CN111323585A - 一种核基质蛋白22酶联免疫检测试剂盒制备方法及试剂盒 - Google Patents
一种核基质蛋白22酶联免疫检测试剂盒制备方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种核基质蛋白22酶联免疫检测试剂盒制备方法及试剂盒，该方法包括制备核基质蛋白22多克隆抗体标记辣根过氧化物酶的酶标结合物；核基质蛋白22校准品的制备；固相包被板的制备；浓缩洗液制备；终止液、底物和底物缓冲液的制备。该试剂盒包括核基质蛋白22校准品、核基质蛋白22多克隆抗体预包被的96孔板、核基质蛋白22多克隆抗体的酶标记物、与酶作用的发光底物、底物缓冲液、浓缩洗液和终止液；本发明提出的核基质蛋白22酶联免疫检测试剂盒制备方法及试剂盒能够对早期的膀胱癌进行诊断，避免了现有技术中对患者身体造成的损害。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒领域，特别是指一种核基质蛋白22酶联免疫检测试剂盒制备方法及试剂盒。
背景技术
膀胱癌是全球范围内最常见的移行上皮细胞癌之一，占尿路上皮癌数量的百分之九十左右。2015年癌症年报中以2.88％占在男性癌症的第七位。其发病率较高，并且随着近些年来生活方式的改变呈逐年上升的趋势，主要治疗方法为手术治疗，但术后复发率较高。
发生癌变时由于恶变细胞核中的遗传物质无法在有丝***末期完成正常分配，核有丝***装置蛋白的合成量急剧升高，作为核有丝***装置蛋白的亚单位的NMP22(核基质蛋白22)水平也会相应升高，并于细胞凋亡后经细胞核释放，以可溶性复合物或片段的形式存在于尿液中。数据显示，膀胱癌上皮细胞内NMP22的表达是正常尿路上皮的25倍以上；利用多克隆抗体技术，可以快速、定量检测尿中NMP22含量，具有较高的敏感度和特异度。
因此，针对上述技术问题，急需一种无创侵入性弱的检测方法对早期膀胱癌进行诊断。
发明内容
本发明提出一种核基质蛋白22酶联免疫检测试剂盒制备方法及试剂盒，解决了现有技术中的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种核基质蛋白22酶联免疫检测试剂盒制备方法，包括如下步骤：
S1、制备核基质蛋白22多克隆抗体标记辣根过氧化物酶的酶标结合物；
S2、核基质蛋白22校准品的制备；
S3、固相包被板的制备；
S4、浓缩洗液制备；
S5、终止液、底物和底物缓冲液的制备。
作为进一步的技术方案，S1步骤包括：
S11、称取辣根过氧化物酶溶于戊二醛溶液中静置，制成酶溶液；
S12、用生理盐水对S11步骤中制成的酶溶液进行洗脱，并置于容器中搅拌；
S13、将待标记的核基质蛋白22进行稀释，并逐滴加入到酶溶液中；
S14、向S13步骤中加入核基质蛋白22的酶溶液中加入碳酸缓冲液，并继续搅拌；并在搅拌后加入赖氨酸，待均匀后进行第一次静置；待第一次静置完成后在搅拌的状态下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，进行第二次静置；
S15、对S14步骤制备完成的溶液进行离心分离，并去除上清液；沉淀物用半饱和硫酸铵二次清洗，并将清洗后的沉淀物溶于PBS中；
S16、将S15步骤制备完成的溶液置于透析袋中进行透析，去除铵离子后进行离心分离，离心分离后去除沉淀，上清液为酶标结合物，分装后进行保存。
作为进一步的技术方案，S2步骤包括：
核基质蛋白22校准品以动物血清或蛋白缓冲液为基质，加入核基质蛋白22纯品配制而成。
优选的，核基质蛋白22校准品的浓度为：80IU/ml。
作为进一步的技术方案，S3步骤包括：
S31、采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体96孔板上；
S32、洗涤对S31步骤制备完成的包被用蒸馏水洗涤三次；
S33、向孔板中每孔分别加入封闭液，进行静置；静置后甩掉封闭液，进行防湿干燥；干燥后封袋并保存。
优选的，S31步骤具体为：采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合，溶解混匀后，调整pH值至4-5，加入3-8mg核基质蛋白22单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110ul，4℃过夜。
作为进一步的技术方案，S4步骤具体为：选用10mM/LPBST浓缩洗液调整pH至7-8，并通过双蒸水稀释后待用。
作为进一步的技术方案，S5步骤为：
选用硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过氧化氢溶液为底物缓冲液。
作为进一步的技术方案，S5步骤为：
选用2mol/L的硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过2％的氧化氢溶液为底物缓冲液。
本发明还提出了一种使用试剂盒制备方法制成的试剂盒，包括：
核基质蛋白22校准品、核基质蛋白22多克隆抗体预包被的96孔板、核基质蛋白22多克隆抗体的酶标记物、与酶作用的发光底物、底物缓冲液、浓缩洗液和终止液。
本发明技术方案通过试剂盒的制备方法制备完成的试剂盒应用于膀胱癌上皮细胞检测领域中，能够准确的检测膀胱癌上皮细胞内核基质蛋白22，进而能够对早期的膀胱癌进行诊断，避免了现有技术中对患者身体造成的损害。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出的一种核基质蛋白22酶联免疫检测试剂盒制备方法，包括如下步骤：
第一步：制备核基质蛋白22多克隆抗体标记辣根过氧化物酶的酶标结合物；具体的，
称取辣根过氧化物酶20-30mg溶于1％-1.5％的戊二醛溶液中静置8-12小时，制成酶溶液；
酶溶液经SephadexG-25层析后，用生理盐水对酶溶液进行洗脱，其中，洗脱的流速控制为0.5-1.5ml/min，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml；并置于容器中搅拌，具体的置于烧杯中进行搅拌；
将待标记的核基质蛋白22选取10-15mg用生理盐水进行稀释至3-5mg，并逐滴加入到酶溶液中；
向加入核基质蛋白22的酶溶液中加入0.2-0.5mg的碳酸缓冲液，并继续搅拌2-4小时；并在搅拌后加入0.2-0.5mg的赖氨酸，待均匀后进行第一次静置1-3小时；第一次静置完成后在搅拌的状态下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，在3-5℃下进行第二次静置0.5-2小时；采用转速为3000rpm的离心泵对制备完成的溶液进行离心分离，并去除上清液；沉淀物用半饱和硫酸铵二次清洗，并将清洗后的沉淀物溶于PBS中；将制备完成的溶液置于透析袋中进行透析，去除铵离子后采用10000rpm的离心泵进行离心分离25-35分钟，离心分离后去除沉淀，上清液为酶标结合物，分装后置于-15～-30℃下进行保存。
第二步：核基质蛋白22校准品的制备；核基质蛋白22校准品以动物血清或蛋白缓冲液为基质，加入核基质蛋白22纯品配制而成；本发明中，优选的，核基质蛋白22校准品的浓度分别为：80IU/ml。
第三步：固相包被板的制备；具体的，
采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体96孔板上；本发明中，优选的，采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合，溶解混匀后，调整pH值至4-5，加入3-8mg核基质蛋白22单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110ul，4℃过夜。
洗涤对骤制备完成的包被用蒸馏水洗涤三次；
向孔板中每孔分别加入250-350ul的封闭液，进行静置2-4小时；静置后甩掉封闭液，进行防湿干燥20-28小时；干燥后封袋并在2-8℃保存。
第四步：浓缩洗液制备；具体为：选用10mM/L的PBST浓缩洗液调整pH至7-8，并通过双蒸水稀释15-25倍后待用。
第五步：终止液、底物和底物缓冲液的制备；具体的，选用硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过氧化氢溶液为底物缓冲液；更为具体的，
选用2mol/L的硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过2％的氧化氢溶液为底物缓冲液。
本发明还提出了一种使用试剂盒制备方法制成的试剂盒，包括：
核基质蛋白22校准品、核基质蛋白22多克隆抗体预包被的96孔板、核基质蛋白22多克隆抗体的酶标记物、与酶作用的发光底物、底物缓冲液、浓缩洗液和终止液。
试剂盒的使用方式如下：
(1)从真空袋中取出已包被完毕的96孔板；
(2)反应孔中分别加待测样品和稀释的各浓度校准品，校准品每孔加0、5、10、20、40、80IU/ml各25ul，每次试验设空白1孔，其余孔加待检样品25ul；
(3)将键入校准品的孔板在37℃恒温温育60min；
(4)弃去孔中溶液，用稀释后的浓缩洗液，自动洗板机或者手工洗板5次，在吸水纸上拍干；
(5)每孔、管依次加入酶标记物200ul，于微量振荡器上震荡30秒混匀；
(6)对加入酶标记物的孔板在37℃恒温温育60min；
(7)弃去孔中溶液，用稀释后的浓缩洗液，自动洗板机或者手工洗板5次，在吸水纸上拍干；
(8)每孔加发光底物100ul，底物缓冲液100ul震荡混匀，在37℃或室温避光反应10min
(9)每孔加入50ul的终止液，之后用酶标仪测量样品孔在405nm处的吸光值；
10)利用吸光值建立标准曲线，以各待测血清吸光度值在标准曲线上查出该血清的NMP22的浓度，计算检测结果。
为更好的进行说明，本发明特举例说明：
实施例1：
第一步：制备核基质蛋白22多克隆抗体标记辣根过氧化物酶的酶标结合物：
(1)称取辣根过氧化物酶20mg溶于1％的戊二醛溶液中静置8小时，制成酶溶液；
(2)酶溶液经SephadexG-25层析后，用生理盐水对酶溶液进行洗脱，其中，洗脱的流速控制为0.5ml/min，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml；并置于容器中搅拌，具体的置于烧杯中进行搅拌；
(3)将待标记的核基质蛋白22选取10-15mg用生理盐水进行稀释至3mg，并逐滴加入到酶溶液中；
(4)向加入核基质蛋白22的酶溶液中加入0.2mg的碳酸缓冲液，并继续搅拌2小时；并在搅拌后加入0.2mg的赖氨酸，待均匀后进行第一次静置1小时；第一次静置完成后在搅拌的状态下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，在3℃下进行第二次静置0.5小时；采用转速为3000rpm的离心泵对制备完成的溶液进行离心分离，并去除上清液；沉淀物用半饱和硫酸铵二次清洗，并将清洗后的沉淀物溶于PBS中；将制备完成的溶液置于透析袋中进行透析，去除铵离子后采用10000rpm的离心泵进行离心分离25分钟，离心分离后去除沉淀，上清液为酶标结合物，分装后置于-15℃下进行保存。
第二步：核基质蛋白22校准品的制备；核基质蛋白22校准品以动物血清或蛋白缓冲液为基质，加入核基质蛋白22纯品配制而成；本发明中，优选的，核基质蛋白22校准品的浓度为：80IU/ml。
第三步：固相包被板的制备；具体的，
采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体96孔板上；本发明中，优选的，采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合，溶解混匀后，调整pH值至4-5，加入3mg核基质蛋白22单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110ul，4℃过夜。
洗涤对骤制备完成的包被用蒸馏水洗涤三次；
向孔板中每孔分别加入250ul的封闭液，进行静置2小时；静置后甩掉封闭液，进行防湿干燥20小时；干燥后封袋并在2℃保存。
第四步：浓缩洗液制备；具体为：10mM/LPBST浓缩洗液调整pH至7，并通过双蒸水稀释15倍后待用。
第五步：终止液、底物和底物缓冲液的制备；具体的，选用2mol/L的硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过2％的氧化氢溶液为底物缓冲液。
实施例2：
第一步：制备核基质蛋白22多克隆抗体标记辣根过氧化物酶的酶标结合物：
(1)称取辣根过氧化物酶25mg溶于1％-1.5％的戊二醛溶液中静置10小时，制成酶溶液；
(2)酶溶液经SephadexG-25层析后，用生理盐水对酶溶液进行洗脱，其中，洗脱的流速控制为1ml/min，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml；并置于容器中搅拌，具体的置于烧杯中进行搅拌；
(3)将待标记的核基质蛋白22选取12.5mg用生理盐水进行稀释至5mg，并逐滴加入到酶溶液中；
(4)向加入核基质蛋白22的酶溶液中加入0.25mg的碳酸缓冲液，并继续搅拌3小时；并在搅拌后加入0.25mg的赖氨酸，待均匀后进行第一次静置2小时；第一次静置完成后在搅拌的状态下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，在4℃下进行第二次静置1小时；采用转速为3000rpm的离心泵对制备完成的溶液进行离心分离，并去除上清液；沉淀物用半饱和硫酸铵二次清洗，并将清洗后的沉淀物溶于PBS中；将制备完成的溶液置于透析袋中进行透析，去除铵离子后采用10000rpm的离心泵进行离心分离30分钟，离心分离后去除沉淀，上清液为酶标结合物，分装后置于-20℃下进行保存。
第二步：核基质蛋白22校准品的制备；核基质蛋白22校准品以动物血清或蛋白缓冲液为基质，加入核基质蛋白22纯品配制而成；本发明中，优选的，核基质蛋白22校准品的浓度为：80IU/ml。
第三步：固相包被板的制备；具体的，
采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体96孔板上；本发明中，优选的，采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合，溶解混匀后，调整pH值至4.6，加入5mg核基质蛋白22单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110ul，4℃过夜。
洗涤对骤制备完成的包被用蒸馏水洗涤三次；
向孔板中每孔分别加入300ul的封闭液，进行静置3小时；静置后甩掉封闭液，进行防湿干燥24小时；干燥后封袋并在5℃保存。
第四步：浓缩洗液制备；具体为：浓缩洗液调整pH至7.2-7.4，并通过双蒸水稀释20倍后待用。
第五步：终止液、底物和底物缓冲液的制备；具体的，选用硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过氧化氢溶液为底物缓冲液；更为具体的，
选用2mol/L的硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过2％的氧化氢溶液为底物缓冲液。
实施例3：
第一步：制备核基质蛋白22多克隆抗体标记辣根过氧化物酶的酶标结合物：
(1)称取辣根过氧化物酶30mg溶于1.5％的戊二醛溶液中静置12小时，制成酶溶液；
(2)酶溶液经SephadexG-25层析后，用生理盐水对酶溶液进行洗脱，其中，洗脱的流速控制为1.5ml/min，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml；并置于容器中搅拌，具体的置于烧杯中进行搅拌；
(3)将待标记的核基质蛋白22选取15mg用生理盐水进行稀释至5mg，并逐滴加入到酶溶液中；
(4)向加入核基质蛋白22的酶溶液中加入0.5mg的碳酸缓冲液，并继续搅拌4小时；并在搅拌后加入0.5mg的赖氨酸，待均匀后进行第一次静置3小时；第一次静置完成后在搅拌的状态下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，在5℃下进行第二次静置2小时；采用转速为3000rpm的离心泵对制备完成的溶液进行离心分离，并去除上清液；沉淀物用半饱和硫酸铵二次清洗，并将清洗后的沉淀物溶于PBS中；将制备完成的溶液置于透析袋中进行透析，去除铵离子后采用10000rpm的离心泵进行离心分离35分钟，离心分离后去除沉淀，上清液为酶标结合物，分装后置于-30℃下进行保存。
第二步：核基质蛋白22校准品的制备；核基质蛋白22校准品以动物血清或蛋白缓冲液为基质，加入核基质蛋白22纯品配制而成；本发明中，优选的，核基质蛋白22校准品的浓度为：80IU/ml。
第三步：固相包被板的制备；具体的，
采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体96孔板上；本发明中，优选的，采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合，溶解混匀后，调整pH值至5，加入8mg核基质蛋白22单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110ul，4℃过夜。
洗涤对骤制备完成的包被用蒸馏水洗涤三次；
向孔板中每孔分别加入350ul的封闭液，进行静置4小时；静置后甩掉封闭液，进行防湿干燥28小时；干燥后封袋并在8℃保存。
第四步：浓缩洗液制备；具体为：10mM/LPBST浓缩洗液调整pH至8，并通过双蒸水稀释25倍后待用。
第五步：终止液、底物和底物缓冲液的制备；具体的，选用硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过氧化氢溶液为底物缓冲液；更为具体的，
选用2mol/L的硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过2％的氧化氢溶液为底物缓冲液。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种核基质蛋白22酶联免疫检测试剂盒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备核基质蛋白22多克隆抗体标记辣根过氧化物酶的酶标结合物；
S2、核基质蛋白22校准品的制备；
S3、固相包被板的制备；
S4、浓缩洗液制备；
S5、终止液、底物和底物缓冲液的制备。
2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S1步骤包括：
S11、称取辣根过氧化物酶溶于戊二醛溶液中静置，制成酶溶液；
S12、用生理盐水对S11步骤中制成的酶溶液进行洗脱，并置于容器中搅拌；
S13、将待标记的核基质蛋白22进行稀释，并逐滴加入到酶溶液中；
S14、向S13步骤中加入核基质蛋白22的酶溶液中加入碳酸缓冲液，并继续搅拌；并在搅拌后加入赖氨酸，待均匀后进行第一次静置；待第一次静置完成后在搅拌的状态下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，进行第二次静置；
S15、对S14步骤制备完成的溶液进行离心分离，并去除上清液；沉淀物用半饱和硫酸铵二次清洗，并将清洗后的沉淀物溶于PBS中；
S16、将S15步骤制备完成的溶液置于透析袋中进行透析，去除铵离子后进行离心分离，离心分离后去除沉淀，上清液为酶标结合物，分装后进行保存。
3.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S2步骤包括：
核基质蛋白22校准品以动物血清或蛋白缓冲液为基质，加入核基质蛋白22纯品配制而成。
4.如权利要求3所述制备方法，其特征在于，核基质蛋白22校准品的浓度为80IU/ml。
5.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S3步骤包括：
S31、采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体96孔板上；
S32、洗涤对S31步骤制备完成的包被用蒸馏水洗涤三次；
S33、向孔板中每孔分别加入封闭液，进行静置；静置后甩掉封闭液，进行防湿干燥；干燥后封袋并保存。
6.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述S31步骤具体为：采用缓冲液与核基质蛋白22单克隆抗体混合，溶解混匀后，调整pH值至4-5，加入3-8mg核基质蛋白22单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110ul，4℃过夜。
7.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S4步骤具体为：选用10mM/LPBST浓缩洗液调整pH至7-8，并通过双蒸水稀释后待用。
8.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述S5步骤为：
选用硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过氧化氢溶液为底物缓冲液。
9.如权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述S5步骤为：
选用2mol/L的硫酸作为终止液；通过TMB和底物缓冲液混合得到发光底物；选用过2％的氧化氢溶液为底物缓冲液。
10.一种使用如权利要求1-9任一项所述试剂盒制备方法制成的试剂盒，其特征在于，包括：
核基质蛋白22校准品、核基质蛋白22多克隆抗体预包被的96孔板、核基质蛋白22多克隆抗体的酶标记物、与所述酶作用的发光底物、底物缓冲液、浓缩洗液和终止液。
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