JP6809397B2 - 質量分析を用いた脂質解析方法及び質量分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、質量分析を用いた脂質解析方法、及びそのための質量分析装置に関する。

生体内における脂質の生化学的な活性は不飽和脂肪酸の二重結合部位（つまり不飽和結合部位）の位置に大きく依存する。そのため、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）法を利用した脂質分析においては、不飽和結合部位を特定することが重要である。しかしながら、従来一般に利用されている低エネルギ衝突誘起解離（ＬＥ−ＣＩＤ）法によるイオン解離を行うタンデム質量分析法では、脂肪酸由来のプロダクトイオンピークが十分に観測されず、不飽和結合部位の特定が困難であることが知られている。これに対し従来、不飽和結合部位を特定する手法として次のような技術が知られている。

非特許文献１には、脂質由来のサンプルを予めピロリジドなどで誘導体化したうえで電子イオン化（ＥＩ）法によりイオン化することで、不飽和結合部位を特徴的に示す質量差が12Daである脂肪鎖由来のプロダクトイオンのピークペアの観測が行えることが記載されている。

特許文献１には、脂質由来のイオンを捕捉しているイオントラップ内にオゾンを導入して脂質由来のイオンと反応させると脂肪酸の不飽和結合部位が特異的に解離する、という性質を利用して不飽和結合部位を特定する方法が記載されている。

特許文献２や非特許文献２には、高エネルギ電子照射や高エネルギ衝突誘起解離によるイオン解離法を用いて得られるプロダクトイオンの中で不飽和結合部位のプロダクトイオンの信号強度は相対的に低い、という性質を利用して不飽和結合部位を推定する方法が記載されている。

また非特許文献３には、高速に加速したヘリウム分子をイオントラップの内部に照射することでイオントラップ内に捕捉されている脂質由来のイオンをラジカル種に変化させ、そのラジカル種を衝突誘起解離により解離させることで脂肪鎖のプロダクトイオンを多く生成し、そのプロダクトイオンの信号強度に基づいて不飽和結合部位を特定する方法が記載されている。

しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、サンプルを予め誘導体化する前処理が必要であって手間が掛かる上に、誘導体化できないサンプルについては解析が行えない。

また、特許文献１に記載の方法では、反応性の高いオゾンが大気中に排出されないようにオゾンフィルタなどの設備を整える必要があり、装置コストが高くなる。

また、特許文献２や非特許文献２、３に記載の方法はいずれも、不飽和結合部位のプロダクトイオンの信号強度が他の部位のプロダクトイオンの信号強度に比べて相対的に低いという現象を利用して不飽和結合部位を推定するものであるが、サンプルの種類や測定条件などによっては、不飽和結合部位以外のプロダクトイオンの信号強度のほうが低くなる場合もあるため安定的な解析は困難である。
即ち、上記従来の方法ではいずれも、不飽和結合部位を特定するのに欠点がある。

オーストラリア特許出願公開第２００７２１１８９３号公報 カナダ特許出願公開第２９５１７６２号公報 国際公開第２０１５／１３３２５９号パンフレット

アンダーソン（Bengt A. Andersson）、ほか１名、「ピロリダイダス・フォー・マス・スペクトロメトリック・デターミネイション・オブ・ザ・ポジション・オブ・ザ・ダブル・ボンド・イン・モノアンサチュレイテッド・ファッティ・アシッズ（Pyrrolidides for mass spectrometric determination of the position of the double bond in monounsaturated fatty acids）」、Lipids、1974年3月、Vol. 9、Issue 3、pp.185-190 新間秀一（Shimma Shuichi）、ほか３名、「ディテイルド・ストラクチュラル・アナリシス・オブ・リピッズ・ダイレクトリ・オン・ティッシュ・スペシメンズ・ユージング・ア・マルディ-スパイラルトフ-リフレクトロン・トフ・マス・スペクトロメータ（Detailed Structural Analysis of Lipids Directly on Tissue Specimens Using a MALDI-SpiralTOF-Reflectron TOF Mass Spectrometer）」、PLoS One、7、2012年5月、pp. e37107 デイムラー（Robert E. Deimler）、ほか２名、「ラディカル-インデュースド・フラグメンテイション・オブ・フォスフォリピッド・ケイションズ・ユージング・メタステイブル・アトム-アクティベイテッド・ディソシエイション・マス・スペクトロメトリ（MAD-MS）（Radical-induced fragmentation of phospholipid cations using metastable atom-activated dissociation mass spectrometry (MAD-MS)）」、International Journal of Mass Spectrometry、2015年11月、Vol. 390、pp. 178-186

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、誘導体化等のサンプルの前処理を要せず、安定的に脂質の不飽和結合部位の位置を特定することができる質量分析を利用した脂質解析方法、及び該解析に好適な質量分析装置を提供することである。

本発明者らは新規のイオン解離法として水素付着解離法（Hydrogen-Attachment Dissociation、以下ＨＡＤ法と略す）を開発し、特許文献３等において提案している。簡単にいうとＨＡＤ法は、水素ラジカルをイオンに付着させて該イオンを解離させる方法である。本発明者はこのＨＡＤ法及びその改良手法を用い、主として生体由来の各種化合物の解析への応用を検討する過程で、サンプル由来のイオンへの水素ラジカルの照射と該イオンに対するプリカーサイオン分離や解離操作との適切な組合せによって、プロダクトイオンスペクトル中に脂質の不飽和結合部位に特徴的なピークペアが十分な信号強度で観測されることを見いだした。そして、この知見に基づき、本発明を完成させるに至った。

即ち、上記課題を解決するためになされた本発明に係る脂質解析方法は、質量分析を利用した脂質解析方法であって、
a)脂質を含む測定対象試料由来のイオンに所定分子のラジカル種を照射して反応を生じさせるイオン反応ステップと、
b)前記イオン反応ステップにおいてラジカル種と反応したあとのイオンの中で目的とする脂質に由来する特定のイオンをプリカーサイオンとして選択的に分離するプリカーサイオン分離ステップと、
c)前記プリカーサイオン分離ステップにおいて分離されたプリカーサイオンを解離させるイオン解離ステップと、
d)前記イオン解離ステップで生成されたプロダクトイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する分離検出ステップと、
e)前記分離検出ステップにおいて得られた検出信号に基づいて作成されるマススペクトル上で、脂肪鎖の不飽和結合部位に特徴的な質量差を有するピークペアを探索し、見いだされたピークペアに基づいて脂質中の不飽和結合部位の位置を特定するデータ解析ステップと、
を有することを特徴としている。

また本発明に係る質量分析装置は本発明に係る脂質解析方法に好適な質量分析装置であり、試料中の目的成分に由来するイオンを解離して得られたプロダクトイオンを質量分析する質量分析装置であって、
a)試料中の成分に由来するイオンに所定分子のラジカル種を照射して反応を生じさせるイオン反応部と、
b)前記イオン反応部でラジカル種と反応したあとのイオンの中で目的成分に由来する特定のイオンをプリカーサイオンとして選択的に分離するプリカーサイオン分離部と、
c)前記プリカーサイオン分離部で分離されたプリカーサイオンを解離させるイオン解離部と、
d)前記イオン解離部で生成されたプロダクトイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する分離検出部と、
を備えることを特徴としている。

本発明に係る脂質解析方法及び質量分析装置において、前記所定分子のラジカル種は、水素ラジカル、ヒドロキシルラジカル、及び酸素ラジカルのうち少なくとも一つを含むものとするとよい。

特許文献３等に開示されているように、適当な条件で水素ラジカルを試料中の成分分子イオンに照射すると該イオンに水素が付着する反応が生じ、該イオンは活性なラジカルイオンとなって該イオンの解離が促進される。これは、電子移動解離（ＥＴＤ）や電子捕獲解離（ＥＣＤ）と同様の不対電子誘導型の解離である。ただし、試料中の成分分子イオンに水素ラジカルを照射しただけでは一部のイオンは解離するものの、ラジカルイオンとなったあとに解離まで進まないものも多い。そのため、特許文献３に記載の装置でも、イオンの解離を促進させるために、イオントラップに捕捉したイオンに水素ラジカルを照射した後に該イオンを励振してガス粒子に衝突させたり該イオンにレーザ光を照射したりする方法が採られている。

こうした方法により、確かにイオンの解離は促進されるものの、例えば水素ラジカルの照射によってすでに解離したイオン（プロダクトイオン）が衝突誘起解離等によってさらに、つまり多段階に解離してしまいがちである。加えて、水素ラジカルと複数回反応したラジカルイオンも含まれる。そうなると、多段階に解離した又は反応したプロダクトイオンピークがマススペクトル（プロダクトイオンスペクトル）に現れるため、ピークパターンが複雑になり解析が困難である。

そこで本発明に係る質量分析装置では、イオン反応部において、試料中の成分分子イオンに所定分子のラジカル種を照射して反応を生じさせたあと、プリカーサイオン分離部において目的成分に由来する特定の質量電荷比を有するイオンをプリカーサイオンとして選択的に分離する。つまり、反応によって生成されたラジカルイオン（又は活性化されたイオン）の段階でプリカーサイオンを分離する。したがって、ラジカル種の照射によってすでに解離して生成されたプロダクトイオンはこの段階で排除され、特定の質量電荷比を有するプリカーサイオンのみがイオン解離部で解離され、プロダクトイオンが生成される。

なお、ラジカル種の照射によってイオンが即座に解離してしまうことを防ぐために、前記イオン反応部は温度が低いほうがよい。一方、ラジカル種との反応によって生成されたラジカルイオンの解離効率を高めるには温度が高いほうがよい。そこで、本発明に係る質量分析装置において、前記イオン解離部はイオンにラジカル種が照射される領域を加熱する加熱部を含む構成とするとよい。

本発明に係る質量分析装置において、前記イオン解離部はプリカーサイオンに光子又は中性粒子を衝突させることにより該イオンの解離を促進させる構成とすることができる。即ち、プリカーサイオンにレーザ光を照射したりプリカーサイオンをアルゴンなどの不活性ガスに衝突させたりして、活性状態にあるプリカーサイオンの不対電子誘導型の解離を促進すればよい。

こうして生成されたプロダクトイオンを分離検出部で質量電荷比に応じて分離して検出することで得られた検出信号に基づき、目的成分由来のイオンについてのプロダクトイオンスペクトルを作成すればよい。上述したように、ラジカル種の照射によって解離してしまったイオンはプリカーサイオン分離の段階で排除されるので、プロダクトイオンスペクトルには、イオン解離部において不対電子誘導型の解離により生成されたプロダクトイオンのピークが現れる。そのため、多段階に解離した或いは反応したプロダクトイオンのピークは観測されにくく、試料成分の構造解析が容易なマススペクトルを得ることができる。

本発明に係る脂質解析方法では、上述したように得られたマススペクトル上で、脂肪鎖の不飽和結合部位に特徴的な質量差を有するピークペアを探索する。典型的には、不飽和結合部位に特徴的な質量差は12Daであるから、質量差が12Daであるピークペアを探索すればよい。そして、見いだされたピークペアに基づいて、脂質中の不飽和結合部位の位置を特定する。こうした一連の解析作業はユーザが手作業で行ってもよいが、好ましくは自動的な解析が行われるほうがよい。

そこで本発明に係る質量分析装置の一実施態様として、脂質を測定対象の試料とした質量分析装置においては、好ましくは、
前記分離検出部で得られた検出信号に基づいて作成されるマススペクトル上で、脂肪鎖の不飽和結合部位に特徴的に現れる質量差が12Daであるピークペアを探索し、見いだされたピークペアに基づいて脂質中の不飽和結合部位の位置を特定するデータ解析部、をさらに備える構成とするとよい。

また、脂肪鎖の飽和結合部位に特徴的に現れる一対のピークの質量差は14Daである。そこで、上記態様の質量分析装置において、前記データ解析部は、前記マススペクトル上で、脂肪鎖の飽和結合部位に特徴的に現れる質量差が14Daであるピークペアを探索し、見いだされたピークペアに基づいて脂肪鎖の構造を推定する構成とするとよい。

また、上述したように得られたマススペクトルでは、グリセロールのsn-1位に結合した脂肪酸由来のプロダクトイオンピークの信号強度に比べてsn-2位に結合した脂肪酸由来のプロダクトイオンピークの信号強度のほうが高くなる。そこで、上記態様の質量分析装置において、前記データ解析部は、脂肪酸由来のプロダクトイオンピークの信号強度に基づいて、グリセロールのsn-2位に結合した脂肪酸を推定する構成とするとよい。

また、上述したように得られたマススペクトルでは、通常、不飽和結合部位のプロダクトイオンピークの信号強度に比べて飽和結合部位のプロダクトイオンピークの信号強度のほうが高くなる。
そこで、本発明に係る質量分析装置の別の実施態様として、脂質を測定対象の試料とした質量分析装置であって、前記分離検出部で得られた検出信号に基づいて作成されるマススペクトル上で、プロダクトイオンピークの信号強度に基づいて飽和結合部位と不飽和結合部位とを推定するデータ解析部、をさらに備える構成としてもよい。

また、イオンに50eV程度以上の高エネルギの電子を照射することでも該イオンを解離させることができるが、こうした方法による脂質由来のイオンの解離では上述したように水素再配置が起こるため、不飽和結合部位のピークペアの質量差は12Daにならず2Da分だけ大きくなる。そのため、電子照射によるイオン解離を実行して得られたマススペクトル上ではピークペアの質量差による不飽和結合部位の特定はできないものの、上述したように取得したマススペクトル上で質量差が12Daであるピークペアに対応するピークペアの質量差が＋2Daだけシフトしていることを確認することで、不飽和結合部位の推定の精度を上げることができる。

そこで、本発明に係る質量分析装置のさらに別の実施態様として、脂質を測定対象の試料とした質量分析装置であって、
イオンにラジカル種を照射せずに前記プリカーサイオン分離部で分離されたプリカーサイオンに電子を照射して該プリカーサイオンの解離を促進させる電子利用イオン解離部と、
前記電子利用イオン解離部によりプリカーサイオンを解離させたときに得られたマススペクトルと、前記ラジカル種を利用した反応のあとにプリカーサイオンを分離して解離させたときに得られたマススペクトルと、における同じプロダクトイオンに由来するピークの質量値のシフトに基づいて不飽和結合部位を推定するデータ解析部と、
をさらに備える構成としてもよい。

また本発明に係る質量分析装置の一実施態様として、前記イオン反応部におけるイオンへのラジカル種の照射、前記プリカーサイオン分離部におけるプリカーサイオンの分離、及び、前記イオン解離部におけるプリカーサイオンの解離は、いずれもイオントラップの内部空間で実行される構成とすることができる。

なお、この場合、イオントラップは、１個のリング電極と一対（２個）のエンドキャップ電極とから成る３次元四重極型のイオントラップ、又は四本のロッド電極を含む四重極型のリニアイオントラップのいずれでもよい。分離検出部における質量電荷比に応じたイオンの分離はイオントラップで行ってもよいし、或いはイオントラップの外側に配置した飛行時間型質量分離器などにより行ってもよい。

この実施態様の質量分析装置によれば、イオンをイオントラップの内部に捕捉している状態で該イオンにラジカル種を照射することができるので、照射時間等の制御が容易である。それによって、ラジカル種による反応を安定的に行うことができる。

また本発明に係る質量分析装置の別の実施態様として、前記イオン反応部におけるイオンへのラジカル種の照射が実行される反応室、前記プリカーサイオン分離部におけるプリカーサイオンの分離が実行される質量分離器、及び、前記イオン解離部におけるプリカーサイオンの解離が実行される解離室が独立に設けられている構成としてもよい。

プリカーサイオンの分離が実行される質量分離器としては例えば四重極マスフィルタを用いることができ、この実施態様の質量分析装置は、トリプル四重極型質量分析装置や四重極−飛行時間型質量分析装置（ｑ−ＴＯＦ型質量分析装置）に反応室を加えた構成とすることができる。この実施態様の質量分析装置によれば、反応室、質量分離器、解離室、分離検出部と順にイオンを輸送しつつ該イオンに対する操作を行うことができるので、例えばガスクロマトグラフ質量分析装置や液体クロマトグラフ質量分析装置のように、質量分析装置に連続的に導入される試料中の成分を分析する必要がある場合に都合がよい。

本発明に係る質量分析を用いた脂質解析方法によれば、誘導体化等のサンプルの前処理を要せず、またオゾンなどの人体に有害である成分を用いることなく、安定的に且つ的確に脂質の不飽和結合部位の位置を特定することができる。また本発明に係る質量分析装置によれば、例えば脂質の不飽和結合部位の位置を容易に特定するために有用なマススペクトルを確実に取得することができる。もちろん、本発明に係る質量分析装置は脂質の構造解析に利用できるのはもちろんのこと、それ以外の様々な化合物の構造解析に有用である。

本発明に係る質量分析装置の一実施例の概略構成図。 本発明に係る質量分析装置を用いて脂質解析を実施する際の分析及び処理の行程を示すフローチャート。 脂質ＰＣ（18:1(9Z)）についてプリカーサイオンを分離した後であって水素ラジカルを照射する前及び水素ラジカルを照射した後におけるプリカーサイオン付近のマススペクトルの実測結果を示す図。 図３（ｂ）に示した水素ラジカル照射後のプリカーサイオンをＬＥ−ＣＩＤ法により解離して得られたプロダクトイオンスペクトルの実測結果を示す図。 脂質ＰＣ（18:1(9Z)）について水素ラジカル照射後にプリカーサイオン分離を行い、そのあと該プリカーサイオンをＬＥ−ＣＩＤ法により解離して得られたプロダクトイオンスペクトルの実測結果を示す図。 脂質ＰＣ（18:1(9Z)/18:0）について水素ラジカル照射後にプリカーサイオン分離を行い、そのあと該プリカーサイオンをＬＥ−ＣＩＤ法により解離して得られたプロダクトイオンスペクトルの実測結果を示す図。 脂質ＰＣ（18:1(9Z)）由来のプリカーサイオンをＬＥ−ＣＩＤ法により解離して得られたプロダクトイオンスペクトルの実測結果を示す図。 脂質ＰＣ（18:1(9Z)/18:0）について本発明によるイオン解離法を行った場合（図６と同じ）及びＥＩＤ法によるイオン解離を行った場合のプロダクトイオンスペクトルの実測結果を示す図。 本発明に係る質量分析装置の他の実施例の概略構成図。

以下、本発明に係る質量分析装置及びこの質量分析装置を用いた脂質解析方法について、添付図面を参照して詳細に説明する。
図１は本発明の一実施例である質量分析システムの概略構成図である。

この実施例の質量分析システムの測定部はイオントラップ飛行時間型質量分析装置であり、真空雰囲気に維持される図示しない真空チャンバの内部に、試料中の成分をイオン化するイオン源１と、イオン源１で生成されたイオンを高周波電場の作用により捕捉するイオントラップ２と、イオントラップ２から射出されたイオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離部３と、分離されたイオンを検出する検出器４と、を備える。本実施例の質量分析システムはさらに、イオントラップ２内に水素ラジカルを導入する水素ラジカル照射部５と、イオントラップ２内に所定のガスを供給するガス供給部６と、イオントラップ２を構成する電極に電圧を印加するトラップ電圧発生部７と、各部の動作を制御する制御部８と、後述するデータ処理を行うデータ処理部９と、解析結果等を表示する表示部１０と、を備える。

ここでは、イオン源１はＭＡＬＤＩイオン源であり、図示しないが、パルス状のレーザ光を試料に照射して該試料中の成分をイオン化する。イオントラップ２は、略円環状のリング電極２１と、該リング電極２１を挟んで対向配置された一対のエンドキャップ電極２２、２４と、を含む３次元四重極型のイオントラップである。ただし、このイオントラップ２はリニア型でもよい。制御部８による制御に応じてトラップ電圧発生部７は、リング電極２１、エンドキャップ電極２２、２４それぞれに対し、所定のタイミングで高周波電圧、直流電圧のいずれか一方又はそれらを合成した電圧を印加する。飛行時間型質量分離部３はこの例ではリニア型であるが、リフレクトロン型やマルチターン型等でもよく、また飛行時間型の質量分離器ではなく、例えばイオントラップ２自体のイオン分離機能を利用して質量分離を行うものやオービトラップなどでもよい。

水素ラジカル照射部５は、水素ラジカルを貯留した又は水素ラジカルを生成する水素ラジカル供給源５１と、その流量を調整可能であるバルブ５２と、水素ラジカルを噴出するノズル５３と、該ノズル５３からの噴出流の中心軸上に開口を有し、拡散する水素分子等のガスを分離して細径の水素ラジカル流を取り出すスキマー５４と、を含む。ガス供給部６は、バッファガスやクーリングガスなどとして使用されるヘリウム、アルゴンなどを貯留したガス供給源６１と、その流量を調整可能であるバルブ６２と、ガスを輸送するためのガス導入管６３と、を含む。

また、データ処理部９は機能ブロックとして、マススペクトル作成部９１と、ピークペア探索部９３、不飽和結合部位認識部９４などを含む脂質解析処理部９２と、を有する。なお、通常、データ処理部９の実体はパーソナルコンピュータ又はワークステーションであり、コンピュータにインストールされた専用の処理ソフトウェアを該コンピュータ上で動作させることで上記機能ブロックの各機能が達成される。

本実施例の質量分析システムにおける基本的な測定動作を簡単に説明する。
イオン源１において試料から生成された各種イオンはパケット状にイオン源１から射出され、エンドキャップ電極２２に形成されているイオン導入孔２３を経てイオントラップ２の内部に導入される。イオントラップ２内に導入された試料成分由来のイオンは、トラップ電圧発生部７からリング電極２１に印加される高周波高電圧によってイオントラップ２内に形成される高周波電場に一旦捕捉される。そのあと、後述するように、イオントラップ２の内部で、特定の質量電荷比を有するイオンの分離や、分離されたイオンの解離が行われ、試料中の目的成分由来のプロダクトイオンがイオントラップ２内に蓄積される。

続いて、所定のタイミングでトラップ電圧発生部７からエンドキャップ電極２２、２４に所定の直流高電圧が印加され、これにより、イオントラップ２内に捕捉されていたプロダクトイオンは加速エネルギを受け、イオン射出孔２５を通して一斉に射出される。こうして一定の加速エネルギを持ったプロダクトイオンが飛行時間型質量分離部３の飛行空間に導入され、飛行空間を飛行する間に質量電荷比に応じて分離される。検出器４は分離されたプロダクトイオンを順次検出し、この検出信号を受けたデータ処理部９においてマススペクトル作成部９１は、例えばイオントラップ２からのイオンの射出時点を時刻ゼロとする飛行時間スペクトルを作成する。そして、予め求めておいた質量校正情報を用いて飛行時間を質量電荷比に換算することにより、プロダクトイオンによるマススペクトルを作成する。脂質解析処理部９２は測定対象試料が脂質である場合に、マススペクトルから得られる情報（質量情報）等に基づく所定のデータ処理を行うことで、試料中の脂質の構造を解析しその結果を表示部１０に出力する。

本実施例の質量分析システムは、脂質の構造解析、特に不飽和結合部位の位置の特定を含む構造解析に有用である。ここで、本実施例の質量分析システムにおける脂質の構造解析の具体的な手順を説明する前に、その解析の手法を実測結果を参照しつつ説明する。

図７は、脂肪酸が１箇所にのみ結合した脂質であるホスファチジルコリンＰＣ（18:1(9Z)）を試料とし、該脂質由来のプリカーサイオンを従来広く用いられているＬＥ−ＣＩＤ法で解離させることで得られたマススペクトル（プロダクトイオンスペクトル）の実測例を示す図である。ここでは、脂肪鎖由来のプロダクトイオンピークは殆ど観測されず、このマススペクトルから脂質の構造を解析するのは実際上不可能である。

図３は、上記ホスファチジルコリンＰＣ（18:1(9Z)）由来の分子イオンをイオントラップ２内でプリカーサイオン分離したあとに、水素ラジカル照射部５からイオントラップ２内に水素ラジカル流を照射した場合の、その水素ラジカル照射前後のプリカーサイオンの質量電荷比付近のマススペクトルである。ここでは水素ラジカルの照射時間は500msecである。図３から、水素ラジカルを照射することによって、プリカーサイオンの一部は水素原子１個の引き抜きに相当する1Daだけその質量値がシフトしていることが分かる。

図４は図３（ｂ）に示した水素ラジカル照射後のプリカーサイオンをＬＥ−ＣＩＤ法により解離して得られたプロダクトイオンスペクトルの実測結果を示す図である。図４を図７と比較すると、従来の単純なＣＩＤ法によるマススペクトルでは観測されなかった脂肪酸由来のプロダクトイオンピークが複数本観測されていることが分かる。また、脂肪酸の不飽和結合部位にはプロダクトイオンピークが現れておらず、不飽和結合部位の特定が可能であるように思われる。しかしながら、帰属不能であるプロダクトイオンピークが多数観測されるうえに、水素再配置に起因する、質量値が±1Daだけシフトしたイオンピークが観測される。こうしたことから、このマススペクトルに基づいて脂質の構造解析を十分な精度で行うことは難しい。

特許文献３等に開示されているように、イオンに適当な条件で水素ラジカルを照射するとイオンを解離させることが可能であり、水素ラジカルの照射とＬＥ−ＣＩＤとを組み合わせるとさらに一層、解離の効率を上げることができる。しかしながら、水素ラジカルの照射により解離したイオンがＬＥ−ＣＩＤ時に導入される不活性ガスとの衝突などでさらに解離してしまうケースや水素ラジカルが再度付着したり脱離したりするケースもあるため、マススペクトルには帰属不能なピークが出現することが予想される。そこで、本発明者は、脂質由来のイオンに水素ラジカルを照射することで該イオンを活性化したあとにプリカーサイオンの選択を行い、活性化された（ただし未だ解離には至っていない）状態のイオンをプリカーサイオンとして分離してＬＥ−ＣＩＤにより解離させる方法に想到した。

図５は、上記ＰＣ（18:1(9Z)）由来の分子イオンに水素ラジカルを照射したあとにプリカーサイオン分離を実行し、そのあとＬＥ−ＣＩＤによるイオン解離を行うことで得られたプロダクトイオンスペクトルの実測例を示す図である。図５から明らかであるように、このマススペクトルには、脂肪鎖のプロダクトイオンピークを示す質量差が＋14Daであるピークペアが明瞭に観測されているうえに、不飽和脂肪酸の不飽和結合部位（Ｃ9）には不飽和結合部位に特徴的である質量差が＋12Daであるピークペアが観測されている。一般に、高エネルギの電子を照射することによるイオン解離では分子内で水素再配置が生じ易い。そのため、プロダクトイオンスペクトルにおいて不飽和結合部位に特徴的な質量差が＋12Daであるピークペアを検出するには、非特許文献１に開示されているような誘導体化が必要である。これに対し、図５で示した、水素ラジカル照射、プリカーサイオン分離、及びＬＥ−ＣＩＤによるイオン解離、という手順による解離手法では、水素再配置が十分に抑制されるためプロダクトイオンスペクトル上の各イオンピークの帰属が容易に行える。

図６は、脂肪酸が２箇所に結合した脂質であるホスファチジルコリンＰＣ（18:1(9Z)/18:0）由来の分子に水素ラジカルを照射したあとにプリカーサイオン分離を実行し、そのあとＬＥ−ＣＩＤによるイオン解離を行うことで得られたプロダクトイオンスペクトルの実測例を示す図である。図５の実測結果と同様に、不飽和結合部位に特徴的に観測される質量差が+12Daであるピークペア（648Da-660Da）が得られている。648Da以下の質量電荷比範囲では、不飽和脂肪鎖と飽和脂肪鎖のプロダクトイオンピークの質量差に相当する+2Daの質量差のピークペアが得られている。このようにＰＣ（18:1(9Z)/18:0）においても、質量差が＋12Daであるピークペアを探索することで不飽和結合部位の位置の識別が可能であることが分かる。

また、ＣＩＤを利用した解離では、sn-2位に結合した脂肪酸由来のプロダクトイオンピークが相対的に強く観測されることが知られているが、本発明に係る上記手法でも、sn-2位由来（648-n×14Da）のプロダクトイオンピークの信号強度がsn-1位由来（646-n×14Da）のプロダクトイオンピークの信号強度より高いことが分かる。この性質を用い、不飽和脂肪鎖がsn-2位に、飽和脂肪鎖がsn-1位に結合していることを識別することも可能である。

なお、図５、図６の例ではいずれも、不飽和結合部位の+7Daの位置にも特徴的なピークが得られている。そこで、上述した質量差が+12Daであるピークペアと併せてこの+7Daのピークの有無を確認することで、不飽和結合部位の特定の精度を高めることができる。ただし、水素再配置は起こりにくいとはいうものの、水素再配置が起こる可能性もあるため、その発生を考慮して不飽和結合部位から+6〜+8Daの離れた範囲のイオンピークを探索することが好ましい。

さらにまた、上述したように一般的には、不飽和結合部位のプロダクトイオンピークの信号強度は飽和結合部位のプロダクトイオンピークの信号強度に比較して低い。そこで、上述したようなピークペアの探索とともに、プロダクトイオンピークの信号強度も不飽和結合部位と飽和結合部位の推定に利用するとよい。

次に、図２に示すフローチャートを参照しつつ、本実施例の質量分析システムにおける脂質の構造解析の具体的な手順を説明する。
まず、イオン源１において脂質試料から生成したイオンをイオントラップ２の内部に捕捉する（ステップＳ１）。そのあと、水素ラジカル照射部５から水素ラジカルをイオントラップ２内に供給し、脂質由来のイオンに照射する（ステップＳ２）。水素ラジカルの照射により脂質由来のイオンから水素の引き抜き反応が起こり、該イオンはラジカルイオンになる。また、このときにイオンの一部は解離してしまう。なお、水素ラジカルを照射する前に、トラップ電圧発生部７からリング電極２１等に所定の電圧を印加し、目的とする脂質由来のイオン以外を排除する予備的なプリカーサイオン分離を実施してもよい。

水素ラジカルを照射したあと、トラップ電圧発生部７からリング電極２１等に所定の電圧を印加し、目的とする脂質由来のイオン以外を排除するプリカーサイオン分離を行う（ステップＳ３）。上述した予備的なプリカーサイオン分離の実行の有無に拘わらず、ステップＳ３の操作は必ず実行される。これにより、水素ラジカル照射の際に解離して生成されたプロダクトイオンは除去され、ラジカルイオンになった脂質由来のイオンのみがプリカーサイオンとして選択される。そのあと、ガス供給部６からイオントラップ２内に所定の不活性ガスを導入し、トラップ電圧発生部７からリング電極２１に所定の高周波電圧を印加する。これにより、イオントラップ２内に捕捉されているイオンは励振してガス粒子に衝突し、ＬＥ−ＣＩＤにより解離される（ステップＳ４）。このときの解離は不対電子誘導型の解離であり、脂質由来の各種のプロダクトイオンが生成される。

なお、水素ラジカルの照射によりイオンが即座に解離してしまうことを回避するため、水素ラジカルの照射は相対的に低い温度の下で行うほうがよいが、ＬＥ−ＣＩＤによるイオンの解離効率を高めるには温度が高いほうがよい。そこで、ガス供給部６に加熱部を設け、ＬＥ−ＣＩＤ時に該加熱部で加熱した不活性ガスをイオントラップ２内に導入するようにしてもよい。

そのあと、ガス供給部６からイオントラップ２内にクーリングガスが導入され、生成されたプロダクトイオンはクーリングガスに接触してクーリングされる。そして、十分にクーリングされたプロダクトイオンをイオントラップ２から一斉に射出して飛行時間型質量分離部３に導入して質量電荷比に応じて分離し、検出器４で順次検出する（ステップＳ５）。マススペクトル作成部９１は検出器４で得られた検出信号に基づいて、目的とする脂質に対応するマススペクトル（プロダクトイオンスペクトル）を作成する（ステップＳ６）。

このマススペクトルには、不飽和結合部位に特徴的な質量差を有するピークペア等、脂質の構造に依存する様々な特徴を有するピークが現れる。そこで、ピークペア探索部９３はマススペクトル上で検出される多数のピークの中で例えば質量差が+12Daであるピークペアを探索する（ステップＳ７）。そして、ピークペアが見つかったならば、脂肪鎖に対応するピーク列の中でのそのピークペアの位置に基づいて、不飽和結合部位の位置を推定する（ステップＳ８）。また、不飽和結合部位と推定される位置を基準に、+6〜+8Daの範囲にピークが現れるか否かを確認する等により、不飽和結合部位の推定結果を検証してもよい。また、上述したようにピークの信号強度も併せて利用し、不飽和結合部位と飽和結合部位とを識別してもよい。こうして脂質の構造解析結果が得られたならば、これを表示部１０に出力する（ステップＳ９）。

こうして、本実施例の質量分析システムによれば、従来はかなり面倒であった脂質の構造解析を容易に且つ安定して行うことができる。

上記実施例の質量分析システムでは、脂質由来のイオンを活性化するために水素ラジカルを用いていたが、本出願人が先に出願した特願２０１７−７４１８３号にも記載されているように、水素ラジカル以外にも、ヒドロキシル（水酸）ラジカルや酸素ラジカルを照射しても水素引抜き反応や酸素付着反応によってラジカルイオンが生じることが分かっている。したがって、水素ラジカルに代えてヒドロキシルラジカルや酸素ラジカルをイオントラップ２内に捕捉したイオンに照射してもよい。ただし、酸素ラジカルを使用する場合には、プリカーサイオンに対し質量が+16Daである１個の酸素原子が付着したイオンが検出される。そこで、この場合には、脂質由来のイオンに対し+16Daだけ質量が大きなイオンをプリカーサイオンとして分離してＬＥ−ＣＩＤを実施することで、不飽和結合部位を特徴的に示す質量差が+12Daであるピークペアを得ることができる。

また、図８（ａ）は図６と同じプロダクトイオンスペクトル、図８（ｂ）はＰＣ（18:1(9Z)/18:0）について電子照射解離（ＥＩＤ）法によるイオン解離を行った場合のプロダクトイオンスペクトルの実測結果を示す図である。ＥＩＤ法は電子イオン化などと同様に、イオンに50eV程度以上の高いエネルギを持つ電子を照射することで該イオンの解離を促進させる手法である。

図８（ｂ）に示したマススペクトルは図８（ａ）に示したマススペクトルと異なり、不飽和結合部位（662Da、676Da）において質量差が12Daである特徴的なピークペアが観測されない。これは電子イオン化（ＥＩ）法と同様に、ＥＩＤ法による脂質の解離では水素再配置が発生するため、不飽和結合部位のプロダクトイオンピークの質量値が+2Da (+2H)だけシフトするためである。そのため、誘導体化などの手法により試料由来のイオンにおける電荷の位置を固定するなどの処理を行わない限り、このマススペクトルから不飽和結合部位を推定することは難しい。しかしながら、本発明の方法により得られたマススペクトル上のピークとＥＩＤ法による解離で得られたマススペクトル上のピークとを比較することにより、質量値が+2Daだけシフトしているピークを明瞭に識別できるという利点がある。

図８に示した例では、両マススペクトルを比較することで、660Da以上の質量電荷比範囲に存在するピークにおいて+2Daの質量値だけピークがシフトしていることが識別できる。このことから、660Da（Ｃ9）が不飽和結合部位であることを確認することができる。

また、上記実施例では基本的に脂質由来の分子イオン［Ｍ＋Ｈ］⁺を解離する場合を選定としていたが、脂質由来であって他により適切なイオンがあれば、必ずしも分子イオンをプリカーサイオンとして選択する必要はない。例えば、試料の種類によっては、試料溶媒に酢酸ナトリウムを含有させることにより、分子にナトリウムが付加したイオン［Ｍ＋Ｎａ］⁺ を得ることができる。こうしたアルカリ金属付加体をプリカーサイオンとして選択してもよい。こうしたアルカリ金属付加体イオンは通常のプロトン付加体と比較して分子内の電荷の位置が固定される傾向があるため、ラジカル由来のプロダクトイオンの収率が高くなる傾向があり、マススペクトル上のイオンピークの感度向上に有効である。

次に、本発明に係る他の実施例による質量分析システムを図９を参照して説明する。
図１に示した実施例の質量分析システムは、イオンに水素ラジカルを照射して該イオンの水素引抜き反応を生じさせるイオン反応領域と、プリカーサイオン分離を行うイオン分離領域と、イオンを解離させるイオン解離領域と、がいずれもイオントラップ２である。そのため、イオン解離のあとにイオントラップ２からイオンを射出し終えるまで、次に測定すべき試料由来のイオンをイオントラップ２内に導入することができず、測定のサイクルを高めるうえでこれが制約となる。一方、図９に示した質量分析システムでは、イオン反応領域、イオン分離領域、及びイオン解離領域が空間的に分離されている。

即ち、この実施例の質量分析システムは、イオン源１００と、イオンレンズ等のイオン輸送光学系１０１と、内部にイオンガイド１０３が配置されたイオン反応室１０２と、前段四重極マスフィルタ１０４と、内部にイオンガイド１０６が配置された衝突室１０５と、後段四重極マスフィルタ１０７と、検出器１０８と、が図示しない真空チャンバ内に配設されている。イオン反応室１０２及び衝突室１０５には、図１に示した質量分析装置が備えるものと同様の、水素ラジカル照射部５及びガス供給部６が付設されている。なお、ここでは、上記各構成要素が略一直線状のイオン光軸Ｃに沿って配置されているが、これらは必ずしも一直線に沿って配置されている必要はない。

試料が気体試料である場合には、イオン源１００は電子イオン化法、化学イオン化法、負化学イオン化法などによるイオン源である。一方、試料が液体試料である場合には、イオン源１００はエレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法などの大気圧イオン源である。また、試料が固体試料である場合、イオン源１００としてＤＡＲＴ法などによるイオン源を用いることもできる。

いずれにしてもイオン源１００で生成された試料成分由来のイオンは、イオン反応室１０２に導入され、水素ラジカル照射部５から水素ラジカル流の照射を受ける。なお、イオンガイド１０３には高周波電圧が供給され、これにより生成される高周波電場によりイオンはイオン光軸Ｃ付近に収束される。水素ラジカルの照射を受けて活性化された試料成分由来のイオンは前段四重極マスフィルタ１０４に導入され、そのイオンの中で特定の質量電荷比を有するイオンのみが前段四重極マスフィルタ１０４を通過しプリカーサイオンとして衝突室１０５に入る。衝突室１０５には所定のガスが連続的に又は間欠的に導入されており、或る程度のエネルギを有して衝突室１０５に入ったイオンはガスに衝突してＬＥ−ＣＩＤにより解離する。

解離により生成されたプロダクトイオンが後段四重極マスフィルタ１０７に導入される。後段四重極マスフィルタ１０７を構成するロッド電極には所定の質量電荷比範囲のスキャン測定を繰り返すように掃引される電圧が印加されており、この後段四重極マスフィルタ１０７を通過し得たイオンが検出器１０８に入射して検出される。これにより、検出器１０８で得られる検出信号に基づいて、プロダクトイオンスペクトルを繰り返し取得することができる。

この質量分析システムは、トリプル四重極型質量分析装置にイオン反応室１０２を加えた構成を有しており、イオン源１００にほぼ連続的に供給する試料中の成分に対応するプロダクトイオンスペクトルを繰り返し取得することができる。したがって、例えばＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳとして利用するのに都合がよい。もちろん、イオン反応室１０２において水素ラジカルの照射時間を延ばしたい場合には、イオンガイド１０３にリニアイオントラップの機能を持たせ、一時的にイオンを蓄積してもよい。さらにまた、イオン反応室１０２と前段四重極マスフィルタ１０４とが一体となっていてもよい。

また、図９に示した構成において、後段四重極マスフィルタ１０７に代えて直交加速式の飛行時間型質量分離器を用いた、ｑ−ＴＯＦ型の構成としてもよいことは明らかである。

さらにまた、上記実施例は本発明の一例にすぎないから、上記記載の点以外で、本発明の趣旨の範囲で適宜、変形、追加、修正を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１、１００…イオン源
２…イオントラップ
２１…リング電極
２２、２４…エンドキャップ電極
２３…イオン導入孔
２５…イオン射出孔
２６…ラジカル粒子導入口
３…飛行時間型質量分離部
４、１０８…検出器
５…水素ラジカル照射部
５１…水素ラジカル供給源
５２…バルブ
５３…ノズル
５４…スキマー
６…ガス供給部
６１…ガス供給源
６２…バルブ
６３…ガス導入管
７…トラップ電圧発生部
８…制御部
９…データ処理部
９１…マススペクトル作成部
９２…脂質解析処理部
９３…ピークペア探索部
９４…不飽和結合部位認識部
１０…表示部
１０１…イオン輸送光学系
１０２…イオン反応室
１０３、１０６…イオンガイド
１０４…前段四重極マスフィルタ
１０５…衝突室
１０７…後段四重極マスフィルタ
Ｃ…イオン光軸

Claims (14)

1. 試料中の目的成分に由来するイオンを解離して得られたプロダクトイオンを質量分析する質量分析装置であって、
   a)試料中の成分に由来するイオンに所定分子のラジカル種を照射して反応を生じさせるイオン反応部と、
   b)前記イオン反応部でラジカル種と反応したあとのイオンの中で目的成分に由来する特定のイオンをプリカーサイオンとして選択的に分離するプリカーサイオン分離部と、
   c)前記プリカーサイオン分離部で分離されたプリカーサイオンを解離させるイオン解離部と、
   d)前記イオン解離部で生成されたプロダクトイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する分離検出部と、
   を備えることを特徴とする質量分析装置。
2. 請求項１に記載の質量分析装置であって、
   前記所定分子のラジカル種は、水素ラジカル、ヒドロキシルラジカル、及び酸素ラジカルのうち少なくとも一つを含むことを特徴とする質量分析装置。
3. 請求項１又は２に記載の質量分析装置であって、
   前記イオン解離部はプリカーサイオンに光子又は中性粒子を衝突させることにより該イオンの解離を促進させることを特徴とする質量分析装置。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の質量分析装置であって、
   前記イオン反応部はイオンにラジカル種が照射される領域を加熱する加熱部を含むことを特徴とする質量分析装置。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の質量分析装置であって、
   前記イオン反応部におけるイオンへのラジカル種の照射、前記プリカーサイオン分離部におけるプリカーサイオンの分離、及び、前記イオン解離部におけるプリカーサイオンの解離は、いずれもイオントラップの内部空間で実行されることを特徴とする質量分析装置。
6. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の質量分析装置であって、
   前記イオン反応部におけるイオンへのラジカル種の照射が実行される反応室、前記プリカーサイオン分離部におけるプリカーサイオンの分離が実行される質量分離器、及び、前記イオン解離部におけるプリカーサイオンの解離が実行される解離室が独立に設けられていることを特徴とする質量分析装置。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の質量分析装置であり、脂質を測定対象の試料とした質量分析装置であって、
   前記分離検出部で得られた検出信号に基づいて作成されるマススペクトル上で、脂肪鎖の不飽和結合部位に特徴的に現れる質量差が12Daであるピークペアを探索し、見いだされたピークペアに基づいて脂質中の不飽和結合部位の位置を特定するデータ解析部、をさらに備えることを特徴とする質量分析装置。
8. 請求項７に記載の質量分析装置であって、
   前記データ解析部は、前記マススペクトル上で、脂肪鎖の飽和結合部位に特徴的に現れる質量差が14Daであるピークペアを探索し、見いだされたピークペアに基づいて脂肪鎖の構造を推定することを特徴とする質量分析装置。
9. 請求項７又は８に記載の質量分析装置であって、
   前記データ解析部は、脂肪鎖由来のプロダクトイオンピークの信号強度に基づいて、グリセロールのsn-2位に結合した脂肪酸を推定することを特徴とする質量分析装置。
   
10. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の質量分析装置であり、脂質を測定対象の試料とした質量分析装置であって、
    前記分離検出部で得られた検出信号に基づいて作成されるマススペクトル上で、プロダクトイオンピークの信号強度に基づいて飽和結合部位と不飽和結合部位とを推定するデータ解析部、をさらに備えることを特徴とする質量分析装置。
11. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の質量分析装置であり、脂質を測定対象の試料とした質量分析装置であって、
    イオンにラジカル種を照射せずに前記プリカーサイオン分離部で分離されたプリカーサイオンに電子を照射して該プリカーサイオンの解離を促進させる電子利用イオン解離部と、
    前記電子利用イオン解離部によりプリカーサイオンを解離させたときに得られたマススペクトルと、前記ラジカル種を利用した反応のあとにプリカーサイオンを分離して解離させたときに得られたマススペクトルと、における同じプロダクトイオンに由来するピークの質量値のシフトに基づいて不飽和結合部位を推定するデータ解析部と、
    をさらに備えることを特徴とする質量分析装置。
12. 質量分析を利用した脂質解析方法であって、
    a)脂質を含む測定対象試料由来のイオンに所定分子のラジカル種を照射して反応を生じさせるイオン反応ステップと、
    b)前記イオン反応ステップにおいてラジカル種と反応したあとのイオンの中で目的とする脂質に由来する特定のイオンをプリカーサイオンとして選択的に分離するプリカーサイオン分離ステップと、
    c)前記プリカーサイオン分離ステップにおいて分離されたプリカーサイオンを解離させるイオン解離ステップと、
    d)前記イオン解離ステップで生成されたプロダクトイオンを質量電荷比に応じて分離して検出する分離検出ステップと、
    e)前記分離検出ステップにおいて得られた検出信号に基づいて作成されるマススペクトル上で、脂肪鎖の不飽和結合部位に特徴的な質量差を有するピークペアを探索し、見いだされたピークペアに基づいて脂質中の不飽和結合部位の位置を特定するデータ解析ステップと、
    を有することを特徴とする、質量分析を用いた脂質解析方法。
13. 請求項１２に記載の脂質解析方法であって、
    前記データ解析ステップは、質量差が12Daであるピークペアを探索することを特徴とする、質量分析を用いた脂質解析方法。
14. 請求項１２に記載の脂質解析方法であって、
    前記所定分子のラジカル種は、水素ラジカル、ヒドロキシルラジカル、及び酸素ラジカルのうち少なくとも一つを含むことを特徴とする、質量分析を用いた脂質解析方法。

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