MXPA06011020A - Metodos y composiciones para la deteccion de una enfermedad cervical. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan metodos y composiciones para identificar una enfermedad cervical de alto grado en una muestra de un paciente; los metodos de la invencion comprenden detectar la sobreexpresion de por lo menos un biomarcador en una muestra corporal, en donde el biomarcador se sobreexpresa selectivamente en una enfermedad cervical de alto grado; en reivindicaciones particulares, la muestra corporal es un frotis cervical o monocapa de celulas cervicales; los biomarcadores de la invencion incluyen genes y proteinas que estan implicados en la regulacion del ciclo celular, transduccion de senal, y replica y trascripcion de ADN; en reivindicaciones particulares, el biomarcador es un gen de fase S; en algunos aspectos de la invencion, la sobreexpresion de un biomarcador de interes se detecta en el nivel de proteina que utilizan anticuerpos de biomarcador especifico o en el nivel de acido nucleico utilizando tecnicas de hibridacion de acido nucleico; tambien se proporcionan equipos para practicar los metodos de la invencion.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA DETECCIÓN DE UNA ENFERMEDAD CERVICAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos y composiciones para la detección de enfermedades cervicales de alto grado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El carcinoma del cuello uterino es la segunda neoplasia más común en mujeres, constituye aproximadamente 12% de todos los cánceres en mujeres y provoca aproximadamente 250,000 muertes al año. Baldwin eí al. (2003) Nature Reviews Cáncer 3:1-10. En muchos países en desarrollo en donde no están disponibles programas de un análisis sistemático en masa, el problema clínico es más grave. El cáncer cervical en estos países es la causa número uno de muertes por cáncer de mujeres. La mayor parte de los casos de cáncer cervical representan carcinoma de células escamosas, aunque también se observa adenocarcinoma. El cáncer cervical se puede evitar al examinar a la población conforme evoluciona a través de etapas intraepiteliales no invasivas bien definidas las cuales se pueden distinguir morfológicamente. Williams eí al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14932-14937. Aunque no se entiende de qué manera las células normales se transforman, el concepto de un espectro continuo de cambio histopatológico de epitelio estratificado normal hasta neoplasia intraepitelial cervical (CIN) a cáncer invasivo se ha aceptado ampliamente durante años. El precursor del cáncer cervical en la displasia, también conocido en la técnica como CIN o lesiones intraepiteliales escamosas (SIL). Las anomalías intraepiteliales escamosas se pueden clasificar mediante la utilización de un sistema de tres puertos (CIN) o dos puertos (Bethesda). Bajo el sistema Bethesda, las lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LSIL), que corresponden a infección CINI y HPV, generalmente representan infecciones HPV productivas con relativamente bajo riesgo de progreso a enfermedad invasiva. Las lesiones ¡ntraepiteliales escamosas de alto grado (HSIL), que corresponden a CINII y CINIII en el sistema de tres puertos, muestran un riesgo mayor de progreso a cáncer cervical que LSIL, aunque LSIL y HSIL se consideran como precursores potenciales de enfermedad maligna. Las muestras de los pacientes también se pueden clasificar por ASCUS (células escamosas atípicas de significancia desconocida) o AGUS (células glandulares atípicas de significancia desconocida) bajo este sistema. Una fuerte asociación de cáncer cervical e infección por tipos de alto riesgo del virus de papiloma humano (HPV), tales como los tipos 16, 18 y 31 , se ha establecido. De hecho, una gran cantidad de pruebas epidemiológicas y biológicas moleculares ha establecido la infección por HPV como un factor causal en cáncer cervical. Además, HPV se encontró en 85% o más de los casos de enfermedad cervical de alto grado. No obstante, la infección por HPV es muy común, presentándose posiblemente en 5-15% de mujeres con una edad de 30, pero algunas mujeres HPV positivas desarrollaran incluso una enfermedad cervical de alto grado o cáncer. La presencia de HPV sola es indicativa únicamente de infección, no de enfermedad cervical de alto grado y por lo tanto la prueba para infección por HPV por sí sola resulta en muchos resultados o falsos positivos. Véase, por ejemplo, Wright e a/. (2004) Obstet. Gynecol. 103:304-309. La literatura actual sugiere que HPV infecta a las células troncales básales dentro del tejido subyacente del útero-cuello uterino. La diferenciación de las células troncales en queratinocitos maduros, con la migración resultante de las células al epitelio cervical estratificado, se asocia con replicación viral por HPV y reinfección de células. Durante este procedimiento de replicación viral, se producen numerosos cambios celulares que incluyen pérdida de regulación del ciclo celular, proliferación activa, replicación de ADN, activación transcripcional e inestabilidad genómica (Crum (2000) Modern Pathology 13:243-251 ; Middleton eí al. (2003) J. Virol. 77:10186-10201 ; Pett et al. (2004) Cáncer Res. 64:1359-1368). La mayor parte de las infecciones por HPV son de naturaleza transitoria, en donde la infección viral se resuelve por sí misma dentro de un período de 12 meses. Para aquellos individuos quienes desarrollan infecciones persistentes con uno o más subtipos oncogénicos de HPV, existe el riesgo del desarrollo de neoplasia en comparación con pacientes sin infección por HPV. Dada la importancia del HPV en el desarrollo de neoplasia cervical, la detección clínica de HPV se ha vuelto una herramienta de diagnóstico importante en la identificación de pacientes en riesgo de desarrollo de neoplasia cervical. La utilidad clínica de un análisis basado en HPV para enfermedad cervical se encuentra en el valor predictivo negativo. Un resultado negativo en HPV en combinación con antecedentes de un frotis de Pap normal es un indicador excelente de una condición sin enfermedad y un riesgo bajo de desarrollo de neoplasia cervical durante 1-3 años posteriores. No obstante, un resultado HPV positivo no es diagnóstico de enfermedad cervical, más bien es una indicación de infección. Aunque la mayor parte de las infecciones por HPV son transitorias y se eliminarán espontáneamente dentro de un período de 12 meses, una infección persistente con un subtipo viral HPV de alto riesgo indica un riesgo mayor para el desarrollo de neoplasia cerivcal. Para suplementar la prueba de HPV, se espera que la identificación de marcadores moleculares asociados con neoplasia cervical mejore la especificidad clínica para el diagnóstico de enfermedad cervical. El examen ortológico de frotis cervicales teñidos de Papanicolaou (frotis Pap) actualmente es el método de elección para detectar cáncer cervical. La prueba de Pap es un método subjetivo que ha permanecido sustancialmente sin cambio durante 60 años. No obstante, existen varias preocupaciones respecto a su funcionamiento. La sensibilidad reportada de la prueba Pap única (la proporción de resultados positivos de enfermedad que sean positivos en la prueba) es bajo y muestra una amplia variación (30-87%). La especificidad de una prueba Pap única (la proporción de resultados negativos de enfermedad que sean negativos en la prueba) puede ser tan bajo como 86% en una población analizada y considerablemente menor en una población ASCUS PLUS para la determinación de la enfermedad de alto grado subyacente. Véase Baldwin eí al., supra. Un porcentaje significativo de frotis Pap caracterizados como LSIL o CINI en realidad son positivos para lesiones de alto grado. Además, hasta 10% de los frotis Pap se clasifican como ASCUS (células escamosas atípicas de significancia no determinadas), es decir, no es posible realizar una categorización clara respecto a una lesión normal, moderada o grave o un tumor. No obstante, la experiencia ha demostrado que hasta 10% de esta población ASCUS tiene lesiones de alto grado, lo cual en consecuencia son vigiladas. Véase, por ejemplo, Manos et al. (1999) JAMA 281 :1605-1610. Por lo tanto, un método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado es que independientemente de cómo funcione junto con el frotis de Pap convencional y las pruebas moleculares para infección de HPV de alto riesgo es necesario. Tal método debe ser capaz de identificar específicamente enfermedad cervical de alto grado que esté presente en todas las poblaciones de pacientes, incluyendo aquellas clasificadas como LSIL o CINI por tinción Pap que actualmente son positivas para lesiones de grado alto (es decir, "falsos negativos"). Por lo tanto, existe necesidad en la técnica de métodos de diagnóstico confiables y específicos que sean capaces de detectar enfermedad cervical de alto grado y de diferenciar enfermedad de alto grado de condiciones que no se consideren enfermedad clínica, tal como la infección por HPV en etapa temprana y displasia moderada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para el diagnóstico de enfermedad cervical de alto grado. Los métodos de la invención comprenden detectar la sobreexpresión de por lo menos un biomarcador, particularmente un biomarcador nuclear, en una muestra corporal, en donde la detección de sobreexpresión del biomarcador identifica específicamente muestras que son indicativas de enfermedad cervical de alto grado. El presente método distingue muestras que son indicativas de enfermedad cervical de alto grado de muestras que son indicativas de proliferación benigna, infección HPV en etapa temprana o displasia moderada. De esta manera, el método se basa en la detección de un biomarcador que sobreexpresa selectivamente en estados de enfermedad cervical de alto grado pero que no se sobreexpresa en células normales o células que no son indicativas de enfermedad clínica. Los biomarcadores de la invención son proteínas y/o genes que se sobreexpresan selectivamente en enfermedad cervical de alto grado, que incluyen aquellas que resultan de disfunción del ciclo celular inducido por HPV y activación de ciertos genes responsables de la inducción de la fase S. Los biomarcadores de interés particular incluye genes de la fase S, cuya sobreexpresión resulta de disfunción del ciclo celular inducido por HPV y la activación subsecuente de los factores transcripcionales SP-1 y E2F. La detección de la sobreexpresión de los genes biomarcadores o proteínas de la invención permiten la diferenciación de muestras que son indicativas de enfermedad de alto grado, tales como displasia moderada a grave y carcinomas cervicales, a partir de células normales o células que no son indicativas de enfermedad clínica (por ejemplo infección HPV en etapa temprana, ausentes de displasia o con displasia ligera). Se puede determinar la sobreexpresión de biomarcador a nivel de proteína o de ácido nucleico. En algunas modalidades, se proporcionan técnicas de inmunocitoquímica que utilizan anticuerpos para detectar la sobreexpresión de proteínas biomarcadores en muestras de citología cervical. En este aspecto de la invención, se utiliza por lo menos un anticuerpo dirigido a un biomarcador específico de interés. La sobreexpresión también se puede detectar por técnicas basadas en ácido nucleico que incluyen, por ejemplo, hibridación y RT-PCR. También se proporcionan adicionalmente equipos que comprenden reactivos para llevar a la práctica los métodos de la invención. Los métodos de la invención también se pueden utilizar en combinación con técnicas tradicionales de diagnóstico ginecológico que analizan características morfológicas o el estado de infección por HPV. Así, por ejemplo, los métodos de inmunocitoquímica que se presentan aquí se pueden combinar con la prueba Pap de manera que toda la información morfológica del método convencional se conserva. De esta manera, la detección de biomarcadores que se sobreexpresan selectivamente en enfermedad cervical de alto grado pueden reducir la elevada tasa de resultados altos negativos de la prueba Pap que pueden facilitar un análisis automatizado en masa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 proporciona un resumen esquemático de ia pérdida de regulación en la proliferación y en el ciclo celular en displasia cervical. Las alteraciones del ciclo celular y los defectos en el control de proliferación en la neoplasia cervical. La infección por HPV y la sobreexpresión de las oncoproteínas E6 y E7 producen una serie de alteraciones en el ciclo celular y control de proliferación. La oncoproteína E6 de HPV abroga los puntos de verificación del ciclo celular en los límites G1/S y G2/M con replicación subsecuente del ADN con mutaciones somáticas. E7 promueve la aceleración en la fase S con expresión prolongada de los genes de la fase S que se requieren para replicación de ADN (inducción aberrante de fase S). De igual manera, E6 promueve la expresión de telomerasa asegurando una integridad cromosómica continua del telómero durante la proliferación e inmortalización celular. Finalmente, E7 abroga la vía de señalización TGF-ß y abroga este mecanismo de control para suprimir G1 y el control de la proliferación.

La figura 2 proporciona una representación esquemática de una inducción aberrante de fase S en neoplasia cervical. Los efectos de las proteínas HPV sobre el control de ciclo celular y la proliferación incluyen inactivación de las vías supresores de los tumores p53 y Rb, activación de la transcripción E2F-1 , inducción de los genes en fase S MCM-2, MCM-6, MCM-7, TOP2A y ciclina E1 , entre otros. Además, E2 interactúa con el factor de transcripción Sp-1 para activar la expresión del gen de p21-waf-1. La figura 3 proporciona una representación esquemática del bucle de retroalimentación sobre la proliferación celular en la fase S aberrante del ciclo celular. La sobreexpresión de ciclina E y CDK2 en la fase S resulta en un mecanismo independiente para permitir la inducción de los genes en la fase S. La figura 4 proporciona una representación esquemática del papel de c-myc en la inducción de una fase S aberrante. C-myc es un activador transcripcíonal importante en la proliferación celular. El gen que codifica para c-myc se localiza en el cromosoma. Este es el mismo sitio en donde se ha documentado la integración de HPV 18 con una amplificación correspondiente de esta región del gen. La amplificación del gen c-myc puede resultar en sobreexpresión de la proteína codificada y concentraciones aumentadas de c-myc pueden contribuir de manera independiente a la transcripción del gen de la fase S acelerando adicionalmente la proliferación celular.

La figura 5 proporciona una representación esquemática de los cebadores TaqManMR dirigidos a las variantees del transcrito MCM7. La figura 6 ¡lustra el patrón de teñido diferencial de un anticuerpo dirigido a Claudin 1 en un ensayo IHC para un paciente con displasía moderada y un paciente con carcinoma de células escamosas. La figura 7 ilustra el patrón de teñido diferencial de un anticuerpo dirigido a Claudin 1 en un formato IHC e ICC. Se muestran células normales y células indicativas de CINIII y HSIL. La figura 8 ilustra patrones de teñido nucleares que se obtiene con un biomarcador nuclear (es decir, MCM2) y patrones de tinción citoplásmicos que se obtienen con un biomarcador citoplásmico (p16). Los resultados son de un ensayo de inmunocitoquímica (ICC) de una muestra de un paciente con enfermedad cervical de alto grado. La figura 9 ilustra una tinción de anticuerpo deseable y no deseable en un ensayo de ¡nmunohistoquímica (IHC) utilizando dos anticuerpos diferentes dirigidos a MCM6 sobre tejido cervical de un paciente con enfermedad cervical de alto grado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para identificar o diagnosticar enfermedad cervical de alto grado. Los métodos comprenden la detección de la sobreexpresión de biomarcadores específicos que se sobreexpresan selectivamente en enfermedad cervical de alto grado (por ejemplo displasia moderada a grave y cáncer cervical). Esto es, los biomarcadores de la invención son capaces de distinguir entre células infectadas con HPV y células infectadas con HPV que son premalignas, malignas o francamente cancerosas. Los métodos para el diagnóstico de enfermedad cervical de alto grado involucran detectar la sobreexpresión de por lo menos un biomarcador que es indicativo de una enfermedad cervical de alto grado en un tejido o una muestra de fluido corporal de un paciente. En modalidades particulares, se utilizan anticuerpos y técnicas de inmunocitoquímica para detectar la expresión del biomarcador de interés. Se proporcionan adicionalmente equipos para llevar a la práctica los métodos de la invención. Se pretende que el término "diagnóstico de enfermedad cervical de alto grado" incluye, por ejemplo, diagnóstico o detección de la presencia de enfermedad cervical, monitoreo del progreso de la enfermedad e identificación de células detectoras o muestras que son indicativas de enfermedad cervical de alto grado. Los términos diagnosticar, detectar e identificar enfermedad cervical de alto grado se utilizan de manera intercambiable en la presente. Por "enfermedad cervical de alto grado" se quiere indicar aquellas condiciones clasificadas por colposcopía como patología premaligna, patología maligna, displasia moderada a grave y cáncer cervical. La enfermedad cervical de alto grado subyacente incluye la identificación histológica de CINII, CINIII, HSIL, carcinoma in situ, adenocarcinoma y cáncer (FIGO, etapas l-IV).

Como se discute en lo anterior, un porcentaje significativo de pacientes presentan frotis de Pap clasificados como normales, CINI o ASCUS en realidad tienen lesiones características de enfermedad cervical de alto grado. Por lo tanto, los métodos de la presente invención permiten la identificación de enfermedad cervical de alto grado en todas las poblaciones de pacientes, incluyendo en estos pacientes que generan un resultado "falso negativo" y facilitan la detección de células anormales poco comunes en una muestra de paciente. El diagnóstico se puede realizar independientemente de la morfología de la célula y del estado de infección HPV, aunque los métodos de la invención también se pueden utilizar junto con técnicas de diagnóstico convencionales, por ejemplo la prueba Pap, la prueba molecular para tipos de alto riesgo de HPV, etc. Los tipos de HPV se han dividido en categorías de alto y bajo riesgo en base en su asociación con cáncer cervical y lesiones precancerosas. Los tipos HPV de bajo riesgo incluyen a los tipos 6, 11 , 42, 43, 44 y no se asocian con un riesgo aumentado de cáncer cervical. En contraste, los tipos HPV de alto riesgo incluyen a los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 68 y se han relacionado fuertemente con cáncer cervical y lesiones intraepiteliales escamosas. Véase, por ejemplo Wright eí al. (2004) Obst?t. Gynecol. 103:304-309. De hecho, más de 99% de los cánceres cervicales se asocian con infección por HPV de alto riesgo. La infección de HPV de alto riesgo persistente genera la ruptura del ciclo celular y los puntos de verificación mitóticos en células cervicales mediante la acción de los genes para HPV 2, E6 y E7. En particular, E7 de HPV provoca un incremento en la ciclina E y la liberación subsecuente del factor de transcripción E2f de la proteína de retinoblastoma (Rb). El factor de transcripción E2f liberado después activa la transcripción de una diversidad de genes en fase S, que incluyen a topoisomerasa II a (Topo2A), proteínas MCM, ciclinas E1 y E2 y p14arf, lo que resulta en pérdida del control del ciclo celular. E2 de HPV estimula adicionalmente la sobreexpresión de los genes en fase S tal como p21waf"1 por activación del factor de transcripción Sp-1. La ruptura del ciclo celular causada por infección HPV persistente puede generar una displasia cervical moderada que con frecuencia puede avanzar a displasia moderada y grave y finalmente a cáncer cervical en algunos casos. Por "cáncer cervical" se entiende cualquier cáncer o lesión cancerosa asociada con tejido cervical o células cervicales. La infección con HPV dentro de los queratinocitos cervicales resulta en muchas alteraciones que interrumpen las actividades dentro del ciclo celular. Las oncoproteínas E6 y E7 de los subtipos HPV de alto riesgo se han implicado en numerosos procedimientos celulares relacionados con una proliferación aumentada y transformación neoplásica de los queratinocitos infectados. La proteína E6 se ha implicado en dos procedimientos críticos. El Iniciadoro es la degradación de la proteína supresora del tumor p53 mediante proteólisis mediada por ubiquitina. La eliminación de p53 funcional elimina un punto de verificación de ciclo celular mayor responsable de la reparación de ADN antes de entrar en la replicación de ADN y mitosis (Duensing y Munger (2003) Prog Cell Cycle Res. 5:383-391 ). Además, se ha demostrado que E6 interactúa con la proteína c-myc y es responsable de la activación transcripcional directa del gen hTERT con expresión subsecuente de telomerasa (McMurray y McCance (2003) J Virol. 77:9852-9861 ; Veldman eí al. (2003) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100:8211-8216). La activación de telomerasa es una etapa clave en la biología del cáncer responsable del mantenimiento de la longitud del telórnero en los cromosomas en replicación y esta enzima asegura cromosomas funcionalmente intactos durante la inmortalización celular. La oncoproteína E7 de HPV se sabe que contribuye a la proliferación celular a través de dos mecanismos independientes. El Iniciadoro es la activación de la vía del supresor de tumor TGF-ß responsable de la supresión del ciclo celular en la fase G1 a través de interacción directa de E7 con proteínas Smad (Smad 2, 3 y 4), y de esta manera se inhibe la capacidad de unirse a ADN (Lee eí al. (2002) J Biol Chem. 277:38557-38564). De igual manera, se sabe que E7 interactúa específicamente con la proteína supresora de tumor Rb. Dentro de la fase G1 del ciclo celular, Rb forma complejo con el factor de transcripción E2F y evita que E2F active la transcripción del gen. En el límite G1/S, la proteína Rb es fosforilada con liberación del factor de transcripción E2F - por lo que se inicia la transcripción del gen E2F y la entrada en la fase S del ciclo celular. La oncoproteína G7 de HPV abroga este mecanismo de control por unión directa con Rb y desplaza a E2F del complejo. Esto resulta en que la transcripción del gen impulsada por E2F es independiente del control del ciclo de célula normal (Duensing y Munger (2003) Prog Cell Cycle Res. 5:383-391 ; Duensing y Munger (2004) Int J Cáncer 109:157-162; Clarke y Chetty (2001 ) Gynecol Oncol 82:238-246). Esta liberación de E2F desacopla la transcripción del gen del control del ciclo celular y resulta en una transcripción prolongada y aberrante de genes de la fase S para síntesis de ADN y proliferación celular. Además, se ha demostrado que las acciones combinadas tanto de E6 como de E7 contribuyen a anomalías en el centrómero y la inestabilidad genómica subsecuente en la neoplasia cervical (Duensing y Munger (2004) ¡nt J Cáncer 109:157-162). Aunque no se pretende estar limitado por un mecanismo particular, en algunas modalidades, se puede caracterizar el comportamiento molecular de la enfermedad cervical de alto grado como la sobreexpresión de genes definidos, que normalmente se expresan únicamente durante la fase S del ciclo celular, como un resultado de la infección por las cepas oncogénicas de HPV. La activación subsecuente sin control de la transcripción del gen y la inducción de fase S aberrante es mediada a través de la vía del factor de transcripción E2F-1. Este comportamiento parece ser indicativo de enfermedad cervical de alto grado y proporciona un enlace entre las infecciones HPV oncogénica y el comportamiento molecular de la neoplasia cervical. El uso de estos biomarcadores moleculares de neoplasias cervical es en formatos de ensayo de diagnóstico molecular puede mejorar la detección de enfermedad cervical con una sensibilidad y especificidad mejoradas con respecto a los métodos actuales. Véase de manera general, las figuras 1-4 y Malinowski (2005) BioTechniques 38:1-8 (en preparación), el cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Por lo tanto, en modalidades particulares, un método para el diagnóstico de enfermedad cervical de alto grado comprende detectar la sobreexpresión de un biomarcador, en donde la sobreexpresión del biomarcador es indicativa de una inducción aberrante de fase S, como se describe en la presente. En otras modalidades adicionales, los métodos comprenden detectar la sobreexpresión de un biomarcador, en donde la sobreexpresión del biomarcador es indicativa de transcripción activa o sobrexpresión de los genes E6 de HPV y E7 de HPV. La displasia se define convencionalmente en términos morfológicos por una pérdida de orientación normal de las células epiteliales, acompañado por alteraciones en las características celulares y de tamaño de núcleo, forma y tinción. Se considera la displasia de acuerdo con el grado de las anomalías celulares (es decir, ligera, moderada, grave) y se acepta ampliamente que existe una etapa intermedia en el avance desde el tejido normal a la neoplasia, como se vuelve evidente por la identificación de condiciones displásicas premalignas tales como CIN. Los métodos de la presente invención permiten la identificación de enfermedad cervical de alto grado, lo cual incluye displasia moderada a grave y cáncer cervical (es decir, las condiciones CINII y anteriores) en base en la sobreexpresión de biomarcadores que son específicos para enfermedad cervical de alto grado.

Los métodos que se describen en la presente proporcionan una detección superior de enfermedad cervical de alto grado en comparación con los frotis Pap y/o la prueba de infección por HPV. En aspectos particulares de la invención, la sensibilidad y especificidad de los métodos actuales son iguales o mayores que los de un frotis Pap convencional. Como se utiliza en la presente, el término "especificidad" se refiere a un nivel en el cual el método de la invención puede identificar con precisión muestras que se han confirmado por NIL o colposcopía (es decir, resultados negativos verdaderos). Es decir, la especificidad es la proporción de resultados negativos de enfermedad que son negativos en la prueba. En un estudio clínico, la especificidad se calcula al dividir el número de resultados negativos verdaderos entre la suma de resultados negativos verdaderos y positivos falsos. Mediante el término "sensibilidad" se pretende que el nivel al cual el método de la invención puede identificar con precisión muestras que se han confirmado por colposcopía como positivas para enfermedad cervical de alto grado (es decir, positivos verdaderos). De esta manera, la sensibilidad es la proporción de resultados positivos a enfermedad que son positivos en la prueba. Se calcula la sensibilidad en un estudio clínico al dividir el número de resultados positivos verdaderos entre la suma de resultados positivos verdaderos y negativos falsos. Véanse los ejemplos 1-3 a continuación. En algunas modalidades, la sensibilidad de los métodos descritos para la detección de enfermedad cervical de alto grado preferiblemente es de por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o mayor. De manera adicional, la especificidad de los presentes métodos preferiblemente es de por lo menos aproximadamente 70%, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o mayor. El término "valor de predicción positivo" o "PPV" se refiere a la probabilidad de que un paciente presente enfermedad cervical de alto grado cuando se limita a aquellos pacientes quienes han sido clasificados como positivos utilizando un método de la invención. Se calcula PPV en un estudio clínico al dividir el número de resultados positivos verdaderos entre la suma de los resultados positivos verdaderos y positivos falsos. En algunas modalidades, el PPV de un método de la invención para el diagnóstico de enfermedad cervical de alto grado es de por lo menos aproximadamente 40%, mientras que el mantenimiento de la sensibilidad de por lo menos aproximadamente 90% o más, particularmente por lo menos aproximadamente 95%. El "valor de predicción negativo" o "NPV" de una prueba es la posibilidad de que un paciente no tenga la enfermedad cuando se limita a todos los pacientes con un resultado de prueba negativo. Se calcula NPV en un estudio clínico al dividir el número de resultados negativos verdaderos entre la suma de resultados negativos verdaderos y negativos falsos.

Los biomarcadores de la invención incluyen genes y proteínas, y variantees y fragmentos de los mismos. Tales biomarcadores incluyen ADN que comprende la secuencia completa o parcial de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el biomarcador, o el complemento de dicha secuencia. Los ácidos nucleicos biomarcadores también incluyen ARN que comprende la secuencia completa o parcial de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de interés. Una proteína biomarcadora es una proteína codificada por, o que corresponde a un biomarcador de ADN de la invención. Una proteína biomarcadora comprende ¡a totalidad o la secuencia de aminoácidos parcial de cualquiera de las proteínas o polipéptidos biomarcadores. Un "biomarcador" es cualquier gen o proteína cuyo nivel de expresión en un tejido o célula está alterado en comparación con el de una célula o tejido normal o sana. Los biomarcadores de la invención son selectivos para enfermedades cervicales de alto grado subyacentes. Mediante el término "sobreexpresada selectivamente en enfermedad cervical de alto grado" se pretende que el biomarcador de interés se sobreexprese en enfermedades cervicales de alto grado pero que no se sobreexprese en condiciones clasificadas como LSIL, CINI, muestras infectadas con HPV sin ninguna displasia presente, células metaplásicas inmaduras y otras condiciones que no se consideren que sean enfermedad clínica. De esta manera, la detección de los biomarcadores de la invención permite la diferenciación de muestras indicativas de una enfermedad cervical de alto grado subyacente en comparación con las muestras que son indicativas de proliferación benigna, infección por HPV en la etapa temprana o displasia ligera. Mediante el término "infección por HPV en etapa temprana" se pretende indicar infección HPV que no ha progresado a displasia cervical. Como se utiliza en la presente, una "displasia ligera" se refiere a LSIL y CINI en donde no está presente una lesión de alto grado. Los métodos de la invención también distinguen células indicativas de enfermedad de alto grado de células normales, células metaplásicas inmaduras y otras células que no son indicativas de enfermedad clínica. De esta manera, los métodos de la invención permiten la identificación precisa de enfermedad cervical de alto grado, incluso en casos de que estén clasificadas erróneamente como normales, CIN, LSIL o ASCUS por la prueba de Pap tradicional (es decir, resultados "falsos negativos"). En algunas modalidades, los métodos para el diagnóstico de enfermedad cervical de alto grado se realiza como un reflejo a un frotis Pap anormal o atípico. Esto es, los métodos de la invención se pueden realizar en respuesta a un paciente que tiene un resultado de frotis Pap anormal o atípico. En otros aspectos de la invención, los métodos se realizan como una prueba de análisis primario para enfermedad cervical de alto grado en una población general de mujeres, al igual que la prueba Pap convencional como actualmente se lleva a cabo. Los biomarcadores de la invención incluyen cualquier gen o proteína que se sobreexpresa selectivamente en una enfermedad cervical de alto grado, como se define en lo anterior. Tales biomarcadores son capaces de identificar células dentro de una suspensión de células de citología que son premalignas, malignas o francamente cancerosas. Los biomarcadores de la invención detectan células de condiciones CINII y anteriores, pero no detectan células CINI e infectadas con HPV, en donde no hay una enfermedad de alto grado subyacente. Los biomarcadores de interés particular incluyen genes y proteínas involucradas en la regulación del ciclo celular, ruptura de HPV del ciclo celular, replicación y transcripción de ADN y transducción de señal. En algunas modalidades, los biomarcadores son genes en fase S, que incluyen aquellos genes cuya expresión es estimulada por el factor de transmisión E2f o el factor de transcripción Sp-1. Se pueden utilizar biomarcadores nucleares para llevar a la práctica ciertos aspectos de la invención. Por el término "biomarcador nuclear" se quiere indicar un biomarcador que se expresa de manera predominante en el núcleo de la célula. Un biomarcador nuclear se puede expresar en un menor grado en otras partes de la célula. Aunque se puede utilizar cualquier biomarcador indicativo de enfermedad cervical de alto grado, en la presente invención, en algunas modalidades los biomarcadores, particularmente biomarcadores nucleares, se seleccionan del grupo que consiste de MCM2, MCM6, MCM7, p21waf1, topoisomerasa II a (Topo2A), p14arf y ciclina E. Más particularmente, el biomarcador puede comprender una proteína MCM. Las proteínas de mantenimiento de minicrosoma (MCM) juegan una parte esencial en la replicación de ADN eucariótico. Las proteínas de mantenimiento de minícrosoma (MCM) funcionan en las etapas tempranas de replicación de ADN mediante el cargado del complejo de prerreplicación sobre ADN y que funcionan como una helicasa para ayudar al desenrollado de ADN dúplex durante la síntesis de novo de la cadena de ADN duplicada. Cada una de las proteínas MCM tiene motivos de ATPasa dependientes de ADN en su dominio central altamente conservado. Los dominios de proteína MCG generalmente aumentan de una manera variable conforme las células normales progresan desde GO a la fase G1/S del ciclo celular. En la fase GO, las proteínas MCM2 y MCM5 son mucho menos abundantes que las proteínas MCM7 y MCM3. MCM6 forma un complejo con MCM2, MCM4 y MCM7, el cual une la histona H3. Además, el subcomplejo de MCM4, MCM6 y MCM7 tiene actividad de helicasa, la cual es mediada por la actividad de unión de ATP de MCM6 y la actividad de unión de ADN de MCM4. Véase, por ejemplo Freeman et al. (1999) Clin. Cáncer Res. 5:2121-2132; Lei et al. (2001 ) J. Cell Sci. 114:1447-1454; Ishimi eí al. (2003) Eur. J. Biochem. 270:1089-1101 , la totalidad de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Las publicaciones iniciales han demostrado que las proteínas MCM, y en particular MCM-5 son útiles para la detección de enfermedad cervical (Williams eí al. (1998) Proc. Natl Acad Sci U.S.A. 95:14932-14937), así como de otros cánceres (Freeman eí al. (1999) Clin Cáncer Res. 5:2121-2132). La literatura publicada indica que los anticuerpos para MCM-5 son capaces de detectar células neoplásicas cervicales. La especificidad para detección de enfermedad cervical de alto grado no ha sido demostrado para MCM-5 (Williams eí al. ( 998) Proc Natl Acad Sci U.S.A 95:14932-14937). La detección de la expresión de MCM-5 no se limita a una enfermedad cervical de alto grado sino que también se detecta en displasia identificada de bajo grado y células proliferativas que han vuelto a entrar al ciclo celular después de la infección con HPV de alto riesgo. La detección de neoplasia cervical con anticuerpos para MCM-5 se muestra en la figura 4. Además de MCM-5, se ha demostrado que otros miembros de la familia MCM, que incluyen a MCM-2 y MCM-7 son marcadores potencialmente útiles para la detección de neoplasia cervical en muestras de tejido (Freeman eí al. (1999) Clin Cáncer Res. 5:2121-2132; Brake eí al. (2003) Cáncer Res. 63:8173-8180). Los resultados recientes han demostrado que MCM-7 parece ser un marcador específico para la detección de enfermedad cervical de alto grado utilizando formatos de ¡nmunoquímica (Brake et al. (2003) Cáncer Res. 63:8173-8180; Malinowski eí al. (2004) Acta Cytol. 43:696). La topoisomerasa II a (Topo2a) es una enzima nucler esencial involucrada en la replicación de ADN y es un objetivo de muchos medicamentos anticancerígenos utilizados para la terapia contra el cáncer. La expresión disminuida de Topo2a es un mecanismo predominante de resistencia a varios agentes quimioterapéuticos. Una variación significativa en el intervalo de expresión de esta proteína se ha observado en muchos tumores diferentes. Topo2a predomina en células en proliferación y se modifica en fase M por fosforilación en los sitios específicos, lo cual es crítico para la condensación y segregación de cromosoma mitótico.

La proteína p21 es una codificada por el gen WAF1/Cip1 en el cromosoma 6p. Se ha demostrado que este gen inhibe la actividad de varios complejos de ciclina/cíclina dependiente de cinasa y que bloquean el progreso del ciclo celular. La expresión de p21waf1 media la función de supresión del ciclo celular de p53. Debido a que p21 parece mediar varias de las funciones reguladoras del crecimiento de p53, su expresión puede reflejar el estado funcional de p53 con mayor precisión que la acumulación de p53. Además, p21waf1 puede inhibir la replicación de ADN al bloquear la acción de antígeno nuclear de céluias en proliferación (PCNA). La ciclina E es una subunidad reguladora de cdk-2 y controla la transición G1/S durante el ciclo de células de mamífero. Las múltiples ¡soformas de ciclina E se expresan únicamente en tumores pero no en tejidos normales, lo que sugiere una regulación postranscripcional de ciclina E. Los análisis in vitro indican que estas isoformas de variantee truncada de ciclina E son capaces de fosforilar histona H1. Las alteraciones en las proteínas ciclina E se han implicado como indicadores de pronóstico pobre en diversos cánceres. Aunque se han discutido con detalle los biomarcadores anteriores, en la práctica de la invención se puede utilizar cualquier biomarcador que se sobreexprese en estados de enfermedad cervical de alto grado (por ejemplo CINII, CINIII y carcinomas cervicales). Otros biomarcadores de interés incluyen genes regulados en el ciclo celular que son específicos para el límite de la fase G1/S o para la fase S. Tales genes incluyen, pero no se limitan a helicasa (DDX11), uracilo ADN glicolasa (UNG), E2F5, ciclina E1 (CCNE1), ciclina E2 (CCNE2), CDC25A, CDC45L, CDC6, p21 WAF-1 (CDKN1A), CDKN3, E2F1 , MCM2, MCM6, NPAT, PCNA, asa de vastago BP (SLBP), BRCA1 , BRCA2, CCNG2, CDKN2C, dihidrofolato reductasa (DHFR), histona H1 , histona H2A, histona H2B, histona H3, histona H4, MSH2, NASP, ribonucleótido de reductasa M1 (RRM1 ), ribonucleótido reductasa M2 (RRM2), timidina sintetasa (TYMS), factor C4 de replicación (RFC4), RAD51 , factor 1A de cromatina (CHAF1A), factor 1 B de cromatina (CHAF1 B), topoisomerasa lll (TOP3A), ORC1 , primasa 2A (PRIM2A), CDC27, primasa 1 , (PRIM1 ), endonucleasa de estructura de aleta (FEN1 ), comp.grp A de anemia fanconi (FNACA), PKMYT1 y proteína de replícación A2 (RPA2). Véase, por ejemplo, Whitfield eí al. (2002) Mol. Biol. Cell 13:1977-2000, incorporado en la presente como referencia en su totalidad. Otros genes en fase S de interés incluyen a cinasa 2 dependiente de ciclina (CDK2), MCM3, MCM4, MCM5, ADN polimerasa I a (ADN POL1), ADN ligasa 1 , B-Myb, ADN metiltransferasa (ADN MET), pericentrina (PER), KIF4, DP-1 , ID-3, proteína de unión de RAN (RANBP1 ), conexión comunicante a 6 (GJA6), aminolevulinato deshidratasa (ALDH), histona 2A Z (H2A.Z), espermina sintasa (SpmS), proliferina 2, proteína de activación de linfocitos T, fosfolipasa A2 (PLA2) y antígeno L6 (L6). Véase, por ejemplo, Nevins eí al. (2001 ) Mol. Cell. Biol. 21 :4689-4699, incorporada en la presente como referencia. En algunos aspectos de la invención, los biomarcadores comprenden genes que son inducidos por el factor de transcripción E2f. Tales genes incluyen, pero no se limitan a timidilato sintasa, timidina cinasa 1 , ribonucleótido reductasa M1 , ribonucleótido reductasa M2, CDK2, ciclina E, MCM3, MCM7, PCNA, subunidad pequeña de ADN primasa, topoisomeras II A (Topo2A), ADN ligasa 1 , flap endonucleasa 1 , RAD51 , CDC2, ciclina A2, ciclina B1 , ciclina B2, KI-67, KIFC1, FIN16, BUB1 , ¡mportina a-2, HMG2, mejorador de zeste, STK-1 , histona del tallo-asa BP, Rb, P18-INK4C, anexina VIII, c-Myb, CDC25A, ciclina D3, ciclina E1 , desoxicitosina cinasa, DP-1 , enzima convertidora de endotelina, enolasa 2, P18 INK4C, ribonucleótido reductasa y uracilo ADN glicolasa 2. Véase, por ejemplo Nevins eí al., supra; Muller eí al. (2000) Genes and Dev. 15:267-285. En modalidades particulares, el biomarcador de interés es un gen inducido por el factor de transcripción E2f que esté involucrado en la regulación del ciclo celular y replicación del ADN tal como, por ejemplo, ciclina E2, Ki-67, p57KIP2, RANBPM y proteína de replicación A1. Algunos genes inducidos por E2f de interés están involcurados en apoptósis e incluyen APAF1 , Bcl-2, caspasa 3, MAP3 cinasa 5 y factor asociado al receptor de TNF. Otros genes inducidos por E2f están involucrados en la regulación de la transcripción e incluyen, por ejemplo, similar a ash2, polihomeótico 2, proteína ecodérmica embriónica, mejorador de zeste, piloso/mejorador de división, caja homeótica A10, caja homética A7, caja homeótica A9, homeodominio TF1 y FT3 de leucemia prelinfocitos B, YY1 TF, dominio POU, TAFII130, factor 172 de TBP, TF3 básico, bromodominio/dedo de zinc, SWI/SNF, ID4, TEA-4, NFATC1 , NFATC3, BT, CNC-1 , MAF, MAFF, MAFG, proteína de unión de núcleo, factor 4 similar a E74, c-FOS, JUNB, dedo de zinc de ADN BP, y transactivador Cbp/p300. Los genes inducidos por E2f involucrados en la transducción de señal también son biomarcadores potenciales de interés e incluyen TGF ß, follistatina, proteína 2 morfogenética de hueso, receptor BMP tipo 1A, homólogo frizzled 1 , WNT10B, esfingosina cínasa 1 , fosfatasa 7 de especificidad doble, fosfatasa de especificidad doble (Y), receptor 3 de FGF, proteína tirosina fosfatasa, fosfatasa D6655 de especificidad doble (Y), receptor de insulina, proliferación 1 de linfocito T maduro, receptor FGF, TGF a, proteína 3 efectora de CDC42, Met, CD58, CD83, TACC1 y TEAD4. Aunque los métodos de la invención requieren la detección de por lo menos un biomarcador en una muestra del paciente para la detección de enfermedad cervical de alto grado, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más biomarcadores se pueden utilizar para llevar a la práctica la presente invención. Se reconoce que la detección de más de un biomarcador en una muestra de cuerpo se puede utilizar para identificar instancias de enfermedad cervical de alto grado. Por lo tanto, en algunas modalidades, se utilizan dos o más biomarcadores, de manera más preferible dos o más biomarcadores complementarios. Por "complementario" se quiere indicar que la detección de la combinación de biomarcadores en una muestra de cuerpo resulta en una identificación exitosa de enfermedad cervical de alto grado en un porcentaje mayor de casos que los que se identificarían si únicamente se utilizara uno de los biomarcadores. Así, en algunos casos se puede realizar una determinación más precisa de enfermedad cervical de alto grado mediante la utilización de por lo menos dos biomarcadores. En consecuencia, en donde se utilizan por lo menos dos biomarcadores, por lo menos dos anticuerpo dirigidos a proteínas biomarcadoras distintas se utilizarán para llevar a la práctica los métodos de inmunocitoquímica descritos en la presente. Los anticuerpos se pueden poner en contacto con la muestra corporal de manera simultánea o concurrente. En algunos aspectos de la invención, la sobreexpresíón de MCM2 y Topo2A se detecta utilizando tres anticuerpos, en donde dos de los anticuerpos son específicos para MCM2 y el tercer anticuerpo es específico para Topo2A. En modalidades particulares, los métodos de diagnóstico de la invención comprenden recolectar una muestra cervical de un paciente, poner en contacto una muestra con por lo menos un anticuerpo específico para un biomarcador de interés y detectar la unión del anticuerpo. Las muestras que presentan sobreexpresión del biomarcador de la invención, determinado por detección de unión de anticuerpo, se consideran positivas para enfermedad cervical de alto grado. En modalidades particulares, la muestra corporal es una monocapa de células cervicales. En algunos aspectos de la invención, la monocapa de células cervicales se proporciona en un portaobjetos de vidrio. Mediante el término "muestra corporal" se pretende que cualquier conjunto de muestras, tejido o fluidos corporales en los cuales se pueda detectar la expresión del biomarcador. Los ejemplos de tales muestras corporales incluyen, pero no se limitan a sangre, líquido linfático, orina, fluidos ginecológicos, biopsias y frotis. Las muestras corporales se pueden obtener de un paciente por una diversidad de técnicas que incluyen, por ejemplo, por raspado o frotis de un área o mediante el uso de una aguja para aspirar fluidos corporales. Los métodos para recolectar las diversas muestras corporales son bien conocidas en el arte. En modalidades particulares, la muestra corporal comprende células cervicales, como muestras de tejido cervical o como células cervicales en suspensión, particularmente en una preparación basada en líquido. En una modalidad, las muestras cervicales se recolectan de acuerdo con las líneas de guía de preparación de espécimen citológico basado en líquido tal como, por ejemplo, la preparación SurePathMR, (TriPath Imaging, Inc.) o ThinPrepMR (CYTYC, Inc.). Las muestras corporales se pueden transferir a un portaobjetos de vidrio para ser observadas por ampliación. Las soluciones fijadas y teñidas se pueden aplicar a las células sobre un portaobjetos de vidrio para conservar el espécimen y para facilitar el examen. En una modalidad, la muestra cervical se recolecta y procesa para proporcionar una muestra de monocapa, como se establece en la patante de E.U.A. No. 5,346,831 , incorporado en la presente como referencia. El método de monocapa se relaciona con un método para producir una monocapa de material citológico en un sustrato cargado catiónicamente. El método comprende las etapas de separar el material citológico por centrifugación sobre un gradiente de densidad, producir un sedimento empacado del material citológico, mezclar el sedimento del material citológico, extraer una alícuota de un volumen predeterminado a partir de sedimento mezclado, depositar la alícuota y un volumen predeterminado de agua en un recipiente de sedimentación, el cual se fija de manera separable a un sustrato cargado catiónicamente, permitir que el material citológico se sedimente sobre el sustrato por la fuerza de gravedad y después de la sedimentación del material citológico, separar el agua del recipiente de sedimentación. Para análisis de automatizado, el recipiente de sedimentación se puede separar el sustrato. La separación se puede realizar por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica como por ejemplo tratamiento con jeringa, tripsinización, tratamiento por ultrasonido, agitación, remolino o mediante el uso del dispositivo descrito en la patente de E.U.A. copendiente 5,316,814, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia. En algunas modalidades, el portaobjetos comprende una monocapa de células SurePathMR, (TriPath Imaging, Inc.) utilizando el procesador del portaobjetos PrepStainMR (TriPath Imaging, Inc.). Cualquiera de los métodos disponibles en la técnica para la identificación o detección de los biomarcadores están incluidas en la presente. La sobreexpresión de un biomarcador de la invención se puede detectar a nivel de ácido nucleico o a nivel de proteína. Para determinar la sobreexpresión, la muestra corporal que se va a examinar se puede comparar con una muestra corporal correspondiente que se origina de una persona sana. Esto es, el nivel "normal" de expresión es el nivel de expresión del biomarcador en células cervicales de un sujeto humano o un paciente quien no está afligido por la enfermedad cervical de alto grado. Tal muestra puede estar presente en forma estandarizado. En algunas modalidades, particularmente cuando la muestra corporal comprende una monocapa de células cervicales, la determinación de la sobreexpresión del biomarcador no requiere comparación entre la muestra corporal y una muestra corporal correspondiente que se origina de una persona sana. En esta situación, la monocapa de células cervicales de un solo paciente puede contener tan pocas como 1-2 células anormales por 50,000 células normales presentes. La detección de estas células anormales, identificadas por su sobreexpresíón de un biomarcador de la invención, evita la necesidad de comparación con una muestra corporal correspondiente que se origine de una persona sana. Los métodos para detectar biomarcadores de la invención comprenden cualquier método que determine la cantidad o la presencia de los bíomarcadores ya sea a nivel de ácido nucleico o proteínas. Tales métodos son bien conocidos en el arte e incluyen pero no se limitan a transferencia Western, transferencia Northern, transferencia Southern, ELISA, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, citometría de flujo, ¡nmunocitoquímica, técnicas de hibridación de ácido nucleico, métodos de transcripción inversos de ácido nucleico y métodos de amplificación de ácido nucleico. En modalidades particulares, la sobreexpresión de un biomarcador se detecta a nivel de proteína utilizando, por ejemplo, anticuerpos que se dirigen contra proteínas biomarcadoras específicas. Estos anticuerpos se pueden utilizar en diversos métodos tales como transferencia Western, ELISA, inmunoprecipítación o técnicas de inmunocitoquímica. De igual manera, la ¡nmunotensión de frotis cervicales se puede combinar con métodos de tinción de Pap convencionales de manera que se pueda obtener información morfológica e información ¡nmunocitoquímica. De esta manera, la detección de los biomarcadores puede reducir la tasa de altos resultados negativos falsos de la prueba del frotis Pap y puede facilitar el análisis automatizado en masa. En una modalidad, los anticuerpos específicos para proteínas biomarcadoras se utilizan para detectar la sobreexpresión de una proteína biomarcadora en una muestra corporal. El método comprende obtener una muestra corporal de un paciente, poner en contacto la muestra corporal con por lo menos un anticuerpo dirigido a un biomarcador que se sobreexpresa selectivamente en enfermedad cervical de alto grado y detectar la unión de anticuerpo para determinar si el biomarcador se sobreexpresa en la muestra del paciente. Un aspecto preferido de la presente invención proporciona una técnica de inmunocitoquímica para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado. Específicamente, este método comprende el teñido por anticuerpo de biomarcadores dentro de una muestra de pacientes que es específica para enfermedad cervical de alto grado. Una persona experta reconocerá que el método de inmunocitoquímica descrito en la presente en lo que sigue se puede llevar a cabo manualmente o de manera automatizada utilizando, por ejemplo, el sistema de teñido Autostainer Universal Staining (Dako) o el Biocare Nemeses Autostainer (Biocare). En el Ejemplo 1 se proporciona un protocolo de teñido de anticuerpo (es decir, inmunocitoquímica) de muestras cervicales.

En un método de inmunocitoquímica preferido, se recolecta una muestra cervical de un paciente en un medio líquido tal como, por ejemplo, en un frasco de recolección SurePatMR (TriPath Imaging, Inc.). Se utiliza un procesador automatizado tal como el sistema PrepStainMR (TriPath Imaging, Inc.) para recolectar células a partir del medio líquido y para depositarlo en una capa delgada sobre un portaobjetos de vidrio para análisis posterior. Los especímenes de portaobjeto se pueden fijar o pueden estar sin fijar y se pueden analizar inmediatamente después de la preparación o se pueden almacenar para análisis posterior. En algunas modalidades, los portaobjetos preparados se almacenan en etanol 95% por un mínimo de 24 horas. De manera alternativa, en otras modalidades, los portaobjetos se almacenan en un amortiguador de pretratamiento, como se describe en lo siguiente. Las muestras pueden necesitar ser modificadas con el fin de volver accesibles los antígenos biomarcadores para la unión de anticuerpo. En un aspecto particular de los métodos de ¡nmunocitoquímica, los portaobjetos se transfieren a un amortiguador de pretratamiento, por ejemplo amortiguador de preparación SureSIideMR (Tripath Imaging, Inc.) y opcionalmente se calientan para aumentar ia accesibilidad de antígeno. El calentamiento de la muestra en el amortiguador de pretratamiento rompe rápidamente la etapa lipídica de las células y vuelve a los antígenos (es decir, las proteínas biomarcadoras) más accesibles para unión del anticuerpo. El amortiguador de pretratamiento puede comprender un polímero, un detergente o un tensioactivo no iónico o aniónico tal como, por ejemplo, un tensioactivo aniónico o no ¡ónico etoxilado, un alcanoato o un alcoxilato o incluso combinaciones de estos tensioactivos o incluso el uso de una sal biliar. En modalidades particulares, el amortiguador de pretratamiento comprende un detergente no iónico o aniónico, tal como alcanoato de sodio con un peso molecular aproximado de 183 kD combinado con un alcoxilato con un peso molecular aproximado de 370 kD (a continuación denominado como RAM). En una modalidad particular, el amortiguador de pretratamiento comprende RAM 1 %. En algunas modalidades, el amortiguador de pretratamiento también se puede utilizar como un amortiguador de almacenamiento de portaobjetos, como se indica en lo anterior. En otra modalidad se utiliza una solución de 0.1% a 1% de monohidrato de la sal de sodio de ácido desoxicólico como amortiguador de almacenamiento así como amortiguador de pretratamiento. En otra modalidad adicional de la invención se puede utilizar como amortiguadores de almacenamiento y pretratamiento una solución de lauret-13-carboxilato de sodio (por ejemplo Sandopan LS) o un complejo aniónico etoxilado o incluso un ácido carboxílico de etoxilato de alquilarilo. En un aspecto particular de la invención, el amortiguador de pretratamiento del portaobjetos comprende 0.05% a 5% de lauret-13-carboxiIato de sodio, particularmente 0.1 % a 1% de lauret-13-carboxilato de sodio, más particularmente 0.5% de lauret-13-carboxilato de sodio. En una modalidad, ios portaobjetos se pueden almacenar en el amortiguador hasta por 72 horas antes de los procedimientos de pretratamiento y teñido. Los amortiguadores de pretratamiento de la invención se pueden utilizar en métodos para producir antígenos más accesibles para la unión de anticuerpo en un inmunoensayo, tal como por ejemplo un método de ¡nmunocitoquímica o un método de inmunohistoquímica. Véase el Ejemplo 14. Los términos "amortiguador de pretratamiento" y "amortiguador de preparación" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un amortiguador que se utiliza para preparar muestras de citología o histología para inmunotinción, particularmente al aumentar la accesibilidad del antígeno para unión del anticuerpo. En la práctica de la invención se puede utilizar cualquier método para hacer que los antígenos sean más accesibles para unión de anticuerpo, que incluye los métodos de recuperación de antígeno conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bibbo et al. (2002) Acta Cytol. 46:25-29; Saqi et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bibbo eí al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11 , incorporado en la presente como referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la recuperación de antígeno comprende almacenar los portaobjetos en etanol 95% durante por lo menos 24 horas, sumergir los portaobjetos en un baño de solución de recuperación objetivo 1X pH 6.0 (DAKO S1699)/dH20 o precalentado a 95°C y colocar los portaobjetos en un vaporizador durante 25 minutos. Véase Ejemplo 2 siguiente. Después del pretratamiento o la recuperación de antígeno para aumentar la accesibilidad del antígeno, las muestras se bloquean utilizando un agente bloqueador apropiado, por ejemplo, un reactivo bloqueador de peroxidasa tal como peróxido de hidrógeno. En algunas modalidades, las muestras se bloquean utilizando un reactivo bloqueador de proteína para evitar la unión no específica del anticuerpo. El reactivo de bloqueo de proteína puede comprender, por ejemplo, caseína purificada. Un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal, dirigido a un biomarcador de interés después se incuba con la muestra. Como se indica en lo anterior, una persona experta en la técnica apreciará que se puede obtener un diagnóstico más preciso de una enfermedad cervical de alto grado en algunos casos al detectar más de un biomarcador en una muestra de paciente. Por lo tanto, en modalidades particulares, se utilizan por lo menos dos anticuerpos dirigidos a dos biomarcadores distintos para detectar enfermedad cervical de alto grado. Cuando se utiliza más de un anticuerpo, estos anticuerpos se pueden agregar a una muestra única secuencialmente como reactivos de anticuerpo individuales o simultáneamente como una combinación de anticuerpos. Véase Ejemplo 3 más adelante. De manera alternativa, cada anticuerpo individual se puede agregar a una muestra separada del mismo paciente y los datos resultantes se pueden acumular. En modalidades particulares, una combinación de anticuerpos comprende por lo menos tres anticuerpos, en donde dos anticuerpos se unen espescíficamente a MCM2 y un tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A. Las técnicas para detectar unión de anticuerpo son bien conocidas en el arte. La unión de anticuerpo a un biomarcador de interés se pueden detectar mediante el uso de reactivos químicos que generan una señal detectable que corresponde al nivel de unión de anticuerpo y en consecuencia al nivel de expresión de proteína biomarcadora. En uno de los métodos de inmunocitoquímica de la invención, se detecta la unión de anticuerpo mediante el uso de un anticuerpo secundario que se conjuga a un polímero marcado. Los ejemplos de polímeros marcados incluyen, pero no se limitan a conjugados de polímeros-enzima. Las enzimas en estos complejos típicamente se utilizan para catalizar la deposición de un cromógeno en el sitio de unión de antígeno-anticuerpo y de esta manera resultan en teñido de células que corresponde al nivel de expresión del biomarcador de interés. Las enzimas de interés particular incluyen peroxidasa de rábano (HRP) y fosfatasa alcalina (AP). Los sistemas de detección de anticuerpo comerciales tales como, por ejemplo, el sistema Dako Envision+ y el sistema Biocare Medical's Match 3 se pueden utilizar para llevar a la práctica la presente invención. En un método de la invención particular de inmunocitoquímica, la unión de anticuerpo a un biomarcador se detecta mediante el uso de un polímero marcado con HRP que se conjuga a un anticuerpo secundario. La unión de anticuerpo también se puede detectar mediante el uso de un reactivo de sonda de ratón, el cual se une a anticuerpos monoclonales de ratón y un polímero conjugado a HRP, el cual se une al reactivo de sonda de ratón. Los portaobjetos se tiñen para unión de anticuerpo utilizando el cromógeno 3,3-diaminobencidina (DAB) y después se someten a tinción contrastante con hematoxilina y opcionalmente un agente de coloración azul tal como hidróxido de amonio o TBS/Tween-20. En algunos aspectos de la invención, los portaobjetos se revisan microscópicamente por un citotecnólogo o por patólogo para determinar la tinción celular (es decir, la sobreexpresión del biomarcador) y para determinar si está presente una enfermedad cervical de alto grado. Alternativamente, las muestras pueden ser revisadas vía microscopía automatizada o por personal con la asistencia de un software de computadora que facilite la identificación de células con tinción positiva. Los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" abarcan de manera general formas de anticuerpos que se encuentran en la naturaleza y anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos y humanizados y anticuerpos multiespecíficos así como fragmentos y derivados de todos los anteriores, fragmentos y derivados los cuales tienen por lo menos un sitio de unión antigénico. Los derivados de anticuerpo pueden comprender una proteína o una porción química conjugada al anticuerpo. Los "anticuerpos" e "inmunoglobulinas" (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos presentan especificidad de unión a un antígeno, las ¡nmunoglobulinas incluyen tanto los anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpo que carecen de especificidad por antígeno. Los polipéptidos de esta última clase son, por ejemplo, producidos a bajas concentraciones por el sistema linfática y a niveles aumentados por los mielomas. El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y abarca anticuerpos completamente ensamblados, fragmentos de anticuerpo que pueden unir antígeno (por ejemplo Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos) y péptidos recombinantes que comprenden a los anteriores. El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancíalmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones que se encuentran de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región que se une a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata eí al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062); moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; anticuerpos multespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína en los anticuerpos produce los fragmentos idénticos que unen antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio único de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar 35 con facilidad. El tratamiento pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y que aún es capaz de generar un enlace cruzado con antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un antígeno de reconocimiento y un sitio de unión completos. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una asociación estrecha, no covalente. En una especie Fv de cadena sencilla, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera se pueden unir covalentemente por un enlazante peptídico flexible de manera tal que las cadenas ligera y pesada se pueden asociar en una estructura "dimérica" análoga a aquella en las especies Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que tres de las CDR de cada dominio variable interactúa para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren la especificidad al anticuerpo en la unión del antígeno. No obstante, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres de las CDR específicas para un antígeno) tienen la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque con una afinidad menor en comparación con el sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el Iniciador dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de algunos residuos en la parte carboxilo terminal del dominio CH de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región de bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual uno o varios de los residuos cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se producen como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre los mismos.

Se pueden preparar anticuerpos policlonales al inmunizar a un sujeto adecuado (por ejemplo conejo, chivo, ratón u otro mamífero) con un inmunógeno de proteína biomarcadora. El título de anticuerpo en el sujeto inmunizado se puede vigilar con respecto al tiempo por técnicas estándar, por ejemplo con un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) utilizando una proteína biomarcadora inmovilizada. En algún momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo son los más altos, se pueden obtener células productoras de anticuerpo a partir del sujeto y se pueden utilizar para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas estándar, tal como la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica de hibridoma EBV (Colé eí al. (1985) en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, ed. Reisfeld and Shell (Alan R. Liss, Inc., New York, NY), pp. 77-96) o las técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas es bien conocida (véase de manera general Coligan eí al., eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY); Galfre eí al. (1977) Nature 266:550-52; Kenneth (1980) en Monoclonal Antibodies: A New Dimensión In Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY); y Lerner (1981 ) Yale J. Biol. Med., 54:387-402). Una alternativa para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, se puede identificar un anticuerpo monoclonal y se puede aislar por análisis sistemático de una biblioteca de inmunoglobulina combinacional recombinante (por ejemplo una biblioteca de presentación de fago de anticuerpos) con una proteína biomarcadora y de esta manera se aislan miembros aislados de la biblioteca de inmunoglobulina que se une a la proteína biomarcadora. Están disponibles comercialmente equipos para generar y analizar bibliotecas de presentación de fago (por ejemplo, la Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo No. 27-9400-01 ; y la Stratagene SuríZAP 9 Phage Display Kit, Catálogo No. 240612). Adicionalmente, los ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles para uso en la generación y en el análisis de una biblioteca de presentación de anticuerpos se pueden encontrar, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,223,409; publicación PCT Nos. WO 92/18619; WO 91/17271 ; WO 92/20791 ; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; y 90/02809; Fuchs eí al. (1991 ) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay eí al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse eí al. (1989) Science 246:1275-1281 ; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734. La detección de unión de anticuerpo se puede facilitar por acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo y ficoeritrina. Un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y los ejemplos de material radioactivos adecuados incluyen 125l, 131l, 35S o 3H. Respecto a la detección de anticuerpo con la tinción en los métodos de inmunocitoquímica de la invención, estos también existen en la técnica, y también hay métodos de videomicroscopía y software para la determinación cuantitativa de una cantidad de especies moleculares múltiples (por ejemplo proteínas biomarcadoras) en una muestra biológica en donde cada especie molecular presente está indicada por un marcador de colorante representativo que tiene un color específico. Tales métodos también son conocidos en la técnica como un método de análisis colorimétrico. En estos métodos, se utiliza la videomicroscopía para proporcionar una imagen de la muestra biológica después de que sea teñido para indicar visualmente la presencia de un biomarcador particular de interés. Algunos de estos métodos, tales como los descritos en la solicitud de patente de E.U.A. 09/957,446 para Marcelpoil et al. y la solicitud de patente de E.U.A. 10/057,729 para Marcelpoil eí al., incorporadas en la presente como referencia, describen el uso de un sistema generador de imagen y software asociado para determinar las cantidades relativas de cada especie molecular presente, en base en la presencia de marcadores de colorante de color representativos, como se indica por la densidad óptica o el valor de transmitancia de los marcadores de colorante de color, respectivamente, determinados por un sistema generador de imagen y software asociado. Estas técnicas proporcionan determinaciones cuantitativas de las cantidades relativas de cada especie molecular en una muestra biológica teñida utilizando una imagen de video única que es "desconstruida" en sus partes de color constitutivas. Los anticuerpos utilizados para llevar a la práctica la invención se seleccionan para tener una especificidad elevada por las proteínas biomarcadoras de interés. Los métodos para producir anticuerpos y para seleccionar anticuerpos apropiados se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Celis, ed. (en prensa) Cell Biology & Laboratory Handbook 3a. edición (Academic Press, New York), la cual se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. En algunas modalidades, los anticuerpos comerciales dirigidos a proteínas biomarcadoras específicas se pueden utilizar para llevar a la práctica la invención. Los anticuerpos de la invención se pueden seleccionar en base en la tinción deseable de muestras citológicas en vez de histológicas. Esto es, en modalidades particulares, los anticuerpos se seleccionan con el tipo de muestra final (es decir, preparaciones de citología) en mente y para especificidad de unión. En algunos aspectos de la invención, los anticuerpos dirigidos a biomarcadores específicos de interés se seleccionan y purifican vía un procedimiento de cribado de etapas múltiples. En modalidades particulares, los polidomas se analizan para identificar anticuerpos específicos para biomarcador que poseen los rasgos deseados de especificidad y sensibilidad. Como se utiliza en la presente, "polidoma" se refiere a hibridomas múltiples. Los polidomas de la invención típicamente se proporcionan en placas de cultivo de tejido de pozos múltiples. En la etapa de análisis de anticuerpo inicial, se genera un microarreglo de tejido de tumor que comprende muestras normales múltiples (es decir, sin CIN), CINIII, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma. Los métodos del equipo, tales como el ChemiconMR Advanced Tissue Arrayer, para generar arreglos de tejidos múltiples en un portaobjetos único, se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,820,504. Los sobrenadantes no diluidos de cada pozo que contiene un polidoma se ensayan para tinción positiva utilizando técnicas estándar de inmunohistoquímica. En esta etapa de análisis inicial, como un fondo, se ignora esencialmente la unión no específica. Los polidomas que producen resultados positivos se seleccionan y utilizan en la segunda fase del análisis de anticuerpo. En la segunda etapa de análisis, los polidomas positivas se someten a un procedimiento de dilución limitante. Los anticuerpos no analizados resultantes se someten a ensayo para tinción positiva de CINIII o muestras de carcinoma cervical utilizando técnicas estándar de inmunohistoquímica. En esta etapa, la tinción de fondo es relevante y los polidomas candidatos que únicamente tiñen positivo para células anormales (es decir, CINIII y células cancerosas) únicamente se seleccionan para análisis adicional.

Para id ntificar anticuerpos que pueden distinguir muestras normales y CINI de aquellas indicativas de enfermedad cervical de alto grado (es decir, CINII y anteriores), se genera un microarreglo de tejido de panel de enfermedad. Este microarreglo de tejido típicamente comprende muestras múltiples que no son CIN, CINI, CINII, CINIII, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma. Se utilizan las técnicas estándar de inmunohistoquímica para realizar un ensayo de los polidomas candidatos para tinción positiva específica de muestras indicativo de enfermedad cervical de alto grado únicamente (es decir, muestras CINÜ y superiores). Los polidomas que producen resultados positivos y la tinción de fondo mínima se seleccionan para análisis adicional. Los cultivos de tinción positiva se preparan como clones individuales con el fin de seleccionar anticuerpos monoclonales candidatos individuales. Los métodos para aislar clones individuales son bien conocidos en la técnica. El sobrenadante de cada clon que comprende anticuerpos no purificados se ensaya para tinción específica de CINU, CINIII, carcinoma de células escamosas y muestras de adenocarcinoma utilizando los microarreglos del tejido de tumor y panel de enfermedad descritos en la presente antes. Los anticuerpos candidatos que muestren tinción positiva de muestras de enfermedad cervical de alto grado (es decir, CINII y mayores), la tinción mínima de otros tipos de células (es decir, muestras normales y CINI) y un fondo pequeño se seleccionan para purificación y análisis adicional. Los métodos para purificar anticuerpos mediante cromatografía de adsorción de afinidad son bien conocidos en la técnica. Con el fin de identificar anticuerpos que presenten tinción específica máxima de muestras de enfermedad cervical de alto grado y fondo mínimo, la tinción no específica en muestras de citología cervical, los anticuerpos candidatos aislados y purificados en los procedimientos de análisis basados en inmunohistoquímica anteriores se ensayan utilizando técnicas de inmunocitoquímica de la presente invención. Los protocolos ejemplares para realizar inmunocitoquímica se proporcionan en los Ejemplos 1 y 2. Específicamente, los anticuerpos purificados de interés se utilizan para realizar ensayos de una cantidad estadísticamente significativa de NIL (es decir, sin lesión invasiva), ASCUS, LSIL, HSIL o muestras de pacientes con citología cervical cancerosa. Las muestras se analizan por inmunocitoquímica como se describe en la presente y se clasifican como positivas, negativas o indeterminadas para enfermedad cervical de alto grado en base en la tinción de anticuerpo positivo para un biomarcador particular. Se calculan la sensibilidad, especificidad, valores de predicción positivos y valores de predicción negativos para cada anticuerpo. Los anticuerpos que presentan tinción específica máxima de enfermedad cervical de alto grado en muestras de citología cervical con fondo mínimo (es decir, una proporción máxima de señal a ruido) se seleccionan para la presente invención.

La identificación de los anticuerpos apropiados resulta en un aumento en la proporción de señal a ruido y un aumento en la utilidad clínica del ensayo. El formato de ensayo y el tipo de muestra que se va a utilizar son factores críticos en la selección de anticuerpos apropiados. Muchos anticuerpos dirigidos a biomarcadores no producen una proporción deseable de señal a ruido en un formato de inmunocitoquímica con preparaciones de citología o en un formato de inmunohistoquímica con muestras fijadas con formalina e incrustadas con parafina. Además, los anticuerpos biomarcadores que producen una relación máxima de señal a ruido en un formato de inmunohistoquímica pueden no funcionar también en ensayos de inmunocitoquímica. Por ejemplo, un anticuerpo que produce el nivel deseado de tinción en un formato de inmunocitoquímica puede no producir el nivel apropiado de tinción en un ensayo de inmunohistoquímica (datos no mostrados). De igual manera, un anticuerpo que produce una proporción aceptable de señal a ruido cuando se utiliza en el ensayo de inmunohistoquímica puede resultar en sobretinción de las muestras de inmunocitoquímica (datos no mostrados). Por lo tanto, la selección de anticuerpo requiere la consideración inicial del formato de ensayo y el tipo de muestra final que se va a utilizar. Los ensayos basados en citología (es decir, inmunocitoquímica) difieren de los ensayos basados en tejido (es decir, inmunohistoquímica) en la medida en que la arquitectura de tejido no está disponible para ayudar con la interpretación de tinción en el formato de inmunocitoquímica. Por ejemplo, en un ensayo de inmunohistoquímica realizado en muestras de pacientes con displasia moderada o carcinoma de células escamosas con un anticuerpo dirigido a claudina 1 , el resultado indica que claudina 1 se expresa en la lesión de la muestra de displasia ligera (es decir, tinción de café claro) pero se sobreexpresa de manera significativa (es decir, tinción café oscuro) en una lesión cancerosa (figura 12). Los resultados que se obtienen con el mismo anticuerpo claudina 1 en un formato de ensayo de inmunocitoquímica son indeterminados (figura 13). Aunque las células anormales son detectables con facilidad utilizando el anticuerpo claudina 1 en un ensayo de inmunohistoquímica, los resultados que se obtienen en la tinción de claudina 1 en el ensayo de inmunocitoquímica de la invención no son más difíciles de interpretar. Por lo tanto, los biomarcadores que son apropiados en un formato de inmunohistoquímica pueden no ser adecuados en un ensayo de inmunocitoquímíca y por lo tanto no se incluyen en la modalidad preferida de la invención. Además, la ubicación de los biomarcadores dentro de la célula también es una consideración importante en ensayos de inmunocitoquímica. Los biomarcadores que presentan patrones de tinción nuclear, citoplásmico o membranal se pueden confirmar morfológicamente y son apropiados para métodos de inmunohistoquímica. No obstante, la tinción citoplásmica y de membrana vuelve difícil identificar características morfológicas críticas de enfermedad cervical (por ejemplo la relación nuclear a citoplásmica) en ensayos de ¡nmunocitoquímica. Véase la figura 15. En contraste, los biomarcadores que se expresan en el núcleo y que muestran un patrón de tinción nuclear facilitan la detección de tinción de anticuerpo y también permiten el análisis morfológico. Véase la figura 15. Por lo tanto en algunas modalidades preferidas, únicamente los biomarcadores que se expresan selectivamente en el núcleo se utilizan en un ensayo de inmunocitoquímica de la invención. Una persona experta en la técnica reconocerá que la optimización del título de anticuerpo y la química de detección son necesarios para maximizar la relación señal a ruido para un anticuerpo particular. Las concentraciones de anticuerpo que maximizan la unión específica a los biomarcadores de la invención y que minimizan la unión no específica (o el "fondo") se determinarán. En modalidades particulares, los títulos de anticuerpo apropiados para uso en preparaciones de citología cervical se determinan al probar inicíalmente diversas diluciones de anticuerpo en muestras de tejido tanto normales como de enfermedad cervical de alto grado, incrustadas en parafina y fijadas con formalina. Se determinan Iniciadoro las concentraciones de anticuerpo óptimas y las condiciones de química de detección para las muestras de tejido cervical incrustadas en parafina y fijadas con formalína. Los diseños de ios ensayos para optimizar el título de anticuerpos y las condiciones de detección son estándar y se encuentran dentro de las capacidades habituales de aquellos con habilidad normal en la técnica. Después de que se determinan las condiciones óptimas para muestras de tejido fijadas, cada anticuerpo después se utiliza en preparaciones de citología cervical bajo las mismas condiciones. Algunos anticuerpos requieren optimización adicional para reducir la tinción de fondo y/o para aumentar la especificidad y sensibilidad de tinción en las muestras de citología. Además, una persona experta en la técnica reconocerá que la concentración de un anticuerpo particular utilizado para llevar a la práctica los métodos de la invención variará dependiendo de factores tales como el tiempo de unión, el nivel de especificidad del anticuerpo para la proteína biomarcadora y el método de preparación de la muestra corporal. Además, cuando se utilizan anticuerpos múltiples, la concentración requerida puede ser afectada por el orden en el cual se aplican los anticuerpos de la muestra, es decir, simultáneamente como una combinación o secuencialmente como reactivos de anticuerpo individuales. Además, la química de detección utilizada para visualizar la unión de anticuerpo a un biomarcador de interés también se puede optimizar para producir la proporción señal a ruido deseada. En otras modalidades, la expresión de un biomarcador de interés se detecta a nivel de ácido nucleico. Las técnicas basadas en ácido nucleico para determinar la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, determinar el nivel de ARNm biomarcador en una muestra corporal. Muchos métodos de detección de expresión ufilizan ARN aislado. Se puede utilizar cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento de ARNm para la purificación de ARN de células cervicales (véase, por ejemplo, Ausubel eí al., ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York). De manera adicional, se pueden procesar grandes cantidades de muestra de tejido utilizando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en el arte tales como, por ejemplo, un procedimiento de aislamiento de ARN de etapa única de Chomczynski (1989, patente de E.U.A. No. 4,843,155). El término "sonda" se refiere a cualquier molécula que es capaz de unir selectivamente a una biomolécula objetivo diseñada específicamente, por ejemplo, como un transcrito nucleotídico o una proteína codificada por o que corresponde a un biomarcador. Las sondas se pueden sintetizar por una persona experta en la técnica o se pueden derivar de preparaciones biológicas apropiadas. Las sondas se pueden diseñar específicamente para ser marcadas. Los ejemplos de moléculas que se pueden utilizar como sondas incluyen, pero no se limitan a ARN, ADN, proteínas, anticuerpos y moléculas orgánicas. El ARNm aislado se puede utilizar en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero que no se limitan a análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de polimerasa y arreglos de sondas. Un método para la detección de niveles de ARNm involucra poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridizar con el ARNm codificado por el gen que es detectado. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de por lo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridizar específicamente bajo condiciones rigurosas a un ARNm o ADN genómico que codifica para un biomarcador de la presente invención. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que el biomarcador en cuestión se está expresando. En una modalidad, el ARNm se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, al correr el ARNm aislado sobre un gel de agarosa y transferir el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En una modalidad alternativa, una o varias de las sondas son inmovilizadas sobre una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con una o varias de las sondas, por ejemplo en un arreglo de chip de gen Affymetrix. Una persona experta en la técnica puede adaptarse fácilmente a los métodos de detección conocidos de ARNm para uso en detección del nivel de ARNm codificados por los biomarcadores de la presente invención. Un método alternativo para determinar el nivel de ARNm biomarcador en una muestra involucra el procedimiento de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, por RT-PCR (la modalidad experimental establecida en Mullis, 1987, patente de E.U.A. No. 4,683,202), reacción en cadena de ligasa (Barany (1991 ) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh eí al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-ß replicasa (Lizardi eí al. (1988) Bio/Technology 6:1197), replicación de círculo rolante (Lizardi eí al., patente de E.U.A. No. 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en el arte. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en cantidades muy pequeñas. En aspectos particulares de la invención, la expresión del biomarcador es determinada por RT-PCR fluorogénica cuantitativa (es decir, el sistema TaqManMR). Dichos métodos típicamente utilizan pares de cebadores oligonucleotídicos que son específicos para el biomarcador de interés. Los métodos para designar cebadores oligonucleotídicos específicos para una secuencia conocida son bien conocidos en el arte. Los niveles de expresión de biomarcador de ARN se pueden monitorear utilizando transferencia de membrana (tal como el que se utiliza en análisis de hibridación tal como el análisis Northern, Southern, dot y similares) o micropozos, tubos de muestras, geles, esferas o fibras (o cualquier soporte sólido que comprenda ácidos nucleicos unidos). Véanse las patentes de E.U.A. Nos. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 y 5,445,934, las cuales se incorporan en la presente como referencia. La detección de la expresión del biomarcador también puede comprender la utilización de sondas de ácido nucleico en solución. En una modalidad de la invención, se utilizan microarreglos para detectar expresión de biomarcador. Los microarreglos son particularmente adecuados para este propósito debido a la capacidad de reproducción entre diferentes experimentos. Los microarreglos de ADN proporcionan un método para la medición simultánea de los niveles de expresión de grandes cantidades de genes. Cada arreglo consiste de un patrón reproducible de sondas de retención unidas a un soporte sólido. El ARN o ADN marcado se hibridiza con sondas complementarias en el arreglo y después se detectan por exploración láser. Las intensidades de hibridación de cada sonda en el arreglo se determinan y convierten a un valor cuantitativo que representa los niveles de expresión de gen relativos. Véanse las patentes de E.U.A. Nos. 6,040,138, 5,800,992 y 6,020,135, 6,033,860 y 6,344,316, las cuales se incorporan en la presente como referencia. Los arreglos oligonucleotídicos de alta densidad son particularmente útiles para determinar el perfil de expresión del gen para una gran cantidad de los ARN en una muestra. Las técnicas para la síntesis de estos arreglos que utilizan los métodos de síntesis mecánica se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No, 5,384,261 , incorporada en la presente como referencia en su totalidad para todos los propósitos. Aunque se prefiere una superficie de arreglo plano, el arreglo se puede fabricar sobre una superficie de virtualmente cualquier forma o incluso en una multiplicidad de superficies. Los arreglos pueden ser péptidos o ácidos nucleicos sobre esferas, geles, superficies poliméricas, fibras tales como fibras ópticas, vidrio o cualquier otro sustrato apropiado, véanse las patentes de E.U.A. Nos. 5,770,358, 5,789,162, 5,708,153, 6,040,193 y 5,800,992, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad para todos ios propósitos. Los arreglos se pueden empacar de manera tal que permiten el diagnóstico u otra manipulación de un dispositivo en donde se incluye todo. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos, 5,856,174 y 5,922,591 que se incorporan en la presente como referencia. En un enfoque, el ARNm total aislado de la muestra se convierte a ARNc marcado y después se hibridiza en un arreglo oligonucleotídico. Cada muestra se hibridiza en un arreglo separado. Se pueden calcular los niveles de transcrito relativos con referencia a los controles apropiados presentes en el arreglo y en la muestra. Los equipos para llevar a la práctica los métodos de la invención se proporcionan adicionalmente. Mediante el término "equipo" se entiende cualquier fabricación (por ejemplo un empaque o un recipiente) que comprende por lo menos un reactivo, por ejemplo un anticuerpo, una sonda de ácido nucleico, etc., para detectar específicamente la expresión de un biomarcador de la invención. El equipo puede ser promovido, distribuido o vendido como una unidad para realizar los métodos de la presente invención. Adicionalmente, los equipos pueden contener un inserto en el empaque que describe al equipo y los métodos para su uso. En una modalidad particular se proporcionan equipos para llevar a la práctica los métodos de inmunocitoquímica de la invención. Tales equipos son compatibles con técnicas de inmunocitoquímica tanto manuales como automatizadas (por ejemplo tinción de células) como se describen en lo siguiente, en el Ejemplo 1 , estos equipos comprenden por lo menos un anticuerpo dirigido a un biomarcador de interés, sustancias químicas para la detección de unión de anticuerpo al biomarcador, una tinción contrastante y opcionalmente un agente que tiñe de azul para facilitar la identificación de células de tinción positiva. Cualquier sustancia química que detecte la unión de antígeno-anticuerpo se puede utilizar en la práctica de la invención. En algunas modalidades, las sustancias químicas de detección comprenden un polímero marcado conjugado a un anticuerpo secundario. Por ejemplo, se puede proporcionar un anticuerpo secundario que se conjuga a una enzima que cataliza la deposición de un cromógeno en el sitio de unión antígeno-anticuerpo. Tales enzimas y técnicas para su uso en la detección de unión de anticuerpo son bien conocidas en el arte. En una modalidad, el equipo comprende un anticuerpo secundario que se conjuga a un polímero marcado con HRP. Los cromógenos compatibles con la enzima conjugada (por ejemplo DAB en el caso de un anticuerpo secundario marcado con HRP) y las soluciones, tales como peróxido de hidrógeno para el blooqueo de tinción no específica, se pueden proporcionar de manera adicional. En otras modalidades, la unión de anficuerpo a una proteína biomarcadora se detecta mediante el uso de un reactivo de sonda de ratón que se une a anticuerpos monoclonales de ratón, seguido por adición de un polímero de dextrano conjugado con HPR que se une al reactivo de sonda de ratón. Tales reactivos de detección están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Biocare Medical. Los equipos de la presente invención pueden comprender además un reactivo bloqueador de peroxidasa (por ejemplo peróxido de hidrógeno), un reactivo bloqueador de proteína (por ejemplo caseína purificada) y una tinción contrastante (por ejemplo hematoxilina). Se puede proporcionar de manera adicional en el equipo un agente para teñir de azul (por ejemplo hidróxido de amonio o TBS, pH 7.4, con Tween-20 y azida de sodio) para facilitar la detección de células de tinción positiva. En otra modalidad, los equipos de inmunocitoquímica de la invención comprenden adicionalmente por lo menos dos reactivos, por ejemplo, anticuerpos para detectar específicamente la expresión de por lo menos dos biomarcadores distintos. Cada anticuerpo se puede proporcionar en el equipo como un reactivo individual o, alternativamente, como una combinación de anticuerpos que comprenden la totalidad de los anticuerpos dirigidos a biomarcadores diferentes de interés. Además, cualquiera o la totalidad de los reactivos de equipo se puede proporcionar dentro de recipientes que los protegen del ambiente por ejemplo en recipientes sellados). Un equipo ejemplar para llevar a la práctica los métodos de la invención se describe en lo siguiente, en el Ejemplo 8. Se pueden incluir controles positivos y/o negativos en los equipos para validar la actividad y el uso correcto de los reactivos utilizados de acuerdo con la invención. Los controles pueden incluir muestras tales como cortes de tejido, células fijas sobre portaobjetos de vidrio, etc., que se sabe son positivas o negativas para la presencia del biomarcador de interés. En una modalidad particular, el control positivo comprende células SiHa. Esta es una línea de células de cáncer escamoso cervical humano que es hipertriploide y positiva para la infección por HPV-16 y por lo tanto sirve como un control positivo para la sobreexpresión de biomarcadores en estados de enfermedad cervical de alto grado. Las células de control SiHa se pueden proporcionar en los equipos de la invención como portaobjetos preparados o como una suspensión celular que es compatible con la preparación del portaobjetos. El diseño y uso de los controles es estándar y se encuentra dentro de las capacidades habituales de una persona habitualmente experta en la técnica. En otras modalidades, se proporcionan adicionalmente equipos para identificar enfermedad cervical de alto grado que comprende detectar sobreexpresión de biomarcador a nivel de ácido nucleico. Tales equipos comprenden, por ejemplo, por lo menos una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico biomarcador o un fragmento del mismo. En modalidades particulares, los equipos comprenden por lo menos dos sondas de ácido nucleico que hibridizan con distintos ácidos nucleicos biomarcadores. En algunas modalidades, los métodos de la invención se pueden utilizar en combinación con técnicas de citología tradicionales que analizan características morfológicas. Por ejemplo, las técnicas inmunocitoquímicas de la presente invención se pueden combinar con la tinción de Pap convencional de manera que se conserva la totalidad de la información morfológica a partir del método convencional. De esta manera, la detección de los biomarcadores puede reducir la alta tasa de resultados falsos negativos de una prueba de frotis de Pap y puede facilitar un análisis automatizado en masa. En una modalidad particular, los métodos de inmunocitoquímica descritos en la presente en lo anterior se combinan con la tinción Pap convencional en un método único, como se describe en lo siguiente en los Ejemplos 6-7. Un método combinado de tinción por inmunocitoquímico y Pap permite la visualización de ambos biomarcadores que se sobreexpresan de manera selectiva en enfermedad cervical de alto grado y la morfología celular en una muestra única (por ejemplo un portaobjetos de microscopio que comprende una monocapa de células cervicales). El método combinado de inmunocitoquímíca y tinción por Pap puede permitir una identificación y diagnóstico más precisos de enfermedad cervical de alto grado, particularmente en casos clasificados erróneamente como normales, LSIL o ASCUS por pruebas Pap convencionales. El análisis de la sobreexpresión de biomarcador y la morfología celular en un método único puede sustituir al frotis Pap como el método de análisis primario para cáncer cervical. Una persona experta en la técnica reconocerá que los parámetros de tinción (por ejemplo tiempos de incubación, condiciones de lavado, concentraciones de cromógeno/teñido, etc.) para esta metodología combinada, necesitan optimizarse de manera que se obtenga un contraste suficiente entre el resultado de inmunocitoquímica (por ejemplo tinción con cromógeno) y la tinción de Pap. El diseño de ensayos para optimizar los parámetros de tinción es estándar y se encuentra dentro de las capacidades habituales de las personas comúnmente expertas en la técnica. Los equipos para realizar el método combinado inmunocitoquímica y tinción por Pap también están abarcados por la presente invención. Tales equipos comprenden los reactivos necesarios para inmunocitoquímica, como se describe en la presente en lo anterior y los reactivos para tinción convencional de Pap, particularmente EA50 y Orange G. Una persona experta en la técnica apreciará adicionalmente que cualquiera o la totalidad de las etapas en los métodos de la invención se pueden implementar por el personal, o alternativamente, se pueden realizar de una manera automatizada. De esta manera, las etapas de la preparación de la muestra corporal, tinción de la muestra y detección de la expresión del biomarcador se pueden automatizar. Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y de ninguna manera como una limitación: Parte experimental EJEMPLO 1 Detección de sobreexpresión de biomarcador utilizando inmunocitoquímica Preparación del portaobjetos y pretratamiento Se recolectan muestras cervicales de pacientes y se colocan en un frasco de recolección SurePathMR (TriPath Imaging, Inc.). Se recolectan células cervicales del medio líquido y se depositan en una capa delgada sobre un portaobjetos de vidrio utilizando el sistema procesador de portaobjetos PrepStainMR (TriPath Imaging, Inc.) Los portaobjetos preparados se transfieren de inmediato a un amortiguador de pretratamiento (RAM 1 %) y se calientan durante 45 minutos a 95°C. Los portaobjetos se enfrían a temperatura ambiente y se enjuagan tres veces (2 minutos por enjuague) en TBS (solución salina amortiguada con tris). Inmunocitoquímica manual Para evitar la tinción de fondo inespecífica, no se permite que los portaobjetos se sequen durante el procedimiento de teñido. Además, con el fin de bloquear la tinción inespecífica, se aplica peróxido de hidrógeno a los portaobjetos durante 5 minutos, seguido por un enjuagado con TBS. Se aplica un anticuerpo dirigido a MCM6 en el portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación con el anticuerpo MCM6, el portaobjetos se lava tres veces con TBS durante 2 minutos por lavado, se aplica el anticuerpo secundario de polímero Dako Envision+ marcado con HRP al portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por un enjuagado con TBS. El sustrato de HRP, el cromógeno DAB se aplica durante 10 minutos y después los portaobjetos se enjuagan durante 5 minutos con agua. Cada portaobjetos se somete a tinción contrastante con hematoxilina y después se enjuaga con agua hasta transparencia. Después de la tinción contrastante, los portaobjetos se enjuagan en hidróxido de amonio durante 10 segundos y después se enjuagan con agua durante 1 minuto. Las muestras se deshidratan para sumergir los portaobjetos en etanol 95% durante 1 minuto y después en etanol absoluto por 1 minuto adicional. Los portaobjetos se aclaran al enjuagarlos tres veces en xileno durante 1 minuto por enjuagado. Los portaobjetos después se cubren con un cubreobjetos con un medio de montaje permanente y se incuban a 35°C hasta sequedad. Las células de tinción positivas se visualizan utilizando un microscopio de campo brillante. Inmunocitoquímica automatizada Se programa el sistema de teñido universal Dako Autostainer de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cargan en el equipo los reactivos necesarios para tinción y tinción contrastante descritos en lo anterior para inmunocitoquímica manual. Los portaobjetos preparados y pretratados se cargan en el equipo Autostainer y se corre el programa. Al final de la corrida, los portaobjetos se retiran y enjuagan en agua durante 5 minutos. Los portaobjetos se deshidratan, se aclaran, se coloca un cubreobjetos y se analizan como se describe en lo anterior.

EJEMPLO 2 Detección de biomarcadores en muestras clínicas Se recolectan aproximadamente 180 muestras de citología cervical de pacientes que representan diversos diagnósticos. Previamente, la presencia o ausencia de células cancerosas o lesiones indicativas de enfermedad de alto grado en estos pacientes se confirma por colposcopía. La siguiente tabla indica el número de muestras dentro de cada grupo de diagnóstico analizado en este estudio, así como una descripción de los hallazgos por colposcopía (por ejemplo la presencia o ausencia de lesiones de alto grado).

CUADRO 1 Especímenes analizados Las muestras se analizan por métodos de inmunocitoquímica para identificar enfermedad cervical de alto grado. Se utilizan anficuerpos para detectar la sobreexpresión de seis biomarcadores de interés: MCM2, MCM6, MCM 7, p21waf1, ciclina E y Topo2A. Los controles de ensayo incluyen MCM2, MCM6, MCM 7, p21waf1, ciclina E y Topo2A e IgG de ratón negativo que corren en una línea de células SiHa. Las muestras también se analizan por técnicas de tinción de Pap tradicionales.

Preparación de los portaobjetos Cada muestra se retira del almacenamiento y se permite que alcance la temperatura ambiente. Se agregan a cada frasco 6 ml de conservador TriPath CytoRichMR y los frascos se someten a remolino. Las muestras se procesan en el procesador automatizado TriPath PrepMateMR y el fluido remanente en el frasco se transfiere a un tubo de centrífuga. Las muestras se centrifugan durante 2 minutos a 200 x g y se aspira el sobrenadante. Las muestras después se centrifugan durante 10 minutos a 800 x g, y se decanta el sobrenadante. Los tubos de muestra se cargan en un sistema TriPath PrepStainMR y se corre el software del sistema (versión 1.1 ; transferencia únicamente). Ocho portaobjetos de cada muestra de paciente se preparan y almacenan en etanol 95% durante por lo menos 24 horas pero no por un período mayor de 2 semanas antes de uso en la tinción de Pap y los métodos de ¡nmunocitoquímica.

Método de tinción de Pap Los portaobjetos preparados se incuban en etanol 95% durante 30 segundos y después se enjuagan con agua durante 30 segundos adicionales. Se aplica hematoxilina a los portaobjetos durante 6 minutos. Los portaobjetos se enjuagan con agua durante 1 minuto, agua acida durante 2 segundos y agua durante 30 segundos. Se aplica durante 30 segundos un agente que tiñe de azul (hidróxido de amonio) y los portaobjetos se enjuagan Iniciadoro con agua y después con etanol 95% durante 30 segundos cada uno. Se aplican durante 6 minutos EA 50 y Orange G (AutocyteMR). Los portaobjetos se enjuagan dos veces en etanol 95%, 3 veces en etanol 100% y 3 veces en xileno durante 30 segundos por enjuagado. Los portaobjetos después se coloca un cubreobjetos utilizando un medio de montaje Acrytol y se incuban a 35°C hasta sequedad. Se revisan las muestras por un patólogo utilizando un microscopio de campo brillante.

Método de inmunocitoquímica Se retiran los portaobjetos preparados de etanol 95% y se enjuagan con agua desionizada durante aproximadamente 1 minuto. Los portaobjetos se colocan en un baño de solución de recuperación objetivo 1X pH 6.0 (DAKOS1699)/dH20 precalentada a 95°C y se colocan en un evaporador durante 25 minutos. Se permite que las muestras se enfríen durante 20 minutos a temperatura ambiente, se enjuagan bien en agua desionizada y se colocan en TBS. Los portaobjetos pretratados se tiñen para expresión de biomarcador esencialmente como se describe en lo anterior en el Ejemplo 1 "inmunocitoquímica automatizada". Los anticuerpos comerciales dirigidos a MCM2 (1 :200), MCM7 (1 :25), p21waf1 (1 :100) y ciclina E (1 :100) se diluyen como se índica y se utilizan para detectar expresión de biomarcador. El anticuerpo MCM6 purificado, identificado por cribado con polidoma como se describe en el Ejemplo 4, se utiliza en una dilución 1:6000.

Interpretación de los portaobjetos Cada portaobjetos se analiza y se revisa por un citotecnólogo y un patólogo. Las muestras se clasifican como positivas, negafivas o indeterminadas para enfermedad cervical de alto grado, de acuerdo con los siguientes parámetros: • No se consideran artefactos no celulares y células inflamatorias que tiñen de café (DAB). • Las células escamosas de apariencia normal, maduras y células glandulares de apariencia normal no se cuentan como positivas cuando se tiñen con DAB. • Las células metaplásicas escamosas con células anormales se consideran positivas. • Una intensidad de tinción de menos de 1.5 se considera negativa. • Los resultados no concluyentes se analizan y se clasifican mediante una revisión conjunta de los portaobjetos. Los resultados de ¡nmunocitoquímica se comparan con los resultados obtenidos previamente por colposcopía. Cada portaobjetos después se le proporciona un resultado final de positivo verdadero (TP), negativo verdadero (TN), positivo falso (FP) o negativo falso (FN) o indeterminado. La sensibilidad, especificidad, los valores de predicción positivos y los valores de predicción negativos para cada biomarcador se calculan.

Resultados Los resultados para cada biomarcador se resumen a continuación CUADRO 2 MCM2 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 34 127 181 Sensibilidad: 0.8718 Especificidad: 0.9478 PPV: 0.8293 NPV: 0.9621 CUADRO 3 MCM6 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 35 17 114 13 181 Sensibilidad: 0.9459 Especificidad: 0.8702 PPV: 0.6731 NPV: 0.9828 CUADRO 4 MCM7 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 37 14 116 11 181 Sensibilidad: 0.9250 Especificidad: 0.8923 PPV: 0.7255 NPV: 0.9748 CUADRO 5 Ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 24 10 133 11 181 Sensibilidad: 0.7059 Especificidad: 0.9779 PPV: 0.8889 NPV: 0.9301 CUADRO 6 p21 wafl Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 31 15 106 23 181 Sensibilidad: 0.8378 Especificidad: 0.8760 PPV: 0.6739 NPV: 0.9464 CUADRO 7 TOPO2A Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 33 119 20 181 Sensibilidad: 0.8919 Especificidad: 0.9597 PPV: 0.8684 NPV: 0.9675 Se analizan aproximadamente 180 casos para determinar la presencia de enfermedad cervical de alto grado utilizando métodos de inmunocítoquímica de la invención. De esta cantidad, los biomarcadores MCM producen una tasa indeterminada que varía de 4% a 7%. Adicionalmente, MCM2 muestra una especificidad de 95% con una sensibilidad de 87%. Los biomarcadores MCM6 y MCM7 producen resultados de sensibilidad comparable de 95% y 93%, respectivamente. La especificidad de estos dos biomarcadores varía de 87% a 89%. La ciclina E produce el valor de especificidad más alto de 98%. Aunque la tasa indeterminada es de 6%, la sensibilidad es de solo 71%. La tasa indeterminada para p21waf1 es la más elevada para todos los marcadores probados a 13%. El marcador p21waf1 produce una sensibilidad de 84% y una especificidad de 88%. Se observa una especificidad de 96% con el biomarcador Topo2A. La tasa indeterminada para Topo2A es 11 %. con una sensibilidad de 89%.

EJEMPLO 3 Detección de biomarcadores en muestras clínicas utilizando mezclas de anticuerpo Se analizan aproximadamente 180 muestras de citología cervical confirmada por colposcopía mediante métodos de inmunocitoquímica para identificar enfermedad cervical de alto grado. Cada muestra se analiza para determinar la expresión de biomarcadores múltiples de interés. Específicamente, diversas combinaciones de anticuerpo se dirigen a MCM2, MCM6, MCM7, p21 wafl , ciclina E y Topo2A y se analizan para determinar su capacidad para detectar enfermedad cervical de alto grado. Estas muestras se evalúan para la expresión de biomarcadores múltiples de interés utilizando los métodos de inmunocítoquímica y las líneas de guía de interpretación de portaobjetos descritas en el ejemplo 2.

Los resultados de inmunocitoquímica se comparan con los resultados obtenidos previamente por colposcopía. Cada portaobjetos después se le proporciona un resultado final de positivo verdadero (TP), negativo verdadero (TN), positivo falso (FP), negativo falso (FN) o indeterminado. Los valores se sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos así como los valores predictivos negativos para cada biomarcador se calcularon.

Resultados Los resultados para cada biomarcador se resumen a continuación CUADRO 8 MCM2 y MCM7 . Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 15 111 14 181 Sensibilidad: 0.9268 Especificidad: 0.8810 PPV: 0.7170 NPV: 0.9737 CUADRO 9 MCM6 y MCM7 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 19 109 13 181 Sensibilidad: 0.9500 Especificidad: 0.8516 PPV: 0.6667 NPV: 0.9820 CUADRO 10 MCM7 v TOPO2A Totales NiL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 32 14 114 17 181 Sensibilidad: 0.8889 Especificidad: 0.8906 PPV: 0.6957 NPV: 0.9661 CUADRO 11 MCM7 y ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 14 116 10 181 Sensibilidad: 0.9268 Especificidad: 0.8923 PPV: 0.7308 NPV: 0.9748 CUADRO 12 MCM7 v p21waf1 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 37 19 98 24 181 Sensibilidad: 0.9250 Especificidad: 0.8376 PPV: 0.6607 NPV: 0.9703 CUADRO 13 MCM2 y MCM6 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 37 20 109 13 181 Sensibilidad: 0.9487 Especificidad: 0.8450 PPV: 0.6491 NPV: 0.9820 CUADRO 14 MCM2 y TOPOHA Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 37 108 20 181 Sensibilidad: 0.8409 Especificidad: 0.9231 PPV: 0.8043 NPV: 0.9391 CUADRO 15 MCM2 y ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 34 123 8 181 Sensibilidad: 0.8537 Especificidad: 0.9318 PPV: 0.7955 NPV: 0.9535 CUADRO 16 MCM2 y p21waf1 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 36 16 102 22 181 Sensibilidad: 0.8780 Especificidad: 0.8644 PPV: 0.6923 NPV: 0.9533 CUADRO 17 TOPO2A v ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 34 6 119 18 181 Sensibilidad: 0.8947 Especificidad: 0.9520 PPV: 0.8500 NPV: 0.9675 CUADRO 18 TOPO2A y p21waf1 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 17 98 25 181 Sensibilidad: 0.9268 Especificidad: 0.8522 PPV: 0.6909 NPV: 0.9703 CUADRO 19 p21waf1 y ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 33 15 106 22 181 Sensibilidad: 0.8684 Especificidad: 0.8760 PPV: 0.6875 NPV: 0.9550 CUADRO 20 MCM2, MCM6, y MCM7 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 20 105 16 181 Sensibilidad: 0.9500 Especificidad: 0.8400 PPV: 0.6552 NPV: 0.9813 CUADRO 21 MCM2. MCM7 y TOPO2A Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 39 15 104 21 181 Sensibilidad: 0.9512 Especificidad: 0.8739 PPV: 0.7222 NPV: 0.9811 CUADRO 22 MCM6, MCM7 v TOPO2A Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 39 19 104 17 181 Sensibilidad: 0.9512 Especificidad: 0.8455 PPV: 0.6724 NPV: 0.9811 CUADRO 23 MCM6. MCM7 y ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 19 109 13 181 Sensibilidad: 0.9500 Especificidad: 0.8516 PPV: 0.6667 NPV: 0.9820 CUADRO 24 MCM2, MCM7 y ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 15 111 14 181 Sensibilidad: 0.9268 Especificidad: 0.8810 PPV: 0.7170 NPV: 0.9737 CUADRO 25 MCM2, MCM7 y p21waf1 Totales N!L 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 19 94 27 181 Sensibilidad: 0.9268 Especificidad: 0.8319 PPV: 0.6667 NPV: 0.9691 CUADRO 26 MCM2, TOPOIIA y ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 37 10 112 19 181 Sensibilidad: 0.9250 Especificidad: 0.9180 PPV: 0.7872 NPV: 0.9739 Cuadro 27 MCM 2. ciclina E y p21waf1 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 36 16 102 22 181 Sensibilidad: 0.8780 Especificidad: 0.8644 PPV: 0.6923 NPV: 0.9533 CUADRO 28 MCM2, TOPOHA y p21waf1 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 17 95 28 181 Sensibilidad: 0.9268 Especificidad: 0.8482 PPV: 0.6909 NPV: 0.9694 CUADRO 29 MCM7, TOPO2A y ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 39 14 108 18 181 Sensibilidad: 0.9512 Especificidad: 0.8852 PPV: 0.7358 NPV: 0.9818 CUADRO 30 MCM7, p21waf1 y ciclina E Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) ' 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 19 97 24 181 Sensibilidad: 0.9268 Especificidad: 0.8362 PPV: 0.6667 NPV: 0.9700 CUADRO 31 MCM7, p21waf1 v TOPO2A Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 39 19 91 30 181 Sensibilidad: 0.9512 Especificidad: 0.8273 PPV: 0.6724 NPV: 0.9785 CUADRO 32 MCM2, MCM7, ciclina E y p21waf1 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 38 19 94 27 181 Sensibilidad: 0.9268 Especificidad: 0.8319 PPV: 0.6667 NPV: 0.9691 CUADRO 33 MCM2, MCM7, ciclina E y TOPOIIA Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 39 15 104 21 181 Sensibilidad: 0.9512 Especificidad: 0.8739 PPV: 0.7222 NPV: 0.9811 CUADRO 34 MCM2, MCM7, ciclina E, p21waf1 y TOPO2A Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 39 19 89 32 181 Sensibilidad: 0.9512 Especificidad: 0.8241 PPV: 0.6724 NPV: 0.9780 CUADRO 35 MCM2, MCMß, MCM7, TOPO2A, ciclina E y p21waf1 Totales NIL 72 ASC-US (sin lesión) 26 ASC-US (lesión) 0 LSIL (sin HSIL) 42 LSIL (HSIL) 6 HSIL 25 Cáncer 10 39 24 86 30 181 Sensibilidad: 0.9512 Especificidad: 0.7818 PPV: 0.6190 NPV: 0.9773 Los datos se compilan en 28 mezclas de anticuerpo, como se describe en lo anterior. Se analiza la expresión del biomarcador utilizando combinaciones que comprenden anticuerpos dirigidos a 2, 3, 4, 5 o la totalidad de los 6 biomarcadores de interés. Una cantidad de veintiuno de las 28 combinaciones de anticuerpo muestran sensibilidades mayores de 92%. Cuatro de las 28 combinaciones producen especificidades superiores a 90% con el valor más bajo en 78%. Los valores más altos se obtienen con una combinación de MCM2, TOPOIIA y ciclina E. Esta combinación proporciona una sensibilidad de 93% junto con una especificidad de 92%. Parece que la combinación de por lo menos 3 biomarcadores puede proporcionar una sensibilidad mayor de 90%. Se reconoce que los ajustes al ensayo pueden aumentar adicionalmente la sensibilidad y especificidad del ensayo.

EJEMPLO 4 Detección de la expresión del biomarcador utilizando combinaciones de anticuerpo Se preparan combinaciones de anticuerpo utilizando diversas combinaciones de anticuerpo dirigidos a cíclina E, MCM2, MCM6, MCM7, p21waf1 y TOP02a. En el cuadro siguiente se presenta la composición de cada combinación. CUADRO 36 Composición de combinaciones de anticuerpos Se preparan dos conjuntos de especímenes de citología cervical ai acumular casos HSiL (acumulado HSIL) y casos NiL (acumuiado NiL).

Cada combinación de anticuerpo se prueba en el acumulado HSIL y el acumulado NIL. Los anticuerpos biomarcadores también se prueban individualmente como un control. Se realiza preparación por portaobjetos e ¡nmunocitoquímica automatizada como se describe en el ejemplo 2. Los portaobjetos se analizan y revisan por un citotecnólogo y un patólogo. El teñido específico de las células indicativo de una enfermedad cervical de alto grado, la tinción de células glandulares, reactividad cruzada a bacterias y la ubicación del teñido celular son todas variables que son registradas durante el procedimiento de análisis. Los resultados de inmunocitoquímica indican un incremento en la tinción de células indicativa de enfermedad cervical de alto grado en el acumulado HSIL con las combinaciones de anticuerpo biomarcador cuando se comparan con los resultados obtenidos con la detección de un biomarcador único. Adicionalmente, no hay un incremento significativo en el fondo cuando el número de anticuerpos en las combinaciones se aumenta de 2 a 3, 4 ó 6. Además, las diversas combinaciones de anticuerpo no muestran un incremento en la tinción de fondo cuando se prueban en el acumulado NIL.

EJEMPLO 5 Detección de sobrexpresión de biomarcador en muestras cervicales utilizando inmunocitoquímica Preparación de portaobjetos y pretratamiento Se recolectan muestras cervicales de los pacientes como se describe en lo anterior, en el ejemplo 1. Los portaobjetos que comprenden una monocapa de células cervicales se preparan por el sistema AutoPrepMR utilizando el modo "únicamente preparación". Los portaobjetos preparados se colocan de inmediato en amortiguador de pretratamiento SureSlideMR 1X (laureth-13-carboxilato de sodio 0.5% (Sandopan LS) y H20 desionizada) por un mínimo de 1 hora y un máximo de 72 horas. Los portaobjetos pretratados se colocan en un vaporizador a 95°C durante 45 minutos sin precalentamiento. Los portaobjetos se retiran del vaporizador, se permite que se enfríen a temperatura ambiente durante 20 minutos y después se enjuagan bien en agua desionizada. Los portaobjetos se enjuagan en TBST (TBS/Tween-20) dos veces, 2 minutos por enjuagado. Los portaobjetos se remojan con agua corriente para eliminar el exceso de amortiguador y se colocan en una cámara húmeda. Los portaobjetos se someten a ¡nmunocitoquímica manual o automatizada, como se describe en lo siguiente. linmunocitoquímica Manual Se aplican a cada portaobjetos 200 µl de reactivo de bloqueo de peroxidasa (peróxido de hidrógeno 0.03%) para cubrir el área de deposición de células, por un período de 5 minutos. Los portaobjetos se enjuagan con TBST tres veces a 2 minutos por enjuagado. Se elimina el exceso de amortiguador y los portaobjetos se colocan en una cámara húmeda. Se aplican 200 µl de reactivo de bloqueo de proteína (caseína purificada y tensioactivo) a cada portaobjetos y se incuban durante 5 minutos. Después de que se elimina el exceso de reactivo de bloqueo de proteína, los portaobjetos se colocan en una cámara húmeda.

Se aplica a cada portaobjetos 200 µl de una combinación de anficuerpo monoclonal primario que comprende dos anficuerpos de ratón antihumano dirigidos a MCM2 (clon 27C5.6 a 0.39 mg/ml, dilución 1 :800; clon 26H6.19 a 0.918 mg/ml; dilución 1 :10,000) y se aplica un tercer anficuerpo de ratón antihumano específico para Topo2A (clon SWT3D1 a 100 µg/ml, dilución 1 :10,000) para cubrir completamente el área de deposición celular. Los portaobjetos se incuban durante 30 minutos y después se enjuagan con TBST tres veces a 2 minutos por enjuagado. Se elimina el exceso de amortiguador y los portaobjetos se regresan a la cámara húmeda. Se aplican como se indica en lo anterior, durante 20 minutos, 20 µl de reacfivo de sonda de ratón que se une a los anticuerpos monoclonales de ratón. Los portaobjetos se enjuagan con TBST tres veces, a 2 minutos por enjuagado. Se elimina el exceso de amortiguador y los portaobjetos se colocan nuevamente en la cámara húmeda. Se aplica como se indica en lo anterior, durante 20 minutos, 200 µl de reactivo de polímero que comprende un polímero de dextrano conjugado con HRP y un anticuerpo de chivo secundario, anti-ratón que se une al reactivo de sonda del ratón, y después los portaobjetos se enjuagan con TBST 3 veces a 2 minutos por enjuagado. Después de que se elimina el exceso de amortiguador, los portaobjetos se regresan a la cámara húmeda. Se aplican como se hizo en lo anterior, durante 5 minutos, 200 µl de solución de sustrato-cromógeno DAB. Los portaobjetos se enjuagan con agua desionizada durante 5 minutos y después se enjuagan con TBST durante 2 minutos con un cambio de amortiguador. Se elimina el exceso de amortiguador y los portaobjetos se colocan en una cámara húmeda como en lo anterior. Se agrega durante 1 minuto 200 µl de hematoxilina, seguido por 3 enjuagados con agua desionizada a 2 minutos por enjuagado. Se elimina el exceso de agua desionizada y los portaobjetos se colocan dentro de la cámara húmeda. A cada portaobjetos se le aplican 200 µl de agente de rematado (es decir, TBS, pH 7.4 con tween-20 y azida de sodio) durante 1 minuto. Los portaobjetos después se enjuagan en un cambio de TBST y un cambio de agua desionizada, durante 2 minutos cada uno. Los portaobjetos después se deshidratan, se aclaran, se les coloca un cubreobjetos y se analizan como se describe en los ejemplos 1 y 2.

Inmunocitoquímica Automatizada El equipo autosteiner se programa de acuerdo con las instrucciones del fabricante para incluir la siguiente secuencia de etapas: a. 2 enjuagues de amortiguador (TBST) b. 5 minutos de bloqueo de peroxidasa c. 2 enjuagados con amortiguador (TBST) d. 5 minutos de bloqueo de proteína, por soplado e. 30 minutos de incubación con combinación de anticuerpo primario f. 3 enjuagues con amortiguador (TBST) g. 20 minutos de reactivo de sonda de ratón h. 3 enjuagados con amortiguador (TBST) i. polímero-HRP durante 20 minutos j. 3 enjuagados con amortiguador (TBST) k. 5 minutos de DAB (1 gota de cromágeno a 1 ml de amortiguador) I. 3 enjuagados con H20 m. 2 enjuagados con amortiguador (TBST) n. 1 minuto con hematoxilina de Mayer o. 3 enjuagados con H20 p. 1 minuto con agente de rematado q. 1 enjuagado con amortiguador (TBST) r. 1 enjuagado con H20 Los reactivos necesarios de teñido y teñido contrastante se cargan en la máquina. Los portaobjetos preparados y pretratados se cargan en el equipo autostainer y se realiza el programa anterior. Al final del programa, los portaobjetos se retiran y se enjuagan brevemente con agua corriente. Los portaobjetos se deshidratan, aclaran, se les coloca un cubreobjetos y se analizan como se describen en los ejemplos 1 y 2.

Resultados CUADRO 37 Casos NIL (n = 45) CUADRO 38 Casos HSIL (n = 45) De los 45 casos NIL probados, una revisión de los portaobjetos teñidos para Pap muestran un caso ASC-US. Los resultados de inmunocitoquímica (ICC) para las muestras NIL son negativos, en donde un caso se considera insatisfactorio para evaluación. Respecto a los casos HSIL, cada uno de los 45 casos se confirma que es una enfermedad cervical de alto grado en base en la revisión de los portaobjetos teñidos por Pap.

Adicionalmente, cada uno de los 45 casos HSIL también es positivo en el ensayo ICC. El control negativo, es decir, un control IgG de ratón universal aplicado a un control de línea de células SiHa produce resultados negativos en el ensayo ICC. El control positivo, es decir, la combinación de anticuerpo primaria aplicada al control de la línea de células SiHa produce resultados positivos en el ensayo ICC.

EJEMPLO 6 Inmunocitoquímica combinada y procedimiento de tinción Pap Se recolectan muestras cervicales de pacientes, como se describe en lo anterior, en el ejemplo 1. Los portaobjetos que comprenden una monocapa de células cervicales se preparan y se pretratan como se indican en el ejemplo 5. Cada portaobjetos pretratado se somete a inmunocitoquímica automatizada y tinción de Pap, con lo que se permite la visualización tanto de la sobreexpresión del biomarcador como la morfología celular en un solo portaobjetos.

Inmunocitoquímica Automatizada Se realiza inmunocitoquímica automatizada en cada portaobjetos como se describe en lo anterior en el ejemplo 5. Al final del programa de tinción, los portaobjetos se retiran del equipo autostainer y se enjuagan con agua corriente durante 3-5 minutos. Cada portaobjetos después se tiñe de acuerdo con métodos de tinción Pap convencionales, como se describe en lo siguiente.

Método de tinción de Pap Después de la ¡nmunocitoquímica automatizada, cada portaobjetos se fine adicionalmente con tinción de Pap. Los portaobjetos Iniciadoro se enjuagan en etanol 95% durante 30 segundos. Se aplican EA50 y Orange G a la mitad de los portaobjetos durante 3 minutos y a los portaobjetos restantes durante 6 minutos. La totalidad de los portaobjetos después se enjuagan 2 veces en etanol 95%, 3 veces en etanol 100% y 3 veces en xileno durante 30 segundos por enjuagado. Los portaobjetos después se coloca un cubre objetos con medio de montaje permanente y se analizan como se describe en lo anterior en los ejemplos 1 y 2.

Resultado Un conjunto de 5 casos NIL y 5 HSIL se someten cada uno durante 3 minutos o 6 minutos de tinción con EA50 y Orange G en el método de finción Pap. Los resultados indican diferencia mínima entre los protocolos de tinción de 3 minutos y de 6 minutos. Los portaobjetos sometidos a 3 minutos de tinción Pap presentan una finción ligeramente menos intensa. Además, las células HSIL de tinción positiva ICC se observan fácilmente con la tinción contrastante de Pap.

EJEMPLO 7 inmunocitoquímica combinada y procedimiento de tinción de Pap (optimización de la tinción de Pap) La inmunocitoquímica combinada y el procedimiento de tinción Pap indicados en el ejemplo 6 se modifican para optimizar los parámetros de tinción Pap con el fin de maximizar el contraste entre la tinción con cromógeno (es decir, DAB) del método de inmunocitoquímica y el nivel de tinción de Pap. Los portaobjetos se preparan, se tratan previamente y se someten a inmunocitoquímica automatizada como se describe en lo anterior en el ejemplo 6. Los portaobjetos se tiñen con tinción de Pap convencional esencialmente como se describe en el ejemplo 6, con las siguientes modificaciones. Se prueba hematoxilina utilizando la formulación de Harris junto con la formulación de Myers. Se aplica EA Orange G durante 3 ó 6 minutos. De manera adicional, existen 3 cambios de etanol 95% después de la adición de EA Orange G. Los portaobjetos reciben una determinación de positivo, negativo o insatisfactorio en base en la tinción de inmunocítoquímíca. Adicionalmente, los portaobjetos se evalúan morfológicamente para comparación con el diagnóstico de Pap que entra.

Resultados CUADRO 39 Resultados del método de inmunocitoquímica y de tinción de Pap combinados El procedimiento combinado de tinción de ICC y Pap permite tanto el análisis morfológico como la determinación de la sobre expresión de biomarcador. Se requerirá experimentación adicional para optimizar más el método. EJEMPLO 8 Equipo de inmunocitoquímica para la detección de sobreexpresión de biomarcador en muestras cervicales I. Principios del procedimiento Un equipo de prueba ¡nmunocitoquímico contiene reactivos que se requieren para completar un procedimiento de tinción inmunocitoquímica de tres etapas para especímenes cervicales en monocapa preparados de manera sistemática. Después de la incubación del anticuerpo monoclonal, este equipo utiliza un reactivo de visualización fácil de utilizar que se basa en tecnología de dextrano. Este reactivo consiste de una molécula secundaria de anticuerpo de chivo, antiratón y moléculas de peroxidasa de rábano unidas a una estructura principal de polímero de dextrano. La conversión enzimática del cromógeno agregado de manera subsecuente resulta en la formación de un producto de reacción visible en uno o varios de los sitios del antígeno. El espécimen después se somete a finción contrastante con hematoxilina, se aplica un agente que tiñe de azul y el portaobjetos se cubre con un cubreobjetos. Los resultados se interpretan utilizando un microscopio óptico. Se obtiene un resultado positivo indicativo de un alto grado de enfermedad cervical cuando las células de interés se tiñen de color café. Una galería de células potencialmente positivas se pueden crear utilizando equipo automatizado de generación de imagen. La galería después se puede observar para determinar un resultado positivo o un resultado negativo. El equipo de prueba inmunocitoquímico es aplicable para tinción tanto manual como automatizada.

II. Reactivos proporcionados Se incluyen en el equipo de prueba inmunocitoquímico los siguientes materiales, suficiente para 75 preparaciones de monocapa utilizando 200 µl de combinación monoclonal de ratón lista para utilizarse, por preparación.

CUADRO 40 Componentes del equipo de inmunocitoquímica Se requieren los siguientes materiales y reactivos para realizar los métodos de inmunocitoquímica pero no se suministran en el equipo: • toallas absorbentes • línea de células SiHa (TriPath Imaging, Inc.) • agua desionizada o destilada • etanol (95% y 100%) • cubreobjetos de vidrio • guantes • cámara húmeda • microscopio óptico (con objetivos 10x, 20x, 40x) • medio de montaje • pipetas y puntas de pipeta (capaces de suministrar volúmenes de 20 µl, 200 µl y 1000 µl) • amortiguador de preparación SureSlide (TriPath Imaging, Inc.) -amortiguador de pretratamiento (lauret-13-carboxilato de sodio 0.5% (Sandopan LS) en H20 desionizada) • recipientes o baños para tinción • cronometro (capaz de intervalos de 1-60 minutos) • solución salina amortiguada con Tris (TBS) • Tween 20 • control negativo de IgG de ratón universal • remolino • xileno o sustitutos de xileno • vaporizador/baño maría lll. Instrucciones para uso Preparación de espécimen Se siguen las siguientes etapas para la preparación de muestras cervicales: • Consultar el manual del operador para el sistema SurePath PreStain SystemMR, para la preparación de portaobjetos a partir de especímenes residuales. • Agregar 8 ml de fluido conservador SurePathMR a la muestra individual en el frasco SurePathMR (aproximadamente 2 ml). La muestra diluida se procesa en PrepMateMR utilizando la técnica estándar y en PrepStainMR utilizando la preparación de portaobjetos GYN versión 1.1. • Los portaobjetos preparados se colocan de inmediato en el amortiguador de pretratamiento durante un mínimo de 1 hora con un máximo de 72 horas antes de la inmunotinción. « Se debe utilizar recuperación de epítopo para un funcionamiento óptimo del equipo. Este procedimiento involucra remojar los portaobjetos preparados en el amortiguador de pretratamiento por un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente seguido por calentamiento del portaobjetos en el amortiguador de pretratamiento a 95°C. Los portaobjetos se mantienen a 95°C durante 15 minutos y se permite que se enfríen hasta la temperatura ambiente durante 20 minutos. Se recomienda el uso de un baño maría calibrado o un vaporizador vegetal capaz de mantener la temperatura requerida. Los laboratorios que se encuentran a altitudes mayores deben determinar el mejor método para mantener la temperatura requerida. El procedimiento de tinción se inicia inmediatamente después de la recuperación de epítopo y enfriamiento. El no cumplir cabalmente con el procedimiento descrito puede alterar los resultados.

Preparación de reactivo Se preparan los siguientes reactivos antes de la tinción: Solución salina amortiguado con Tris en Tween 20 0.05% (TBST) • Se prepara TBS de acuerdo con las especificaciones del fabricante. • Se agrega Tween 20 a una concentración final de 0.05%. • Se almacena a temperatura ambiente sí se utiliza en la siguiente semana. • Se puede almacenar solución no utilizada a 2-8°C durante 3 meses. • La solución es transparente e incolora. Se desecha la solución diluida sí presenta apariencia turbia. Solución de sustrato-cromógeno (DAB) (volumen suficiente para 5 portaobjetos) • Se transfiere 1 ml de sustrato amortiguado DAB a un tubo de prueba. • Se agrega una gota (20 - 30 µl) de DAB+ cromógeno. Se mezcla perfectamente y se aplica a los portaobjetos con una pipeta.

• Se prepara solución de sustrato-cromógeno fresca diariamente. • Cualquier precipitado que se desarrolle en la solución no afecta la calidad de la tinción.

IV. Protocolo de tinción (realizado a temperatura ambiente, 20-25°C) Se realizan las siguientes etapas para inmunotinción de muestras de citología cervical: Notas de Procedimiento para tinción • El usuario debe leer estas instrucciones con precaución y familiarizarse con todos los componentes antes de su uso. • Todos los reactivos están equilibrados a temperatura ambiente (20-25°C) antes de la inmunotinción. Todas las incubaciones se realizan a temperatura ambiente. • No permita que los portaobjetos se sequen durante el procedimiento de tinción. Las preparaciones celulares secas pueden mostrar una finción inespecífica aumentada. Cubran los portaobjetos expuestos a raspado. Los portaobjetos se deben colocar en una cámara húmeda para incubación prolongada. Recuperación de epítopo • Coloque los portaobjetos preparados en el amortiguador de pretratamiento por un mínimo de 1 hora a un máximo de 72 horas. • Incube durante 15 minutos a 95°C. • Retire la totalidad del recipiente coplin con portaobjetos del baño maría o del vaporizador y permita que los portaobjetos se enfríen en el amortiguador durante 20 minutos. • Enjuague los portaobjetos con diH20 y se transfiere a un baño TBST. Bloqueo con peroxidasa • Elimine con agua corriente el exceso de amortiguador. • Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad preparada (llenada con toallas de papel humedecidas con agua o con gasa). • Coloque 200 µl de reactivo de bloqueo de peroxidasa para cubrir el área de deposición de células. • Incube durante 5 minutos (± 1 minuto). • Enjuague el portaobjetos en TBST, 3 cambios, 2 minutos cada uno. Bloqueo de proteína • Elimine con agua corriente el exceso de amortiguador. • Coloque los portaobjetos en la cámara de humedad preparada (rellenada con toallas de papel o con gasa humedecidas con agua). • Coloque 200 µl de bloqueo de proteína para cubrir completamente el área de deposición de las células. • Incube durante 5 minutos (± 1 minuto). • No enjuague los portaobjetos. Combinación de anticuerpo primario • Elimine con agua corriente el exceso de bloqueo de proteína.

• Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad preparada (rellenada con toallas de papel o con gasa humedecidas con agua). ß Coloque 200 µl de combinación de anticuerpo primario (para cubrir completamente el área de deposición celular). • Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. • Enjuague cada portaobjetos individualmente con TBST utilizando una botella de lavado (no dirija el flujo directamente al área de deposición de células). Coloque el portaobjetos en un anaquel deslizable. • Enjuague los portaobjetos en TBST, 3 cambios, 2 minutos cada uno. Química de detección • Elimine con agua corriente el exceso de amortiguador. • Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad preparada (rellenada con toallas de papel o gasa humedecida con agua). • Coloque 200 µl de sonda de ratón para cubrir completamente el área de deposición de las células. • Incube durante 20 minutos (± 1 minuto). • Enjuague el portaobjetos en TBST, 3 cambios, 2 minutos cada uno. • Elimine con agua corriente el exceso de amortiguador. • Coloque el portaobjetos en una cámara de humedad preparada (rellenada con toallas de papel o gasa humedecida con agua).

• Coloque 200 µl de polímero para cubrir el área de deposición de células. • Incube durante 20 minutos (± 1 minuto). • Enjuague el portaobjetos en un baño TBST, 3 cambios, 2 minutos cada uno. • Elimine con agua corriente el exceso de amortiguador. • Coloque el portaobjetos en una cámara de humedad preparada (rellenada con toallas de papel o gasa humedecida con agua). • Coloque 200 µl de solución de trabajo DAB para cubrir completamente el área de deposición de células. • Incube durante 5 minutos (± 1 minuto). • Enjuague los portaobjetos durante 5 minutos en diH20 durante 5 minutos. Tinción contrastante • Enjuague los portaobjetos en TBST, 1 cambio durante 2 minutos. • Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad preparada (rellenada con toallas de papel o gasa humedecidas con agua). • Coloque 200 µl de hematoxilina para cubrir completamente el área de deposición de células. • Incube durante 1 minuto (± 10 segundos). • Enjuague los portaobjetos durante 3 minutos en H20 que corre.

• Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad preparada (rellenada con toallas de papel o gasa humedecidas con agua). • Tina de azul los portaobjetos al aplicar 200 µl de agente de tinción azul durante 1 minuto (± 10 segundos). • Repite el enjuagado con agua corriente durante 1 minuto. Montaje • Sumerja el portaobjetos en etanol 95%, 1 minuto o 25 inmersiones. • Sumerja el portaobjetos en alcohol absoluto, 4 cambios, 1 minuto cada uno o 25 inmersiones. • Aclare con xileno, 3 cambios, 1 minuto cada uno o 25 inmersiones. • Cubra los portaobjetos con un cubre objetos con un medio de montaje permanente no acuoso ufilizando cubreobjetos de vidrio.

V, Control de calidad Se consideran los siguientes temas de control de calidad cuando se utiliza el quipo de inmunocitoquímica descrito en este ejemplo: La variabilidad en resultados con frecuencia se deriva de diferencias en el manejo del espécimen y cambios en los procedimientos de prueba. Consulte las líneas de guía de control de calidad propuestas de la NCCLS Quality Assurance for Immunocytochemistry para información adicional.

La línea de células control está disponible de TriPath Imaging, Inc. Cada frasco contiene una línea de células de cáncer cervical, la cual es procesada de una manera similar que los especímenes clínicos. Se deben teñir dos portaobjetos en cada procedimiento de tinción. La evaluación de la línea de células de portaobjetos control indica la validez de la corrida de tinción.

VI. Interpretación de la tinción Portaobjetos control: El portaobjetos control teñido con el equipo de prueba inmunocitoquímico se examina Iniciadoro para determinar que todos los reactivos funcionan adecuadamente. La presencia de un producto de reacción café (tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobenc¡dina, DAB) en los núcleos de las células es indicativo de reactividad positiva. Especímenes del paciente: Se realiza evaluación del portaobjetos por un citotecnólogo o un patólogo utilizando microscopía óptica. Las células se revisan manual o electrónicamente almacenadas en una galería de imágenes derivada de un microscopio óptico. Se recolectan aproximadamente 1610 muestras cervicales que representan diversos diagnósticos. El siguiente cuadro indica el número de muestras analizadas utilizando el equipo de inmunocitoquímíca dentro de cada grupo de diagnóstico, determinado por tinción de Pap convencional o biopsia.

CUADRO 41 Especímenes de paciente dentro de cada grupo de diagnóstico (tinción de Pap) CUADRO 42 Especímenes de paciente dentro de cada qrupo de diagnóstico (biopsia) Guía de clasificación de portaobjetos Se sigue el siguiente procedimiento para la calificación de todos los portaobjetos analizados por los métodos de inmunocitoquímica descritos en este ejemplo: Etapa 1 : ¿Es un espécimen adecuado? El Bethesda System for reporting Cervical Cytology (segunda edición) establece "una preparación adecuada basada en líquido debe tener un mínimo calculado de por lo menos 5000 células escamosas bien visualizadas/bien conservadas". Estos mismos criterios se aplican cuando se evalúa la totalidad de los portaobjetos. No obstante, al igual que en una preparación Pap habitual, cualquier espécimen con células anormales, los cuales presenten una reacción molecular positiva, por definición, es satisfactoria para evaluación. Sí la respuesta a esta etapa es "sí", el citotecnólogo procede a la siguiente etapa; sí la respuesta es "no" el resultado se considera insatisfactorio para evaluación.

Etapa 2: /.Existe una tinción nuclear café moderada e intensa en células epiteliales? Las sustancias químicas de detección utilizadas en el equipo de inmunocitoquímica de este ejemplo (por ejemplo el equipo de química de detección SureDetect) tiñe núcleos displásicos asociados con > CIN 2 con un cromágeno café, DAB. Para responder "si" de esta etapa, las muestras se analizan para tinción café y se visualizan con facilidad. Sí solo es una cantidad ligera o "superpuesta" de color café es la que se observa, no es una garantía suficiente para considerarla positiva. Sí no se observa tinción nuclear café, esto se considera como un resultado de prueba negativo. Sí existe una tinción café adecuada, el análisis avanza a la siguiente etapa.

Etapa 3: /.Estas células escamosas (o glandulares) se tiñen en el núcleo de color café y la célula es = ASC (AGC)? Utilizando el mismo criterio morfológico indicado en The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology (segunda edición) ("TBS"), se determina sí la célula escamosa que contiene el núcleo café es > ASC (células escamosas atípicas). Esto puede incluir ASC-US, ASC-H, LSIL, HSIL y cancerosas. Sí la célula es de apariencia glandular, se aplica el criterio TBS para determinar sí una célula es > AGC (células glandulares atípicas). Esto puede incluir AGC endocervical, AGC endometrial, AIS y adenocarcinoma. Sí se considera que la célula es > ASC (o > AGC) entonces esto puede resultar en un resultado de prueba positivo. Sí las células en cuestión son consistentes con NILM (lesión negativa o intraepitelial o malignidad), esto puede ser un resultado de prueba negativo.

VIL Resultados Originalmente 27 casos se clasificaron como NIL por los métodos de finción de Pap convencionales que dan tinción positiva en la prueba de inmunocitoquímica. De estos 27 casos, 7 se clasificaron como HSIL, 10 como ASC-H, 3 como ASC-US y 3 como indeterminados ante una revisión por patólogos certificados en el extranjero. Los 7 casos HSIL se consideran enfermedad cervical de alto grado. Estos 27 casos se identificaron como de inmunotinción positiva en el ensayo de inmunocitoquímica por lo que indican el valor de los métodos descritos en la presente para identificar a pacientes mal clasificados como NIL por tinción Pap. Los resultados de biopsia no se obtienen para todos los especímenes NIL. Los cálculos de sensibilidad y valor de predicción positivos (PPV) para el método de inmunocitoquímica descrito en este ejemplo se calcula en base en la comparación de los resultados de biopsia de "norma dorada". Una sola biopsia tiene limitaciones respecto al estándar dorado. El PPV para el ensayo ICC mejora el monitoreo en serie del paciente utilizando un criterio de valoración quirúrgico más agresivo tal como un procedimiento de extracción electroquirúrgica de asa o biopsia de cono. Dado que la biopsia se sabe que genera un resultado negativo falso para enfermedad en por lo menos 31 %. Véase Elit et al. (2004) J. Lower Genital Tract Disease 8(3): 181-187.

CUADRO 43 Sensibilidad calculada y valor de predicción positivo de la prueba ICC en base en ios resultados de biopsia ^intervalo de confianza 95%) La sensibilidad de PPV y el método de inmunocitoquímica también se comparan con los obtenidos con tinción de Pap convencional. Se utilizan dos criterios de valoración clínicos para la tinción de Pap (es decir, > LSIL y > HSIL). Nuevamente, la norma para todos los cálculos es el resultado de la biopsia.

CUADRO 44 Comparación de la prueba Pap en el método de inmunocitoquímica *(95% de intervalo de confianza) Los resultados presentados en el cuadro 42 indican que el método de inmunocitoquímica detecta más muestras de enfermedad cervical de alto grado, pero al mismo tiempo mantiene un PPV alto. Se produjeron 14 resultados negativos falsos en este estudio utilizando el equipo de inmunocitoquímica. Se llevaron a cabo pruebas de HPV en 13 de los 14 muestras de paciente. No estaban disponibles muestras adicionales para uno de los pacientes con resultado negativo falso. Se aislo el ADN genómico de las muestras de citología cervical utilizando el equipo de ADN de tejido NucleoSpinMR (BD Clontech, Cat#635967). Con propósitos de control de calidad, se realiza el análisis por PCR de ß-globina, un gen constitutivo. La amplificación del gen L1 de HPV se realiza como se describe en la técnica tanto por PCR L1 convencional como con un conjunto de cebador MY09/11 por medio de PCR incrustada con MY09/11 y conjuntos de cebador GP5+/6+ para mejorar la sensibilidad de detección. El secuenciado de ADN del amplicon L1 se realiza adicionalmente para identificar uno o varios de los tipos de HPV presentes. El ADN genómico de buena calidad se aisla en 10 de los 13 muestras de citología clínica. Una cantidad de 3 muestras presenta un ADN genómico de poca calidad, como se indica por los análisis por PCR de ß-globina. El ADN HPV es ¡ndetectable o negativo en 10 de las 13 muestras utilizando PCR para L1 convencional (con cebadores MY09/11 ) y el PCR L1 incrustada (con cebadores MY09/11 y GP5+/6+). Estos datos indican que ocurrió un error de muestrado para la mayor parte de muestras negativas falsas, dado que HPV es positivo para enfermedad cervical de alto grado (sensibilidad de > 92%).

EJEMPLO 9 Selección de anticuerpo MCM6 Cribado de polídoma Los polidomas que se proporcionan en placas de tejido de pozos múltiples se analizan para identificar anficuerpo específicos del biomarcador MCM 6 que poseen los rasgos deseados de sensibilidad y especificidad. Se genera un microarreglo de tejido que comprende células normales múltiples (es decir, sin CIN), CINIII, carcinoma de células escamosas y muestras de adenocarcinoma en un solo portaobjetos. Los sobrenadantes no diluidos de cada pozo contiene un polidoma se someten a ensayo por tinción positiva del microarreglo de tejido. El fondo, es decir, la unión no específica, se ignora esencialmente en está etapa. Una cantidad de once de los 35 polidomas probados producen resultados de tinción positivos y se seleccionan para análisis adicional. Con el fin de determinar la especificidad de los polidomas seleccionados, se comparan los patrones de tinción obtenidos con los sobrenadantes de polidoma y los obtenidos con un anticuerpo para MCM 6 disponible comercialmente (BD Transduction Laboratories). Los patrones de tinción obtenidos con los sobrenadantes de polidoma parecen ser más específicos que los observados con el anticuerpo MCM 6 comercial (figura 17). Los 11 polidomas seleccionados después se someten a un procedimiento de dilución limitante. Se ensayan treinta diluciones limitantes, que resultan de los sobrenadantes de los polidomas seleccionados, para tinción posifiva de un microarreglo de tejido que comprende células normales múltiples (es decir, sin CIN), CINlll, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma. Se selecciona dos clones de dilución limitante 9D4.3 y 9D4.4 como los mejores sobrenadantes en base en la tinción positiva de muestras de tejido anormal y cervical canceroso. Las diluciones variables de estos clones después se prueban para determinar su reactividad a NIL, LSIL, tejido HSIL y ejemplos de citología basada en líquido acumulado. El clon 9D4.3 a una dilución 1 :100 produce una relación máxima señal a ruido y se selecciona para caracterización adicional. Caracterización de MCM 6, clon 9D4.3 Con el fin de caracterizar adicíonalmente el clon 9D4.3, se realiza un ensayo del clon para tinción positiva de 40 muestras de citología basadas en líquido que se seleccionan de las siguientes categorías de diagnóstico: NIL (7), LSIL (10), HSIL (18) y carcinoma cervical (5). Los portaobjetos se preparan utilizando el procesador de portaobjetos PrepStainMR (TriPath Imaging, Inc.) para cada una de las 40 muestras. Cada una de los dos portaobjetos por muestra se tiñen con un anficuerpo MCM 2 (Dako) y el clon 9D4.3. Los portaobjetos remanentes se utilizan para tinción por PAP o como un control negativo. Para preparar los portaobjetos, cada muestra se centrifuga durante 2 minutos a 200 x g para formar un sedimento, y se decanta el sobrenadante. Se agregan a cada muestra 2 ml de agua desionizada y las muestras se someten a remolino y después se centrifugan durante 5 minutos a 600 x g. Después de decantar el sobrenadante se agregan 700 µl adicionales de agua amortiguada con tris. Finalmente las muestras se cargan en un precursor de portaobjetos PrepStainMR (Tripath Imaging, Inc.) versión 1 .1 y se corre el programa de transferencia únicamente.

Todos los portaobjetos se mantienen en ETOH 95% durante por lo menos 24 horas y no más de 3 días después de la preparación. La recuperación de antígeno para MCM2 se obtiene al colocar los portaobjetos en un baño de solución de recuperación objetivo 1 x, pH 6.0 (DAKO S1699)/dH20, precalentado a 95°C durante 25 minutos en un evaporador. Para MCM6, se obtiene accesibilidad de antígeno al colocar los portaobjetos en un baño de amortiguador tris 1 x, pH 9.5 (Biocare)/dH20, precalentado a 95°C durante 25 minutos en un evaporador. Después del tratamiento con vapor, todos los portaobjetos se permite que se enfríen a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los portaobjetos se tiñen por inmunocitoquímica utilizando el equipo DAKO universal Autostainer como se describe en el ejemplo 1 , "inmunocitoquímica automatizada". Los portaobjetos se analizan y evalúan por un citotecnólogo experimentado para determinación morfológica de categoría de diagnóstico. Las muestras se determinan para intensidad de tinción de marcador (0-3), porcentaje de células de tinción positiva y la ubicación de la tinción del marcador (nuclear, citoplásmica, membranal o una combinación). La intensidad de la tinción de la célula se le proporciona una calificación de 0-3. Se cuentan células con calificación > 1.5. Las células escamosas con apariencia normal, maduras, y células glandulares con apariencia normal no se cuentan como positivas cuando se tiñen de café. No obstante, las células metaplásicas escamosas se cuentan como positivas junto con células anormales. Los portaobjetos de inmunocitoquímica después se les proporciona una designación de TN (negativo verdadero), FN (negativo falso), TP (positivo verdadero) o FP (positivo falso).

CUADRO 45 Clon 9D4.3 (MCM6) TP FP FN TN Intotal determinado NIL 1 LSIL 10 HSIL 24 Cáncer 5 28 1 10 0 40 CUADRO 46 MCM2 TP FP FN TN In- total determinado NIL 1 LSIL 10 HSIL 24 Cáncer 5 27 1 10 0 40 Cálculos Utilizados Sensibilidad = TP/(TP + FN) Especificidad = TN/(FP + TN) Potencia de predicción positiva (PPP) = TP/(TP + FP) Potencia de predicción negativa (NPP) = TN/(FN + TN) La sensibilidad y especificidad para el clon 9D4.3 es comparable on la que se obfiene con el anticuerpo MCM2 disponible comercialmente. Un caso NIL es negativo para ambos anticuerpos. Un total de 9 de 10 casos LSIL son negativos con el clon 9D4.3 y el anticuerpo MCM2 comercial. Un total de 23 de los 24 casos HSIL son positivos con el clon 9D4.3, y el anticuerpo MCM2 comercial. Con las muestras dé cáncer cervical, 5 de 5 fueron positivos con el clon 9D4.3 y 4 de 5 fueron positivos con el anticuerpo MCM 2. Purificación de MCM 6, clon 9D4.3 Debido a su sensibilidad, especificidad y presentación del patrón de teñido nuclear, se purifica el clon 9D4.3 para análisis adicional. El anticuerpo purificado se obtiene utilizando cromatografía de adsorción de afinidad Streamline rProteinA (Amersham Biosciences), de acuerdo con los métodos estándar. La solución de anticuerpo resultante después se prueba para reactividad contra acumulados de citología cervical basados en líquido HSIL a diversas diluciones entre 1 :500 y 1 :6000. La señal es evidente hasta un título de 1 :6000.

EJEMPLO 10 Detección de PCR en tiempo real de Biomarcadores en Muestras Clínicas de Teiido Se realiza PCR en tiempo real TaqManMR con el sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Los cebadores y las sondas se diseñan con la ayuda del programa Iniciador ExpressMR versión 1.5 (Applied Biosystems) para amplificación específica de los biomarcadores cervicales dirigidos (es decir, MCM7,p21waf1, p14ARF/p16, ciclina E1 y ciclina E2) en este estudio. La información de secuencia para los cebadores y las sondas se muestra a confinuación: MCM7: Nombre dei Cebador: MCM7_T1T3-F Secuencia: CTCTGAGCCCGCCAAGC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25) Nombre del Cebador: MCM7_T1T3-R Secuencia: TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26) Nombre de la Sonda: MCM7_T1T3-Probe Secuencia: CCCTCGGCAGCGATGGCACT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 27) Nombre del Cebador: MCM7_T2T4-F Secuencia: GAGGAATCCCGAGCTGTGAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 28) Nombre del Cebador: MCM7_T2T4-R Secuencia: CCCGCTCCCGCCAT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 29) Nombre de la Sonda: MCM7 T2T4-Probe Secuencia: CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 30) Nombre del Cebador: MCM7_J2-F Secuencia: GTCCGAAGCCCCCAGAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 31 ) Nombre del Cebador: MCM7_T2-R Secuencia: CCCGACAGAGACCACTCACA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 32) Nombre de la Sonda: MCM7_T2-Probe Secuencia: CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 33) Nombre del Cebador: MCM7_T3T4-F Secuencia: CGCTACGCGAAGCTCTTTG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 34) Nombre del Cebador: MCM7_T3T4-R Secuencia: CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 35) Nombre de la Sonda: MCM7_T3T4-Probe Secuencia: TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 36) p21 wafl .

Nombre del Cebador: p21T1T2-F Secuencia: CAAACGCCGGCTGATCTT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 37) Nombre del Cebador: p21T1T2-R Secuencia: CCAGGACTGCAGGCTTCCT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 38) Nombre de la Sonda: ?21T1T2-Probe Secuencia: CAAGAGGAAGCCCTAATCCGCCCA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 39) Nombre dei Cebador: p21T2-F Secuencia: GAGCGGCGGCAGACAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 40) Nombre del Cebador: p21T2-R Secuencia: CCGCGAACACGCATCCT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 41) Nombre de la Sonda: p21T2-Probe Secuencia: CCCAGAGCCGAGCCAAGCGTG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 42) Nombre del Cebador: p21T3-F Secuencia: TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 43) Nombre del Cebador: p21T3-R Secuencia: TCCAGTCTGGCCAACAGAGTT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 44) Nombre de la Sonda: p21T3-Probe Secuencia: CGGCGGCAGACCAGCATGAC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 45) p14ARF/p16: Nombre del Cebador: p16T4-F Secuencia: GCC CTC GTG CTG ATG CTA CT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 46) Nombre del Cebador: p16T4-R Secuencia: TCA TCA TGA CCT GGT CTT CTA GGA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 47) Nombre de la Sonda: p16T4-Probe Secuencia: AGC GTC TAG GGC AGC AGC CGC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 48) Nombre del Cebador: p16T1 -F Secuencia: TGCCCAACGCACCGA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 49) Nombre del Cebador: p16T1-R Secuencia: GGGCGCTGCCCATCA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 50) Nombre de la Sonda: p16T1 -Probé Secuencia: TCGGAGGCCGATCCAGGTCATG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 51) Nombre del Cebador: p16T2-F Secuencia: AAGCTTCCTTTCCGTCATGC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 52) Nombre del Cebador: p16T2-R Secuencia: CATGACCTGCCAGAGAGAACAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 53) Nombre de la Sonda: p16T2-Probe Secuencia: CCCCCACCCTGGCTCTGACCA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 54) Nombre del Cebador: p16T3-F Secuencia: GGAAACCAAGGAAGAGGAATGAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 55) Nombre del Cebador: p16T3-R Secuencia: TGTTCCCCCCTTCAGATCTTCT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 56) Nombre de la Sonda: p16T3-Probe Secuencia: ACGCGCGTACAGATCTCTCGAATGCT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 57) Nombre del Cebador: p16 Universal-F Secuencia: CACGCCCTAAGCGCACAT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 58) Nombre del Cebador: 16 Universal-R Secuencia: CCTAGTTCACAAAATGCTTGTCATG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 59) Nombre de la Sonda: p16 Sonda Universal Secuencia: TTTCTTGCGAGCCTCGCAGCCTC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 60) Ciclina E1 : Nombre del Cebador: CCNE1T1T2-F Secuencia: AAAGAAGATGATGACCGGGTTTAC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 61) Nombre del Cebador: CCNE1T1T2-R Secuencia: GAGCCTCTGGATGGTGCAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 62) Nombre de la Sonda: CCNE1T1T2-P Secuencia: CAAACTCAACGTGCAAGCCTCGGA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 63) Nombre del Cebador: CCNE1T1-F Secuencia: TCCGCCGCGGACAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 64) Nombre del Cebador: CCNE1T1-R Secuencia: CATGGTGTCCCGCTCCTT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 65) Nombre de la Sonda: CNE1T1 -Probé Secuencia: ACCCTGGCCTCAGGCCGGAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 66) Ciclina E2 Nombre del Cebador: CCNE2T1T2-F Secuencia: GGAATTGTTGGCCACCTGTATT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 67) Nombre del Cebador: CCNE2T1T2-R Secuencia: CTGGAGAAATCACTTGTTCCTATTTCT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 68) Nombre de la sonda TaqMan: CCNE2T1T2-P Secuencia: CAGTCCTTGCATTATCATTGAAACACCTCACA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 69) Nombre del Cebador: CCNE2T1T3-F Secuencia: TCAACTCATTGGAATTACCTCATTATTC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 70) Nombre del Cebador: CCNE2T1T3-R Secuencia: ACCATCAGTGACGTAAGCAAACTC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 71 ) Nombre de la sonda TaqMan: CCNE2T1T3-P Secuencia: CCAAACTTGAGGAAATCTATGCTCCTAAACTCCA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 72) Nombre del Cebador: CCNE2T2-F Secuencia: TTTTGAAGTTCTGCATTCTGACTTG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 73) Nombre del Cebador: CCNE2T2-R Secuencia: ACCATCAGTGACGTAAGCAAGATAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 74) Nombre de la sonda TaqMan: CCNE2T2-P Secuencia: AACCACAGATGAGGTCCATACTTCTAGACTGGCT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 75) Las sondas se marcan con colorante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) en la base 5' y un colorante de extinción TAMRA (6-carboxitetramefilrodamina) en la base 3'. Los tamaños de los amplicones son de aproximadamente 100 pares de bases. Se utiliza ARN ribosómico 18S como un control endógeno. Se marca una sonda de ARNr 18S con un colorante fluorescente VIC R. La mezcla de cebador ARNr 18S/sonda predesarrollada se adquiere de Applied Biosystems. Se convierte cuantitativamente 5 µg de ARN total extraído de tejido cervical normal (N) o canceroso (T) a la forma de ADNc de cadena sencilla con hexámeros aleatorios mediante la utilización del equipo High-Capacity cADN Archive (Applied Biosystems). Se preparan los siguientes reactivos de reacción: Mezcla Maestra 20X de Cebadores/Sonda (en 200 µl) 180 µM de cebador directo 20 µl 180 µM de cebador inverso 20 µl 100 µM de sonda TaqMan 10 µl H20 150 µl Mezcla de Reacción Final (25 ul/pozo) 20X de mezcla maestra de cebadores/sonda 1.25 µl 2X de mezcla maestra de PCR Universal TaqMan (P/N: 4304437) 12.5 µl Plantilla de ADNc 5.0 µl H20 6.25 µl Se adquiere mezcla maestra PCR Universal TaqMan 20X de Applied Biosystems. Las concentraciones del cebador final y la sonda, en un volumen total de 25 µl es de 0.9 µlM y 0.25 µM, respectivamente. Se aplican a cada pozo 10 ng de ARN total. Las condiciones de amplificación son 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C y un ciclo de dos etapas de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 60 segundos para un total de 40 ciclos. Se incluyen en cada corrida por lo menos tres mezclas de reacción control sin plantilla. Todos los experimentos se realizan por triplicado. Al final de cada reacción, se utiliza la intensidad de fluorescencia registrada para los siguientes cálculos: Rn+ es el valor Rn de una reacción que contiene todos los componentes. Rn" es el vaior de Rn de una muestra que no ha reaccionado (valor inicial del valor detectado en NTC). ?Rn es la diferencia entre Rn+ y Rn' y es un indicador de la magnitud de la señal generada por la PCR. El método Ct comparativo, el cual no utiliza una cantidad conocida de estándar sino que compara la cantidad relativa de la secuencia objetivo con cualquier valor de referencia seleccionado (por ejemplo ARNr 18S) es el que se utiliza en este estudio. Se utiliza el protocolo TaqManMR Human Endogenous Control Píate para convertir datos sin tratar para análisis de datos en PCR en tiempo real.

Resultados Los resultados se obtenidos con cada biomarcador y con los cebadores específicos se incluyen a continuación en forma tabular. Los resultados que se obtienen con muestras de tejido cervical normal (es decir, NIL) se les denomina como N; aquellos obtenidos con tejidos de cáncer cervical se les marca como T.

CUADRO 47 Resultados de MCM7 TaqMan MR CUADRO 48 Resultados de p21 wwaaftl? TaqMan .MR CUADRO 49 Resultados de Pi4ARFp1ß TaqMan1 MR CUADRO 50 Resultados de Ciclina E1 TaqMan MR CUADRO 51 Resultados de Ciclina E2 TaqMan1 MR EJEMPLO 11 Detección de PCR en tiempo real de Biomarcadores en Muestras de Tejido Clínico La PCR en tiempo real TaqManMR se realiza como se describe en el ejemplo 9 utilizando muestras de tejido de cáncer cervical (por ejemplo adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas) y muestras de tejido cervical normal. Los cebadores y las sondas se diseñan con la ayuda del programa Iniciador ExpressMR versión 1-5 (Applied Biosystems), para amplificación específica de los biomarcadores cervicales dirigidos (es decir, MCM2, MCM6, MCM7 y Topo2A) en este estudio. La información de secuencia para cebadores y sondas se muestra a continuación: Cebadores TaqMan MCM2: Nombre del Cebador: MCM2-F Secuencia: 5'-GGAGGTGGTACTGGCCATGTA-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 80) Nombre del Cebador: MCM2-R Secuencia: 5'-GGGAGATGCGGACATGGAT-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 81 ) Nombre de la Sonda: MCM2-P Secuencia: 5'-CCAAGTACGACCGCATCACCAACCA-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 82) MCM6: Nombre del Cebador: MCM6-F Secuencia: 5'-CATTCCAAGACCTGCCTACCA-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 83) Nombre del Cebador: MCM6-R Secuencia: 5'-ATGCGAGTGAGCAAACCAATT-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 84) Nombre de la sonda TaqMan: MCM6-P Secuencia: 5'-ACACAAGATTCGAGAGCTCACCTCATCCA-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 85) MCM7: Nombre del Cebador: MCM7 T1T3-F Secuencia: CTCTGAGCCCGCCAAGC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25) Nombre del Cebador: MCM7_T1T3-R Secuencia: TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26) Nombre de la sonda: MCM7_T1T3-Probe Secuencia: CCCTCGGCAGCGATGGCACT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 27) Nombre del Cebador: MCM7_T2T4-F Secuencia: GAGGAATCCCGAGCTGTGAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 28) Nombre del Cebador: MCM7_T2T4-R Secuencia: CCCGCTCCCGCCAT (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 29) Nombre de la Sonda: MCM7_T2T4-Probe Secuencia: CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 30) Nombre del Cebador: MCM7_T2-F Secuencia: GTCCGAAGCCCCCAGAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 31 ) Nombre del Cebador: MCM7_T2-R Secuencia: CCGACAGAGACCACTCACA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 32) Nombre de la Sonda: MCM7_T2-Probe Secuencia: CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 33) Nombre del Cebador: MCM7_T3T4-F Secuencia: CGCTACGCGAAGCTCTTTG (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 34) Nombre del Cebador: MCM7_T3T4-R Secuencia: CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 35), Nombre de la Sonda: MCM7_T3T4-Probe Secuencia: TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 36) TOPO2A Nombre del Cebador: TOP2A_F Secuencia: 5'-GGCTACATGGTGGCAAGGA-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 86) Nombre del Cebador: TOP2A_R Secuencia: 5'-TGGAAATAACAATCGAGCCAAAG-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 87) Nombre de la sonda TaqMan: TOP2A_P Secuencia: 5'-TGCTAGTCCACGATACATCTTTACAATGCTCAGC-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 88) Resultados Los resultados obtenidos de cada biomarcador se incluyen a continuación en forma tabular. Los datos también se resumen en lo siguiente.

CUADRO 52 Muestras de Tejido de Cáncer Cervical Congeladas de Inmediato CUADRO 53 Muestras de Tejido Normal Adyacente Resumen de Resultados CUADRO 54 Tumor versus adyacente normal Marcador Tumor (M ± SD) Normal (M ± SD) R MCM2 17.43 ±7.34 3.71 ±2.21 4.70 <0.0001 MCM6 14.32 ±4.32 4.12 ±1.56 3.48 <0.0001 MCM7 19.38 ±6.94 5.85 ± 2.59 3.31 <0.0001 TOP2A 20.53 ± 7.54 5.56 ± 3.33 3.69 <0.0001 M: Media, SD: Desviación Estándar; R: Proporción de las Medias de tumor versus normal; P: Valor P de la prueba t.

CUADRO 55 HPV-16 versus HPV-18 Marcador Tipo de Casos Tumor (M ± SD) Normal (M ± SD) Tumor HPV MCM2 16 18 16.77 ±6.78 3.29 ±2.13 18 8 17.23 ±8.16 3.99 ± 2-40 16+18 6 14.52 ±7.18 4.27 ± 2.47 MCM6 16 18 14.19 ±4.44 3.97 ±1.75 18 8 14.24 ±4.10 4.35 ±1.54 16+18 6 12.38 ±3.89 3.92 ±1.04 MCM7 16 18 19.39 ±6.94 6.07 ± 2.98 18 8 17.23 ±4.16 5.07 ±1.91 16+18 6 18.04 ±7.71 6.07 ± 2.56 TOP2A 16 18 20.92 ± 7.38 5.46 ± 4.26 18 8 16+18 6 &BitS 6.19 ±3.33 5.32 ± 3.57 Carcinoma de Células Escamosas versus Adenocarcinoma Marcador Histopatología Casos Tumor (M ± SD) Normal (M ± SD) MCM2 SCC 30 17.66 ± 7.28 3.74 ± 2.23 AC 4 15.72 ± 8.69 3.39 ± 2.49 MCM6 SCC 30 14.48 ± 4.44 4.13 ± 1.55 AC 4 13.16 ± 3.49 4.03 ± 1.98 MCM7 SCC 30 19.27 ± 7.25 6.01 ± 2.58 AC 4 20.20 ± 4.57 4.32 ± 2.53 TOP2A SCC 30 20.01 ± 7.47 5.65 ± 3.34 AC 4 21.47 ± 7.87 4.77 ± 3.92 SCC: Carcinoma de Células Escamosas; AC: Adenocarcinoma EJEMPLO 12 Detección por PCR en Tiempo Real de Biomarcadores en Líneas de Célula de Cáncer Cervical y de Mama Se realiza PCR en tiempo real TaqManMR para detectar niveles de presión MCM2, MCM6 y MCM7 en líneas de células de cáncer cervical y de mama.

Diseño Experimental y Protocolos Se adquieren de ATCc y se ufilizan en este experimento tres líneas de células de cáncer cervical humanas de SiHa, Caski y HeLa así como tres líneas de células de cáncer de mama humano, MCF-7, SK-BR3 y CAMA.

Se extrae el ARN total celular de células recién cultivadas con el equipo RNeasyMR Protect Mini (Qiagen, Valencia, CA) y se convierte en la forma de ADNc de cadena sencilla con hexámeros aleatorios utilizando High-Capacity cADN Archive Kit (Applied Biosystems, P/N: 4322171 ). Se realiza PCR en tiempo real en el sistema de detección de secuencia ABI PrismMR 7700 utilizando TaqManMR Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Los cebadores y sondas para amplificación específica de MCM2, MCM6 y MCM7 se diseñan con el programa ABI Iniciador ExpressMR, v1-5. MCM7 contiene cuatro variantees transcripcionales: la variantee 1 de transcripto (T1 , refseq NM_005916) y la variantee 2 de transcripto (T2, refsq NM_182776) se identifican en la base de datos nucleotídicas NCBI Entrez. La variantee T3 y T4 tiene exones alternados cerca del extremo 5' como se analiza por el montaje EST a través del marcador de modelo NCBI. Los cebadores y sondas se designan como T1T3, T2T4, T2 y T3T4 específicamente para detectar las variantees T1 y T3, T2 y T4, T2 y T3 y T4, respectivamente. En los ejemplos 10 y 11 anteriores se muestran las secuencias de cebadores y sondas. Las sondas se marcan con colorante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) en la base 5' y un colorante de extinción TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina) en la base 3'. Se utiliza ARN ribosómico 18S como control endógeno. La sonda de ARNr 18S se marca con el colorante fluorescente VIC. La mezcla de cebador/sonda de ARNr 18S revelada previamente se adquiere de Applied Biosystems. Se aplican 10 ng de ADNc a la mezcla de reacción que contiene 0.9 µM y 0.25 µM de los cebadores y sondas, respectivamente, en un volumen total de 25 µl. Las condiciones de amplificación son: 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C y 1 ciclo de dos etapas de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 60 segundos, para un total de 40 ciclos. En cada corrida se incluyen por lo menos tres mezclas de reacción control sin plantilla. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Se utiliza el método de cuantificación relativa para calcular los niveles de expresión de los genes objetivo en relación al control endógeno 18S, en base en sus valores CT siguiendo el manual del usuario ABI (P/N 4303859).

Resultados Los resultados que se obtienen para cada biomarcador se incluye a continuación en forma de cuadro.

CUADRO 57 Expresión de Biomarcador en Líneas de Células de Cáncer Cervical y de Mama Conclusiones Se demuestra que la línea de células HeLa cervical tiene bajos niveles de expresión de los biomarcadores MCM2, MCM6 y MCM7. Las líneas de células de cáncer cervical SiHa, de mama MCM7 y CAMA todas muestran sobreexpresión de los biomarcadores MCM2, MCM6 y MCM7. Las líneas de células de cáncer cervical Caski y de mama SK-BR3 muestran sobreexpresión de MCM7, pero una baja expresión de MCM2 y MCM6.

EJEMPLO 13 Inducción de Expresión de Biomarcador Cervical en Céiulas 293 por Transfección del Gen E6/E7 de HPV16 Transitorio Se utiliza el ensayo de PCR en tiempo real TaqManMR para investigar el enlace de la expresión del biomarcador cervical con la transcripción de oncogen HPV de alto riesgo en un sistema de líneas de células HEK 293.

Diseño Experimental y Protocolos En este experimento se adapta un sistema de expresión regulado por tetraciclina (T-Rex system, Invitrogen, Inc). Se construyen vectores T-Rex que expresan la proteína HPV16 E2, E6 o E7. Se utilizan como controles negativos los vectores que contienen los genes mutantes E2, E6 o E7. Después se transfectan células T-Rex 293 con los plásmidos HPV y se activa la expresión de los genes HPV por tetraciclina durante 4 horas, 24 horas y 72 horas. El ARN celular total se extrae de las células transfectadas por RNeasyMR Protect Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) y se convierte en la forma de ADNc de cadena sencilla con hexámeros aleatorios utilizando High-Capacity cADN Archive Kit (Applied Biosystems, P/N: 4322171 ). Se realiza PCR en tiempo real en el sistema de detección de secuencia ABI PrismMR 7700 utilizando TaqManMR Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Los cebadores y sondas para amplificación específica de MCM2, MCM6, MCM7, TOP2A, Ciclina E1 , p21 , p14, HPV16 E2, E6 y E7 se diseñan con el programa ABI Iniciador ExpressMR, v1.5. MCM7 contiene cuatro variantees transcripcionales: la variantee 1 de transcripto (T1 , refseq NM_005916) y la variantee 2 de transcripto (T2, refsq NM_182776) se identifican en la base de datos nucleotídica NCBI Entrez. La variantee T3 y T4 tiene exones alternados cerca del extremo 5' como se analiza por el montaje EST a través del elaborador de modelo NCBI. Los cebadores y sondas se designan como T1T3, T2T4, T2 y T3T4 específicamente para detectar las variantees T1 y T3, T2 y T4, T2 y T3 y T4, respectivamente. En los ejemplos 10 y 11 se muestran las secuencias de cebadores y sondas. Las sondas se marcan con colorante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) en la base 5' y un colorante de extinción TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina) en la base 3'. Se utiliza ARN ribosómico 18S como control endógeno. La sonda de ARNr 18S se marca con un colorante fluorescente VIC. La mezcla de cebador/sonda de ARNr 18S revelada previamente se adquiere de Applied Biosystems. Se aplican 10 ng de ADNc a la mezcla de reacción que contiene 0.9 µM y 0.25 µM de los cebadores y sondas, respectivamente, en un volumen total de 25 µl. Las condiciones de amplificación son: 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C y 1 ciclo de dos etapas de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 60 segundos, para un total de 40 ciclos. En cada corrida se incluyen por lo menos tres mezclas de reacción control sin plantilla. Todos los experimentos se realizan por duplicado. Se utiliza el método de cuantificación relativa para calcular los niveles de expresión de los genes objetivo en relación al control endógeno 18S, en base en sus valores CT siguiendo el manual de usuario ABl (P/N 4303859).

Resultados Se observa que se incrementa la expresión de los genes HPV16 E2, E6 y E7 en células T-Rex 293 a través del curso en el tiempo de transfección. La expresión de ARNm de Topo2A, MCM2, MCM6, MCM7 y ciclina E en células T-Rex 293 se induce de manera significativa por los genes HPV16 E6 o E7, después de la transfección de 4 horas hasta 72 horas. No obstante, no existe niveles de expresión elevados detectados para p21 y p14 después de la transfección del gen HPV. La expresión de E6 o E7 no parece estar reprimida por la co-tranfección de gen E2. Esto es debido a que la expresión de E6 o E7 es impulsada de manera pura por el promotor CMV externo en vez de los promotores HPV naturales. Esto último no se presenta n este sistema de modelo.

CUADRO 58 Topo2A CUADRO 59 MCM2 CUADRO 60 MCM6 CUADRO 61 MCM7 CUADRO 62 Ciclina E1 CUADRO 63 p21 CUADRO 64 p14 CUADRO 65 HPV16 E2 CUADRO 66 HPV16 E6 CUADRO 67 HPV16 E7 EJEMPLO 14 Accesibilidad Aumentada de Antígeno en Inmunocitoquímica y Métodos de Inmunohistoquímica que Utilizan un Amortiguador de Pretratamiento de Portaobjetos Selección de Espécimen y Descripción de Reactivo La citología pariada y ios especímenes de histología, del mismo paciente, se someten a inmunoensayos para detectar la sobreexpresión de biomarcador. Se analizan muestras de residuo de bloque de parafina y especímenes de citología SurePathMR de pacientes clasificados como ASCUS (3), LSIL (6) y HSIL (5). Los reactivos utilizados con la combinación de anticuerpos (para citología), la combinación modificada de anticuerpos (para histología) reactivos de detección, tinción contrastante y amortiguador de preparación SureSlideMR 10X (amortiguador de pretratamiento).

Preparación del Portaobjetos para Citología e Inmunocitoquímica Automatizada Para inmunocitoquímica, la preparación del portaobjetos y el pretratamiento se llevan a cabo como se indica en el ejemplo 5. Después se realiza inmunocitoquímica automatizada en cada espécimen de citología como se describe en el ejemplo 5, con una excepción. La combinación de anticuerpo primario (MCM2 Clon 26H6.19 1 :10,000, MCM2 Clon 27C5.6 1 :800, TOPIIA Clon SWT3D1 1 :1000) se reduce la incubación a 30 minutos para este experimento.

Preparación del Portaobjetos para Histología e Inmunohistoquímica Automatizada Para cada caso, se cortan secciones de 4 micrómetros y se secan durante la noche o por 20 minutos en un horno de aire forzado a 70°C A las secciones se les quita la parafina en 3 cambios de xileno durante 5 minutos cada una. Los portaobjetos después se aclaran en alcohol absoluto durante 5 minutos cada uno. Los portaobjetos se remojan en agua y se enjuagan perfectamente. Los portaobjetos se transfieren a una solución precalentada de amortiguador de preparación SureSlide 1X y se incuban en un evaporador durante 25 minutos. Los portaobjetos se retiran del vaporizador y se permite que se enfríen a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los portaobjetos se enjuagan lentamente en agua hasta que se cambia por completo el amortiguador. Se aplica un enjuagado con TBST para 2 cambios, de 2 minutos cada uno. La inmunohistoquímica automatizada se lleva a cabo como se describe en el ejemplo 5 para inmunocitoquímica, con dos excepciones. La incubación de la combinación de anticuerpo primario se reduce a 30 minutos para este experimento. De manera adicional, la combinación de anticuerpo primario se modifica con las siguientes diluciones (MCM2 Clon 26H6.19 1 :4,000, MCM2 Clon 27C5.6 1 :200, TOPOIIA Clon SWT3D1 1 :400).

Resultados Se observaron patrones de tinción anticipados en especímenes tanto de histología como de citología con el uso de los reactivos RUÓ. Específicamente, se demostró con éxito la capacidad para inmunoteñir los especímenes tanto de histología como de citología con el amortiguador de preparación SureSlideMR, reactivo de detección y los reactivos de tinción contrastante.

CUADRO 68 Nucleótido Biomarcador e Información de Secuencia de Aminoácidos En base en la descripción y ejemplos anteriores, una persona experta en la técnica apreciará que los métodos de la invención permiten detección superior de enfermedad cervical de alto grado, independiente de la edad, en comparación con la práctica convencional. Los métodos de la invención pueden encontrar uso particular como se describe en lo siguiente: • Para mujeres con más de 30 años de edad, la prueba puede ser un reflejo ya sea de un resultado HPV positivo o el reflejo de un resultado de ASCUS+ citología. • Para mujeres menores de 30 años de edad, la prueba se puede utilizar en combinación con citología para la detección de enfermedad cervical de alto grado. • Para mujeres con más de 30 años de edad, la prueba se puede utilizar en combinación con citología para la detección de enfermedad cervical de alto grado. • Para mujeres de menos de 30 años de edad, la prueba se puede utilizar como un análisis primario para detectar enfermedad cervical de alto grado. • Para mujeres de más de 30 años de edad, la prueba se puede utilizar como un análisis primario para detectar enfermedad cervical de alto grado. « La prueba puede ser una sustitución para el frotis Pap en mujeres menores de treinta años de edad. • Finalmente, la prueba puede ser una sustitución para el frotis Pap, independiente de la edad. Otras ventajas potenciales que se encuentran en la práctica de la presente invención incluyen: • Detección de anomalías histológicas de alto grado en mujeres de más de 30 años de edad con resultados NIL/HPV positivo. • La especificidad superior para la detección de la enfermedad cervical de alto grado en mujeres con más de 30 años de edad quienes son positivas para la prueba ADN+Pap. • Detección superior para enfermedad cervical de alto grado en mujeres dentro de las categorías ASC-US, ASC-H y LSIL, independiente de la edad. • Especificidad superior para la detección de enfermedad cervical de alto grado dentro de la categoría LSIL. • Detección de enfermedad cervical de alto grado junto con diagnóstico basado en citología en mujeres menores de 30 años de edad. • Detección de enfermedad cervical de alto grado junto con diagnóstico basado en citología, independiente de la edad. • Especificidad mejorada para la detección de enfermedad cervical de alto grado como un análisis primario en mujeres menores de 30 años de edad. • Especificidad mejorada para la detección de enfermedad cervical de alto grado como análisis primario, independiente de la edad. • Identificación de la enfermedad cervical y diferenciación de la infección por HPV y enfermedad cervical de alto grado. • Se puede establecer un funcionamiento de ensayo aceptable ufilizando interpretación manual o interpretación asistida vía mícrocoscopía automatizada. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan en la presente como referencia en la misma medida a si cada publicación o solicitud de patente individual fuera indicada de manera específica e individual para ser incorporada como referencia. Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, será evidente que se pueden llevar a la práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las modalidades anexas.

Claims (88)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para el diagnóstico de enfermedad cervical de alto grado en un paciente, el método está caracterizado porque comprende detectar la sobreexpresión de por lo menos un biomarcador nuclear en una muestra de cuerpo del paciente, en donde la detección de sobreexpresión del biomarcador nuclear identifica específicamente las muestras que son indicativas de enfermedad cervical de alto grado.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la detección de sobreexpresión del biomarcador distingue muestras que son indicativas de enfermedad cervical de alto grado a partir de muestras que son indicativas de proliferación benigna, infección por HPV en etapa temprana o displasia ligera.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el método para el diagnóstico de enfermedad cervical de alto grado es independiente del análisis morfológico o la determinación del estado de infección por HPV.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la detección de sobreexpresión comprende utilizar por lo menos un anticuerpo para detectar la expresión de proteína biomarcadora.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el método comprende realizar inmunocitoquímica.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la sobreexpresión del biomarcador molecular se detecta a nivel de ácido nucleico.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la detección de sobreexpresión comprende realizar RT-PCR cuantitativa.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra comprende células cervicales en suspensión en una preparación basada en líquido.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra comprende una muestra de tejido cervical.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la sensibilidad del método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado es por lo menos 90%

11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque ei valor de predicción positivo dei método para diagnosficar enfermedad cervical de alto grado es de por lo menos 40%.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la especificidad del método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado es de por lo menos 85%.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el método se lleva a cabo en respuesta a que el paciente presente un resultado de frotis Pap anormal.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el método se realiza como un análisis primario para detectar enfermedad cervical de alto grado en una población de pacientes en general.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el método se realiza junto con análisis morfológico.

16.-Un método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado en un paciente, el método está caracterizado porque comprende detectar la sobreexpresión de por lo menos dos biomarcadores en una muestra corporal del paciente, en donde la detección de sobreexpresión de los biomarcadores identifica específicamente muestras que son indicativas de enfermedad cervical de alto grado.

17. -Un método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: a) obtener una muestra corporal del paciente; b) poner en contacto la muestra con por lo menos un anticuerpo, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína biomarcadora nuclear que se sobreexpresa selectivamente en la enfermedad cervical de alto grado; y c) detectar la unión del anticuerpo a la proteína biomarcadora nuclear.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el método comprende realizar ¡nmunocitoquímica.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el método se realiza manualmente.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el método se realiza de una manera automatizada.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la muestra comprende células cervicales.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la muestra comprende una monocapa de células cervicales.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la sensibilidad del método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado es por lo menos 90%.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque ¡a especificidad dei método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado es por lo menos 85%.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el método se realiza en respuesta a que el paciente tenga un resultado de frotis Pap anormal.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el método se realiza como un análisis primario para enfermedad cervical de alto grado en una población de pacientes en general.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el biomarcador nuclear es un gen involucrado en la ruptura del ciclo de las células inducido por HPV y activación de la inducción de la fase S.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el biomarcador nuclear se selecciona del grupo que consiste de MCM2, MCM6, MCM7, p14ARF, p21waf1, Topo2A y ciclina E.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el biomarcador nuclear es una proteína MCM.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el biomarcador es un gen inducido por el factor de transcripción E2f.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el biomarcador es un gen inducido por el factor de transcripción Sp-1.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el biomarcador es un gen de la fase S.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el biomarcador está involucrado en la regulación del ciclo celular.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el biomarcador está involucrado en la replicación y transcripción de ADN.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende además la tinción de papanicolaou (Pap) de la muestra.

36.- Un método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: a) obtener una muestra corporal del paciente; b) poner en contacto la muestra con por lo menos dos anticuerpos, en donde cada uno de los anticuerpos se une específicamente a una proteína biomarcadora distinta que se sobreexpresa selectivamente en la enfermedad cervical de alto grado; y c) detectar la unión de los anticuerpos a las proteínas biomarcadoras.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste de MCM2, MCM6, MCM7, p14ARF, p21waf1, Topo2A y ciclina E.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque por lo menos uno de los biomarcadores es una proteína MCM.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque por lo menos tres anticuerpos se ponen en contacto con la muestra, en donde el Iniciadoro y segundo anticuerpos se unen específicamente a MCM2, y en donde un tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque los anficuerpos se ponen en contacto con la muestra secuencialmente como reactivo de anticuerpo individual.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque los anticuerpos se ponen en contacto con la muestra simultáneamente como una combinación de anficuerpos.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque cada uno de los anticuerpos se pone en contacto con un portaobjetos de microscopio separado que comprende una porción de la muestra.

43.- Un método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: a) obtener una muestra de anticuerpo del paciente; b) poner en contacto a la muestra con por lo menos un anticuerpo, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína biomarcadora que se sobreexpresa selectivamente en la enfermedad cervical de alto grado; c) detectar la unión del anticuerpo a la proteína biomarcadora; y d) teñir la muestra con tinción de papanicolaou (Pap).

44.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque el método se lleva a cabo en respuesta a que el paciente presente un resultado de tinción Pap anormal.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque el método se lleva a cabo como un análisis primario para enfermedad cervical de alto grado en una población de pacientes en general.

46.- Un método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado, el método está caracterizado porque comprende detectar la sobreexpresión de por io menos un biomarcador en una muestra corporal del paciente, en donde la sobreexpresión del biomarcador es indicativa de inducción de fase S aberrante.

47.- Un método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado, el método está caracterizado porque comprende detectar la sobreexpresión de por lo menos un biomarcador en una muestra corporal del paciente, en donde la sobreexpresión del biomarcador es indicativa de transcripción activa de E6 de HPV y E7 de HPV, oncogénicos.

48.- Un método para diagnosticar enfermedad cervical de alto grado, el método está caracterizado porque comprende detectar la sobreexpresión de por lo menos un biomarcador en una muestra corporal del paciente, en donde la sobreexpresión del biomarcador es indicativa de sobreexpresión de E6 de HPV y E7 de HPV oncogénicos.

49.- Un equipo caracterizado porque comprende por lo menos un anticuerpo, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína biomarcadora nuclear que se sobreexpresa selectivamente en la enfermedad cervical de alto grado.

50.- El equipo de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el biomarcador nuclear se selecciona del grupo que consiste de MCM2, MCM6, MCM7, p14ARF, p21waf1, Topo2A y ciclina E.

51.- El equipo de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado además porque el biomarcador nuclear es una proteína MCM.

52.- El equipo de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el equipo comprende un reactivo bloqueador de peroxidasa, un reactivo bloqueador de proteína, sustancias químicas para la detección de anticuerpo que se une a las proteínas biomarcadoras, una tinción contrastante, un agente para teñir de azul e instrucciones de uso.

53.- El equipo de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque las sustancias químicas para la detección de unión de anticuerpo comprenden un cromógeno y un anticuerpo secundario conjugado a un polímero marcado, en donde el cromógeno comprende 3'3'-diaminobenzidina y en donde el polímero marcado comprende peroxidasa de rábano conjugada a un polímero de dextrano.

54.- El equipo de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque la tinción contrastante comprende hematoxilina.

55.- Eí equipo de conformidad con ia reivindicación 52, caracterizado además porque el agente que tiñe de azul comprende una solución que comprende solución salina amortiguada con Tris, pH 7.4, Tween-20 y azida de sodio.

56.- El equipo de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque comprende una muestra de control positivo.

57.- El equipo de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque la muestra de control positivo comprende células SiHa.

58.- El equipo de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque comprende los reactivos para tinción de Pap.

59.- El equipo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque los reactivos para tinción de Pap comprenden Ea50 y Orange G.

60.- Un equipo caracterizado porque comprende por lo menos dos anticuerpos, en donde cada uno de los anticuerpos se une específicamente a una proteína biomarcadora distinta que se sobreexpresa selectivamente en enfermedades cervicales de alto grado.

61.- El equipo de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado además porque se proporcionan por lo menos dos anficuerpos como reactivos separados.

62.- El equipo de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado además porque por lo menos dos anticuerpos se proporcionan como una combinación.

63. El equipo de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado además porque por lo menos uno de los anticuerpos se une específicamente a una proteína MCM.

64.- El equipo de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado además porque el equipo comprende por lo menos tres anficuerpos, en donde un Iniciadoro y un segundo anficuerpos en el equipo se unen específicamente a MCM2 y en donde el tercer anticuerpo se une específicamente a Topo2A.

65.- El equipo de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque comprende un reactivo bloqueador de peroxidasa, un reactivo bloqueador de proteína, sustancias químicas para la detección de unión de anticuerpo a proteínas biomarcadoras, una tinción contrastante, un agente que tiñe de azul e instrucciones para uso.

66. Un equipo caracterizado porque comprende por lo menos un anticuerpo y reactivos para tinción de Pap, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteína biomarcadora que se sobreexpresa selectivamente en enfermedades cervicales de alto grado, y en donde los reactivos para tinción por Pap comprenden EA50 y Orange G.

67.- Un método para utilizar el equipo de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque se utiliza para el diagnóstico de enfermedades cervicales de alto grado.

68.- Un método de uso del equipo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque se utiliza en ei diagnóstico de enfermedades cervicales de alto grado.

69.- Un método para el diagnóstico de enfermedad cervical de alto grado en un paciente, que comprende detectar la sobreexpresión de por lo menos una molécula de ácido nucleico que codifica para un biomarcador nuclear que se sobreexpresa selectivamente en enfermedades cervicales de alto grado, en donde el biomarcador nuclear se selecciona del grupo que consiste de MCM2, MCM6, MCM7, p14ARF, p21waf1, Topo2A y ciclina E, el método está caracterizado porque comprende: (a) obtener una muestra corporal del paciente; (b) aislar material de ácido nucleico de la muestra; (c) mezclar el material de ácido nucleico con por lo menos un par de cebadores oligonucleotídicos específicos para el biomarcador nuclear y una ADN polimerasa termoestable bajo condiciones que son adecuadas para la amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR); (d) realizar PCR; y (d) detectar productos de amplificación por PCR.

70.- El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque la realización de PCR comprende realizar RT-PCR.

71.- El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque la muestra comprende células cervicales en suspensión en una preparación basada en líquido.

72.- El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque la muestra comprende muestra de tejido cervical.

73.- El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque el biomarcador nuclear es una proteína MCM.

74.- El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque el método se realiza en respuesta a que el paciente tiene un resultado de frotis de Pap anormal.

75.- El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque el método se realiza como un análisis primario de enfermedad cervical de alto grado en una población de pacientes en general.

76.- Un método para diagnosticar una enfermedad cervical de alto grado, el método está caracterizado porque comprende detectar la sobreexpresión de por lo menos dos biomarcadores en una muestra corporal del paciente, en donde la detección de sobreexpresión de los biomarcadores identifica específicamente muestras que son indicativas de enfermedad cervical de alto grado, y en donde la sobreexpresión de los biomarcadores se detecta a nivel de ácido nucleico.

77.- El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado además porque la detección de sobreexpresión comprende realizar RT-PCR.

78.- Un equipo caracterizado porque comprende por lo menos un par de cebadores oligonucleotídicos específicos para un biomarcador nuclear que se sobreexpresa selectivamente en enfermedad cervical de alto grado.

79.- Un equipo caracterizado porque comprende por lo menos dos pares de cebadores oligonucleotídicos, en donde cada par de cebadores oligonucleotídicos es específico para un biomarcador que se sobreexpresa selectivamente en enfermedades cervicales de alto grado.

80.- Un método de uso del equipo de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque se realiza el diagnóstico de una enfermedad cervical de alto grado en un paciente.

81.- Un amortiguador de pretratamiento de un portaobjetos caracterizado porque comprende 0.05% a 5% de lauret-13-carboxiIato de sodio.

82.- El amortiguador de pretratamiento de portaobjetos de conformidad con la reivindicación 81 , caracterizado además porque comprende 0.1 % a 1 % de lauret-13-carboxilato de sodio.

83.- El amortiguador de pretratamiento de portaobjetos de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado además porque comprende además 0.5% de iauret-13-carboxilato de sodio.

84.- Un método para preparar una muestra para uso en un ensayo de inmunocitoquímica, caracterizado porque comprende aplicar una composición que comprende 0.05 a 5% de lauret-13-carboxilato de sodio a la muestra.

85.-EI método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado además porque la composición comprende 0.1% a 1 % de lauret-13-carboxilato de sodio.

86.- El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado además porque la composición comprende 0.5% de lauret-13-carboxilato de sodio.

87.- El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado además porque la composición se aplica a la muestra durante menos de una hora.

88.- El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado además porque comprende además calentar la muestra.