JP6769982B2 - Ｒａｓ変異と関連するがんの治療方法 - Google Patents

Description

関連技術
本願は、２０１５年３月６日に出願された米国特許仮出願第６２／１２９，６５４号および２０１５年１１月２日に出願された米国特許仮出願第６２／２４９，７８８号（これらの開示は全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）の優先権を主張する。

技術分野
本発明は、化学および医薬の分野に関する。より詳細には、本発明は、プリナブリンを用いた、ＲＡＳ変異に関連するがんの治療方法に関する。

ＲＡＳタンパク質は、細胞内シグナル伝達ネットワークを制御するバイナリー分子スイッチの役割を果たす。ＲＡＳ調節シグナル経路は、アクチン細胞骨格完全性、増殖、分化、細胞接着、アポトーシス、および細胞遊走などの過程を制御する。ＲＡＳサブファミリーは、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳなどの少なくとも２１のメンバーを含む。ＲＡＳまたはＲＡＳ関連タンパク質は、細胞の外側から細胞核へシグナルを中継する。これらのシグナルは、細胞に***・成長を指示または成熟して特定の機能を獲得する（分化する）ように指示する。ＲＡＳタンパク質は、ＧＴＰと呼ばれる分子をＧＤＰと呼ばれる別の分子に転換することを意味するＧＴＰアーゼと呼ばれるタンパク質の分類に属する。ＲＡＳタンパク質は、スイッチの様に作用し、ＧＴＰ分子およびＧＤＰ分子によりオンオフされる。シグナルを伝達するため、ＲＡＳタンパク質は、ＧＴＰ分子とくっつくこと（結合）によりオンされなければならない。ＧＴＰをＧＤＰに転換する場合、ＲＡＳタンパク質はオフ（不活性化）される。タンパク質がＧＤＰと結合している場合、シグナルを細胞核に中継しない。ＲＡＳタンパク質が特定のコドンにおいて変異している場合、ＲＡＳタンパク質は、そのＧＴＰ結合状態で動きが取れないので、核にシグナルを送信し続けて細胞は***を止めることができず、これは制御されない細胞成長またはがんである。

ＲＡＳ遺伝子は、がん遺伝子として公知の遺伝子分類に属する。ＲＡＳ遺伝子の変異型は、正常な細胞をがんにする可能性を有する。これらのＲＡＳ遺伝子から産生したタンパク質は、ＧＴＰアーゼである。これらのタンパク質は、細胞***、細胞分化、および細胞アポトーシスにおいて重要な役割をする。しかしながら、発がん性ＲＡＳが腫瘍増殖を持続する代謝、特に腫瘍内微小環境における変化を調整することによる機序、および特定の代謝経路がＲＡＳ媒介腫瘍維持に必須であるかどうかは、今なお、活発に研究されている。ＲＡＳ変異を特徴とするがんは、公知の治療法を用いて治療するのが困難であり、これらのがんの治療用の承認薬はない。ＲＡＳ変異は、がん患者生存の負の予測因子であり；患者のがんがＲＡＳ変異を有する場合、がん患者の予後はより不良となる（またはより短い全生存）。従って、発がん性ＲＡＳ遺伝子変異と関連するがんのより効果的な治療の切迫したアンメットニーズがある。

いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、ＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんの治療方法に関する。

いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、ＫＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんの治療方法に関する。

いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、ＮＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんの治療方法に関する。

いくつかの実施形態は、細胞をプリナブリンと接触させることを含む、ＲＡＳ変異を有する細胞の増殖阻害方法に関する。

いくつかの実施形態は、細胞をプリナブリンと接触させることを含む、ＲＡＳ変異を有する細胞のアポトーシス誘導方法に関する。

いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、対象のＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんの進行阻害方法に関する。

図１ａ〜１ｄは、ヒト病態を模倣するグリオブラストーマ（ＧＢＭ）の前神経遺伝子組み換えマウスモデル（ＧＥＭＭ）を示す。図１ａは、腫瘍周囲の浮腫を示すヒトＧＢＭのＴ２ ＭＲＩ画像を示し；図１ｂは、腫瘍周囲の浮腫を示すマウスＧＢＭのＴ２ ＭＲＩ画像を示し；図１ｃは、特徴的な偽柵状ネクローシスおよび微小血管増殖を示すＧＢＭのＨ＆Ｅ染色のヒト顕微鏡写真画像を示し；図１ｄは、特徴的な偽柵状ネクローシスおよび微小血管増殖を示すＧＢＭのＨ＆Ｅ染色のマウス顕微鏡写真画像を示す。 媒体、テモゾロミドまたは分割放射線照射で治療したＰＤＧＦ誘導グリオーマを有するマウスの腫瘍サイズを示す。 媒体のみ、ドセタキセルのみ、ならびにプリナブリンおよびドセタキセルの組合せで治療したマウスの腫瘍重量剖検を示す。 コントロールおよびプリナブリンで治療されたＫＲＡＳ変異の発現を特徴とするＰＤＧＦ誘導グリオーマを有するマウスの生存率を示す。 プリナブリン、テモゾロミド、および放射線の組合せならびにテモゾロミドおよび放射線の組合せで治療されたＫＲＡＳ変異の発現を特徴とするＰＤＧＦ誘導グリオーマを有するマウスの生存率を示す。 媒体コントロール、プリナブリン、イリノテカン、またはプリナブリンおよびイリノテカンの組合せで治療されたマウスの試験過程を通じたＨＣＴ−１５（Ｋｒａｓ変異Ｇ１３Ｄ）ヒト結腸腫瘍異種移植片を有するマウスの腫瘍量の変化を示す。 媒体コントロール、プリナブリン、イリノテカン、またはプリナブリンおよびイリノテカンの組合せで治療されたマウスの試験過程を通じたＬｏｖｏ（Ｋｒａｓ変異、ｐ．Ｇ１３Ｄ）ヒト結腸腫瘍異種移植片を有するマウスの腫瘍量の変化を示す。

プリナブリン、（３Ｚ，６Ｚ）−３−ベンジリデン−６−｛［５−（２−メチル−２−プロパニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］メチレン｝−２，５−ピペラジンジオンは、天然化合物フェニルアヒスチンの合成類似体である。
プリナブリンを、米国特許第７，０６４，２０１号および同第７，９１９，４９７号（その全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）に記載の方法および手順に従って容易に製造できる。いくつかの実施形態は、発がん性ＲＡＳ変異と関連するがん治療のためのプリナブリンの使用に関する。
いくつかの実施形態は、対象のＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがん治療のためのプリナブリンの使用に関する。いくつかの実施形態は、ＲＡＳ変異を有する細胞の増殖阻害のためのプリナブリンの使用に関する。いくつかの実施形態は、ＲＡＳ変異を有する細胞のアポトーシス誘導のためのプリナブリンの使用に関する。いくつかの実施形態は、対象のＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんの進行阻
害のためのプリナブリンの使用に関する。いくつかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質はＫＲＡＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質はＮＲＡＳタンパク質である。

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全技術および科学用語は、本開示に属する分野の当業者により共通に理解されるのと同じ意味を有する。全特許、出願、公開された出願、および他の出版物は、その全文を参照することにより組み入れられる。本明細書の用語の複数の定義がある場合、特に指定されない限り、本節中のものが適用される。

本明細書で使用するとき、「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類または鳥類、例えば、ニワトリ、ならびにその他の脊椎動物または無脊椎動物を意味する。

「哺乳類」という語は、その通常の生物学上の意味で使用される。従って、詳細には、サル（チンパンジー、類人猿、サル）を含む霊長類およびヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ラット、マウス、モルモット等が挙げられるが、これに限定されない。

本明細書で使用するとき、「効果量」または「治療効果量」は、疾病もしくは病状の１つ以上の症状をある程度軽減する、またはその発症の可能性を減らす効果があり、疾病または病状を治癒させることを含む治療薬の量を表す。

本明細書で使用するとき、「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、予防および／または治療目的のために対象に化合物または医薬組成物を投与することを表す。「予防的治療」という語は、疾病もしくは病状の徴候をまだ示していないが特定の疾病もしくは病状に罹患し易い、さもなければそのリスクがある対象を治療して、それにより、治療が、患者が該疾病もしくは病状にかかる可能性を減らすことを表す。「治療処置」という語は、既に疾病または病状に罹患している対象への投与治療を表す。

「薬剤的に許容可能な塩」という語は、化合物の生物学的効果および特性を保持し、生物学的またはその他の意味において医薬品用途に有害でない塩を表す。ほとんどの場合、本明細書で開示された化合物は、アミノ基および／もしくはカルボキシル基またはそれと類似の基の存在によって酸塩および／または塩基塩を形成できる。薬剤的に許容可能な酸付加塩を無機酸および有機酸と生成できる。塩を誘導できる無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられる。塩を誘導できる有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等が挙げられる。薬剤的に許容可能な塩も、無機塩基および有機塩基を用いて生成できる。塩を誘導できる無機塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム等を含有する塩基が挙げられ；特に好ましいのは、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩である。いくつかの実施形態では、無機塩基との本明細書に開示の化合物の治療は、該化合物の反応活性水素を失って、Ｌｉ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋およびＣａ^２＋等の無機カチオンを含む塩形態を得る。塩を誘導できる有機塩基としては、例えば、第一級、第二級、および第三級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂等、特に、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンが挙げられる。１９８７年９月１１日に公開されたＪｏｈｎｓｔｏｎらの国際公開第８７／０５２９７
号（その全文を参照することにより本明細書に組み入れられる）に記載されているように、多くのこのような塩は当技術分野で公知である。

いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の薬剤的に許容可能な希釈剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、薬剤的に許容可能な希釈剤は、コリフォール（登録商標）（ポリエチレングリコール（１５）−ヒドロキシステアレート）を含むことができる。いくつかの実施形態では、薬剤的に許容可能な希釈剤は、プロピレングリコールを含むことができる。いくつかの実施形態では、薬剤的に許容可能な希釈剤は、コリフォールおよびプロピレングリコールを含むことができる。いくつかの実施形態では、薬剤的に許容可能な希釈剤は、コリフォールおよびプロピレングリコールを含むことができ、希釈剤の総重量に対して、コリフォールは約４０重量％であり、プロピレングリコールは約６０重量％である。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の他の薬剤的に許容可能な賦形剤をさらに含むことができる。

標準的製剤処方技術を、Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005)（その全文を参照することにより本明細書に組み入れられる）に記載のものなど、本明細書に記載の医薬組成物を製造するために使用できる。従って、いくつかの実施形態は：（ａ）プリナブリンまたはその薬剤的に許容可能な塩の安全かつ治療効果のある量；および（ｂ）薬剤的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤またはその組合せを含む医薬組成物を含む。

他の実施形態は、別々の組成物または同じ組成物で、プリナブリンおよび追加の治療薬の同時投与を含む。従って、いくつかの実施形態は、（ａ）プリナブリンまたはその薬剤的に許容可能な塩の安全かつ治療効果のある量および（ｂ）薬剤的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤またはその組合せを含む第一医薬組成物；ならびに（ａ）追加の治療薬の安全かつ治療効果のある量および（ｂ）薬剤的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤またはその組合せを含む第二医薬組成物を含む。いくつかの実施形態は、（ａ）プリナブリンまたはその薬剤的に許容可能な塩の安全かつ治療効果のある量；（ｂ）追加の治療薬の安全かつ治療効果のある量；および（ｃ）薬剤的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤またはその組合せを含む医薬組成物を含む。

本明細書に記載の医薬組成物の投与は、これに限定されないが、経口、舌下、口腔、皮下、静脈内、鼻腔内、局所、経皮、皮内、腹腔内、筋肉内、肺内、腟内、直腸内、または眼内を含む同様な有用性を果たす薬剤の投与の許容された方法のいずれでもよい。経口および非経口投与は、好ましい実施形態の対象である徴候を治療する際にお決まりのことである。

「薬剤的に許容可能な担体」または「薬剤的に許容可能な賦形剤」という語は、いずれかおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を包含する。医薬作用物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤が有効成分と相溶性がない場合を除き、治療組成物での使用が期待される。加えて、当技術分野で共通に使用されるような様々なアジュバントを含有してもよい。医薬組成物中への様々な成分の含有についての考察は、例えば、Gilman et al. (Eds.) (1990); Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press（その全文を参照することにより本明細書に
組み入れられる）に記載されている。

薬剤的に許容可能な担体またはその成分の役割ができる物質のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびショ糖などの糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、お
よびメチルセルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの固形潤滑剤；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオ油などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類；アルギン酸；ツイーンなどの乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；香味料；打錠薬剤、安定剤；酸化防止剤；防腐剤；発熱物質なしの水；等張食塩水；およびリン酸緩衝液である。

本明細書に記載の組成物を好ましくは単位剤形で提供する。本明細書で使用するとき、「単位剤形」は、適正な医療行為に従って、１回の投与で動物、好ましくは哺乳類対象に投与するのに適切な化合物または組成物の量を含有する組成物である。しかしながら、１回または単位剤形の製剤は、該剤形を１日１回または治療過程当たり１回投与することを意味しない。このような剤形は、１日１回、２回、３回またはそれ以上投与されると考えられ、ある期間（例えば、約３０分から約２〜６時間まで）にわたって点滴で投与してもよく、または持続点滴として投与してもよく、１回の投与を特に除外しないが、治療過程中に１回より多く与えられてもよい。製剤形態が治療全過程を特に予期せず、このような決定は製剤形態よりむしろ治療の当業者に委ねられると当業者は認識するだろう。

上記有用な組成物は、様々な投与経路、例えば、経口、舌下、口腔、鼻腔、直腸、局所（経皮および皮内を含む）、眼、脳内、頭蓋内、くも膜下腔内、動脈内、静脈内、筋肉内、または他の非経口投与経路用に適切な形態のいずれでもよい。経口および鼻腔用組成物は、吸入により投与され、利用可能な方法により製造される組成物を含むと当業者は認識するだろう。所望の特定の投与経路に応じて、当技術分野で周知の様々な薬剤的に許容可能な担体を使用してもよい。薬剤的に許容可能な担体としては、例えば、固形または液体充填剤、希釈剤、ヒドロトロピー剤、界面活性剤、およびカプセル化物質が挙げられる。必要に応じて、化合物または組成物の活性と実質的に干渉しない医薬活性物質を含有してもよい。化合物または組成物と共に使用する担体の量は、化合物の単位用量当たり投与する物質の実用量を提供するのに充分なものである。本明細書に記載の方法で有用な剤形を製剤するための技術および組成物は、以下の参考文献（全て参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている：Modern Pharmaceutics, 4th Ed., Chapters 9 and 10 (Banker & Rhodes, editors, 2002); Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets (1989); and Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 8th Edition
(2004)。

錠剤、カプセル剤（例えば、液体ゲルカプセルおよび固体ゲルカプセル）、顆粒剤および混合散剤などの固体形態を含む様々な経口用剤形を使用できる。適切な結合剤、潤滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、香味料、流動誘導剤、および溶融剤を含み、圧縮錠剤、粉薬錠剤、腸溶錠剤、糖衣錠剤、フィルムコート錠剤、または多重圧縮錠剤であり得る。液体経口用剤形としては、適切な溶媒、防腐剤、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味料、溶融剤、着色剤および香味料を含有する、水性液剤、乳剤、懸濁剤、非発泡性顆粒剤から再構成した液剤および／または懸濁剤、ならびに発泡性顆粒剤から再構成した発泡性製剤が挙げられる。

経口投与用単位剤形の製剤に適切な薬剤的に許容可能な担体は、当技術分野で周知である。錠剤は、通常、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、ラクトースおよびセルロースなどの不活性希釈剤；デンプン、ゼラチンおよびショ糖などの結合剤；デンプン、アルギン酸およびクロスカルメロースなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびタルクなどの潤滑剤として従来の薬剤的に適合するアジュバントを含む。二酸化ケイ素などの流動促進剤を使用して、粉末混合物の流動特性を改良できる。ＦＤ＆Ｃ染料などの着色剤を外観のために使用できる。アスパルテーム、サッカリン、メント
ール、ペパーミント、および果実フレーバーなどの甘味料および香料はチュアブル錠用に有用なアジュバントである。カプセル剤は、通常、上記に開示の１つ以上の固体希釈剤を含む。担体成分の選択は、味、費用、および保存性など、重要でない二次的考察に依存し、当業者により容易に製造できる。

経口用組成物としては、液剤、乳剤、懸濁剤等も挙げられる。このような組成物の製剤に適切な薬剤的に許容可能な担体は、当技術分野で周知である。シロップ剤、エリキシル剤、乳剤および懸濁剤用担体の典型的成分としては、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液状ショ糖、ソルビトールおよび水が挙げられる。懸濁剤のため、典型的懸濁剤としては、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ＡＶＩＣＥＬ ＲＣ−５９１、トラガントおよびアルギン酸ナトリウムが挙げられ；典型的な湿潤剤としては、レクチンおよびポリソルベート８０が挙げられ；典型的防腐剤としては、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムが挙げられる。経口用液体組成物は、上記開示の甘味料、香料および着色剤などの１つ以上の成分を含有してもよい。

このような組成物を、対象組成物が所望の局所用途の近傍の胃腸管内で、または所望の作用が広がる様々な時間において放出されるように、通常、ｐＨまたは時間依存性コーティングを用いた従来方法によりコーティングしてもよい。このような剤形としては、典型的には、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、オイドラギットコーティング、ワックスおよびシェラックの１つ以上が挙げられるが、これに限定されない。

本明細書に記載の組成物は、必要に応じて他の薬効成分を含んでもよい。

対象化合物の全身送達を達成するために有用な他の組成物としては、舌下、口腔および鼻腔用剤形が挙げられる。このような組成物は、典型的には、ショ糖、ソルビトールおよびマンニトールなどの可溶充填物質；およびアカシア、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの結合剤の１つ以上を含む。上記開示の流動促進剤、潤滑剤、甘味料、着色料、酸化防止剤および香料も含んでもよい。

局所用眼科用途に処方された液体組成物を、眼に局所投与できるように製剤する。時々、製剤検討（例えば、薬剤安定性）があまり最適な快適さを必要としなくてもよいが、快適さを可能な限り最大化してもよい。快適さが最大化できない場合、局所眼科用途の患者に受け入れられるように液体を製剤してもよい。加えて、眼科的に許容可能な液体を、単回使用用に包装してもよく、あるいは複数回の使用にわたって汚染を防止するために防腐剤を含有してもよい。

眼科用途のため、液剤または薬剤を多くの場合主要な媒体として生理食塩水を用いて製剤する。好ましくは、眼科用液剤を適切な緩衝系を用いて快適なｐＨに維持してもよい。製剤は、従来の薬剤的に許容可能な防腐剤、安定剤および界面活性剤も含有してもよい。

本明細書に開示の医薬組成物中に使用してもよい防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、ＰＨＭＢ、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、および硝酸フェニル水銀が挙げられるが、これに限定されない。有用な界面活性剤は、例えば、ツイーン８０である。同様に、様々な有用な媒体を、本明細書に開示の眼科用製剤で使用してもよい。これらの媒体としては、ポリビニルアルコール、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよび精製水が挙げられるが、これに限定されない。

等張調整剤を必要に応じてまたは都合に応じて添加してもよい。等張調整剤としては、塩、特に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールおよびグリセリン、または他の適切な眼科的に許容可能な等張調整剤が挙げられるが、これに限定されない。

得られた製剤が眼科的に許容可能である限り、様々な緩衝液およびｐＨを調節するための手段を使用してもよい。多くの組成物のため、ｐＨは、４〜９であるだろう。従って、緩衝液としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液およびホウ酸緩衝液が挙げられる。酸または塩基を使用して、必要に応じて、これらの製剤のｐＨを調節してもよい。

眼科的に許容可能な酸化防止剤としては、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソールおよびブチル化ヒドロキシトルエンが挙げられるが、これに限定されない。

眼科用製剤に含有してもよい他の賦形剤成分は、キレート剤である。他のキレート剤も代わりにまたはこれと共に使用してもよいが、有用なキレート剤はエデト酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）である。

局所用途のため、本明細書に開示の組成物を含有するクリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、液剤または懸濁剤、他を使用する。局所用製剤は、概して、医薬用担体、共溶媒、乳化剤、浸透促進剤、防腐剤系、および皮膚軟化薬から成り得る。

静脈内投与のため、本明細書に記載の組成物を、食塩水またはブドウ糖液などの薬剤的に許容可能な希釈剤中に溶解または分散してもよい。適切な賦形剤を含有して、所望のｐＨを達成してもよく、ＮａＯＨ、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＣｌ、およびクエン酸が挙げられるが、これに限定されない。様々な実施形態では、最終組成物のｐＨは、２〜８、または好ましくは４〜７の範囲である。酸化防止賦形剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、アセトン−重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、チオ尿素、およびＥＤＴＡが挙げられ得る。最終静脈内組成物中に見られる適切な賦形剤の他の非限定的な例としては、リン酸ナトリウムまたはカリウム、クエン酸、酒石酸、ゼラチン、およびブドウ糖、マンニトール、およびデキストランなどの炭水化物が挙げられ得る。さらに許容可能な賦形剤は、Powell, et al., Compendium of Excipients for Parenteral Formulations, PDA J Pharm Sci and Tech 1998, 52 238-311および Nema et al., Excipients and Their Role in Approved Injectable Products: Current Usage and Future Directions, PDA J Pharm Sci and Tech 2011, 65 287-332（これら両方ともその全文を参照することにより本明細書に組み入れられる）に記載されている。抗菌剤を含有して、静菌性または静真菌性溶液を達成してもよく、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、およびクロロブタノールが挙げられるが、これに限定されない。

静脈内投与用組成物を、投与のすぐ前に滅菌水、食塩水またはブドウ糖水溶液などの適切な希釈剤で再構成する１つ以上の固体の形態で医療提供者に提供してもよい。他の実施形態では、組成物をすぐに非経口投与できる液剤で提供する。さらに他の実施形態では、組成物を投与前にさらに希釈する液剤で提供する。本明細書に記載の組成物および別の薬剤の組合せを投与することを含む実施形態では、この組合せを混合物として医療提供者に提供してもよく、または医療提供者が投与前に２つの薬剤を混合してもよく、２つの薬剤を別々に投与してもよい。

本明細書に記載の活性化合物の実際の用量は具体的な化合物、および治療する病状に依存し；適切な用量の選択は充分に熟練技術者の知見の範囲内である。いくつかの実施形態
では、プリナブリンまたは他の治療薬の単回用量は、体表面積の約５ｍｇ／ｍ^２〜約１５０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約５ｍｇ／ｍ^２〜約１００ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１０ｍｇ／ｍ^２〜約１００ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１０ｍｇ／ｍ^２〜約８０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１０ｍｇ／ｍ^２〜約５０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１０ｍｇ／ｍ^２〜約４０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１０ｍｇ／ｍ^２〜約３０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１３．５ｍｇ／ｍ^２〜約１００ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１３．５ｍｇ／ｍ^２〜約８０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１３．５ｍｇ／ｍ^２〜約５０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１３．５ｍｇ／ｍ^２〜約４０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１３．５ｍｇ／ｍ^２〜約３０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１５ｍｇ／ｍ^２〜約８０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１５ｍｇ／ｍ^２〜約５０ｍｇ／ｍ^２、体表面積の約１５ｍｇ／ｍ^２〜約３０ｍｇ／ｍ^２であり得る。いくつかの実施形態では、プリナブリンまたは他の治療薬の単回用量は、体表面積の約１３．５ｍｇ／ｍ^２〜約３０ｍｇ／ｍ^２であり得る。いくつかの実施形態では、プリナブリンまたは他の治療薬の単回用量は、体表面積の約５ｍｇ／ｍ^２、約１０ｍｇ／ｍ^２、約１２．５ｍｇ／ｍ^２、約１３．５ｍｇ／ｍ^２、約１５ｍｇ／ｍ^２、約１７．５ｍｇ／ｍ^２、約２０ｍｇ／ｍ^２、約２２．５ｍｇ／ｍ^２、約２５ｍｇ／ｍ^２、約２７．５ｍｇ／ｍ^２、約３０ｍｇ／ｍ^２、約４０ｍｇ／ｍ^２、約５０ｍｇ／ｍ^２、約６０ｍｇ／ｍ^２、約７０ｍｇ／ｍ^２、約８０ｍｇ／ｍ^２、約９０ｍｇ／ｍ^２、または約１００ｍｇ／ｍ^２であり得る。

いくつかの実施形態では、プリナブリンまたは他の治療薬の単回用量は、約５ｍｇ〜約３００ｍｇ、約５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約７．５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約３０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約８０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約８０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約８０ｍｇ、約３０ｍｇ〜約８０ｍｇ、約４０ｍｇ〜約８０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約６０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約６０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約６０ｍｇ、約３０ｍｇ〜約６０ｍｇ、または約４０ｍｇ〜約６０ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、プリナブリンまたは他の治療薬の単回用量は、約２０ｍｇ〜約６０ｍｇ、約２７ｍｇ〜約６０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約４５ｍｇ、約２７ｍｇ〜約４５ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、プリナブリンまたは他の治療薬の単回用量は、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１２．５ｍｇ、約１３．５ｍｇ、約１５ｍｇ、約１７．５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２２．５ｍｇ、約２５ｍｇ、約２７ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、または約２００ｍｇであり得る。

腫瘍が制御下にあり続け、レジメンが臨床的に忍容される限り、投与期間は複数週治療サイクルであり得る。いくつかの実施形態では、プリナブリンまたは他の治療薬の単回投薬量を、週１回、好ましくは３週（２１日）治療サイクルの１日目および８日目の各々に１回投与できる。いくつかの実施形態では、プリナブリンまたは他の治療薬の単回投薬量を、週１回、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、または１週間、２週間、３週間、４週間、もしくは５週間治療サイクル中毎日投与できる。治療サイクルの各週の同日または異なる日に投与できる。

レジメンが臨床的に忍容される限り、治療サイクルを繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、治療サイクルをｎ回繰り返し、ｎは２〜３０の範囲の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、前の治療サイクル完了直後に新しい治療サイクルを起こすことができる。いくつかの実施形態では、前の治療サイクル完了後ある期間で新しい治療サイクルを起こすことができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物を、他の治療薬と併用して使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物を、化学療法、放射線療法、およ
び生物学的療法などの治療と組み合わせて投与または使用できる。

治療方法
いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、ＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんの治療方法に関する。いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、発がん性ＲＡＳ変異と関連するがんの治療方法に関する。

いくつかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質の変異型は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳタンパク質の変異型である。いくつかの実施形態では、ＲＡＳタンパク質は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＲＡＳの変異型は、ＫＲＡＳタンパク質の変異型である。いくつかの実施形態では、ＲＡＳの変異型は、ＮＲＡＳタンパク質の変異型である。いくつかの実施形態では、ＲＡＳ遺伝子変異は、ＫＲＡＳ遺伝子変異である。いくつかの実施形態では、ＲＡＳ遺伝子変異は、ＮＲＡＳ遺伝子変異である。

いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、ＫＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんの治療方法に関する。いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、発がん性ＫＲＡＳ変異と関連するがんの治療方法に関する。

いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、ＮＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんの治療方法に関する。いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む、発がん性ＮＲＡＳ変異と関連するがんの治療方法に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、プリナブリンおよび本明細書に記載のプリナブリンを含む組成物を用いたがんの治療方法を含む。いくつかの方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の化合物、組成物、医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は動物、例えば、哺乳類、ヒトであり得る。

いくつかの実施形態では、がんは、結腸直腸がん、膵がん、腎がん、肺がん、肝がん、乳がん、前立腺がん、胃腸がん、腹膜がん、メラノーマ、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頚がん、子宮がん、膀胱がん、グリオブラストーマ、転移性脳腫瘍、唾液腺がん、甲状腺がん、脳がん、リンパ腫、骨髄腫、および頭頚部がんから選択される。いくつかの実施形態では、がんは、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺の扁平上皮がん、肝細胞がん、結腸がん、子宮内膜がん、および肝細胞がんから選択される。いくつかの実施形態では、がんは、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、子宮内膜がん、多発性骨髄腫、膵がん、腎がん、およびグリオブラストーマから選択される。いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺がん、膵がん、およびグリオブラストーマから選択される。いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺がんである。

いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳは、コドン１２、１３、５９、および６１から選択される１つ以上の位置において変異を含む。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２、Ｇ１３、Ｓ１７、Ｐ３４、Ａ５９、およびＱ６１から選択される１つ以上のアミノ酸位置において変異を有する。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実
施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２、Ｇ１３、Ａ５９、Ｑ６１、Ｋ１１７およびＡ１４６から選択される１つ以上のアミノ酸位置において変異を有する。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ｋ１１７Ｒ、Ｋ１１７Ｅ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２、Ｇ１３、Ａ５９およびＱ６１から選択される１つ以上のアミノ酸位置において変異を有する。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１ＲおよびＱ６１Ｈから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２、Ｇ１３およびＤ１５３から選択される１つ以上のアミノ酸位置において変異を有する。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１３Ｄ、およびＤ１５３Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＳおよびＤ１５３Ｖから選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳは、コドン１２、１３、５９、６１、および１４６から選択される１つ以上の位置において変異を含む。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２、Ｇ１３、Ａ５９、Ｑ６１、Ｋ１１７およびＡ１４６から選択される１つ以上のアミノ酸位置において変異を有する。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ａ５９Ｄ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ｋ１１７Ｒ、Ｋ１１７Ｅ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｑ６１またはＡ１４６の１つ以上のアミノ酸位置において変異を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｎ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｖ、およびそのいずれかの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳタンパク質の変異型は、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｌ、およびそのいずれかの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含むＲＡＳ変異を有する細胞の増殖阻害方法に関する。いくつかの実施形態は、細胞をプリナブリンと接触させることを含む、ＲＡＳ変異を有する細胞のアポトーシス誘導方法に関する。いくつかの実施形態では、接触は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、細胞をプリナブリンと接触させることを含む、対象のＲＡＳの変異型を発現することを特徴とするがんの進行阻害方法に関する。いくつかの実施形態では、接触は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含む。

いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含むＫＲＡＳ変異を有する細胞の増殖阻害方法に関する。いくつかの実施形態は、細胞をプリナブリンと接触させることを含む、ＫＲＡＳ変異を有する細胞のアポトーシス誘導方法に関する。いくつかの実施形態は、細胞をプリナブリンと接触させることを含む、対象のＫＲＡＳの変異型を発現することを特徴とするがんの進行阻害方法に関する。

いくつかの実施形態は、それを必要とする対象にプリナブリンを投与することを含むＮ
ＲＡＳ変異を有する細胞の増殖阻害方法に関する。いくつかの実施形態は、細胞をプリナブリンと接触させることを含む、ＮＲＡＳ変異を有する細胞のアポトーシス誘導方法に関する。いくつかの実施形態は、細胞をプリナブリンと接触させることを含む、対象のＮＲＡＳの変異型を発現することを特徴とするがんの進行阻害方法に関する。

いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

さらなる実施形態は、それを必要とする対象に化合物の組合せを投与することを含む。組合せは、追加の薬物と一緒に、本明細書に記載の化合物、組成物、医薬組成物を含むことができる。

いくつかの実施形態は、本明細書に記載の化合物、組成物、および／または医薬組成物を追加の薬物と一緒に同時投与することを含む。「同時投与」とは、いつまたはどのようにそれらを実際に投与するかにかかわらず、２つ以上の薬剤が同時に患者の血流中に見られ得ることを意味する。１つの実施形態では、薬剤を同時に投与する。１つのこのような実施形態では、１つの剤形中に薬剤を混ぜ合わせることにより組合せ投与を行う。別の実施形態では、薬剤を逐次投与する。１つの実施形態では、経口など同じ経路により薬剤を投与する。別の実施形態では、１つは経口投与し、もう１つは静脈内投与するなど異なる経路により薬剤を投与する。

本明細書に記載の治療方法は、プリナブリンを追加の活性薬剤と一緒に同時投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、方法は、追加の治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の治療薬がドセタキセルであり、がんがヒト非小細胞肺がんである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬がベバシズマブであり、がんがヒト非小細胞肺がんである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬がイリノテカンであり、がんが結腸がんである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬がテモゾロミドであり、がんがグリオブラストーマである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬がイリノテカンであり、がんが結腸がんである。

いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、テモゾロミド、ベバシズマブ（ｂｅｖｉｃｉｚｕｍａｂ）、エベロリムス、カルムスチン、ロムスチン、プロカルバジン、ビンクリスチン、イリノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート（ｍｅｔｈａｔｒｅｘａｔｅ）、エトポシド、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓａｔｉｎｅ）、ブレオマイシン、アクチノマイシン、シクロホスファミド、またはイホスファミドであり得る。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、ベバシズマブ、ドセタキセル、イリノテカン、およびテモゾロミドから選択される。いくつかの実施形態では、追加の治療薬はドセタキセルである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬はイリノテカンである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬はベバシズマブである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬はテモゾロミドである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬はゲムシタビンである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬はカルムスチンである。いくつかの実施形態では、追加の治療薬はロムスチンである。

本明細書に記載の治療方法は、放射線療法と併用して使用もできる。

本明細書に記載の方法は、ＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんを有する患者を同定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、患者の同定は、該患者がＲＡＳ変異を有するかどうかを決定することを含むことができる。いくつかの実施形態は、ＲＡＳ変異を有すると確認された患者のがんの治療方法に関し、該方法は、プリナブリンの薬剤的に効果のある量を患者に投与することを含み、該患者は、（ｉ）患者から試料を集め；（ｉｉ）試料からＤＮＡを単離し；（ｉｉｉ）単離ＤＮＡの
ＲＡＳ遺伝子またはそのフラグメントを増幅し；および（ｉｖ）増幅したＲＡＳ遺伝子中に変異があるかどうか検出することにより患者がＲＡＳ変異を特徴とするがんを有するかどうかを決定することにより同定される。ＲＡＳ変異の検出方法の例としては、拡大難治性変異システム（ＡＲＭＳ）ＰＣＲ、ＢＥＡＭｉｎｇアッセイ、デジタルＰＣＲ、および他の適切なプライマー、およびシークエンシングまたはＰＣＲ用プローブが挙げられるが、これに限定されない。

本明細書に記載の方法は、ＫＲＡＳの変異型を発現することを特徴とするがんを有する患者を同定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、患者の同定は、該患者がＫＲＡＳ変異を有するかどうかを決定することを含むことができる。いくつかの実施形態は、ＫＲＡＳ変異を有すると確認された患者のがんの治療方法に関し、該方法は、プリナブリンの薬剤的に効果のある量を患者に投与することを含み、該患者は、（ｉ）患者から試料を集め；（ｉｉ）試料からＤＮＡを単離し；（ｉｉｉ）単離ＤＮＡのＫＲＡＳ遺伝子またはそのフラグメントを増幅し；および（ｉｖ）増幅したＫＲＡＳ遺伝子中に変異があるかどうか検出することにより患者がＫＲＡＳ変異を特徴とするがんを有するかどうかを決定することにより同定される。

本明細書に記載の方法は、ＫＲＡＳ変異についての試験をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、例えば、コドン１２、１３、５９、６１および／または１４６におけるＫＲＡＳ変異を、患者から採取した病変試料から検出してもよい。このような試験のいくつかの実施形態では、ＤＮＡを試料から取り出し、検出可能になるように標的の変異ＤＮＡを増幅するためにＰＣＲを用いて標識化オリゴヌクレオチドプローブに対して試験する。いくつかの実施形態では、商業試験センターはこのような試験を実施できる。いくつかの実施形態では、ＴｈｅｒａＳｃｒｅｅｎ：Ｋ−ＲＡＳ変異キット（ＤｘＳ Ｌｔｄ、英国マンチェスターＭ１ ３ ９ＸＸ、グラフトンストリート４８）などの試験キットを使用してもよい。例えば、ＴｈｅｒａＳｃｒｅｅｎキットは、Ｋ−ＲＡＳ発がん遺伝子のコドン１２および１３の変異を検出できる：
ＧＩｙ １２ Ａｓｐ（ＧＧＴ＞ＧＡＴ）ＧＩｙ １２ Ａｒｇ（ＧＧ１＞ＣＧＴ）
ＧＩｙ １２ Ａｌａ（ＧＧＴ＞ＧＣＴ）ＧＩｙ １２ Ｃｙｓ（ＧＧＴ＞ＴＧＴ）
ＧＩｙ １２ ＶａＩ（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）ＧＩｙ １３ Ａｓｐ（ＧＧＯＧＡＣ）
Ｇｌｙ ｌ２ Ｓｅｒ（ＧＧＴ＞ＡＧＴ）

本明細書に記載の方法は、ＮＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんを有する患者を同定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、患者の同定は、該患者がＮＲＡＳ変異を有するかどうかを決定することを含むことができる。いくつかの実施形態は、ＮＲＡＳ変異を有すると確認された患者のがんの治療方法に関し、該方法は、プリナブリンの薬剤的に効果のある量を患者に投与することを含み、該患者は、（ｉ）患者から試料を集め；（ｉｉ）試料からＤＮＡを単離し；（ｉｉｉ）単離ＤＮＡのＮＲＡＳ遺伝子またはそのフラグメントを増幅し；および（ｉｖ）増幅したＮＲＡＳ遺伝子中に変異があるかどうか検出することにより患者がＮＲＡＳ変異を特徴とするがんを有するかどうかを決定することにより同定される。

本明細書に記載の方法は、ＮＲＡＳ変異についての試験をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、例えば、コドン１２、１３、５９、６１および／または１４６におけるＮＲＡＳ変異を、患者から採取した病変試料から検出してもよい。このような試験のいくつかの実施形態では、ＤＮＡを試料から取り出し、検出可能になるように標的の変異ＤＮＡを増幅するためにＰＣＲを用いて標識化オリゴヌクレオチドプローブに対して試験する。いくつかの市販キット（Ｄｘｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、およびＱｕｅｓｔ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ参照）、シークエンシングまたはＰＣＲ用プライマーおよびプローブを、ＮＲＡＳのコ
ドン変異に基づいて設計できる。

本明細書に記載の方法は、ＨＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんを有する患者を同定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、患者の同定は、該患者がＨＲＡＳ変異を有するかどうかを決定することを含むことができる。いくつかの実施形態は、ＨＲＡＳ変異を有すると確認された患者のがんの治療方法に関し、該方法は、プリナブリンの薬剤的に効果のある量を患者に投与することを含み、該患者は、（ｉ）患者から試料を集め；（ｉｉ）試料からＤＮＡを単離し；（ｉｉｉ）単離ＤＮＡのＨＲＡＳ遺伝子またはそのフラグメントを増幅し；および（ｉｖ）増幅したＨＲＡＳ遺伝子中に変異があるかどうか検出することにより患者がＨＲＡＳ変異を特徴とするがんを有するかどうかを決定することにより同定される。

本発明をさらに例証するため、以下の実施例を記載する。もちろん、実施例は、本発明を具体的に限定するものと解釈すべきでない。請求の範囲内のこれらの実施例の変化形は、当業者の範囲内であり、本明細書に記載、および特許請求された本発明の範囲内と見なされる。本開示、および当分野の技術を用いて当業者は実施例を網羅しなくとも本発明を製造および使用できると読者は認識するだろう。

実施例１
２〜１０％ＦＢＳを添加したそのそれぞれの適切な成長培地内で全セルラインを成長し、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気で収容した。

１００μＬ容積の９６ウェルマイクロタイタープレート内の成長培地に細胞を播種した。それから、加湿インキュベーター内で３７℃、２４時間、細胞をインキュベートした。ＨＰ Ｄ３００デジタルディスペンサーを用いて試験薬剤（プリナブリン）の用量を得た。手短に言えば、デジタルディスペンサーは、培地含有ウェルに正確な体積でＤＭＳＯ溶媒中の試験薬剤（プリナブリン）を添加した。試験薬剤（プリナブリン）ウェルが受けたＤＭＳＯと等体積をコントロールウェル中に入れた。試験薬剤の添加後、加湿インキュベーター内で３７℃、７２時間、表１に記載の濃度および希釈で細胞を暴露した。７２時間の暴露後、プリナブリンおよびコントロール培地を取り出し、２００μｌの培地およびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔの１：１混合物を各ウェルに添加した。加湿インキュベーター内で３７℃、６０分間、プレートをインキュベートした。インキュベート後、ルミノメーターを用いて発光を記録した。

発光信号から算出された未治療（媒体）コントロールの細胞増殖パーセントとしてデー
タを表した。未治療コントロールの平均発光値によりプリナブリンで治療した試料の平均発光値を割ることによって細胞の生存率を決定した。プリナブリン治療試料およびコントロールの阻害濃度（ＩＣ_５０）値を、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて、非線形回帰分析を用いたデータのカーブフィッティングにより推定した。

表２に示すように、単一の活性薬剤としてプリナブリンは、ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳ変異の両方を含むＲＡＳ変異を有する様々な腫瘍セルラインに対する低ＩＣ_５０濃度において細胞毒性効果を有する。

実施例２
プリナブリンおよびドセタキセルの組合せを試験し、その活性を、Ａ５４９（ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｓ）ヒト肺腫瘍異種移植モデルにおける標準化学療法薬ドセタキセルと比較した。実験データから、Ａ５４９モデルにおいてドセタキセルと併用したプリナブリンの有望な相加効果または相乗効果を決定した。

Ａ５４９ヒト肺腫瘍異種移植モデル
約２０ｇの重量で５〜６週齢の雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州マディソン）から得た。Ａ５４９ヒト肺腫瘍セルラインを、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から得た。Ａ５４９ヒト肺腫瘍セルラインは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓにおいて変異を有した。腫瘍は、５８歳白人男性の肺がん性組織の移植片培養に由来する。動物は、ヌードマウスホスト内において皮下増殖腫瘍から収穫したＡ５４９ヒト腫瘍がんのフラグメントを用いてトロカールにより皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。腫瘍が約４６ｍｇの大きさになった場合（移植後１８日）、動物を治療群およびコントロール群にペアマッチングした。ネガティブコントロール群は８匹の腫瘍マウスを含み、他の全群は９匹の腫瘍マウスを含んだ。各マウスの耳にタグを付け、実験中ずっと個別にフォローした。非ＧＬＰ設定において試験を実施した。ペアマッチング後１日目に初回投与した。２つの異なるスケジュール−１日目、４日目、８日目、１１日目および１５日目、ならびにｑｄｘ５（５日間毎日１回投与）で、７．５ｍｇ／ｋｇのプリナブリンを腹腔内投与した。ネガティブコントロールの役割のため、１２．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５％クレモフォール、および８２．５％ピーナッツ油を混合して腹腔内投与した；ｑｄｘ５。１２．５ｍｇ／ｋｇで、１日目、３日目、および５日目にドセタキセル（Ａｖｅｎｔｉｓ）を静脈内投与し、ポジティブコントロールの役割のため、ｗｋｌｙｘ３で１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。また、ｑｄｘ５スケジュールで７．５ｍｇ／ｋｇのプリナブリンを、単剤と同じ用量、経路、およびスケジュールでドセタキセルと併用して投与した。プリナブリンおよびドセタキセル併用群では、プリナブリンの１５〜３０分前にドセタキセルを投与した。

プリナブリンの重量を量ってから、１２．５％ＤＭＳＯ、５％クレモフォール、および８２．５％ピーナッツ油をそれぞれ添加した。最終的に、ボルテックスにより化合物を混合し、１時間内に注射した。

各群は８匹のマウスを含んだ。１日目からスタートして、マウスの重量を週２回量り、ノギスを用いて週２回腫瘍測定を行った。標準式、（Ｗ２×Ｌ）／２により、これらの腫瘍測定を腫瘍重量ｍｇに換算した。コントロール群腫瘍サイズが１グラムの平均値に達した場合、実験を止めた。中止の際、マウスの重量を量り、殺処分してその腫瘍を切除した。腫瘍の重量を量り、群当たりの平均腫瘍重量を算出した。このモデルでは、平均治療腫瘍重量／平均コントロール腫瘍重量×１００を１００％から差引いて、各群について腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を得た。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェア（Ｍａｃｈｉｎｔｏｓｈバージョン３．０）を用いた片側ｔ検定を使用してｐ値算出した。

この腫瘍異種移植モデルでは、いくつかの薬剤は腫瘍縮小を引き起こしたかもしれない。これらの薬剤で、所与の腫瘍の最終重量を、治療開始１日目のそれ自身の重量から差し引いた。この差を、初期腫瘍重量により割って、退縮％を得た。平均腫瘍退縮％を、腫瘍退縮した群のマウスのデータから算出した。

ネガティブおよびポジティブコントロール
ネガティブコントロール群は、８７０．４ｍｇ±３０５．１の５６日目最終平均腫瘍重量を有した。ドセタキセル（１２．５ｍｇ／ｋｇ；静脈内；１日目、３日目、５日目）は、試験のポジティブコントロールの役割を果たし、それぞれ６５５．１ｍｇ±１０９．２および６９１．４±１７５．８の最終平均腫瘍重量を有した。これは、媒体コントロール群と比較してドセタキセルが２６．１％のＴＧＩになり、過去実施したＡ５４９試験で見られた期待される活性範囲内であった。ドセタキセル群またはイリノテカン群で観察された中毒死はなかった。

ドセタキセル群の動物は、いくらか重量減少した。１１日目、初期平均重量減少を２．７％と記録した。２２日目までに、動物はその重量を戻し、１５．４％のポジティブな重量増加を示した。ポジティブコントロール群で観察された中毒死はなかった。

プリナブリンおよびドセタキセルの併用
１〜５日目に７．５ｍｇ／ｋｇのプリナブリンを腹腔内投与することにより、１５２５．７ｍｇ±３５５．３の平均最終腫瘍重量となった。プリナブリン（７．５ｍｇ／ｋｇ；１〜５日目）およびドセタキセル（１２．５ｍｇ／ｋｇ；静脈内；１日目、３日目、５日目）の併用群は、２６５．８ｍｇ±１１３．１の５６日目最終平均腫瘍重量を有した。これは、７４．３％のＴＧＩという結果であった。この併用は、６５５．１ｍｇ±１０９の平均最終腫瘍重量を有したドセタキセル治療群より優れており、併用群とドセタキセル単剤群との差は、統計的に有意（ｐ＜０．０５）であった。

プリナブリン単剤群の動物は、重量増加した。１１日目および２２日目、平均重量増加を、それぞれ１０．６％および２１．８％と記録した。この投与群で観察された中毒死はなかった。併用群の動物は、重量減少した。１１日目、初期平均重量減少を２．７％と記録した。２２日目までに、動物はその重量を戻し、１６％の重量増加を示した。

この投与レベルおよび評価スケジュールにおいて、動物は、単剤としてプリナブリンによる有害性を受けなかった。全５つの試験では、単剤で投与した場合、プリナブリン群において１匹の死のみであった。図３は、プリナブリン（７．５ｍｇ／ｋｇ）をドセタキセル（１２．５ｍｇ／ｋｇ）と併用で腹腔内経路により使用した場合のマウスの腫瘍重量剖検を示す。Ａ５４９肺腫瘍モデルに対するドセタキセルと併用のプリナブリンは、ドセタキセル単独と比較した場合、統計的に有意な（ｐ＜０．０５）ＴＧＩの増加を示した（７４．３％対２６．１％）。この結果は、ドセタキセル単剤と比較した場合、プリナブリンとドセタキセルの併用の強力な腫瘍増殖阻害は、Ａ５４９（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ）ヒト肺腫瘍異種移植モデルにおいてドセタキセルと併用したプリナブリンの有望な相加効果または相乗効果を示していることを示した。

実施例３
使用したグリオーマのマウスモデルは、グリオブラストーマ（ＧＢＭ）の前神経分子サブグループを模倣するグリオーマのＰＤＧＦ誘導ＧＥＭＭであった。このモデルは、体細胞特異性遺伝子導入に基づき；複製可能なＡＬＶスプライスアクセプター（ＲＣＡＳ）レトロウイルスシステムは、細胞型特異的に分化の厳密に調節されたウインドウ内の特定の遺伝子変異の滴下注入を可能とした。ＲＣＡＳ／ｔｖ−ａシステムは、ＲＣＡＳレトロウイルスベクターを使用して、特定の細胞集団においてＲＣＡＳ受容体（ｔｖ−ａ）を発現するように遺伝子組換えしたマウスを感染させた。ここで、脳内のネスチン発現細胞にＰＤＧＦをＲＣＡＳ媒介導入することにより、グリオーマを生成した。脳内の幹細胞／前駆細胞集団においてネスチンを発現し、ヒトおよびマウス脳腫瘍の両方において血管周辺部（ＰＶＮ）にあるがん幹細胞のマーカーであることを示した。ＰＤＧＦ誘導グリオーマは、感染後４〜５週間までにＩｎｋ４ａ−ａｒｆ−／−欠失と組み合わせた場合、完全な浸透率を有して発生した。これらの腫瘍は、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６ＩＮＫ４Ａおよびｐ１４ＡＲＦの両方をコードする）欠失が「前神経」ヒトグリオーマの５６％で観察されたＧＢＭの「前神経」サブタイプを密接に模倣した。シェーレル構造、微小血管増殖および偽柵状ネクローシスなどのヒトグリオーマを規定する腫瘍細胞構造を、図１ａ〜１ｄに示すようにこのＧＥＭＭにおいて再形成した。さらに、グリオーマ細胞は白質トラックに沿って遊走し、ニューロンおよび血管を囲み、軟膜下の空間内の脳の縁に蓄積した。これに関して、グリオーマのＰＤＧＦ誘導ＧＥＭＭは、ＰＮ−ＧＢＭに酷似し、腫瘍内微小環境において腫瘍細胞と非新生細胞との間の相互作用を規定する優れた実験システムを示す。

グリオーマのＰＤＧＦ誘導モデルを使用して、図２に示すように、放射線およびテモゾロミドに対する応答を決定した。グリオーマ保持マウスを症状により同定して、Ｔ２強調ＭＲＩにより確認した。媒体、１２日間の毎日２５ｍｇ／ｋｇのテモゾロミド、または２週間毎週５日で１日２Ｇｙ（グレイ）の線量で分割放射線照射（合計２０Ｇｙ）のいずれかでこれらのマウスを治療した。図２の上２つの画像は、未治療（媒体）の腫瘍増殖を示し；対照的に、テモゾロミド治療および放射線照射した腫瘍はその同じ期間にわたって体積縮小した。これらの腫瘍は治療後に再発し、これらの対応するマウスのコホートの生存率曲線で示すように再発腫瘍で全動物は死んだ。放射線およびテモゾロミドでの治療についての試験データは：１）このマウスモデルで試験を行った、２）マウス生存に対するこれらの治療効果はヒト状態に酷似していた、３）全マウスは病気で死んだ、および４）これらのマウスコホートの比較的同じ結果は、試験における生存差を検出するためにこの実験的パラダイムの使用を支持したことを例証した。

上記方法を用いて準備したグリオーマのＰＤＧＦ誘導モデルを生成した。マウスは、ネスチンプロモーターからのＲＣＡＳ受容体（ｔｖ−ａ）の発現およびｉｎｋ４ａ／ａｒｆ−／−のバックグラウンドおよびｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘルシフェラーゼを有するトランスジェニックであり、Ｇ１２Ｄ変異ＫＲＡＳを発現するＲＣＡＳ−ＰＤＧＦおよびＲＣＡＳ−ＫＲＡＳで感染させた。得られた腫瘍は、最初の３〜４週間内で発生した。腫瘍はＧＢＭの組織学的特徴を有し、嗜眠の症状および不充分なグルーミング、Ｔ２強調シークエンスを用いたＭＲＩスキャン、またはＩＶＩＳシステムを用いたバイオルミネセンスイメージングを用いて同定することができる。治療群（ＫＲＡＳ腫瘍）のマウスに、１０週間毎週２回７．５ｍｇ／ｋｇのプリナブリンを腹腔内投与し、コントロール群のマウスに、プリナブリン希釈液（４０重量％コリフォールおよび６０重量％プロピレングリコール）のみを投与した。これらの治療マウスは重量増加し始めたが、数日内で症状の改善を示す。

Ｇ１２Ｄ変異ＫＲＡＳを発現するＰＤＧＦ誘導グリオーマを有するマウスに対してプリナブリンを試験した。４〜６週齢ネスチン−ｔｖ−ａ／ｉｎｋ４ａ−ａｒｆ−／−マウスをイソフルランで麻酔し、Ｄｆ−１細胞にトランスフェクトしたＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ、ＲＣＡＳ−ＫＲＡＳを注射した。ハミルトンシリンジに装着した２６ゲージニードルにより定位フレームを用いて、２×１０^５ＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ／ＲＣＡＳ−ＫＲＡＳの１：１混合物１マイクロリットルをマウスに注射した。細胞を右前頭葉内に注射したが、十字縫合１．７５ｍｍ、側方−０．５ｍｍ、および深さ２ｍｍに調整する。マウスを重量減少に対して注意深くモニターし、合計２連続日にわたって＞０．３グラム減少した場合または腫瘍の外的徴候を示した場合試験を供した。マウスを試験群に入れ、嗜眠、猫背姿勢、食欲喪失、腫瘍増殖の外的徴候、興奮、重量減少および全体的な成長障害について継続的にモニターしながら、プリナブリンまたは上記プリナブリン希釈液のいずれかで治療した。体重の２０％より多く減少、移動性、摂食の無力さまたは雄で１４グラム／雌で１２グラム未満の重量になった場合、マウスを殺処分した。マウスをＣＯ_２を用いて殺処分した；脳を回収し、１０％中性緩衝ホルマリンにＯ／Ｎ貯蔵してから、Ｆｌｅｘ８０と入れ換えて４℃で貯蔵した。

図４は、Ｇ１２Ｄ Ｋｒａｓ変異を含むグリオブラストーマを有するマウスの生存率を示す。図４に示すように、グリオブラストーマのＰＤＧＦ誘導モデルを有するマウスは、概して、コントロール群と比較したとき、プリナブリン治療群において有意により良好な生存率を有した（ｐ＝０．００１）。

実施例４
Ｇ１２Ｄ変異ＫＲＡＳを発現するＰＤＧＦ誘導グリオーマを有するマウスを、実施例３に記載の手順を用いて準備してこの実験で使用した。４〜６週齢ネスチン−ｔｖ−ａ／ｉ
ｎｋ４ａ−ａｒｆ−／−マウスをイソフルランで麻酔し、Ｄｆ−１細胞にトランスフェクトしたＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ、ＲＣＡＳ−ＫＲＡＳを注射した。ハミルトンシリンジに装着した２６ゲージニードルにより定位フレームを用いて、２×１０^５ＲＣＡＳ−ＰＤＧＦ−Ｂ−ＨＡ／ＲＣＡＳ−ＫＲＡＳの１：１混合物１マイクロリットルをマウスに注射した。細胞を右前頭葉内に注射したが、十字縫合１．７５ｍｍ、側方−０．５ｍｍ、および深さ２ｍｍに調整する。マウスを重量減少に対して注意深くモニターし、合計２連続日にわたって＞０．３グラム減少した場合または腫瘍の外的徴候を示した場合試験を供した。

マウスを２つの試験群に入れた。１つの群を、テモゾロミド（ＴＭＺ）、放射線およびプリナブリンの組合せで治療した：１０ｇｙ×１で照射し、ＴＭＺおよびプリナブリン希釈液中プリナブリン７．５ｍｇ／ｋｇを１０週間月曜日と木曜日の週２回腹腔内投与した。他の群、コントロール群を、ＴＭＺおよび放射線の組合せで治療した：１０ｇｙ×１で照射し、ＴＭＺを１０週間月曜日と木曜日の週２回腹腔内投与した。マウスを、嗜眠、猫背姿勢、食欲喪失、腫瘍増殖の外的徴候、興奮、重量減少および全体的な成長障害についてモニターした。体重の２０％より多く減少、移動性、摂食の無力さまたは雄で１４グラム／雌で１２グラム未満の重量になった場合、マウスを殺処分した。マウスをＣＯ_２を用いて殺処分した；脳を回収し、１０％中性緩衝ホルマリンにＯ／Ｎ貯蔵してから、Ｆｌｅｘ８０と入れ換えて４℃で貯蔵した。図５に示すように、グリオブラストーマのＰＤＧＦ誘導モデルを有するマウスは、概して、プリナブリン、ＴＭＺおよび放射線を受けるコントロール群と比較したとき、ＴＭＺおよび放射線治療群において有意により良好な生存率を有した（ｐ＝０．０１４９）。

実施例５
プリナブリンおよびイリノテカンの組合せを試験し、その活性を、ＨＣＴ−１５（ＫＲＡＳ変異Ｇ１３Ｄ；Ｐ５３変異Ｓ２４１Ｆ）ヒト結腸腫瘍異種移植モデルにおける標準化学療法薬イリノテカンと比較した。実験データから、ＨＣＴ−１５モデルにおいてイリノテカンと併用したプリナブリンの相乗効果を決定した。

ＨＣＴ−１５ヒト結腸腫瘍異種移植モデル
雌胸腺欠損ヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）は、Ｈａｒｌａｎ（インディアナ州インディアナポリス）により供給された。マウスを４週齢で受け取った。全マウスを取り扱う前に気候順化した。ＨＣＴ−１５ヒト結腸腫瘍セルラインをＡＴＣＣ（バージニア州マナサス）から受け取った。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｓｅｒａｄｉｇｍ；ペンシルバニア州ラドナー）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｏｎｚａ；メリーランド州ウォーカーズビル）で培養液を維持し、５％ＣＯ２雰囲気中に収容した。充分な量の細胞を回収するまで、１：１０分割比で組織培養フラスコ内に培養液を広げた。ＨＣＴ−１５ヒト結腸腫瘍セルラインは、ＫＲＡＳ Ｇ１３ＤおよびＰ５３ Ｓ２４１Ｆにおいて変異を有した。

雌マウスに、皮下右側に、ＨＣＴ−１５腫瘍細胞（５×１０^６細胞／マウス）の懸濁液を含有する５０％培地／５０％マトリゲル混合物０．１ｍｌを接種した。

プリナブリン（４０％ソルトール：６０％プロピレングリコール中８０ｍｇ／２０ｍＬ）を無菌５％ブドウ糖溶液で０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。試験終了まで週２回、プリナブリン７．５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。プリナブリン媒体（４０％ソルトール：６０％プロピレングリコール）を、プリナブリンと同じ比で、無菌５％ブドウ糖溶液で希釈し、ネガティブコントロールとして使用した。１０ｍｌ／ｋｇの用量体積で１００ｍｇ／ｋｇの用量を届けるために、イリノテカン（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カリフォルニア州アーバイン）を０．９％塩化ナトリウム溶液で１０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度まで希釈した。３週間週１回１００ｍｇ／ｋｇの用量でイリノテカンを腹腔内投与し、ポジティブコントロールとした。また、単剤と同じ用量、経路、およびスケジュールでイリノテカンと併用してプリナブリンを投与した。プリナブリンおよびイリノテカン併用群では、プリナブリンの１２０分前にイリノテカンを投与した。

接種後７日間、デジタルノギスを用いて腫瘍を測定した。ノギスを使用して腫瘍の幅および長さ直径を測定した。測定値を、動物試験管理ソフトウェア、Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｖ．２．１．１（Ｓｔｕｄｙ Ｌｏｇ）を用いてデジタル的に記録した。腫瘍量を、式：腫瘍量（ｍｍ^３）＝（ａ×ｂ^２／２）（式中、「ｂ」は最小直径であり「ａ」は最大直径_１である）を利用して算出した。１０４〜１２５ｍｍ^３の腫瘍サイズを有する４０匹のマウスを１０匹毎の４群にランダムに分け、Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒを用いたランダム平衡により、各々は約１１２ｍｍ^３の平均を有する（１日目）。マウスをランダム化し、その後週２回取り出す場合、腫瘍量および体重を記録した。臨床観察を毎日行った。

コントロール群腫瘍サイズが１グラムの平均値に達した場合、実験を止めた。中止の際、マウスの重量を量り、殺処分してその腫瘍を切除した。腫瘍の重量を量り、群当たりの平均腫瘍重量を算出し、ならびに腫瘍ネクローシスの視覚的評価を行った。

平均腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を２７日目（試験の最終日）に算出した。異種移植試験の全統計解析を、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）ｖ６．００ソフトウェアで行った。２７日目の腫瘍量の差をＶａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて確認した。

ネガティブおよびポジティブコントロール
ネガティブコントロール群は、１７０１．４ｍｍ^３±１７８．０の２７日目最終平均腫瘍量を有した。イリノテカン（１００ｍｇ／ｋｇ；腹腔内；１日目、８日目、１５日目）は、試験のポジティブコントロールの役割を果たし、１１９６．２ｍｍ^３±１２１．７の最終平均腫瘍量を有した。媒体ネガティブコントロール群と比較して、これは、イリノテカンについて３１．８％のＴＧＩという結果であった。ネガティブコントロールまたはポジティブ群で観察された中毒死はなかった。

媒体ネガティブコントロール、プリナブリン、およびイリノテカンでの治療の忍容性は良好であった。試験の最終数日で、いくつかの軽度の重量減少が、媒体コントロール群およびプリナブリン群で発生したが、体重減少は大幅なものではなかった。臨床観察は、この腫瘍モデルで典型的である腫瘍ネクローシスで主に構成された。プリナブリンおよびイリノテカンの併用治療は、中程度の体重減少が観察されており、かなり良好な忍容性であった。

プリナブリン（７．５ｍｇ／ｋｇ；１〜５日目）およびイリノテカン（１００ｍｇ／ｋｇ、１日目、８日目および１５日目）の併用群は、７６６．８ｍｍ^３±８４．２の２７日目最終平均腫瘍量を有した。これは、５８．８％のＴＧＩという結果であった。この併用は、１１９６．２ｍｍ^３±１２１．７の平均最終腫瘍量を有したイリノテカン治療群より優れており、併用群とイリノテカン単剤群との差は、統計的に有意（ｐ＜０．０５）であった。

この投与レベルおよび評価スケジュールにおいて、動物は、単剤としてプリナブリンによる有害性を受けなかった。図６は、プリナブリン（７．５ｍｇ／ｋｇ）をイリノテカン（１００ｍｇ／ｋｇ）と併用で腹腔内経路により使用した場合のマウスの試験過程にわたる腫瘍量を示す。ＨＣＴ−１５結腸腫瘍モデルに対するイリノテカンと併用のプリナブリンは、イリノテカン単独と比較した場合、統計的に有意な（ｐ＜０．０５）ＴＧＩの増加
を示した（５８．８％対３１．８％）。この結果は、イリノテカン単剤と比較した場合、プリナブリンとイリノテカンの併用の強力な腫瘍増殖阻害は、ＨＣＴ−１５（ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ）ヒト肺腫瘍異種移植モデルにおいてイリノテカンと併用したプリナブリンの有望な相加効果または相乗効果を示していることを示した。

実施例６
プリナブリンおよびイリノテカンの組合せを試験し、その活性を、ＬｏＶｏ（ＫＲＡＳ変異 ｐ．Ｇ１３Ｄ）ヒト結腸腫瘍異種移植モデルにおけるイリノテカン単独と比較した。実験データから、ＬｏＶｏモデルにおいてイリノテカンと併用したプリナブリンの有望な相加効果または相乗効果を決定した。

ＬｏＶｏヒト結腸腫瘍異種移植モデル：雌胸腺欠損ヌードマウス（Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１_ｎｕ）は、Ｈａｒｌａｎ（インディアナ州インディアナポリス）により供給された。マウスを４週齢で受け取った。全マウスを取り扱う前に気候順化した。ＬｏＶｏヒト結腸腫瘍セルラインをＡＴＣＣ（バージニア州マナサス）から受け取った。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｓｅｒａｄｉｇｍ；ペンシルバニア州ラドナー）を添加したＦ１２−Ｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｅｌｌｇｒｏ、バージニア州マナサス）で培養液を維持し、５％ＣＯ２雰囲気中に収容した。充分な量の細胞を回収するまで、１：３の分割比で組織培養フラスコ内に培養液を広げた。ＬｏＶｏヒト結腸腫瘍セルラインは、ＫＲＡＳ ｐ．Ｇ１３Ｄにおいて変異を有した。

雌マウスに、皮下右側に、ＬｏＶｏ腫瘍細胞（１×１０^７細胞／マウス）の懸濁液を含有する５０％培地／５０％マトリゲル混合物０．１ｍｌを接種した。

プリナブリン（４０％ソルトール：６０％プロピレングリコール中８０ｍｇ／２０ｍＬ）を無菌５％ブドウ糖溶液で０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。試験終了まで週２回、プリナブリン７．５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。プリナブリン媒体（４０％ソルトール：６０％プロピレングリコール）を、プリナブリンと同じ比で、無菌５％ブドウ糖溶液で希釈し、ネガティブコントロールとして使用した。１０ｍｌ／ｋｇの用量体積で１００ｍｇ／ｋｇの用量を届けるために、イリノテカン（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カリフォルニア州アーバイン）を０．９％塩化ナトリウム溶液で１０ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。３週間週１回８０ｍｇ／ｋｇの用量でイリノテカンを腹腔内投与し、ポジティブコントロールとした。また、単剤の各々と同じ用量、経路、およびスケジュールでイリノテカンと併用してプリナブリンを投与した。プリナブリンおよびイリノテカン併用群では、プリナブリンの１２０分前にイリノテカンを投与した。

接種後７日間、デジタルノギスを用いて腫瘍を測定した。ノギスを使用して腫瘍の幅および長さ直径を測定した。測定値を、動物試験管理ソフトウェア、Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｖ．２．１．１（Ｓｔｕｄｙ Ｌｏｇ）を用いてデジタル的に記録した。腫瘍量を、式：腫瘍量（ｍｍ^３）＝（ａ×ｂ^２／２）（式中、「ｂ」は最小直径であり「ａ」は最大直径_１である）を利用して算出した。１０４〜１２５ｍｍ^３の腫瘍サイズを有する４０匹のマウスを１０匹毎の４群にランダムに分け、Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒを用いたランダム平衡により、各々は約１１２ｍｍ^３の平均を有する（１日目）。マウスをランダム化し、その後週２回取り出す場合、腫瘍量および体重を記録した。臨床観察を毎日行った。

プロトコールに沿って１５日目１５００ｍｍ^３以上の平均腫瘍量に達した後、媒体コントロールを殺処分した。死んでいるまたは瀕死であることが分かったマウスを殺処分するために、イリノテカン群が７７４ｍｍ^３の平均腫瘍量に達した場合、治療群を終了した。剖検の時に、腫瘍を切除し、湿重量測定を記録し、ならびに腫瘍ネクローシスの視覚的評
価を行った。

平均腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を２７日目に算出した。異種移植試験の全統計解析を、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）ｖ６．００ソフトウェアで行った。２７日目の腫瘍量の差をＶａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて確認した。ウェルチ補正を用いる片側スチューデントｔ検定も使用して、各群と媒体コントロールとのいずれもの差も検証し、両側スチューデントｔ検定を使用して併用群とそのそれぞれの単剤との差を検証した。

媒体コントロールは、１５日目に２０７８．１ｍｍ^３の平均腫瘍量に達した。この群は、試験全体を通して特記すべき平均体重減少はなかった。１０匹のマウスのうち９匹は、１２日目に軽微〜中程度の腫瘍ネクローシスを最初に観察した。全動物は最後の殺処分まで生存した。

プリナブリン７．５ｍｇ／ｋｇでの治療により、１５日目に１２７９．２ｍｍ^３平均腫瘍量となった。この群では、１５日目に４１．０％のＴＧＩ（ｎ＝７）を得た。１５日目での媒体コントロールと比較した場合、平均腫瘍量の有意な減少が観察された（ｐ＜０．０５）（スチューデントｔ検定）。この群は、試験全体を通して平均体重減少はなかった。１０匹のマウスのうち９匹は、１２日目に軽微〜重度の腫瘍ネクローシスを最初に観察した。重度腫瘍ネクローシスによる罹患を示す臨床観察が理由でマウス５を１９日目に瀕死状態で殺処分した。マウス２、３、４、７、および１０は、試験中に死んだことが分かった。マウス８は、技術的な誤りが理由で死んだことが分かった。１０匹のマウスのうち３匹は、最後の殺処分まで生存した。

イリノテカン８０ｍｇ／ｋｇでの治療により、１５日目に１１５６．７ｍｍ^３平均腫瘍量となった。この群では、１５日目に媒体コントロールと比較した場合、４７．２％のＴＧＩ（ｎ＝１０）を得た。１５日目での媒体コントロールと比較した場合、平均腫瘍量の有意な減少が観察された（ｐ＜０．０５）（スチューデントｔ検定）。この群は、試験最終日２０日目に最大７．４％の中程度の体重減少であった。１０匹のマウスのうち８匹は、１２日目に軽微〜重度の腫瘍ネクローシスを最初に観察した。重度腫瘍ネクローシスによる罹患を示す臨床観察が理由でマウス３、４、および５をそれぞれ１９日目、１５日目、および１８日目に瀕死状態で殺処分した。マウス１および１０は、それぞれ１７日目および２０日目に死んだのが分かった。１０匹のマウスのうち５匹は、最後の殺処分まで生存した。

プリナブリン７．５ｍｇ／ｋｇおよびイリノテカン８０ｍｇ／ｋｇでの治療により、１５日目に４６８．４ｍｍ^３平均腫瘍量となった。この群では、１５日目に媒体コントロールと比較した場合、８２．４％のＴＧＩ（ｎ＝１０）を得た。１５日目での媒体コントロール（スチューデントｔ検定）および単剤プリナブリン（スチューデントｔ検定）と比較した場合、平均腫瘍量の有意な減少が観察された（ｐ＜０．０５）。１５日目に単剤イリノテカンと比較した場合、平均腫瘍量の有意な差は観察されなかった。この群は、試験最終日２０日目に最大５．８％の中程度の体重減少であった。１０匹のマウスのうち５匹は、１５日目に軽微〜中程度の腫瘍ネクローシスを最初に観察した。全１０匹のマウスは最後の殺処分まで生存した。図７に示すように、プリナブリンおよびイリノテカンの併用は、単剤としてのイリノテカンより優れた。イリノテカン単独群のマウスの減少が理由で、平均腫瘍量は、１５日目の１１５７ｍｍ^３から２０日目の７７４ｍｍ^３に減少し、認識できる変化を引き起こした。

Claims (22)

1. ＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とするがんの治療のための、プリナブリンを含む組成物であって、
   前記ＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、およびＤ１５３Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸位置において変異を含む、ＮＲＡＳタンパク質の変異型、ＨＲＡＳタンパク質の変異型またはＫＲＡＳタンパク質の変異型である、前記組成物。
2. 前記ＲＡＳタンパク質の変異型が、ＫＲＡＳタンパク質の変異型である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記がんが、結腸直腸がん、膵がん、腎がん、肺がん、肝がん、乳がん、前立腺がん、胃腸がん、腹膜がん、メラノーマ、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頚がん、子宮がん、膀胱がん、グリオブラストーマ、転移性脳腫瘍、唾液腺がん、甲状腺がん、脳がん、リンパ腫、骨髄腫、および頭頚部がんから成る群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記がんが、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺の扁平上皮がん、肝細胞がん、結腸がん、子宮内膜がん、および肝細胞がんから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記がんが、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、子宮内膜がん、多発性骨髄腫、膵がん、腎がん、およびグリオブラストーマから成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記がんが、非小細胞肺がん、膵がん、およびグリオブラストーマから成る群から選択される、請求項５に記載の組成物。
7. 前記がんが、非小細胞肺がんである、請求項６に記載の組成物。
8. 前記ＫＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記ＫＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記ＫＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１ＲおよびＱ６１Ｈから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記ＫＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＤ１５３Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記ＫＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｇ１２ＣおよびＤ１５３Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記ＲＡＳタンパク質の変異型が、ＮＲＡＳタンパク質の変異型である、請求項１に記載の組成物。
14. 前記ＮＲＡＳタンパク質が、コドン１２、１３、５９、６１、および１４６から成る群から選択される１つ以上の位置において変異を含む、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記ＮＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、およびＡ１４６Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１４に記載の組成物。
16. 追加の活性薬剤と組み合わせて用いる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. 前記追加の活性薬剤が追加の治療薬である、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記追加の治療薬がドセタキセルであり、前記がんがヒト非小細胞肺がんである、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記追加の治療薬がイリノテカンであり、前記がんがヒト結腸がんである、請求項１８に記載の組成物。
20. ＲＡＳ変異を有する細胞の増殖を阻害するための、プリナブリンを含む組成物であって、
    前記ＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７
    Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、およびＤ１５３Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸位置において変異を含む、ＮＲＡＳタンパク質の変異型、ＨＲＡＳタンパク質の変異型またはＫＲＡＳタンパク質の変異型である、前記組成物。
21. ＲＡＳ変異を有する細胞のアポトーシスを誘導するための、プリナブリンを含む組成物であって、
    前記ＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、およびＤ１５３Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸位置において変異を含む、ＮＲＡＳタンパク質の変異型、ＨＲＡＳタンパク質の変異型またはＫＲＡＳタンパク質の変異型である、前記組成物。
22. 対象においてＲＡＳタンパク質の変異型を発現することを特徴とする、がんの進行を阻害するための、プリナブリンを含む組成物であって、
    前記ＲＡＳタンパク質の変異型が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ａ５９Ｅ、Ａ５９Ｇ、Ａ５９Ｔ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、およびＤ１５３Ｖから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸位置において変異を含む、ＮＲＡＳタンパク質の変異型、ＨＲＡＳタンパク質の変異型またはＫＲＡＳタンパク質の変異型である、前記組成物。