JP6767096B2 - 免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ - Google Patents
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Description
以下の特性を有する化合物、好ましくはペプチドであって:
a)直鎖状配列で9個のアミノ酸からなり;
b)これらの9個のアミノ酸のうち、5個はカチオン性であり、4個は親油性のR基を有していて;
c)前記9個のアミノ酸のうち少なくとも1個は、非遺伝的にコードされたアミノ酸(遺伝的にコードされたアミノ酸の、例えば修飾された誘導体)であり;および任意に、
d)親油性およびカチオン性残基は、いずれかのタイプの残基が互いに2個以下で隣接するように配置され、;さらに、必要に応じて、
e)前記分子は、2対の隣接したカチオン性アミノ酸と、1対または2対の隣接した親油性残基を有し;
免疫チェックポイント阻害剤(ICI)と、組み合せて、逐次的に、または別々に投与することにより腫瘍の治療で使用されるものである。
2-アミノ-3-(ビフェニル-4-イル)プロパン酸(ビフェニルアラニン)、
2-アミノ-3,3-ジフェニルプロパン酸(ジフェニルアラニン)、
2-アミノ-3-(アントラセン-9-イル)プロパン酸、
2-アミノ-3-(ナフタレン-2-イル)プロパン酸、
2-アミノ-3-(ナフタレン-1-イル)プロパン酸、
2-アミノ-3-[1,1':4',1"-テルフェニル-4-イル]-プロピオン酸、
2-アミノ-3-(2,5,7-トリ-tert-ブチル-1H-インド-ル-3-イル)プロパン酸、
2-アミノ-3-[1,1':3',1"-テルフェニル-4-イル]-プロピオン酸、
2-アミノ-3-[1,1':2',1"-テルフェニル-4-イル]-プロピオン酸、
2-アミノ-3-(4-ナフタレン-2-イル-フェニル)-プロピオン酸、
2-アミノ-3-(4'-ブチルビフェニル-4-イル)プロパン酸、
2-アミノ-3-[1,1':3',1"-テルフェニル-5'-イル]-プロピオン酸、および
2-アミノ-3-(4-(2,2-ジフェニルエチル)フェニル)プロパン酸。
LCCLLCCLC (II) (配列番号:2)
CLLCCLLCC (III) (配列番号:3)
CCLLCLLCC (IV) (配列番号:4)
CLCCLLCCL (V) (配列番号:5)
ペプチド模倣物は、典型的にはそのペプチドと同等の極性、三次元的大きさおよび機能性(生物活性)を維持していることにより特徴づけられるが、ペプチド結合は、しばしばより安定な結合によって置換される。「安定」とは、加水分解酵素による酵素分解に対してより耐性であることを意味する。一般的に、アミド結合に代わる結合(アミド結合代用物)は、アミド結合の特性(例えば構造、立体容積、静電特性、水素結合の可能性等)の多くを保持する。「"Drug Design and Development", Krogsgaard, Larsen, Liljefors and Madsen (Eds) 1996, Horwood Acad.」の第14章は、ペプチド模倣物の設計および合成のための技術の一般的な考察を提供する。
N-アルキル (Schmidt, R. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 1995, 46,47)、レトロ-インバースアミド(Chorev, M and Goodman, M., Acc. Chem. Res, 1993, 26, 266)、チオアミド(Sherman D.B. and Spatola, A.F. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 433)、チオエステル、ホスホン酸、ケトメチレン(Hoffman, R.V. and Kim, H.O. J. Org. Chem., 1995, 60, 5107)、ヒドロキシ化メチレン、フルオロビニル (Allmendinger, T. et al., Tetrahydron Lett., 1990, 31, 7297)、ビニル,メチレンチオ(Sasaki, Y and Abe, J Chem. Pharm. Bull. 1997 45, 13),メチレンチオ(Spatola, A.F., Methods Neurosci, 1993, 13, 19)、アルカン(Lavielle, S. et. al., Int. J. Peptide Protein Res., 1993, 42, 270)、スルホンアミド(Luisi, G. et al. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 2391)。
CCL'LCCLLC (I') (配列番号: 6)
CCLLCCLL'C (I'') (配列番号: 7)
CCLL'CCLLC (I''') (配列番号: 8)
LCCLL'CCLC (II') (配列番号: 9)
特に好ましいのは、式Iおよび式IIの化合物(好適にはペプチド)であり、これらの中では式I"の化合物(好適にはペプチド)が特に好ましい。
・標準的な一文字コードは、遺伝的にコードされたアミノ酸のために使用されている
・小文字はD型アミノ酸を表す
・Dipは、ジフェニルアラニンである
・Bipは、ビフェニルアラニンである
・Ornは、オルニチンである
・Dapは、2,3-ジアミノプロピオン酸である
・Dabは、2,4-ジアミノ酪酸である
・1-NALは、1-ナフチルアラニンである
・2-Nalは、2-ナフチルアラニンである
・Athは、2-アミノ-3-(アントラセン-9-イル)プロパン酸である
・Phe(4,4'Bip)は、2-アミノ-3-[1,1':4',1″-テルフェニル-4-イル]プロピオン酸である。
(i)本明細書中に定義されるペプチド化合物;および
(ii)本明細書に記載された免疫チェックポイント阻害剤。
実施例1- In vitroでの細胞毒性活性の試験において、37種類のヒト癌細胞株のパネルに対し5種類の試験した化合物の中で、LTX-315が最も強力である。
In vitroにおける、37種類のヒト癌細胞株のパネルに対する5種類の試験化合物の細胞毒性活性試験
1.研究目的
37種類のヒト癌細胞株のパネルに対し50%増殖阻害を得る5種類の新規化合物の濃度(IC50)を決定すること。
2.1.試験物質
2.1.1.試験物質
・試験物質:LTX-302、LTX-313、LTX-315、LTX-320およびLTX-329(粉末形態で提供されたもの)(Table 1参照)。
Oncodesign (Dijon, France)により提供されたSigma (Saint Quentin Fallavier, France)製のTriton X-100(登録商標)をポジティブコントロールとして使用した。
・化合物は、4℃で保存した。粉末は、最初に無血清培地(RPMI 1640, Lonza, Verviers, Belgium)に溶解し、適切な希釈状態とするために、さらに無血清培地を用いて希釈した。原液は保存せず、実験の日に新たに調製した。
・1%(最終濃度)のTriton X-100(登録商標)は、培地を用いて希釈することにより得た。
2.2.1.腫瘍細胞株
癌細胞株および培地は、Oncodesignから購入し提供された。
腫瘍細胞は、37℃、加湿雰囲気(5%CO2、95%空気)中で、接着した単層(adherent monolayers)または、懸濁物として増殖させた。培地は、2mMのL-グルタミン(Lonza, Belgium)を含み、10%ウシ胎児血清(FBS, Lonza)を添加したRPMI 1640であった。実験で使用するために、トリプシン-ヴェルセン(Lonza)で5分間処理することにより接着細胞を培養フラスコから剥離し、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス培地(Lonza)で希釈し、完全培地を添加することにより中和した。細胞は血球計数器で計数し、生存率を0.25%トリパンブルー排除試験法により評価した。
3.1.細胞株の増幅およびプレ-ティング
接着成長した細胞株または懸濁液成長した細胞株を、それぞれ、10%のFBSを添加した、または添加していない薬剤フリー培地190μLで処理を行う前に、96ウェル平底マイクロタイタープレート(Nunc, Dutscher, Brumath, France)に播種し、37℃で24時間インキュベートした。
接着細胞株は、処理前に、200μlのFBSを含まない培地で1回洗浄した。腫瘍細胞は、400μMの最高用量として、1/4の希釈過程での10種類の濃度(4×10ー4〜4×1010Mの範囲)の化合物と4時間インキュベートした。1%(最終濃度)のTriton X-100(登録商標)をポジティブコントロールとするとともに、FBSを含まない培地をネガティブコントロールとした。これらの細胞(190μL)を、5%のCO2下、37℃で、試験物質を含有したFBSを含まない培地200μL(最終体積)中でインキュベートした。
試験物質のin vitroにおける細胞毒性活性は、新規テトラゾリウム化合物(MTS、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)、およびPMS(フェナジンメトサルフェート)とよばれる電子カップリング試薬を使用したMTSアッセイ(BALTROP J.A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1:611-614)により示された。
4.1.IC50の決定
増殖の阻害濃度(IC)は次の通りに表された:
IC50(50%阻害濃度):細胞増殖の50%阻害を得る薬物濃度
用量応答曲線は、XLFit 3(IDBS, United Kingdom)を用いてプロットした。IC50の決定値は、片対数曲線からXLfit3ソフトウェアを用いて計算した。それぞれのIC50決定値は、平均値および標準偏差と同様に生成した。
耐性指数は、以下の式を用いて計算した。
5.1. LTX-302
試験したすべての37種のヒト腫瘍細胞株はLTX-302化合物に感受性であり、T-47D細胞株とHep G2細胞株についてのIC50値はそれぞれ4.83±0.96μM〜20.09±4.07μMの範囲であった。
試験した37種のヒト腫瘍細胞株の全ては、LTX-313化合物に感受性であり、それらのIC50値は、4.01±0.39μM(RPMI 8226細胞株)〜18.49±4.86μM(U-87 MG細胞株)の範囲であった。
試験した37種類のヒト腫瘍細胞株は、全て、LTX-315化合物に対して感受性であった。IC50値の範囲は、1.18±0.25μM(T-47D細胞株)〜7.16±150μM(SK-OV-3細胞株)であった。
試験した37種類のヒト腫瘍細胞株は、全て、LTX-320化合物に対して感受性があった。そのIC50値の範囲は、3.46±0.22μM(T-47D細胞株)〜16.64±3.15μM(Hep G2細胞株)であった。
試験した37種のヒト腫瘍細胞株は、全て、LTX-329化合物に対して感受性であった。そのIC50値の範囲は、2.43±0.34μM(T-47D細胞株)〜16.90±1.18μM(U-87 MG細胞株)であった。
T-47D乳癌細胞株は、LTX化合物が試験された細胞株で最も感受性の高い細胞株である。
・試験したすべての5種類の化合物(すなわちLTX-302、LTX-313、LTX-315、LTX-320およびLTX-329)は、37種類のヒト癌細胞株に対して細胞溶解活性を示し、そのIC50は1〜10μM以下(in micromolar to ten micromolar range)の範囲であった。
・LTX-315化合物は、試験を行った37種類のヒト癌細胞株の全てにおいて、1μM〜5μMのIC 50値を有する最も強力な化合物である。
10種類のリンパ腫細胞株のパネルに対する5種類の試験化合物のin vitro細胞毒性試験
1.研究目的
・10種類のリンパ腫細胞株のパネルに対して50%の増殖阻害(IC50)を得るための濃度(IC50)を5種類の新規な化合物について決定すること。
2.1.試験物質
2.1.1.試験物質
・試験物質:LTX-302、LTX-313、LTX-315、LTX-320およびLTX-329は粉末形態で提供される(Table 1参照)。
・Oncodesign (Dijon, France)により提供されたSigma (Saint Quentin Fallavier, France)製のTriton X-100(登録商標)をポジティブコントロールとして使用した。
・化合物は4℃で保存した。粉末は、最初に無血清培地(RPMI 1640, Lonza, Verviers, Belgium)の中に溶解し、適切な希釈状態とするために、さらに無血清培地を用いて希釈した。原液は保存せずに、実験の日に新たに調製した。
・1%(最終濃度)のTriton X-100(登録商標)は、培地を用いて希釈することにより得た。
2.2.1.腫瘍細胞株
癌細胞株および培地は、Oncodesignから購入、提供された。
腫瘍細胞は、加湿雰囲気(5%CO2、95%空気)中、37℃で懸濁物として増殖させた。各細胞株のための培地は、以下のTable 3に記載されている。実験用で使用するために、細胞は血球計測器で計数し、その生存率を0.25%トリパンブルー排除試験法により評価した。
3.1.細胞株の増幅およびコロニー形成
腫瘍細胞を、平底96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Dutscher, Brumath, France)に播種し、薬剤およびFBSを含まない培地190μLによる処理の前に24時間37℃でインキュベートした。各細胞株についての移植密度を以下のTable 4にまとめる。
腫瘍細胞は、最高用量400μMとして、1/4ずつ希釈する過程における10段階の濃度の化合物(4×10-4〜4×10-10M)のもとで4時間インキュベートされた。1%(最終濃度)Triton X-100(登録商標)をポジティブコントロールとして用いた。FBSを含まない培地をネガティブコントロールとして用いた。腫瘍細胞(190μL)は、試験化合物を含み、FBSを含まない培地(終容量200μL)中で5%のCO2下37℃の条件下でインキュベートされた。
試験物質のin vitroにおける細胞毒性活性は、新規テトラゾリウム化合物(MTS、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)、およびPMS(フェナジンメトサルフェート)とよばれる電子カップリング試薬を使用したMTSアッセイ(BALTROP J.A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1:611-614)により示された。
4.1. IC50のデータは、実施例1と同様に測定した。
5.1. LTX-302
試験したすべての10種のヒトリンパ腫細胞株はLTX-302化合物に感受性であり、IC50値は、5.30±2.02μM(U-937細胞株)〜12.54±3.52μM(Raji細胞株)の範囲であった。10種類の感受性細胞株について得られたLTX-302化合物についてのIC50平均値は、8.11±2.44μMであり、中央値は7.53μMであった。
試験したすべての10種のヒトリンパ腫細胞株はLTX-313化合物に感受性であり、IC50値は、3.21±2.81μM(Ramos細胞株)〜16.08±4.86μM(Raji細胞株)の範囲であった。
試験したすべての10種のヒトリンパ腫細胞株はLTX-315化合物に感受性であり、IC50値は、1.15±0.42μM(U-937細胞株)〜4.93±1.03μM(Raji細胞株)の範囲であった。
試験したすべての10種のヒトリンパ腫細胞株はLTX-320化合物に感受性であり、IC50値は、2.22±NAμM(Hs 445細胞株)〜11.26±3.42μM(Raji細胞株)の範囲であった。
試験したすべての10種のヒトリンパ腫細胞株はLTX-329化合物に感受性であり、IC50値は、2.46 ± NA μM(Hs 445細胞株)〜8.70 ± 1.70μM(Raji細胞株)の範囲であった。
KARPAS-299およびRaji細胞株は、試験に用いられたLTX化合物のいずれに対しても最も耐性を有する細胞株である。
・試験したすべての5種類の化合物(すなわちLTX-302、LTX-313、LTX-315、LTX-320とLTX-329)は、10種類のヒトリンパ腫細胞株に対して細胞溶解活性を示し、そのIC50はマイクロモルレベルの濃度であった。
・LTX-315化合物は、試験を行った10種類のヒトリンパ腫細胞株の全てにおいて、1μM〜5μMのIC 50値を有する最も強力な化合物である。
in vitroでの溶血活性
試験の根本方針
ヒト赤血球に対するペプチドLTX-315の溶血活性を測定した。
新たに採取したヒトの血液を、赤血球を分離するために1500rpmで10分間遠心分離した。1500rpm,10分間の遠心分離を利用して、赤血球(RBC)をPBS[150mMのNaClを含む35mMのリン酸緩衝液、pH7.4]で3回洗浄した後、PBSでヘマトクリット値(赤血球の体積比)を10%に調整した。
参照物質:PBS(ネガティブコントロール)およびTriton X-100(登録商標)(ポジティブコントロール)。
放出されたヘモグロビンを、405nmにおける上清の吸光度を測定することによりモニターし、溶血率(%)は、次式により算出した。
50%溶血(EC50)に対応するLTX-315の濃度は、用量反応曲線から決定した。
結果
5回の異なる実験における平均値を標準偏差とともに、以下に示す。このデータはまた図1にも示されている。図1は、LTX-315におけるEC50の平均値が1200μg/mL(833μM)以上であることを示している。
マウスA20 B細胞リンパ腫に対する薬力学的効果
試験の根本方針
研究の目的は、マウスA20 B細胞リンパ腫における、様々な用量のLTX-315の効果を調べることであった。
投与は、滅菌生理食塩水に溶解したLTX-315の腫瘍内注射により行われた。
様々な処理の抗腫瘍効果は、以下のTable 6において、平均腫瘍サイズとして示される。
グループ3において、最も低用量(1回あたり0.25mg)のLTX-315投与を受けることで、弱い阻害効果が最初の数日の間、観察される。グループ1およびグループ2では、それぞれ1回あたり1.0mgまたは0.5mgのLTX-315の投与を受けることで、全ての動物が部分寛解または完全寛解を示した。最適量を投与されたグループのマウスのうち、7匹中3匹のマウスについて、抗腫瘍活性が腫瘍の完全寛解をもたらしたことがわかった(グループ1)。
マウスにおける、マウスCT26WT結腸癌腫瘍に対するLTX-315の効果
材料および方法
投与は、滅菌生理食塩水(滅菌水中0.9% NaCl)中に溶解したLTX-315の腫瘍内注射によって行われた。
様々な処置の抗腫瘍効果は、以下のTable 9における平均腫瘍サイズとして示される。
腫瘍が目的の大きさである最低20mm2に達した時点で上記処置を開始し、腫瘍が125mm2の最大腫瘍量に達したとき。動物は屠殺された。
感受性癌細胞,多剤耐性癌細胞および正常ヒト細胞に対するLTX-315の活性
完全に腫瘍が退縮したマウスにおけるマウスA20 B細胞リンパ腫およびマウスCT26WTの結腸癌細胞の再投与
この試験では、LTX-315の処理後に完全な腫瘍退縮を以前に示した動物における腫瘍増殖の効果を調査しようとした。
マウスA20 B細胞リンパ腫モデルにおけるLTX-315の免疫学的効果。In vivoでの養子脾臓細胞移植の予備研究。
この研究の目的は、10mg/mLのLTX-315により溶解したA20リンパ腫細胞を用いた予防接種の抗癌効果を調べることであった:
(i)予防接種単独;
(ii)予防接種および予防接種に先立って接種部位に20mg/mLのLTX-315を接種することとの併用。
動物:Harlan Laboratories(England, UK; www.harlan.com)から供給された6〜8週齢の特定病原体フリーの雌Balb/cマウス。
試験物質: LTX-315(ロット1013687)によって溶解させたマウスA20細胞、およびLTX-315(ロット1013687)のみ
試験物質の調製:10×106個のA20細胞を、10mg/mLのLTX-315/溶媒50μLに加えたもの(「A20溶解物」)。試験物質は、混合30分後に使用可能な状態であった。LTX-315のみのものは、NaClを0.9%含む滅菌水中に溶解した。
参照物質:なし
コントロールの処理:なし
評価法:計量・検査による腫瘍サイズ測定および健康管理
方法に関する追加データ:デジタルキャリパーは、腫瘍サイズ測定に使用した。計量と身体検査は健康管理に使用された。平均体重、投与量、投与経路および処理計画は、(下記)Table 11に示されている通りである。
様々な処理の抗癌効果は、以下のTable 12に、平均腫瘍サイズとして示されており、また、該データのグラフ表示は図7に示されている。表12において、1日目は、ワクチン接種から6週間経過後の、生存A20細胞の接種日だった。
生存A20B細胞リンパ腫細胞の接種は、処理(treatment)が行われた(1日目)の6週間後に行われた。腫瘍が130mm2の最大許容腫瘍量に達したとき、動物を屠殺した。
本研究では、ヒトメラノーマ細胞に対するLTX-315の殺腫瘍効果を調べた。このペプチドは内在しており、ミトコンドリアに関与することで、最終的に溶解性細胞死をもたらす。LTX-315ペプチドは、腫瘍内注射における二段階の作用機序を介して固形腫瘍を治療するために設計された。一段階目は、腫瘍そのものの破壊であり、二段階目は、死にかけの腫瘍細胞からのダメージ関連分子パターン分子(DAMPs)の放出であり、DAMPsは、腫瘍の再発と転移に対するその後の免疫防御を誘導することができる。
試薬
LTX-315およびLTX-328(KAQ-DIP-QKQAW-NH2)は、それぞれBachem AG(Bubendorf, Switzerland)およびInnovagen(Lund, Sweden)に依頼して作製された。LTX-315パシフィックブルーとLTX-328パシフィックブルーは、依頼して、それぞれ、Innovagen (Lund, Sweden) 、Norud (Tromso, Norway)から購入した。
A375細胞株A375(ECACC,88113005)は、患者試料に由来するヒト悪性メラノーマであり、Public Health England(PHE Culture Collections、Porton Down, Salisbury,UK)から購入した。
LTX-315の細胞毒性効果を、比色MTT生存度アッセイを用いて、Eliassenら((2002), 22(5): pp2703-10)に記載される方法で調べた。A375細胞を、96ウェルプレートに1×105細胞/mLの濃度で0.1mL播種し、完全増殖培地中で一晩接着させた。その後、培地を除去し、細胞を無血清RPMI-1650培地で2回洗浄してから、無血清RPMI培地に2.5〜300μg/mLの濃度範囲で溶解させたLTX-315を加えて、5〜180分間インキュベートした。無血清RPMI培地で処理した細胞は、ネガティブコントロール細胞として使用し、1%Triton X-100を含む無血清培地で処理した細胞は、ポジティブコントロールとして使用した。最終的な結果は、3連のウェルを用いた3回の試験における平均値を用いて計算した。
非標識細胞を用いた生細胞イメージング
25μg/mLのヒトフィブロネクチン(Sigma)でプレコートした「Nunc(登録商標) Lab-Tec(登録商標) 8-wells chambered covered glass」(Sigma)上に、完全培地を用いてA375細胞を10,000細胞/ウェルで播種し、一晩で接着させた。細胞を無血清のRPMI培地で2回洗浄し、RPMI培地に溶解させたペプチドで処理し、さらに、63X/1.2Wの対物レンズを使用し、Bright on a Leica TCS SP5共焦点顕微鏡を用いて観察した。この顕微鏡は、CO2と温度が制御されたインキュベーションチャンバーを備えていた。
細胞は、生細胞イメージング用として播種され、ペプチド処理に先立って、MitoTracker(登録商標) CMH2XROS(Invitrogen)100nMで15分間処理された。細胞は、17μMのLTX-315で処理された。一方、ネガティブコントロールは無血清のRPMI培地のみで処理された。60分間のインキュベーション後、細胞をZeissの顕微鏡を用いて解析した。続いて、全ての共焦点イメージング実験が、少なくとも2回以上実施され、同様の結果を得た。
Subconfluential(細胞が培養皿の半分くらいに増えた状態)のA375細胞は、上述したように8,000細胞/ウェルで播種され、メーカーのプロトコルに従って、トランスフェクション試薬Lipofectamine LTX with PLUS (Invitrogen)を用いて、第2日目にトランスフェクション(形質移入)された。ミトコンドリアは、pDsRed2-Mitoを用いて標識し、核は、GFP-Histon2B plasmid(Imaging Platform, University of Tromso)を使用して標識した。トランスフェクションから1日後、細胞を無血清のRPMI培地で2回洗浄し、異なる濃度およびインキュベーション期間において、LTX-315パシフィックブルー(LTX-315 PB)またはLTX-328パシフィックブルーを用いて処理した。MTTアッセイによって決定されたように、LTX-315 PBは、非標識のLTX-315と同様の細胞毒性プロファイルを示した。コントロール細胞は、非標識LTX-315で処理されたものと、無血清のRPMI培地のみで処理されたものであった。インキュベーション後、細胞は、PBSに含まれる4%パラホルムアルデヒドで固定され、ウェルをProLong(登録商標)Gold Antifade Reagent(Invitrogen)で封入した。細胞はさらに693、1.2 Wの対物レンズを用いて、Leica TCS SP5共焦点顕微鏡を使用して解析した。
A375細胞を6ウェルプレートへ1ウェル当たり1×105細胞で播種し、膜構造を最適化させるため、培地中で3日間増殖させた。また、培地は2日目に交換した。細胞は、無血清RPMI培地で2回洗浄した後、5、10および25μg/mLとなるように無血清RPMI培地に溶解したLTX-315で処理した。また、無血清RPMI培地をネガティブコントロールとして用いた。
DCFDA cellular reactive oxygen species detection assay kit(細胞活性酸素種の検出アッセイキット)は、アブカム(abcam(登録商標))から購入した。A375細胞は、96ウェルコスターブラッククリアボトムプレート(96-well Costar black clear bottom plate)に1ウェル当たり20000細胞で播種し、DCFDAアッセイの前に37℃で16時間インキュベートした。細胞は、1ウェルあたり100μLの予熱したPBSを用いて1回洗浄し、細胞培養インキュベーターの中で、キット付属の緩衝液に20μMで含まれるDCFDAと37℃で45分間インキュベートした。その後、1ウェルあたり100μLの緩衝液で再度洗浄した。次いで、上記細胞を、17μMの濃度で緩衝液に溶解したLTX-315ペプチド100μL/ウェルで30分間刺激した。刺激しなかった細胞は、ネガティブコントロールとして使用した。
A375細胞を完全培地中、6ウェルプレートにおいて1ウェルあたり3×105個播種し、一晩接着させた。細胞は、35μMのLTX-315またはLTX-328で処理した後、37℃、5%CO2下で異なる時間(5、10、15、30、60分)インキュベートした。ネガティブコントロールは、無血清RPMI-1650であった。
HMGB1についての解析と同様にA375細胞を、播種し、35μMのLTX-315またはLTX-328で処理し、異なる時間(5分、15分、45分)インキュベートした。HMGB1についての解析と同様に上清を回収し、濃縮し、上清由来のサンプルを4.5 hour solid form Cytochrome C- Elisa kit(R&D Systems, USA, #DCTC0)を用いてメーカーの製品説明書に従って解析した。すぐ後に、50%に希釈したサンプルは、分析され、450nmに設定したマイクロプレートリーダーを用いてその吸光度が測定された。この測定値を、540nmにおける測定値から差し引いた。アッセイサンプルの各セットについて標準曲線を作成した。サンプルは4連で測定開始(RUN)され、上清中に放出されたシトクロム-Cは、未処理細胞の上清中のシトクロム-Cのレベル以上で現れた。
LTX-315で処理したA375細胞の上清をEnliten(登録商標) ATP luciferase assay kit(Promega, USA)を用いて解析した。細胞は、ROSに関する解析の通りに播種され、1〜15分間の異なるインキュベーション時間において、LTX-315を用いたインキュベーション処理を2連行った。この実験を3回繰り返した。
全てのデータは、少なくとも2連の実験を、少なくとも2回独立して行なったものでり、平均±標準偏差として表される。シトクロム-Cの放出とATPの放出についてのデータは、一元配置分散分析および多重比較検定を用いて比較を行い、P値<0.05となるときに統計的有意性を示すとみなした。
メラノーマ細胞に対するLTX-315の細胞毒性効果
In vitroにおけるA735メラノーマ細胞に対するLTX-315の効果を調べるために、発明者らは、MTTによる細胞生存率アッセイによって、異なるインキュベーション時間におけるペプチド(LTX-315)に対するIC50値を決定した。IC50値は、インキュベーション開始から僅か5分後に30μM、90分後に14μMにまで推移した。さらに180分までインキュベーションをおこなったが、追加の効果は生じなかった(図8)。
発明者らは、次にLTX-315で処理したA735メラノーマ細胞の細胞形態を評価しようと考えた。細胞をIC50値のLTX-315で処理し、明視野共焦点顕微鏡で調べた。処理された細胞は、細胞凝集に先立って、正常な上皮形態から細胞質の中身が溶出し細胞が全崩壊する急激な変化を示した(データは示さず)。これらの変化は、通常、細胞の大半において、IC50値における処理から15〜60分以内に発生した。
ペプチドの内部移行および細胞内における動態を調べるため、LTX-315をパシフィックブルーで標識し、それぞれ3μM、1.5μMの濃度で細胞と共にインキュベートした。標識されたLTX-315は、迅速に細胞膜を通過し、1.5μMで、LTX-315ペプチドは、30分間のインキュベーション後にミトコンドリア周辺への蓄積が確認されたが、細胞核では検出されなかった(図9)。標識された、非溶解性である偽配列のペプチドLTX-328は、いずれの濃度およびインキュベーション時間であっても細胞内移行をしなかった(図10)。
発明者らは、さらに、透過電子顕微鏡(TEM)によって、処理した細胞における超微細構造の変化を評価した。A375細胞に、培地中に直接溶解したLTX-315、または培地のみのいずれかで処理を行った。低濃度(3.5μM)のLTX-315ペプチドで処理した細胞の多くが、一部のミトコンドリアの形態が変化を示すのと同様に空胞化を示した(図11)。これらのミトコンドリアは電子密度が高くなく、また、クリステがより一層離れているか全く観察されない状態であり、ある程度の再組織化を示しているように見えた。これらのサンプル中のネクローシス細胞の数は5%未満であった。これらの低濃度では、細胞質の空胞化が観察された。これらのサンプルにおけるのもう一つの共通知見は、周辺的に配置された空胞であり、これらは、均質物質を含む単一膜に沿って並べられていた(図11(B))。
DAMPsは、細胞が損傷している間、細胞内のソース(intracellular source)から放出される分子である。DAMPsは、抗原提示細胞(APC)上にあるパターン認識受容体(PRRs)への結合を介して、免疫応答を開始し継続させることができる。一般的に知られているDAMPsは、ATP、HMGB1、カルレティキュリン、シトクロム-C、ミトコンドリアDNAおよび活性酸素種(ROS)である。発明者らは、次に、LTX-315で処理した細胞からATPが上清に放出されるか否かを調べた。そこで、処理細胞および非処理細胞の上清を、ルシフェラーゼ検出アッセイを用いて分析した。図15に示すように、ATPは、LTX-315処理後早くも5分後には上清中に検出され、また上記放出は濃度依存的であった。
LTX-315で処理した細胞が、培地中にシトクロム-Cを放出するかどうかを評価するために、A375細胞を、35μMのLTX-315で異なる時間(5分、15分、45分)処理した。上清はその後ELISAアッセイを用いて分析した。35μMのLTX-315で処理された細胞は、未処理のコントロール細胞と比較して、上清中のシトクロム-C値は3倍以上であった。シトクロム-Cの増加は、それぞれ、処理後早くも5分後に検出され、また、ペプチド処理の15分〜45分後にもシトクロム-C値が増加した(図13)。
HMGB1は、非ヒストン、クロマチン結合核タンパク質である。一旦ネクローシス細胞から受動的に放出されると、HMGB1は、いくつかの免疫賦活化効果において、樹状細胞の機能的成熟、サイトカイン刺激および走化性を誘発することができる。HMGB1は、通常、細胞核内にあり、健常細胞の細胞溶解物中にあるともされるが、培地(上清)中では見られない。発明者らは、LTX-315で処理した細胞からのHMGB1の放出を評価するために、細胞溶解物中の核画分(nuclear compartment)から細胞上清へ移行して遊離しているHMGB1を調べた。
LTX-315処理後の活性酸素の生成はCH2DCFDA蛍光アッセイにより測定した。相当量のROSがLTX-315とのインキュベーションの15分後に発生し、ROSの発生量は、(LTX-315の)濃度に依存的であった(図12)。
パシフィックブルー蛍光分子で標識されたLTX-315は、A375メラノーマ細胞とインキュベーション後、数分以内に内在化して細胞質内に拡散した(図9)。低濃度においては、ペプチドがミトコンドリア周辺へ蓄積することが明らかであった一方で、高濃度では細胞質内でさらに拡散して細胞膜周辺に円形構造に蓄積された(図10)。ペプチドがミトコンドリア膜を攻撃した場合には、ミトコンドリアの膜電位の低下または完全な崩壊さえも予測される。膜電位依存ミトコンドリア染色剤のMitoTracker CMXh2ROSを用いた細胞の共焦点イメージングは、ペプチド処理後短時間におけるミトコンドリアシグナルの消失を示した(データは示さず)。このシグナルの消失は、ミトコンドリアとペプチド(LTX-315)との相互作用が、ミトコンドリアの最も重要な細胞機能に重要であるミトコンドリア膜電位の消失を引き起こすことを示している。変化したミトコンドリアの形態も、透過電子顕微鏡(TEM)によって確認された。
抗‐プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)抗体または抗−細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)抗体のいずれかとLTX-315との組合せ(併用)について、マウスMCA205肉腫モデルで分析した。7匹の動物は、グループごとに試験された。試験ごとに、2つの独立した実験が行われ、同一の結果を得た。ANOVA統計分析を行った。本試験で使用した抗PD-1抗体は、マウスIgGアイソタイプであった。抗CTLA-4抗体は、ラットIgGアイソタイプであった。両抗体は、eBioscience社から購入した。
Claims (5)
- 配列番号23の式を有する化合物、またはその塩、エステルまたはアミドを含む医薬製剤であって、
免疫チェックポイント阻害剤と逐次的に投与することにより、腫瘍の治療に使用され、
前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体であり、
前記免疫チェックポイント阻害剤は前記化合物の最初の投与前に投与される、
医薬製剤。 - 前記免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ(ipilimumab)、トレメリムマブ(tremelimumab)からなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項1に記載の医薬製剤。
- 免疫チェックポイント阻害剤と併用投与されることを特徴とする、腫瘍治療のための医薬の製造における化合物の使用であって、ここで前記化合物は
配列番号23の式を有する化合物、またはその塩、エステル、またはアミドの形態であり
、
前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体であり、ここで免疫チェックポイント阻害剤は前記化合物の最初の投与前に投与される、化合物の使用。 - 医薬パックであって、
(i)配列番号23を有する化合物、またはその塩、エステルまたはアミド;および
(ii)抗CTLA-4抗体;
を含み、前記化合物の最初の投与前に前記抗CTLA-4抗体が投与される、腫瘍治療のための医薬パック。 - 免疫チェックポイント阻害剤と逐次的に投与することによって腫瘍の成長、発達または定着に対するワクチンとして使用するための医薬製剤であり、前記化合物の最初の投与の前に前記免疫チェックポイント阻害剤を投与する請求項1または2に記載の医薬製剤。
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