置の血液容器において、重力により有核細胞含有液から分離された赤血球を他の容器に放出するステップを説明する図である。 図１０において赤血球を除去した後の有核細胞含有液を細胞捕捉フィルタに流通させ、有核細胞を捕捉させるステップを示す図である。

符号の説明

Ａ 末梢血（細胞ソース）
Ｂ 赤血球
Ｄ 回収液
Ｅ 血小板
１，１′，１″ 有核細胞回収装置
２ 細胞捕捉フィルタ
２ａ 入口
２ｂ 出口
３ 血液容器（細胞ソース容器）
４ 回収容器
５ ドレインバッグ
６ シリンジ（回収液供給手段）
７ 第１の三方弁（第１の切替弁）
９ 第２の三方弁（第２の切替弁）

Claims (5)

1. 血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタと、
   該細胞捕捉フィルタの入口側に、第１の切替弁を介して接続され、細胞ソースを収容した細胞ソース容器および回収容器と、
   前記細胞捕捉フィルタの出口側に、第２の切替弁を介して接続され、前記細胞捕捉フィルタを透過した血小板を収容するドレインバッグおよび回収液を供給する回収液供給手段と、
   前記細胞ソース容器を区画可能なクリップとを備え、
   前記細胞ソース容器が、重力により前記細胞ソースを赤血球と有核細胞含有液とに分離し、
   前記クリップにより、前記細胞ソース容器内において分離したこれらの赤血球と有核細胞含有液とを相互に混合しないように分離させた状態で該有核細胞含有液を前記細胞捕捉フィルタに流入させる有核細胞回収装置。
2. 前記回収容器が減圧されている請求項１に記載の有核細胞回収装置。
3. 前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかである請求項１または請求項２に記載の有核細胞回収装置。
4. 容器内に収容した細胞ソースを該容器内において重力により赤血球と有核細胞含有液とに分離し、分離させた前記赤血球と前記有核細胞含有液とが相互に混合しないように、該容器をクリップにより挟んで区画する赤血球分離ステップと、
   該赤血球分離ステップにより赤血球から分離された有核細胞含有液を、血小板を捕捉せず血管新生に有効な有核細胞を捕捉する細胞捕捉フィルタに前記容器から流入させて透過させる細胞捕捉ステップと、
   回収液を前記細胞捕捉フィルタに逆方向から透過させる逆洗ステップと、
   該細胞透過フィルタを逆方向に透過した液体を回収する回収ステップとを備える有核細胞の回収方法。
5. 前記細胞ソースが、末梢血、臍帯血、骨髄液、脂肪組織または胎盤組織のいずれかである請求項４に記載の有核細胞の回収方法。

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