JP6783590B2 - 増幅核酸検出方法及び検出デバイス - Google Patents
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Description
(a)前記核酸検出デバイス上の、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域とは異なる領域に、前記DNA増幅断片を配置する工程、
(b)溶媒を用いて、前記DNA増幅断片を、前記第1オリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域の方向に、上記デバイス上で拡散させる工程、及び
(c)前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域において、前記第1オリゴヌクレオチドプローブと、前記DNA増幅断片とを、ハイブリダイズさせる工程、
を含むことが好ましい。
(e)溶媒を用いて、前記DNA増幅断片を、前記標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている領域の方向に拡散させ、
(f)前記標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている領域において、前記DNA増幅断片と、標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ、
(g)工程(f)でハイブリダイズした複合体を前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている方向に、展開媒体上で拡散させ、
(h)前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域において、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブと前記複合体とをハイブリダイズさせることが好ましい。
(1)L−DNAタグ付きプライマーの合成
本実施例では、鋳型としてpUC19(タカラバイオ社製)を用い、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)およびリバースプライマー(R)を設計した。さらにそれぞれの5’末端側に非天然型(L型)DNA鎖からなるタグ配列T1およびT2を導入したL−DNAタグ付きプライマー、T1−FおよびT2−Rを設計した。L−DNAタグ付きプライマーの合成は、0.2μMスケールのカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、DNA自動合成機(H−8−SE:Gene World)で合成した。
プライマーF:5’−Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号1)
プライマーR:5’−Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号2)
タグ配列T1:5’−Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)−3’(配列番号3)
タグ配列T2:5’−Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)−3’(配列番号4)
プライマーT1−F:5’−Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)−Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号5)
プライマーT2−R:5’−Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)−Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号6)。
前記工程(1)で実施し作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーFとプライマーRを各15pmolと、10ngのpUC19とを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを35回行い、目的の約330bpを増幅した。また、pUC19を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有L型オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号7、配列番号3の相補鎖)を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
ヌクレオチドプローブ1:5’−Ld(TTGGCTCTGTCTCCGTTGTC)−NH2−3’(配列番号7)。
カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン(日本ポール社製、6mmx60mm)を水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄した。活性化したメンブレンの一端から30mmの箇所に、配列番号4に対して相補的な配列(配列番号8)を有するアミノ基含有L型オリゴヌクレオチドプローブを、ディスペンサーを用いてライン上に塗布し、15分間風乾した。その後、メンブレンをTris緩衝液で処理し、ブロッキング後、メンブレンを水洗、乾燥した。
ヌクレオチドプローブ2:5’−Ld(CACTGGGCATACGGTAGCAT)−NH2−3’(配列番号8)。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したナイロンメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、L型DNAタグ付きプライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
(1)ヘアピンタグ付きプライマーの合成
実施例1の工程(1)と同様に、鋳型としてpUC19(タカラバイオ社製)を用い、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)およびリバースプライマー(R)を設計した。その5’末端側にヘアピン構造を有するポリメラーゼ反応阻害領域(H)、およびタグ配列T3およびT4を導入したタグ付きプライマー、T3−H−FおよびT4−H−Rを合成した。
ポリメラーゼ反応阻害配列H:5’−Dd(AGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTC GCCT)−3’(配列番号9)
タグ配列T3:5’−Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)−3’(配列番号10)
タグ配列T4:5’−Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAAT)−3’(配列番号11)
プライマーT3−H−F:5’− Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATG TGCGCTCGCGACCTCGCCTGGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号12)
プライマーT4−H−R:5’− Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGC GCTCGCGACCTCGCCTCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号13)。
前記工程(1)で実施し作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーFとプライマーRを各15pmolと、10ngのpUC19とを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを35回行い、目的の約330bpを増幅した。また、pUC19を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号14、配列番号10の相補鎖)を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ3:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)−NH2−3’(配列番号14)。
カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン(日本ポール社製、6mmx60mm)を水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄した。活性化したメンブレンの一端から30mmの箇所に、配列番号11の相補的な配列(配列番号15)を有するアミノ基含有L型オリゴヌクレオチドプローブを、ディスペンサーを用いてライン上に塗布し、15分間風乾した。その後、メンブレンをTris緩衝液で処理し、ブロッキング後、メンブレンを水洗、乾燥した。
オリゴヌクレオチドプローブ4: 5’−Dd(ATTGAGCAAGTGTACAGAGCA)−NH2−3’(配列番号15)。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したナイロンメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、ヘアピンタグ付きプライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
(1)人工核酸(アゾベンゼン)挿入プライマーの合成
実施例1の工程(1)と同様に、鋳型としてpUC19(タカラバイオ社製)を用い、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)およびリバースプライマー(R)を設計した。それぞれの5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T5およびT6を導入したタグ付きプライマー、T5−X−FおよびT6−X−Rを合成した。この2種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。本検討で作製したプライマーセットを示す。
タグ配列T6:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)−3’(配列番号17)
プライマーT5−X−F:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号18)
プライマーT6−X−R:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号19)
なお、プライマーに挿入されたアゾベンゼンは下記式(1)で表される。
前記工程(1)で実施し作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーT5−X−FとプライマーT6−X−Rを各15pmolと、10ngのpUC19とを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを35回行い、目的の約330bpを増幅した。また、pUC19を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号20、配列番号16の相補鎖)を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ5:5’−Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)−NH2−3’(配列番号20)。
カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン(日本ポール社製、6mmx60mm)を水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄した。活性化したメンブレンの一端から30mmの箇所に、配列番号17の相補的な配列(配列番号21)を有するアミノ基含有D型オリゴヌクレオチドプローブを、ディスペンサーを用いてライン上に塗布し、15分間風乾した。その後、メンブレンをTris緩衝液で処理し、ブロッキング後、メンブレンを水洗、乾燥した。
オリゴヌクレオチドプローブ6:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−NH2−3’(配列番号21)。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したナイロンメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
(1)金コロイド結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
Gold Colloid(40nm、9.0×1010(粒子数/ml)、British BioCell International社製)とチオール基含有オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号22、配列番号16の相補鎖)を混合し、50℃で16時間インキュベートした。6000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去、0.05M 塩化ナトリウム、5mMリン酸バッファー、pH7を添加し混和後、再度50℃で40時間インキュベートした。
配列番号17に相補的な配列(配列番号23)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、ストレプトアビジンと混合する。その混合液をニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 180、 ミリポア社製)にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ8:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−Biotin−3’(配列番号23)。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
実施例3の工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(3)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。実施例3の工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
(1)オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号17に相補的な配列(配列番号24)を有するオリゴヌクレオチドプローブをUltraBindアフィニティメンブレン(日本ポール社製)にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、80℃で1時間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ9:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−3’(配列番号24)。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したUltraBindアフィニティメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
実施例3の工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(2)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。実施例3の工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
(1)人工核酸(アゾベンゼン)挿入プライマーの合成
本実施例では、標的核酸の鋳型としてはpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類をテンプレートとして用い、PCR増幅により約330塩基対、約200塩基対、および、約100塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F1)とリバースプライマー(R1)、フォワードプライマー(F2)とリバースプライマー(R2)、および、フォワードプライマー(F3)とリバースプライマー(R3)の3組のプライマーをそれぞれ設計した。それぞれの5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T10とT11、タグ配列T12とT13、および、タグ配列T14とT15を導入したタグ付きプライマー、T10−X−F1とT11−X−R1、T12−X−F2とT13−X−R2、および、T14−X−F3とT15−X−R3を合成した。この6種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製した3組のプライマーセットを示す。
タグ配列T11:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)−3’(配列番号26)
プライマーT10−X−F1:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号27)
プライマーT11−X−R1:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号28)
タグ配列T12:5’−Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)−3’(配列番号29)
タグ配列T13:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)−3’(配列番号30)
プライマーT12−X−F2:5’−Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT X AGCATTATGAATTATATGGT)−3’(配列番号31)
プライマーT13−X−R2:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA X TTGTTTACATTTATAGCATC)−3’(配列番号32)
タグ配列T14:5’−Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)−3’(配列番号33)
タグ配列T15:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)−3’(配列番号34)
プライマーT14−X−F3:5’−Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA X TGGTTTTAAAACTCTGATAC)−3’(配列番号35)
プライマーT15−X−R3:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG X AGTATGATGAGGGTGTAACA)−3’(配列番号36)
前記工程(1)で実施し作製した3組のプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーT10−X−F1、プライマーT11−X−R1、プライマーT12−X−F2、プライマーT13−X−R2、プライマーT14−X−F3、および、プライマーT15−X−R3を各15pmolと、各テンプレート10ngを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。反応液は次の5種類を用意した。
(i)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)を添加、
(ii)テンプレートとしてEcoRIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iii)テンプレートとしてBamHIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iv)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類全て添加、そして、
(v)テンプレートなし。
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(青色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ16(配列番号37、配列番号25の相補鎖)、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(オレンジ色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ17(配列番号38、配列番号29の相補鎖)、および、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(緑色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ18(配列番号39、配列番号33の相補鎖)を、それぞれ水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、オリゴヌクレオチドプローブ16結合ラッテックス(青色)、オリゴヌクレオチドプローブ17結合ラテックス(オレンジ色)、オリゴヌクレオチドプローブ18結合ラテックス(緑色)を作製した。
オリゴヌクレオチドプローブ16:5’−Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)−NH2−3’(配列番号37)。
オリゴヌクレオチドプローブ17:5’−Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)−NH2−3’(配列番号38)
オリゴヌクレオチドプローブ18:5’−Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)−NH2−3’(配列番号39)
(4)3種のオリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号26に相補的な配列(配列番号40)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ、配列番号30に相補的な配列(配列番号41)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ、および、配列番号34に相補的な配列(配列番号42)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、それぞれストレプトアビジンと混合する。それらの混合液をニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 135、 ミリポア社製)上の3箇所にディスペンサーを用いて、上流側から順に互いに離れた位置でライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。3本の検出ラインを作製した。
オリゴヌクレオチドプローブ19:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−Biotin−3’(配列番号40)。
オリゴヌクレオチドプローブ20:5’−Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)−Biotin−3’(配列番号41)。
オリゴヌクレオチドプローブ21:5’−Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)−Biotin−3’(配列番号42)。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程(3)で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
工程(2)で作製した(i)〜(v)のPCR産物をそれぞれ変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。その結果は以下に示す。
(i):1本目の検出ラインのみ青色に着色。
(ii):2本目の検出ラインのみオレンジ色に着色。
(iii):3本目の検出ラインのみ緑色に着色。
(iv):1本目の検出ラインが青色に、2本目の検出ラインがオレンジ色に、3本目の検出ラインが緑色にそれぞれ着色。
(v):どの検出ラインも着色は認められなかった。
この結果から、それぞれの標的遺伝子特異的に検出が可能であり、3種類の同時検出も確認できた。
また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
(1)ジョイントプライマーの合成
本実施例では、標的核酸の鋳型としてはpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類をテンプレートとして用い、PCR増幅により約330塩基対、約200塩基対、および、約100塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(Fj1)とリバースプライマー(Rj1)、フォワードプライマー(Fj2)とリバースプライマー(Rj2)、および、フォワードプライマー(Fj3)とリバースプライマー(Rj3)の3組のプライマーをそれぞれ設計した。それぞれの5’末端側に共通配列KF1とKR1、共通配列KF2とKR2、および、共通配列KF3とKR3を導入した共通配列付加プライマー、KF1−Fj1とKR1−Rj1、KF2−Fj2とKR2−Rj2、および、KF3−Fj3とKR3−Rj3を合成した。この6種の共通配列付加プライマー(ジョイントプライマー)はつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製した3組のプライマーセットを示す。
共通配列KR1:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号44)
プライマーKF1−Fj1:5’−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号45)
プライマーKR1−Rj1:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号46)
共通配列KF2:5’−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)−3’(配列番号47)
共通配列KR2:5’−Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA)−3’(配列番号48)
プライマーKF2−Fj2:5’−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT AGCATTATGAATTATATGGT)−3’(配列番号49)
プライマーKR2−Rj2:5’−Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA TTGTTTACATTTATAGCATC)−3’(配列番号50)
共通配列KF3:5’−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)−3’(配列番号51)
共通配列KR3:5’−Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC)−3’(配列番号52)
プライマーKF3−Fj3:5’−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC TGGTTTTAAAACTCTGATAC)−3’(配列番号53)
プライマーKR3−Rj3:5’−Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC AGTATGATGAGGGTGTAACA)−3’(配列番号54)
本実施例では、工程1で作成したジョイントプライマーセットがそれぞれ増幅する3種類のPCR増幅断片に結合できるように、それぞれのジョイントプライマーと同一の共通配列を有するプライマーを3組設計した。それぞれのプライマーは、5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T22とT23、タグ配列T24とT25、および、タグ配列T26とT27を導入したタグ付きプライマー、T22−X−KF1とT23−X−KR1、T24−X−KF2とT25−X−KR2、および、T26−X−KF3とT27−X−KR3を合成した。この6種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製した3組のプライマーセットを示す。
タグ配列T23:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)−3’(配列番号56)
プライマーT22−X−KF1:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X TGGGCTGACCTAGAGGTCTT )−3’(配列番号57)
プライマーT23−X−KR1:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X ATGAAATGCAGGCCATTCGG )−3’(配列番号58)
タグ配列T24:5’−Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)−3’(配列番号59)
タグ配列T25:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)−3’(配列番号60)
プライマーT24−X−KF2:5’−Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT X CCGGAACAGACACCAGGTTT)−3’(配列番号61)
プライマーT25−X−KR2:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA X GAAGCTGTACCGTCACATGA)−3’(配列番号62)
タグ配列T26:5’−Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)−3’(配列番号63)
タグ配列T27:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)−3’(配列番号64)
プライマーT26−X−KF3:5’−Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA X ATACCGATGAGTGTGCTACC)−3’(配列番号65)
プライマーT27−X−KR3:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG X TGGCCTGTGTGACACTATGC)−3’(配列番号66)
前記工程(1)および(2)で実施し作製した6組のプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーKF1−Fj1、プライマーKR1−Rj1、プライマーKF2−Fj2、プライマーKR2−Rj2、プライマーKF3−Fj3、プライマーKR3−Rj3、プライマーT22−X−KF1、プライマーT23−X−KR1、プライマーT24−X−KF2、プライマーT25−X−KR2、プライマーT26−X−KF3、プライマーT27−X−KR3を各8pmolと、各テンプレート10ngを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。反応液は次の5種類を用意した。
(i)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)を添加、
(ii)テンプレートとしてEcoRIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iii)テンプレートとしてBamHIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iv)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類全て添加、そして、
(v)テンプレートなし。
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(青色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ28(配列番号67、配列番号55の相補鎖)、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(オレンジ色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ29(配列番号68、配列番号59の相補鎖)、および、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(緑色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ30(配列番号69、配列番号63の相補鎖)を、それぞれ水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、オリゴヌクレオチドプローブ28結合ラッテックス(青色)、オリゴヌクレオチドプローブ29結合ラテックス(オレンジ色)、オリゴヌクレオチドプローブ30結合ラテックス(緑色)を作製した。
オリゴヌクレオチドプローブ28:5’−Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)−NH2−3’(配列番号67)。
オリゴヌクレオチドプローブ29:5’−Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)−NH2−3’(配列番号68)
オリゴヌクレオチドプローブ30:5’−Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)−NH2−3’(配列番号69)
配列番号56に相補的な配列(配列番号70)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ、配列番号60に相補的な配列(配列番号71)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ、および、配列番号64に相補的な配列(配列番号72)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、それぞれストレプトアビジンと混合する。それらの混合液をニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 135、ミリポア社製)上の3箇所にディスペンサーを用いて、上流側から順に互いに離れた位置でライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。3本の検出ラインを作製した。
オリゴヌクレオチドプローブ32:5’−Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)−Biotin−3’(配列番号71)。
オリゴヌクレオチドプローブ33:5’−Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)−Biotin−3’(配列番号72)。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程(4)で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
工程(3)で作製した(i)〜(v)のPCR産物をそれぞれ変性することなく、直ちに工程(6)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。その結果は以下に示す。
(i):1本目の検出ラインのみ青色に着色。
(ii):2本目の検出ラインのみオレンジ色に着色。
(iii):3本目の検出ラインのみ緑色に着色。
(iv):1本目の検出ラインが青色に、2本目の検出ラインがオレンジ色に、3本目の検出ラインが緑色に着色。
(v):どの検出ラインも着色は認められなかった。
この結果から、それぞれの標的遺伝子特異的に検出が可能であり、3種類の検出も確認できた。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
(1)ジョイントプライマーの合成
本実施例では、標的核酸の鋳型としてはpUC19(タカラバイオ社製)をテンプレートとして用い、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)とリバースプライマー(R)を設計した。それぞれの5’末端側に共通配列KFとKRを導入した共通配列付加プライマー、KF−FとKR−Rを合成した。この2種の共通配列付加プライマー(ジョイントプライマー)はつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製したプライマーセットを示す。
共通配列KR:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号74)
プライマーKF−F:5’−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号75)
プライマーKR−R:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号76)
本実施例では、工程(1)で作成したジョイントプライマーセットが増幅するPCR増幅断片に結合できるように、それぞれのジョイントプライマーと同一の共通配列を有するプライマーをそれぞれ設計した。一方のプライマーは、5’末端側にビオチン修飾したものを合成し、もう一方のプライマーは5’末端側にFITC修飾したものを合成した。この2種の修飾プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製したプライマーセットを示す。
プライマーKF2:5’−Biotin−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)−3’(配列番号77)
プライマーKR2:5’−FITC−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号78)
前記工程(1)および(2)で実施し作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーKF−F、プライマーKR−R、プライマーKF2、プライマーKR2を各8pmol、および、テンプレートとして10ngのpUC19を0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを30回行い、約360bpの目的配列を有するDNA断片を増幅した。
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(青色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とストレプトアビジン(和光純薬工業社製)を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、ストレプトアビジン結合ラッテックス(青色)を作製した。このラテックス溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
抗FITC抗体(インビトロジェン社製)を5mM トリスバッファー(pH 7.5)に溶解し、ニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 135、 ミリポア社製)上にディスペンサーを用いて、ライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。検出ラインを作製した。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程(4)で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、ビオチン修飾プライマーとFITC修飾プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
工程(3)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(6)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。その結果、工程(3)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
(1)ジョイントプライマーの合成
本実施例では、標的核酸の鋳型としてはpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類をテンプレートとして用い、PCR増幅により約330塩基対、約200塩基対、および、約100塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(Fj1)とリバースプライマー(Rj1)、フォワードプライマー(Fj2)とリバースプライマー(Rj2)、および、フォワードプライマー(Fj3)とリバースプライマー(Rj3)の3組のプライマーをそれぞれ設計した。それぞれの5’末端側に共通配列KF1とKR1、共通配列KF2とKR2、および、共通配列KF3とKR3を導入した共通配列付加プライマー、KF1−Fj1とKR1−Rj1、KF2−Fj2とKR2−Rj2、および、KF3−Fj3とKR3−Rj3を合成した。この6種の共通配列付加プライマー(ジョイントプライマー)はつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製した3組のプライマーセットを示す。
共通配列KR1:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号80)
プライマーKF1−Fj1:5’−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号81)
プライマーKR1−Rj1:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号82)
共通配列KF2:5’−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)−3’(配列番号83)
共通配列KR2:5’−Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA)−3’(配列番号84)
プライマーKF2−Fj2:5’−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT AGCATTATGAATTATATGGT)−3’(配列番号85)
プライマーKR2−Rj2:5’−Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA TTGTTTACATTTATAGCATC)−3’(配列番号86)
共通配列KF3:5’−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)−3’(配列番号87)
共通配列KR3:5’−Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC)−3’(配列番号88)
プライマーKF3−Fj3:5’−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC TGGTTTTAAAACTCTGATAC)−3’(配列番号89)
プライマーKR3−Rj3:5’−Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC AGTATGATGAGGGTGTAACA)−3’(配列番号90)
本実施例では、工程(1)で作成したジョイントプライマーセットがそれぞれ増幅する3種類のPCR増幅断片に結合できるように、それぞれのジョイントプライマーと同一の共通配列を有するプライマーを3組設計した。3組のそれぞれの一方のプライマーとして5’末端をビオチン化修飾したプライマー、KF1、KF2、および、KF3を合成した。また、3組のそれぞれのもう一方のプライマーとして、5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T34、タグ配列T35、および、タグ配列T36を導入したタグ付きプライマー、T34−X−KR1、T35−X−KR2、および、T36−X−KR3を合成した。この6種の修飾プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。作製した3組のプライマーセットを以下に示す。
プライマーKF1:5’−Biotin−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)−3’(配列番号92)
プライマーT34−X−KR1:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号93)
タグ配列T35:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)−3’(配列番号94)
プライマーKF2:5’−Biotin−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)−3’(配列番号95)
プライマーT35−X−KR2:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA X GAAGCTGTACCGTCACATGA)−3’(配列番号96)
タグ配列T36:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)−3’(配列番号97)
プライマーKF3:5’−Biotin−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)−3’(配列番号98)
プライマーT36−X−KR3:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG X TGGCCTGTGTGACACTATGC)−3’(配列番号99)
前記工程(1)および(2)で実施し作製した6組のプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーKF1−Fj1、プライマーKR1−Rj1、プライマーKF2−Fj2、プライマーKR2−Rj2、プライマーKF3−Fj3、プライマーKR3−Rj3、プライマーKF1、プライマーT34−X−KR1、プライマーKF2、プライマーT35−X−KR2、プライマーKF3、プライマーT36−X−KR3を各8pmolと、各テンプレート10ngを0.2 mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。反応液は次の5種類を用意した。
(i)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)を添加、
(ii)テンプレートとしてEcoRIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iii)テンプレートとしてBamHIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iv)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類全て添加、そして、
(v)テンプレートなし。
これら反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを30回行い、それぞれ目的の配列を有するDNA断片を次のように得た。(i)約360bp、(ii)約230bp、(iii)約130bp、および、(iv)約360bp、約230bp、約130bpの3種類、(v)増幅DNA断片なし(ネガティブコントロールとする)を増幅した。
Gold Colloid(粒径40nm、British BioCell International社製)とストレプトアビジンを混合し、50℃で16時間インキュベートした。6000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去、0.05M 塩化ナトリウム、5mMリン酸バッファー、pH7を添加し混和後、再度50℃で40時間インキュベートした。
インキュベート後、遠心(6000rpm、15分間)を行い、上清を除去し、5mMリン酸バッファー(pH7)を添加した。このバッファー置換を再度行った。
調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
配列番号91に相補的な配列(配列番号100)を有するオリゴヌクレオチドプローブ、配列番号94に相補的な配列(配列番号101)を有するオリゴヌクレオチドプローブ、および、配列番号97に相補的な配列(配列番号102)を有するオリゴヌクレオチドプローブを合成する。それらのプローブ溶液をニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 135、 ミリポア社製)上の3箇所にディスペンサーを用いて、上流側から順に互いに離れた位置でライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。3本の検出ラインを作製した。
オリゴヌクレオチドプローブ38:5’−Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)−3’(配列番号101)。
オリゴヌクレオチドプローブ39:5’−Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)−3’(配列番号102)。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程(4)で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、ビオチン修飾プライマーとアゾベンゼン挿入プライマーのセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストリップを作製した。
工程(3)で作製した(i)〜(v)のPCR産物をそれぞれ変性することなく、直ちに工程(6)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。その結果は以下に示す。
(i):1本目の検出ラインのみ着色。
(ii):2本目の検出ラインのみ着色。
(iii):3本目の検出ラインのみ着色。
(iv):1本目、2本目、3本目の検出ラインがそれぞれ着色。
(v):どの検出ラインも着色は認められなかった。
この結果から、それぞれの標的遺伝子特異的に検出が可能であり、3種類の検出も確認できた。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
(1)人工核酸(アゾベンゼン)挿入プライマーの合成
本実施例では、標的としてプラスミドpUC19を導入した大腸菌(E.coli DH5α)を用いる。pUC19が鋳型となるときに、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)およびリバースプライマー(R)を設計した。それぞれの5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T37およびT38を導入したタグ付きプライマー、T37−X−FおよびT38−X−Rを合成した。この2種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。本検討で作製したプライマーセットを示す。
タグ配列T37:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)−3’(配列番号103)
タグ配列T38:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)−3’(配列番号104)
プライマーF:5’−Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号105)
プライマーR:5’−Dd(TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号106)
プライマーT37−X−F:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号107)
プライマーT38−X−R:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号108)
プラスミドpUC19を導入した大腸菌(E.coli DH5α)のコロニーを取り、1ml水中に混和した。前記工程(1)で作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーFとプライマーRを各5pmolと、前記大腸菌のけん濁液1μlとを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaqPCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、25μlのPCR反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを30回行い、目的の約330bpを増幅した。また、けん濁液を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。
Gold Colloid(10nm、5.7×1012(粒子数/ml)、British BioCell International社製)と抗FITC抗体溶液(5mMリン酸バッファー、pH7)を混合し、20分、室温で静置した。1%BSA、0.1%PEG溶液を1/2量添加し、10000rpmで25分間遠心分離し、上清を除去、1%BSA、0.1%PEG溶液を添加し混和後、10000rpmで25分間遠心分離した。遠心後に上清を除去し、5mMリン酸バッファー(pH7)を添加した。このバッファー置換を再度行った。
オリゴヌクレオチドプローブ40:5’−Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)−FITC−3’(配列番号109)。
配列番号104に相補的な配列(配列番号110)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ41を、ストレプトアビジンと混合する。その混合液をニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 180、 ミリポア社製)にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ41:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−Biotin−3’(配列番号110)。
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。
工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程(2)で検体として大腸菌を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして大腸菌を添加しない場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。
2.タグ領域
3.ポリメラーゼ反応阻害領域(スペーサー領域)
4.第1プライマー(ジョイントプライマー)のプライマー領域
5.第1プライマー(ジョイントプライマー)の共通領域
6.第2プライマーの共通領域
7.第2プライマーのタグ領域
8.第2プライマーのポリメラーゼ反応阻害領域(スペーサー領域)
9.標的核酸配列
10.フォワードプライマー
11.フォワードプライマーのプライマー領域
12.フォワードプライマーのタグ領域
13.リバースプライマー
14.リバースプライマーのプライマー領域
15.リバースプライマーのタグ領域
16.部分二本鎖核酸構造をもつPCR産物
17.標的核酸配列
18.フォワード第1プライマー
19.フォワード第1プライマーのプライマー領域
20.フォワード第1プライマーのタグ領域
21.リバース第1プライマー
22.リバース第1プライマーのプライマー領域
23.リバース第1プライマーのタグ領域
24.第1プライマーによる二本鎖PCR産物
25.フォワード第2プライマー
26.フォワード第2プライマーのプライマー領域
27.フォワード第2プライマーのタグ領域
28.リバース第2プライマー
29.リバース第2プライマーのプライマー領域
30.リバース第2プライマーのタグ領域
31.部分二本鎖核酸構造をもつPCR産物
32.サンプルパッド
33.コンジュゲートパッド
34.捕捉用オリゴヌクレオチドを保持した担体
35.吸収パッド
36.基材
37.テストライン
38.コントロールライン
39.標識分子結合用オリゴヌクレオチド
40.標識分子
41.PCR産物−標識分子複合体
42.多孔質メンブレン
43.捕捉用オリゴヌクレオチド
44.捕捉用オリゴヌクレオチドを各ウェルに保持した担体(マイクロアレイ)
45.捕捉用オリゴヌクレオチドを保持したビーズ担体
Claims (11)
- DNAポリメラーゼにより二本鎖化されないタグ領域を有する2つのプライマーを含むプライマーセットであって、プライマーのタグ領域の塩基配列は互いに異なるものであるプライマーセット、
DNAポリメラーゼ、並びに、
上記プライマーセット及びDNAポリメラーゼを用いた反応により増幅された、両端に2つの一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片を配置する配置領域、
標識物質が結合したオリゴヌクレオチドプローブを含む領域であって、該オリゴヌクレオチドプローブが該増幅断片の一方の一本鎖領域とハイブリダイズする領域、及び、
配置領域の下流にあるオリゴヌクレオチドプローブを結合した領域であって、該オリゴヌクレオチドプローブが該増幅断片のもう一方の一本鎖領域とハイブリダイズする領域、を含むクロマトグラフィー担体、
を含む核酸検出キット。 - DNAポリメラーゼにより二本鎖化されないタグ領域を有する2つのプライマーを含むプライマーセットであって、プライマーのタグ領域の塩基配列は互いに異なるものであるプライマーセット、
DNAポリメラーゼ、
標識物質が結合したオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、
上記プライマーセット及びDNAポリメラーゼを用いた反応により増幅された、両端に2つの一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片の一方の一本鎖領域と、上記標識物質が結合したオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイズによる複合体を配置する配置領域、
及び、
配置領域の下流にあるオリゴヌクレオチドプローブを結合した領域であって、該オリゴヌクレオチドプローブが該増幅断片のもう一方の一本鎖領域とハイブリダイズする領域、を含むクロマトグラフィー担体、
を含む核酸検出キット。 - DNAポリメラーゼにより二本鎖化されないタグ領域を有するプライマー、およびビオチン修飾プライマーを含むプライマーセット、
DNAポリメラーゼ、並びに、
上記プライマーセット及びDNAポリメラーゼを用いた反応により増幅された、一方の端部に一本鎖領域、他方の端部にビオチンを有する二本鎖DNA増幅断片を配置する配置領域、
標識物質が結合したビオチン結合タンパク質を含む領域であって、該ビオチン結合タンパク質が該増幅断片のビオチンと複合体を形成する領域、及び、
配置領域の下流にあるオリゴヌクレオチドプローブを結合した領域であって、該オリゴヌクレオチドプローブが該増幅断片の一本鎖領域とハイブリダイズする領域、
を含むクロマトグラフィー担体、
を含む核酸検出キット。 - DNAポリメラーゼにより二本鎖化されないタグ領域を有するプライマー、およびビオチン修飾プライマーを含むプライマーセット、
DNAポリメラーゼ、
標識物質が結合したビオチン結合タンパク質、並びに、
上記プライマーセット及びDNAポリメラーゼを用いた反応により増幅された、一方の端部に一本鎖領域、他方の端部にビオチンを有する二本鎖DNA増幅断片と、上記標識物質が結合したビオチン結合タンパク質との複合体を配置する配置領域、及び、
配置領域の下流にあるオリゴヌクレオチドプローブを結合した領域であって、該オリゴヌクレオチドプローブが該増幅断片の一本鎖領域とハイブリダイズする領域、
を含むクロマトグラフィー担体、
を含む核酸検出キット。 - (i)標的核酸の鋳型にハイブリダイズ可能な配列、及び、該鋳型にハイブリダイズ不可能な第1共通配列を有する第1プライマー、並びに該鋳型の相補鎖にハイブリダイズ可能な配列、及び、該鋳型の相補鎖にハイブリダイズ不可能な第2共通配列を有する第2プライマーからなる第1プライマーセット、
(ii)前記第1または第2の共通配列およびDNAポリメラーゼにより二本鎖化されないタグ領域を有するプライマー、及び、ビオチン修飾された他方の共通配列からなるプライマーを含む第2プライマーセット、
(iii)DNAポリメラーゼ、並びに、
(iv)クロマトグラフィー担体であって、上記第1プライマーセット、第2プライマーセット及びDNAポリメラーゼを用いた反応により増幅された、一方の端部に一本鎖領域、他方の端部にビオチンを有する二本鎖DNA増幅断片を配置する配置領域、
標識物質が結合したビオチン結合タンパク質を含む領域であって、該ビオチン結合タンパク質が該増幅断片のビオチンと複合体を形成する領域、及び、
配置領域の下流にあるオリゴヌクレオチドプローブを結合した領域であって、該オリゴヌクレオチドプローブが該増幅断片の一本鎖領域とハイブリダイズする領域、
を含むクロマトグラフィー担体、
を含む核酸検出キット。 - DNAポリメラーゼにより二本鎖化されないタグ領域が、天然のヌクレオチドからなる、請求項1〜5のいずれかに記載の核酸検出キット。
- DNAポリメラーゼにより二本鎖化されないタグ領域を有するプライマーが、標的核酸の鋳型にハイブリダイズ可能な配列とタグ領域との間に、ポリメラーゼ反応阻害領域からなるスペーサー構造を有する、
請求項1〜6のいずれかに記載の核酸検出キット。 - 前記プライマーセットおよび前記DNAポリメラーゼを用いたPCR反応により、天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片が得られる、
請求項1〜7のいずれかに記載の核酸検出キット。 - 天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域が、二本鎖DNA領域と同一方向からなる配列である、
請求項8に記載の核酸検出キット。 - 下記工程(1)〜(3):
(1)プライマーセットを用いて標的核酸を増幅し、天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片を得る工程、
(2)前記増幅断片と標識物質との、核酸ハイブリダイゼーションまたはビオチン−ビオチン結合タンパク質の相互作用を介した結合、クロマトグラフィー担体上の配置領域への前記増幅断片の配置、およびクロマトグラフィー担体上での前記増幅断片の拡散を行う工程、
および、
(3)前記増幅断片をクロマトグラフィー担体上の領域に保持されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ、クロマトグラフィー担体上の領域に保持されたオリゴヌクレオチドプローブ、増幅核酸、および標識物質を含む複合体を形成し、前記複合体中の標識物質を目視検出する工程
を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の核酸検出キットを用いた核酸検出方法。 - 1分子の前記複合体に含まれる標識物質の分子数が1であり、
前記複合体中において、(クロマトグラフィー担体上の領域に保持されたオリゴヌクレオチドプローブの分子数):(クロマトグラフィー担体上の領域に保持されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした増幅断片の分子数)=1:1である、
請求項10に記載の核酸検出方法。
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