CN104974259B - 抗vegf/pigf双特异性抗体、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体的，本发明公开了抗VEGF/PIGF双特异性抗体、其制备方法及用途。本发明的抗VEGF/PIGF双特异性抗体既能与VEGF结合，又能与PIGF相结合，可有效抑制肿瘤内血管形成，进而更有效地抑制肿瘤生长。

Description

抗VEGF/PIGF双特异性抗体、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种能同时与两种不同靶点相结合的双特异性抗体、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

新生血管生成在肿瘤的发生发展过程中发挥着十分重要的作用。当肿瘤的体积超过1mm³时，依靠组织渗透所获得的营养不能够支撑肿瘤继续发展对于营养的需求。因此，肿瘤组织需要通过新生血管的生成来获取其发展所需要的各种养分。处于缺氧以及营养缺乏状态的肿瘤细胞会分泌多种促新生血管生成的因子，如血管内皮生长因子（VEGF），成纤维细胞生长因子(FGF)，人胎盘生长因子（PIGF)，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等。在这些生长因子的作用下，通过一系列复杂的过程，包括血管内皮基质的降解、内皮细胞的迁移、内皮细胞增殖、管道化分支形成血管环和新的基底膜等步骤来形成新的血管。由于新生血管生成在肿瘤发生发展中的重要性，通过抑制肿瘤的新生血管生成来抑制肿瘤的生长已经成为当今肿瘤临床治疗的重要手段。

在肿瘤细胞分泌的各种促新生血管生成的生长因子中，VEGF是公认的针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的有丝***原。VEGF与血管内皮细胞上的两种高亲和力受体VEGFR1和VEGFR2结合后，直接刺激血管内皮细胞增殖，并诱导其迁移和形成管腔样结构；同时还可增加微血管通透性，引起血浆蛋白（主要是纤维蛋白原）外渗，并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成。VEGF在血管发生和形成过程中起着中枢性的调控作用，是关键的新生血管生成刺激因子。

目前，Genetech公司开发的针对VEGF的特异性单克隆抗体Bevacizumab（Avastin）在临床治疗中已经取得积极效果，被美国FDA批准其与化疗药物联合用于转移性结肠癌、肺癌以及神经胶质瘤等肿瘤疾病的治疗。但是由于肿瘤细胞所分泌的促血管新生因子的多样性，以及相关的各种因子在功能上具有一定的可替代性，因此通过抑制单个促血管新生因子如VEGF的活性并不能完全阻断肿瘤内的新生血管的生成。临床前动物实验表明，肿瘤组织在经过Bevacizumab处理后，组织内的其他促血管新生因子如PIGF，血管生成素-1（angiopoietin-1），FGF的表达量显著上升,（Casanovas O,Hicklin DJ,Bergers G,Hanahan D.Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGFsignaling in late-stage pancreatic islet tumors.Cancer Cell2005;8:299-309.）。此外，临床试验也进一步证明，在结肠癌患者中，经过抗VEGF的治疗后，患者体内的PIGF水平显著升高（Willett CG,Boucher Y,Duda DG,di Tomaso E,Munn LL,et al.Surrogatemarkers for antiangiogenic therapy and dose-limiting toxicities forbevacizumab with radiation and chemotherapy:continued experience of phase Itrial in rectal cancer patients.J Clin Oncol2005;23:8136-9）。

与VEGF不同的是，PIGF选择性地与VEGFR1以及它的辅助受体神经毡蛋白-1(neuropilin-1)和神经毡蛋白-2（neuropilin-2）相结合，并且在巨噬细胞、骨髓前体细胞的表面表达大量的VEGFR1。功能上，PIGF除了能够刺激内皮细胞的增殖、迁移外，还能够通过趋化作用招募巨噬细胞和髓系前体细胞进入肿瘤组织，在肿瘤组织内形成一个有利于血管新生的微环境。依赖PIGF所招募的巨噬细胞以及相关髓系细胞在肿瘤组织新生血管生成的过程中发挥了重要的作用。研究表明，侵润进入肿瘤组织的巨噬细胞在相关微环境中被诱导成M2型巨噬细胞。与M1型巨噬细胞主要起激活机体特异性免疫应答的作用不同，M2型巨噬细胞能够大量合成和释放各种抗炎细胞因子如白介素-10（IL-10）、肿瘤生长因子-β（TGF-β）等、免疫抑制因子以及多种促进肿瘤生长的细胞因子，从而抑制炎症反应和促进肿瘤细胞生长与转移。通过氯膦酸盐脂质体(clodronate liposomes)或抗PIGF抗体去除侵润肿瘤组织的巨噬细胞后，组织内的血管新生和肿瘤的生长被显著抑制。此外，临床前动物体内实验证明，在对抗VEGF抗体耐受的移植瘤模型中，抗PIGF抗体和抗VEGF抗体联用能够显著增强抗VEGF抗体的体内抗肿瘤作用（Fischer C,Jonckx B,Mazzone M,Zacchigna S,Loges S,et al.Anti-PIGF inhibits growth of VEGF(R)-inhibitor-resistant tumorswithout affecting healthy vessels.Cell2007;131:463-75）。但是在临床实践中，一方面，由于联合应用两种抗体造价太高，且可用于组合治疗的抗体数目有限，另一方面，临床上两种不同靶向抗体药物进行联合治疗在安全性方面存在着诸多风险。

因此，构建一个能够同时与VEGF和PIGF相结合的双特异性抗体，进而更有效地抑制肿瘤生长，一直是本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，得到了一个可以同时阻断VEGF和PIGF两个靶点的双特异性抗体，即本发明所述的“重组抗VEGF/PIGF双特异性抗体”，从而完成了本发明。

具体地，本发明公开了：

1、一种抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其特征在于，所述抗体既能与VEGF结合，又能与PIGF相结合。

2、上述1所述抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体氨基酸序列包含抗VEGF单克隆抗体的可变区和抗PIGF单克隆抗体的可变区序列。

3、上述1或2所述抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示，所述双特异性抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12所示。优选地，

所述双特异性抗体还包括恒定区，且其轻链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示，重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

4、一种分离的核酸分子，其编码上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。优选地，所述核酸分子编码所述双特异性抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7所示，编码所述双特异性抗体重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO:9和SEQID NO:11所示。

5、一种表达载体，含有上述4所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列；优选的，其所述载体可以为pCHO1.0、pDR1、pcDNA3.1（+）、pcDNA3.1/ZEO(+)或pDHFR。

6.一种宿主细胞，含有上述5所述的载体。优选的，所述宿主细胞为真核细胞。优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。最优选的，所述宿主细胞为CHO细胞。7、一种制备上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体的方法，所述方法包括步骤：

a)在表达条件下，培养上述6所述的宿主细胞，从而表达抗VEGF/PIGF双特异性抗体，

b)分离或纯化所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。

8、一种组合物，含有上述1-3任一所述的抗体和药学上可接受的载体。

9、上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体或上述8所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

10、上述9所述用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。

本发明中，任何能够同时和VEGF，PIGF特异性相结合的氨基酸序列及编码相应氨基酸序列的DNA序列都适合于本发明。

本发明中，任何合适的载体都可用于抗VEGF/PIGF双特异性抗体表达载体的构建，可以为pCHO1.0，pDR1,pcDNA3.1（+）,pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR等，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的编码相应氨基酸序列的DNA序列。

哺乳动物或昆虫宿主细胞培养***可用于本发明，例如COS,CHO,NS0，sf9及sf21等均可适用于本发明。

可用的宿主细胞也可以为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21(DE3),TG1之一。

本发明中公开的抗VEGF/PIGF双特异性抗体的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗VEGF/PIGF双特异性抗体，分离或纯化所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。利用上述方法，可以将抗VEGF/PIGF双特异性抗体纯化为基本均一的物质，例如在非还原性SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的抗VEGF/PIGF双特异性抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。

本发明公开的上述抗VEGF/PIGF双特异性抗体的结构可以简单地表示为：轻链VL1-linker₁-VL2-CL，重链VH1-linker₂-VH2-CH。其中VL1，VH1分别为抗VEGF/PIGF双特异性抗体轻、重链的第一可变区结构域；VL2，VH2分别为抗VEGF/PIGF双特异抗体轻、重链的是第二可变区结构域；CL，CH分别为抗VEGF/PIGF双特异性抗体轻、重链的恒定区；linker₁，linker₂分别是连接抗VEGF/PIGF双特异性抗体轻链、重链的第一和第二可变区结构域的连接多肽。上述双特异性抗体是通过以下方法得到的：轻链VL1(来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.7)，VL2(来自抗PIGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.5),重链VH1(来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.11)，VH2(来自抗PIGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.9)由上海生物工程技术服务有限公司全基因合成。轻链VL1和VL2经过linker₁（QPKAAPSVTLFPP）串联后与人抗体轻链恒定区基因（SEQ ID No.1）以overlapPCR连接后克隆到pCHO1.0载体（购自Life Technology公司）的第一个限制性多酶切位点，构建真核表达载体pCHO-VEGF/PIGFDVD-Ig-L，同样，重链VH1和VH2经过linker₂（ASTKGPSVFPLAP）串联后与人抗体重链恒定区基因（SEQ ID No.3）连接被克隆到已含有双特异性抗体轻链的pCHO-VEGF/PIGF DVD-Ig-L的表达载体的第二个限制性多酶切位点，构建完整的双特异性表达质粒。上述质粒用FreeStyle^TMMAX Reagent转染进入CHO-S细胞，并用含50μg/ml嘌呤霉素和1μM的甲氨喋呤的选择培养基筛选稳定表达VEGF/PIGF双特异性抗体的单细胞克隆.利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化抗VEGF/PIGF双特异性抗体。

本发明的申请人对上述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体进行与VEGF、PIGF的亲和力检测、抑制HUVEC细胞增殖、体内抑瘤等实验。实验结果表明，本发明公开的抗VEGF/PIGF双特异性抗体可以很好的与VEGF和PIGF结合。它能够阻断VEGF所参与调控的血管内皮细胞的增殖，迁移和活化，同时它也能够阻断PIGF所介导的肿瘤组织中巨噬细胞和髓系细胞的侵润，从而更加显著地阻断肿瘤组织中新生血管的生成、切断肿瘤发生发展过程中氧气和养分的供给，抑制肿瘤的生长，由于同时抑制了参与新生血管生成的多种细胞（内皮细胞，巨噬细胞，髓系细胞等）的活性，因此，本发明抗VEGF/PIGF双特异性抗体可以降低肿瘤组织耐药性的产生。

本发明公开上述抗VEGF/PIGF双特异性抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的融合受体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述,抗VEGF/PIGF双特异性抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）；poloxamer（如poloxamer188）；Triton；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使抗VEGF/PIGF双特异性抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂包括但不限于：糖类，可以是还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，可以为谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，可以是三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一；缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含上述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明所指的肿瘤，包括但不限于：腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、***、***、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经***的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌***肿瘤、胃肠道胰腺内分泌***肿瘤，生殖***肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或***的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

本发明公开的抗VEGF/PIGF双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物（1）作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素（MMC）；（2）影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤（MTX）和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5FU、FT－207、卡培他滨）等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤（6－MP）和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲（HU）等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Ara-C）和健择（Gemz）等；（3）作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；（4）主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；（5）其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗***：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素－2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera)；Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)、Bevacizumab(Avastin)；5、其他一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的抗VEGF/PIGF双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

附图说明

图1.pCHO1.0表达载体结构示意图,

图2.抗VEGF/PIGF双特异性抗体结构示意图；

图3.抗VEGF/PIGF双特异性抗体抑制HUVEC细胞增殖活性实验结果图；

图4.抗VEGF/PIGF双特异性抗体对结肠癌HT-29移植瘤体内抗肿瘤作用实验结果图；

图5.抗VEGF/PIGF双特异性抗体对结肠癌Lovo移植瘤体内抗肿瘤作用实验结果图；

具体实施方式

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为是对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建抗体表达质粒的方法，将编码蛋白的基因***到相应的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.（1989）Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2^ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press.

实施例1.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献（Cell,1980,22：197-207）和文献（Nucleic Acids Research，1982，10：4071-4079）的报道，分别设计引物扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃分钟；94℃45秒，60℃45秒，72℃1分10秒，30个循环；72℃10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体（购自Life Technology公司，以下同）中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别显示了重链恒定区（CH）的核苷酸和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CL和pGEM-T/CH。

实施例2.抗VEGF/PIGF双特异性抗体表达载体的构建

轻链VL1(来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.7)、VL2(来自抗PIGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.5),重链VH1(来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.11)、VH2(来自抗PIGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.9)的核苷酸序列由上海生物工程技术服务有限公司全基因合成。轻链VL1与VL2核苷酸序列通过overlapPCR的方法与Linker1以串联形式进行连接（Linker1核苷酸序列见SEQ ID No.13），并且被克隆到pGEM-T载体。然后轻链双变区基因（VL1-VL2）核苷酸序列与人抗体轻链恒定区核苷酸序列以overlapPCR连接被克隆到pGEM-T载体中，挑选阳性克隆，测序正确。以AvrII和BstZ17I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得的酶切片断与同酶切的质粒pCHO1.0（购自Life Technology公司，以下同）用T4DNA连接酶进行连接，构建成轻链表达载体pCHO(VEGF/PIGF DVD-IgG-L)。重链VH1与VH2核苷酸序列通过overlapPCR的方法与Linker2以串联形式进行连接（Linker2核苷酸序列见SEQ IDNo.15），并且被克隆到pGEM-T载体。然后重链双变区基因（VH1-VH2）核苷酸序列与人抗体IgG1重链恒定区核苷酸序列以overlapPCR连接被克隆到pGEM-T载体中，挑选阳性克隆，测序正确。以EcoRV和Pacl酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得的酶切片断与同酶切的轻链表达载体pCHO(VEGF/PIGF DVD-IgG-L)用T4DNA连接酶进行连接，构建完整的VEGF/PIGF双特异性抗体表达载体pCHO(VEGF/PIGF DVD-IgG)。附图1展示了pCHO1.0表达载体结构示意图。其中，PPGK是磷酸甘油酸激酶启动子；PEF2/CMV是EF2/CMV杂合启动子，PCMV/EF1是CMV/EF1杂合启动子，SV40pA表示SV40多腺苷化信号；CMVpA表示CMV多腺苷化信号，DHFR表示二氢叶酸还原酶基因；pac为嘌呤霉素抗性基因，pMB1ori为质粒复制起点。图2展示了获得的抗VEGF/PIGF双特异性抗体结构示意图，抗VEGF/PIGF双特异性抗体轻链VL1-linker₁-VL2-CL，重链VH1-linker₂-VH2-CH其中VL1，VH1分别为抗VEGF/PIGF双特异性抗体轻、重链的第一可变区结构域；VL2，VH2分别为抗VEGF/PIGF双特异抗体轻、重链的是第二可变区结构域；CL，CH分别为抗VEGF/PIGF双特异性抗体轻、重链的恒定区；linker₁，linker₂分别是连接抗VEGF/PIGF双特异性抗体轻链、重链的第一和第二可变区结构域的连接多肽，轻链VL1(来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.7，氨基酸序列SEQ ID No.8)，VL2(来自抗PIGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.5，氨基酸序列SEQ ID No.6),重链VH1(来自抗VEGF抗体，核苷酸序列SEQ ID No.11，氨基酸序列SEQ ID No.12)，VH2(来自抗PIGF抗体，核苷酸序列SEQ IDNo.9，氨基酸序列SEQ ID No.10)，轻链CL（核苷酸序列SEQ ID No.1，氨基酸序列SEQ IDNo.2），重链CH（核苷酸序列SEQ ID No.3，氨基酸序列SEQ ID No.4）。

于125ml摇瓶中接种5×10⁵/ml CHO-S细胞30ml，细胞培养24小时后进行转染：取pCHO(VEGF/PIGF DVD-IgG)质粒50μg和50μl FreeStyle^TMMAX Reagent（Invitrogen公司产品）分别溶于1.45ml OptiPRO^TMSFM，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育10分钟使形成DNA-脂质体复合物，将DNA-脂质体复合物加入到摇瓶中，再将转染后的CHO-S细胞于37℃，8%CO₂于摇床培养箱中130-150rpm继续培养。转染进行48小时后用含50μg/ml嘌呤霉素和1μM的甲氨喋呤的选择培养基筛选稳定表达抗VEGF/PIGF双特异性抗体的单细胞克隆细胞。

取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：小鼠抗人IgG1(CH2)包被于ELISA板，4℃过夜，用2%BSA-PBS于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(Humanmyeloma IgG1,κ)，37℃孵育2小时，加入HRP-小鼠抗人IgG(CH3)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用5分钟，最后用H₂SO₄终止反应，测OD₄₅₀值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱（GE公司产品）分离纯化VEGF/PIGF双特异性抗体，经测序，和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10序列一致，将纯化的双特异性抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。图2为双特异性抗体结构图。

实验例

实验例1.Biacore法检测抗VEGF/PIGF双特异性抗体与VEGF亲和力实验

抗VEGF/PIGF双特异性抗体与VEGF（购自：R&D公司）的亲和力是根据用BIAcore-2000^TM表面胞质团共振***测得的结合速率常数和解离速率常数计算出的。用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺将生物传感器芯片CM5活化，以便于VEGF共价偶联。将VEGF的缓冲液换为20mM乙酸钠（PH4.8），然后稀释至约50微克/毫升。将一等份样品（35微升）以2微升/分钟的流速注入，以达到约700-1400共振单位（RU）的偶联蛋白，然后注入1M乙醇胺作为封闭剂。对于抗VEGF/PIGF双特异性抗体与VEGF亲和力检测，将抗VEGF/PIGF双特异性抗体或抗VEGF-抗体（按照实施例2方法自行制备，以下同）在PBS/TWEEN ^TM缓冲液（含0.05%TWEEN20^TM的磷酸盐缓冲液）中的2倍系列稀释液，以10微升/分钟的速度注入，结合和解离速率用标准方法（Karlsson等人，免疫学方法杂志（J.Immun.Methods）145:229-240（1991））计算，平衡解离常数Kd(表面胞质团共振（SPR）测量值的K_d)按K_off/K_on进行计算。数据见表1。如表1所示，抗VEGF/PIGF双特异性抗体与抗VEGF抗体相比，具有十分相似的动力学常数，其与VEGF的结合平衡解离常速Kd值为7×10^-10M左右。

实验例2.抗VEGF/PIGF双特异性抗体与PIGF亲和力检测实验

抗VEGF/PIGF双特异性抗体与PIGF（购自R&D公司）的亲和力是根据用BIAcore-2000^TM表面胞质团共振***测得的结合速率常数和解离速率常数计算出的。用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺将生物传感器芯片CM5活化，以便于PIGF共价偶联。将PIGF的缓冲液换为20mM乙酸钠（PH4.8），然后稀释至约60微克/毫升。将一等份样品（35微升）以2微升/分钟的流速注入，以达到约700-1400共振单位（RU）的偶联蛋白，然后注入1M乙醇胺作为封闭剂。对于抗VEGF/PIGF双特异性抗体与PIGF亲和力检测，将抗VEGF/PIGF双特异性抗体或抗PIGF-抗体（按照实施例2方法制备得到）在PBS/TWEEN^TM缓冲液（含0.05%TWEEN20^TM的磷酸盐缓冲液）中的2倍系列稀释液，以10微升/分钟的速度注入，结合和解离速率用标准方法（Karlsson等人，免疫学方法杂志（J.Immun.Methods）145:229-240（1991））计算，平衡解离常数Kd(表面胞质团共振（SPR）测量值的K_d)按K_off/K_on进行计算。数据见表2。抗VEGF/PIGF双特异性抗体和抗PIGF抗体具有十分相似的动力学常数，抗VEGF/PIGF双特异性抗体与PIGF的结合力略低于抗PIGF抗体，结合平衡解离常速Kd值为8×10^-9M左右。

实验例3.抗VEGF/PIGF双特异性抗体抑制HUVEC细胞增殖实验

实验步骤：取生长状态良好的HUVEC细胞（购自中国科学院典型培养物典藏委员会细胞库），调整细胞浓度为2.5×10⁴/ml，接种于96孔细胞培养板，100μl/孔，于37℃、5%C02孵箱中培养24h后换无血清培养基，继续培养24h，分别加入不同浓度梯度的VEGF/PIGFDVD-IgG,抗VEGF抗体,抗PIGF抗体，以PBS为对照，每个浓度取3个平行孔，37℃孵育1h，加入终浓度为50ng/ml的VEGF-A或100ng/ml的VEGF-C继续培养72h后，加入l00μl/孔CellTiter（Promega公司产品）试剂，室温孵育15分钟后，96孔板的荧光值在SpectraMax进行读数检测HUVEC细胞的增殖情况，计算不同处理组的相关抑制率。如图3所示，结果表明VEGF/PIGFDVD-IgG,抗VEGF抗体,抗PIGF抗体可同时抑制VEGF-A引起的HUVEC细胞增殖，且VEGF/PIGFDVD-IgG抑制VEGF-A引起的HUVEC细胞增殖的活性较抗VEGF抗体和抗PIGF抗体强。

实验例4.抗VEGF/PIGF双特异性抗体体内抑制HT-29移植瘤生长实验

实验步骤：为评价VEGF/PIGF双特异性抗体的体内抗肿瘤作用，人结肠癌细胞HT-29(5×10⁶细胞/只)（购自中国科学院典型培养物典藏委员会细胞库，以下同）接种于Balb/ca裸小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司，以下同）的右侧皮下，待裸小鼠的皮下肿瘤长到100-200mm³时，对荷瘤裸小鼠进行随机分组，共分为四组：空白对照组，抗VEGF抗体治疗组，抗PIGF抗体治疗组，抗VEGF/PIGF双特异性抗体治疗组。每三天进行尾静脉注射给药一次，持续给药四周。每周测量肿瘤的长宽两次，计算相对肿瘤体积，结果如图4所示。结果表明：在结肠癌HT-29移植瘤模型中，与抗VEGF抗体治疗组和抗PIGF抗体治疗组相比，抗VEGF/PIGF双特异性抗体治疗组的肿瘤生长受到了更为显著地抑制，肿瘤体积明显小于抗VEGF抗体治疗组和抗PIGF抗体治疗组，且与进行治疗的初始肿瘤体积相比，肿瘤的体积显著缩小。

实验例5.VEGF/PIGF双特异性抗体体内抑制LoVo移植瘤生长实验

实验步骤：为评价抗VEGF/PIGF双特异性抗体的体内抗肿瘤作用，人结肠癌细胞Lovo(5×10⁶细胞/只)接种于Balb/CA裸小鼠的右侧皮下，待裸小鼠的皮下肿瘤长到100-200mm³时，对荷瘤裸小鼠进行随机分组，共分为四组：空白对照组，抗VEGF抗体治疗组，抗PIGF抗体治疗组，抗VEGF/PIGF双特异性抗体治疗组。每三天进行尾静脉注射给药一次，持续给药四周。每周测量肿瘤的长宽两次，计算相对肿瘤体积，结果如图5所示。结果表明：在结肠癌Lovo移植瘤模型中，与抗VEGF抗体治疗组和抗PIGF抗体治疗组相比，抗VEGF/PIGF双特异性抗体治疗组的肿瘤生长受到了更为显著地抑制，肿瘤体积明显小于抗VEGF抗体治疗组和抗PIGF抗体治疗组。

Claims (9)

1.一种抗VEGF/PIGF双特异性抗体，既能与VEGF结合，又能与PIGF相结合，其特征在于，所述双特异性抗体轻链结构为VL1-linker1-VL2-CL，重链结构为VH1-linker2-VH2-CH，其中双特异性抗体轻链可变区VL1氨基酸序列为SEQ ID NO:8,VL2氨基酸序列为SEQ ID NO:6，连接肽linker1的氨基酸序列为SEQ ID NO:14，双特异性抗体重链可变区VH1氨基酸序列为SEQ ID NO:12,VH2氨基酸序列为SEQ ID NO:10，连接肽linker2的氨基酸序列为SEQ IDNO:16。

2.权利要求1所述抗VEGF/PIGF双特异性抗体，其轻链恒定区CL氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示，重链恒定区CH氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

3.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-2任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。

4.一种表达载体，含有权利要求3所述的核酸分子和与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列；其所述载体为pCHO1.0、pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)或pDHFR。

5.一种宿主细胞，含有权利要求4所述的载体。

6.一种制备权利要求1-2任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体的方法，所述方法包括步骤：

a)在表达条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达抗VEGF/PIGF双特异性抗体，

b)分离并纯化a)所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体。

7.一种组合物，含有权利要求1-2任一所述的抗体和药学上可接受的载体。

8.权利要求1-2任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体或权利要求7所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

9.权利要求1-2任一所述的抗VEGF/PIGF双特异性抗体或权利要求7所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述用途还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。