JP6616574B2 - 目視判定可能な遺伝子検査 - Google Patents
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Description
(1)下記(i)および(ii)をハイブリダイズさせ、目視で検出可能な状態にすることを含む遺伝子解析方法:
(i)ストリップ上に固定したオリゴヌクレオチドプローブ;
(ii)下記(a)および(b)を、核酸試料を鋳型とする一回または複数回の熱サイクル処理を経るライゲーション処理に供して増幅した一本鎖ライゲーション産物:
(a)前記核酸試料に相補的な第一の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび前記プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列または標識部分を含むクエリーオリゴ;
(b)前記核酸試料に相補的であって、前記第一の一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよびタグ配列または標識部分を含むコモンオリゴ、
(2)サイクリングライゲーション反応を行う(1)の方法、
(3)核酸試料およびオリゴヌクレオチドがDNAである、(1)または(2)の方法、
(4)ストリップが、ストリップ上の異なる位置に配された複数のプローブを固定したプローブ領域と、前記プローブ領域とは異なる位置に配された位置マーカー領域とを備えたクロマトグラフィー本体である、(1)〜(3)のいずれかの方法、
(5)遺伝子差異を検出するためのものである、(1)〜(4)のいずれかの方法、
(6)遺伝子多型を検出するためのものである、(1)〜(5)のいずれかの方法、
(7)オリゴヌクレオチドプローブを固定したストリップ、
対象とする核酸試料に相補的な配列および前記プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド、ならびに
対象とする核酸試料に相補的であって、該一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドおよび標識物質またはタグ配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド、
を含む、(1)〜(6)のいずれかの遺伝子検査方法のためのキット。
本発明の対象となる核酸試料は、ヌクレオチドが重合した分子であり、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド等を含む。また、あらゆる種類の一本鎖または二本鎖のDNA等を含む。さらに、天然のヌクレオチドのみで形成されたもの、および非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むもの、あるいは合成核酸も含む。典型的には、核酸試料はDNAである。
本発明の遺伝子解析方法では、オリゴヌクレオチドプローブが固定された固相担体を用いる。好ましくは、膜上にオリゴヌクレオチドプローブを結合させたアレイである「ストリップ」を固相担体として用いる。このような固相担体は、遺伝子解析方法の実施の前に調製してもよいし、市販品を使用してもよい。固相担体は、好ましくは異なる位置に複数のプローブが固定されたプローブ領域を有することが好ましい。また、プローブ領域とは別の位置に、位置マーカー領域を有することが好ましい。本明細書において、ストリップに固定されたオリゴヌクレオチドプローブを、検出プローブとも称する。
本発明の遺伝子解析方法は、クエリーオリゴおよびコモンオリゴを調製することを含む。
上記クエリーオリゴおよびコモンオリゴを、核酸試料を鋳型とするライゲーション反応に供することで固相担体にハイブリダイズさせるライゲーション産物を得ることができる。本明細書にいうライゲーションとは、対応する核酸試料に結合したクエリーオリゴとコモンオリゴを連結する工程である。核酸試料に結合したクエリーオリゴとコモンオリゴは互いに隣接し合った状態になっているので、リガーゼ等を作用させてライゲーション反応を行うことにより、連結部を介してクエリーオリゴとコモンオリゴを連結させることができる。この際のライゲーション反応は複数の遺伝子を同時に増幅させることができるマルチプレックス反応が可能である。増幅できる遺伝子数は2〜15である。好ましくは、3〜10であり、さらに好ましくは、4〜8である。
多量のライゲーション産物を得るためにLCRを用いると、上述の通り検査精度の問題がある。そこで本発明者らはクエリーオリゴおよびコモンオリゴの相補鎖を加えることなく、90℃以上の熱処理と50℃程度のライゲーション反応を組合せることで、さらに高感度かつ正確に遺伝子多型の判定等を行うことを可能とした(図6)。この温度調整方法は、単純なライゲーション反応とは異なり、また、クエリーオリゴおよびコモンオリゴの相補鎖を入れないことからLCRとも異なった新しいライゲーション方法である。本発明者らは熱処理とライゲーション反応を組み合わせたこの温度調節方法をサイクリングライゲーション反応(CLR:Cycling Ligation Reaction)と命名した。本明細書において、この反応を「サイクリングライゲーション反応」と称する。
ライゲーション処理によって得られたライゲーション産物は、検出プローブが固定された固相担体に供され、検出される。例えば、ストリップなどのクロマトグラフィー本体を用いる場合、ライゲーション産物を展開液に加え、必要に応じてバッファー、発色液等を加えて混合し、クロマトグラフィーによってハイブリダイゼーション反応を行う。本発明の方法を用いると、遺伝子解析の結果が目視で検出可能な状態となる。
本発明の方法による標的遺伝子変異の検出を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。ライゲーション反応までの手順を図1に示した。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製
4.ライゲーション反応
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)を用いた検出。
また、ヒト由来のゲノムDNA 4サンプル(A04、B03、C03、D03)を実験に供試した。
1−1.プライマーの調製
ヒトゲノム中のCYP2D6遺伝子に特異的な以下の表1に示すプライマーC12〜C14(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。C12プライマーはCYP2D6遺伝子の遺伝子多型であるrs16947(CがTに変異)、C14プライマーは同遺伝子多型であるrs1065852(CがTに変異)を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。なお、図面ではrs16947を2850C>T、rs1065852を100C>Tと記載している。
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムDNAはヒト由来のものを用いた。ゲノムDNAを表1のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、QIAGEN社のMultiplex PCR Kitを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表2に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で15分後、95℃で30秒、68℃で2分を40サイクル、その後4℃に下げる)を行った。そして、増幅したサンプルはAgilent Technologies社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図2に示す。
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)を準備した。プローブの塩基配列を表3に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ2種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの(WTと標記)と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの(MTと標記)からなる。コモンオリゴの3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されており、クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。また、クエリーオリゴとタグ配列の間にはspacer C3が挿入されている。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴDNAの位置は図3に記載した。
ライゲーション反応を行うために、コモンオリゴの5’末端にリン酸基を付加した。リン酸基を付加する試薬として、東洋紡社のT4 Polynucleotide Kinaseを使用した。
表4に示す試薬を調製した。なお、コモンオリゴの最適濃度を調べる目的で、調製液に加えるコモンオリゴ濃度を1μM、10μM、50μM、100μMの4種類とした。
コモンオリゴ溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、37℃で30分後、95℃で3分、その後4℃に下げ、反応を終了した。
リン酸基付加反応を行ったコモンオリゴ溶液全量(20μL)にクエリーオリゴ20μLを混合した。なお、各コモンオリゴ溶液に対して表5の組成でクエリーオリゴを混合した。
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表6のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で5分後、58℃で15分、95℃で2分、その後37℃に下げ、反応を終了した。
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、ホルムアミドを30%含有するTEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を用いて実施した。反応液の組成を表7に示す。
上記反応液各50μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を表8および図4に示す。図4に示すように、3.ライゲーション用プローブの調製でコモンオリゴの濃度を500nM、クエリーオリゴを2.5μMとした場合に予想される位置で発色が見られ、本手法が効果を有することが確認できた。
本発明の検出方法による標的遺伝子変異の検出感度をさらに上げる方法として、次の手順で実験を行った。以下、これらの順序に従って説明する。ライゲーション反応までの手順を図7に示す。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製
4.サイクリングライゲーション反応
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)を用いた検出
また、ヒト由来のゲノムDNA(A、B、C、D、E、F、G)を実験に供試した。
ヒトゲノム中のCYP2D6遺伝子に特異的な以下の表9に示すプライマーC09、C10、C12、C14およびポジティブコントロールとしてG3PDH遺伝子に特異的なプライマーコントロール(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。C09プライマーはCYP2D6遺伝子の遺伝子多型であるrs1135840(GがCに変異)、C10プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるrs5030865(GがAに変異)、C12プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるrs16947(CがTに変異)、C14プライマーは同遺伝子多型であるrs1065852(CがTに変異)を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。なお、図面ではrs1135840を4180G>C、rs5030865を1758G>A、rs16947を2850C>T、rs1065852を100C>Tと記載している。
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムDNAはヒト由来のものを用いた。ゲノムDNAを表9のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、KAPABIOSYSTEMS社のKAPA2G FAST Multiplexを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表10に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で3分後、95℃で15秒、60℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分、最後に4℃に下げる)を行った。そして、増幅したサンプルはAgilent Technologies社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図8に示す。
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)を準備した。プローブの塩基配列を表11に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ2種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの(WTと標記)と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの(MTと標記)からなる。コモンオリゴの5’末端にはリン酸基[P]が修飾されており、3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されている。なお、実施例1ではコモンオリゴの5’末端にリン酸基を修飾する反応を行っていたが、今回は操作時間の短縮を目的とし、オリゴ合成段階で5’末端にリン酸基を修飾したコモンオリゴを用いた。クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。また、クエリーオリゴとタグ配列の間にはspacer C3が挿入されている。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴDNAの位置は図9に記載した。なお、本実施例ではTBA社が販売するクロマトグラフィー本体のE12シリーズを使用した。実施例1で使用したD6シリーズより固定化されたオリゴDNAの数が増え、12種類になっている(F−1〜F−12)。
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表12のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で1分後、58℃で5分、その後、95℃で15秒、58℃で30秒を30サイクル、その後95℃で1分加熱し、37℃に温度を下げ反応を終了した。
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、TEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を用いて実施した。反応液の組成を表13に示す。
上記反応液各20μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は37℃で行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図10に示すように、既知の遺伝子多型とクロマトグラフィー本体による遺伝子多型解析結果がすべて一致した。サイクリングライゲーション反応によりクロマトグラフィー本体上のラインが実施例1よりもしっかりと目視できるようになった。これらのことから、本手法が簡便な遺伝子多型の判定法として有効であることが示された。
ヒトの遺伝子の遺伝子多型だけでなく、本発明の検出方法が動物種判定法としても利用できることを示すため、下記の手順で実験を行った。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製
4.サイクリングライゲーション反応
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)を用いた検出
また、ヒト由来のゲノムDNA、ウシ由来のゲノムDNA、ブタ由来のゲノムDNA、ニワトリ由来のゲノムDNA、ウシとブタとニワトリ由来のDNAを1:1:1で混合したDNAを実験に供試した。
ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリのゲノム中のミトコンドリアDNAの中から、これら4種に共通のDNA配列を見つけ出し、表14に示すプライマー(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムDNAはヒト、ウシ、ブタ、ニワトリ由来のものを用いた。ゲノムDNAを表14のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、KAPABIOSYSTEMS社のKAPA2G FAST Multiplexを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表15に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で3分後、95℃で15秒、57℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分、最後に4℃に下げる)を行った。そして、増幅したサンプルはAgilent Technologies社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図11に示す。
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)を準備した。プローブの塩基配列を表16に示す。ライゲーション用プローブは各動物種にコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ1種類を作成した。また、ポジティブコントロール用として、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリに共通のコモンオリゴ、クエリーオリゴを作成した。コモンオリゴの5’末端にはリン酸基[P]が修飾されており、3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されている。クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。また、本実施例ではクエリーオリゴとタグ配列の間にはspacer C3は挿入されていない。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴDNAの位置は図12に記載した。なお、本実施例ではTBA社が販売するクロマトグラフィー本体のF12シリーズを使用した。実施例2で使用したE12シリーズとは固定化されたオリゴDNAの位置が多少異なっている。
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表17のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で1分後、58℃で5分、その後、95℃で15秒、58℃で30秒を30サイクル、その後95℃で1分加熱し、37℃に温度を下げ反応を終了した。
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、TEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表18に示す。
上記反応液各20μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は37℃で行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図13に示すように、本手法によりクロマトグラフィー本体による各動物種判定が可能であった。このことから、本手法が簡便な動物種判定手法として有効であることを示した。
ヒトの遺伝子の遺伝子多型だけでなく、本発明の検出方法がウイルス等の型判定法としても利用できることを示すため、下記の手順で実験を行った。検出対象はヒトパピローマウイルスの16型および18型とした。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製
4.サイクリングライゲーション反応
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)を用いた検出
また、実験材料として、HPV16の遺伝子断片およびHPV18の遺伝子断片を導入したプラスミド、および、HPV16に感染していることが既知の臨床検体1サンプルを用いた。
表19に示すHPVの16型および18型に特異的なプライマーおよびポジティブコントロールとしてヒトのG3PDH遺伝子に特異的なプライマー(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したDNAはHPVの16型由来のDNA配列が含まれるプラスミドおよび18型由来のDNA配列が含まれるプラスミドを用いた。これらプラスミドには表19で示したHPV16およびHPV18のプライマー配列が含まれている。また、HPV型判定の性能を評価するために、HPV16の感染が既知のヒトゲノムDNAを実験に用いた。これらDNAを表19のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、KAPABIOSYSTEMS社のKAPA2G FAST Multiplexを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表20に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で3分後、95℃で15秒、57℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分、最後に4℃に下げる)を行った。そして、増幅したサンプルはAgilent Technologies社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図14に示す。
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)を準備した。プローブの塩基配列を表21に示す。ライゲーション用プローブはHPV16、HPV18およびポジティブコントロールのヒトG3PDH遺伝子にそれぞれコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ1種類を作成した。コモンオリゴの5’末端にはリン酸基[P]が修飾されており、3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されている。クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。また、本実施例ではクエリーオリゴとタグ配列の間にはspacer C3は挿入されていない。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴDNAの位置は図12に記載した。なお、本実施例ではTBA社が販売するクロマトグラフィー本体のF12シリーズを使用した。実施例2で使用したE12シリーズとは固定化されたオリゴDNAの位置が多少異なっている。
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表22のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で1分後、58℃で5分、その後、95℃で15秒、58℃で30秒を30サイクル、その後95℃で1分加熱し、37℃に温度を下げ反応を終了した。
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、TEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表23に示す。
上記反応液各20μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は37℃で行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図15に示すように、本手法によりクロマトグラフィー本体によるHPVの16型、18型判定が可能であった。このことから、本手法が簡便なHPV型判定手法として有効であることを示した。
クエリータグのスペーサーの有無が検査の結果に影響を与えるかを調べるため、次の手順で実験を行った。以下、これらの順序に従って説明する。
1.プライマーの調製
2.標的遺伝子の増幅
3.ライゲーション用プローブの調製(スペーサー無し)
4.サイクリングライゲーション反応
5.クロマトグラフィー本体(PAS:Printed Array Strip)用いた検出
また、ヒト由来のゲノムDNA 3サンプル(A12、B12、C12)を実験に供試した。
ヒトゲノム中のCYP2D6遺伝子に特異的な以下の表24に示すプライマーC09〜C14およびポジティブコントロールとしてG3PDH遺伝子に特異的なプライマーコントロール(ユーロフィンジェノミクス社製)を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、100μMの濃度に調整された。C09プライマーはCYP2D6遺伝子の遺伝子多型であるrs1135840(GがCに変異)、C12プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるrs16947(CがTに変異)、C14プライマーは同遺伝子多型であるrs1065852(CがTに変異)を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。なお、実施例の図ではrs1135840を4180G>C、rs16947を2850C>T、rs1065852を100C>Tと記載している。
2−1.反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムDNAはヒト由来のものを用いた。ゲノムDNAを表24のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、KAPABIOSYSTEMS社のKAPA2G FAST Multiplexを使用した。サーマルサイクラーとして、eppendorf社のMastercycler(登録商標) gradientを使用した。表25に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
調製したサンプル溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクル反応(95℃で3分後、95℃で15秒、60℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分、最後に4℃に下げる)を行った。
3−1.ライゲーション用のプローブの調製
2.で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ(コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはTBA社製)を準備した。プローブの塩基配列を表26に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ1種類、クエリーオリゴ2種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの(WTと標記)と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの(MTと標記)からなる。コモンオリゴの5’末端にはリン酸基[P]が修飾されており、3’末端にはビオチン[Biotin]が標識されている。クエリーオリゴの5’末端にはクロマトグラフィー本体(PAS)に固定化されたオリゴDNAと相補的なタグ配列が付加されている(配列情報非開示)。クエリーオリゴとタグ配列の間にはspacer C3は挿入されていない。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴDNAの位置は図9に記載した。なお、本実施例ではTBA社が販売するクロマトグラフィー本体のE12シリーズを使用した。
4−1.反応液調製
ライゲーション反応における組成は表27のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、NEW ENGLAND BioLabs社のTaq DNA Ligaseを使用した。
ライゲーション溶液をPCRチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、95℃で1分後、58℃で5分、その後、95℃で15秒、58℃で30秒を30サイクル、その後95℃で1分加熱し、37℃に温度を下げ反応を終了した。
5−1.ハイブリダイゼーション反応
4.で得られた一本鎖DNAを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液(TBA社製)、ラテックス液(TBA社製)、TEバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表28に示す。
上記反応液各20μLを1.5mLチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は37℃で行った。反応液は約20分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図16に示すように、既知の遺伝子多型とクロマトグラフィー本体による遺伝子多型解析結果がすべて一致し、かつ、spacer C3がある場合と無い場合の結果も一致した。このことから、本手法にスペーサーの有無は影響を与えないことを示した。
Claims (6)
- 下記(i)および(ii)をハイブリダイズさせ、目視で検出可能な状態にすることを含む遺伝子解析方法:
(i)ストリップ上に固定したオリゴヌクレオチドプローブ;
(ii)下記(a)および(b)を、核酸試料を鋳型とする20〜40回の熱サイクル処理を経る、1サイクルの反応時間が2分以内であるサイクリングライゲーション反応を行うライゲーション処理に供して増幅した一本鎖ライゲーション産物:
(a)前記核酸試料に相補的な第一の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび前記プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列もしくは目視での検出を可能とする標識部分を含むクエリーオリゴ;
(b)前記核酸試料に相補的であって、前記第一の一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよびタグ配列もしくは目視での検出を可能とする標識部分を含むコモンオリゴ、
であって、クエリーオリゴおよびコモンオリゴのいずれかがタグ配列を含む、およびクエリーオリゴおよびコモンオリゴのいずれかが標識部分を含む、ものである、遺伝子解析方法。 - 核酸試料およびオリゴヌクレオチドがDNAである、請求項1に記載の方法。
- ストリップが、ストリップ上の異なる位置に配された複数のプローブを固定したプローブ領域と、前記プローブ領域とは異なる位置に配された位置マーカー領域とを備えたクロマトグラフィー本体である、請求項1または2に記載の方法。
- 遺伝子差異を検出するためのものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子多型を検出するためのものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブを固定したストリップ、
対象とする核酸試料に相補的な配列および前記プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド、ならびに
対象とする核酸試料に相補的であって、該一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する配列および標識物質またはタグ配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド、
を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子解析方法のためのキット。
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