WO2023233690A1 - 試料分子の構造解析方法 - Google Patents

試料分子の構造解析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023233690A1
WO2023233690A1 PCT/JP2022/046104 JP2022046104W WO2023233690A1 WO 2023233690 A1 WO2023233690 A1 WO 2023233690A1 JP 2022046104 W JP2022046104 W JP 2022046104W WO 2023233690 A1 WO2023233690 A1 WO 2023233690A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ion
mass
measurement
ions
analysis
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/046104
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
裕子 福山
秀治 志知
Original Assignee
株式会社島津製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社島津製作所 filed Critical 株式会社島津製作所
Publication of WO2023233690A1 publication Critical patent/WO2023233690A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/04—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/10—Ion sources; Ion guns
    • H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/26—Mass spectrometers or separator tubes
    • H01J49/34—Dynamic spectrometers
    • H01J49/42—Stability-of-path spectrometers, e.g. monopole, quadrupole, multipole, farvitrons

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing the structure of sample molecules using mass spectrometry.
  • a mass spectrometer (MALDI-MS) equipped with an ion source based on the Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) method uses an analytical sample prepared by mixing the sample with an ionization aid called a matrix.
  • the sample molecules in the analysis sample are ionized by irradiating them with laser light for a short period of time, and the generated ions are introduced into a mass separator where they are separated and detected according to their mass-to-charge ratio (m/z). .
  • the MALDI method is generally known as a soft ionization method that can ionize refractory compounds without significantly decomposing them. Therefore, MALDI-MS is widely used to obtain molecular weight information of biopolymers such as nucleic acids, nucleic acid-related substances, peptides, proteins, and sugar chains.
  • molecular weight related ions precursor ions generated from sample molecules are intentionally dissociated using an appropriate method in a MALDI ion source, and various fragment ions are thereby generated.
  • mass spectrometry on the fragment ion, the structure of the sample molecule is estimated based on the mass information of the fragment ion.
  • ISD fragments various fragment ions (ISD fragments) of nucleic acids are generated by in-source decay (ISD) using MALDI-TOFMS. Mass spectrometry is performed, and based on the mass information of the fragment ions obtained thereby, the base sequence information of the nucleic acid is analyzed.
  • In-source decomposition is a technique in which ions are dissociated in an ion source simultaneously with or immediately after ionization.
  • the MALDI method is a soft ionization method, so ions are inherently difficult to dissociate, but by increasing the intensity of the laser beam, increasing the energy during ionization, or using a special matrix, for example, It is known that ion dissociation is promoted during ionization.
  • ISDs of nucleic acid molecules include a, b, c, d/w, x, y, z-ions, etc., which are generated by specific cleavage at one site of a phosphodiester bond (or phosphorothioate bond, etc.). It is known that fragments occur.
  • MALDI-TOFMS is used as a mass spectrometer, and most of the ions generated in the ion source are introduced into the mass separation unit and separated from those with lower mass. Detect. Therefore, when ISD is performed, fragment ions are detected in a wide range from a low mass region to a high mass region. In this case, there is a problem that the peak of fragment ions on the low mass region side overlaps with the peak of cluster ions derived from the matrix, or detection is suppressed due to ion suppression effects or the like.
  • ions in the low mass region are preferentially detected, which may cause a problem in which it is difficult to obtain sensitivity for fragment ions in the high mass region.
  • the target mass range for one measurement is wide, there is a problem that the overall detection sensitivity and resolution of fragment ions tend to decrease, especially under conditions where the fragmentation efficiency from precursor ions is low.
  • the fragment ion peak near the m/z value of the precursor ion may overlap with peaks other than fragment ions (base elimination peaks, etc. in the case of nucleic acids), or excessive energy may be applied to the precursor ion during fragmentation.
  • peaks other than fragment ions base elimination peaks, etc. in the case of nucleic acids
  • FIG. 5 of Non-Patent Document 3 describes the ISD spectrum of a nucleic acid by MALDI-TOFMS.
  • the peak of the fragment ion near the m/z value of the precursor ion overlaps with the peak other than the fragment ion, and the peak of the fragment ion dissociated at the base sequence part far from the 3' or 5' end (m/z of the precursor ion).
  • the sensitivity and resolution are lower than the peaks of fragment ions detected at m/z values far from the m/z value near the m/z value toward the low mass region.
  • the present invention was made in view of the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to detect fragment ions necessary for structural analysis of sample molecules with high sensitivity in a relatively wide mass range from low mass range to high mass range.
  • the purpose is to provide a structural analysis method that allows for
  • the method for structural analysis of sample molecules according to the present invention is as follows: An ion source using a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method, an ion trapping section for separating and trapping ions having a predetermined mass-to-charge ratio from among the ions generated by the ion source, and the ion trapping section
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • a method for analyzing the structure of a sample molecule using an ion trap mass spectrometer equipped with a detection unit for detecting captured ions the method comprising: Ion amount setting items related to the amount of ions generated by the ion source, and the ion capture when performing molecular weight related ion measurement for detecting molecular weight related ions of the sample molecules contained in the sample using the mass spectrometer.
  • a standard analysis condition acquisition step of respectively acquiring standard analysis conditions for a mass-to-charge ratio range setting item regarding the mass-to-charge ratio range of ions captured in the detection unit and a signal intensity setting item regarding the signal strength of ions in the detection unit; Among the standard analysis conditions acquired in the standard analysis condition acquisition step, at least one analysis condition of the ion amount setting item, the mass-to-charge ratio range setting item, and the signal intensity setting item is changed.
  • An ion source using a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method an ion trapping section for separating and trapping ions having a predetermined mass-to-charge ratio from among the ions generated by the ion source, and the ion trapping section
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • a method for analyzing the structure of a sample molecule using an ion trap mass spectrometer equipped with a detection unit for detecting captured ions the method comprising: Ion amount setting items related to the amount of ions generated by the ion source, and the ion capture when performing molecular weight related ion measurement for detecting molecular weight related ions of the sample molecules contained in the sample using the mass spectrometer.
  • a standard analysis condition acquisition step of respectively acquiring standard analysis conditions for a mass-to-charge ratio range setting item regarding the mass-to-charge ratio range of ions captured in the detection unit and a signal intensity setting item regarding the signal strength of ions in the detection unit; Among the standard analysis conditions acquired in the standard analysis condition acquisition step, at least one analysis condition of the ion amount setting item, the mass-to-charge ratio range setting item, and the signal intensity setting item is changed.
  • a product ion measurement step of performing product ion measurement to detect a plurality of first fragment ions generated by dissociation of molecular weight related ions of the sample molecule MS/MS measurement condition setting step of setting measurement conditions for performing MS/MS measurement using at least one of the plurality of first fragment ions detected in the product ion measurement as a precursor ion; an MS/MS measurement data acquisition step of acquiring mass spectrum data of the MS/MS measurement by performing the MS/MS measurement based on the measurement conditions set in the MS/MS measurement condition setting step; a second fragment peak extraction step of extracting a peak corresponding to a second fragment ion generated in the MS/MS measurement from the mass spectrum data acquired in the MS/MS measurement data acquisition step; a data analysis step of determining a part of the structure of the sample molecule based on the mass information of the peak extracted in the second fragment peak extraction step; It has the following.
  • molecular weight-related ion refers to a general term for ions that are directly useful for obtaining molecular weight information, and specifically includes, for example, protonated molecules, deprotonated molecules, and sodium ion-added molecules. (sodium adduct molecule) etc.
  • fragment ions necessary for structural analysis of sample molecules can be detected with high sensitivity in a relatively wide mass range from a low mass range to a high mass range.
  • a sufficient number of fragment ions can be detected to perform structural analysis of sample molecules.
  • more structural information such as sequence information can be determined regarding the molecular structure of sample molecules containing relatively high mass molecules such as biopolymers.
  • fragment ions (second fragment ions) obtained by further dissociating fragment ions (first fragment ions) derived from molecular weight-related ions can be detected with high sensitivity.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing an example of a mass spectrometer used to implement the structural analysis method according to the present invention.
  • 1 is a flowchart showing the procedure of a structural analysis method according to an embodiment of the present invention.
  • 5 is a flowchart showing the steps of a structural analysis method according to another embodiment of the present invention.
  • 1 is a diagram showing mass spectra of standard nucleic acid A when conditions (a) to (e) are used in Example 1.
  • FIG. FIG. 3 is a diagram showing the mass spectrum of standard nucleic acid A and the sequence analysis status of standard nucleic acid A when condition (e) is used in Example 1.
  • 3 is a diagram showing mass spectra of standard nucleic acid A when conditions (b) to (d) are used in Example 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing the mass spectrum of standard nucleic acid A and the sequence analysis status of standard nucleic acid A when condition (d) is used in Example 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing the mass spectrum (m/z 2000 to 6000) of standard nucleic acid A when conditions (b) and (c) are used in Example 3.
  • 3 is a diagram showing the mass spectrum (m/z 3000 to 5000) of standard nucleic acid A when conditions (b) and (c) are used in Example 3.
  • FIG. FIG. 3 is a diagram showing the mass spectrum of standard nucleic acid A and the sequence analysis status of standard nucleic acid A when condition (c) is used in Example 3.
  • FIG. 3 is a diagram showing the mass spectrum of standard nucleic acid A and the sequence analysis status of standard nucleic acid A when conditions (b) and (c) are used in Example 3.
  • FIG. FIG. 4 is a diagram showing the mass spectrum of mipomersen and the sequence analysis status of mipomersen when conditions (a) and (b) are used in Example 4.
  • FIG. 4 is a diagram showing the mass spectrum of mipomersen and the sequence analysis status of mipomersen when using the measurement conditions of MS/MS measurement in Example 4.
  • the inventors of the present application solved the above problem by using an ion trap (IT) mass spectrometer (MALDI-ITMS) equipped with a MALDI ion source, and it has been confirmed that ion dissociation is promoted.
  • ISD ion trap
  • MALDI-ITMS mass spectrometer
  • the present invention provides a method for structural analysis of sample molecules using MALDI-ITMS, which can preferentially detect fragment ions in the low mass region with high sensitivity among the fragment ions necessary for analysis.
  • the purpose is to
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing an example of a mass spectrometer used to carry out the structural analysis method according to the present embodiment.
  • the mass spectrometer used in this embodiment is an ion trap type mass spectrometer, and includes an ion source 1 that ionizes a sample containing an analyte, and ions that have a predetermined mass-to-charge ratio among the ions generated by the ion source 1.
  • An ion trap 2 ion trapping section in the present invention that once traps the trapped ions by the action of a high-frequency electric field and separates the trapped ions according to their mass-to-charge ratio (m/z), and a detection section 3 that detects the separated ions. Equipped with.
  • the ion source 1 is an ion source using the MALDI method, and includes a laser irradiation unit 11 that irradiates a sample with laser light, and a sample stage 12 on which a sample plate S on which a sample is placed is placed.
  • the ion trap 2 is a quadrupole ion trap that includes an annular ring electrode 21 and a pair of end cap electrodes 22 and 23 facing each other with the ring electrode 21 interposed therebetween.
  • An ion entrance hole 22a is formed in the entrance end cap electrode 22, and an ion exit hole 23a is formed in the exit end cap electrode 23.
  • the detector 3 includes a conversion dynode 31 that converts ions into electrons, and a detector (secondary electron multiplier) 32 that multiplies and detects the electrons coming from the conversion dynode 31.
  • Predetermined voltages are applied to the ring electrode 21 and end cap electrodes 22 and 23 of the ion trap 2, respectively.
  • the high frequency electric field thus formed allows ions to be captured in the internal space surrounded by the ring electrode 21 and end cap electrodes 22 and 23, and ions can be ejected from the internal space through the ion exit hole 23a. .
  • delay time By changing the time (hereinafter referred to as delay time) from when the sample is irradiated with laser light by the ion source 1 to when the trapping voltage for trapping ions is applied to the ring electrode 21 of the ion trap 2, The range of mass-to-charge ratios of ions that are preferentially captured in the ion trap is controlled. If the delay time is made longer, ions on the higher mass side can be captured more reliably than other ions, and when the delay time is made shorter, ions on the lower mass side can be captured more reliably than other ions.
  • the predetermined voltage applied to the ring electrode 21 and the end cap electrodes 22, 23 may be a sinusoidal high frequency voltage, or may be a rectangular wave voltage generated by switching two different voltages at high speed.
  • the frequency can be changed while keeping the amplitude (voltage value) of the square wave voltage constant, or the duty ratio, which is the ratio of the switching interval of the square wave voltage, can be changed. By varying this, the range of mass-to-charge ratios of ions that can be captured is controlled.
  • the ion trap mass spectrometer in this embodiment utilizes the mass separation function of the ion trap itself to eject the ions captured in the ion trap in descending order of mass-to-charge ratio, and a detector disposed outside the ion trap.
  • a mass spectrometer that detects ions
  • the ions ejected all at once from the ion trap are separated according to their mass-to-charge ratio by a mass separator placed outside the ion trap, such as a time-of-flight mass separator. It also includes a mass spectrometer that performs detection using a detector placed outside the ion trap.
  • a tandem type mass spectrometer having a configuration in which two mass separation units are connected in series may be used so as to perform MS/MS measurement described later.
  • Step 101 Obtaining standard analysis conditions when performing MS measurement
  • a measurement for detecting molecular weight-related ions (protonated molecules [M+H] + , deprotonated molecules [MH] -, etc.) of sample molecules that are the analyte is performed.
  • MS measurement standard analysis conditions are obtained.
  • MS measurement uses measurement conditions to detect molecular weight-related ions with as high sensitivity and high resolution as possible, so it is a measurement that does not involve ion dissociation (or only a small amount of ion dissociation occurs).
  • a mass spectrometer has various setting items that can be set as appropriate depending on the type of object to be analyzed and the purpose of analysis.
  • the standard analysis conditions are set for the ion amount setting items related to the ion amount, the mass-to-charge ratio range setting items related to the mass-to-charge ratio range of ions captured in the ion trap 2, and the signal intensity setting items related to the signal strength of ions in the detection unit 3. get.
  • Standard analysis conditions are typical conditions that allow detection of ions related to the molecular weight of sample molecules.
  • the Default values may be used as standard analysis conditions. In that case, reading the default value from a storage unit or the like in which the default value is stored in advance corresponds to obtaining standard analysis conditions.
  • perform MS measurement by changing the settings of various setting items to the default values so that ions related to the molecular weight of sample molecules are detected with higher sensitivity and high resolution. A value (threshold value, threshold value, etc.) may be determined.
  • the ion amount setting items include the laser intensity (laser power) irradiated by the laser irradiation unit 11, the mass-to-charge ratio range setting items include the RF delay value corresponding to the delay time, and the signal strength setting items include the conversion dynode. These include the voltage applied to the detector 31 and the voltage applied to the detector (secondary electron multiplier) 32.
  • Step 102 Setting changed analysis conditions that changed the standard analysis conditions]
  • modified analysis conditions are set in which at least one of the ion amount setting item, mass-to-charge ratio range setting item, and signal intensity setting item is changed. That is, there may be a case where only one of the ion amount setting item, the mass-to-charge ratio range setting item, and the signal intensity setting item is changed, and the remaining setting items are not changed.
  • the ion amount setting items are changed so that the amount of ions generated in the ion source 1 increases
  • the mass-to-charge ratio range setting items are changed so that the amount of ions generated in the ion trap 2 increases compared to when performing MS measurement under standard analysis conditions. is changed so that ions on the lower mass side are captured preferentially
  • the signal strength setting items are changed so that the signal strength of the ions in the detection unit 3 is increased.
  • the intensity of the laser beam which is an ion amount setting item
  • it is preferable to set it higher than the standard analysis conditions for example, about 1 to 40% higher than the value of the standard analysis conditions. It is more preferable to set it higher, and even more preferably to set it higher by about 1 to 30%.
  • the RF delay value which is a mass-to-charge ratio range setting item
  • it is preferable to set it lower than the standard analysis conditions for example, it is more preferable to set it 5 to 30% lower than the value of the standard analysis conditions. More preferably, it is set 10-20% lower (such that the delay time is 1-3 ⁇ sec).
  • the voltage applied to the conversion dynode 31 which is a signal strength setting item
  • it is preferable to set it higher than standard analysis conditions for example, it is preferable to set it higher by about 5 to 30%, and about 10 to 30%. It is more preferable to set it high.
  • the voltage applied to the detector (secondary electron multiplier) 32 which is also a signal strength setting item
  • it is preferable to set it higher than standard analysis conditions for example, set it 5 to 50% higher. is preferable, and it is more preferable to set it as high as 10 to 50%.
  • Step 103 Obtaining data by ISD measurement using changed analysis conditions. Using the above modified analysis conditions, a measurement (corresponding to the product ion measurement of this application) is performed to detect fragment ions generated by dissociation of molecular weight related ions (precursor ions) of sample molecules, and Get data.
  • the generation mechanism of fragment ions derived from sample molecules since the generation mechanism of fragment ions derived from sample molecules has not yet been proven, in this specification, dissociation that occurs simultaneously with or immediately after ionization in the ion source of a MALDI ion trap mass spectrometer, The overall dissociation of ions that occurs in the apparatus thereafter will be referred to as in-source decomposition (ISD), and the above measurement (product ion measurement) accompanied by ISD will be referred to as ISD measurement. Furthermore, hereinafter, the fragment ions generated in the above measurement will be referred to as first fragment ions or ISD fragments. According to the ISD measurement using the above-mentioned modified analysis conditions, it is possible to detect particularly the first fragment ion in the low mass region side far from the m/z value of the molecular weight related ion with high sensitivity.
  • the range of the predetermined mass-to-charge ratio is further set such that the maximum value of the predetermined mass-to-charge ratio of ions captured by the ion trap 2 is smaller than the value of the mass-to-charge ratio of ions related to the molecular weight of the sample molecule.
  • the ISD measurement may be performed using the conditions set.
  • the maximum value of the predetermined mass-to-charge ratio of ions captured by the ion trap 2 be set to be smaller, for example, by 0.5 to 40%, than the value of the mass-to-charge ratio of ions related to the molecular weight of the sample molecules. It is preferable to set it as small as 0.5 to 20%.
  • the measurement mode pre-installed in the device to a measurement mode in which the target mass range is m/z 2000 to 18000.
  • There is a method such as switching to a measurement mode that does not include molecular weight 6000 by switching from m/z mode to a measurement mode that covers m/z 650 to 5000.
  • the target mass range in the measurement mode is determined according to the frequency of the high-frequency voltage applied to the ion trap 2.
  • the main thing to do is to adjust the frequency of the high-frequency voltage and set the cutoff value on the low mass side (Low Mass Cut-Off: LMCO).
  • the mass range to be measured is determined.
  • the LMCO is set to a small value, and the mass range to be measured is set to the lower mass side.
  • the LMCO is set to a large value, and the mass range to be measured is set to the low mass side. is set on the high mass side. That is, by changing the frequency of the high-frequency voltage applied to the ion trap 2, the range of the predetermined mass-to-charge ratio is changed.
  • Another method of changing the range of the predetermined mass-to-charge ratio is to change the setting item of the duty ratio, which is the ratio of the switching interval of the rectangular wave voltage built into the device, for an analyte with a molecular weight of about 6000.
  • the setting item of the duty ratio which is the ratio of the switching interval of the rectangular wave voltage built into the device, for an analyte with a molecular weight of about 6000.
  • mass spectrum data is obtained in which first fragment ions having a mass-to-charge ratio close to the m/z value of the precursor ion are excluded.
  • the detection sensitivity of the first fragment ion in a low mass range far from the m/z value of the precursor ion is improved.
  • step 103 ISD measurements are performed both with and without the conditions in which the predetermined mass-to-charge ratio range is set as described above, thereby obtaining mass spectral data obtained in each measurement. You can do it like this. Thereby, the first fragment ions derived from the sample molecules can be detected from a low mass region to a high mass region.
  • the range of the predetermined mass-to-charge ratio was set so that the maximum value of the predetermined mass-to-charge ratio of ions captured by the ion trap 2 was smaller than the value of the mass-to-charge ratio of ions related to the molecular weight of the analyte.
  • standard analysis conditions were obtained in step 102 regarding the voltage applied to the sample stage 12 of the ion source 1, and the voltage applied to the sample stage 12 was changed to a larger value than the analysis conditions. ISD measurement may be performed using the conditions.
  • the voltage applied to the sample stage is preferably set to be about 4 to 8 times higher than standard analysis conditions, and more preferably about 4 to 5 times higher.
  • Step 104 Creation of ISD spectrum
  • a mass spectrum (ISD spectrum) is created based on the data obtained by the ISD measurement in step 103.
  • the mass spectrum data in the present invention includes information on the mass-to-charge ratio of each peak in the mass spectrum and its signal intensity, and in step 104, mass spectrum data of ISD measurement (ISD spectrum data) is acquired.
  • Step 105 Analysis of mass spectral data
  • peaks corresponding to various first fragment ions are extracted, the attribution of various first fragment ions is determined based on the mass information indicated by the peaks, and the results are combined. Determining at least a portion of the structure of the original sample molecule. Determining the structure includes sequence analysis and identifying the type of chemical modification or the site where the chemical modification has been performed by sequence analysis. A database search or de novo sequencing may be used to determine the structure.
  • the mass spectrum data obtained from both of them is obtained.
  • the analysis may be performed by combining the attribution results of the various first fragment ions obtained. By doing so, it is possible to more reliably perform structural analysis of the object to be analyzed.
  • the analyte in the present invention is, for example, a sample molecule containing relatively high-mass molecules such as biopolymers.
  • biopolymers include nucleic acids, peptides, sugar chains, proteins, and lipids.
  • nucleic acid here also includes nucleic acid-related substances such as modified nucleic acids, nucleic acid derivatives, and nucleic acid drugs.
  • nucleic acids and nucleic acid-related substances will be collectively referred to as nucleic acids.
  • the analyte is a nucleic acid
  • the degree of polymerization (base length) of the nucleic acid is not particularly limited, but it is preferably an oligonucleotide in which several to several dozen nucleotides are polymerized.
  • the analysis sensitivity of nucleic acids with a large molecular weight is particularly improved, so a nucleic acid with a molecular weight of 3,000 or more, particularly a nucleic acid with a molecular weight of 6,000 or more is more preferable.
  • the nucleic acid may be a natural product obtained from living organisms or a processed product thereof, or may be an artificially synthesized chemically synthesized nucleic acid.
  • a sample for analysis is prepared by dropping a mixed solution of a sample containing a nucleic acid and a matrix material onto a sample plate and drying it.
  • a mixed solution may be prepared in advance, and the mixed solution may be dropped onto the sample plate and dried, or the mixed solution may be prepared on the sample plate and dried as it is.
  • an appropriate material can be selected depending on the type of nucleic acid.
  • a mixed matrix in which two or more types of matrix substances are mixed may be used, and among them, a mixed matrix in which 3-HPA and 2,4-DHAP, 3-HPA and THAP, and 2,4-DHAP and THAP are mixed, respectively, may be used. is preferred.
  • the sample for analysis may further contain a matrix additive.
  • a matrix additive ammonium citrate dibasic (ACD) can be used.
  • ACD ammonium citrate dibasic
  • the order in which the sample containing nucleic acid, the matrix substance, and the matrix additive are mixed is not particularly limited, but a matrix/additive mixed solution containing the matrix substance and matrix additive may be prepared in advance.
  • a sample for analysis by mixing a sample solution containing a nucleic acid with the matrix/additive mixed solution.
  • the sample solution and the matrix/additive mixed solution may be dropped onto the sample plate and dried to prepare the sample for analysis.
  • An analytical sample may be prepared by dropping each onto a sample plate, mixing them on the sample plate, and drying the mixture. Preparing the matrix/additive mixed solution in advance facilitates the preparation of samples for analysis.
  • the concentration of the matrix additive in the matrix/additive mixed solution is preferably 10 to 100 mM, more preferably 30 to 70 mM, from the viewpoint of generating a sufficient amount of ions related to the molecular weight of nucleic acids.
  • FIG. 3 is a flowchart showing the procedure of the structural analysis method of this embodiment.
  • Step 201 Obtaining standard analysis conditions when performing MS measurement
  • Step 202 Setting changed analysis conditions that changed the standard analysis conditions
  • Step 203 Acquisition of data by ISD measurement using changed analysis conditions
  • Step 204 Creation of ISD spectrum
  • Step 205 Setting measurement conditions for MS/MS measurement
  • At least one of the plurality of first fragment ions detected in the ISD measurement in step 203 is selected as a precursor ion, and MS/MS measurement of the precursor ion is performed.
  • Set the measurement conditions for MS/MS measurement generally involves selecting ions with a specific mass-to-charge ratio from among ions generated from sample molecules in a mass separation unit in the first stage as precursor ions, and then colliding them in a subsequent collision chamber.
  • the precursor ions are dissociated by CID with a gas such as argon introduced into the ion trap 2 to generate product ions containing various fragment ions, and then mass scanning is performed to determine the mass-to-charge ratio. Ions are ejected in ascending order of .
  • first fragment ion As the precursor ion, it is preferable to select a first fragment ion that is detected with relatively high sensitivity in the ISD spectrum data acquired in step 204 and that does not overlap with other peaks as much as possible. If such a first fragment ion is used as a precursor ion, multiple fragment ions generated in subsequent MS/MS measurements (hereinafter, fragment ions generated in MS/MS measurements are also referred to as second fragment ions) can be detected with high sensitivity. be done. Further, it is preferable to select a first fragment ion in a low mass region far from the m/z value of the molecular weight related ion as the precursor ion.
  • the m/z value of the first fragment selected as a precursor ion is preferably m/z 5000 or less, more preferably m/z 3000 or less, and even more preferably m/z 2000 or less.
  • Step 206 Obtaining data by MS/MS measurement
  • MS/MS measurement is performed based on the measurement conditions set in step 205, and data regarding the detected peaks is acquired.
  • Step 207 Creation of MS/MS spectrum
  • MS/MS spectrum A mass spectrum (MS/MS spectrum) is created based on the data obtained in step 206, and mass spectrum data (MS/MS spectrum data) of MS/MS measurement is obtained.
  • Step 208 Analysis of mass spectral data
  • peaks corresponding to various first fragment ions are extracted from the ISD spectrum data acquired in step 204, the attribution of various first fragment ions is determined based on the mass information indicated by the peak, and At least a portion of the structure of the original sample molecule is determined by combining the results.
  • peaks corresponding to various second fragment ions are extracted from the MS/MS spectrum data acquired in step 207, the attribution of the various second fragment ions is determined based on the mass information indicated by the peaks, and the results are A part of the structure of the original sample molecule is determined.
  • the peak attribution results of ISD measurement By combining the peak attribution results of ISD measurement and the peak attribution results of MS/MS measurement, more information regarding the structure of the sample molecule can be obtained, and the accuracy of structural analysis is improved. From the peak assignment results of MS/MS measurements, it becomes easier to obtain information on the terminal structure of the sample molecule, which is difficult to obtain due to the sensitivity of ISD fragments in ISD measurements alone.
  • the sample molecule is a nucleic acid
  • the structure (base sequence, modification information, etc.) near the 3' end or 5' end of the nucleic acid can be determined from the peak assignment results of MS/MS measurements.
  • step 208 the attribution of the first fragment ion and the second fragment ion is determined based on the ISD spectrum data acquired in step 204 and the MS/MS spectrum data acquired in step 207, but It is sufficient to simply determine the attribution of the second fragment ion based on the MS/MS spectrum data acquired in step 207. In that case, if the first fragment ion generated by ISD measurement is detected in step 203 and the m/z value of the first fragment ion can be obtained, step 204 (creation of ISD spectrum, acquisition of ISD spectrum data) is performed. In step 208, only a part of the structure of the original sample molecule is determined by combining the assignment results of the various second fragment ions.
  • sample solution a 10 pmol/ ⁇ L aqueous solution of standard nucleic acid A (5'-TGTGCGTGTGTAGTGTCT-3': MW 6201.1, DNA, SEQ ID NO: 1, synthetically commissioned product) was prepared.
  • a 40 mg/mL 50% acetonitrile (ACN) aqueous solution of 2,4-dihydroxyacetophenone (2,4-DHAP) was prepared, containing diammonium hydrogen citrate (ACD) at a concentration of 70 mM as a matrix additive. did.
  • Mass spectrometry> For mass spectrometry, a MALDI digital ion trap mass spectrometer (MALDI-DITMS, manufactured by Shimadzu Corporation, trade name: MALDImini-1) was used. 3. The sample plate containing the analytical sample prepared in step 1 was inserted into MALDI-DITMS, and MS and ISD measurements were performed in positive mode using the raster function.
  • MALDI-DITMS MALDI digital ion trap mass spectrometer
  • MS measurement> The values in Table 1 below were used as conditions (various settings of the mass spectrometer) for performing MS measurements.
  • the measurement mode indicates the range of the mass-to-charge ratio of ions to be measured, and more specifically, it defines the range of the mass-to-charge ratio of ions captured in the ion trap, and the range is indicated in parentheses. Shown inside. The same applies to the table below.
  • Figure 4 shows the mass spectra of standard nucleic acid A obtained by MS measurement and ISD measurement under each condition (conditions (a), (b), (c), (d), and (e) in order from the top).
  • the mass spectrum obtained when using this method is shown below.
  • the left side represents the entire measured mass-to-charge ratio (m/z 3300 to 6300), and the right side shows an enlarged part of it (m/z 4400 to 5200).
  • the arrows in the figure indicate the detection status of molecular weight related ions ([M+H] + , precursor ions).
  • the numerical values in the figure indicate the peak intensity (mV) of the most intense ion in each mass spectrum.
  • FIG. 5 shows the ISD spectrum of fragment ions obtained under condition (e) and the status of nucleic acid base sequence analysis. From FIG. 5, it was possible to determine most of the sequences of standard nucleic acid A (90% of the entire sequence, excluding the sequence near the center).
  • Mass spectrometry and structural analysis were performed in the same manner as in Example 1, except that the measurement conditions for MS measurement and ISD measurement were different.
  • MS measurement> The values in Table 3 below were used as conditions (various settings of the mass spectrometer) for performing MS measurements.
  • Figure 6 shows the ISD spectra of standard nucleic acid A obtained by ISD measurement under each condition (ISD spectra when using conditions (b), (c), and (d) in order from the bottom). show.
  • condition (b) in which the detector voltage, conversion dynode voltage, RF delay value, and laser power were changed from condition (a)
  • fragment ions were generated in the high mass region near the precursor ion. It was easy to detect ( Figure 6(b)).
  • the measurement mode was further changed to make the maximum value of the mass-to-charge ratio range of ions captured in the ion trap smaller than the mass-to-charge ratio of the precursor ions.
  • Figure 5 shows the ISD spectrum of standard nucleic acid A when ISD measurement was performed under conditions (b) in Table 4, with the laser power changed to 65 (i.e., conditions (e) in Table 2). and the sequence of standard nucleic acid A and its attribution status.
  • condition (b) in Table 4 when the laser power was set to 75 (condition (b) in Table 4, Fig. 6 (b)) and when it was set to 65 (condition (e) in Table 2), , Fig. 5), the obtained ISD spectra were almost unchanged. Therefore, the attribution status of the ISD spectrum of condition (b) in Table 4 will be explained using FIG. 5. From FIG. 5, a large number of fragment ions could be assigned, and about 90% of the base sequence could be determined. However, due to the low sensitivity of fragment ions in the low mass region, it was not possible to analyze the entire sequence.
  • FIG. 7 shows the ISD spectrum of standard nucleic acid A when ISD measurement was performed under condition (d) (conditions in FIG. 6(d)), the sequence of standard nucleic acid A, and its attribution status.
  • condition (d) conditions in FIG. 6(d)
  • FIG. 7 shows the ISD spectrum of standard nucleic acid A when ISD measurement was performed under condition (d) (conditions in FIG. 6(d)), the sequence of standard nucleic acid A, and its attribution status.
  • condition (d) condition in FIG. 6(d)
  • FIG. 7 shows the ISD spectrum of standard nucleic acid A when ISD measurement was performed under condition (d) (conditions in FIG. 6(d)), the sequence of standard nucleic acid A, and its attribution status.
  • a large number of fragment ions are detected, including fragment ions in the low mass region, where the peak could not be observed in Figure 5 due to low detection sensitivity, and it is possible to determine approximately 60% of the base sequence. did it.
  • no fragment ions
  • Mass spectrometry and structural analysis were performed in the same manner as in Example 1, except that the measurement conditions for MS measurement and ISD measurement were different.
  • FIGS. 8A and 8B show ISD spectra of standard nucleic acid A obtained by ISD measurement under each condition (ISD spectra when conditions (b) and (c) are used in order from the bottom).
  • Figure 8A shows the entire measured mass-to-charge ratio (m/z 2000-6000)
  • Figure 8B shows an enlarged part of it (m/z 3000-5000). It is.
  • FIG. 9 shows the ISD spectrum of standard nucleic acid A, the sequence of standard nucleic acid A, and its attribution status when ISD measurement was performed under condition (c). From FIG. 9, when including ions with low peak intensities, a large number of fragment ions could be assigned, and the entire sequence could be analyzed. However, under these conditions, the fragment ion intensity near the precursor ion was low.
  • Figure 10 shows the ISD spectrum of standard nucleic acid A when ISD measurements were performed under conditions (b) and (c) (upper row is condition (b), lower row is condition (c)), the sequence of standard nucleic acid A, and its sequence. Indicates attribution status.
  • condition (c) the entire sequence of the nucleic acid could be analyzed, but the peak intensity of ions near the precursor ion was low.
  • condition (b) fragment ions near the precursor were observed with sufficient intensity.
  • sample solution mipomersen (sample after desalting and purification of synthetic nucleic acid for research and development.
  • DNA total length is 20 bases, MW 7177) (5'-MG-MC-MC-MU-MC-dA-dG-dT) -dC-dT-dG-dC-dT-dT-dC-MG-MC-MA-MC-MC-3', M indicates 2'-O-(2-methoxyethyl)nucleoside, d indicates 2'-deoxynucleoside
  • the carbon at position 5 of cytosine and uracil was replaced with a methyl group, and all the phosphodiester bonds between nucleotides were replaced with phosphorothioate bonds.
  • matrix solution 40 mg/mL 50% ACN aqueous solution (3-HPA solution) of 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) containing 40 mM ACD as a matrix additive and 40 mg of 2,4-DHAP containing 70 mM ACD as a matrix additive. /mL 50% ACN aqueous solution (2,4-DHAP solution) was prepared, and a mixed matrix (3-HPA + 2,4-DHAP , 1:1) solution was prepared.
  • the sample plate was inserted into MALDI-DITMS (manufactured by Shimadzu Corporation, product name: MALDImini-1), and ISD measurement was performed using the raster function in positive mode.
  • the values in Table 7 below were used as the conditions (various settings of the mass spectrometer) for performing ISD measurement.
  • the laser power the optimum value was used for each condition.
  • FIG. 11 shows the ISD spectrum of mypomersen obtained using the mixed matrix 3-HPA+2,4-DHAP and the attribution status of the main peaks.
  • Figure 11(a) is the ISD spectrum obtained by performing ISD measurement using condition (a) in Table 7
  • Figure 11(b) is the ISD spectrum obtained by performing ISD measurement using condition (b) in Table 7.
  • the peak intensity is doubled compared to the other part.
  • each peak is given the name of the fragment ion species of the corresponding oligonucleotide (general name proposed in Non-Patent Document 4).
  • This name represents each ion type as a fragment ion series according to the nucleic acid dissociation pattern naming convention, and fragment ions including the 5' end are expressed as a n , b n , c n , and d n . , fragment ions containing 3' ends in opposite directions are designated x m , y m , z m , w m .
  • the subscripts n and m indicate the number of constituent units (by definition, the number of bases) from the corresponding end to the dissociation site.
  • B in the name of the fragment ion species represents the base of the nucleic acid.
  • a 16 -B (G) in FIG. 11(b) is an ion in which the base guanine (G) is removed from the a 16 ion. Show that something is true. The same applies to the following figures.
  • the area surrounded by a frame at the right end of FIG. 11(b) shows the spectrum near the m/z value of the molecular weight related ion [M+H] + (precursor ion).
  • the base elimination peak of the precursor ion was detected with particularly high sensitivity, and it was confirmed that the detection of the ISD fragment peak was inhibited by the overlapping of the base elimination peak and the ISD fragment peak. .
  • FIG. 12 shows an MS/MS spectrum using w 5 -ion detected in the ISD spectrum of FIG. 11 as a precursor ion and the main peak attribution status.
  • FIG. 12 shows multiple types of second fragment ions containing terminal sequence information with sufficient intensity and resolution, and the terminal sequence could be analyzed more reliably.
  • the MS/MS spectrum shown in Figure 12 there was no overlap between the product ion peak near the precursor ion and the peak of the second fragment ion, such as the base elimination peak seen in the ISD spectrum shown in Figure 11(b). .
  • this method of performing structural analysis by combining ISD measurement and MS/MS measurement can be used regardless of the substance to be analyzed. Furthermore, improvements can be made to more reliably perform terminal sequence analysis, which is a problem in MALDI-MS ISD analysis.
  • This method is considered to be particularly effective for unstable nucleic acids that are prone to cleavage such as base elimination, and for measurements using MALDI-IT-TOFMS that are prone to fragmentation.
  • a method for structural analysis of sample molecules includes: An ion source using a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method, an ion trapping section for separating and trapping ions having a predetermined mass-to-charge ratio from among the ions generated by the ion source, and the ion trapping section
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • ion trapping section for separating and trapping ions having a predetermined mass-to-charge ratio from among the ions generated by the ion source
  • the ion trapping section A method for analyzing the structure of a sample molecule using an ion trap mass spectrometer equipped with a detection unit for detecting captured ions, the method comprising: Ion amount setting items related to the amount of ions generated by the ion source, and the ion capture when performing molecular weight related ion measurement for detecting molecular weight related ions of the sample molecules contained in the sample using the mass spectrometer.
  • a standard analysis condition acquisition step of respectively acquiring standard analysis conditions for a mass-to-charge ratio range setting item regarding the mass-to-charge ratio range of ions captured in the detection unit and a signal intensity setting item regarding the signal strength of ions in the detection unit; Among the standard analysis conditions acquired in the standard analysis condition acquisition step, at least one analysis condition of the ion amount setting item, the mass-to-charge ratio range setting item, and the signal intensity setting item is changed.
  • fragment ions necessary for structural analysis can be detected with high sensitivity in a relatively wide mass range from low mass range to high mass range.
  • the mass spectrometer is a device capable of MS/MS measurement, moreover, MS/MS measurement condition setting step of setting measurement conditions for performing MS/MS measurement using at least one of the plurality of first fragment ions detected in the product ion measurement as a precursor ion; an MS/MS measurement data acquisition step of performing the MS/MS measurement based on the measurement conditions set in the MS/MS measurement condition setting step and acquiring mass spectrum data of the MS/MS measurement; a second fragment peak extraction step of extracting a peak corresponding to a second fragment ion generated in the MS/MS measurement from the mass spectrum data acquired in the MS/MS measurement data acquisition step; has In the data analysis step, based on the mass information of the peak extracted in the first fragment peak extraction step and the mass information of the peak extracted in the second fragment peak extraction step, at least one of the structures of the sample molecule is determined. It may also be something that determines the division.
  • a method for structural analysis of sample molecules includes: An ion source using a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method, an ion trapping section for separating and trapping ions having a predetermined mass-to-charge ratio from among the ions generated by the ion source, and the ion trapping section
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • ion trapping section for separating and trapping ions having a predetermined mass-to-charge ratio from among the ions generated by the ion source
  • the ion trapping section A method for analyzing the structure of a sample molecule using an ion trap mass spectrometer equipped with a detection unit for detecting captured ions, the method comprising: Ion amount setting items related to the amount of ions generated by the ion source, and the ion capture when performing molecular weight related ion measurement for detecting molecular weight related ions of the sample molecules contained in the sample using the mass spectrometer.
  • a standard analysis condition acquisition step of respectively acquiring standard analysis conditions for a mass-to-charge ratio range setting item regarding the mass-to-charge ratio range of ions captured in the detection unit and a signal intensity setting item regarding the signal strength of ions in the detection unit; Among the standard analysis conditions acquired in the standard analysis condition acquisition step, at least one analysis condition of the ion amount setting item, the mass-to-charge ratio range setting item, and the signal intensity setting item is changed.
  • the method for structural analysis of a sample molecule includes: Changing the analysis conditions of the ion amount setting item so that the changed analysis conditions increase the amount of ions generated in the ion source than when the molecular weight related ion measurement of the sample is performed under the standard analysis conditions. Or, have the analysis conditions of the mass-to-charge ratio range setting item been changed so that ions with a lower mass than the mass-to-charge ratio of ions related to the molecular weight of the sample molecule are captured preferentially? Alternatively, the analysis conditions of the signal intensity setting items may be changed so that the signal intensity of the ions in the detection section is increased.
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with high sensitivity.
  • the method for structural analysis of a sample molecule according to any one of paragraphs 1 to 4 includes: The changed analysis conditions change the analysis conditions of the ion amount setting item so that the amount of ions generated in the ion source increases, and the analysis of the signal intensity setting item so that the signal intensity of ions at the detection section increases.
  • the conditions may be changed.
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with higher sensitivity.
  • the method for structural analysis of a sample molecule according to any one of paragraphs 1 to 5 includes:
  • the ion amount setting item is a laser intensity irradiated with the ion source,
  • the changed analysis conditions may be one in which the laser intensity is changed to a value greater than the standard analysis conditions.
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with higher sensitivity.
  • the method for structural analysis of a sample molecule according to any one of paragraphs 1 to 6 includes:
  • the mass-to-charge ratio range setting item is the time from when the ion source irradiates the laser to when a trapping voltage for trapping ions is applied to the ion trapping section,
  • the modified analysis conditions may be one in which the time is changed to a shorter value than the standard analysis conditions.
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with higher sensitivity.
  • the method for structural analysis of sample molecules described in Section 7 includes:
  • the modified analysis conditions may be such that the time is set to a value 1 to 3 ⁇ sec shorter than the standard analysis conditions.
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with higher sensitivity.
  • the method for structural analysis of a sample molecule according to any one of paragraphs 1 to 8 includes:
  • the detection unit includes a conversion dynode and a detector,
  • the signal strength setting item is a voltage applied to the conversion dynode and a voltage applied to the detector,
  • the modified analysis conditions may be one in which at least one of the voltage applied to the conversion dynode and the voltage applied to the detector is changed to a value greater than the standard analysis conditions.
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with higher sensitivity.
  • the method for structural analysis of a sample molecule according to any one of paragraphs 1 to 9 includes: The product ion measurement is performed by adjusting the predetermined mass-to-charge ratio so that the maximum value of the predetermined mass-to-charge ratio of ions captured by the ion trapping section is smaller than the value of the mass-to-charge ratio of ions related to the molecular weight of the sample molecule. This may be done by setting a range of
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with higher sensitivity.
  • the method for structural analysis of sample molecules described in Section 10 includes: The range of the predetermined mass-to-charge ratio may be set by setting the frequency of the trapping voltage in the ion trapping section.
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with higher sensitivity.
  • the method for structural analysis of sample molecules described in Section 10 includes:
  • the mass spectrometer is a digital ion trap type mass spectrometer,
  • the range of the predetermined mass-to-charge ratio may be set by setting a duty ratio of the trapping voltage in the ion trapping section.
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with higher sensitivity.
  • the method for structural analysis of a sample molecule includes:
  • the mass spectrometer includes a sample stage for placing a sample plate on which the sample is placed,
  • the standard analysis condition acquisition step further acquires standard analysis conditions of a voltage applied to the sample stage when performing the molecular weight related ion measurement,
  • the product ion measurement may be performed under conditions in which the voltage applied to the sample stage is changed to a value greater than the standard analysis conditions.
  • fragment ions on the low mass-to-charge ratio side can be detected with higher sensitivity.
  • the method for structural analysis of a sample molecule includes:
  • the mass spectrometer is a digital ion trap type mass spectrometer,
  • the product ion measurement data acquisition step further includes such a step that the maximum value of the predetermined mass-to-charge ratio of ions captured by the ion trapping section is smaller than the value of the mass-to-charge ratio of ions related to the molecular weight of the sample molecule.
  • the product by changing at least one of the frequency of the trapping voltage and the duty ratio of the trapping voltage in the ion trapping section, or without changing at least one of the frequency of the trapping voltage and the duty ratio of the trapping voltage.
  • the first fragment peak extraction step includes mass spectrum data obtained by performing the product ion measurement while changing at least one of the frequency of the capture voltage and the duty ratio of the capture voltage in the product ion measurement data acquisition step; extracting peaks corresponding to the plurality of first fragment ions in both mass spectrum data obtained by performing the product ion measurement without changing at least one of the frequency of the trapping voltage and the duty ratio of the trapping voltage;
  • the data analysis step may include determining at least a portion of the structure of the sample molecule based on the mass information of the peak extracted in the first fragment peak extraction step. Thereby, the structure of the sample molecule can be analyzed more reliably.
  • the method for structural analysis of a sample molecule according to any one of paragraphs 1 to 14 includes:
  • the sample molecule may be a nucleic acid or a nucleic acid-related substance.
  • the method for structural analysis of sample molecules described in Section 2 is as follows:
  • the sample molecule may be a nucleic acid or a nucleic acid-related substance, and part of the structure of the sample molecule may be the structure of a terminal portion of the nucleic acid or nucleic acid-related substance.
  • the method for structural analysis of sample molecules described in Section 3 is as follows:
  • the sample molecule may be a nucleic acid or a nucleic acid-related substance, and part of the structure of the sample molecule may be the structure of a terminal portion of the nucleic acid or nucleic acid-related substance.
  • Ion source 2 Inon source 2
  • Ion trap 3 Detection unit 11
  • Laser irradiation unit 12 Sample stage 21
  • Ring electrodes 22, 23 External electrode 31
  • Conversion dynode 32 Detector (secondary electron multiplier)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本発明の試料分子の構造解析方法は、ＭＡＬＤＩ法によるイオン源、前記イオン源で生成されたイオンの中から所定の質量電荷比のイオンを捕捉するためのイオン捕捉部、及び前記イオン捕捉部で捕捉されたイオンを検出するための検出部を備えた質量分析装置を用いて試料分子の構造を解析する方法であって、分子量関連イオン測定を行う際の、イオン量設定項目、質量電荷比範囲設定項目、及び信号強度設定項目の標準的な分析条件を取得する工程と、前記標準的な分析条件のうち前記イオン量設定項目、前記質量電荷比範囲設定項目、前記信号強度設定項目の少なくとも一つの分析条件を変更した変更分析条件でプロダクトイオン測定を行い、該プロダクトイオン測定のマススペクトルデータを取得する工程と、前記マススペクトルデータからフラグメントイオンに対応するピークを抽出する工程と、抽出されたピークの質量情報に基づいて前記試料分子の構造の少なくとも一部を決定する工程を有する。これにより、構造解析に必要なフラグメントイオンを感度良く優先的に検出することができる。

Description

試料分子の構造解析方法
　本発明は、質量分析を利用した試料分子の構造解析方法に関する。
　マトリックス支援レーザ脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization：ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源を有する質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）では、試料とマトリックスと呼ばれるイオン化補助剤とを混合して調製した分析用試料にレーザ光を短時間照射することで該分析用試料中の試料分子をイオン化し、生成されたイオンを質量分離器に導入してその質量電荷比（ｍ／ｚ）に応じて分離し検出する。
　ＭＡＬＤＩ法は一般に、難揮発性化合物をあまり分解せずにイオン化することが可能な、ソフトなイオン化法として知られている。そのため、ＭＡＬＤＩ－ＭＳは、核酸や核酸関連物質、ペプチド、タンパク質、糖鎖などの生体高分子の分子量情報を取得するのに広く利用されている。また、このような生体高分子の構造解析では、ＭＡＬＤＩイオン源において試料分子から生成された分子量関連イオン(プリカーサイオン）を適宜の方法で意図的に解離させ、それにより生成される多様なフラグメントイオンを質量分析することで、該フラグメントイオンの質量情報に基づいて試料分子の構造を推定することが行われている。
　例えば、非特許文献１～３に記載されている核酸の構造解析方法では、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳを用いてインソース分解（In-Source Decay：ＩＳＤ)により生成される核酸の各種フラグメントイオン（ＩＳＤフラグメント）の質量分析を行い、それにより得られる該フラグメントイオンの質量情報に基づいて核酸の塩基配列情報の解析を行っている。インソース分解とは、イオン化と同時に又はイオン化の直後にイオン源においてイオンを解離させる手法である。上述の通りＭＡＬＤＩ法はソフトなイオン化法であるため本来はイオンが解離しにくいが、例えば、レーザ光の強度を上げイオン化の際のエネルギーを高めたり、特殊なマトリックスを使用したりすることで、イオン化の際にイオンの解離が促進されることが知られている。核酸分子のＩＳＤにおいては、ホスホジエステル結合（又は、ホスホロチオエート結合など）部位の一箇所で特異的に切断されて生じたａ, ｂ, ｃ, d/ｗ, x, y, z－ｉｏｎｓなどのＩＳＤフラグメントが生じることが知られている。
Nathan A. Hagan, 他5名, "Enhanced In-Source Fragmentationin MALDI-TOF-MS of Oligonucleotides Using 1,5-Diaminonapthalene", Journal of the American Society for Mass Spectrometry, (米国), 2012, 23, pp.773-777 Hisao Shimizu, 他6名, "Application of high-resolution ESI and MALDI mass spectrometry to metabolite profiling of small interfering RNA duplex", Journal of Mass Spectrometry, (米国), 2012, 47, pp.1015?1022 Satoshi Kimura, 他1名, "Effect of oligonucleotide structural difference on matrix-assisted laser desorption/ionization in-source decay in comparison with collision-induced dissociation fragmentation", (米国), Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2020, 34, e8819 Scott A. McLuckey, 他2名, "Tandem mass spectrometry of small, multiply charged oligonucleotides", Journal of the American Society for Mass Spectrometry, （米国）, 1992, 3, pp. 60-70
　非特許文献１～３に記載されている方法では、質量分析装置にＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳを用いており、イオン源で生成されたイオンの多くを質量分離部に導入し、質量の小さいものから分離して検出する。そのため、ＩＳＤを行った場合、低質量域から高質量域までの広範囲においてフラグメントイオンが検出される。この場合、低質量域側のフラグメントイオンのピークがマトリックス由来のクラスタ－イオンなどのピークと重複したり、イオンサプレッション効果などにより検出が抑制されたりするという問題がある。加えて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳでは低質量域側のイオンが優先して検出されるため、高質量側のフラグメントイオンの感度が得られにくい課題が生じたりする場合がある。また、一回の測定の対象質量域が広いことから、特にプリカ－サイオンからのフラグメント効率が低い条件下では、フラグメントイオン全体の検出感度、分解能が低下しやすい課題がある。
　さらに、プリカーサイオンのｍ／ｚ値付近のフラグメントイオンのピークがフラグメントイオン以外のピーク（核酸の場合、塩基脱離ピークなど）と重複したり、フラグメンテーションの際にプリカーサイオンに過多のエネルギーが加わることからイオン分離しきれないフラグメントイオンが生じることで分解能が低くなったりするという問題がある。
　例えば、非特許文献３の図５にはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによる核酸のＩＳＤスペクトルが記載されているが、図５のＩＳＤスペクトルでは、３’末端あるいは５’末端付近の塩基配列部分で解離したプリカーサイオンのｍ/ｚ値付近のフラグメントイオンのピークが、フラグメントイオン以外のピークと重複し、また３’末端あるいは５’末端から離れた塩基配列部分で解離したフラグメントイオンのピーク（プリカーサイオンのｍ/ｚ値付近から低質量域側に離れたｍ/ｚ値で検出されたフラグメントイオンのピーク）に比べ、感度や分解能が低くなっている。
　本発明は、上記の課題に鑑みて成されたものであり、試料分子の構造解析に必要なフラグメントイオンを、低質量域から高質量域までの比較的広い質量域で、感度良く検出することができる構造解析方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために成された本発明に係る試料分子の構造解析方法は、
　マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源、前記イオン源で生成されたイオンの中から所定の質量電荷比のイオンを分離して捕捉するためのイオン捕捉部、及び前記イオン捕捉部で捕捉されたイオンを検出するための検出部、を備えたイオントラップ型質量分析装置を用いて試料分子の構造を解析する方法であって、
　前記質量分析装置を用いて試料に含まれる前記試料分子の分子量関連イオンを検出するための分子量関連イオン測定を行う際の、前記イオン源で生成されるイオン量に関するイオン量設定項目、前記イオン捕捉部において捕捉されるイオンの質量電荷比範囲に関する質量電荷比範囲設定項目、及び前記検出部におけるイオンの信号強度に関する信号強度設定項目の標準的な分析条件をそれぞれ取得する標準分析条件取得工程と、
　前記標準分析条件取得工程において取得された標準的な分析条件のうち前記イオン量設定項目、前記質量電荷比範囲設定項目、及び前記信号強度設定項目の少なくとも一つの分析条件を変更した変更分析条件で、前記試料分子の分子量関連イオンが解離して生じる複数の第１フラグメントイオンを検出するためのプロダクトイオン測定を行い、該プロダクトイオン測定のマススペクトルデータを取得するプロダクトイオン測定データ取得工程と、
　前記プロダクトイオン測定データ取得工程において取得されたマススペクトルデータから前記第１フラグメントイオンに対応するピークを抽出する第１フラグメントピーク抽出工程と、
　前記第１フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて前記試料分子の構造の少なくとも一部を決定するデータ解析工程と、
　を有するものである。
　上記課題を解決するために成された本発明の別の態様は、
　マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源、前記イオン源で生成されたイオンの中から所定の質量電荷比のイオンを分離して捕捉するためのイオン捕捉部、及び前記イオン捕捉部で捕捉されたイオンを検出するための検出部、を備えたイオントラップ型質量分析装置を用いて試料分子の構造を解析する方法であって、
　前記質量分析装置を用いて試料に含まれる前記試料分子の分子量関連イオンを検出するための分子量関連イオン測定を行う際の、前記イオン源で生成されるイオン量に関するイオン量設定項目、前記イオン捕捉部において捕捉されるイオンの質量電荷比範囲に関する質量電荷比範囲設定項目、及び前記検出部におけるイオンの信号強度に関する信号強度設定項目の標準的な分析条件をそれぞれ取得する標準分析条件取得工程と、
　前記標準分析条件取得工程において取得された標準的な分析条件のうち前記イオン量設定項目、前記質量電荷比範囲設定項目、及び前記信号強度設定項目の少なくとも一つの分析条件を変更した変更分析条件で、前記試料分子の分子量関連イオンが解離して生じる複数の第１フラグメントイオンを検出するためのプロダクトイオン測定を行うプロダクトイオン測定工程と、
　前記プロダクトイオン測定で検出される前記複数の第１フラグメントイオンのうちの少なくとも一つをプリカーサイオンとするＭＳ／ＭＳ測定を実行するための測定条件を設定するＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程と、
　前記ＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程において設定された測定条件に基づいて前記ＭＳ／ＭＳ測定を行うことにより、該ＭＳ／ＭＳ測定のマススペクトルデータを取得するＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程と、
　前記ＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程で取得されたマススペクトルデータから前記ＭＳ／ＭＳ測定で生じる第２フラグメントイオンに対応するピークを抽出する第２フラグメントピーク抽出工程と、
　前記第２フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて、前記試料分子の構造の一部を決定するデータ解析工程と、
　を有するものである。
　本発明において、分子量関連イオンは、分子量情報の獲得に直接役立つイオンの総称を示すものとし、具体的には、例えばプロトン付加分子（protonated molecule）、脱プロトン分子（deprotonated molecule）、ナトリウムイオン付加分子（sodium adduct molecule）などが含まれる。
　本発明によれば、試料分子の構造解析に必要なフラグメントイオンを、低質量域から高質量域までの比較的広い質量域で、感度良く検出することができる。その結果、試料分子の構造解析を行うのに十分な数のフラグメントイオンを検出することができる。特に生体高分子など比較的高質量分子を含む試料分子の分子構造について、配列情報などのより多くの構造情報を決定することができる。
　また、本発明の別の態様によれば、分子量関連イオン由来のフラグメントイオン（第１フラグメントイオン）をさらに解離させたフラグメントイオン（第２フラグメントイオン）を感度良く検出することができる。その結果、第１フラグメントイオンの質量情報だけでは精度良く解析できないような試料分子の分子構造部分について、より確実に構造情報を決定することができる。
本発明に係る構造解析方法を実施するために用いられる質量分析装置の一例を示す概略構成図。 本発明の一実施形態の構造解析方法の手順を示すフローチャート。 本発明の別の実施形態の構造解析方法の手順を示すフローチャート。 実施例１における、条件（ａ）～（ｅ）を用いた場合の標準核酸Ａのマススペクトルを示す図。 実施例１における、条件（ｅ）を用いた場合の標準核酸Ａのマススペクトル及び標準核酸Ａの配列解析状況を示す図。 実施例２における、条件（ｂ）～（ｄ）を用いた場合の標準核酸Ａのマススペクトルを示す図。 実施例２における、条件（ｄ）を用いた場合の標準核酸Ａのマススペクトル及び標準核酸Ａの配列解析状況を示す図。 実施例３における、条件（ｂ）、（ｃ）を用いた場合の標準核酸Ａのマススペクトル（ｍ／ｚ ２０００～６０００）を示す図。 実施例３における、条件（ｂ）、（ｃ）を用いた場合の標準核酸Ａのマススペクトル（ｍ／ｚ ３０００～５０００）を示す図。 実施例３における、条件（ｃ）を用いた場合の標準核酸Ａのマススペクトル及び標準核酸Ａの配列解析状況を示す図。 実施例３における、条件（ｂ）、（ｃ）を用いた場合の標準核酸Ａのマススペクトル及び標準核酸Ａの配列解析状況を示す図。 実施例４における、条件（ａ）、（ｂ）を用いた場合のミポメルセンのマススペクトル及びミポメルセンの配列解析状況を示す図。 実施例４における、ＭＳ／ＭＳ測定の測定条件を用いた場合のミポメルセンのマススペクトル及びミポメルセンの配列解析状況を示す図。
　本願発明者らは、上記課題に対して、ＭＡＬＤＩイオン源を有するイオントラップ型（Ion Trap：ＩＴ）質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＩＴＭＳ）を用い、イオンの解離が促進されることが確認されているＩＳＤ用のマトリックスを用いて試料分子の構造解析を行うことを試みた。なお、これまでＭＡＬＤＩ－ＩＴＭＳを用いてＩＳＤを試みた報告はほぼない。その結果、イオンの解離は生じるものの、それにより得られるフラグメントイオンはプリカーサイオンのｍ／ｚ値に近いものに制限されてしまうことが確認された。これは、プリカーサイオンと、プリカ－サイオンからより多くの解離が生じて得られる低質量電荷比側のフラグメントイオンとでは、ＭＡＬＤＩ－ＩＴＭＳの空間電荷効果によるイオンの捕捉条件が異なることが原因と考えられる。このような現象は、分析対象物が高質量分子である場合に特に顕著であった。
　本発明では、ＭＡＬＤＩ－ＩＴＭＳを用いた試料分子の構造解析方法において、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量域側のフラグメントイオンを感度良く、優先的に検出することができる方法を提供することを目的とする。
　以下、本発明に係る試料分子の構造解析方法の一実施形態について、図面を参照して説明する。図１は本実施形態に係る構造解析方法を実施するために用いられる質量分析装置の一例を示す概略構成図である。
＜質量分析装置＞
　本実施形態で用いる質量分析装置はイオントラップ型質量分析装置であり、分析対象物を含む試料をイオン化するイオン源１と、イオン源１で生成されたイオンのうち所定の質量電荷比のイオンを高周波電場の作用により一旦捕捉し、捕捉されたイオンを質量電荷比（ｍ／ｚ）に応じて分離するイオントラップ２（本発明におけるイオン捕捉部）と、分離されたイオンを検出する検出部３とを備える。
　イオン源１は、ＭＡＬＤＩ法を利用したイオン源であり、試料にレーザ光を照射するレーザ照射部１１と、試料が載せられたサンプルプレートＳを載置するためのサンプルステージ１２を含む。イオントラップ２は、円環状のリング電極２１と、該リング電極２１を挟んで対向配置された一対のエンドキャップ電極２２、２３と、を含む四重極型のイオントラップである。入口側エンドキャップ電極２２にはイオン入射孔２２ａが、出口側エンドキャップ電極２３にはイオン出射孔２３ａが形成されている。検出器３は、イオンを電子に変換するコンバージョンダイノード３１と、コンバージョンダイノード３１から到来する電子を増倍して検出する検出器（二次電子増倍管）３２を含む。
　イオントラップ２のリング電極２１及びエンドキャップ電極２２，２３には、それぞれ所定の電圧が印加される。それにより形成される高周波電場によって、リング電極２１及びエンドキャップ電極２２、２３で囲まれる内部空間にイオンを捕捉したり、イオンを該内部空間内からイオン出射孔２３ａを通して排出したりすることができる。
　イオン源１で試料にレーザ光を照射してから、イオントラップ２のリング電極２１にイオンを捕捉するための捕捉電圧を印加するまでの時間（以後、遅延時間とよぶ）を変更することにより、イオントラップに優先的に捕捉されるイオンの質量電荷比の範囲が制御される。遅延時間を長くするとより高質量側のイオンを、短くするとより低質量側のイオンを、他のイオンに比べ確実に捕捉することができる。
　リング電極２１及びエンドキャップ電極２２，２３に印加される所定の電圧は、正弦波状の高周波電圧でもよく、異なる２つの電圧を高速にスイッチングすることにより生じる矩形波電圧でもよい。矩形波電圧により発生する電場を利用するデジタルイオントラップでは、矩形波電圧の振幅（電圧値）を一定に維持したまま周波数を変えることにより、あるいは矩形波電圧のスイッチング間隔の比であるデューティ比を変えることにより、捕捉可能なイオンの質量電荷比の範囲が制御される。
　本実施形態におけるイオントラップ型質量分析装置は、イオントラップ自体の質量分離機能を利用して該イオントラップ内に捕捉したイオンを質量電荷比の小さい順に排出し、イオントラップの外部に配置した検出器でイオンを検出する質量分析装置のほか、イオントラップから一斉に排出されたイオンを例えば飛行時間型質量分離部などのイオントラップの外部に配置した質量分離部で質量電荷比に応じて分離し、同じくイオントラップの外部に配置した検出器で検出する質量分析装置も含むものとする。また、後述するＭＳ／ＭＳ測定ができるよう、二つの質量分離部が直列に接続された構成を有するタンデム型の質量分析装置であってもよい。
　次に、本実施形態の構造解析方法の手順について、図２のフローチャートを参照しつつ説明する。
＜構造解析方法＞
　ここでは、質量分析装置としてデジタルイオントラップを有するイオントラップ型質量分析装置を用いた例を説明する。
［ステップ１０１：ＭＳ測定を行う際の標準的な分析条件の取得］
　まず、分析対象物である試料分子の分子量関連イオン（プロトン付加分子［Ｍ＋Ｈ］＋、脱プロトン分子［Ｍ－Ｈ］－など）を検出するための測定（本願発明における分子量関連イオン測定に相当する。以後、ＭＳ測定とよぶ。）を行う際の、標準的な分析条件を取得する。ＭＳ測定は、分子量関連イオンをできるだけ高感度に高分解能で検出するための測定条件を用いるため、イオンの解離を伴わない（あるいはイオンの解離が起こるとしてもごく僅かである）測定である。質量分析装置には、分析対象物の種類や分析目的などに応じて適宜設定することができる各種設定項目があり、本実施形態に係る構造解析方法においては、イオン源１で生成されるイオン量に関するイオン量設定項目、イオントラップ２において捕捉されるイオンの質量電荷比範囲に関する質量電荷比範囲設定項目、及び検出部３におけるイオンの信号強度に関する信号強度設定項目について、標準的な分析条件をそれぞれ取得する。
　標準的な分析条件とは、試料分子の分子量関連イオンを検出可能な条件のうちの代表的な条件である。標準的な分析条件の取得方法としては、例えば、質量分析装置において予め設定された各種設定項目のデフォルト値を用いてＭＳ測定を行った結果、試料分子の分子量関連イオンが検出されれば、そのデフォルト値を標準的な分析条件としてもよい。その場合、デフォルト値が予め記憶された記憶部などから該デフォルト値を読み取ることが、標準的な分析条件を取得することに相当する。もしくは、デフォルト値に対して各種設定項目の設定値を、試料分子の分子量関連イオンがより高感度に高分解能に検出されるよう変更してＭＳ測定を行い、試料分子の分子量関連イオンが検出される値（しきい値、threshold値等）を求めてもよい。
　イオン量設定項目としてはレーザ照射部１１で照射するレーザ強度（レーザパワー）などであり、質量電荷比範囲設定項目としては遅延時間に対応するＲＦｄｅｌａｙ値などであり、信号強度設定項目としてはコンバージョンダイノード３１に印加する電圧や検出器（二次電子倍増管）３２に印加する電圧などである。
［ステップ１０２：標準的な分析条件を変更した変更分析条件の設定］
　次に、ステップ１０１で取得された標準的な分析条件のうち、イオン量設定項目、質量電荷比範囲設定項目、信号強度設定項目の少なくとも一つを変更した変更分析条件を設定する。すなわち、イオン量設定項目、質量電荷比範囲設定項目、信号強度設定項目のうちいずれか一つだけを変更し、残りの設定項目を変更しない場合があってもよい。このとき、標準的な分析条件でＭＳ測定を行った場合よりも、イオン量設定項目についてはイオン源１で発生するイオン量が増えるように変更し、質量電荷比範囲設定項目についてはイオントラップ２において低質量側のイオンが優先的に捕捉されるように変更し、信号強度設定項目については検出部３においてイオンの信号強度が大きくなるように変更する。
　具体的には、イオン量設定項目であるレーザ光の強度を変更する場合、標準的な分析条件に対して高く設定するのが好ましく、例えば標準的な分析条件の値より１～４０％ほど高く設定するのがより好ましく、１～３０％程高く設定するのがさらに好ましい。質量電荷比範囲設定項目であるＲＦｄｅｌａｙ値を変更する場合、標準的な分析条件に対し低く設定するのが好ましく、例えば標準的な分析条件の値より５～３０％低く設定するのがより好ましく、１０～２０％低く（遅延時間が１～３μ秒であるように）設定するのがさらに好ましい。信号強度設定項目であるコンバージョンダイノード３１への印加電圧を変更する場合、標準的な分析条件に対し高く設定するのが好ましく、例えば５～３０％程高く設定するのが好ましく、１０～３０％程高く設定するのがさらに好ましい。同じく信号強度設定項目である検出器（二次電子倍増管）３２への印加電圧を変更する場合、標準的な分析条件に対し高く設定するのが好ましく、例えば５～５０％程高く設定するのが好ましく、１０～５０％程高く設定するのがさらに好ましい。
［ステップ１０３：変更分析条件を用いたＩＳＤ測定によるデータの取得］
　上記変更分析条件を用いて、試料分子の分子量関連イオン（プリカーサイオン）が解離して生じたフラグメントイオンを検出するための測定（本願のプロダクトイオン測定に相当する）を行い、検出されたイオンに関するデータを取得する。本発明においては、試料分子由来のフラグメントイオンの発生機構が未だ証明されていないことから、本明細書では、ＭＡＬＤＩイオントラップ型質量分析装置のイオン源でイオン化と同時に又はイオン化の直後に生じる解離、及びその後の装置内で生じるイオンの解離全般をインソース分解（ＩＳＤ）と呼ぶことにし、ＩＳＤを伴う上記測定（プロダクトイオン測定）をＩＳＤ測定と呼ぶことにする。また、以下では、上記測定で生じるフラグメントイオンを第１フラグメントイオン又はＩＳＤフラグメントと呼ぶ。上記変更分析条件を用いたＩＳＤ測定によれば、特に分子量関連イオンのｍ／ｚ値から離れた低質量域側の第１フラグメントイオンを感度良く検出することができる。
　ステップ１０３では、さらに、イオントラップ２で捕捉されるイオンの所定の質量電荷比の最大値が、試料分子の分子量関連イオンの質量電荷比の値よりも小さくなるよう該所定の質量電荷比の範囲を設定した条件を用いてＩＳＤ測定を行ってもよい。このとき、イオントラップ２で捕捉されるイオンの所定の質量電荷比の最大値が試料分子の分子量関連イオンの質量電荷比の値よりも例えば０.５～４０％ほど小さくなるよう設定するのが好ましく、０．５～２０％ほど小さく設定するのがより好ましい。
　所定の質量電荷比の範囲を変更する方法としては、例えば、分子量６０００程度の分析対象物に対し、予め装置に組み込まれている測定モードを、対象質量域がｍ／ｚ ２０００～１８０００である測定モードからｍ／ｚ ６５０～５０００である測定モードに切り替えることにより、分子量６０００を対象として含まない測定モードに切り替える、などの方法がある。測定モードの対象質量域は、イオントラップ２に印加する高周波電圧の周波数に応じて決定される。具体的には、イオントラップに捕捉されるイオン量は制限されるため、主に、高周波電圧の周波数を調整し、低質量側のカットオフ値（Low Mass Cut-Off: LMCO）を設定することで、測定対象となる質量範囲が決まる。高周波電圧の周波数を大きくすると、LMCOが小さく設定され、測定対象となる質量域は低質量側に設定され、一方、高周波電圧の周波数を小さくすると、LMCOが大きく設定され、測定対象となる質量域は高質量側に設定される。すなわち、イオントラップ２に印加する高周波電圧の周波数を変化させることにより、所定の質量電荷比の範囲が変更される。
　また、所定の質量電荷比の範囲を変更する他の方法として、分子量６０００程度の分析対象物に対し、予め装置に組み込まれている矩形波電圧のスイッチング間隔の比であるデューティ比の設定項目の値を、例えば具体的に標準値５０：５０から５２：４８の値に変更することにより、ｍ／ｚ　５５００以上のイオンを排除する、などの方法がある。そうすることで、プリカーサイオンのｍ／ｚ値に近い質量電荷比を有する第１フラグメントイオンが排除されたマススペクトルデータが得られる。結果として、プリカーサイオンのｍ／ｚ値から離れた低質量域の第１フラグメントイオンの検出感度が向上する。
　ステップ１０３では、上記のように所定の質量電荷比の範囲を設定した条件を用いた場合と、用いない場合の両方でＩＳＤ測定を行うことにより、それぞれの測定で得られるマススペクトルデータを取得するようにしてもよい。これにより、低質量域から高質量域にわたって試料分子由来の第１フラグメントイオンを検出することができる。
　また、イオントラップ２で捕捉されるイオンの所定の質量電荷比の最大値が、分析対象物の分子量関連イオンの質量電荷比の値よりも小さくなるよう該所定の質量電荷比の範囲を設定した条件を用いることに加え、さらにイオン源１のサンプルステージ１２への印加電圧についてステップ１０２で標準的な分析条件を取得し、該分析条件よりもサンプルステージ１２への印加電圧を大きい値に変更した条件を用いて、ＩＳＤ測定を行ってもよい。サンプルステージへの印加電圧は、標準的な分析条件に対し４～８倍ほど高く設定するのが好ましく、４～５倍ほど高く設定するのがより好ましい。
［ステップ１０４：ＩＳＤスペクトルの作成］
　ステップ１０３のＩＳＤ測定により得られたデータに基づきマススペクトル（ＩＳＤスペクトル）を作成する。本発明におけるマススペクトルデータは、該マススペクトルにおける各ピークの質量電荷比及びその信号強度の情報を含み、ステップ１０４でＩＳＤ測定のマススペクトルデータ（ＩＳＤスペクトルデータ）が取得される。
［ステップ１０５：マススペクトルデータの解析］
　ステップ１０４で取得されたＩＳＤスペクトルデータから、各種第１フラグメントイオンに対応するピークを抽出し、該ピークが示す質量情報に基づいて各種第１フラグメントイオンの帰属を決定し、それらの結果を合わせて元の試料分子の構造の少なくとも一部を決定する。構造の決定は、配列解析や、配列解析により化学修飾の種類又は該化学修飾が施された部位を特定することを含む。構造の決定には、データベース検索やデノボシーケンシング（De Novo Sequencing)を利用してもよい。
　ステップ１０３で所定の質量電荷比の範囲を設定した条件を用いた場合と用いない場合の両方においてＩＳＤ測定を行い、ステップ１０４で両方のＩＳＤ測定のマススペクトルデータを取得した場合、それら両方から得られた各種第１フラグメントイオンの帰属結果を組み合わせて解析を行ってもよい。そうすることで、より確実に分析対象物の構造解析を行うことができる。
＜分析対象物＞
　本発明における分析対象物は、例えば、生体高分子など比較的高質量分子を含む試料分子である。生体高分子としては、例えば、核酸、ペプチド、糖鎖、タンパク質、脂質などが挙げられる。
　ここでいう核酸には、修飾核酸、核酸誘導体、核酸医薬品などの核酸関連物質も含まれる。以下、核酸、核酸関連物質を合わせて、単に核酸とよぶ。分析対象物が核酸である場合、核酸の重合度（塩基長）は特に限定されないが、数～数十個程度のヌクレオチドが重合したオリゴヌクレオチドであることが好ましい。本発明に係る分析方法では、分子量が大きい核酸の分析感度が特に向上することから、分子量が３０００以上、中でも分子量が６０００以上の核酸であることがより好ましい。また、核酸は、生物から得られる天然物又はそれらの加工物であってもよく、化学的に合成された人工合成核酸であってもよい。
＜分析用試料の調製方法＞
　ここでは一例として、分析対象物は核酸であるものとする。分析用試料は、核酸を含む試料及びマトリックス物質を混合した混合溶液をサンプルプレート上に滴下し、乾燥させて調製する。このとき、混合溶液を予め調製し、該混合溶液をサンプルプレート上に滴下して乾燥させてもよく、該混合溶液をサンプルプレート上で調製してそのまま乾燥させてもよい。
　マトリックス物質としては、核酸の種類に応じた適宜の物質を選択することができる。例えば、3-ヒドロキシピコリン酸（3-hydroxypicolinic acid；３－ＨＰＡ）、2,4-ジヒドロキシアセトフェノン（2,4-dihydroxyacetophenone：２，４－ＤＨＡＰ）、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（2,5-dihydroxybenzoic acid ：ＤＨＢ）、2',4',6'-トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（2',4',6'-trihydroxyacetophenone monohydrate：ＴＨＡＰ）、6-アザ-2-チオチミン（6-aza-2-thiothymine：ＡＴＴ）、3-アミノピラジン-2-カルボン酸（3-aminopyrazine-2-carboxylic acid：ＡＰＣＡ）、アントラニル酸（anthranilic acid：ＡＡ）、及びニコチン酸（nicotinic acid：ＮＡ）などが挙げられる。中でも、２，４－ＤＨＡＰ及びＴＨＡＰが好ましい。また、２種以上のマトリックス物質を混合した混合マトリックスを用いてもよく、中でも、３－ＨＰＡと２，４－ＤＨＡＰ、３－ＨＰＡとＴＨＡＰ、２，４－ＤＨＡＰとＴＨＡＰをそれぞれ混合した混合マトリックスが好ましい。
　分析用試料には、さらに、マトリックス添加剤を含んでも良い。マトリックス添加剤としては、クエン酸水素二アンモニウム（ammonium citrate dibasic：ＡＣＤ）を用いることができる。クエン酸のアンモニウム塩は、クエン酸イオンと結合するアンモニウムイオンの数に応じていくつかの種類が存在するが、本実施形態で好適に用いられるのは、１つのクエン酸イオンに対して２つのアンモニウムイオンが結合した塩である。
　分析用試料にマトリックス添加剤が含まれる場合、核酸を含む試料、マトリックス物質、マトリックス添加剤を混合する順序は特に限定されないが、マトリックス物質とマトリックス添加剤を含むマトリックス・添加剤混合溶液を予め調製し、核酸を含む試料溶液と該マトリックス・添加剤混合溶液を混合して分析用試料を調製するのが好ましい。この場合、試料溶液とマトリックス・添加剤混合溶液を予め混合した混合溶液をサンプルプレートに滴下し、乾燥させることで分析用試料を調製してもよく、試料溶液、及びマトリックス・添加剤混合溶液をサンプルプレート上にそれぞれ滴下して、これらをサンプルプレート上で混合して乾燥させることで分析用試料を調製してもよい。マトリックス・添加剤混合溶液を予め調製することにより、分析用試料の調製が容易になる。マトリックス・添加剤混合溶液中のマトリックス添加剤の濃度は、核酸の分子量関連イオンを十分な量生成させる観点から、１０～１００ｍＭが好ましく、３０～７０ｍＭがより好ましい。
　次に、本発明に係る試料分子の構造解析方法の別の実施形態について、図面を参照して説明する。図３は、本実施形態の構造解析方法の手順を示すフローチャートである。
［ステップ２０１：ＭＳ測定を行う際の標準的な分析条件の取得］
［ステップ２０２：標準的な分析条件を変更した変更分析条件の設定］
［ステップ２０３：変更分析条件を用いたＩＳＤ測定によるデータの取得］
［ステップ２０４：ＩＳＤスペクトルの作成］
　上述したステップ１０１～１０４と同様の方法により、ＭＳ測定を行う際の標準的な分析条件を取得し（ステップ２０１）、該標準的な分析条件を変更した変更条件を設定し（ステップ２０２）、該変更条件を用いたＩＳＤ測定によるデータを取得し（ステップ２０３）、該データに基づきＩＳＤスペクトルを作成し、ＩＳＤスペクトルデータを取得する（ステップ２０４）。
［ステップ２０５：ＭＳ／ＭＳ測定の測定条件の設定］
　ステップ２０４で取得されたＩＳＤスペクトルデータに基づき、ステップ２０３のＩＳＤ測定で検出された複数の第１フラグメントイオンのうちの少なくとも一つをプリカーサイオンとして選出し、該プリカーサイオンのＭＳ／ＭＳ測定を実行するための測定条件を設定する。ＭＳ／ＭＳ測定とは、一般的には、前段の質量分離部において、試料分子から生成されたイオンの中から特定の質量電荷比を有するイオンをプリカーサイオンとして選別し、続く衝突室で衝突誘起解離（Collision Induced Dissociation：ＣＩＤ）により該プリカーサイオンを解離させて各種フラグメントイオン（プロダクトイオン）を生成させ、後段の質量分離部で該フラグメントイオン（プロダクトイオン）を分離する測定手法として、知られている。本実施形態で用いるイオントラップ型質量分析装置におけるＭＳ／ＭＳ測定では、特定の質量範囲の（特定の質量電荷比を有する）イオンのみをイオントラップ２内部に残すことで、これらのイオンをプリカーサイオンとして選別し、続いてイオントラップ２内に導入されたアルゴンなどのガスとのＣＩＤによりプリカ－サイオンを解離させて各種フラグメントイオンを含むプロダクトイオンを生成し、その後マススキャンを行うことで質量電荷比の小さい順にイオンを排出する。
　プリカーサイオンとしては、ステップ２０４で取得されたＩＳＤスペクトルデータにおいて、比較的感度高く検出され、できるだけ他のピークと重複していない第１フラグメントイオンを選出するのがよい。このような第１フラグメントイオンをプリカーサイオンとすれば、後のＭＳ／ＭＳ測定で生じる複数のフラグメントイオン（以下、ＭＳ／ＭＳ測定で生じるフラグメントイオンを第２フラグメントイオンとも呼ぶ。）が感度良く検出される。また、プリカーサイオンとして分子量関連イオンのｍ／ｚ値から離れた低質量域にある第１フラグメントイオンを選出するのがよい。このような第１フラグメントイオンをプリカーサイオンとすれば、ＭＳ／ＭＳ測定により得られるマススペクトルが複雑にならず、データ解析が容易になる。プリカーサイオンとして選出される第１フラグメントのｍ／ｚ値は、ｍ／ｚ ５０００以下が好ましく、ｍ/ｚ ３０００以下がより好ましく、ｍ／ｚ ２０００以下がさらに好ましい。
［ステップ２０６：ＭＳ／ＭＳ測定によるデータの取得］
　ステップ２０５で設定された測定条件に基づいてＭＳ／ＭＳ測定を行い、検出されたピークに関するデータを取得する。
［ステップ２０７：ＭＳ／ＭＳスペクトルの作成］
　ステップ２０６で得られたデータに基づきマススペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を作成し、ＭＳ／ＭＳ測定のマススペクトルデータ（ＭＳ／ＭＳスペクトルデータ）を取得する。
［ステップ２０８：マススペクトルデータの解析］
　ステップ１０５と同様に、ステップ２０４で取得されたＩＳＤスペクトルデータから各種第１フラグメントイオンに対応するピークを抽出し、該ピークが示す質量情報に基づいて各種第１フラグメントイオンの帰属を決定し、それらの結果を合わせて元の試料分子の構造の少なくとも一部を決定する。さらに、ステップ２０７で取得されたＭＳ／ＭＳスペクトルデータから各種第２フラグメントイオンに対応するピークを抽出し、該ピークが示す質量情報に基づいて各種第２フラグメントイオンの帰属を決定し、それらの結果を合わせて元の試料分子の構造の一部を決定する。ＩＳＤ測定のピーク帰属結果とＭＳ／ＭＳ測定のピーク帰属結果を合わせることにより、試料分子の構造に関する情報をより多く得ることができ、構造解析の精度が向上する。ＭＳ／ＭＳ測定のピーク帰属結果からは、ＩＳＤ測定のみではＩＳＤフラグメントの感度が低下しやすく構造情報が得られにくい、試料分子の末端構造の情報が、より得られやすくなる。特に、試料分子が核酸である場合、ＭＳ／ＭＳ測定のピーク帰属結果から、核酸の３’末端又は５’末端付近の構造（塩基配列、修飾情報など）を決定することができる。
　本実施形態では、ステップ２０８において、ステップ２０４で取得されたＩＳＤスペクトルデータ及びステップ２０７で取得されたＭＳ／ＭＳスペクトルデータを基に第１フラグメントイオン及び第２フラグメントイオンの帰属をそれぞれ決定したが、ステップ２０７で取得されたＭＳ／ＭＳスペクトルデータを基に第２フラグメントイオンの帰属を決定するだけでもよい。その場合、ステップ２０３でＩＳＤ測定により生成される第１フラグメントイオンが検出され、該第１フラグメントイオンのｍ／ｚ値を得ることができれば、ステップ２０４（ＩＳＤスペクトルの作成、ＩＳＤスペクトルデータの取得）は行われなくてもよく、ステップ２０８では、各種第２フラグメントイオンの帰属結果を合わせて元の試料分子の構造の一部のみを決定する。
　以下、本発明に係る構造解析方法を実施例によって説明するが、これは単なる例示であって、本発明はこれに限定されるものではない。
＜１．試料溶液の調製＞
　試料溶液として、標準核酸Ａ（５’－ＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＡＧＴＧＴＧＴＣＴ－３’：　ＭＷ　６２０１．１、ＤＮＡ、配列番号１、合成依頼品）の１０ｐｍｏｌ／μＬの水溶液を作製した。
＜２．マトリックス溶液の調製＞
　マトリックス溶液として、７０ｍＭの濃度のクエン酸水素二アンモニウム（ＡＣＤ）をマトリックス添加剤として含む、2,4-ジヒドロキシアセトフェノン（２，４－ＤＨＡＰ）の４０ｍｇ／ｍＬ５０％アセトニトリル（acetonitrile：ＡＣＮ）水溶液を作製した。
＜３．分析用試料の調製＞
　１．で調製した試料溶液と２．で調製したマトリックス溶液を１：１（ｖ／ｖ）で混合し、得られた混合液１μＬをサンプルプレ－ト（ＳＵＳプレ－ト）上に滴下し、乾燥した。
＜４．質量分析＞
　質量分析には、ＭＡＬＤＩデジタルイオントラップ型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＤＩＴＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名：ＭＡＬＤＩｍｉｎｉ－１）を用いた。３．で調製した分析用試料が載ったサンプルプレートをＭＡＬＤＩ－ＤＩＴＭＳに挿入し、ポジティブモードでラスタ－機能を用いてＭＳ測定及びＩＳＤ測定を行った。
＜４－１．ＭＳ測定＞
　ＭＳ測定を行う際の条件（質量分析装置の各種設定値）として、以下の表１の値を用いた。測定モードは、測定対象となるイオンの質量電荷比の範囲を示すものであり、より具体的にはイオントラップに捕捉されるイオンの質量電荷比の範囲を規定するものであり、その範囲を括弧内に示す。以下の表においても同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜４－２．ＩＳＤ測定＞
　ＩＳＤ測定を行う際の条件（質量分析装置の各種設定値）として、以下の表２の値を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜５．構造解析＞
　得られたフラグメントイオンのマススペクトルデータから、標準核酸Ａの塩基配列を解析した。
＜結果＞
　図４に、各条件でのＭＳ測定及びＩＳＤ測定により得られた標準核酸Ａのマススペクトル（上から順番に、条件（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）を用いた場合のマススペクトル）を示す。各条件のマススペクトルのうち、左側は測定した質量電荷比の全体（ｍ／ｚ ３３００～６３００）を表すものであり、右側はその一部（ｍ／ｚ ４４００～５２００）を拡大したものである。また、図中の矢印は、分子量関連イオン（[Ｍ＋Ｈ]＋、プリカーサイオン）の検出状況を示している。図中の数値は、各マススペクトル中の最も強度の高いイオンのピーク強度（ｍＶ）を示す。 
　図４より、条件（ａ）のｍ／ｚ ３３００～６３００のマススペクトルにおいて、標準核酸Ａのプロトン化分子[Ｍ＋Ｈ]＋が高感度に検出されることを確認した。同時に、条件（ａ）では、塩基脱離イオンを含むフラグメントイオンのピークがいくつか検出されているが、フラグメントイオンの数は少なく検出感度も低かった（図４（ａ））。
　これに対して、検出器電圧、コンバージョンダイノード電圧、ＲＦｄｅｌａｙ値、レーザパワーを少しずつ変更した条件（ｂ）～（ｅ）では、フラグメントイオンピークの検出感度が向上し、検出されるピークの数が増えることが確認された（図４（ｂ）～（ｅ））。特に条件（ａ）を用いて測定を行った場合と条件（ｅ）を用いて測定を行った場合を比較すると、低質量電荷比側に検出されるフラグメントイオンピークの感度が向上し、検出されるピークの数が大幅に増えていた。
　図５に、条件（ｅ）で得られたフラグメントイオンのＩＳＤスペクトル及び核酸の塩基配列解析状況を示す。図５より、標準核酸Ａのほとんどの配列（中央付近の配列を除く、全体の９割の配列）を決定することができた。
　上記結果は、レーザパワーを通常のＭＳ測定時の値より高い値に変更することでイオン源において生成されるイオン量が増え、検出器電圧及びコンバージョンダイノード電圧を通常のＭＳ測定時の値より高い値に変更することで個々のイオン信号が増幅されたことによるものと考えられる。また、ＲＦｄｅｌａｙ値を通常のＭＳ測定時の値より低めの値に変更することで、プリカーサイオンより低質量電荷比側のフラグメントイオンが優先的に捕捉され、結果としてフラグメントイオンの検出感度を向上することができたと考えられる。以上より、ＭＡＬＤＩ－ＩＴＭＳを用いたＩＳＤ分析が可能となり、比較的高質量の標準核酸（ＭＷ　６２０１）に対しても、配列のほとんどを決定することができることが確認された。
　ＭＳ測定およびＩＳＤ測定の測定条件が異なる以外は、実施例１と同様の方法で質量分析及び構造解析を行った。
＜４－１．ＭＳ測定＞
　ＭＳ測定を行う際の条件（質量分析装置の各種設定値）として、以下の表３の値を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜４－２．ＩＳＤ測定＞
　ＩＳＤ測定を行う際の条件（質量分析装置の各種設定値）として、以下の表４の値を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜結果＞
　まず、条件（ａ）において、図示しないが、標準核酸Ａのプロトン化分子［Ｍ＋Ｈ］＋が高感度に検出されることが確認された。
　次に、図６に、各条件でのＩＳＤ測定により得られた標準核酸ＡのＩＳＤスペクトル（下から順番に、条件（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を用いた場合のＩＳＤスペクトル）を示す。条件（ａ）に対して、検出器電圧、コンバージョンダイノード電圧、ＲＦｄｅｌａｙ値、レーザパワーをそれぞれ変更した条件（ｂ）を用いて測定を行った場合、プリカーサイオンに近い高質量域側でフラグメントイオンが検出されやすかった（図６（ｂ））。一方、上記変更に加えさらに測定モードを変更してイオントラップに捕捉されるイオンの質量電荷比範囲の最大値をプリカーサイオンの質量電荷比より小さくした条件（ｃ）及び（ｄ）を用いて測定を行った場合では、プリカーサイオンから離れた低質量域側でもフラグメントイオンが検出された（図６（ｃ）および（ｄ））。特に、サンプルステージ電圧を条件（ａ）に対して高く設定した条件（ｄ）において、低質量域側のフラグメントイオンが数多く、比較的感度高く検出されることが確認された（図６（ｄ））。尚、条件（ｂ）～（ｄ）は、測定モードとサンプルステージ電圧の影響をよりわかりやすくするため、それ以外の分析条件を揃えた上で、比較評価を行った（表４）。
　図５に、表４の条件（ｂ）のうち、レーザパワーを６５に変更した場合の条件でＩＳＤ測定を行った場合（すなわち、表２の（ｅ）の条件）の標準核酸ＡのＩＳＤスペクトル及び標準核酸Ａの配列とその帰属状況を示す。少なくとも今回の実験では、表４の条件（ｂ）において、レーザパワーを７５にした場合（表４の条件（ｂ）、図６（ｂ））と６５にした場合（表２の条件（ｅ）、図５）で、得られるＩＳＤスペクトルはほとんど変わらなかった。そのため、図５を用いて、表４の条件（ｂ）のＩＳＤスペクトルの帰属状況を説明する。図５より、多数のフラグメントイオンを帰属することができ、塩基配列の９割程度を決定することができた。ただし、低質量域側のフラグメントイオンの感度が低いため、全配列を解析することはできなかった。
　図７に、条件（ｄ）でＩＳＤ測定を行った場合（図６（ｄ）の条件）の標準核酸ＡのＩＳＤスペクトルと、標準核酸Ａの配列及びその帰属状況を示す。図７では、図５では検出感度が低いためにピークを観測することができなかった低質量域側のフラグメントイオンを含む多数のフラグメントイオンが検出され、塩基配列の６割程度を決定することができた。ただし、標準核酸Ａのプリカーサイオン付近の高質量域側ではフラグメントイオンを検出することができなかったため、全配列を解析することはできなかった。
　最終的に、図５のマススペクトルデータから得られた解析結果及び図７のマススペクトルデータから得られた解析結果を組み合わせることで、比較的高質量（ＭＷ　６２０１）の標準核酸の全配列を解析することができた。
　ＭＳ測定およびＩＳＤ測定の測定条件が異なる以外は、実施例１と同様の方法で質量分析及び構造解析を行った。
＜４－１．ＭＳ測定＞
　ＭＳ測定を行う際の条件（質量分析装置の各種設定値）として、以下の表５の値を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜４－２．ＩＳＤ測定＞
　ＩＳＤ測定を行う際の条件（質量分析装置の各種設定値）として、以下の表６の値を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜結果＞
　まず、条件（ａ）において、図示しないが、標準核酸Ａのプロトン化分子［Ｍ＋Ｈ］＋が高感度に検出されることが確認された。
　次に、図８Ａ、８Ｂに、各条件でのＩＳＤ測定により得られた標準核酸ＡのＩＳＤスペクトル（下から順番に、条件（ｂ）、（ｃ）を用いた場合のＩＳＤスペクトル）を示す。各条件のＩＳＤスペクトルのうち、図８Ａは測定した質量電荷比の全体（ｍ／ｚ ２０００～６０００）を表すものであり、図８Ｂはその一部（ｍ／ｚ ３０００～５０００）を拡大したものである。
　条件（ａ）に対して、検出器電圧、コンバージョンダイノード電圧、ＲＦｄｅｌａｙ値、レーザパワーをそれぞれ変更した条件（ｂ）を用いて測定を行った場合、プリカ－サイオンに近い高質量域側でフラグメントイオンが検出されやすかった（図８Ａ（ｂ－２））。一方、上記変更に加えイオン捕捉部に印加する高周波電圧に関するデューティ比を変更して、イオントラップに捕捉されるイオンの質量電荷比範囲の最大値をプリカーサイオンの質量電荷比より小さくした設定した条件（ｃ）を用いて測定を行った場合では、プリカーサイオン付近のイオンが除かれ(図８Ａ（ｃ－２）)、プリカーサイオンのｍ／ｚ値から離れた低質量域側のフラグメントイオンが検出されやすくなった（図８Ａ（ｃ－２）、図８Ｂ（ｃ－１））。結果として、デューティ比の変更により、低質量域側のフラグメントイオンのピークがより高強度に検出された。
　図９に、条件（ｃ）でＩＳＤ測定を行った場合の標準核酸ＡのＩＳＤスペクトル及び標準核酸Ａの配列とその帰属状況を示す。図９より、ピーク強度の低いイオンも含めると、多数のフラグメントイオンを帰属することができ、全配列を解析することができた。但し、この条件ではプリカ－サイオン付近のフラグメントイオン強度は低かった。
　図１０に、条件（ｂ）及び（ｃ）でＩＳＤ測定を行った場合の標準核酸ＡのＩＳＤスペクトル（上段が条件（ｂ）、下段が条件（ｃ））と、標準核酸Ａの配列及びその帰属状況を示す。条件（ｃ）を用いた場合のマススペクトルでは、核酸の全配列を解析することができたが、プリカ－サイオン付近のイオンについてはピーク強度が低かった。一方、条件（ｂ）を用いた場合のマススペクトルでは、プリカーサ付近のフラグメントイオンが十分な強度で観測された。条件（ｂ）及び条件（ｃ）のマススペクトルデータから得られた解析結果を組み合わせることで、比較的高質量（ＭＷ　６２０１）の標準核酸の全配列をより確実に解析することができた。
＜１．試料溶液の調製＞
　試料溶液として、ミポメルセン（研究開発用の合成核酸の脱塩精製後の試料。ＤＮＡ：全長は２０塩基長、ＭＷ　７１７７）（5’-MG-MC-MC-MU-MC-dA-dG-dT-dC-dT-dG-dC-dT-dT-dC-MG-MC-MA-MC-MC-3’、Mは2'-O-(2-methoxyethyl)nucleoside、dは 2’-deoxynucleosideを示す。cytosineとuracilの5位の炭素はメチル基に置換され、全てのヌクレオチド間のホスホジエステル結合はホスホロチオエート結合に置換されている。：配列番号２）の２０ｐｍｏｌ／μＬの水溶液を作製した。
＜２．マトリックス溶液の調製＞
　４０ｍＭのＡＣＤをマトリックス添加剤として含む3-ヒドロキシピコリン酸（３－ＨＰＡ）の４０ｍｇ／ｍＬ５０％ＡＣＮ水溶液（３－ＨＰＡ溶液）と、７０ｍＭのＡＣＤをマトリックス添加剤として含む２，４－ＤＨＡＰの４０ｍｇ／ｍＬ５０％ＡＣＮ水溶液（２，４－ＤＨＡＰ溶液）を作製し、３－ＨＰＡ溶液と２，４－ＤＨＡＰ溶液を１：１（v/v）で混合した混合マトリックス（３－ＨＰＡ＋２，４－ＤＨＡＰ、１：１）溶液を作製した。
＜３．分析用試料の調製＞
　１．で調製した試料溶液と２．で調製した混合マトリックス溶液を１：１（v/v）で混合し、得られた混合液１μＬをサンプルプレ－ト（ＳＵＳプレ－ト）上に滴下し、乾燥した。
＜４．質量分析＞
＜４－１. ＩＳＤ測定＞
　３．のサンプルプレートをＭＡＬＤＩ－ＤＩＴＭＳ（株式会社島津製作所製、商品名：ＭＡＬＤＩｍｉｎｉ－１）に挿入し、ポジティブモードでラスタ－機能を用いてＩＳＤ測定を行った。ＩＳＤ測定を行う際の条件（質量分析装置の各種設定値）として、以下の表７の値を用いた。レーザパワーについては、各条件で最適な値を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜４－２．ＭＳ／ＭＳ測定＞
　４－１．のＩＳＤ測定により得られたＩＳＤスペクトルにおいて、比較的低質量側のＩＳＤフラグメント（今回は、ｗ５－ｉｏｎ）をプリカーサイオンとする測定条件を用い、ＭＳ／ＭＳ測定（low energy CID）を行った。
＜５．構造解析＞
　４－１．のＩＳＤ測定により得られたＩＳＤスペクトル及び４－２．のＭＳ／ＭＳ測定により得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの主なフラグメントイオンピークを帰属し、ミポメルセンの塩基配列を解析した。
＜結果＞
　図１１に、混合マトリックス３－ＨＰＡ＋２，４－ＤＨＡＰを用いて得られたミポメルセンのＩＳＤスペクトルと主なピークの帰属状況を示す。図１１（ａ）は表７の条件（ａ）を用いてＩＳＤ測定を行って得られたＩＳＤスペクトル、図１１（ｂ）は表７の条件（ｂ）を用いてＩＳＤ測定を行って得られたＩＳＤスペクトルであり、図１１（ｂ）のｘ２と記載されたバーで示す部分では、それ以外の部分に比べピーク強度を２倍に拡大している。また、図１１のＩＳＤスペクトルでは、対応するオリゴヌクレオチドのフラグメントイオン種の名称（非特許文献４で提唱された一般的名称）を各ピークに付している。この名称は、各イオン種を核酸の解離パターン命名規則に従ったフラグメントイオン系列で表したものであり、５’末端を含むフラグメントイオンは、ａｎ、ｂｎ、ｃｎ、ｄｎと表記され、反対方向の３’末端を含むフラグメントイオンは、ｘｍ、ｙｍ、ｚｍ、ｗｍと表記される。なお、添え字のｎとｍは、対応する末端から解離部位までの構成単位数（定義としては、塩基の数）を示す。また、フラグメントイオン種の名称中のＢは核酸の塩基を表し、例えば、図１１（ｂ）におけるａ１６－Ｂ（Ｇ）は、ａ１６イオンから塩基のグアニン（Ｇ）が脱離したイオンであることを示す。以下の図においても同様である。
　図１１（ｂ）の右端の枠で囲った箇所が分子量関連イオン[Ｍ＋Ｈ]＋（プリカーサイオン）のｍ／ｚ値付近のスペクトルを示す。この領域では、特にプリカーサイオンの塩基脱離ピークなどが感度高く検出され、該塩基脱離ピークなどとＩＳＤフラグメントピークが重複することにより、ＩＳＤフラグメントピークの検出が阻害されていることが確認された。
　図１２に、図１１のＩＳＤスペクトルで検出されたｗ５－ｉｏｎをプリカーサイオンとするＭＳ／ＭＳスペクトルと主なピーク帰属状況を示す。図１１のＩＳＤスペクトルおよびピーク帰属状況と比べ、図１２では末端配列情報を含む第２フラグメントイオンが十分な強度と分解能で複数種類生じ、より確実に末端配列の解析ができた。また、図１２のＭＳ／ＭＳスペクトルでは、図１１（ｂ）のＩＳＤスペクトルに見られるような塩基脱離ピークなどプリカーサイオン付近のプロダクトイオンピークと第２フラグメントイオンのピークの重複はみられなかった。
　全体として、図１１のＩＳＤスペクトルからできるだけ多くの塩基配列情報を得た後、分子量関連イオンのｍ／ｚ値から比較的離れた低質量域のＩＳＤフラグメントをプリカーサイオンとするＭＳ／ＭＳ測定を行うことにより、ＩＳＤ測定ではピーク検出が阻害されやすい分子量関連イオンのｍ／ｚ値付近のフラグメントイオンピークを明確に検出し、末端の塩基配列を解析することで、より信頼性の高い全塩基配列解析が可能となった。すなわち、ＩＳＤ測定とＭＳ／ＭＳ測定を組み合わせることで、より確実な塩基配列解析が可能となった。
　このようにＩＳＤ測定とＭＳ／ＭＳ測定を組み合わせて構造解析を行う手法は、基本的に、分析対象物を選ばず使用することができる。また、ＭＡＬＤＩ－ＭＳのＩＳＤ分析の課題である末端配列解析をより確実に行うことができるよう改良することができる。この手法は、特に、塩基脱離などの解裂が生じやすく不安定な核酸に対し、またフラグメンテーションを生じやすいＭＡＬＤＩ－ＩＴ－ＴＯＦＭＳを用いて測定する場合により効果的であると考えられる。
　［態様］
　上述した例示的な実施形態が以下の態様の具体例であることは、当業者には明らかである。
（第１項）
　本発明の一態様に係る試料分子の構造解析方法は、
　マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源、前記イオン源で生成されたイオンの中から所定の質量電荷比のイオンを分離して捕捉するためのイオン捕捉部、及び前記イオン捕捉部で捕捉されたイオンを検出するための検出部、を備えたイオントラップ型質量分析装置を用いて試料分子の構造を解析する方法であって、
　前記質量分析装置を用いて試料に含まれる前記試料分子の分子量関連イオンを検出するための分子量関連イオン測定を行う際の、前記イオン源で生成されるイオン量に関するイオン量設定項目、前記イオン捕捉部において捕捉されるイオンの質量電荷比範囲に関する質量電荷比範囲設定項目、及び前記検出部におけるイオンの信号強度に関する信号強度設定項目の標準的な分析条件をそれぞれ取得する標準分析条件取得工程と、
　前記標準分析条件取得工程において取得された標準的な分析条件のうち前記イオン量設定項目、前記質量電荷比範囲設定項目、及び前記信号強度設定項目の少なくとも一つの分析条件を変更した変更分析条件で、前記試料分子の分子量関連イオンが解離して生じる複数の第１フラグメントイオンを検出するためのプロダクトイオン測定を行い、該プロダクトイオン測定のマススペクトルデータを取得するプロダクトイオン測定データ取得工程と、
　前記プロダクトイオン測定データ取得工程において取得されたマススペクトルデータから前記第１フラグメントイオンに対応するピークを抽出する第１フラグメントピーク抽出工程と、
　前記第１フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて前記試料分子の構造の少なくとも一部を決定するデータ解析工程と、を有するものである。
　これにより、構造解析に必要なフラグメントイオンを、低質量域から高質量域までの比較的広い質量域で、感度良く検出することができる。
（第２項）
　第１項に記載の試料分子の構造解析方法において、
　前記質量分析装置がＭＳ／ＭＳ測定が可能な装置であり、
　さらに、
　前記プロダクトイオン測定で検出される前記複数の第１フラグメントイオンのうちの少なくとも一つをプリカーサイオンとするＭＳ／ＭＳ測定を実行するための測定条件を設定するＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程と、
　前記ＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程において設定された測定条件に基づいて前記ＭＳ／ＭＳ測定を行い、該ＭＳ／ＭＳ測定のマススペクトルデータを取得するＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程と、
　ＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程において取得されたマススペクトルデータから前記ＭＳ／ＭＳ測定で生じる第２フラグメントイオンに対応するピークを抽出する第２フラグメントピーク抽出工程と、
　を有し、
　前記データ解析工程において、前記第１フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報と、前記第２フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて、前記試料分子の構造の少なくとも一部を決定するものであってもよい。
　これにより、分子量関連イオン由来の第１フラグメントイオンだけでなく、該第１フラグメントイオンをさらに解離させた第２フラグメントイオンを感度良く検出することができる。その結果、第１フラグメントイオンの質量情報だけでは全体の分子構造を精度良く解析できないような試料分子について、第１フラグメントイオン及び第２フラグメントイオンの質量情報に基づいて、より確実に構造情報を決定することができる。
（第３項）
　本発明の別の態様に係る試料分子の構造解析方法は、
　マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源、前記イオン源で生成されたイオンの中から所定の質量電荷比のイオンを分離して捕捉するためのイオン捕捉部、及び前記イオン捕捉部で捕捉されたイオンを検出するための検出部、を備えたイオントラップ型質量分析装置を用いて試料分子の構造を解析する方法であって、
　前記質量分析装置を用いて試料に含まれる前記試料分子の分子量関連イオンを検出するための分子量関連イオン測定を行う際の、前記イオン源で生成されるイオン量に関するイオン量設定項目、前記イオン捕捉部において捕捉されるイオンの質量電荷比範囲に関する質量電荷比範囲設定項目、及び前記検出部におけるイオンの信号強度に関する信号強度設定項目の標準的な分析条件をそれぞれ取得する標準分析条件取得工程と、
　前記標準分析条件取得工程において取得された標準的な分析条件のうち前記イオン量設定項目、前記質量電荷比範囲設定項目、及び前記信号強度設定項目の少なくとも一つの分析条件を変更した変更分析条件で、前記試料分子の分子量関連イオンが解離して生じる複数の第１フラグメントイオンを検出するためのプロダクトイオン測定を行うプロダクトイオン測定工程と、
　前記プロダクトイオン測定で検出される前記複数の第１フラグメントイオンのうちの少なくとも一つをプリカーサイオンとするＭＳ／ＭＳ測定を実行するための測定条件を設定するＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程と、
　前記ＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程において設定された測定条件に基づいて前記ＭＳ／ＭＳ測定を行うことにより、該ＭＳ／ＭＳ測定のマススペクトルデータを取得するＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程と、
　前記ＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程で取得されたマススペクトルデータから前記ＭＳ／ＭＳ測定で生じる第２フラグメントイオンに対応するピークを抽出する第２フラグメントピーク抽出工程と、
　前記第２フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて、前記試料分子の構造の一部を決定するデータ解析工程と、
　を有する。
　これにより、分子量関連イオン由来の第１フラグメントイオンをさらに解離させた第２フラグメントイオンを感度良く検出することができる。その結果、第１フラグメントイオンの質量情報だけでは精度良く解析できないような試料分子の分子構造部分について、より確実に構造情報を決定することができる。
（第４項）
　第１～３項のいずれかに記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記変更分析条件が、前記標準的な分析条件で前記試料の前記分子量関連イオン測定を行ったときよりも、前記イオン源で発生するイオン量が増えるように前記イオン量設定項目の分析条件を変更したものであるか、前記試料分子の分子量関連イオンの質量電荷比よりも低質量側のイオンが優先的に捕捉されるように前記質量電荷比範囲設定項目の分析条件を変更したものであるか、あるいは前記検出部におけるイオンの信号強度が大きくなるように前記信号強度設定項目の分析条件を変更したものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンを感度良く検出することができる。
（第５項）
　第１～４項のいずれかに記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記変更分析条件が、前記イオン源で発生するイオン量が増えるように前記イオン量設定項目の分析条件を変更し、前記検出部におけるイオンの信号強度が大きくなるように前記信号強度設定項目の分析条件を変更したものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンをより感度良く検出することができる。
（第６項）
　第１項～第５項のいずれかに記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記イオン量設定項目が、前記イオン源で照射するレーザ強度であり、
　前記変更分析条件が、該レーザ強度を前記標準的な分析条件よりも大きい値に変更したものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンをより感度良く検出することができる。
（第７項）
　第１項～第６項のいずれかに記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記質量電荷比範囲設定項目が、前記イオン源でレーザを照射してから、前記イオン捕捉部にイオンを捕捉するための捕捉電圧を印加するまでの時間であり、
　前記変更分析条件が、該時間を前記標準的な分析条件よりも短い値に変更したものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンをより感度良く検出することができる。
（第８項）
　第７項に記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記変更分析条件が、前記時間を前記標準的な分析条件よりも１～３μ秒短い値に設定したものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンをさらに感度良く検出することができる。
（第９項）
　第１項～第８項のいずれかに記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記検出部がコンバージョンダイノード及び検出器を備え、
　前記信号強度設定項目が、該コンバージョンダイノードへの印加電圧及び該検出器への印加電圧であり、
　前記変更分析条件が、該コンバージョンダイノードへの印加電圧及び該検出器への印加電圧の少なくとも一方を前記標準的な分析条件よりも大きい値に変更したものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンをより感度良く検出することができる。
（第１０項）
　第１項～第９項のいずれかに記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記プロダクトイオン測定は、前記イオン捕捉部で捕捉されるイオンの前記所定の質量電荷比の最大値が前記試料分子の分子量関連イオンの質量電荷比の値よりも小さくなるよう前記所定の質量電荷比の範囲を設定して行われるものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンをより感度良く検出することができる。
（第１１項）
　第１０項に記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記イオン捕捉部における前記捕捉電圧の周波数を設定して前記所定の質量電荷比の範囲を設定するものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンをより感度良く検出することができる。
（第１２項）
　第１０項に記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記質量分析装置がデジタルイオントラップ型の質量分析装置であり、
　前記イオン捕捉部における前記捕捉電圧のデューティ比を設定して前記所定の質量電荷比の範囲を設定するものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンをより感度良く検出することができる。
（第１３項）
　第１０項～第１２項のいずれかに記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記質量分析装置が、前記試料が載せられたサンプルプレートを載置するためのサンプルステージを備え、
　前記標準分析条件取得工程が、さらに、前記分子量関連イオン測定を行う際の、前記サンプルステージへの印加電圧の標準的な分析条件を取得し、
　前記プロダクトイオン測定は、前記サンプルステージへの印加電圧を前記標準的な分析条件よりも大きい値に変更した条件で行われるものであってもよい。
　これにより、解析に必要なフラグメントイオンのうち、特に低質量電荷比側のフラグメントイオンをさらに感度良く検出することができる。
（第１４項）
　第１項、第２項、及び第４項～第１３項のいずれかに記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記質量分析装置がデジタルイオントラップ型の質量分析装置であり、
　前記プロダクトイオン測定データ取得工程が、さらに、前記イオン捕捉部で捕捉されるイオンにおける前記所定の質量電荷比の最大値が、前記試料分子の分子量関連イオンの質量電荷比の値よりも小さくなるよう、前記イオン捕捉部における前記捕捉電圧の周波数及び前記捕捉電圧のデューティ比の少なくとも一方を変更して、あるいは前記捕捉電圧の周波数及び前記捕捉電圧のデューティ比の少なくとも一方を変更せずに、前記プロダクトイオン測定を行い、前記プロダクトイオン測定のマススペクトルデータをそれぞれ取得し、
　前記第１フラグメントピーク抽出工程は、前記プロダクトイオン測定データ取得工程が、前記捕捉電圧の周波数及び前記捕捉電圧のデューティ比の少なくとも一方を変更して前記プロダクトイオン測定を行い取得したマススペクトルデータ、及び前記捕捉電圧の周波数及び前記捕捉電圧のデューティ比の少なくとも一方を変更せずに前記プロダクトイオン測定を行い取得したマススペクトルデータの両方において前記複数の第１フラグメントイオンに対応するピークを抽出し、
　前記データ解析工程は、前記第１フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて前記試料分子の構造の少なくとも一部を決定するものであってもよい。
　これにより、より確実に試料分子の構造を解析することができる。
（第１５項）
　第１項～第１４項のいずれかに記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記試料分子が核酸又は核酸関連物質であってもよい。
（第１６項）
　第２項に記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記試料分子が核酸又は核酸関連物質であり、前記試料分子の構造の一部が核酸又は核酸関連物質の末端部分の構造であってもよい。
（第１７項）
　第３項に記載の試料分子の構造解析方法は、
　前記試料分子が核酸又は核酸関連物質であり、前記試料分子の構造の一部が核酸又は核酸関連物質の末端部分の構造であってもよい。
１…イオン源
２…イオントラップ
３…検出部
１１…レーザ照射部
１２…サンプルステージ
２１…リング電極
２２，２３…エンドキャップ電極
３１…コンバージョンダイノード
３２…検出器（二次電子倍増管）

Claims (17)

  1. 　マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源、前記イオン源で生成されたイオンの中から所定の質量電荷比のイオンを分離して捕捉するためのイオン捕捉部、及び前記イオン捕捉部で捕捉されたイオンを検出するための検出部、を備えたイオントラップ型質量分析装置を用いて試料分子の構造を解析する方法であって、
    　前記質量分析装置を用いて試料に含まれる前記試料分子の分子量関連イオンを検出するための分子量関連イオン測定を行う際の、前記イオン源で生成されるイオン量に関するイオン量設定項目、前記イオン捕捉部において捕捉されるイオンの質量電荷比範囲に関する質量電荷比範囲設定項目、及び前記検出部におけるイオンの信号強度に関する信号強度設定項目の標準的な分析条件をそれぞれ取得する標準分析条件取得工程と、
    　前記標準分析条件取得工程において取得された標準的な分析条件のうち前記イオン量設定項目、前記質量電荷比範囲設定項目、及び前記信号強度設定項目の少なくとも一つの分析条件を変更した変更分析条件で、前記試料分子の分子量関連イオンが解離して生じる複数の第１フラグメントイオンを検出するためのプロダクトイオン測定を行い、該プロダクトイオン測定のマススペクトルデータを取得するプロダクトイオン測定データ取得工程と、
    　前記プロダクトイオン測定データ取得工程において取得されたマススペクトルデータから前記第１フラグメントイオンに対応するピークを抽出する第１フラグメントピーク抽出工程と、
    　前記第１フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて前記試料分子の構造の少なくとも一部を決定するデータ解析工程と、
    　を有する、試料分子の構造解析方法。
  2. 　請求項１に記載の試料分子の構造解析方法において、
    　前記質量分析装置がＭＳ／ＭＳ測定が可能な装置であり、
    　さらに、
    　前記プロダクトイオン測定で検出される前記複数の第１フラグメントイオンのうちの少なくとも一つをプリカーサイオンとするＭＳ／ＭＳ測定を実行するための測定条件を設定するＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程と、
    　前記ＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程において設定された測定条件に基づいて前記ＭＳ／ＭＳ測定を行い、該ＭＳ／ＭＳ測定のマススペクトルデータを取得するＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程と、
    　ＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程において取得されたマススペクトルデータから前記ＭＳ／ＭＳ測定で生じる第２フラグメントイオンに対応するピークを抽出する第２フラグメントピーク抽出工程と、
    　を有し、
    　前記データ解析工程において、前記第１フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報と、前記第２フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて、前記試料分子の構造の少なくとも一部を決定する、
    　試料分子の構造解析方法。
  3. 　マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源、前記イオン源で生成されたイオンの中から所定の質量電荷比のイオンを分離して捕捉するためのイオン捕捉部、及び前記イオン捕捉部で捕捉されたイオンを検出するための検出部、を備えたイオントラップ型質量分析装置を用いて試料分子の構造を解析する方法であって、
    　前記質量分析装置を用いて試料に含まれる前記試料分子の分子量関連イオンを検出するための分子量関連イオン測定を行う際の、前記イオン源で生成されるイオン量に関するイオン量設定項目、前記イオン捕捉部において捕捉されるイオンの質量電荷比範囲に関する質量電荷比範囲設定項目、及び前記検出部におけるイオンの信号強度に関する信号強度設定項目の標準的な分析条件をそれぞれ取得する標準分析条件取得工程と、
    　前記標準分析条件取得工程において取得された標準的な分析条件のうち前記イオン量設定項目、前記質量電荷比範囲設定項目、及び前記信号強度設定項目の少なくとも一つの分析条件を変更した変更分析条件で、前記試料分子の分子量関連イオンが解離して生じる複数の第１フラグメントイオンを検出するためのプロダクトイオン測定を行うプロダクトイオン測定工程と、
    　前記プロダクトイオン測定で検出される前記複数の第１フラグメントイオンのうちの少なくとも一つをプリカーサイオンとするＭＳ／ＭＳ測定を実行するための測定条件を設定するＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程と、
    　前記ＭＳ／ＭＳ測定条件設定工程において設定された測定条件に基づいて前記ＭＳ／ＭＳ測定を行うことにより、該ＭＳ／ＭＳ測定のマススペクトルデータを取得するＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程と、
    　前記ＭＳ／ＭＳ測定データ取得工程で取得されたマススペクトルデータから前記ＭＳ／ＭＳ測定で生じる第２フラグメントイオンに対応するピークを抽出する第２フラグメントピーク抽出工程と、
    　前記第２フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて、前記試料分子の構造の一部を決定するデータ解析工程と、
    　を有する、試料分子の構造解析方法。
  4. 　前記変更分析条件が、前記標準的な分析条件で前記試料の前記分子量関連イオン測定を行ったときよりも、前記イオン源で発生するイオン量が増えるように前記イオン量設定項目の分析条件を変更したものであるか、前記試料分子の分子量関連イオンの質量電荷比よりも低質量側のイオンが優先的に捕捉されるように前記質量電荷比範囲設定項目の分析条件を変更したものであるか、あるいは前記検出部におけるイオンの信号強度が大きくなるように前記信号強度設定項目の分析条件を変更したものである、請求項１に記載の試料分子の構造解析方法。
  5. 　前記変更分析条件が、前記イオン源で発生するイオン量が増えるように前記イオン量設定項目の分析条件を変更し、前記検出部におけるイオンの信号強度が大きくなるように前記信号強度設定項目の分析条件を変更したものである、請求項１に記載の構造解析方法。
  6. 　前記イオン量設定項目が、前記イオン源で照射するレーザ強度であり、
    　前記変更分析条件が、該レーザ強度を前記標準的な分析条件よりも大きい値に変更したものである、請求項１に記載の試料分子の構造解析方法。　
  7. 　前記質量電荷比範囲設定項目が、前記イオン源でレーザを照射してから、前記イオン捕捉部にイオンを捕捉するための捕捉電圧を印加するまでの時間であり、
    　前記変更分析条件が、該時間を前記標準的な分析条件よりも短い値に変更したものである請求項１に記載の試料分子の構造解析方法。
  8. 　前記変更分析条件が、前記時間を前記標準的な分析条件よりも１～３μ秒短い値に設定したものである、請求項７に記載の試料分子の構造解析方法。
  9. 　前記検出部がコンバージョンダイノード及び検出器を備え、
    　前記信号強度設定項目が、該コンバージョンダイノードへの印加電圧及び該検出器への印加電圧であり、
    　前記変更分析条件が、該コンバージョンダイノードへの印加電圧及び該検出器への印加電圧の少なくとも一方を前記標準的な分析条件よりも大きい値に変更したものである、請求項１に記載の試料分子の構造解析方法。
  10. 　前記プロダクトイオン測定は、前記イオン捕捉部で捕捉されるイオンの前記所定の質量電荷比の最大値が前記試料分子の分子量関連イオンの質量電荷比の値よりも小さくなるよう前記所定の質量電荷比の範囲を設定して行われるものである、請求項１に記載の試料分子の構造解析方法。
  11. 　前記イオン捕捉部における前記捕捉電圧の周波数を設定して前記所定の質量電荷比の範囲を設定する、請求項１０に記載の試料分子の構造解析方法。
  12. 　前記質量分析装置がデジタルイオントラップ型の質量分析装置であり、
    　前記イオン捕捉部における前記捕捉電圧のデューティ比を設定して前記所定の質量電荷比の範囲を設定する、請求項１０に記載の試料分子の構造解析方法。
  13. 　前記質量分析装置が、前記試料が載せられたサンプルプレートを載置するためのサンプルステージを備え、
    　前記標準分析条件取得工程が、さらに、前記分子量関連イオン測定を行う際の、前記サンプルステージへの印加電圧の標準的な分析条件を取得し、
    　前記プロダクトイオン測定は、前記サンプルステージへの印加電圧を前記標準的な分析条件よりも大きい値に変更した条件で行われるものである、請求項１０に記載の試料分子の構造解析方法。
  14. 　前記質量分析装置がデジタルイオントラップ型の質量分析装置であり、
    　前記プロダクトイオン測定データ取得工程が、さらに、前記イオン捕捉部で捕捉されるイオンにおける前記所定の質量電荷比の最大値が、前記試料分子の分子量関連イオンの質量電荷比の値よりも小さくなるよう、前記イオン捕捉部における前記捕捉電圧の周波数及び前記捕捉電圧のデューティ比の少なくとも一方を変更して、あるいは前記捕捉電圧の周波数及び前記捕捉電圧のデューティ比の少なくとも一方を変更せずに、前記プロダクトイオン測定を行い、前記プロダクトイオン測定のマススペクトルデータをそれぞれ取得し、
    　前記第１フラグメントピーク抽出工程は、前記プロダクトイオン測定データ取得工程が、前記捕捉電圧の周波数及び前記捕捉電圧のデューティ比の少なくとも一方を変更して前記プロダクトイオン測定を行い取得したマススペクトルデータ、及び前記捕捉電圧の周波数及び前記捕捉電圧のデューティ比の少なくとも一方を変更せずに前記プロダクトイオン測定を行い取得したマススペクトルデータの両方において前記複数の第１フラグメントイオンに対応するピークを抽出し、
    　前記データ解析工程は、前記第１フラグメントピーク抽出工程において抽出されたピークの質量情報に基づいて前記試料分子の構造の少なくとも一部を決定する、請求項１に記載の試料分子の構造解析方法。
  15. 　前記試料分子が核酸又は核酸関連物質である、請求項１に記載の試料分子の構造解析方法。
  16. 　前記試料分子が核酸又は核酸関連物質であり、前記試料分子の構造の一部が核酸又は核酸関連物質の末端部分の構造である、請求項２に記載の試料分子の構造解析方法。
  17. 　前記試料分子が核酸又は核酸関連物質であり、前記試料分子の構造の一部が核酸又は核酸関連物質の末端部分の構造である、請求項３に記載の試料分子の構造解析方法。
PCT/JP2022/046104 2022-05-31 2022-12-14 試料分子の構造解析方法 WO2023233690A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022089237 2022-05-31
JP2022-089237 2022-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023233690A1 true WO2023233690A1 (ja) 2023-12-07

Family

ID=89025964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/046104 WO2023233690A1 (ja) 2022-05-31 2022-12-14 試料分子の構造解析方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023233690A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012050351A (ja) * 2010-08-31 2012-03-15 Shimadzu Corp マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置を用いたイオン源内解裂によるｒｎａ配列決定法
US20120100623A1 (en) * 2010-04-26 2012-04-26 Zoltan Timar Method of oligonucleotide sequencing by mass spectrometry
WO2015107642A1 (ja) * 2014-01-16 2015-07-23 株式会社島津製作所 質量分析装置

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120100623A1 (en) * 2010-04-26 2012-04-26 Zoltan Timar Method of oligonucleotide sequencing by mass spectrometry
JP2012050351A (ja) * 2010-08-31 2012-03-15 Shimadzu Corp マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置を用いたイオン源内解裂によるｒｎａ配列決定法
WO2015107642A1 (ja) * 2014-01-16 2015-07-23 株式会社島津製作所 質量分析装置

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10541120B2 (en) Method of tandem mass spectrometry
US9536717B2 (en) Multiple ion injection in mass spectrometry
US8581179B2 (en) Protein sequencing with MALDI mass spectrometry
CA2517700C (en) Obtaining tandem mass spectrometry data for multiple parent ions in an ion population
EP2419198B1 (en) Acquisition and analysis of mixed ion populations in a mass spectrometer
US20040155180A1 (en) Mass spectrometry methods using electron capture by ions
WO2011081981A2 (en) Merged ion beam tandem tof-tof mass spectrometer
JP5727503B2 (ja) 多重タンデム質量分析法
US8389931B2 (en) Method for sequencing peptides and proteins using metastable-activated dissociation mass spectrometry
JP2021183977A (ja) 最適化された標的を絞った分析
WO2023234372A1 (ja) 核酸の質量分析方法
WO2023233690A1 (ja) 試料分子の構造解析方法
WO2023234374A1 (ja) 核酸の分析方法及びそれに用いるマトリックス
US7045777B2 (en) Combined chemical/biological agent mass spectrometer detector
WO2023234373A1 (ja) 核酸の構造解析方法
He et al. Detection of oligonucleotides by external injection into an ion trap storage/reflectron time‐of‐flight device
Peterkin Ion Isolation And Gas-Phase Charge Reduction For The Analysis of Protein Mixtures
CN117949525A (zh) Rna的分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22944964

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1