JP6737504B2 - 卵巣明細胞腺癌の検査方法及び検査薬 - Google Patents
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Description
また、全血、血球、血清、血漿などの血液成分から卵巣癌を検出する方法としては、癌抗原125(Cancer Antigen 125、CA125)を検出対象とする方法が一般に知られている。CA125は、1981年にBastらがヒト卵巣癌細胞株(OVCA433)を免疫原として樹立したモノクローナル抗体(OC125)によって認識される抗原であり、血液成分中にCA125を検出すると高い陽性率で卵巣表層上皮性卵巣癌を示す。そのため、卵巣癌のスクリーニング、卵巣癌の治療効果の評価、治療後の経過観察などに有効な検査として広く利用されている(非特許文献1及び2)。
一方、本発明者の荒川らはTFPI2が卵巣癌では明細胞腺癌細胞株から特異的に産生されること、卵巣癌患者組織における遺伝子発現は明細胞腺癌患者のみで特異的に向上することを明らかとし(特許文献4)、血中TFPI2は健常人及び子宮内膜症例と比較して明細胞腺癌で有意に向上していることを見出した(特許文献5、非特許文献14)。
(1)以下の(i)〜(iii)の特徴を有する、組織因子経路阻害因子2(TFPI2)プロセシングポリペプチド。
(i)配列番号1に示すTFPI2アミノ酸配列の23残基目のアスパラギン酸から131残基目のヒスチジンもしくは130残基目のシステインまでのアミノ酸配列、又はこれと80%以上の同一性を有する配列を含む。
(ii)還元SDS−PAGEにより分子量約16,000に分画される。
(iii)アスパラギン結合型糖鎖切断処理後のペプチド断片が、還元SDS−PAGEにより分子量約12,000に分画される。
(2)検体において、(1)に記載のTFPI2プロセシングポリペプチド量を測定することを含む、卵巣明細胞腺癌を検出する方法。
(3)前記検体において、さらにインタクトTFPI2量を測定することを含む、(2)に記載の方法。
(4)前記TFPI2プロセシングポリペプチド量と前記インタクトTFPI2量との合計が、対照から算出した基準値を超えた場合に、卵巣明細胞腺癌が検出されたと判定する、(3)に記載の方法。
(5)配列番号1に示すTFPI2アミノ酸配列の23残基目のアスパラギン酸から131残基目のヒスチジンもしくは130残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いる抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、(2)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前記抗体が、TFPI2のクニッツドメイン1を認識する抗体である、(5)に記載の方法。
(7)質量分析法を用いて前記測定を行う、(2)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(8)配列番号1に示すTFPI2アミノ酸配列の23残基目のアスパラギン酸から131残基目のヒスチジンもしくは130残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む、卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬。
本発明のポリペプチドは、組織因子経路阻害因子2(TFPI2)プロセシングポリペプチドである。
後述する実施例が示すように、NT−TFPI2は癌細胞の細胞内画分には存在せず、細胞培養上清のみに存在していたことから、インタクトTFPI2が癌細胞外に分泌された後に細胞外マトリクスに局在し、何らかの特徴的なプロセシングを経て出現するTFPI2の断片ポリペプチドであると推測される。
NT−TFPI2は、配列番号1に示すTFPI2アミノ酸配列23残基目のアスパラギン酸から131残基目のヒスチジンまたは130残基目のシステインよりもC末端側のアミノ酸配列も含んでいてもよく、例えば131残基目のアミノ酸としてヒスチジンまたは132残基目のアミノ酸としてアルギニンを有するものも好ましい。また、TFPI2のクニッツドメイン3部分を含まないことが好ましい。
また、NT−TFPI2は、前記配列の両側に他のペプチドフラグメントを有していてもよいが、TFPI2のクニッツドメイン3を認識する抗体の抗原決定基を有しないことが好ましい。
なお、インタクトTFPI2は、配列番号1のアミノ酸配列の23残基目から235残基目で表されるペプチドである。
なお、NT−TFPI2は、配列番号1で表されるTFPI2アミノ酸配列のN末端から116残基目のアスパラギンにアスパラギン結合型糖鎖が付加している。
本発明の卵巣明細胞腺癌を検出する方法は、検体において、NT−TFPI2量を測定することを含む。これは、他の組織型と比べて卵巣明細胞腺癌細胞において特徴的に、細胞外にNT−TFPI2が存在することに基づく方法である。この方法により、後述する実施例が示すように、従来知られた腫瘍マーカー(CA125)やインタクトTFPI2単独を測定した場合に比べて、卵巣明細胞腺癌を特異的に高い感度と特異度で検出することができる。
本発明の検出方法では、検体において、NT−TFPI2量に加えさらにインタクトTFPI2量を測定してもよい。これは、検体中のNT−TFPI2とインタクトTFPI2との合計量に基づいて卵巣明細胞腺癌の検出の判定を行っても十分な感度と特異度が得られるからでもある。あるいは、後述するように、両方の測定による合計量とインタクトTFPI2単独の測定量とから間接的にNT−TFPI2量を測定することによっても、卵巣明細胞腺癌の検出を行えるからでもある。
(a)標識した測定対象及び測定対象を認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
(b)測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
(c)蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
(d)エピトープの異なる2種類の、測定対象を認識する抗体(うち1つは標識した抗体)を用い、当該2つの抗体と測定対象との3者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
(e)前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その結合タンパクのポリペプチドを質量分析装置等により検出する方法。
(d)、(e)の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では(d)の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。
(A)NT−TFPI2とインタクトTFPI2の両方を認識する抗体を用いて、NT−TFPI2及びインタクトTFPI2の合計量を測定する方法(NT+I−TFPI2測定系)。なお、前記NT−TFPI2とインタクトTFPI2の両方を認識する抗体は、配列番号1で表されるTFPI2アミノ酸配列の23残基目のアスパラギン酸から131残基目のヒスチジンまたは130残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体であることが好ましく、TFPI2のクニッツドメイン1に対する抗原認識部位を有する抗体であることがさらに好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる2種類を用いる。
(B)NT−TFPI2を認識せずインタクトTFPI2を認識する抗体を用いて、インタクトTFPI2単独の量を測定する方法(I−TFPI2測定系)。なお、前記NT−TFPI2を認識せずインタクトTFPI2を認識する抗体は、TFPI2のクニッツドメイン3に対する抗原認識部位を有する抗体であること好ましい。また、この方法で前述したサンドイッチ法を用いる場合は、通常、前記抗体はエピトープの異なる2種類を用い、うち少なくとも1種類はNT−TFPI2を認識せずインタクトTFPI2を認識する抗体を用い、もう1種類はNT−TFPI2を認識せずインタクトTFPI2を認識する抗体であってもNT−TFPI2とインタクトTFPI2の両方を認識する抗体であってもよい。
(C)(A)のNT+I−TFPI2測定系で測定したNT−TFPI2及びインタクトTFPI2の合計量から、(B)のI−TFPI2測定系で測定したインタクトTFPI2単独量を減じることにより、NT−TFPI2単独の量を算出する方法。
(D)インタクトTFPI2を認識せずNT−TFPI2を認識する抗体を用いて、NT−TFPI2単独の量を測定する方法。なお、前記インタクトTFPI2を認識せずNT−TFPI2を認識する抗体は、例えば、NT−TFPI2のC末端部分のペプチド配列を特異的に認識する抗体が挙げられる。前述したサンドイッチ法を用いる場合は、例えば、当該抗体を固相抗体とし、クニッツドメイン1に対する認識部位を有する抗体を検出抗体とする。
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
なお、免疫原として、NT−TFPI2ポリペプチド又はインタクトTFPI2タンパク質そのもの、またはNT−TFPI2ポリペプチド又はインタクトTFPI2タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチドを用いると、前記タンパク質または前記オリゴペプチドを調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の抗原に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、結果として検体中に含まれるTFPI2濃度を正確に定量できなくなる可能性がある。一方、免疫原として、NT−TFPI2ポリペプチド又はインタクトTFPI2タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いると、免疫された動物の体内で構造変化を受けない導入した通りのNT−TFPI2ポリペプチド又はインタクトTFPI2タンパク質のインタクトまたは部分領域が発現されるため、検体中のNT−TFPI2ポリペプチド又はインタクトTFPI2に対し、高い特異性及び結合力(すなわち高親和性)を有した抗体が得られるため好ましい。
TFPI2を認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。
なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のNT−TFPI2及び/又はインタクトTFPI2に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞(HEK)293T細胞株、サル腎臓細胞COS7株、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。
なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。
検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等のタンパク質をAgilent Human 14等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相HPLC等でさらに分画することが好ましい。
測定は、タンデム質量分析(MS/MS)、液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析(LC/MS/MS)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(matrix assisted laser desorption ionization time−of−flight mass spectrometry、MALDI−TOF/MS)、表面増強レーザーイオン化質量分析(surface enhanced laser desorption ionization mass spectrometry、SELDI−MS)等により行うことができる。
判定に用いるNT−TFPI2量及びインタクトTFPI2量は、測定値もしくは換算濃度値の何れでもよい。なお、換算濃度値は、TFPI2を標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。
基準値(Cutoff値)は、明細胞腺癌以外の卵巣腫瘍、子宮腫瘍、又は健常人などの卵巣明細胞腺癌ではない検体と、卵巣明細胞腺癌検体とをそれぞれ測定し、受信者動作特性(ROC)曲線解析により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。例えば、具体的には、血清を検体として用いた際のNT−TFPI2量とインタクトTFPI2量との合計の基準値(Cutoff値)は、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる4−メチルウンベリフェロン生成濃度をもって算出される測定値(rate:nmol/(L・s))である1.9に設定してもよい。
本発明の卵巣明細胞腺癌検出用の試薬は、配列番号1で表されるTFPI2アミノ酸配列の23残基目のアミノ酸から131残基目又は130残基目のアミノ酸までの領域内の抗原決定基に結合する抗体を含む。前記抗体は好ましくは、TFPI2のクニッツドメイン1を認識する抗体である。これらの抗体はNT−TFPI2及びインタクトTFPI2の両方を認識することができる。
本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体としてエピトープの異なる2種類の抗体を含むことが好ましい。
本発明の卵巣明細胞腺癌検出試薬は、さらに、卵巣癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を含む、卵巣癌の腫瘍マーカーの検出試薬を含んでいてもよい。卵巣癌の腫瘍マーカーとしては、例えばCA125等が挙げられる。
本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。
まず、本発明の試薬は、以下の(I)から(III)に示す方法で作製することができる。
(I)まず、サンドイッチ法で用いる、NT−TFPI2及びインタクトTFPI2を認識する、エピトープの異なる2種類の抗体(以下、「抗体1」及び「抗体2」とする)のうち、抗体1をイムノプレートや磁性粒子等のB/F(Bound/Free)分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、2物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
(II)担体に前記抗体1を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行ない1次試薬とする。
(III)他方の抗体2を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を2次試薬として準備する。抗体2に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、2次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Tris−HCl緩衝液などが好ましい。
このようにして作製した本発明の試薬は必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
(IV)(II)で作製した1次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度4℃から40℃の範囲で、5分から180分間反応させればよい。
(V)未反応物質をB/F分離により除去し、続いて(III)で作製した2次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度4℃から40℃の範囲で、5分から180分間反応させればよい。
(VI)未反応物質をB/F分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のTFPI2溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトNT−TFPI2及びインタクトTFPI2濃度を定量する。
DNA免疫にて液性免疫を効果的に誘導するためには、対象抗原タンパク質を膜結合型タンパク質として細胞表面上に局在させるのが好ましい。TFPI2は本来分泌タンパク質であるため、TFPI2を細胞表面上に局在させるべく、TFPI2のC末端側にGPI(glycosylphosphatidylinositol)アンカーを付加したタンパク質(以下、GPIアンカー型TFPI2)を発現可能なプラスミドベクターを構築した。
(a)GPIアンカー型TFPI2発現プラスミド用プライマー
Forward:
5’−cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca−3’(配列番号2、3’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の73から87番目の塩基配列に相当)
Reverse:
5’−catcagtggtgaattcaaattgcttcttccg−3’(配列番号3、5’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の691から705番目の塩基配列に相当)
(3−1)(2)で構築したGPIアンカー型TFPI2発現プラスミドを常法に従い293T細胞株へ導入した。
(3−2)前記発現プラスミドが導入された293T細胞株を、5%CO2インキュベータにて、10%FBS(Fetal Bovine Serum)添加D−MEM培地(和光純薬社製)を用いて、24時間・37℃で培養し、TFPI2を一過性発現させた。
(3−3)(3−2)で得られた培養細胞に、FLAGタグと特異的に結合するSIGMA社製マウス抗FLAG M2抗体、または、陰性対照としてFLAGタグとは結合しないマウス抗BNC抗体を添加し、30分静置した。なお、BNCとは、BNP(脳性ナトリウム利尿ペプチド)のC末端側7アミノ酸からなるペプチドである(特開2009−240300号)。
(3−4)静置後、蛍光標識した抗マウスIgG抗体(BECKMAN COULTER社製)を添加し、さらに30分間静置後、FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)解析を行なった。
マウスへの免疫は、実施例1(2)で構築したGPIアンカー型TFPI2発現プラスミドを、DNA量として40μg含むよう調製したPBS溶液100μLを、4匹のBalb/cマウスに投与した。初回の免疫から7日後、14日後、21日後、28日後、及び35日後に追加投与し、初回の免疫開始後42日目に採血して抗血清を採取し、それぞれ抗血清A−1からA―4とした。
抗血清評価用として、GPIアンカー型TFPI2を恒常的に発現可能なチャイニーズハムスター卵巣由来CHO−K1細胞株を以下の方法で作製した。
(1)実施例1(2)で構築したTFPI2発現プラスミドを、常法に従いCHO−K1細胞株へ遺伝子導入後、5%CO2インキュベータにて、10%FBS添加Hams F12培地(和光純薬社製)を用いて、24時間・37℃で培養した。
(2)培養後、抗生物質Geneticin溶液(Invitrogen社製)を250μg/mLとなるよう添加し、さらに3週間培養した。
(3)抗FLAG抗体を用いてセルソーターによりGPIアンカー型TFPI2を恒常的に発現するCHO−K1細胞を獲得した。
実施例1(2)で構築したTFPI2発現プラスミドにおいて、挿入したTFPI2遺伝子と、その3’末端側に存在するGPIアンカーのコード領域との間に、BNP(脳性ナトリウム利尿ペプチド)のC末端側7アミノ酸からなるBNCペプチド(特許文献5)をコードするオリゴヌクレオチドをさらに挿入することにより、N末端側にFLAGペプチド、C末端側にBNCペプチドがそれぞれ付加され、且つGPIアンカーを有さない分泌型TFPI2を発現可能なプラスミドを調製した。具体的調製方法を以下に示す。
(b)分泌型TFPI2発現プラスミド用プライマー
Forward:
5’−cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca−3’(配列番号4、3’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の73から87番目の塩基配列に相当)
Reverse:
5’−agcatcagtggtgaattctcattagtggcgacgcagaactttgcaaaattgcttcttccg−3’(配列番号5、5’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の691から705番目の塩基配列に相当)
(3−1)実施例1記載と同様に、(2)で構築した分泌型TFPI2発現プラスミドを293T細胞株へ導入して分泌型TFPI2を一過性発現させ、培養72時間後の培養液を遠心分離し、上清を分泌型TFPI2溶液として回収した。
(3−2)分泌型TFPI2溶液を試料として用いて、(A)酵素免疫測定法(ELISA法)、及び(B)ウエスタンブロット(WB)法を行った。
(A−1)ウサギ抗FLAGポリクローナル抗体(ROCKLAND社製)を100ng/ウェルになるようカーボネート緩衝液(pH9.8)で希釈し、MaxiSorp96穴プレート(NUNC社製)に固相化した。
(A−2)4℃にて一晩反応後、TBS(Tris−Buffered Saline)により3回洗浄し、3%ウシ血清アルブミン(BSA;Bovine Serum Albumin)を含むTBS溶液を250μL/ウェルにて各ウェルに添加し、室温で2時間放置した。
(A−3)TBSにより3回洗浄を行ない、分泌型TFPI2溶液、及び、陰性対照として発現プラスミドを導入していない293T細胞株の培養上清を、50μL/ウェルにて添加し、室温で1時間放置した。
(A−4)0.5%Tween 20を含むTBS(TBS−T)により3回洗浄を行なった後、1%BSAを含むTBS−T(1%BSA/TBS−T)で1μg/mLになるよう希釈したマウス抗BNCモノクローナル抗体溶液を、50μL/ウェルで添加し、室温で1時間放置した。
(A−5)TBS−Tにより3回洗浄を行なった後、1%BSA/TBS−Tで10000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスイムノグロブリンG−Fc抗体(SIGMA社製)溶液を50μL/ウェルにて添加し、室温で1時間放置した。
(A−6)TBS−Tにより4回洗浄を行ない、TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL社製)を添加後、1mol/Lリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて450nmの吸光値を測定した。
(B−1)(3−1)で得られた分泌型TFPI2溶液、及び、陰性対照として発現プラスミドを導入していない293T細胞株の培養上清を、常法に従いSDS−PAGEで展開し、PVDF膜(GEヘルスケア社製)に転写した。
(B−2)5%スキムミルクを含むTBS−T(ブロッキング溶液)を室温で2時間反応することでブロッキング後、ブロッキング溶液にアルカリフォスファターゼ標識抗BNC抗体を1μg/シートにて添加し、4℃で一晩反応させた。
(B−3)TBS−Tで洗浄後、Western Lightning CDP−Star(パーキンエルマー社製)を用い、得られた化学発光を感光フィルムにより検出した。
ELISA法での解析結果を図2に示す。分泌型TFPI2溶液(分泌型TFPI2培養上清)では、陰性対照(293T培養上清)と比較して明瞭な添加量依存的なシグナルが認められ、分泌型TFPI2が培養上清中に産生されていることが示された。
ウエスタンブロット法での解析結果を図3に示す。分泌型TFPI2溶液(分泌型TFPI2培養上清)では、分子量約35kDa付近に明瞭なバンドが検出され、N末端にFLAGタグ、C末端にBNCタグを有する分泌型TFPI2が培養上清中に産生されていることが示された。
実施例2で採取したマウス抗血清を、実施例3で作製したGPIアンカー型TFPI2発現CHO−K1細胞を用いた細胞酵素免疫測定法(CELISA)、及び実施例4で得られた分泌型TFPI2溶液を用いたELISAにより解析した。なお、特異性の検討の為、TFPI2とは異なるタンパク質をGPIアンカー型(N末端側にFLAGタグ、C末端側にGPIアンカーを有する)及び分泌型(N末端側にFLAGタグ、C末端側にBNCタグを有する)でそれぞれ発現する発現プラスミドを、公知の遺伝子配列に基づいて上述したTFPI2発現プラスミドと同様に構築し、293T細胞株やCHO−K1細胞に導入して利用した。以下、当該TFPI2とは異なるタンパク質を、対照タンパク質ともいう。
(1−1)96ウェルプレートに、実施例3で作製したGPIアンカー型TFPI2発現CHO−K1細胞、及び陰性対照細胞として前記対照タンパク質をGPIアンカー型で発現するCHO−K1細胞を、1ウェルあたり5×104細胞で添加し、10%FBS添加Hams F12培地(和光純薬社製)を用いて、5%CO2インキュベータにて、24時間・37℃で培養した。
(1−2)GPIアンカー型TFPI2発現細胞及び陰性対照細胞に対して2000倍希釈した抗血清(A1からA4)またはマウス抗FLAG M2抗体(SIGMA社製)を、それぞれ1次抗体として添加し、室温にて1時間反応させた。
(1−3)反応後プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスイムノグロブリンG−Fc抗体(SIGMA社製)を2次抗体として添加し、室温にて1時間反応させた。
(1−4)反応後プレートを洗浄し、TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL社製)を添加後、1mol/Lリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて450nmの吸光値を測定した。
陰性対照として前記対照タンパク質を分泌型で発現する293T細胞株の培養上清(以下、分泌型対照タンパク質溶液ともいう)を用いた他は、実施例4(A)と同様な方法で各マウス抗血清を評価した。
CELISA解析の結果を図4に示す。陰性対照細胞ではいずれの抗血清でもシグナルがほとんど認められなかったが、TFPI2発現細胞では明瞭なシグナルが認められた。本結果より実施例2で実施したDNA免疫により特異性の高い抗TFPI2抗血清が得られたことが示された。
ELISA解析の結果を図5に示す。CELISAの結果同様、抗血清(A1からA4)を用いた場合は、TFPI2に対してのみ明瞭なシグナルが認められ、本法でも実施例2で実施したDNA免疫により特異性の高い抗血清が得られたことが示された。
図4及び図5の結果をまとめると、実施例2で得られたマウス抗血清は、GPIアンカー型TFPI2及び分泌型TFPI2のいずれに対しても特異性の高い抗血清であることがわかる。
TFPI2に対する抗体を産生可能なハイブリドーマを以下の方法により樹立した。
(1)実施例2でDNA免疫により抗体価の上昇が認められたマウスから脾臓細胞を採取し、脾細胞を回収した。
(2)回収した脾細胞とマウスミエローマ細胞株SP2/0とで、ポリエチレングリコール存在下で常法に従い細胞融合を実施した。
(3)HAT(Sigma−Aldrich社製)/GIT培地(和光純薬社製)で約10日間培養することで抗体産生細胞ハイブリドーマを選択した。
(4)選択した抗体産生細胞ハイブリドーマの培養上清を、実施例5(1)に記載のCELISA及び実施例4(A)に記載のELISAに供し、TFPI2に対する抗体を産生可能なハイブリドーマのスクリーニングを行った。
(5)スクリーニングにより選択されたウェル中の細胞を限界希釈法によりモノクローナル化を行ない、HT(Sigma−Aldrich社製)/GIT培地からGIT培地に馴化培養し、最終的に10種類のハイブリドーマ(TS−TF01〜TS−TF10)を樹立した。
各抗体の認識する抗原決定基を、TFPI2の各クニッツドメインであるKD1、KD2及びKD3のバリアント発現細胞により同定した。各バリアント発現用プラスミドの具体的調製方法を以下に示す。
(1)下記(c)、(d)及び(e)記載のプライマーを用いて、TFPI2のKD1領域、KD2領域及びKD3からC末端領域に相当するポリヌクレオチドを、常法に従いRT−PCR法により増幅した。
Forward:
5’−cgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca−3’(配列番号6、3’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の73から87番目の塩基配列に相当)
Reverse:
5’−catcagtggtgaattctttttctatcctcca−3’(配列番号7、5’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の259から273番目の塩基配列に相当)
Forward:
5’−cgatgacgacaagcttgttcccaaagtttgc−3’(配列番号8、3’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の274から288番目の塩基配列に相当)
Reverse:
5’−catcagtggtgaattctttctttggtgcgca−3’(配列番号9、5’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の445から459番目の塩基配列に相当)
Forward:
5’−cgatgacgacaagcttattccatcattttgc−3’(配列番号10、3’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の460から474番目の塩基配列に相当)
Reverse:
5’−catcagtggtgaattcaaattgcttcttccg−3’(配列番号11、5’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の691から705番目の塩基配列に相当)
(3)実施例3記載の方法で上記3種の一過性発現細胞を調製し、実施例6記載10種のモノクローナル抗体の認識する抗原決定基を同定した。
実施例6で樹立した10種類のハイブリドーマから、以下の方法によりTFPI2に対するモノクローナル抗体(抗TFPI2モノクローナル抗体)を調製し、CELISA解析を実施した。
(1−1)前記カラムをあらかじめPBS(Phosphate Buffer Saline;10mM リン酸+150mM NaCl(pH7.4))にて緩衝液置換した後、ハイブリドーマ培養上清を流速10mL/minで通過させた。
(1−2)カラム容量の5倍以上のPBSにより十分カラムを洗浄することで、未結合タンパク質の除去を行なった。この際、カラムを通過した緩衝液のOD280による吸光度が0.01以下になったことを確認することで、未結合タンパク質が残存していないと判断した。
(1−3)カラム洗浄後、溶出液(100mM グリシン(pH2.5))により結合抗体を溶出させた。なお、溶出抗体は速やかに1/10容量の1M Tris(pH8.0)を添加し、中性にするとともに、TBSによる速やかな透析を行ない、各精製抗体のタンパク濃度を吸光度計により定量した。
(2−1)前記抗体希釈溶液を実施例5(1)記載の方法でCELISA解析を実施した。なお、各抗体200ng/wellのみTFPI2発現細胞と対照細胞で解析し、66.6ng/well以下の抗体希釈溶液はTFPI2発現細胞のみとした。CELISA解析結果を図6に示す。陽性対照である抗FLAG抗体はTFPI2発現細胞及び陰性対照細胞双方で明瞭なシグナルが認められた。比較対照である抗TFPI2 P−2抗体はTFPI2発現細胞対して全くシグナルが認められなかったが、当該抗体はWB用途いわゆる変性タンパク検出用であり、天然型の高次構造を有するTFPI2を用いた本解析系では反応性が認められないことは至極当然である。一方、前記10種の抗TFPI2抗体は抗体間差が認められるものの総じてTFPI2発現細胞に対して特異的かつ濃度依存的なシグナルが認められた。
実施例8で調製した10種類の抗TFPI2モノクローナル抗体の抗体固定化磁性微粒子を調製し、各抗体と特異的に結合する卵巣明細胞腺癌細胞培養上清中のタンパク質を以下の方法により同定した。なお、卵巣明細胞腺癌細胞としてはOVISE、OVMANA及びOVSAYOの3種類を用いた。
(2−1)前記3種の癌細胞を、10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地(和光純薬社製)にて100%コンフルエント状態で3日間培養した。
(2−2)培養上清を遠心後、上清0.1mLに対し、実施例8に記載の方法で調製した10種の抗体固定化磁性微粒子を各々添加し、室温で1時間撹拌して反応させた。
(2−3)PBST−NP40(0.1% Tween 20、1% NP40)で2回洗浄後、界面活性剤を含まないPBSで3回洗浄した。
(2−4)各抗体固定化磁性微粒子に結合したタンパク質を実施例4(B)記載のウエスタンブロットにより解析した。なお、分子量マーカーはFull−Range Rainbow Molecular Weight Markers(GE社製)を、SDS−PAGE用ゲルは10−20%グラジェントゲル(マリソル社製)用いた。ウエスタンブロットの検出用抗体は横浜市立大婦人科にて樹立されたインタクトTFPI2のN末端を認識する抗TFPI2ペプチド抗体(非特許文献6参照)をアルカリフォスファターゼ標識キット(同仁化学社製)にて標識し、実施例4記載の方法で検出した。WBデータの解析はChemi−Stage付属Labo1Dソフトウェア(クラボウ社製)で行い、各抗体の強いシグナルが認められたAまたはBにおける単位面積あたりのシグナル強度を数値化した。なお本検討は3回実施しており、面積Labo1Dソフトウェア解析結果は3回の実験結果におけるシグナル平均値及び標準誤差を算出した。
実施例9でNT−TFPI2に親和性の高いことが確認されたTS−TF01抗体及びTS−TF04抗体、並びに対照としてTS−TF05抗体の計3種類の抗体固定化磁性微粒子を用いたIP−WBの再検証を行った。また、TS−TF01抗体及びTS−TF04抗体に結合するNT−TFPI2ポリペプチドを質量分析法により解析した。卵巣癌細胞培養上清としては実施例9で調製したOVISE及びOVMANAの2種類を用い、実施例9記載の方法で調製したサンプルを用いてIP−WBを実施した。OVMANAサンプルのみ質量分析用に以下の通りサンプルを調製した。
(2)染色が認められた分子量約16,000付近の3種類及び染色が認められない周辺の1種類計4種類の断片(TS−TF01:図8Ruby染色のA及びBに記載の断片、TS−TF04:図8Ruby染色のC及びDに記載の断片)を切り出し、ジチオスレイトール及びヨードアセトアミドを用いて還元アルキル化後、トリプシンによるゲル内消化を実施した。
(3)トリプシン消化により生成したペプチド断片を、C18逆相カラムを用いた1DナノLCシステム(Ultimate3000、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)により分離し、LTQオービトラップ質量分析計(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)によりMS/MS測定を行なった。得られたデータはProtein Discoverer 1.3ソフトウェア(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて解析し、Swiss−Protデータベース上のアミノ酸配列に対して検索をかけてタンパク質を同定した。
実施例9及び実施例10で明細胞腺癌培養上清中にはインタクトTFPI2及びNT−TFPI2双方の存在が認められたため、固相側をクニッツドメイン1に対する抗原認識部位を有するTS−TF04抗体、検出側にクニッツドメイン1に対する抗原認識部位を有するTS−TF01抗体を用いて、インタクトTFPI2及びNT−TFPI2を包括的に測定対象とする「NT+I−TFPI2測定系」の測定試薬を以下の通り調製した。また、固相側にクニッツドメイン1に対する抗原認識部位を有するTS−TF04抗体、検出側にクニッツドメイン3に対する抗原認識部位を有するTS−TF05抗体を用いて、インタクトTFPI2のみを測定対象とする「I−TFPI2測定系」の測定試薬を以下の通り調製した。
(2)抗TFPI2モノクローナル抗体(TS−TF01またはTS−TF05)をアルカリフォスファターゼ標識キット(同仁化学社製)にて、2種類の抗TFPI2標識抗体を調製した。
(3)磁力透過性の容器(容量1.2mL)に、(1)で調製した12個の抗体固定化担体を入れた後、(2)で調製した標識抗体を0.5μg/mL含む緩衝液(3%BSAを含むトリス緩衝液、pH8.0)50μLを添加し、凍結乾燥を実施することで、測定試薬A(TS−TF04抗体/TS−TF01抗体を用いたNT+I−TFPI2測定試薬)及び測定試薬B(TS−TF04抗体/TS−TF05抗体を用いたI−TFPI2測定試薬)の2種類のTFPI2測定試薬を作製した。なお、作製したTFPI2測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで4℃で保管した。
TFPI2を含むサンプルとして実施例4で作製した組換えTFPI2上清、実施例9で調製したOVISE及びOVMANAをFBSで10倍希釈し、TFPI2を含まないサンプルとしてFBSのみの計4種の擬似検体サンプルをそれぞれ調製し、実施例11で作製した2種のTFPI2測定試薬を用いて5点測定することで前記試薬を評価した。
(1)希釈サンプル20μLと界面活性剤を含む希釈液80μLを、実施例11で作製したTFPI2測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
(2)37℃恒温下で10分間の抗原抗体反応を行ない、
(3)界面活性剤を含む緩衝液にて8回の洗浄を行ない、
(4)4−メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加する、
ことで行い、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる4−メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値(nmol/(L・s))とした。
本発明者の荒川らは、明細胞性、漿液性及び粘液性の各種卵巣癌培養細胞パネルにおいて、培養上清を質量分析法により、細胞中の遺伝子発現をRealtimePCRにより解析し、明細胞性のみで特徴的に産生される分子としてTFPI2を同定した(特許文献4)。従って、実施例11記載のTFPI2測定試薬でも同様に明細胞腺癌培養上清のみでTFPI2測定値が高値を示せば、本試薬の測定対象はTFPI2と判断できる。荒川らが使用した各種卵巣癌細胞培養上清パネルをTFPI2測定試薬により解析した。
明細胞性:OVISE、OVTOKO、OVMANA、OVSAYO
漿液性 :OVKATE、OVSAHO
粘液性 :RMUG−S、MCAS
2)実施例12記載の方法で、計8種類の培養上清を2種のTFPI2測定試薬により解析した。
TFPI2はUniProt等の一般的なデータベース及び文献等のこれまでの公知情報から、配列番号1で示されるアミノ酸配列の116残基目及び170残基目の2か所のアスパラギンにアスパラギン結合型糖鎖が付加していることが知られている。従って、NT−TFPI2ポリペプチドは実施例10の結果から116残基目のアスパラギン結合型(N型)糖鎖を含む糖タンパクと予測されるため、N−グリカナーゼを用いた糖鎖消化処理によるNT−TFPI2ポリペプチドの分子量変化を、実施例10記載の3種の抗体と、N−グリカナーゼ処理区または未処理区の実施例9記載のOVISE、OVMANA及びOVSAYO上清とを用いてIP−WBを行い検証した。同時に、上清中TFPI2のIP効率を、実施例11で作製した測定試薬を用いて算出するIP−AIAにより検証した。
(2)1抗体区あたり100μLの(1)で処理した上清を用い、対照として磁性微粒子のみの添加区を、3種の抗体固定化磁性微粒子添加区の計4試験区を設け、実施例9記載の方法でIPを実施した。反応後の溶液をマグネットにより上清及び磁性微粒子画分に分離した。
(3)上清画分は実施例10記載の2種類の測定試薬で測定し、N−グリカナーゼ処理によるTFPI2測定値への影響及び3種の抗体のIP効率を算出した。IP効率(回収率(%))は、100−((2)記載上清の測定値/抗体未固定の磁性微粒子反応溶液測定値)から算出した。
(4)磁性微粒子画分には実施例9記載の方法でWBを実施し、その発光シグナルを検出した。
TFPI2の測定値及びIP効率はいずれもN−グリカナーゼ処理の有無で変動がなく、N−グリカナーゼ処理による反応系の阻害は認められなかった。IP効率においては、TS−TF04及びTS−TF01IP区は、3種の上清と2種の測定系いずれの結果においても回収率が97%以上と高く、ほぼ完全にTFPI2分子を回収していることが示された。一方、TS−TF05IPでは、A)NT+I−TFPI2測定試薬による回収率は4点平均74.3%なのに対し、B)I−TFPI2測定試薬による回収率は4点平均91.3%と有意な差異が認められた。TS−TF05は、TS−TF04及びTS−TF01とは異なるTFPI2の領域を認識することが示唆された。
NT−TFPI2ポリペプチドの産生機構解明を目標として、培養上清中におけるTFPI2の経時的な動態を、実施例9記載のIP−WBまたは実施例14記載のIP−AIA法により検証した。
(1)OVISE、OVMANA及びOVSAYO細胞を15cmディッシュにてコンフルエントな状態になるまで前培養した。
(2)各ディッシュに新たな培地20mLを加え、培養24、48、72、及び144時間後の培養上清をそれぞれ経時的に回収した。
(3)(2)で回収した上記4点の上清を、実施例9記載の方法で抗体あたり100μLの上清を用いてIPを実施し、3種の抗体固定化磁性微粒子を含む溶液をマグネットにより上清及び磁性微粒子画分に分離した。
(4)上清画分は実施例11記載の2種類の測定試薬で測定し、培養上清中TFPI2量の経時変化を測定した。
(5)培養期間によりTFPI2が経時的に向上することから、WBを実施する際に回収時間の異なる計4点のTFPI2量を平均化する必要がある。そこで(4)の24時間後の培養上清中のTFPI2測定値を基に、以降3点の磁性微粒子画分のSDS−PAGE添加量を適宜希釈して各レーンのTFPI2添加量を調整し、実施例9記載のWBを実施した。経時的に回収した培養上清のTFPI2測定値及びWB像を図11に示す。
実施例13及び14により、培養上清中にインタクトTFPI2及びNT−TFPI2ポリペプチドが産生することが示されたが、当該分子が細胞内にも局在することも考えられる。従って、細胞内のTFPI2分子をIP−WB法により検証した。
1)明細胞性としてOVISE、OVMANA及びOVSAYOを、漿液性としてOVKATE及びOVSAHOを実施例13記載の方法で培養した。
2)細胞可溶化剤として2Mチオウレア、7Mウレア、3%CHAPS、1%TritonX-100溶液を調製し、細胞培養プレートから培地を除去しPBSで3回洗浄後、細胞可溶化剤を培養プレートに添加した。
3)セルスクレーパーにより細胞を剥がし、15,000rpmで20分遠心分離後、その上清画分を細胞抽出液とした。
4)上記細胞抽出液を用いて、実施例11記載の2種類のTFPI2測定試薬による測定、及び実施例9記載の3種の抗体によるIP−WBを実施した。
本実施例で使用した62例の妊婦血清検体(PROMEDDX社購入検体)は第1三半期から第3三半期を含む妊娠5週齢から40週齢の検体であり、いずれの検体もインフォームドコンセント承諾済と記載された欧米人血清検体である。
全自動エンザイムイムノアッセイ装置AIA−1800(東ソー社製)を評価用装置とし、実施例11で作製したA)NT+I−TFPI2測定試薬及びB)I−TFPI2測定試薬の2種類を用いて測定した。
本実施例で使用した検体パネル(123例)を表4に示す。本検体は横浜市立大婦人科にて同一プロトコルにて収集された血清検体であり、インフォームドコンセントの承諾及び横浜市立大学倫理委員会の承認を受けている。
NT+I−TFPI2測定系及びI−TFPI2測定系のTFPI2測定値及びCA125測定値を図14に示す。CA125は卵巣癌悪性全般で高値傾向を示すが、NT+I−TFPI2測定系及びI−TFPI2測定系の測定値は明細胞腺癌で高値傾向を示した。
本パネル解析結果を良性卵巣腫瘍、子宮内膜症、境界悪性腫瘍、明細胞腺癌、その他悪性卵巣腫瘍の5群に分類した結果を図15に、2種のTFPI2測定値及びCA125測定値の各群における最小値、25パーセンタイル、中央値、75パーセンタイル、最大値、95%信頼区間における濃度範囲を表5に示す。CA125は良性卵巣腫瘍に比べ子宮内膜症で高値、さらに悪性腫瘍全般で明瞭な高値傾向を示した。CA125は子宮内膜症の補助マーカーであることから良性腫瘍において子宮内膜症で高値を示すことは妥当である。明細胞腺癌とその他悪性卵巣腫瘍間では中央値がほぼ等しいことから、CA125では明細胞腺癌を見分けることは不可能であるといえる。一方、NT+I−TFPI2測定系及びI−TFPI2測定系の測定値は明細胞腺癌のみで高値傾向が認められたが、NT+I−TFPI2測定系の測定値の方がより高値傾向にあることが示された。
NT−TFPI2ポリペプチドのC末端配列を、重酸素水法を用いた質量分析法により解析した。
卵巣癌細胞培養上清としては実施例9で調製したOVMANAを用い、TS−TF01抗体カラムを用いて質量分析用に以下の通りサンプルを調製した。
(1)HiTrap NHSカラム(GEヘルスケア社製)とTS−TF01抗体を用いて常法に従いTS−TF01抗体結合カラムを作製した。
(2)OVMANA培養上清10mLをシリンジにて抗体カラムに3回通液し、TBSで3回洗浄を行った。
(3)0.1Mグリシン(pH2.0)溶液1mLを抗体カラムに3回通液し、抗体カラム結合画分溶液として回収した。
(4)抗体カラム結合画分溶液をトリクロロ酢酸で濃縮後、SDS−PAGEで展開し、SYPRO−Ruby染色(インビトロジェン社製)により染色した。
(5)染色が認められた計3種類(図17A:SYPRO−Ruby染色の#1〜#3に記載の断片)のゲル断片を切り出し、アセトニトリルにて脱水後、V8プロテアーゼ(シグマ社製)を用いてゲル内消化を行った。その際、得られるC末端配列がゲル内消化によって生じたものなのか、あるいは細胞のプロセシング作用によって生じたものなのかを質量情報から区別するために、ゲル内消化反応は通常の超純水(H2O16)と重酸素水(H2O18)を1:1の割合で混合した10 mM重炭酸アンモニウム水溶液中で行った。
(6)ペプチド消化物をC18逆相ナノLCシステムに連結したトリプルTOF5600質量分析装置(ABSciex社製)にて分析した。測定データは、Protein Pilotソフトウェア(AB Sciex社製)を用いてSwiss−Protデータベース上のアミノ酸配列に対して検索をかけてアミノ酸配列を同定した。
本実施例で検出されたペプチドの前駆イオンの質量スペクトルの代表例(図17C)、及び対応するイオンの同定情報(表9)から内部ペプチドと想定される23DAAQEPTGNNAE34(配列番号13)や81ACDDACWRIE90(配列番号14)は、C末端がO18でラベルされて生じたペプチドと、通常のO16から生じたペプチドとが同時に検出・同定された。例えば図17Cに示すように、23DAAQEPTGNNAE34(配列番号13)は、O16及びO18でラベルされたm/z 608.76及びm/z 609.76となる2価イオンのモノアイソトープイオンがそれぞれ検出され、それらに付随するアイソトポマーが混在した形で前駆イオンが検出された。81ACDDACWRIE90(配列番号14)の場合も同様であり、本データはこれらのペプチドがC末端ではないことを示しており、C末端配列同定を主旨とする本解析系の妥当性を実証するものである。
一方、124KFFSGGCH131(配列番号15)、124KFFSGGC130(配列番号16)、及び203DCKRACAKALK212(配列番号17)は、O16でラベルされて生じたペプチドは、検出・同定されたものの、O18でラベルされて生じたペプチドは検出されなかった。従って、NT−TFPI2ポリペプチドのC末端配列はHis131又はCys130であることが強く示唆される。
また、バンド#3から全長TFPI2のC末端側に位置する203DCKRACAKALK212(配列番号17)も検出されたことから、バンド#3にはNT−TFPI2とArg132よりC末端の配列を有するポリペプチド、いわゆるCT−TFPI2が混在していることを示唆される。しかしながら、NT−TFPI2ポリペプチドのC末端配列は、重酸素水法による質量情報から定義されたものであり、その妥当性を否定するものではない。
Claims (7)
- 以下の(i)〜(iii)の特徴を有する、組織因子経路阻害因子2(TFPI2)プロセシングポリペプチド。
(i)配列番号1に示すTFPI2アミノ酸配列の23残基目のアスパラギン酸から131残基目のヒスチジンもしくは130残基目のシステインまでのアミノ酸配列、又はこれと90%以上の同一性を有する配列を含む。
(ii)還元SDS−PAGEにより分子量約16,000に分画される。
(iii)アスパラギン結合型糖鎖切断処理後のペプチド断片が、還元SDS−PAGEにより分子量約12,000に分画される。 - 検体において、請求項1に記載のTFPI2プロセシングポリペプチド量及びインタクトTFPI2量を測定することを含む、卵巣明細胞腺癌を検出する方法。
- 前記TFPI2プロセシングポリペプチド量と前記インタクトTFPI2量との合計が、対照から算出した基準値を超えた場合に、卵巣明細胞腺癌が検出されたと判定する、請求項2に記載の方法。
- 配列番号1に示すTFPI2アミノ酸配列の23残基目のアスパラギン酸から131残基目のヒスチジンもしくは130残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体を用いる抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記抗体が、TFPI2のクニッツドメイン1を認識する抗体である、請求項4に記載の方法。
- 質量分析法を用いて前記測定を行う、請求項2又は3に記載の方法。
- 配列番号1に示すTFPI2アミノ酸配列の23残基目のアスパラギン酸から131残基目のヒスチジンもしくは130残基目のシステインまでの領域内の抗原決定基に結合す
る抗体を含む、請求項4に記載の方法に用いるための試薬。
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