TW202204640A - 判別屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌之erm(41)基因之單鹼基突變之方法、用於該方法之引子組及探針 - Google Patents
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Abstract
本發明之一個以上之實施方式提供用以判別屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中erm(41)基因之單鹼基突變之新方法。
本發明之一個以上之實施方式係關於一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中相當於erm(41)基因之第28位之鹼基之方法，其包括於判定對象之抗酸菌之基因組DNA中檢測如下指標鹼基序列之步驟，該指標鹼基序列於上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，存在上述指標鹼基序列表示上述鹼基為胞嘧啶，不存在上述指標鹼基序列表示上述鹼基為胸腺嘧啶。
Description
本發明關於一種判別屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌之erm(41)基因之單鹼基突變之方法、用於該方法之引子組及探針。又，本發明關於一種判別抗酸菌之erm(41)基因之單鹼基突變之方法、用於該方法之引子組及探針。
抗酸菌為抗酸性、非移動性之革蘭氏陽性桿菌。抗酸菌大體分為結核菌群(Mycobacterium tuberculosis complex，結核分枝桿菌複合群)與非結核性抗酸菌(Nontuberculous mycobacteria，非結核分枝桿菌；NTM)兩大類。
非結核性抗酸菌迄今為止已報告有170種以上之菌種，其中確定對人具有病原性的約30種。
非結核性抗酸菌症之中，膿腫分枝桿菌複合群(Mycobacteroides abscessus complex)症由於現有之抗菌藥難以奏效、尚未確立有效之治療法，故患者人數累積，重症患者亦不斷增多。作為致病菌群之膿腫分枝桿菌複合群包含膿腫分枝桿菌膿腫亞種(Mycobacteroides abscessus subsp. abscessus)、膿腫分枝桿菌馬賽亞種(Mycobacteroides abscessus subsp. massiliense)及膿腫分枝桿菌博萊亞種(Mycobacteroides abscessus subsp. bolletii)3個亞種。再者，有時將Mycobacteroides abscessus記為Mycobacterium abscessus。
專利文獻1中揭示有一種用以判別膿腫分枝桿菌複合群之上述3個亞種之引子組，該引子組包含第1引子與第2引子，第1引子係將於3個亞種中一致之膜轉運體基因之下游區域作為標靶，以每個亞種擴增產物大小不同之方式設計，第2引子係將於3個亞種中一致之ATP結合盒轉運體基因之下游區域作為標靶，以每個亞種擴增產物大小不同之方式設計。
已知於膿腫分枝桿菌複合群中，會因基因突變引發對抗生素之耐藥性。膿腫分枝桿菌複合群中存在大環內酯敏感性株、及於給藥期間耐藥性化之誘導耐藥性株。已知該誘導耐藥性之有無係與erm(41)基因之單鹼基多型有關，erm(41)基因之第28位鹼基為胸腺嘧啶之T28株具有誘導耐藥性，上述鹼基為胞嘧啶之C28株則為敏感性(參照非專利文獻1)。
另一方面，作為檢測肺炎黴漿菌等細菌中之大環內酯系抗生素耐藥性突變菌之方法，專利文獻2中記載有使於標準株與突變菌株中行為不同之水解探針接觸受檢體之生物學試樣，利用即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)進行檢測之方法。
作為判別基因之單鹼基多型之技術，已知利用對偶基因特異性引子(Allele-specific primer)之引子延伸反應(包括核酸擴增法)之技術。所謂對偶基因特異性引子係取決於作為標靶之單鹼基多型之鹼基種而於引子延伸反應效率存在明顯差異之引子。因此，例如使用對偶基因特異性引子實施PCR，對其擴增產物量進行解析，藉此可特定作為標靶之單鹼基多型之鹼基種。但於該情形時，若未嚴格規定反應條件，則會出現偽陽性之問題。專利文獻3中有關於偽陽性反應較少之單鹼基多型判別法之記載，其係使自3'末端起第2位及第3位之鹼基成為特定模式，使用3'末端鹼基與作為標靶之單鹼基多型相對應之對偶基因特異性引子。然而，於用以直接檢測單鹼基多型之對偶基因特異性引子之設計中，無論如何均需於引子之3'末端附近設置與單鹼基多型部位相對應之部位，設計靈活性低，根據單鹼基多型之周邊序列，有時難以選取同時兼備足以據此判別之引子延伸效率與較少之偽陽性反應之引子。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本專利特開2019-97493號公報
專利文獻2：國際公開WO2013/136818
專利文獻3：日本專利第3859678號公報
[非專利文獻]
非專利文獻1：J Antimicrob Chemother 2017; 72: 1669-1677
[發明所欲解決之問題]
如上所述，已知膿腫分枝桿菌複合群之大環內酯誘導耐藥性之有無與erm(41)基因之單鹼基多型有關，erm(41)基因之第28位鹼基為胸腺嘧啶之T28株具有誘導耐藥性，上述鹼基為胞嘧啶之C28株則為敏感性。因此，判別為T28株或為C28株於推定膿腫分枝桿菌複合群之大環內酯敏感性之方面有用。
為了取得用以直接檢測單鹼基多型之對偶基因特異性引子，如專利文獻3之記載，需於限定之序列候補之中設計兼備足以據此判別之引子延伸效率與較少之偽陽性反應之引子，不易實施。
因此，本發明之一個以上之實施方式提供一種用以判別屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中之erm(41)基因之第28位鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶之新方法。又，本發明之一個以上之實施方式提供一種用以判別抗酸菌中之erm(41)基因之第28位鹼基為胞嘧啶之新方法。
[用以解決問題之技術手段]
本發明者等人在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌之基因組DNA上驚喜地發現了一種於erm(41)基因之第28位鹼基為胞嘧啶之情形時存在、但於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在的指標鹼基序列。並發現可基於該指標鹼基序列之有無來判別判定對象之抗酸菌之erm(41)基因之第28位鹼基，從而完成以下之發明。
[1]
一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶之方法，其包括：
於判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA中檢測如下指標鹼基序列之步驟，該指標鹼基序列於上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，
檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶，
未檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胸腺嘧啶。
[2]
如[1]記載之方法，其中上述指標鹼基序列為序列編號2之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之第1鹼基序列或與上述第1鹼基序列互補之第2鹼基序列。
[3]
如[2]記載之方法，其中上述第1鹼基序列中之至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
[4]
一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性之方法，其包含如[1]至[3]中任一項記載之方法，
檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌對大環內酯系抗生素具有敏感性，
未檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌對大環內酯系抗生素不具有敏感性。
[5]
一種引子組，其係用以在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，
該引子組包含第1引子與第2引子，
第1引子含有於3'末端包含鹼基序列f12之聚核苷酸，鹼基序列f12能夠與上述指標鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之部分鹼基序列f11之互補鹼基序列雜交，
第2引子含有於3'末端包含鹼基序列r12之聚核苷酸，鹼基序列r12能夠與較上述指標鹼基序列所含之上述部分鹼基序列f11之3'末端更位於3'末端側的連續10個鹼基以上之部分鹼基序列r11雜交。
[6]
如[5]記載之引子組，其中上述指標鹼基序列為序列編號2之鹼基序列所含之連續20個鹼基以上之第3鹼基序列。
[7]
如[6]記載之引子組，其中上述第3鹼基序列所含之自上述部分鹼基序列f11之5'末端之鹼基至部分鹼基序列r11之3'末端之鹼基的鹼基序列中之至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列所含之連續20個鹼基以上之鹼基序列。
[8]
如[6]或[7]記載之引子組，其中上述部分鹼基序列f11為
(f11-12-1)序列編號2之鹼基序列之第4624～4668位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-18-1)序列編號2之鹼基序列之第2356～2397位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-20-1)序列編號2之鹼基序列之第2624～2663位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-22-1)序列編號2之鹼基序列之第4044～4083位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-24-1)序列編號2之鹼基序列之第6535～6575位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-26-1)序列編號2之鹼基序列之第7478～7520位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、或
(f11-28-1)序列編號2之鹼基序列之第7629～7673位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列，
上述部分鹼基序列r11為
(r11-13-1)序列編號2之鹼基序列之第4694～4740位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-19-1)序列編號2之鹼基序列之第2672～2711位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-21-1)序列編號2之鹼基序列之第3539～3583位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-23-1)序列編號2之鹼基序列之第5061～5103位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-25-1)序列編號2之鹼基序列之第6566～6605位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-27-1)序列編號2之鹼基序列之第7931～7976位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、或
(r11-29-1)序列編號2之鹼基序列之第8302～8346位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
[9]
如[5]至[8]中任一項記載之引子組，其中上述第1引子及上述第2引子之一者進而包含作為能夠與標記物質結合之標籤或標記物質的標記部，另一者進而包含作為能夠與固相載體結合之標籤的結合部。
[10]
一種套組，其係用以在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，該套組包含
如[9]記載之引子組、與
固相載體，其至少一部分包含能夠與上述結合部結合之部分。
[11]
一種探針，其係用以在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，
該探針含有如下聚核苷酸，其包含能夠與上述指標鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之部分鹼基序列p1雜交的鹼基序列。
[12]
如[11]記載之探針，其中上述指標鹼基序列為序列編號2之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之第1鹼基序列或與上述第1鹼基序列互補之第2鹼基序列。
[13]
如[12]記載之探針，其中上述部分鹼基序列p1中之至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
[14]
如[12]或[13]記載之探針，其中上述部分鹼基序列p1為
(p1-12-1)序列編號2之鹼基序列之第4624～4668位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-18-1)序列編號2之鹼基序列之第2356～2397位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-20-1)序列編號2之鹼基序列之第2624～2663位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-22-1)序列編號2之鹼基序列之第4044～4083位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-24-1)序列編號2之鹼基序列之第6535～6575位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-26-1)序列編號2之鹼基序列之第7478～7520位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-28-1)序列編號2之鹼基序列之第7629～7673位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-13-1)序列編號2之鹼基序列之第4694～4740位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-19-1)序列編號2之鹼基序列之第2672～2711位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-21-1)序列編號2之鹼基序列之第3539～3583位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-23-1)序列編號2之鹼基序列之第5061～5103位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-25-1)序列編號2之鹼基序列之第6566～6605位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-27-1)序列編號2之鹼基序列之第7931～7976位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、或
(p1-29-1)序列編號2之鹼基序列之第8302～8346位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
[15]
一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶之方法，其包括：
將判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA衍生的聚核苷酸作為模板，使用如[5]至[9]中任一項記載之引子組，進行核酸擴增反應；
對上述核酸擴增反應之擴增產物進行檢測；及
於檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶，於未檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述鹼基為胸腺嘧啶。
[16]
一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性之方法，其包含如[15]記載之方法，該方法包括：
於檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素具有敏感性，於未檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素不具有敏感性。
[17]
一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶之方法，其包括：
將判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA衍生的聚核苷酸、與如[11]至[14]中任一項記載之探針於能夠雜交之條件下進行培養；
對上述基因組DNA或上述聚核苷酸與上述探針之雜交進行檢測；及
於檢測到上述雜交之情形時，判定上述判定對象之抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶，於未檢測到上述雜交之情形時，判定上述鹼基為胸腺嘧啶。
[18]
一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性之方法，其包含如[17]記載之方法，該方法包括：
於檢測到上述雜交之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素具有敏感性，於未檢測到上述雜交之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素不具有敏感性。
[19]
一種判定抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶之方法，其包括：
於判定對象之抗酸菌之基因組DNA中檢測如下指標鹼基序列，該指標鹼基序列於上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，
檢測到上述指標鹼基序列表示上述判定對象之抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶。
[20]
如[19]記載之方法，其中上述指標鹼基序列為序列編號2之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之第1鹼基序列或與上述第1鹼基序列互補之第2鹼基序列。
[21]
如[20]記載之方法，其中上述第1鹼基序列中之至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
[22]
一種判定抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性之方法，其包含如[19]至[21]中任一項記載之方法，
檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌對大環內酯系抗生素具有敏感性。
[23]
一種引子組，其係用以於抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，
該引子組包含第1引子與第2引子，
第1引子含有於3'末端包含鹼基序列f12之聚核苷酸，鹼基序列f12能夠與上述指標鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之部分鹼基序列f11之互補鹼基序列雜交，
第2引子含有於3'末端包含鹼基序列r12之聚核苷酸，鹼基序列r12能夠與較上述指標鹼基序列所含之上述部分鹼基序列f11之3'末端更位於3'末端側的連續10個鹼基以上之部分鹼基序列r11雜交。
[24]
如[23]記載之引子組，其中上述指標鹼基序列為序列編號2之鹼基序列所含之連續20個鹼基以上之第3鹼基序列。
[25]
如[24]記載之引子組，其中上述第3鹼基序列所含之自上述部分鹼基序列f11之5'末端之鹼基至部分鹼基序列r11之3'末端之鹼基的鹼基序列中之至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列所含之連續20個鹼基以上之鹼基序列。
[26]
如[24]或[25]記載之引子組，其中上述部分鹼基序列f11為
(f11-12-1)序列編號2之鹼基序列之第4624～4668位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-18-1)序列編號2之鹼基序列之第2356～2397位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-20-1)序列編號2之鹼基序列之第2624～2663位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-22-1)序列編號2之鹼基序列之第4044～4083位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-24-1)序列編號2之鹼基序列之第6535～6575位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-26-1)序列編號2之鹼基序列之第7478～7520位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、或
(f11-28-1)序列編號2之鹼基序列之第7629～7673位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列，
上述部分鹼基序列r11為
(r11-13-1)序列編號2之鹼基序列之第4694～4740位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-19-1)序列編號2之鹼基序列之第2672～2711位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-21-1)序列編號2之鹼基序列之第3539～3583位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-23-1)序列編號2之鹼基序列之第5061～5103位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-25-1)序列編號2之鹼基序列之第6566～6605位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-27-1)序列編號2之鹼基序列之第7931～7976位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、或
(r11-29-1)序列編號2之鹼基序列之第8302～8346位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
[27]
如[23]至[26]中任一項記載之引子組，其中上述第1引子及上述第2引子之一者進而包含作為能夠與標記物質結合之標籤或標記物質的標記部，另一者進而包含作為能夠與固相載體結合之標籤的結合部。
[28]
一種套組，其係用以於抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，該套組包含
如[27]記載之引子組、與
固相載體，其至少一部分包含能夠與上述結合部結合之部分。
[29]
一種探針，其係用以於抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，
該探針含有如下聚核苷酸，其包含能夠與上述指標鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之部分鹼基序列p1雜交的鹼基序列。
[30]
如[29]記載之探針，其中上述指標鹼基序列為序列編號2之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之第1鹼基序列或與上述第1鹼基序列互補之第2鹼基序列。
[31]
如[30]記載之探針，其中上述部分鹼基序列p1中之至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
[32]
如[30]或[31]記載之探針，其中上述部分鹼基序列p1為
(p1-12-1)序列編號2之鹼基序列之第4624～4668位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-18-1)序列編號2之鹼基序列之第2356～2397位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-20-1)序列編號2之鹼基序列之第2624～2663位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-22-1)序列編號2之鹼基序列之第4044～4083位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-24-1)序列編號2之鹼基序列之第6535～6575位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-26-1)序列編號2之鹼基序列之第7478～7520位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-28-1)序列編號2之鹼基序列之第7629～7673位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-13-1)序列編號2之鹼基序列之第4694～4740位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-19-1)序列編號2之鹼基序列之第2672～2711位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-21-1)序列編號2之鹼基序列之第3539～3583位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-23-1)序列編號2之鹼基序列之第5061～5103位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-25-1)序列編號2之鹼基序列之第6566～6605位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-27-1)序列編號2之鹼基序列之第7931～7976位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、或
(p1-29-1)序列編號2之鹼基序列之第8302～8346位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
[33]
一種判定抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶之方法，其包括：
將判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA衍生的聚核苷酸作為模板，使用如[23]至[27]中任一項記載之引子組，進行核酸擴增反應；
對上述核酸擴增反應之擴增產物進行檢測；及
於檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶。
[34]
一種判定抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性之方法，其包含如[33]記載之方法，該方法包括：
於檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素具有敏感性。
[35]
一種判定抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶之方法，其包括：
將判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA衍生的聚核苷酸、與如[29]至[32]中任一項記載之探針於能夠雜交之條件下進行培養；
對上述基因組DNA或上述聚核苷酸與上述探針之雜交進行檢測；及
於檢測到上述雜交之情形時，判定上述判定對象之抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶。
[36]
一種判定抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性之方法，其包含如[35]記載之方法，該方法包括：
於檢測到上述雜交之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素具有敏感性。
[37]
一種如[5]至[8]中任一項記載之引子組、如[10]記載之套組、或如[11]至[14]中任一項記載之探針之用途，其係用於在抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在。
[38]
一種如[5]至[8]中任一項記載之引子組、如[10]記載之套組、或如[11]至[14]中任一項記載之探針之用途，其係用於判定抗酸菌中erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶。
[39]
一種如[5]至[8]中任一項記載之引子組、如[10]記載之套組、或如[11]至[14]中任一項記載之探針之用途，其係用於判定抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性。
[40]
一種如[5]至[8]中任一項記載之引子組、如[10]記載之套組、或如[11]至[14]中任一項記載之探針之用途，其係用於判定抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶。
本說明書包含作為本申請案之優先權之基礎的日本專利申請號2020-066277號之揭示內容。
[發明之效果]
根據本發明之一個以上之實施方式，可容易地判別屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中erm(41)基因之第28位鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶。又，根據本發明之一個以上之實施方式，可容易地判別抗酸菌中erm(41)基因之第28位鹼基為胞嘧啶。
以下，對本發明進行詳細說明。
＜用語＞
於本發明中，用語「聚核苷酸」或「核酸」係指DNA或RNA，典型而言指DNA。用語「聚核苷酸」或「核酸」於鹼基數方面並無特別限定，亦包括寡核苷酸。本發明中，引子或探針所含之聚核苷酸或核酸典型而言為天然之核苷酸之聚合物。所謂天然之核苷酸係指由天然之腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶之鹼基，及去氧核糖或核糖之糖部，以及磷酸基構成之核苷酸，且該核苷酸之各部分未經人工修飾。天然之核苷酸通常為D型核苷酸。所謂D型核苷酸表示糖部分包含D型去氧核糖或核糖之核苷酸。
所謂鹼基序列X「能夠雜交」至鹼基序列Y上，意指包含鹼基序列X之聚核苷酸(尤其是DNA片段)於嚴格之條件下雜交至包含鹼基序列Y之聚核苷酸(尤其是DNA片段)上，且不雜交至不具有鹼基序列Y之聚核苷酸上。即，所謂雜交係指特異性地雜交。此處，所謂「嚴格之條件」，意指形成通常所說之特異性雜種，而未形成非特異性雜種之條件，例如可參照Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press來適當確定。具體而言，可藉由Southern雜交時之溫度或溶液所含之鹽濃度、及Southern雜交之清洗步驟時之溫度或溶液所含之鹽濃度來設定嚴格之條件。更詳細而言，作為嚴格之條件，例如於雜交步驟中，鈉濃度為25～500 mM、較佳為25～300 mM，溫度為40～68℃、較佳為40～65℃。更具體而言，雜交可於1～7×SSC(1×SSC係指150 mM氯化鈉、15 mM檸檬酸單鈉、pH值7.2)、0.02～3%SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)、溫度40℃～60℃下進行。又，雜交之後亦可進行清洗步驟，清洗步驟可於例如0.1～2×SSC、0.1～0.3%SDS、溫度50～65℃下進行。
作為嚴格之條件之具體例，例如可列舉如下條件：於包含5×SSC、0.1%(w/v)N-月桂醯肌胺酸、0.02%(w/v)SDS之雜交溶液中，進行一晩(8～16小時左右)包含鹼基序列X之DNA片段與包含鹼基序列Y之DNA片段之雜交，繼而，使用包含0.1～0.5×SSC、0.1%(w/v)SDS、較佳為包含0.1×SSC、0.1%(w/v)SDS之清洗溶液清洗15分鐘，進行2次該清洗。進行雜交及清洗之溫度較佳為50℃以上、更佳為65℃以上，雜交溶液可較佳地進而包含0.5～2(w/v)之核酸雜交用封閉試劑。該條件下之雜交及清洗後，包含鹼基序列X之DNA探針與包含鹼基序列Y之DNA片段雜交之情形時，可謂鹼基序列X「能夠雜交」至鹼基序列Y上。
於鹼基序列X能夠雜交至鹼基序列Y上之情形時，包含鹼基序列X之聚核苷酸(尤其是DNA)與包含鹼基序列Y之聚核苷酸(尤其是DNA)只要為於核酸擴增反應之退火條件下可形成足夠之雜交形成穩定雙鏈所需之氫鍵的組合即可，無需為相互完全互補之鹼基序列。例如於鹼基序列X與鹼基序列Y之間，10鹼基中可存在1個錯配、20鹼基中可存在1個錯配、或30鹼基中可存在1個錯配等若干個錯配。
於鹼基序列X能夠雜交至鹼基序列Y上之情形、或表述為「能夠與鹼基序列X雜交之鹼基序列Y」之情形時，較佳為滿足以下之(A)～(C)之1個以上之關係。
(A)鹼基序列X之互補鹼基序列與鹼基序列Y一致。再者，於鹼基序列X之互補鹼基序列與鹼基序列Y之一者為DNA之鹼基序列、另一者為RNA之鹼基序列之情形時，一者中之胸腺嘧啶與另一者中之尿嘧啶視為同一鹼基。
(B)鹼基序列Y為於鹼基序列X之互補鹼基序列中缺失、置換、附加及/或***1個或數個鹼基之鹼基序列。
(C)鹼基序列Y為與鹼基序列X之互補鹼基序列具有80%以上之同一性之鹼基序列。
於上述(B)中，所謂「1個或數個」係指較佳為1～5個、更佳為1～4個、更佳為1～3個、尤佳為1個或2個，最佳為1個。
於上述(C)中，同一性之值表示使用演算複數個鹼基序列間之同一性之軟體(例如FASTA、DANASYS、及BLAST)於缺省設定下算出之值。鹼基序列之同一性之值係算出以一致度最大之方式比對(alignment)一對鹼基序列時一致之鹼基之數量，作為該一致之鹼基之數量相對於進行比較之鹼基序列之總鹼基數的比率而算出。此處，於存在空位(gap)之情形時，上述總鹼基數為將1個空位當作1個鹼基計數所得之鹼基數。關於同一性之確定方法之詳細說明，請參照例如Altschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990。
於上述(C)中，同一性更佳為90%以上、更佳為95%以上、更佳為96%以上、更佳為97%以上、更佳為98%以上、更佳為99%以上之同一性。
上述(A)～(C)之中，尤佳為上述(A)。
於本發明中，引子及/或探針所含之聚核苷酸之製造方法並無特別限定，可利用聚核苷酸合成裝置來製造，亦可藉由受託合成服務來製造。
＜核酸擴增反應＞
於使用本發明之一個以上之實施方式之引子組進行核酸擴增反應之情形時，可為使用耐熱性聚合酶之核酸擴增反應，亦可為使用鏈置換型聚合酶之核酸擴增反應。聚合酶指核酸聚合酶，為DNA聚合酶或RNA聚合酶，較佳為DNA聚合酶。
作為使用耐熱性聚合酶之核酸擴增反應，可列舉聚合酶鏈反應法(PCR法)。作為耐熱性聚合酶，可利用市售之DNA聚合酶，例如可較佳地利用TaKaRa Ex Taq(註冊商標)等。又，溫度、時間、緩衝液之組成等可根據所使用之DNA聚合酶或各引子之濃度等而適當選擇。PCR法中之改性、退火、延伸各步驟之時間、溫度、緩衝液組成、基質核苷酸濃度、循環數等各條件可考慮到所選擇之DNA聚合酶、引子序列、標靶核酸之鹼基數、模板濃度等要素而適當設定。
鏈置換型聚合酶係一面使包含標靶核酸之雙鏈核酸之氫鍵自解離，一面合成新DNA鏈之酶，例如可列舉：ϕ29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、DNA聚合酶I之克列諾(Klenow)片段、Vent DNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶、DeepVent DNA聚合酶、DeepVent(Exo-)DNA聚合酶、96-7 DNA聚合酶、Aac DNA聚合酶及Csa DNA 聚合酶等。鏈置換型聚合酶無需進行雙鏈之解離，故可實現等溫下之核酸擴增。
作為使用鏈置換型聚合酶之核酸擴增反應，較佳為等溫核酸擴增法，可例示RPA法(Recombinase Polymerase Amplification，重組酶聚合酶擴增)、TRIAmp法(Tandem Repeat-mediated Isothermal Amplification，串聯重複介導等溫擴增)、LAMP法(Loop-mediated isothermal amplification，環介導等溫擴增)、HDA法(Helicase-dependent amplification，解旋酶依賴性擴增)等方法。
使用鏈置換型聚合酶之等溫核酸擴增法係藉由使模板核酸、引子、鏈置換型聚合酶及基質核苷酸共存，於可使擴增引子與模板核酸形成穩定之鹼基對鍵、且可發揮酶活性之溫度下培養而進行。採用等溫核酸擴增法之核酸擴增反應之溫度、緩衝液組成、基質核苷酸濃度、反應時間等各條件可考慮到所選擇之鏈置換型聚合酶、引子序列、標靶核酸之鹼基數、模板核酸濃度等要素而適當設定。
所謂「標靶核酸」係指包含指標鹼基序列中之所欲檢測及/或擴增之鹼基序列的核酸、或者包含所欲檢測及/或擴增之鹼基序列之互補鹼基序列的核酸。標靶核酸亦可與其互補鏈一起作為雙鏈存在。亦可指作為雙鏈存在之標靶核酸中之一條鏈，稱為「標靶核酸」。所欲檢測之核酸與其互補鏈均可稱為「標靶核酸」。即，於本發明中，所謂「檢測標靶核酸」或「擴增標靶核酸」，包括以下兩種情況：將標靶核酸本身作為目的，檢測或擴增標靶核酸；將標靶核酸之互補鏈或標靶核酸與互補鏈之雙鏈核酸作為目的，檢測或擴增標靶核酸、標靶核酸之互補鏈、或標靶核酸與互補鏈之雙鏈核酸。
進行核酸擴增反應之情形時作為模板之核酸只要一部分包含指標鹼基序列及/或其互補鹼基序列，可為DNA，亦可為RNA，較佳為DNA。作為核酸擴增反應之模板的核酸通常為至少一部分包含標靶核酸之聚核苷酸鏈與該聚核苷酸鏈之互補鏈的雙鏈DNA。
作為模板之核酸可為天然者，亦可為人工合成者。例如，可為自生物樣本提取之天然核酸，亦可為藉由PCR等核酸擴增反應進行擴增所得者、或藉由反轉錄反應所合成之cDNA等。
＜抗酸菌＞
本說明書中作為判別對象之「抗酸菌」意指抗酸性、非移動性之革蘭氏陽性桿菌。於本說明書中，「抗酸菌」可包含「非結核性抗酸菌(Nontuberculous mycobacteria；NTM)」、尤其是「屬於膿腫分枝桿菌複合群(Mycobacteroides abscessus complex)之抗酸菌」。如上所述，膿腫分枝桿菌複合群包含3個亞種。本發明之一個以上之實施方式較佳為用於檢測膿腫分枝桿菌複合群中之erm(41)基因之第28位鹼基之突變，尤佳為用於檢測膿腫分枝桿菌膿腫亞種及膿腫分枝桿菌博萊亞種中之erm(41)基因之第28位鹼基之突變。再者，有時將Mycobacteroides屬記為Mycobacterium屬。
＜erm(41)基因＞
erm(41)基因係編碼紅黴素核糖體甲基轉移酶(erythromycin ribosomal methyltransferase)之基因。erm(41)基因於克拉黴素等大環內酯系抗生素之存在下表現紅黴素核糖體甲基轉移酶，誘導對大環內酯系抗生素之耐藥性。
膿腫分枝桿菌複合群之標準株之基因組DNA所含之erm(41)基因具有序列編號1之鹼基序列。於序列編號1之鹼基序列中，第28位鹼基為胸腺嘧啶。erm(41)基因具有序列編號1之鹼基序列之抗酸菌為可誘導對大環內酯系抗生素之耐藥性之耐藥菌。
另一方面，於約10%之膿腫分枝桿菌複合群中，相當於erm(41)基因之鹼基序列之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基自胸腺嘧啶突變成胞嘧啶。該基因型之抗酸菌無法誘導對大環內酯系抗生素之耐藥性，為大環內酯系抗生素敏感性菌。
再者，一些屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌不具有erm(41)基因之序列編號1所示之鹼基序列之全長序列而有一部分缺失，即為erm(41)基因部分缺失株。即便為erm(41)基因部分缺失株，亦具有位於較序列編號1之鹼基序列之第28位鹼基之上游的鹼基序列，存在上述鹼基為胸腺嘧啶之株與上述鹼基為胞嘧啶之株。
於以下之說明中，將相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胸腺嘧啶之型表述為「正常型」、「erm(41)T28」或「T28」。並將相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胸腺嘧啶之抗酸菌株表述為「T28株」。再者，相當於erm(41)T28基因之鹼基序列係指序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胸腺嘧啶者，其他位置之鹼基序列可與序列編號1之鹼基序列一致，亦可為於序列編號1之鹼基序列中缺失、置換、附加及/或***1個或數個鹼基者，如上所述，位於較erm(41)基因之28位之下游的部分序列可缺失。
又，於以下之說明中，將相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶之型表述為「突變型」、「erm(41)C28」或「C28」。並將相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶之抗酸菌株表述為「C28株」。再者，erm(41)C28基因之鹼基序列係指相當於序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶者，其他位置之鹼基序列可與序列編號1之鹼基序列一致，亦可為於序列編號1之鹼基序列中缺失、置換、附加及/或***1個或數個鹼基者，如上所述，位於較erm(41)基因之28位之下游的部分序列可缺失。
於上述2個段落中，所謂「1個或數個」係指較佳為1～5個、更佳為1～4個、更佳為1～3個、尤佳為1個或2個，最佳為1個。
＜抗酸菌之erm(41)基因型之判定方法1＞
本發明之第一實施方式關於
一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶之方法，其包括：
於判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA中檢測如下指標鹼基序列，該指標鹼基序列於上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，
檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶，
未檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胸腺嘧啶。
根據上述第一實施方式之方法，屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌為C28株或為T28株可藉由檢測於上述抗酸菌為C28株之情形時特異性地存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域的指標鹼基序列，而非藉由檢測erm(41)基因中之單鹼基突變來判定。於上述第一實施方式之方法中，無需直接檢測單鹼基之突變，只要可檢測出基因組DNA中存在或不存在指標鹼基序列，即可判定為C28株或為T28株，因此實施簡便。
上述第一實施方式之方法亦可用於判別抗酸菌、尤其是屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌是否對大環內酯系抗生素具有敏感性。判定抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性之方法包括於判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA中檢測上述指標鹼基序列，檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌對大環內酯系抗生素具有敏感性，未檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌對大環內酯系抗生素不具有敏感性。
上述指標序列亦可用作判定抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶的指標。
本發明者等人驚喜地發現，具有序列編號2之鹼基序列之區域特異性地存在於C28株之基因組DNA中，不存在於T28株之基因組DNA中。
序列編號2之鹼基序列為自5'末端至3'末端，序列編號3之鹼基序列、序列編號4之鹼基序列、序列編號5之鹼基序列、序列編號6之鹼基序列、序列編號7之鹼基序列、序列編號8之鹼基序列、序列編號9之鹼基序列、序列編號10之鹼基序列及序列編號11之鹼基序列依序連結而成之鹼基序列。序列編號3～11之各鹼基序列之5'末端及3'末端之鹼基於序列編號2之鹼基序列中之位置示於下表。
[表1]
| 序列編號2中之位置 5'末端 | 3'末端 | 長度 (bp) | |
| 序列編號3 | 1 | 128 | 128 |
| 序列編號4 | 129 | 2365 | 2237 |
| 序列編號5 | 2366 | 3573 | 1208 |
| 序列編號6 | 3574 | 4053 | 480 |
| 序列編號7 | 4054 | 5093 | 1040 |
| 序列編號8 | 5094 | 6431 | 1338 |
| 序列編號9 | 6432 | 6595 | 164 |
| 序列編號10 | 6596 | 7487 | 892 |
| 序列編號11 | 7488 | 8336 | 849 |
序列編號2之鹼基序列之中，尤其是序列編號3之鹼基序列、序列編號5之鹼基序列、序列編號7之鹼基序列、序列編號9之鹼基序列及序列編號11之鹼基序列為於T28株之基因組DNA中不存在同源性相對較高者之鹼基序列，因此作為C28株之判定指標尤佳。
作為上述指標鹼基序列，只要為於抗酸菌C28株之基因組DNA中特異性地存在之鹼基序列即可，具體而言，較佳為序列編號2之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之第1鹼基序列或與上述第1鹼基序列互補之第2鹼基序列。上述第1鹼基序列更佳為序列編號2之鹼基序列所含之連續20個鹼基以上、50個鹼基以上、100個鹼基以上、500個鹼基以上或1000個鹼基以上之鹼基序列。上述第1鹼基序列之鹼基數之上限並無特別限定，例如可為3000個鹼基以下或1500個鹼基以下。
上述第1鹼基序列更佳為其至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、較佳為20個鹼基以上、50個鹼基以上、100個鹼基以上、500個鹼基以上或1000個鹼基以上之鹼基序列。此種第1鹼基序列或作為其互補鹼基序列之第2鹼基序列為於T28株之基因組DNA中不存在同源性相對較高者之鹼基序列，因此，基於其之存在，可高精度地判定C28株。
上述第一實施方式之方法中，檢測上述指標鹼基序列之方法並無特別限定，例如可藉由使用後述探針或引子之方法實施。
上述第一實施方式之方法中，在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌之基因組DNA中檢測到上述指標鹼基序列之情形時，可判定上述抗酸菌為C28株，在上述抗酸菌之基因組DNA中未檢測到上述指標鹼基序列之情形時，可判定上述抗酸菌為T28株。
＜用以檢測C28株特異性指標鹼基序列之探針＞
本發明之第二實施方式關於
一種探針，其係用以在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，
該探針含有如下聚核苷酸，其包含能夠與上述指標鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之部分鹼基序列p1雜交的鹼基序列。
上述第二實施方式中之上述指標鹼基序列可於與第一實施方式相關之指標鹼基序列相同之範圍中選擇。
上述部分鹼基序列p1為上述指標鹼基序列中之與第二實施方式之探針雜交之區域。
上述部分鹼基序列p1為上述指標鹼基序列中之連續之部分鹼基序列，只要為具有用以維持特異性所需之鹼基數者即可，該鹼基數為10個鹼基以上即可，更佳為15個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上。上述部分鹼基序列p1之鹼基數之上限並無特別限定，例如可為400個鹼基以下、300個鹼基以下、200個鹼基以下、100個鹼基以下或50個鹼基以下之上述指標鹼基序列之部分鹼基序列。
上述部分鹼基序列p1更佳為其至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為15個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上、且例如400個鹼基以下、300個鹼基以下、200個鹼基以下、100個鹼基以下或50個鹼基以下之鹼基序列。
上述部分鹼基序列p1
較佳為
(p1-12-1)序列編號2之鹼基序列之第4624～4668位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-18-1)序列編號2之鹼基序列之第2356～2397位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-20-1)序列編號2之鹼基序列之第2624～2663位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-22-1)序列編號2之鹼基序列之第4044～4083位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-24-1)序列編號2之鹼基序列之第6535～6575位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-26-1)序列編號2之鹼基序列之第7478～7520位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-28-1)序列編號2之鹼基序列之第7629～7673位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-13-1)序列編號2之鹼基序列之第4694～4740位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-19-1)序列編號2之鹼基序列之第2672～2711位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-21-1)序列編號2之鹼基序列之第3539～3583位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-23-1)序列編號2之鹼基序列之第5061～5103位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-25-1)序列編號2之鹼基序列之第6566～6605位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-27-1)序列編號2之鹼基序列之第7931～7976位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、或
(p1-29-1)序列編號2之鹼基序列之第8302～8346位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列，
更佳為
(p1-12-2)序列編號2之鹼基序列之第4629～4663位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-18-2)序列編號2之鹼基序列之第2361～2392位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-20-2)序列編號2之鹼基序列之第2629～2658位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-22-2)序列編號2之鹼基序列之第4049～4078位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-24-2)序列編號2之鹼基序列之第6540～6570位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-26-2)序列編號2之鹼基序列之第7483～7515位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-28-2)序列編號2之鹼基序列之第7634～7668位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-13-2)序列編號2之鹼基序列之第4699～4735位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-19-2)序列編號2之鹼基序列之第2677～2706位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-21-2)序列編號2之鹼基序列之第3544～3578位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-23-2)序列編號2之鹼基序列之第5066～5098位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-25-2)序列編號2之鹼基序列之第6571～6600位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(p1-27-2)序列編號2之鹼基序列之第7936～7971位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、或
(p1-29-2)序列編號2之鹼基序列之第8307～8341位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列。
本發明之上述第二實施方式之探針於嚴格之條件下可雜交至包含上述指標鹼基序列之聚核苷酸中之上述部分鹼基序列p1之區域。因此，本發明之上述第二實施方式之探針可用於核酸雜交法(例如Southern雜交)或即時PCR法(例如TaqManTM法、分子信標(Molecular Beacon)法)等。
構成上述第二實施方式之探針之聚核苷酸包含與上述部分鹼基序列p1之互補鹼基序列一致或同源之鹼基序列。此處所謂「同源」，指滿足上述(B)或(C)之條件，具體而言滿足以下之(B1)或(C1)之條件。
(B1)構成上述第二實施方式之探針之聚核苷酸之鹼基序列為於上述部分鹼基序列p1之互補鹼基序列中缺失、置換、附加及/或***1個或數個鹼基之鹼基序列。
(C1)構成上述第二實施方式之探針之聚核苷酸之鹼基序列為與上述部分鹼基序列p1之互補鹼基序列具有80%以上之同一性之鹼基序列。
關於上述(B1)中之「1個或數個」、上述(C1)中之「同一性」之較佳範圍，如上述(B)及(C)之相關記述。
構成上述第二實施方式之探針之聚核苷酸無需僅由與上述部分鹼基序列p1之互補鹼基序列一致或同源之鹼基序列(以下記為「鹼基序列q1」)構成，亦可於鹼基序列q1之5'末端側及3'末端側之一側或兩側附加其他鹼基序列。鹼基序列q1尤佳為與上述部分鹼基序列p1之互補鹼基序列一致。
構成上述第二實施方式之探針之聚核苷酸整體之鹼基數並無特別限定，可設為8個鹼基以上、10個鹼基以上、更佳為15個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上，且可設為較佳為400個鹼基以下、300個鹼基以下或200個鹼基以下。於即時PCR法中使用該探針之情形時，聚核苷酸較佳為50個鹼基以下，更佳為40個鹼基以下或35個鹼基以下。
作為構成上述第二實施方式之探針之聚核苷酸之具體例，可例示：
包含序列編號12、13、18～29之任一鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為15個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、尤佳為20個鹼基以上之鹼基序列的聚核苷酸。
上述第二實施方式之探針亦可為於上述聚核苷酸進而附加作為能夠與標記物質結合之標籤或標記物質的標記部者。此種標記部之具體例如下文中引子之相關記述。包含標記部之探針與包含上述指標鹼基序列之聚核苷酸雜交生成之複合體可將標記部作為指標而易於檢測。
又，上述第二實施方式之探針亦可為於上述聚核苷酸進而附加作為能夠與固相載體結合之標籤的結合部者。此種結合部之具體例如下文中引子之相關記述。包含結合部之上述探針與包含上述指標鹼基序列之聚核苷酸雜交生成之複合體可經由結合部固定於固相載體，易於檢測及單離。
包含結合部之上述探針亦可以經由結合部預先固定於固相載體之狀態提供。固定於固相載體之上述探針可捕捉包含上述指標鹼基序列之聚核苷酸。
於即時PCR法中使用上述第二實施方式之探針之情形時，較佳為利用擴增產物之即時檢測中通常所用之標記物質進行標記化。例如，用作探針之聚核苷酸之5'末端與報導螢光物質連結、3'末端與淬滅色素連結。作為報導螢光物質，可例示：羧基螢光素(FAM)、六氯螢光素(HEX)、四氯螢光素(TET)等。作為淬滅色素，可例示：羧基四甲基若丹明(TAMRA)等螢光物質、Black Hole Quencher色素(BHQ)，4-((4-(二甲基胺基)苯基)偶氮)苯甲酸(4-((4-(dimethylamino) phenyl)azo)benzoic acid，DABCYL)等非螢光物質等。
上述第二實施方式之探針可用於判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶之方法。
該方法具體而言可為包括如下操作之方法：
將判定對象之抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之抗酸菌之基因組DNA衍生之聚核苷酸、與上述探針於能夠雜交之條件下進行培養；
對上述基因組DNA或上述聚核苷酸與上述探針之雜交進行檢測；及
於檢測到上述雜交之情形時，判定上述判定對象之抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶，於未檢測到上述雜交之情形時，判定上述鹼基為胸腺嘧啶。
又，上述第二實施方式之探針可用於判定抗酸菌、尤其是屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性之方法。該方法具體而言可為包括如下操作之方法：
將判定對象之抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之抗酸菌之基因組DNA衍生之聚核苷酸、與上述探針於能夠雜交之條件下進行培養；
對上述基因組DNA或上述聚核苷酸與上述探針之雜交進行檢測；及
於檢測到上述雜交之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素具有敏感性，於未檢測到上述雜交之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素不具有敏感性。
又，上述第二實施方式之探針可用於判定抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶之方法。該方法具體而言可為包括如下操作之方法：
將判定對象之抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之抗酸菌之基因組DNA衍生之聚核苷酸、與上述探針於能夠雜交之條件下進行培養；
對上述基因組DNA或上述聚核苷酸與上述探針之雜交進行檢測；及
於檢測到上述雜交之情形時，判定上述判定對象之抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶。
此處，作為「由判定對象之抗酸菌之基因組DNA衍生之聚核苷酸」，可列舉：上述基因組DNA之一部分之部分聚核苷酸、或者上述基因組DNA整體或包含上述指標鹼基序列之部分藉由核酸擴增反應擴增獲得之擴增產物。
作為上述各形態中之「能夠雜交之條件」，較佳為與作為「嚴格之條件」所記載之條件相同之條件。
＜用以檢測C28株特異性指標鹼基序列之引子組＞
本發明之第三實施方式關於
一種引子組，其係用以在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，
該引子組包含第1引子與第2引子，
第1引子含有於3'末端包含鹼基序列f12之聚核苷酸，鹼基序列f12能夠與上述指標鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之部分鹼基序列f11之互補鹼基序列雜交，
第2引子含有於3'末端包含鹼基序列r12之聚核苷酸，鹼基序列r12能夠與較上述指標鹼基序列所含之上述部分鹼基序列f11之3'末端更位於3'末端側的連續10個鹼基以上之部分鹼基序列r11雜交。
作為上述指標鹼基序列，只要為於抗酸菌C28株之基因組DNA中特異性地存在之鹼基序列即可，具體而言，較佳為序列編號2之鹼基序列所含之連續20個鹼基以上之第3鹼基序列。上述第3鹼基序列更佳為序列編號2之鹼基序列所含之連續40個鹼基以上、50個鹼基以上、100個鹼基以上、500個鹼基以上或1000個鹼基以上之鹼基序列。上述第3鹼基序列之鹼基數之上限並無特別限定，例如可為3000個鹼基以下或1500個鹼基以下。
於以下之說明中，將上述第3鹼基序列所含之自上述部分鹼基序列f11之5'末端之鹼基至部分鹼基序列r11之3'末端之鹼基的鹼基序列稱為「標靶序列」。標靶序列及其互補鹼基序列藉由使用本實施方式之引子組之核酸擴增反應進行擴增。標靶序列較佳為其至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列所含之連續20個鹼基以上、較佳為40個鹼基以上、50個鹼基以上、100個鹼基以上、500個鹼基以上或1000個鹼基以上之鹼基序列。該標靶序列為於T28株之基因組DNA中不存在同源性相對較高者之鹼基序列，因此，基於其之存在，可高精度地判定C28株。
上述標靶序列之長度並無特別限定。為了提高檢測精度，標靶序列較佳為包含上述指標鹼基序列之較佳為20個鹼基以上、更佳為40個鹼基以上、50個鹼基以上、100個鹼基以上、500個鹼基以上或1000個鹼基以上之連續部分。上述標靶序列之長度之上限並無特別限定，通常為3000個鹼基以下或1500個鹼基以下。
上述部分鹼基序列f11位於標靶序列之5'末端。上述部分鹼基序列r11位於標靶序列之3'末端。
上述部分鹼基序列f11及上述部分鹼基序列r11之長度分別可為10個鹼基以上、更佳為15個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上，又，典型而言，可為40個鹼基以下、30個鹼基以下或27個鹼基以下。
上述部分鹼基序列f11
較佳為
(f11-12-1)序列編號2之鹼基序列之第4624～4668位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-18-1)序列編號2之鹼基序列之第2356～2397位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-20-1)序列編號2之鹼基序列之第2624～2663位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-22-1)序列編號2之鹼基序列之第4044～4083位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-24-1)序列編號2之鹼基序列之第6535～6575位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-26-1)序列編號2之鹼基序列之第7478～7520位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、或
(f11-28-1)序列編號2之鹼基序列之第7629～7673位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列，
更佳為
(f11-12-2)序列編號2之鹼基序列之第4629～4661位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-18-2)序列編號2之鹼基序列之第2361～2390位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-20-2)序列編號2之鹼基序列之第2629～2656位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-22-2)序列編號2之鹼基序列之第4049～4076位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-24-2)序列編號2之鹼基序列之第6540～6568位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-26-2)序列編號2之鹼基序列之第7483～7513位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、或
(f11-28-2)序列編號2之鹼基序列之第7634～7666位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列，
尤佳為
(f11-12-3)序列編號2之鹼基序列之第4629～4658位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-18-3)序列編號2之鹼基序列之第2361～2387位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-20-3)序列編號2之鹼基序列之第2629～2653位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-22-3)序列編號2之鹼基序列之第4049～4073位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-24-3)序列編號2之鹼基序列之第6540～6565位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(f11-26-3)序列編號2之鹼基序列之第7483～7510位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、或
(f11-28-3)序列編號2之鹼基序列之第7634～7663位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列。
上述(f11-12-1)～(f11-28-1)中，「連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」較佳為「自3'末端起第1～12位之鹼基開始，朝向5'末端方向，連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」。
上述(f11-12-2)～(f11-28-2)中，「連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」較佳為「自3'末端起第1～5位之鹼基開始，朝向5'末端方向，連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」。
上述(f11-12-3)～(f11-28-3)中，「連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」較佳為「自3'末端起第1～2位之鹼基開始，朝向5'末端方向，連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」。此處，「自3'末端起第1～2位之鹼基」更佳為「3'末端之鹼基」。
上述部分鹼基序列r11
較佳為
(r11-13-1)序列編號2之鹼基序列之第4694～4740位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-19-1)序列編號2之鹼基序列之第2672～2711位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-21-1)序列編號2之鹼基序列之第3539～3583位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-23-1)序列編號2之鹼基序列之第5061～5103位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-25-1)序列編號2之鹼基序列之第6566～6605位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-27-1)序列編號2之鹼基序列之第7931～7976位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、或
(r11-29-1)序列編號2之鹼基序列之第8302～8346位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列，
更佳為
(r11-13-2)序列編號2之鹼基序列之第4701～4735位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-19-2)序列編號2之鹼基序列之第2679～2706位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-21-2)序列編號2之鹼基序列之第3546～3578位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-23-2)序列編號2之鹼基序列之第5068～5098位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-25-2)序列編號2之鹼基序列之第6573～6600位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-27-2)序列編號2之鹼基序列之第7938～7971位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、或
(r11-29-2)序列編號2之鹼基序列之第8309～8341位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列，
尤佳為
(r11-13-3)序列編號2之鹼基序列之第4704～4735位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-19-3)序列編號2之鹼基序列之第2682～2706位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-21-3)序列編號2之鹼基序列之第3549～3578位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-23-3)序列編號2之鹼基序列之第5071～5098位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-25-3)序列編號2之鹼基序列之第6576～6600位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、
(r11-27-3)序列編號2之鹼基序列之第7941～7971位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列、或
(r11-29-3)序列編號2之鹼基序列之第8312～8341位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列。
上述(r11-13-1)～(r11-29-1)中，「連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」較佳為「自5'末端起第1～12位之鹼基開始，朝向3'末端方向，連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」。
上述(r11-13-2)～(r11-29-2)中，「連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」較佳為「自5'末端起第1～5位之鹼基開始，朝向3'末端方向，連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」。
上述(r11-13-3)～(r11-29-3)中，「連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」較佳為「自5'末端起第1～2位之鹼基開始，朝向3'末端方向，連續10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之鹼基序列」。「自5'末端起第1～2位之鹼基」更佳為「5'末端之鹼基」。
上述部分鹼基序列f11與上述部分鹼基序列r11只要為如下組合即可：於序列編號2之鹼基序列中，上述部分鹼基序列f11之3'末端之鹼基較部分鹼基序列r11之5'末端之鹼基更位於5'末端側(上游側)。
較佳為於上述部分鹼基序列f11為(f11-12-1)、(f11-12-2)或(f11-12-3)時，上述部分鹼基序列r11為(r11-13-1)、(r11-13-2)、(r11-13-3)、(r11-23-1)、(r11-23-2)或(r11-23-3)。於該情形時，序列編號7之部分鹼基序列可進行擴增。
較佳為於上述部分鹼基序列f11為(f11-18-1)、(f11-18-2)或(f11-18-3)時，上述部分鹼基序列r11為(r11-19-1)、(r11-19-2)、(r11-19-3)、(r11-21-1)、(r11-21-2)或(r11-21-3)。於該情形時，序列編號5之部分鹼基序列可進行擴增。
較佳為於上述部分鹼基序列f11為(f11-20-1)、(f11-20-2)或(f11-20-3)時，上述部分鹼基序列r11為(r11-19-1)、(r11-19-2)、(r11-19-3)、(r11-21-1)、(r11-21-2)或(r11-21-3)。於該情形時，序列編號5之部分鹼基序列可進行擴增。
較佳為於上述部分鹼基序列f11為(f11-22-1)、(f11-22-2)或(f11-22-3)時，上述部分鹼基序列r11為(r11-13-1)、(r11-13-2)、(r11-13-3)、(r11-23-1)、(r11-23-2)或(r11-23-3)。於該情形時，序列編號7之部分鹼基序列可進行擴增。
較佳為於上述部分鹼基序列f11為(f11-24-1)、(f11-24-2)或(f11-24-3)時，上述部分鹼基序列r11為(r11-25-1)、(r11-25-2)或(r11-25-3)。於該情形時，序列編號9之部分鹼基序列可進行擴增。
較佳為於上述部分鹼基序列f11為(f11-26-1)、(f11-26-2)或(f11-26-3)時，上述部分鹼基序列r11為(r11-27-1)、(r11-27-2)、(r11-27-3)、(r11-29-1)、(r11-29-2)或(r11-29-3)。於該情形時，序列編號11之部分鹼基序列可進行擴增。
較佳為於上述部分鹼基序列f11為(f11-28-1)、(f11-28-2)或(f11-28-3)時，上述部分鹼基序列r11為(r11-27-1)、(r11-27-2)、(r11-27-3)、(r11-29-1)、(r11-29-2)或(r11-29-3)。於該情形時，序列編號11之部分鹼基序列可進行擴增。
第1引子中之聚核苷酸可以於3'末端包含能夠與上述部分鹼基序列f11之互補鹼基序列雜交之鹼基序列f12之方式設計。第1引子中之聚核苷酸只要為於3'末端包含鹼基序列f12者即可，亦可於鹼基序列f12之5'末端側進而附加其他鹼基序列。第1引子中之聚核苷酸之全長並無特別限定，例如可設為10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上，又，典型而言，可設為40個鹼基以下、30個鹼基以下或27個鹼基以下。
於上述鹼基序列f12能夠與上述部分鹼基序列f11之互補鹼基序列雜交之情形時，上述部分鹼基序列f11與上述鹼基序列f12一致或同源。此處，所謂「同源」，指滿足上述(B)或(C)之條件，具體而言，滿足以下之(B2)或(C2)之條件。
(B2)上述鹼基序列f12為於上述部分鹼基序列f11中缺失、置換、附加及/或***1個或數個鹼基之鹼基序列。
(C2)上述鹼基序列f12為與上述部分鹼基序列f11具有80%以上之同一性之鹼基序列。
關於上述(B2)中之「1個或數個」、上述(C2)中之「同一性」之較佳範圍，如上述(B)及(C)之相關記述。
第2引子中之聚核苷酸可以於3'末端包含能夠與上述部分鹼基序列r11雜交之鹼基序列r12之方式設計。第2引子中之聚核苷酸只要為於3'末端包含鹼基序列r12者即可，亦可於鹼基序列r12之5'末端側進而附加其他鹼基序列。第2引子中之聚核苷酸之全長並無特別限定，例如可設為10個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上，又，典型而言，可設為40個鹼基以下、30個鹼基以下或27個鹼基以下。
於上述鹼基序列r12能夠與上述部分鹼基序列r11雜交之情形時，上述部分鹼基序列r11之互補鹼基序列與上述鹼基序列r12一致或同源。此處，所謂「同源」，指滿足上述(B)或(C)之條件，具體而言，滿足以下之(B3)或(C3)之條件。
(B3)上述鹼基序列r12為於上述部分鹼基序列r11之互補鹼基序列中缺失、置換、附加及/或***1個或數個鹼基之鹼基序列。
(C3)上述鹼基序列r12為與上述部分鹼基序列r11之互補鹼基序列具有80%以上之同一性之鹼基序列。
關於上述(B3)中之「1個或數個」、上述(C3)中之「同一性」之較佳範圍，如上述(B)及(C)之相關記述。
第1引子與第2引子之組合並無特別限定，可以藉由核酸擴增反應能夠將基因組DNA之標靶區域擴增為聚核苷酸片段之方式組合。
作為上述第三實施方式之引子組之較佳例，可例示以下之引子組，其中
第1引子為含有(C28f)之引子，
(C28f)為於3'末端包含鹼基序列C28fb之40個鹼基以下之聚核苷酸，鹼基序列C28fb為與序列編號12、18、20、22、24、26或28所示之鹼基序列一致或同源之鹼基序列C28fa所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列，
第2引子為含有(C28r)之引子，
(C28r)為於3'末端包含鹼基序列C28rb之40個鹼基以下之聚核苷酸，鹼基序列C28rb為與序列編號13、19、21、23、25、27或29所示之鹼基序列一致或同源之鹼基序列C28ra所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
上述(C28f)中，鹼基序列C28fa與序列編號12、18、20、22、24、26或28之鹼基序列一致或同源，即滿足上述(B)或(C)之關係(序列編號12、18、20、22、24、26或28之鹼基序列相當於鹼基序列X，鹼基序列C28fa相當於鹼基序列Y)。
上述(C28f)中，鹼基序列C28fa較佳為自3'末端起連續之較佳為3鹼基以上、更佳為5個鹼基以上、更佳為10個鹼基以上、更佳為12鹼基以上、更佳為15個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之部分與序列編號12、18、20、22、24、26或28所示之鹼基序列一致，且其餘部分同源(即滿足上述(B)或(C)之關係(序列編號12、18、20、22、24、26或28之鹼基序列之其餘部分相當於鹼基序列X，鹼基序列C28fa之其餘部分相當於鹼基序列Y))的鹼基序列，較佳為與序列編號12、18、20、22、24、26或28所示之鹼基序列一致。
上述鹼基序列C28fb較佳為上述鹼基序列C28fa所含之連續12鹼基以上、15個鹼基以上、17個鹼基以上或20個鹼基以上之鹼基序列，更佳為上述鹼基序列C28fa之自3'末端之鹼基起連續之鹼基序列。
上述鹼基序列C28fb更佳為與上述鹼基序列C28fa一致。
上述(C28r)中，鹼基序列C28ra與序列編號13、19、21、23、25、27或29之鹼基序列一致或同源，即滿足上述(B)或(C)之關係(序列編號13、19、21、23、25、27或29之鹼基序列相當於鹼基序列X，鹼基序列C28ra相當於鹼基序列Y)。
上述(C28r)中，鹼基序列C28ra較佳為自3'末端起連續之較佳為3鹼基以上、更佳為5個鹼基以上、更佳為10個鹼基以上、更佳為12鹼基以上、更佳為15個鹼基以上、更佳為17個鹼基以上、更佳為20個鹼基以上之部分與序列編號13、19、21、23、25、27或29所示之鹼基序列一致，且其餘部分同源(即滿足上述(B)或(C)之關係(序列編號13、19、21、23、25、27或29之鹼基序列之其餘部分相當於鹼基序列X，鹼基序列C28ra之其餘部分相當於鹼基序列Y))的鹼基序列，較佳為與序列編號13、19、21、23、25、27或29所示之鹼基序列一致。
上述鹼基序列C28rb較佳為上述鹼基序列C28ra所含之連續12鹼基以上、15個鹼基以上、17個鹼基以上或20個鹼基以上之鹼基序列，更佳為上述鹼基序列C28ra之自3'末端之鹼基起連續之鹼基序列。
上述鹼基序列C28rb更佳為與上述鹼基序列C28ra一致。
第1引子可僅由上述聚核苷酸構成，亦可進而包含後述標記部或結合部。上述聚核苷酸與標記部或結合部可經由後述適宜之間隔基而化學連結。於第1引子中，標記部及結合部之一者於上述聚核苷酸上之連結位置只要為不會對上述聚核苷酸與包含標靶區域之聚核苷酸或其互補鏈之退火及核酸擴增反應中之延伸造成阻礙之位置，則並無特別限定，較佳為上述聚核苷酸之5'末端。
第2引子可僅由上述聚核苷酸構成，亦可進而包含後述標記部或結合部。上述聚核苷酸與標記部或結合部可經由後述適宜之間隔基而化學連結。於第2引子中，標記部及結合部之一者於上述聚核苷酸上之連結位置只要為不會對上述聚核苷酸與包含標靶區域之聚核苷酸或其互補鏈之退火及核酸擴增反應中之延伸造成阻礙之位置，則並無特別限定，較佳為上述聚核苷酸之5'末端。
於第1引子及第2引子之至少一者包含標記部之情形時，使用其之核酸擴增反應中獲得包含標記部之擴增產物，因此易於進行擴增產物之檢測。
於第1引子及第2引子之至少一者包含結合部之情形時，使用其之核酸擴增反應中獲得包含結合部之擴增產物，因此能夠將擴增產物固定於固相載體，易於進行擴增產物之檢測。
更佳為第1引子及第2引子之一者進而包含標記部、另一者進而包含結合部。於使用該形態之引子組之核酸擴增反應中，獲得包含標記部與結合部之雙鏈之擴增產物，因此易於藉由核酸層析法進行檢測。
以下，對包含標記部及結合部之引子組進行說明。
(標記部)
標記部為能夠與標記物質結合之標籤或標記物質之任一者，較佳為能夠與標記物質結合之標籤。本說明書中，有時將能夠與標記物質結合之標籤稱為標記用標籤。於標記部為標記用標籤之情形時，藉由使核酸擴增反應之擴增產物與標記物質接觸，可對擴增產物之一端所含之標籤進行標記。於標記部為標記物質之情形時，作為核酸擴增反應之擴增產物，可獲得一端包含標記物質之擴增產物。
標記物質只要為可檢測擴增產物者即可，並無特別限定，較佳為可目視檢測擴增產物者。作為此種標記物質，可列舉：著色粒子、色素、酵素(過氧化酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶等)等，較佳為著色粒子。所謂「著色粒子」，可列舉：金屬(例如金、銀、銅、鉑等)粒子、金屬棒、著色之乳膠粒子、包含色素之二氧化矽奈米粒子等，但並不限定於該等。標記物質之大小只要無礙於將擴增產物捕捉至後述固相載體即可。標記物質較佳為於檢測時顯色良好者，可以尺寸比後述固相載體或具備固相載體之核酸檢測裝置之各種多孔質構件之孔徑小的方式適當選擇。例如，標記物質之大小可設為約500 nm以下、較佳為約0.1 nm～250 nm、更佳為約1 nm～100 nm之粒徑。作為色素，亦可使用螢光色素(螢光素(fluorescein)、花青等)等，該情形時較佳為照射各螢光色素之激發波長光進行檢測。
可用作標記部之標記用標籤只要為能夠與標記物質結合者即可，可根據標記物質之結構而適當選擇，並無特別限定，例如可利用包含核酸(DNA、RNA等)、蛋白質、肽、或其他化合物(例如生物素、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、地高辛(DIG)等低分子化合物)、或該等之組合者。作為標記用標籤之一較佳形態，為包含聚核苷酸、或由聚核苷酸構成者。標記用標籤可包含之該聚核苷酸只要為不會對使用上述引子組之核酸擴增反應造成實質性阻礙者，則並無特別限定，可使用鹼基數例如為5～50、較佳為10～35之聚核苷酸，更佳為包含序列編號14或15所示之鹼基序列或其部分鹼基序列或該等之互補鹼基序列之(或由其構成之)聚核苷酸。作為標記用標籤之另一較佳形態，為包含生物素、FITC、DIG等低分子化合物者。
於標記部為上述標記用標籤之情形時，標記物質與標記用標籤之結合可為直接結合，亦可為間接結合，可根據所利用之標記物質與標記用標籤之組合而適當選擇較佳之結合方法。例如，於標記用標籤包含聚核苷酸之情形時，使標記物質結合至能夠與該聚核苷酸雜交之聚核苷酸(例如包含與該聚核苷酸之鹼基序列互補之序列之聚核苷酸)，使兩者之聚核苷酸雜交，藉此可使標記物質與標記用標籤間接結合。標記物質與聚核苷酸之結合可經由肽、蛋白質、核酸等進行，亦可經由適宜之官能基進行。雜交之條件只要為引發雜交之條件即可，並無特別限定，例如可藉由在20℃～40℃下、包含10 mM～50 mM之磷酸之緩衝液(pH值6～7)中反應而進行。為了提高雜交效率，可使緩衝液中進而包含氯化鈉等鹽。
又，於標記用標籤為低分子化合物之情形時，可利用連結有結合性物質之標記物質進行標記，該結合性物質包括：與上述低分子化合物特異性地結合之蛋白質(例如與生物素結合之抗生物素蛋白、與FITC結合之蛋白質)、抗體(例如抗DIG抗體)、適體等。於該情形時，可使用各種中性附近之緩衝液使標記用標籤與結合性物質結合。
標記部(標記用標籤或標記物質)與第1引子所含之聚核苷酸或第2引子所含之聚核苷酸可藉由任意方法結合，可直接結合或間接結合。其中，於標記部中之至少與上述聚核苷酸連接之部分包含聚核苷酸之情形時，為了避免該部分因核酸擴增反應而與上述聚核苷酸形成雙鏈，經由能夠對DNA聚合酶反應之進行加以抑制或停止之間隔基將上述聚核苷酸與標記部結合。作為此種「間隔基」，只要為能夠對DNA聚合酶反應之進行加以抑制或停止而防止標記部雙鏈化者即可，例如可列舉：具有牢固之髮夾結構或假結結構之核酸序列、L型核酸、肽核酸(PNA)、橋接核酸(BNA，Bridged Nucleic Acid)或鎖定核酸(LNA，Locked Nucleic Acid)、螢光素、Cy3、Cy5、下述式I所表示之包含偶氮苯結構之二價基、脂肪鏈(伸烷基鏈或聚氧伸烷基鏈)、包含5'-5'結合、3'-3'結合之類的倒位序列結構之二價基等，但並不限定於該等。
[化1]
(式I)
於經由式I所表示之二價基連接2個聚核苷酸分子之情形時，該二價基之一側之3'端之磷酸基指一聚核苷酸分子之5'末端之核苷酸之磷酸基，另一側之5'端之氧原子與另一聚核苷酸分子之3'末端之核苷酸之磷酸基形成磷酸酯鍵。
作為脂肪鏈之間隔基，例如可列舉以下之式(II)所表示之間隔基。
5'-O-Cm
H2m
-O-3' 式(II)
(式中，5'表示5'側之磷酸二酯鍵之氧原子，3'表示3'側之磷酸二酯鍵之氧原子，m表示1以上40以下之整數。H可經取代基取代)
於式(II)中，m較佳為2以上36以下，更佳為3以上16以下。式(II)中之H可經取代基取代，作為取代基，典型而言，可列舉：烷基、烷氧基、羥基等。作為取代基之烷基及烷氧基之碳數較佳為1～8，更佳為1～4。又，於具有2個以上之取代基之情形時，取代基可相同亦可不同。進而，亦較佳為不具有取代基。
又，作為其他間隔基，可列舉以下之式(III)所表示之間隔基。
5'-(OCn
H2n
)L
-O-3' 式(III)
(式中，5'表示5'側之磷酸二酯鍵之氧原子，3'表示3'側之磷酸二酯鍵之氧原子，n表示2以上4以下之整數，L表示1以上、且使(n＋1)×L成為40以下之整數。H可經取代基取代)
於式(III)中，(n＋1)×L較佳為2以上36以下，更佳為3以上16以下。式(III)中之H之取代基適用與式(II)中之取代基相同之形態。
作為其他脂肪鏈之間隔基，例如可列舉以下之二價基。
[化2]
於經由該等二價基連接2個聚核苷酸分子之情形時，各二價基之一端之磷酸基指一聚核苷酸分子之3'末端或5'末端之核苷酸之磷酸基，另一端之氧原子與另一聚核苷酸分子之5'末端或3'末端之核苷酸之磷酸基形成磷酸酯鍵。
(結合部及固相載體)
結合部為能夠與後述固相載體結合之標籤。本說明書中，有時將能夠與固相載體結合之標籤稱為固定化用標籤。
可用作結合部之固定化用標籤只要為能夠與固相載體結合者即可，可根據固相載體之結構而適當選擇，並無特別限定，例如可利用包含聚核苷酸(DNA、RNA等)、蛋白質、肽、或其他化合物(例如低分子化合物)、或該等之組合者。固定化用標籤較佳為包含聚核苷酸、或由聚核苷酸構成者。固定化用標籤可包含之該聚核苷酸只要為不會對使用上述引子組之核酸擴增反應造成實質性阻礙者，則並無特別限定，可使用鹼基數例如為5～50、較佳為10～35之聚核苷酸，更佳為包含序列編號14或15所示之鹼基序列或其部分鹼基序列或該等之互補鹼基序列之(或由其構成之)聚核苷酸。
固相載體並無特別限定，可利用包含樹脂、金屬、多糖類、礦物等者，可製成膜(membrane)、膜(film)、不織布、平板、凝膠等形狀。固相載體較佳為具有可使溶液中之擴增產物或標記物質展開之多孔質構造者。於本發明中，作為可利用之固相載體，例如可列舉：濾紙、硝化纖維素膜、聚醚碸膜、尼龍膜、乾燥之各種凝膠(矽膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、明膠)、矽、玻璃、塑膠等。關於固相載體之大小及形態，可適當選擇適於進行各種操作或檢測者。
固相載體只要以至少一部分能夠與固定化用標籤結合之方式構成即可，更佳為以僅一部分能夠與固定化用標籤結合之方式構成。藉由以僅使固相載體之特定部分能夠與固定化用標籤結合之方式構成，而僅侷限於上述部分檢測經固相載體捕捉之擴增產物，故可容易地判別陽性或陰性。
固相載體與固定化用標籤之結合可為直接結合，亦可為間接結合，可根據所利用之固相載體與固定化用標籤之組合而適當選擇較佳之結合方法。例如於固定化用標籤包含聚核苷酸之情形時，將能夠與該聚核苷酸雜交之聚核苷酸(例如包含與該聚核苷酸之鹼基序列互補之序列之聚核苷酸)固定於固相載體而製作標籤捕捉機構，使兩者之聚核苷酸雜交，藉此可使固相載體與固定化用標籤間接結合。聚核苷酸向固相載體之固定化可經由肽、蛋白質、核酸等進行，亦可經由適宜之官能基進行。作為雜交之條件，可於上述關於標記用標籤與標記物質之結合所記載之條件下進行。於將聚核苷酸固定於固相載體之情形時，藉由侷限於特定部分進行固定化，而僅侷限於特定部分檢測所捕捉之擴增產物，故可容易地判別陽性或陰性。
結合部(固定化用標籤)與第1引子所含之聚核苷酸或第2引子所含之聚核苷酸可藉由任意方法結合，可直接結合或間接結合。其中，於固定化用標籤中之至少與上述聚核苷酸連接之部分包含聚核苷酸之情形時，為了避免該部分因核酸擴增反應而與上述聚核苷酸形成雙鏈，經由能夠對DNA聚合酶反應之進行加以抑制或停止之間隔基將上述聚核苷酸與固定化用標籤結合。設置於結合部與聚核苷酸之間的間隔基之具體例與上述關於設置於標記部與聚核苷酸之間的間隔基所記載者相同。
＜使用用以檢測C28株特異性指標鹼基序列之引子組的基因型之判定方法＞
使用包含上述第1引子及第2引子之上述第三實施方式之引子組，可判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶。
該判定方法例如包括：
將判定對象之抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之抗酸菌之基因組DNA衍生之聚核苷酸作為模板，使用包含上述第1引子及第2引子之上述第三實施方式之引子組，進行核酸擴增反應；
對上述核酸擴增反應之擴增產物進行檢測；及
於檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶，於未檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述鹼基為胸腺嘧啶。
又，包含上述第1引子及第2引子之上述第三實施方式之引子組可用於判定抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶之方法。該方法例如可為包括如下操作之方法：
將判定對象之抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之抗酸菌之基因組DNA衍生之聚核苷酸作為模板，使用包含上述第1引子及第2引子之上述第三實施方式之引子組，進行核酸擴增反應；
對上述核酸擴增反應之擴增產物進行檢測；及
於檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶。
此處，作為「由判定對象之抗酸菌之基因組DNA衍生之聚核苷酸」，可列舉：上述基因組DNA之一部分之部分聚核苷酸、或者上述基因組DNA整體或包含上述指標鹼基序列之部分藉由核酸擴增反應擴增獲得之擴增產物。
核酸擴增反應之例如上所述。
於判定對象之抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之抗酸菌之基因組DNA衍生之聚核苷酸中包含藉由使用上述第1引子與上述第2引子之核酸擴增反應形成之標靶序列之情形時，生成包含作為擴增產物之標靶序列之聚核苷酸片段。
藉由核酸擴增反應生成之擴增產物之檢測方法並無特別限定，例如可例示如下方法：藉由凝膠電泳分離核酸擴增反應之反應液，確認有無與包含特定標靶序列之聚核苷酸片段相當之尺寸之條帶(band)；或使特異性地標記於包含特定標靶序列之聚核苷酸片段上之聚核苷酸探針與核酸擴增反應之反應液或其生成物雜交，對複合體進行檢測。
又，擴增產物之檢測方法之一形態亦為如下：於聚核苷酸之5'末端連結報導螢光物質、3'末端連結淬滅色素之本發明之第二實施方式之探針之存在下進行核酸擴增反應，以包含特定標靶序列之聚核苷酸片段擴增之情形時產生之螢光作為指標來檢測聚核苷酸片段。
又，於第1引子及第2引子之一者進而包含作為能夠與標記物質結合之標籤或標記物質的標記部，另一者進而包含作為能夠與固相載體結合之標籤的結合部之情形時，可進行以下之使用固相載體之檢測步驟。
(使用固相載體之檢測步驟)
於該檢測步驟中，使核酸擴增反應之生成物與至少一部分包含能夠與結合部結合之部分之固相載體接觸，以標記部作為指標，檢測固相載體之上述部分之擴增產物。
於標記部為上述標記用標籤之情形時，進而進行使標記物質與標記用標籤結合之標記步驟即可。標記步驟詳見下文。於標記部為上述標記物質之情形時無需標記步驟。檢測步驟中之所謂「以標記部作為指標」，於標記部為標記用標籤之情形時指以經過標記步驟所結合之標記物質作為指標來檢測擴增產物，於標記部為標記物質之情形時指以該標記物質作為指標來檢測擴增產物。
所謂核酸擴增反應之生成物，指有可能包含擴增產物之核酸擴增反應之反應液、或將該反應液中之擴增產物進一步高濃度化所得之試樣等。
固相載體之詳細說明如上所述。
上述生成物向固相載體之能夠與結合部結合之部分的接觸於如下條件，即，根據固相載體與結合部之組合，於上述生成物中包含擴增產物之情形時以擴增產物之結合部結合於上述部分之方式適當調節之條件(例如雜交之條件、或pH值5～9左右之緩衝液條件)下進行即可。
擴增產物之檢測可藉由檢測、較佳為目視檢測與經固相載體捕捉之擴增產物結合之上述標記物質而進行。於存在擴增產物之情形時，會檢測到經固相載體捕捉、結合之擴增產物之標記物質。以是否檢測到該標記物質作為指標，可判別核酸擴增反應之反應系中有無擴增產物(包含標靶序列之聚核苷酸片段)。
(標記步驟)
標記步驟係於引子組所含之上述標記部為上述標記用標籤之情形時進行之步驟，藉由使核酸擴增反應之生成物與標記物質接觸，而使標記用標籤與標記物質結合來進行。標記步驟可於使核酸擴增反應之生成物接觸固相載體之前進行，亦可於接觸之後進行，亦可與接觸同時進行。
標記物質與上述生成物之接觸於如下條件，即，根據標記物質與標記用標籤之組合，於上述生成物中包含擴增產物之情形時以標記物質與擴增產物之標記用標籤結合之方式適當調節之條件(例如上述雜交之條件、或pH值5～9左右之緩衝液條件)下進行即可。
(檢測裝置)
上述檢測步驟及標記步驟可使用利用核酸層析法之核酸檢測裝置進行。藉由利用該核酸檢測裝置，無需特殊裝置即可檢測、判別於核酸擴增反應之反應系中有無擴增產物(包含標靶序列之聚核苷酸片段)，可簡便且快速地獲得結果。
核酸檢測裝置可利用藉由核酸層析法檢測經標記之核酸擴增產物時利用之公知之核酸檢測裝置(WO2012/070618)。
圖1表示本發明中可利用之核酸檢測裝置之一實施方式之模式圖，核酸檢測裝置並不限定於本實施方式。再者，於以下之說明中，各構件隨附之符號對應於圖1中所示之符號。
圖1之核酸檢測裝置10係於基材5之上，以相互依序接觸之方式配置作為用以接受核酸擴增反應之反應系之反應系接受部的樣品墊3、保持標記物質之結合墊2、一部分包含能夠與擴增產物所含之結合部結合之部分6之多孔質固相載體1、及吸收墊4而形成。固相載體1之部分6係定域配置、固定用以捕捉擴增產物之構件(捕捉機構)(例如上述寡核苷酸等)之部分。未作圖示，但亦可利用膜被覆固相載體1之表面。樣品墊3、結合墊2、固相載體1及吸收墊4可由作為上述固相載體可利用之具有多孔質結構之構件構成。該等可由同一構件構成，亦可由不同構件構成。基材5可支持其上配置之各種構件，只要為使核酸檢測裝置易於操作者即可，例如可利用包含樹脂、金屬、礦物等者。於將標記物質混合至展開溶液中之情形、或標記部為標記物質之情形時，可省略結合墊2。
於樣品墊3添加核酸擴增反應之反應系。可直接添加上述反應系，亦可與適宜之展開溶液(例如磷酸緩衝液、Tris緩衝液、古德緩衝液、SSC緩衝液)一起添加。展開溶液視需要可進而包含界面活性劑、鹽、蛋白質、核酸等。添加於樣品墊3之上述反應系沿圖1中之箭頭指示之方向，自上游向下游，於毛細現象之作用下展開。
又，作為另一形態，亦可藉由在保持有核酸擴增反應之生成物及/或展開溶液之容器(例如PCR管、Eppendorf管、96孔盤等)內放入該核酸檢測裝置，使樣品墊3浸漬於核酸擴增反應之生成物及/或展開溶液中之方法展開。於該情形時，樣品墊3之寬度較佳設為2.0～10.0 mm、更佳設為2.0～5.0 mm，以便樣品墊3伸入至保持有核酸擴增反應之生成物及/或展開溶液之容器內。
於上述標記部為標記用標籤之實施方式中，反應系中之擴增產物於通過保持有標記物質之結合墊2時，與標記物質接觸，經由標記用標籤而被標記物質標記。
繼而，反應系中之擴增產物於通過固相載體1時，與固定於部分6之捕捉機構接觸，經由固定化用標籤而被固相載體1捕捉、結合。
於存在擴增產物之情形時，會於部分6檢測到經包含捕捉機構之固相載體1之部分6捕捉、結合的擴增產物上結合之標記物質。若標記物質為可目視確認者，則標記物質會引起部分6之呈色。以該標記物質之檢測(呈色)之有無作為指標，可判別試樣中有無擴增產物。
＜使用用以檢測C28株特異性指標鹼基序列之引子組的對大環內酯系抗生素之敏感性之判定方法＞
使用包含上述第1引子及第2引子之上述第三實施方式之引子組，可判定抗酸菌、尤其是屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌對大環內酯系抗生素之敏感性。
該判定方法例如包括：
將判定對象之抗酸菌之基因組DNA或由判定對象之抗酸菌之基因組DNA衍生之聚核苷酸作為模板，使用包含上述第1引子及第2引子之上述第三實施方式之引子組，進行核酸擴增反應；
對上述核酸擴增反應之擴增產物進行檢測；及
於檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素具有敏感性，於未檢測到上述擴增產物之情形時，判定上述抗酸菌對大環內酯系抗生素不具有敏感性。
上述判定方法中之核酸擴增反應及擴增產物之檢測可藉由與上述相同之方式進行。
＜抗酸菌之erm(41)基因型之判定方法2＞
本發明之第四實施方式關於
一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶之方法，其包括：
於判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA中檢測如下指標鹼基序列，該指標鹼基序列於上述erm(41)基因之上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胞嘧啶之情形時不存在，
檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胸腺嘧啶，
未檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶。
[實施例]
膿腫分枝桿菌複合群之標準株之基因組資訊係自NCBI資料庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)取得。膿腫分枝桿菌複合群之臨床分離株及分讓株(下述表5所示之株)之基因組資訊分別係利用新一代定序儀(MiSeq(illumina))對由純培養之菌體製備之DNA進行解析而取得。基於該等基因組資訊，對具有erm(41)基因之正常型(T28)之株(T28株)與具有erm(41)基因之突變型(C28)之株(C28株)進行分子系統解析，結果發現T28株與C28株於分子系統層面可分為2個不同之群組。進而，使用Mauve軟體(Darling等人(2005))進行核酸序列之比對，經過比較解析，結果發現C28株特異性地具有高度保存之序列編號2之***鹼基序列。
有時將序列編號2之鹼基序列稱為「***鹼基序列」。
＜實施例1＞
作為與序列編號2之***鹼基序列特異性地雜交之引子組，設計C28-f引子及C28-r引子。將各引子之序列示於表2。使用所設計之引子組進行PCR，利用核酸層析法對核酸擴增產物進行解析，藉此驗證是否可特異性地檢測C28株。
(I)引子之結構
為了應對藉由核酸層析法之檢測，於各引子之5'末端，經由包含抑制聚合酶反應之偶氮苯結構的上述式I所表示之二價基，連結包含以下之標籤序列之DNA。此時，上述式I所表示之包含偶氮苯結構之二價基之5'端與包含標籤序列之DNA之3'末端之核苷酸之磷酸基形成磷酸酯鍵，該二價基之3'端之磷酸基與上述引子之引子部分之5'末端之核苷酸之去氧核糖之5'位之羥基形成磷酸酯鍵。
於包含序列編號12之鹼基序列之C28-f引子之5'末端，經由偶氮苯結構附加包含序列編號15之鹼基序列之固定化用標籤1。於包含序列編號13之鹼基序列之C28-r引子之5'末端，同樣地附加包含序列編號14之鹼基序列之標記用標籤1。
使用分別附加標籤後之C28-f引子及C28-r引子之組合作為第1引子組。
序列編號12之鹼基序列為序列編號2之第4634位～第4658位之部分鹼基序列、序列編號7之第581位～第605位之部分鹼基序列。
序列編號13之鹼基序列為序列編號2之第4704位～第4730位之部分鹼基序列之互補鹼基序列、序列編號7之第651位～第677位之部分鹼基序列之互補鹼基序列。
[表2]
| 名稱 | 序列 | 序列編號 |
| C28-f | TCCTCGGAATCGGCACTGTCCGTTG | 12 |
| C28-r | TACAGCAGCTCAACAGTGACACCGAAG | 13 |
| 標記用標籤1 | TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG | 14 |
| 固定化用標籤1 | TGCATCGAGTGACAGCTAATGTGTGAT | 15 |
(II)寡核苷酸結合金膠體之製作
將金膠體(Gold Colloid，40 nm，9.0×1010
(粒子數/ml)，British Biocell International公司製造)與具有表3之序列編號16之鹼基序列之含硫醇基之寡核苷酸進行混合，於50℃下培養16小時。以6000 rpm進行15分鐘離心分離，去除上清液，添加0.05M氯化鈉、5mM磷酸緩衝液(pH值7)進行混合後，再次於50℃下培養40小時。
培養後，進行離心分離(6000 rpm、15分鐘)，去除上清液，添加5mM磷酸緩衝液(pH值7)。再次進行該緩衝液置換。
藉由以上之操作製備寡核苷酸結合金膠體。
將製備之寡核苷酸結合金膠體之懸浮液均勻地添加於玻璃纖維制墊後，利用真空乾燥機進行乾燥，而製成結合墊。
(含硫醇基之寡核苷酸)
含硫醇基之寡核苷酸係包含序列編號16之鹼基序列之寡核苷酸之3'末端之3'位之磷酸基、與HO-(CH2
)m
-SH(m為6)所表示之化合物之羥基藉由磷酸酯鍵結合而成者。
(III)固定有標籤捕捉機構之膜之製作
使用分注器，於Merck Millipore公司製造之硝化纖維素膜(Hi-Flow180)上，以與展開方向正交之寬度1 mm之線狀之方式塗佈含有作為標籤捕捉機構之包含序列編號17之鹼基序列之寡核苷酸探針1之溶液。其後，於40℃下乾燥30分鐘，藉此製作具備標籤捕捉機構之膜。將塗佈有序列編號17之寡核苷酸探針1之線設定為T1線。
[表3]
| 名稱 | 序列 | 序列編號 |
| 含硫醇基之寡核苷酸 | CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA-SH | 16 |
| 寡核苷酸探針1 | ATCACACATTAGCTGTCACTCGATGCA | 17 |
(IV)核酸檢測裝置之製作
依據圖1之模式圖所示之檢測裝置，製作核酸檢測裝置。
即，將作為基材5之聚丙烯製背襯片(Lohmann公司)、作為結合墊2之上述(II)中所製作之結合墊、上述(III)中所製作之於部分6具備作為標籤捕捉機構之寡核苷酸探針1之膜(固相載體)1、作為樣品墊3之玻璃纖維製樣品墊、及作為吸收墊4之纖維素製吸收墊各者如圖1所示般相互重合貼合，製作核酸檢測裝置10。
(V)PCR
使用上述(I)中記載之附加標籤後之第1引子組，依據TaKaRa TaqHS perfect Mix之指南，製備下述PCR用反應液。
[表4]
| 2× TaKaRa TaqHS perfect Mix | 10.0 μl |
| 第1引子組 | |
| 5 μM Fw引子(序列編號12) | 0.5 μl |
| 5 μM Rv引子(序列編號13) | 0.5 μl |
| 模板DNA(1 ng/μl) | 1.0 μl |
| 滅菌蒸餾水 | 8.0 μl |
作為模板DNA，使用由表5所示之抗酸菌株(膿腫分枝桿菌複合群及其他抗酸菌之臨床分離株、分讓株、相近之抗酸菌株)純化之DNA。作為陰性對照，製備除使用1 μL滅菌蒸餾水代替上述模板DNA溶液以外組成相同之PCR反應液。5 μM Fw引子溶液及5 μM Rv引子溶液係使特定引子以濃度成為5 μM之方式溶解於滅菌蒸餾水中而成者。
將PCR反應液設置於PCR裝置(Bioer公司，LifeEco)，於94℃下反應1分鐘後，反覆進行94℃-5秒/62℃-10秒/72℃-5秒之循環35次。
再者，如上所述，針對用於試驗之膿腫分枝桿菌複合群之各株，藉由定序解析來識別為T28株或為C28株。
(VI)使用核酸層析法檢測系之檢測
將上述條件下之PCR後之反應液應用於上述核酸檢測裝置10，嘗試檢測核酸擴增產物。具體而言，於上述器件10上之樣品墊3添加PCR後之反應液5 μL，進而添加80 μL之展開溶液(調配有界面活性劑之檸檬酸緩衝液)，藉此使反應液展開。於室溫下經過10分鐘後，目視確認於膜1上之包含呈線狀固定之標籤捕捉機構之部分6有無T1線之著色。
於確認到T1線之著色之情形時，表示模板DNA中包含於C28株中特異性地存在之序列編號2所示之***鹼基序列，表示獲得源於C28株之核酸擴增產物。
將結果示於表5(表5-1及表5-2)、圖2。表5中，可確認到著色之情形時記為「+」、無法確認到著色之情形時記為「-」。
[表5-1]
[表5-2]
| No. | 株名 | DNA定序法之 解析結果 | 核酸層析法 線著色 |
| 1 | 膿腫分枝桿菌LRC2 | T28 | - |
| 2 | 膿腫分枝桿菌LRC6 | T28 | - |
| 3 | 膿腫分枝桿菌LRC50 | T28 | - |
| 4 | 膿腫分枝桿菌LRC1 | T28 | - |
| 5 | 膿腫分枝桿菌LRC10 | T28 | - |
| 6 | 膿腫分枝桿菌LRC42 | T28 | - |
| 7 | 膿腫分枝桿菌LRC27 | T28 | - |
| 8 | 膿腫分枝桿菌LRC32 | T28 | - |
| 9 | 膿腫分枝桿菌LRC78 | T28 | - |
| 10 | 膿腫分枝桿菌MT11 | C28 | + |
| 11 | 膿腫分枝桿菌MT50 | C28 | + |
| 12 | 膿腫分枝桿菌MT10 | C28 | + |
| 13 | 膿腫分枝桿菌K14 | C28 | + |
| 14 | 膿腫分枝桿菌K16 | C28 | + |
| 15 | 膿腫分枝桿菌K34 | C28 | + |
| 16 | 膿腫分枝桿菌54 | C28 | + |
| 17 | 膿腫分枝桿菌67 | C28 | + |
| 18 | 膿腫分枝桿菌158 | C28 | + |
| 19 | 膿腫分枝桿菌YNKW | C28 | + |
| 24 | 膿腫分枝桿菌LRC18036 | C28 | + |
| 25 | 膿腫分枝桿菌ATCC19977 | T28 | - |
| 26 | 膿腫分枝桿菌JCM15300 | T28 | - |
| 27 | 膿腫分枝桿菌BD | T28 | - |
| 28 | 龜分枝桿菌 | - | |
| 29 | 概念分枝桿菌 | - | |
| 30 | 偶發分枝桿菌 | - | |
| 31 | 休斯頓分枝桿菌 | - | |
| 32 | 嗜鮭分枝桿菌 | - | |
| 33 | 塞內加爾分支桿菌 | - | |
| 34 | 恥垢分枝桿菌 | - | |
| 35 | 戈登分枝桿菌 | - | |
| 36 | 堪薩斯分枝桿菌 | - | |
| 37 | 結核分枝桿菌T1 | - | |
| 38 | 結核分枝桿菌T2 | - | |
| 39 | 結核分枝桿菌T3 | - | |
| 40 | 結核分枝桿菌T4 | - |
| 41 | 結核分枝桿菌T5 | - | |
| 42 | 結核分枝桿菌T6 | - | |
| 43 | 結核分枝桿菌T7 | - | |
| 44 | 結核分枝桿菌T8 | - | |
| 45 | 結核分枝桿菌T9 | - | |
| 46 | 結核分枝桿菌T10 | - | |
| 47 | 鳥分枝桿菌M1 | - | |
| 48 | 鳥分枝桿菌M2 | - | |
| 49 | 鳥分枝桿菌M3 | - | |
| 50 | 鳥分枝桿菌M4 | - | |
| 51 | 鳥分枝桿菌M5 | - | |
| 52 | 鳥分枝桿菌M7 | - | |
| 49 | 鳥分枝桿菌M8 | - | |
| 50 | 鳥分枝桿菌M9 | - | |
| 51 | 鳥分枝桿菌M10 | - | |
| 52 | 陰性對照 | - |
試驗之結果表明所構建之層析法檢測系能夠特異性地檢測膿腫分枝桿菌複合群之erm(41)基因之第28位為胞嘧啶之株(C28株)，確認與T28株或其他抗酸菌種無交叉反應。
＜實施例2＞
基於C28株之基因組DNA中特異性地存在之序列編號2之***鹼基序列之序列資訊，設計特異性地檢測C28株之引子。各引子係以會與***鹼基序列中之部分鹼基序列特異性地雜交，於檢體中包含源自C28株之DNA之情形時引發核酸擴增反應之方式設計。使用所設計之引子進行PCR，利用瓊脂糖凝膠電泳法對核酸擴增產物進行解析，藉此驗證是否可特異性地檢測C28株。
[表6]
| 名稱 | 序列 | 序列編號 | 序列編號2之 ***鹼基序列中之 對應鹼基 |
| 1-C28-1f | GCGCGATGAGACAGGTCACCCG | 18 | 2366-2387 |
| 1-C28-1r | GCAGTCTCTGTGACGGTCAC | 19 | 2682-2701之互補序列 |
| 1-C28-2f | GACGCAGATACGATGGTGCA | 20 | 2634-2653 |
| 1-C28-2r | TGAAACCGGCTGCTGGTGCGATGTG | 21 | 3549-3573之互補序列 |
| 2-C28-1f | CTTCAGCGGCAGCTTCAAGC | 22 | 4054-4073 |
| 2-C28-1r | TTGCACCCAATGCGCCACGGGAG | 23 | 5071-5093之互補序列 |
| 3-C28-1f | CGCACCGTGACGCACAACTCG | 24 | 6545-6565 |
| 3-C28-1r | TCGGCTGCCCGATGGGCCTG | 25 | 6576-6595之互補序列 |
| 4-C28-1f | TCAAGCTTGGCGATGTACTCGTT | 26 | 7488-7510 |
| 4-C28-1r | CGCCCATTCTCCAAATCGGAAATCAC | 27 | 7941-7966之互補序列 |
| 4-C28-2f | GCATTGCGTCCTCCTCCGTTCATGG | 28 | 7639-7663 |
| 4-C28-2r | CTCGTTACCCTCGATTTGTTGCCAC | 29 | 8312-8336之互補序列 |
(I)PCR
分別使用包含表6中記載之序列編號18及19之第2引子組、包含序列編號20及21之第3引子組、包含序列編號22及23之第4引子組、包含序列編號24及25之第5引子組、包含序列編號26及27之第6引子組、包含序列編號28及29之第7引子組，依據TaKaRa TaqHS perfect Mix之指南，製備下述PCR用反應液。
[表7]
| 2× TaKaRa TaqHS perfect Mix | 10.0 μl |
| 第2～7引子組 | |
| 5 μM Fw引子 | 0.5 μl |
| 5 μM Rv引子 | 0.5 μl |
| 模板DNA(1 ng/μl) | 1.0 μl |
| 滅菌蒸餾水 | 8.0 μl |
作為模板DNA，使用分別由膿腫分枝桿菌ATCC19977及膿腫分枝桿菌LRC18036製備之純化基因組DNA。膿腫分枝桿菌ATCC19977為T28株，膿腫分枝桿菌LRC18036為C28株。基於鹼基序列資訊，推測若使用第2引子組，以膿腫分枝桿菌LRC18036之基因組DNA作為模板實施PCR，則特異性地獲得336bp之區域作為核酸擴增產物。若使用第3引子組同樣地實施PCR，則特異性地獲得940bp之區域作為核酸擴增產物。若使用第4引子組同樣地實施PCR，則特異性地獲得1040bp之區域作為核酸擴增產物。若使用第5引子組同樣地實施PCR，則特異性地獲得51bp之區域作為核酸擴增產物。若使用第6引子組同樣地實施PCR，則特異性地獲得479bp之區域作為核酸擴增產物。若使用第7引子組同樣地實施PCR，則特異性地獲得698bp之區域作為核酸擴增產物。另一方面，推測若以作為T28株之膿腫分枝桿菌ATCC19977之基因組DNA作為模板實施PCR，則使用第2～第7引子組均不會獲得核酸擴增產物。
作為陰性對照，製備除使用1 μL滅菌蒸餾水代替上述模板DNA溶液以外組成相同之PCR反應液。5 μM Fw引子溶液及5 μM Rv引子溶液係使用使特定引子以濃度成為5 μM之方式溶解於滅菌蒸餾水中而成者。
將PCR反應液設置於PCR裝置(Bioer公司，LifeEco)，於94℃下反應1分鐘後，反覆進行94℃-5秒/62℃-10秒/72℃-5秒之循環35次。將反應後之PCR反應液供於瓊脂糖凝膠電泳解析，檢測有無核酸擴增產物。將結果示於圖3。於圖3中，A表示藉由瓊脂糖凝膠電泳檢測使用第2引子組之PCR之擴增產物之結果，B表示使用第3引子組之上述結果，C表示使用第4引子組之上述結果，D表示使用第5引子組之上述結果，E表示使用第6引子組之上述結果，F表示使用第7引子組之上述結果。
試驗之結果表明，於使用各引子組之情形時，均僅於檢體中包含源自膿腫分枝桿菌複合群之C28株(膿腫分枝桿菌LRC18036)之DNA時，藉由瓊脂糖凝膠電泳解析確認到特異性之核酸擴增產物。基於該結果，確認藉由檢測有無序列編號2所示之***鹼基序列，能夠特異性地檢測C28株。
本說明書中引用之所有之刊物、專利及專利申請直接以引用之形式併入本說明書中。
1:固相載體
2:結合墊(標記物質保持部)
3:樣品墊(試樣接受部)
4:吸收墊
5:基材
6:包含標籤捕捉機構之部分
10:核酸檢測裝置
圖1係表示核酸檢測裝置10之模式圖。1：固相載體、2：結合墊(標記物質保持部)、3：樣品墊(試樣接受部)、4：吸收墊、5：基材、6：包含標籤捕捉機構之部分。
圖2係表示於實施例2中，藉由核酸層析法檢測PCR之擴增產物所得之結果，上述PCR係將不同之抗酸菌株之基因組DNA作為模板，使用可特異性地擴增序列編號2所示之指標鹼基序列之引子組。
圖3係表示於實施例2中，藉由瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR之擴增產物所得之結果，上述PCR係將膿腫分枝桿菌ATCC19977(T28株)及膿腫分枝桿菌LRC18036(C28株)之基因組DNA作為模板，使用可特異性地擴增序列編號2所示之指標鹼基序列之不同區域的第2～7引子組。圖3中，A表示藉由瓊脂糖凝膠電泳檢測使用第2引子組之PCR之擴增產物之結果，B表示使用第3引子組之上述結果，C表示使用第4引子組之上述結果，D表示使用第5引子組之上述結果，E表示使用第6引子組之上述結果，F表示使用第7引子組之上述結果。
Claims (13)
- 一種判定屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中相當於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位之鹼基為胞嘧啶或為胸腺嘧啶之方法，其包括： 於判定對象之上述抗酸菌之基因組DNA中檢測如下指標鹼基序列之步驟，該指標鹼基序列於上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在， 檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胞嘧啶， 未檢測到上述指標鹼基序列表示上述抗酸菌之基因組DNA中之上述erm(41)基因之上述鹼基為胸腺嘧啶。
- 如請求項1之方法，其中上述指標鹼基序列為序列編號2之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之第1鹼基序列或與上述第1鹼基序列互補之第2鹼基序列。
- 如請求項2之方法，其中上述第1鹼基序列中之至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
- 一種引子組，其係用以在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在， 該引子組包含第1引子與第2引子， 第1引子含有於3'末端包含鹼基序列f12之聚核苷酸，鹼基序列f12能夠與上述指標鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之部分鹼基序列f11之互補鹼基序列雜交， 第2引子含有於3'末端包含鹼基序列r12之聚核苷酸，鹼基序列r12能夠與較上述指標鹼基序列所含之上述部分鹼基序列f11之3'末端更位於3'末端側的連續10個鹼基以上之部分鹼基序列r11雜交。
- 如請求項4之引子組，其中上述指標鹼基序列為序列編號2之鹼基序列所含之連續20個鹼基以上之第3鹼基序列。
- 如請求項5之引子組，其中上述第3鹼基序列所含之自上述部分鹼基序列f11之5'末端之鹼基至部分鹼基序列r11之3'末端之鹼基的鹼基序列中之至少一部分，包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列所含之連續20個鹼基以上之鹼基序列。
- 如請求項5或6之引子組，其中上述部分鹼基序列f11為 (f11-12-1)序列編號2之鹼基序列之第4624～4668位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (f11-18-1)序列編號2之鹼基序列之第2356～2397位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (f11-20-1)序列編號2之鹼基序列之第2624～2663位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (f11-22-1)序列編號2之鹼基序列之第4044～4083位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (f11-24-1)序列編號2之鹼基序列之第6535～6575位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (f11-26-1)序列編號2之鹼基序列之第7478～7520位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、或 (f11-28-1)序列編號2之鹼基序列之第7629～7673位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列， 上述部分鹼基序列r11為 (r11-13-1)序列編號2之鹼基序列之第4694～4740位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (r11-19-1)序列編號2之鹼基序列之第2672～2711位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (r11-21-1)序列編號2之鹼基序列之第3539～3583位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (r11-23-1)序列編號2之鹼基序列之第5061～5103位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (r11-25-1)序列編號2之鹼基序列之第6566～6605位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (r11-27-1)序列編號2之鹼基序列之第7931～7976位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、或 (r11-29-1)序列編號2之鹼基序列之第8302～8346位之範圍之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
- 如請求項4至7中任一項之引子組，其中上述第1引子及上述第2引子之一者進而包含作為能夠與標記物質結合之標籤或標記物質的標記部，另一者進而包含作為能夠與固相載體結合之標籤的結合部。
- 一種套組，其係用以在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在，該套組包含 如請求項8之引子組、與 固相載體，其至少一部分包含能夠與上述結合部結合之部分。
- 一種探針，其係用以在屬於膿腫分枝桿菌複合群之抗酸菌中檢測如下指標鹼基序列者，該指標鹼基序列於erm(41)基因之序列編號1之鹼基序列之第28位相當之鹼基為胞嘧啶之情形時存在於基因組DNA之上述erm(41)基因以外之區域，於上述鹼基為胸腺嘧啶之情形時不存在， 該探針含有如下聚核苷酸，其包含能夠與上述指標鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之部分鹼基序列p1雜交的鹼基序列。
- 如請求項10之探針，其中上述指標鹼基序列為序列編號2之鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之第1鹼基序列或與上述第1鹼基序列互補之第2鹼基序列。
- 如請求項11之探針，其中上述部分鹼基序列p1中之至少一部分包含序列編號3、5、7、9或11之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
- 如請求項11或12之探針，其中上述部分鹼基序列p1為 (p1-12-1)序列編號2之鹼基序列之第4624～4668位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-18-1)序列編號2之鹼基序列之第2356～2397位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-20-1)序列編號2之鹼基序列之第2624～2663位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-22-1)序列編號2之鹼基序列之第4044～4083位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-24-1)序列編號2之鹼基序列之第6535～6575位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-26-1)序列編號2之鹼基序列之第7478～7520位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-28-1)序列編號2之鹼基序列之第7629～7673位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-13-1)序列編號2之鹼基序列之第4694～4740位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-19-1)序列編號2之鹼基序列之第2672～2711位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-21-1)序列編號2之鹼基序列之第3539～3583位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-23-1)序列編號2之鹼基序列之第5061～5103位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-25-1)序列編號2之鹼基序列之第6566～6605位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、 (p1-27-1)序列編號2之鹼基序列之第7931～7976位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列、或 (p1-29-1)序列編號2之鹼基序列之第8302～8346位之範圍之鹼基序列或其互補鹼基序列所含之連續10個鹼基以上之鹼基序列。
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